KR20100049568A - Ｒｓｖ 감염 및 관련 병증의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피험체에서 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염[예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV 상기도 감염(URI) 및/또는 하기도 감염(LRI)], 및/또는 이와 관련된 증상 또는 장기 호흡기 병증[예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)]을 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법으로서, 인간 피험체에게 높은 친화력 및/또는 높은 결합력으로 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고 변형된 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편을 더 포함하는 1종 이상의 항체를 유효량으로 투여함으로써 RSV 감염을 감소시킬 뿐만 아니라, 향염증성 상피 세포 면역 반응을 감소시켜, 상기 환자에서 천식 및/또는 천명 및/또는 COPD의 후속 진행을 완화시키는 방법을 제공한다.

Description

ＲＳＶ 감염 및 관련 병증의 치료 방법{METHODS OF TREATING RSV INFECTIONS AND RELATED CONDITIONS}
1. 서론
본 발명은 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염과 관련된 증상 및/또는 장기적 결과를 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, RSV 감염과 관련된 증상 및/또는 장기적 결과를 치료 또는 개선하는 방법으로서, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 그 단편의 유효량을 인간 피험체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 인간 피험체에서 상기 항체 또는 항체 단편의 특정 혈청 역가가 형성되는 것인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 높은 친화력(affinity) 및/또는 높은 결합력(avidity)으로 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 RSV 감염[예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV 상기도 감염(URI) 및/또는 하기도 감염(LRI)]을 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법으로서, 본원에 제공된 1종 이상의 Fc 변형 항체(예를 들어, 1종 이상의 변형된 항체)의 유효량을 인간 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 치료적 유효량의 본 발명 항체를 투여함으로써, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 포함하는 검출 가능한 또는 진단용 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 RSV 감염을 검출 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.
2. 발명의 배경
호흡기 세포융합 바이러스
호흡기 감염은 상기도(예를 들어, 코, 귀, 부비강 및 후두) 및 하기도(예를 들어, 기관, 기관지 및 폐)의 일반적 감염이다. 상기도 감염의 증상은 콧물 또는 코막힘, 자극 과민성, 안절부절증, 식욕 부진, 활동 수준 감소, 기침 및 발열을 포함한다. 바이러스 상기도 감염은 인후통, 감기, 크루프(croup) 및 독감(flu)을 유발하고/하거나 이들과 관련이 있다. 하기도 감염의 임상 징후로는 폐 객담을 발생시키는 잔기침, 발열 및 호흡 곤란을 들 수 있다.
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 전세계적으로 호흡기 질환의 주된 원인 중 하나이다. 미국의 경우, 이 바이러스가 매년 수만명의 입원 환자와 수천명의 사망자를 발생시키는 원인이 되고 있다(RSV의 생물학적 특성 및 관리에 대한 최근의 검토는 문헌[Black, C.P., Resp. Care 2003 48(3):209-31] 참조). 유아와 소아는, 하부 호흡계로 이동하여 결핵 또는 기관지염을 유발하는 중증 RSV 감염 위험이 가장 크다. 실제로, 소아 기관지염 사례의 80%와 유아 결핵의 50%가 RSV에 기인한다. 이 바이러스는 매우 만연되어 있고 전염성이 커서, 거의 모든 소아가 2세 경에 감염되곤 한다. 감염이 지속적인 면역력을 발생시키지는 못하지만, 재감염은 덜 심각한 경향이 있어서, 나이가 더 많은 어린이와 건강한 성인의 경우, RSV가 감기 또는 독감과 같은 병으로서 발현되어 상부 및/또는 하부 호흡계에 영향을 주지만, 하기도에 심각한 손상을 줄 정도로 진행되지는 않는다. 그러나, RSV 감염은 노인이나 면역력이 약한 성인에서는 심각해질 수 있다[Evans, A.S., eds., 1989, Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 3rd ed., Plenum Medical Book, New York, p. 525-544; Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608; 및 Garvie et al., 1980, Br. Med. J. 281:1253-1254; Hertz et al., 1989, Medicine 68:269-281].
백신 또는 상업적으로 입수 가능한 치료제가 아직 이용 가능하지는 않지만, RSV 유발성 중증 하기도 질환 위험이 높은 유아에 대한 예방 및 LRI 감소 분야에서는 약간의 성공이 있었다. 특히, 2종의 면역글로불린, 즉, RSV-IGIV(정맥내 RSV-면역글로불린, RespiGamTM으로도 알려짐) 및 팔리비주맙(SYNAGIS
Figure pct00001
)에 기초한 치료법이 중증 LRI를 앓고 있는 고위험 유아를 보호하는 것으로 승인되었다. 그러나, RSV-IGIV도 팔리비주맙도 중증 하기도 급성 RSV 질환에 대한 예방제 이외의 용도로서는 승인을 받지 못하였다.
RSV는 오염된 분비물과의 물리적 접촉에 의해 쉽게 전파된다. 이 바이러스는 손에서 30분 이상 동안, 조리대와 사용한 휴지에서 수시간 동안 생존할 수 있다. RSV의 높은 전염성은 중증 감염에 걸리는 것과 관련된 위험 인자로부터 알 수 있다. 가장 큰 위험 인자 중 하나는 병원내 생활인데, 병원에서는 일부 경우 소아과 병동 의료진의 50% 이상이 감염된 것으로 확인되었다[Black, C.P., Resp. Care 2003 48(3):209-31]. 이러한 성인 감염의 최대 20%가 증상을 보이지 않으나, 여전히 상당량의 바이러스를 발산시킨다. 다른 위험 인자로는 주간 탁아 시설에의 위탁, 사람이 많은 생활 환경 및 가정에 취학 연령의 형제 자매이 있는 것을 들 수 있다.
전술한 바와 같이, RSV는 단순히 고위험 유아에 국한되는 질병이 아니기 때문에, 저위험 소아 및 고위험 성인 집단을 위한 대안적 치료법으로서, 예방과는 다른 RSV 치료법을 개발하는 것이 유용하다. 그러나, 확립된 RSV 질환을 위한 치료 선택권은 한정되어 있다. 하기도의 중증 RSV 질환은 습도를 높인 산소의 투여 및 호흡 보조 장치의 사용을 비롯하여 상당한 관리 보호를 요하는 경우가 많다[Fields et al., eds, 1990, Fields Virology, 2nd ed., Vol. 1, Raven Press, New York, p. 1045-1072]. 감염 치료를 위해 승인된 유일한 약물은 항바이러스제 리바비린이다[American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases, 1993, Pediatrics 92:501-504]. 이것은 RSV 폐렴 및 세기관지염의 치료에 있어서 효과적이며 면역적격 소아의 중증 RSV 질환의 진행을 개선하는 것으로 확인되었다[Smith et al., 1991, New Engl. J. Med. 325:24-29]. 그러나, 리바비린은 용도가 한정되어 있는데, 그 이유는 리바비린이 장기간의 에어로졸 투여를 요하고 병원에서 리바리린을 투여하는 동안 임신한 여성이 이 약물에 노출될 수 있는 있는 잠재적 위험의 우려가 있기 때문이다.
팔리비주맙(palivizumab)을 사용한 RSV의 치료를 연구한 임상 시험이 수행된 바 있다. Malley 및 그의 동료는, RSV에 감염되어 중증 RSV 질환을 앓고 있는 기관내 삽관을 실시한 유아를 대상으로, 15 mg/kg의 팔리비주맙 또는 위약을 단회 주입하기 전과 후에, 하기도 RSV 농도에 미치는 팔리비주맙의 항바이러스 효과를 연구하였다(문헌[Malley, R. et al., The Journal of Infectious Diseases, 1998; 178:1555-1561] 참조). 이 연구에서는, 폐내 바이러스 역가에 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었으나, RSV로 인한 병원 치료 기간, 산소 보충 치료 일수, 또는 하기도 감염 점수가 높은 상태로의 내원 일수에 개선이 없었다.
Saez-Llorens 및 그의 동료에 의한 또 다른 연구에서는, I/II 기 임상 시험을 수행하여, 급성 RSV 감염으로 병원 치료를 받고 있는 이전에 건강했던 소아를 대상으로 15 mg/kg의 팔리비주맙을 1회 정맥내 투여하는 것의 안전성, 내성, 약동학적 특성 및 임상 결과를 보고하였다. 이 연구는 RSV 질환으로 인해 병원 치료를 받고 있는 소아에 대해 정맥내 팔리비주맙이 안전하고 허용성이 좋다고 결론을 내렸지만, 임상 결과에 있어서는 위약군과 팔리비주맙군 간에 유의적인 차이가 없었다(즉, RSV로 인한병원 치료 기간, 산소 보충 치료 일수, 또는 하기도 감염 점수가 높은 상태로의 내원 일수에 개선이 없었다).
치료 결과 및 선택권을 개선시키는 한 가지 방법은 1종 이상의 고효능 RSV 중화 단일클론 항체(MAb)를 개발하는 것이다. 이러한 MAb는, RSV 시즌 전반에 걸쳐 반복 투여가 요구되기 때문에, 유리학 약동학적 특성을 유지하고 인간 항마우스 항체 반응의 발생을 방지하기 위해, 인간 또는 인간화 항체여야 한다. 이러한 항체 중 하나인 모타비주맙(motavizumab) 또는 MEDI-524(문헌[Wu et al., J. Mol. Biol. 368:652-655 (2007)] 참조)는 예방이 아니라 치료 상황에서 보다 성공적인 임상 결과를 이끌어 낸다. 저위험 유아에 있어서의 RSV의 효과적 치료는 호흡기 질환의 후속 진행 또는 천식, 반응성 기도 질환(RAD), 천명 및/또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 장기적 결과를 완화시킬 수 있는 것으로 생각된다.
천식 및 반응성 기도 질환(RAD)
미국에서는 약 천이백만 명이 천식 환자이고, 이것이 소아의 병원 치료의 주된 원인이 되고 있다[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th ed., 1999)].
천식은 기도 과반응성("AHR"), 기관지 수축(즉, 천명), 호산구 염증, 점액 과분비, 상피하 섬유증 및 높은 IgE 수치를 특징으로 하는 폐의 염증성 질환이다. 천식 공격은 환경적 유발 인자[예를 들어, 진드기, 곤충, 동물(예를 들어, 고양이, 개, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그, 마우스, 래트 및 조류), 진균류, 공기 오염물(예를 들어, 담배 연기), 자극성 기체, 연기, 증기, 에어로졸, 화학약품 또는 화분], 운동 또는 찬 공기에 의해 유발될 수 있다. 천식의 원인(들)은 알려지지 않았다. 그러나, 천식의 가족력[London et al., 2001, Epidemiology 12(5):577-83], 집먼지 진드기, 담배 연기 및 바퀴벌레와 같은 알레르기원에 대한 초기 노출[Melen et al., 2001, 56(7):646-52] 및 RSV와 같은 호흡기 감염[Wenzel et al., 2002, Am J Med, 112(8):672-33; 및 Lin et al., 2001, J Microbiol Immuno Infect, 34(4):259-64]이 천식 발생 위험을 증가시킬 수 있는 것으로 추정하고 있다. 위험 인자, 동물 모델 및 염증 마커를 비롯한 천식에 대한 검토는 본원에서 그 전체가 참고로 포함하는 문헌[O'Byrne and Postma (1999), Am. J. Crit. Care. Med. 159:S41-S6]를 참조할 수 있다.
현행 치료법은 주로 천식의 관리를 목적으로 하며, β-아드레날린성 약물(예를 들어, 에피네프린 및 이소프로테레놀), 테오필린, 항콜린성 약물(예를 들어, 아트로핀 및 이프라토퓸 브로마이드), 코티코스테로이드 및 류코트리엔 억제제의 투여를 포함한다. 이들 치료법은 약물 상호작용, 구강 건조증, 흐린 시야, 어린이의 성장 억제 및 폐경기 여성의 골다공증과 같은 부작용과 관련되어 있다. 염증성 세포로부터의 매개 인자 방출을 억제하고, 기도 과반응성을 감소시키고, 알레르기원에 대한 반응을 차단하기 위해 크로몰린 및 네도크로밀이 예방 목적으로 투여된다. 그러나, 천식 발생 위험이 높은 피험체에 대해 천식의 발생을 예방하는 데 이용할 수 있는 치료법은 현재 없는 실정이다. 따라서, 천식에 대해 부작용이 더 적고 치료 효능이 더 우수한 새로운 치료법이 필요하다. 특히, 천식의 후속 진행에 대한 위험 인자인 바이러스(즉, RSV) 감염에 반응하는 환자의 염증 반응을 감소 또는 완화시킬 수 있는 치료제를 개발할 것이 요망된다.
반응성 기도 질환은 천식 유사 증상에 대한 더 넓은(종종 같은 의미의) 정의이며, 일반적으로 만성 기침, 객담 생산, 천명 또는 호흡 곤란을 특징으로 한다.
천명
천명(치음 수포음으로도 알려짐)은 일반적으로 좁아진 호흡관, 특히 폐 안 깊은 곳에 위치한 좁고 죄는 기도를 통한 공기 흐름에 의해 만들어지는 소음을 특징으로 한다. 이것은 RSV 감염과, 천식 및 세기관지염과 같은 2차적 RSV 병증의 일반적 증상이다. 천명의 임상적 중요성은 이것이 기도 협착의 지표자이고 호흡 곤란의 지표가 될 수 있다는 점에 있다.
천명은 날숨 때(호흡을 내쉴 때) 가장 현저하지만, 들숨 때(호흡을 들이쉴 때)나 날숨 때나 어느 때에도 발생할 수 있다. 천명은 작은 기관지(흉부 깊이 있는 호흡관)로부터 발생하는 것이 가장 흔하지만, 더 큰 기도가 폐색될 경우에도 발생할 수 있다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 정상적인 호흡을 방해하는 공기 흐름의 폐쇄를 특징으로 하는 2종의 폐 질환, 즉, 만성 기관지염 및 폐기종을 일컫는 용어이다. 상기 두 병증은 대개 공존하기 때문에, 의사들은 COPD라는 용어를 선호한다. 이 용어는 천식과 같은 다른 폐쇄성 질환은 포함하지 않는다.
만성 기관지염은 염증으로서, 결국 기관지 내막에 반흔을 발생시킨다. 기관지에 염증이 생기고/생기거나 감염이 발생할 경우, 폐로의 공기 유입/유출량이 줄어 들어, 진한 점액 또는 가래가 나온다. 이 병증은, 기침의 원인이 되는 다른 기초 질환 없이, 2년 연속으로 1년에 3개월 동안 한달 중 대부분의 날에 점액을 발생시키는 기침이 나타나는 것으로 정의된다.
이 염증은 결국 기관지 내막의 반흔 형성으로 이어진다. 기관지가 장기간 동안 자극을 받을 경우, 꾸준하게 과도한 점액이 생성되고, 기관지 내막은 비후화되며, 자극성 기침이 발생하고, 공기 흐름에 장애가 생길 수 있으며, 폐에 상처가 생길 수 있다. 그 후, 기관지는 기도 내에 박테리아 감염을 위한 이상적인 번식처를 만들게 되며, 이는 결국 공기 흐름을 방해한다.
만성 기관지염의 증상으로는 만성 기침, 점액 증가, 가래를 끌어올리는 잦은 기침 및 숨가쁨을 들 수 있다. 2004년, 약 9백만 명의 미국인이 만성 기관지염의 의사 진단을 받은 것으로 보고되었다. 만성 기관지염은 모든 연령의 인구에게 발병하지만, 45세 이상의 인구에서 발병률이 더 높다.
흡연은 COPD의 주요 위험 인자이다. COPD 사망의 약 80∼90%가 그 원인이 흡연에 있다. COPD의 다른 위험 인자로는 공기 오염, 간접 흡연, 소아 호흡기 감염 병력(예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염 병력) 및 유전을 들 수 있다
2004년, 천백사십만명의 성인 미국인(18세 이상)이 COPD를 앓고 있는 것으로 추정되었다. 그러나, 이천사백만명에 가까운 성인 미국인이 폐 기능 손상의 징후를 보여, COPD의 낮은 진단율을 나타내었다. 대략 638,000명의 퇴원이 보고되었는데, 이는 100,000명당 21.8명의 퇴원율이다. COPD는 노령 인구의 입원 치료의 중요한 원인이다. 2004년에 퇴원자 중 대략 65%가 65세 이상의 인구였다.
2004년도에, 직접적인 건강 관리 비용으로서 건강 관리 비용 2백9억 달러, 간접적인 이환 손실 비용으로서 7십4억 달러 및 간접적인 사망 손실 비용으로서 8십9억 달러를 비롯하여 COPD에 대한 국가 비용이 약 3백7십2억 달러였다.
3. 발명의 개요
본 발명은, 부분적으로, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 사용한 수동 면역화에 의해 포유동물에서 상기 항체 또는 그 단편의 치료적으로 유효한 혈청 역가를 생성 또는 유도하는 방법을 개발하는 것에 기초한다. 본 발명은 또한, 부분적으로, 낮은 혈청 역가가 치료적으로 유효하도록, 치료 용도를 위해 증가된 효능을 생성하는 RSV 항원에 대한 높은 친화력을 갖는 항체를 확인하는 것에 기초한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 치료적 유효량의 본 발명 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법에 이용될 수 있으며, 상기 관리, 치료 및/또는 개선은 감염 후에 이루어진다.
본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 고친화력 및/또는 고결합력으로 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 그 단편을 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편의 낮은 혈청 역가는 공지된 항체의 유효 혈청 역가보다 치료적으로 유효하기 때문에, 저용량의 상기 항체 또는 항체 단편이, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 유효한 혈청 역가를 형성하는 데 사용될 수 있다. 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 저용량으로 사용하는 것은 부작용 가능성을 감소시킨다. 또한, 본원에 기재된 항체 또는 그 단편의 높은 친화력 및/또는 높은 결합력은, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 필요한 것으로 이전에 생각되었던 것보다 상기 항체 또는 그 단편의 투여 빈도를 줄일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 혈청 항체 역가가 약 0.1 ㎍/ml∼약 800 ㎍/ml가 되도록 상기 피험체에게 적어도 제1 용량의 본 발명의 변형된 항체를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 혈청 항체 역가는 상기 피험체에서 수시간, 수일, 수주 및/또는 수개월 동안 지속된다. 일 실시형태에서, 제1 용량의 본 발명의 변형된 항체는 서방형 제제로, 및/또는 폐내 또는 비내 전달을 통해 투여된다.
또한, 본 발명은, 상기도 RSV 감염(URI) 및/또는 하기도 RSV 감염(LRI)의 치료 및/또는 개선뿐만 아니라, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하기 위한, RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 대한 높은 친화력 및/또는 높은 결합력을 갖는 항체를 제공하며, 이때 상기 항체는 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는 변형된 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인) 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 상기 IgG 불변 도메인 내의 이같은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해, 이같은 아미노산 변형을 갖지 않는 야생형 항체와 비교할 때 하나 이상의 FcR'에 대한 변경된 결합 친화력을 포함하는 변형된 이펙터 기능을 갖는 변형된 항체가 생성된다.
하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 갖는 변형된 항체로서, 상기 아미노산 치환에 의해, 야생형 Fc 도메인(즉, 상기 아미노산 치환을 갖지 않는 도메인)을 갖는 동일한 항체에 비해 증가된 항체 의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 갖는 변형된 항체가 생성되는 것인 변형된 항체도 본 발명의 일부로서 고려되며, 이 항체를 본원에서 "3M" 돌연변이 또는 변형된 항체라 칭한다.
또한, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 갖는 변형된 항체로서, 상기 아미노산 치환에 의해, 야생형 Fc 도메인(즉, 상기 아미노산 치환을 갖지 않는 도메인)을 갖는 동일한 항체에 비해 증가된 항체 의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 갖는 변형된 항체가 생성되는 것인 변형된 항체도 본 발명의 일부로서 고려되며, 이 항체를 본원에서 "TM" 돌연변이 또는 변형된 항체라 칭한다.
또한, 본 발명의 변형된 항체는, 이펙터 기능(즉, 예컨대 ADCC)을 증가 또는 감소시키는 아미노산 치환을 포함할 뿐만 아니라, 또한, IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 또는 힌지-Fc 도메인) 및 이들에 부착된 임의의 분자의 생체내 반감기를 증가시키는 아미노산 변형을 포함하며, 이로써 본 발명의 변형된 항체는 단일의 변형된 항체로서 증가된 생체내 반감기와 함께 증가된 ADCC(3M)를 갖는 것들을 포함한다는 것도 고려된다. 또한, 본 발명의 변형된 항체는, 예를 들어, 단일의 변형된 항체로서 증가된 생체내 반감기와 함께 감소된 ADCC(TM)를 갖는 것들을 포함한다는 것도 고려된다.
본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 높은 친화력 및/또는 높은 결합력으로 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 치료적 유효량의 본원에 제공된 항체(변형된 항체)를 상기 피험체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명 항체의 낮은 및/또는 장기 지속적인 혈청 역가는 공지된 항체(예를 들어, 팔리비주맙)의 유효 혈청 역가보다 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 관리, 치료 및/또는 개선에 더 효과적이기 때문에, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 관리, 치료 및/또는 개선하는 데 유효한 혈청 역가를 형성하기 위해 더 낮은 및/또는 더 적은 용량의 항체가 사용될 수 있다(예를 들어, RSV 시즌당 1회 이상 투여). RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명 항체를 더 낮은 및/또는 더 적은 용량으로 사용하는 것은 부작용 가능성을 감소시키고, 치료 과정 동안, 예를 들어 유아에게 투여하는 데 더 안전하다[예를 들어, 공지된 항체(예를 들어, 팔리비주맙)에 비해 낮은 혈청 역가, 더 긴 혈청 반감기 및/또는 상기도 및/또는 하기도로의 더 우수한 국재화에 기인함].
일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체(즉, 본 발명의 변형된 항체), 예컨대 이펙터 기능(즉, 예컨대 ADCC)을 증가 또는 감소시키는 아미노산 치환을 포함할 뿐만 아니라 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 또는 힌지-Fc 도메인) 및 여기에 부착된 임의의 분자의 생체내 반감기를 증가시키는 아미노산 변형을 포함하는 변형된 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 항체(이로써 본 발명의 변형된 항체가, 단일의 변형된 항체로서, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기와 함께 증가된 ADCC(3M)를 갖는 것들을 포함함)를 치료적 유효량으로 상기 치료를 요하는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 변형된 항체가, 단일의 변형된 항체로서, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기와 함께 감소된 ADCC(TM)를 갖는 항체를 포함하는 것도 고려된다. 일부 실시형태에서, 상기도 및 하기도 RSV 감염 및/또는 급성 RSV 질환이 모두 관리, 치료 또는 개선될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 상기 피험체가 약 0.01 ㎍/ml∼약 2.5 ㎍/ml의 비갑개 및/또는 비분비물 항체 농도를 갖도록, 제1 용량의 본 발명의 항체를 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 비갑개 및/또는 비분비물 항체 농도는 수시간, 수일, 수주 및/또는 수개월 동안 유지된다. 제1 용량의 본 발명의 변형된 항체는 치료적 유효량일 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 용량의 본 발명의 항체는 서방형 제제로, 및/또는 폐내 또는 비내 전달에 의해 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 유효량의 본 발명의 변형된 항체를 투여하는 것을 포함하며, 상기 유효량이 국소 반응에 대해 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 기관지 폐포 세척액(BAL) 중에서 측정된 및/또는 전신 면역에 대해 혈청 중에서 측정된 RSV 역가의 감소를 유도하는 것인 방법을 제공한다. 여기서, 음성 대조군(예컨대 위약), 다른 치료제(팔리비주맙을 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 항체 투여 전 환자의 역가에 비해 RSV 역가의 감소가 관찰될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 변형된 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 약 105 M-1s-1∼약 1010 M-1s-1의 결합 속도 상수 또는 kon 속도[항체(Ab)+항원(Ag)--kon→Ab-Ag]를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 kon이 약 105 M-1s-1∼약 108 M-1s-1, 바람직하게는 약 2.5×105 또는 5×105 M-1s-1, 더 바람직하게는 약 7.5×105 M-1s-1인 고효능 항체이다. 이러한 항체는 또한 높은 친화력(예를 들어, 약 109 M-1)을 가지거나 또는 더 낮은 친화력을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 항체는 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, kon 속도가 공지된 항RSV 항체(예를 들어, 팔리비주맙)보다 1.5배 이상 더 높다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 변형된 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, koff 속도(Ab-Ag--Koff→Ab+Ag)가 5×10-1 s-1 미만 내지 10×10-10s-1 미만이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 공지된 항RSV 항체(예를 들어, 팔리비주맙)보다 1.5배 이상 더 낮은 koff 속도를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 변형된 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 친화성 상수 또는 Ka(kon/koff)가 약 102 M-1∼약 5×1015 M-1, 바람직하게는 104 M-1 이상이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 Ka가 약 109 M-1, 바람직하게는 약 1010 M-1, 더 바람직하게는 약 1011 M-1인 고효능 항체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 본 발명의 변형된 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 해리 상수 또는 Kd(koff/kon)가 약 5×10-2 M∼약 5×10-16 M이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 변형된 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지된 분석법(예를 들어, BIAcore 분석법)을 이용하여 측정하였을 때 해리 상수(Kd)가 약 25 pM∼약 3,000 pM이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 본 발명의 변형된 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 시험관내 마이크로중화 분석법으로 측정시 중간 억제 농도(IC50)가 약 6 nM∼약 0.01 nM이다. 특정 실시형태에서, 상기 마이크로중화 분석법은 본원에 기재된 마이크로중화 분석법(예를 들어, 본원의 실시예 6.4, 6.8 및 6.18에 기재된 것) 또는 문헌[Johnson et al., 1999, J. Infectious Diseases 180:35-40]에 기재된 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 시험관내 마이크로중화 분석법으로 측정시 IC50이 3 nM 미만, 바람직하게는 1 nM 미만이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험체(예를 들어, 유아, 미숙아로 태어난 유아, 면역 손상 피험체, 의료 종사자)에게 본 발명의 1종 이상의 항체(예를 들어, 변형된 항체)를 치료적으로 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV 감염이 한 개체에서 다른 개체로 전파되는 것을 방지하거나, 전파된 감염을 약화시키기 위해, 피험체 또는 인간 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 피험체는 RSV에 감염된 다른 개체에 노출된 적이 있거나(무증상일 수도 있고 아닐 수도 있음), 또는 노출될 가능성이 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 RSV에 감염된 개체에의 잠재적 또는 실제적 노출 후에 약 1∼2주의 기간 동안 1일 1회 이상(예를 들어, 1회, 2회, 4회 등) 상기 피험체의 비내에 투여된다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 약 60 mg/kg∼약 0.025 mg/kg, 더 바람직하게는 약 0.025 mg/kg∼15 mg/kg의 용량으로 투여된다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 사용하기 위한, 표 1에 기재된 임의의 VH 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그 단편 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 사용하기 위한, 표 1에 기재된 하나 이상의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 항체 또는 그 단편 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 VL 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 사용하기 위한, 표 1에 기재된 하나 이상의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 항체 또는 그 단편 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, RSV 감염과 관련된 하나 이상의 증상 및/또는 장기적 결과를 치료 또는 개선하는 데 사용하기 위한, 표 1에 기재된 임의의 VH 도메인 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, RSV 감염과 관련된 하나 이상의 증상 및/또는 장기적 결과를 치료 또는 개선하는 데 사용하기 위한, 표 1에 기재된 하나 이상의 VH CDR 및 하나 이상의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR 및 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 항체 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 실시형태에서, 바람직하게는 상기 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체 및 방법은 MEDI-524(모타비주맙) VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체의 사용을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 MEDI-524(모타비주맙)의 VH 쇄 및/또는 VL 쇄를 포함하는 항체의 사용을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 변형된 Fc 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체는 변형된 Fc 도메인(즉, 비변형된 MEDI-524)을 포함하지 않는 MEDI-524(모타비주맙)의 Fc 도메인에 비해 FcRn 수용체에 대해 증가된 또는 감소된 친화력을 갖는다.
또한, 본 발명의 변형된 항체 및 방법은 임의의 IgG Fc 부위 변형을 갖지 않는 동일한 항체에 비해, RSV에 의한 감염에 대한 환자의 염증 반응을 추가로 조절한다는 것도 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것은, 임의의 IgG Fc 부위 변형을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때, RSV 감염 조직/세포로부터의 사이토카인 방출을 추가로 감소시키고/시키거나 케모카인 방출을 추가로 감소시킨다. 본 발명의 변형된 항체를 사용하여 RSV에 감염된 환자에 대해 향염증 반응을 감소시키는 것은 환자에 대해 천식 또는 다른 만성 호흡기 질환의 후속 발생 위험을 추가로 완화시킬 것으로 생각된다.
본 발명은 RSV 감염 부위에 직접적으로 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 그 단편을 전달하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은, 예를 들어, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 RSV 감염의 장기적 결과를 완화시키기 위해, 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 그 단편을 폐내 전달하는 방법을 포함한다. 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 그 단편을 전달하는 개선된 방법은 상기 항체 또는 항체 단편을 피험체에 투여하는 용량 및/또는 빈도를 줄인다.
3.1 용어
용어 "RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체", "항RSV 항체", "변형된 항체" 및 본원에서 사용되는 유사한 용어들은 RSV 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체[즉, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc-도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 항체]를 말한다. RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 관련된 항원과 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 다른 항원과 교차 결합하지 않는다. RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편이, 예를 들어, 면역분석법, BIAcore 또는 당업자에게 공지된 다른 기법에 의해 확인할 수 있다. Fc 변형 항체 또는 그 단편은, 방사성 면역분석법(RIA) 및 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)과 같은 실험적 기법을 이용하여 측정할 때 임의의 교차 반응성 항원보다 더 높은 친화력으로 RSV 항원에 결합할 경우 RSV 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 항체 특이성에 대한 고찰은, 예를 들어, 문헌[Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York, p. 332-336]을 참조할 수 있다.
본 발명의 항체는 합성 항체, 단일클론 항체, 재조합에 의해 제조된 항체, 다중 특이적 항체(이중 특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디이(intrabody), 단일쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일 특이적, 이중 특이적 등을 포함함), Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드 결합 Fv(sdFv), 항이디오타입(항Id) 항체 및 전술한 것 중 임의의 것의 에피토프 결합성 단편을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 특히, 본 발명의 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성이 있는 부분, 즉, RSV 항원(바람직하게는, RSV F 항원)[예를 들어, 항RSV 항체의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR)]에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합성 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 본 발명의 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 IgG 항체, 또는 그 클래스(예를 들어, 인간 IgG1) 또는 그 서브클래스이다.
"불변 도메인"이란 용어는 항원 결합성 부위를 포함하는 면역글로불린의 다른 부분, 즉, 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 말한다. 상기 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인과 경쇄의 CHL 도메인을 포함한다.
본원에서 사용될 때 "유효 중화 역가"란 용어는, (인간에 있어서) 임상적으로 효능이 있거나, 예를 들어, 코튼 래트(목화나무쥐)에 있어서 바이러스를 99% 감소시키는 것으로 확인된, 동물(인간 또는 코튼 래트)의 혈청 중에 존재하는 양에 해당하는 항체의 양을 말한다. 99% 감소는 RSV의 특이적 공격, 예를 들어, 103 pfu, 104 pfu, 105 pfu, 106 pfu, 107 pfu, 108 pfu 또는 109 pfu의 RSV의 공격으로 정의된다.
본원에서 사용될 때 "노인"이란 용어는 65세 이상의 인간 피험체를 말한다.
본원에서 사용될 때 "FcRn 수용체" 또는 "FcRn"이란 용어는 인간 또는 영장류의 태반 또는 난황낭(토끼)을 통해 태아에게, 소장을 통해 초유로부터 신생아에게 모체의 IgG가 전달될 때 관여하는 것으로 알려진 Fc 수용체("n"은 "네오네이트(neonate)"를 나타냄)를 말한다. 또한, FcRn은, IgG 분자에 결합하여, 이것을 혈청으로 재순환시키는 것에 의해, 일정한 혈청 IgG 수치를 유지하는 데 관여한다고 알려져 있다. IgG 분자에의 FcRn의 결합은 pH 의존적이며, pH 6.0에서 최적 결합이 나타난다. 인간 FcRn의 아미노산 서열과 쥐과 동물 FcRn의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 337 및 서열 번호 338에 제시된다.
본원에서 사용될 때, "융합 단백질"이란 용어는 항체의 아미노산 서열 및 이종성 폴리펩티드 또는 단백질[즉, 정상적으로는 항체의 일부가 아닌 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어, 비 항RSV 항원 항체)]의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용될 때, "고효능"이란 용어는 본원에 기재된 것과 같은 생물학적 활성(예를 들어, RSV의 중화)에 대해 다양한 분석법으로 측정시 높은 효능을 나타내는 항체를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 고효능 항체는, 마이크로중화 분석법으로 측정시, IC50 값이 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1.75 nM 미만, 1.5 nM 미만, 1.25 nM 미만, 1 nM 미만, 0.75 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.25 nM 미만, 0.1 nM 미만, 0.05 nM 미만, 0.025 nM 미만, 또는 0.01 nM 미만이다. 특정 실시형태에서, 상기 마이크로중화 분석법은 본원에 기재되어 있거나 문헌[Johnson et al., 1999, J. Infectious Diseases 180:35-40]에 기재된 마이크로중화 분석법이다. 또한, 본 발명의 고효능 항체는 상기 항체를 투여하지 않은 코튼 래트에 비해 105 pfu로 항원 공격한 지 5일 후 코튼 래트의 RSV 역가를 75% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 99% 낮춘다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 고효능 항체는 1종 이상의 RSV 항원에 대해 높은 친화력 및/또는 높은 결합력을 나타낸다(예를 들어, 상기 항체는 1종 이상의 RSV 항원에 대해 2×108 M-1 이상, 바람직하게는 2×108M-1∼5×1012M-1, 예컨대 2.5×108 M-1 이상, 5×108 M-1 이상, 109 M-1 이상, 5×109 M-1 이상, 1010 M-1 이상, 5×1010 M-1 이상, 1011 M-1 이상, 5×1011 M-1 이상, 1012 M-1 이상, 또는 5×1012 M-1 이상의 친화력을 가짐).
본원에서 사용될 때, "인간 유아"란 용어는 생후 24개월 미만, 바람직하게는 16개월 미만, 12개월 미만, 6개월 미만, 3개월 미만, 2개월 미만, 또는 1개월 미만인 인간을 말한다.
본원에서 사용될 때, "미숙아로 태어난 인간 유아"란 용어는 임신 40주 미만, 바람직하게는 임신 35주 미만에 태어난 인간을 말하며, 여기서, 상기 유아는 생후 6개월 미만, 바람직하게는 3개월 미만, 더 바람직하게는 2개월 미만, 가장 바람직하게는 1개월 미만이다.
본원에서 사용될 때, "IgG Fc 부위", "Fc 부위", "Fc 도메인", "Fc 단편" 및 다른 유사한 용어는 IgG 분자의 파파인 분해에 의해 얻은 결정화 가능한 단편과 서로 관련이 있는 IgG 분자의 일부를 말한다. Fc 부위는 디설파이드 결합에 의해 연결되는 IgG 분자의 2개의 중쇄의 C 말단 반부로 이루어진다. 이것은 항원 결합 활성을 갖고 있지는 않지만, 탄수화물 부분과, 보체 및 FcRn 수용체를 비롯한 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다(하기 참조). 예를 들어, Fc 단편은 전체 제2 불변 도메인 CH2(인간 IgG1의 231∼340번 잔기, 서열 번호 339 참조) 및 제3 불변 도메인 CH3(인간 IgG1의 341∼447번 잔기, 서열 번호 340 참조)를 포함한다. 본원에서 사용되는 모든 넘버링은 달리 나타내지 않는다면 EU 인덱스(EU index)[Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed.]에 따른 것이다.
본원에서 사용될 때, "IgG 힌지-Fc 부위" 또는 "힌지-Fc 단편"이란 용어는, EU 인덱스[Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed.]에 따를 때, Fc 부위(231∼447번 잔기) 및 Fc 부위의 N 말단으로부터 연장되는 힌지 부위(216∼230번 잔기; 예를 들어 서열 번호 341)로 이루어진 IgG 분자의 부위를 말한다. 인간 IgG1 힌지-Fc 부위의 아미노산 서열의 예가 서열 번호 342이다.
본원에서 사용될 때, "감염" 및 "RSV 감염"이란 용어는 숙주에서의 RSV의 생활사의 모든 단계(세포 또는 신체 조직에서의 RSV에 의한 침입 및 그 복제를 포함하나 이들에 한정되지 않음)뿐만 아니라 RSV에 의한 침입 및 그 복제로부터 기인하는 병적 상태를 말한다. RSV에 의한 침입 및 RSV의 증식은 하기 단계를 포함하나 이들에 한정되지 않는다: RSV 입자의 세포에의 도킹, 바이러스와 세포막의 융합, 바이러스 유전자 정보의 세포로의 도입, RSV 단백질의 발현, 새로운 RSV 입자의 생산 및 세포로부터 RSV의 방출. RSV 감염은 상기도 RSV 감염(URI), 하기도 RSV 감염(LRI) 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 실시형태에서, RSV에 의한 침입 및 그 복제로부터 기인하는 병적 상태는 급성 RSV 질환이다. 본원에서 사용될 때 "급성 RSV 질환"이란 용어는 RSV 감염으로 인해 폐 또는 하기도에 발생하는 임상적으로 유의한 질환을 말하며, 이 질환은 폐렴 및/또는 세기관지염으로서 나타날 수 있고, 이때 이러한 증상은 저산소증, 수면 무호흡증, 호흡 곤란증, 빠른 호흡, 천명, 청색증 등을 포함할 수 있다. 급성 RSV 질환은 발병 개체가 병원 치료, 산소 투여, 기도 삽관 및/또는 환기 치료와 같은 의료적 개입을 받을 것을 요한다.
본원에서 사용될 때, "생체내 반감기"란 용어는 특정 동물의 순환계에서의 특정 유형의 IgG 분자 또는 FcRn 결합성 부위를 포함하는 그 단편의 생물학적 반감기를 말하며, 동물 체내에서 투여된 양의 절반이 그 동물의 순환계 및/또는 다른 조직으로부터 제거되는 데 필요한 시간으로 표현된다. 특정 IgG의 제거 곡선이 시간의 함수로서 간주될 경우, 그 곡선은 일반적으로, 주사된 IgG 분자의 혈관내 공간과 혈관외 공간 사이의 평형을 나타내고 부분적으로 분자의 크기에 의해 결정되는 빠른 α 상과, 혈관내 공간에서 IgG 분자의 이화작용을 나타내는 더 긴 β 상을 갖는 2상이다. "생체내 반감기"란 용어는 실질적으로 β 상의 IgG 분자의 반감기에 해당한다. 본원에서 사용될 때, 변형된 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 항체의 "증가된 생체내 혈청 반감기" 또는 "연장된 생체내 혈청 반감기"는, 변형된 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함하지 않는 항체에 비해[예를 들어, 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편에 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 항체(즉, 비변형 항체)에 비해, 또는 팔리비주맙과 같은 다른 RSV 항체에 비해] 항체의 생체내 혈청 반감기에 있어서 증가가 있음을 의미한다.
"하기도"란 용어는 기관지, 세기관지 및 폐포를 비롯하여 기관(windpipe, trachea) 및 폐를 포함하는 하기도의 주요 통로 및 구조를 말한다.
본원에서 사용될 때, "MEDI-524"란 용어는 본원에서 그 전체를 참고로 포함하는 문헌[Wu et al., J. Mol. Biol. 368, 652-665 (2007)]에 기재된 비변형된 항RSV 단일클론 항체(모타비주맙)이다.
본원에서 사용될 때, "변형된 항체"란 용어는 또한 "Fc 변형 항체"와 동의어로서, 항체 불변 도메인(바람직하게는 IgG, 더 바람직하게는 IgG1 불변 도메인) 또는 그 FcRn 결합성 단편의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기에 하나 이상의 "변형"을 포함하는 본원에 기재된 임의의 항체를 포함하며, 여기서, 상기 항체는, 예를 들어, 상기 항체의 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)과 Fc 수용체 네오네이트(FcRn) 간의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기에 있어서의 하나 이상의 변형의 결과로서, 변형된 이펙터 기능(즉, ADCC)을 보유할 수 있고, 이와 함께, IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편에 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 동일한 항체에 비해 증가된 생체내 반감기를 갖는다. "변형된 항체" 또는 "Fc 변형 항체"란 용어는 또한 표시된 위치에 언급된 잔기 중 하나 이상을 자연적으로 포함하는 항체를 포함한다(예를 들어, 상기 잔기는 변형을 갖지 않는 분자 내의 언급된 위치에 이미 존재한다). 불변 도메인 위치의 넘버링은 EU 인덱스[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed.]에 따른 것이다. 본원에서 사용될 때, "변형된 항체" 또는 "Fc 변형 항체"는 고효능, 고친화성 및/또는 고결합성의 변형된 항체일 수도 있고 아닐 수도 있다. 특정 실시형태에서, 상기 변형된 항체는 고효능 항체이고, 다른 실시형태에서, 고효능 및 고친화성의 변형된 항체이다.
본원에서 사용될 때, 본 발명 항체의 불변 도메인 또는 그 FcR 결합성 단편에 있어서의 하나 이상의 "아미노산 잔기에 대한 변형"은 항체의 불변 도메인 또는 그 FcR 결합성 단편(바람직하게는, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)의 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 임의의 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실이 있음을 의미한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 변형은 치환이다. 일 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 234E, 235R, 235A, 235W, 235P, 235V, 235Y, 236E, 239D, 265L, 269S, 269G, 298I, 298T, 298F, 327N, 327G, 327W, 328S, 328V, 329H, 329Q, 330K, 330V, 330G, 330Y, 330T, 330L, 330I, 330R, 330C, 332E, 332H, 332S, 332W, 332F, 332D 및 332Y이며, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 239D, 330L 및 332E이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 이같은 Fc 도메인 아미노산 치환은, 상기 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때, ADCC(3M)에 있어서의 증가를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 233P, 234F, 234V, 235A, 235E, 265A, 327G, 330S 및 331S로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 234F, 235E 및 331S로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 이같은 Fc 도메인 아미노산 치환은, 상기 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때, ADCC(3M)에 있어서의 감소를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 3M 및 TM에 대해 기재된 것 이외에도 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 위치에서의 변형과 함께 하나 이상의 아미노산 변형이 존재하며, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat 등의 상기 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 이러한 Fc 도메인 조합 아미노산 치환은, 상기 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때, 생체내 반감기의 증가를 보이면서 ADCC(3M)가 증가된 변형된 항체, 또는 생체내 반감기의 감소를 보이면서 ADCC(TM)의 감소를 보이는 변형된 항체를 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, IgG 불변 도메인은 252번 위치의 Y(252Y), 254번 위치의 T(254T) 및/또는 256번 위치의 E(256E)를 포함하며, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 아미노산 돌연변이의 이러한 조합은 본 발명 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 한다.
본원에서 사용될 때, "감염 다중도(M.O.I)"란 용어는 단일 세포, 조직 또는 환자를 감염시키는 RSV 바이러스의 평균 수를 정량하는 방식이다. 일 실시형태에서, 임상적 RSV 감염인 것으로 간주되는 RSV 감염은 환자는 RSV M.O.I. 측정치가 약 0.001∼약 0.1이다. 또 다른 실시형태에서, 임상적 RSV 감염인 것으로 간주되는 RSV 감염 환자는 RSV M.O.I. 측정치가 약 0.1 또는 약 0.01이다.
본원에서 사용될 때, "요양소(nursing home)"란 용어는 꾸준한 간호가 필요하고 일상 생활에 심각한 장애가 있는 사람들을 위한 요양소 또는 전문 요양 시설(SNF) 또는 공동 주거 시설에서 생활하는 인간 환자를 의미한다. 거주자는, 예를 들어 신체 장애가 있는 노인 및 청년을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "약학적으로 허용되는"이란 표현은 동물, 더 특히 인간에의 사용에 대해, 미연방 정부 또는 주정부의 허가 기관에 의해 승인되었거나, 미국 약전, 유럽 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 수록되어 있음을 의미한다.
"RSV 항원"이란 용어는 항체가 면역 특이적으로 결합하는 RSV 폴리펩티드를 말한다. RSV 항원은 또한 항체가 면역 특이적으로 결합하는 RSV 폴리펩티드 또는 그 단편의 유사체 또는 유도체를 의미하기도 한다. 일부 실시형태에서, RSV 항원은 RSV F 항원, RSV G 항원 또는 RSV SH 항원이다.
본원에서 사용될 때, "혈청 역가"란 용어는 집단 내에서 10 피험체 이상, 바람직하게는 20 피험체 이상, 가장 바람직하게는 40 피험체 이상 최대 약 100,1000 또는 그 이상의 피험체의 평균 혈청 역가를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "부작용"이란 용어는 치료(예를 들어, 치료제)의 원치 않는 효과 및 불리한 효과를 포함한다. 원치 않는 효과가 반드시 불리한 것은 아니다. 치료(예를 들어, 치료제)의 불리한 효과는 유해하거나 불쾌하거나 위험한 것일 수 있다. 부작용의 예로는 URI, 비염, 설사, 기침, 위장염, 천명, 구역질, 구토, 식욕부진, 복부 경련, 발열, 통증, 체중 감소, 탈수증, 탈모증, 호흡 곤란, 불면증, 현기증, 점막염, 신경 및 근육에 대한 영향, 피로, 구강 건조증 및 식욕 감퇴, 투여 부위의 발진 또는 종창, 발열, 오한 및 피로 등의 독감과 같은 증상, 소화관 장애 및 알레르기 반응을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 환자가 경험한 그 밖의 원치않는 효과는 다수가 있고 당업계에 알려져 있다. 그 중 다수가 문헌[Physician and Desk Reference (58th ed., 2004)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용될 때, "피험체"란 용어와 "환자"란 용어는 상호 교환하여 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 피험체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)이고, 가장 바람직하게는 인간이다. 일 실시형태에서, 상기 피험체는 RSV에 감염된(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI) 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 피험체는 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI) 발병 위험이 있는 포유동물이고, 바람직하게는 인간(예를 들어, 면역 손상 또는 면억억제 포유동물, 또는 유전적 소인이 있는 포유동물)이다. 일 실시형태에서, 상기 피험체는 RSV 감염에 기인하거나 이에 의해 유발되었거나 이와 관련이 있는 호흡기 병증(천식, 천명 또는 RAD을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)이 있는 인간이다. 일부 실시형태에서, 상기 피험체는 0∼5세이거나 인간 유아이며, 바람직하게는 0∼2세(예를 들어, 0∼12월령)의 유아이다. 다른 실시형태에서, 상기 피험체는 고령의 피험체이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, "치료적으로 유효한 혈청 역가"는, 피험체에서 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 중증도, 지속 기간 및/또는 그와 관련된 증상을 감소시키는 피험체, 바람직하게는 인간에서의 혈청 역가이다. 바람직하게는, 상기 치료적으로 유효한 혈청 역가는 감염에 기인한 합병증의 발병 확률이 가장 높은 인간(예를 들어, 낭포성 섬유증, 기관지 폐 이형성증, 선천성 심장병, 선천성 면역결핍증 또는 후천성 면역결핍증이 있는 인간, 골수 이식을 받은 인간, 인간 유아 또는 노인)에 있어서 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 중증도, 지속 기간 및/또는 그와 관련된 증상을 감소시킨다. 본 발명의 다른 특정 실시형태에서, "치료적으로 유효한 혈청 역가"는, 코튼 래트에 있어서, 105 pfu로 항원 공격한 지 5일 후의 RSV 역가를, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 투여하지 않은 코튼 래트에 대해 105 pfu의 RSV로 항원 공격한 지 5일 후의 RSV 역가보다 99% 더 낮게 하는 혈청 역가이다. 일부 실시형태에서, 본 발명 항체의 치료적 유효량은 약 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg 또는 약 60 mg/kg이다. 일 실시형태에서, 본 발명 항체의 치료적 유효량은 상기 피험체 체중 kg당 약 15 mg의 항체이다.
본원에서 사용될 때, "치료한다", "치료" 및 "치료하는"이란 표현들은 1종 이상의 치료법의 적용(본 발명 항체와 같은 1종 이상의 치료제의 투여를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 기인하는 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간을 감소 또는 개선하는 감염 후 투여를 말한다. 특정 실시형태에서, 이러한 용어는 RSV 복제를 감소 또는 억제하는 것, RSV가 다른 조직 또는 피험체로 전파되는 것(예를 들어, 하기도로의 전파)을 억제 또는 감소시키는 것, RSV에 의한 세포의 감염을 억제 또는 감소시키는 것, 급성 RSV 질환을 억제 또는 감소시키는 것, RSV 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 억제 또는 감소시키는 것, 및/또는 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 억제 또는 감소시키는 것을 의미한다.
"상기도"란 용어는 코 또는 콧구멍, 비강, 입, 목구멍(인두) 및 성대(후두)를 비롯한 상기도의 주요 통로 및 구조를 말한다.
4. 도면의 설명
도 1은 RSV에 감염된 상피 Hep-2 세포(RSV-524)에 감염 후 1시간 또는 12시간째 MEDI-524를 첨가한 후, RSV 감염 Hep-2 세포에 의해 분비된 IL-6 또는 IL-8의 존재에 대해 분석한 결과를 보여준다. 대조군은 무관한 것으로 간주되는 항CD2 항체인 MEDI-507(RSV-507)이다. RSV 감염 후 1시간째 첨가된 MEDI-524는, 감염 후 12시간째보다 RSV 감염 세포로부터의 IL-6 및 IL-8 분비가 크게 감소되었음을 보여준다.
도 2는 RSV에 감염된 상피 Hep-2 세포(RSV-524)에 감염 후 1시간 또는 12시간째 MEDI-524를 첨가한 후, RSV 감염 Hep-2 세포에 의해 분비된 IL-12p70 또는 TNF-α의 존재에 대해 분석한 결과를 보여준다. 대조군은 무관한 것으로 간주되는 항CD2 항체인 MEDI-507(RSV-507)이다. RSV 감염 후 1시간째 첨가된 MEDI-524는, 감염 후 12시간째보다 RSV 감염 세포로부터의 IL-12p70 또는 TNF-α 분비가 크게 감소되었음을 보여준다.
도 3은 RSV 감염 Hep-2 세포와 동시에 배양된 활성화된 대식 세포로부터의MEDI-524 매개성 MIP-1b 및 MCP-1의 케모카인 방출을 보여준다.
도 4는 RSV 감염 Hep-2 세포와 동시에 배양된 활성화된 대식 세포로부터의MEDI-524 매개성 IP-10 및 에오탁신-3의 케모카인 방출을 보여준다.
도 5는 FACS 분석에 의한 MEDI-524 매개성 THP-1 활성화를 보여준다. MEDI-524 또는 대조군 항체 MEDI-507을, INF-γ 활성화 THP-1 세포와 혼합된 DiD 염색 RSV 감염 Hep-2 세포에 감염 후에 첨가하여, x축 상의 THP-1 세포에 대한 HLADR-PE 및 y축 상의 Hep-2 세포에 대한 DiD-APC에 대해 분석하였다. MEDI-524는 RSV 감염 세포의 단핵구 식작용을 매개할 수 있다.
도 6은 MEDI-524 및 MEDI-524 3M(Kabat 넘버링에 따라, 아미노산 돌연변이 239D, 330L, 332E를 가짐) 매개성 항체 의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 보여준다. RSV 감염 Hep-2 세포를 NK 이펙터 세포와 혼합한 후, MEDI-524 또는 MEDI-524 3M을 첨가하였다. 세포독성은 ADCC 분석법, LDH 방출 분석법으로 측정하였다.
도 7은, 바이러스 역가량을 측정하기 위한 바이러스 플라크 분석법을 이용하여, 코튼 래트 폐 균질물 중의 바이러스 역가 감소에 미치는, MEDI-524에 비해 우수한 MEDI-524 TM(Kabat 넘버링에 따라, 아미노산 돌연변이 234F, 235E, 331S를 가짐)의 치료 효능을 보여준다. 4마리 동물로 이루어진 군 각각에 모타비주맙(MEDI-524), ADCC 증강 변이체(MEDI-524-3M) 또는 ADCC 결함 변이체(MEDI-524-TM)를 7 mg/kg의 농도로 다양한 시점(감염 24시간 전 또는 감염 72시간 후)에 복강내 주사하였다. 한 동물 군은 미처리 상태로 두고 바이러스만을 투여하였고(비감작 감염), 한 동물 군은 미처리, 비감염 상태로 두었다(비감작 비감염). 시점 0에, 모든 동물들에게 105 pfu를 비내 투여하여 감염시키고, 감염 4일 후, 모든 동물들을 희생시켜 바이러스 역가를 분석하였다. 폐내 바이러스 역가가 도시되어 있다(log10 pfu/g [평균±표준 오차]).
도 8은 RSV 감염 후 1시간째 모타비주맙 또는 MEDI-524를 첨가한 것이 A549 세포에서 PD-L1 발현을 감소시켰음을 보여준다.
도 9는 RSV 감염 후 1시간, 6시간 또는 12시간째 모타비주맙 또는 MEDI-524를 첨가한 것이 모두 A549 세포에서 ICAM-1 발현을 감소시켰음을 보여준다.
도 10은 RSV 감염 후 1시간, 6시간 또는 12시간째 모타비주맙 또는 MEDI-524를 첨가한 것이 모두 A549 세포의 세포 아폽토시스를 감소시켰음(유도 배수)(카스파제 3/7 활성의 의해 측정)을 보여준다.
도 11은 RSV 감염 후 A549 세포의 부유 비율(%) 및 A549 세포의 RSV 감염 후 1시간, 6시간 또는 12시간째 모타비주맙 또는 MEDI-524을 함유한 비율(%)을 보여준다.
도 12는, RSV 감염 후 모타비주맙 또는 MEDI-524의 첨가가, HEp-2 세포와 A549 세포 둘 다의 세포 배양물 상청액으로의 RSV 방출을 감소시킨다는 것을 보여준다.
5. 발명의 상세한 설명
항체 및 항체-항원 복합체와 면역계 세포와의 상호작용은 항체 의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 비롯한 다양한 반응을 일으킨다[참고 문헌: Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995); 및 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]. ADCC란 FcR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 킬러(NK) 세포, 호중구 및 대식 세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 그 후 표적 세포의 용해를 유발하는 세포 매개성 반응을 말한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다.
몇 가지 항체 이펙터 기능은 항체의 Fc 부위에 결합하는 Fc 수용체(FcR)에 의해 매개된다. FcR은 면역글로불린 이소타입에 대한 그 특이성에 의해 정의되는데; IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로, IgE 항체에 대한 Fc 수용체는 FcεR로, IgA 항체에 대한 Fc 수용체는 FcαR로 칭해지며, 그 밖의 것도 같은 방식이다. FcγR의 3 가지 서브클래스, 즉, FcγRI(CD64), FcγII(CD32) 및 FcγIII(CD16)가 확인되었다. 이러한 상이한 FcR 서브타입은 상이한 세포 유형에서 발현된다[참고 문헌: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]. 예를 들어, 인간의 경우, FcγIIIB는 호중구에서만 확인되는 반면, FcγIIIA는 대식 세포, 단핵구, 자연 킬러(NK) 세포 및 T 세포의 부분집단에서 확인된다. 특히, FcγRIIIA는 ADCC에 관여하는 세포 유형 중 하나인 NK 세포 상에 존재하는 유일한 FcR이다.
또한, 본 발명은, 상기도 RSV 감염(URI) 및/또는 하기도 RSV 감염(LRI)을 치료 및/또는 개선하는 것뿐만 아니라, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하기 위한, RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 대해 고친화력 및/또는 고결합력을 갖는 항체(즉, "변형된 항체")를 제공하며, 여기서 상기 항체는 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, 변형된 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)에 하나 이상의 변형을 포함하고, 이 변형은 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 또는 힌지-Fc 도메인) 및 여기에 부착된 임의의 분자의 생체내 반감기를 증가시키고, 변형된 부위를 포함하는 IgG 또는 그 FcRn 결합성 단편의 FcRn에 대한 친화력을 증가시킨다. 상기 아미노산 변형은 임의의 잔기에서의 임의의 변형(일부 실시형태에서, 특정 위치의 잔기는 변형되지 않지만, 이미 원하는 잔기를 가지고 있음), 바람직하게는 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 잔기 중 하나 이상에서 임의의 변형일 수 있으며, 여기서 상기 변형은 변형된 부위를 포함하는 IgG 또는 그 FcRn 결합성 단편의 FcRn에 대한 친화력을 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 252번 위치의 타이로신(252Y), 254번 위치의 트레오닌(254T) 및/또는 256번 위치의 글루탐산(256E)(Kabat 등의 문헌(1991)에 기재된 EU 인덱스에 따른 불변 도메인의 넘버링)을 포함한다. 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편에서의 단백질 서열이 면역학적으로 유용하다[U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. (Kabat et al.)]. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편에 252Y, 254T 및 256E를 포함한다(이하, "YTE")(Kabat 등의 상기 문헌에 기재된 EU 인덱스 참조).
본 발명은, 고친화력 및/또는 고결합력으로 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체(변형된 항체)를 유효량으로 피험체에 투여하는 것으로 포함하는, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명 항체의 낮은 혈청 역가 및/또는 장기 지속적인 혈청 역가는 공지된 항체(예를 들어, 팔리지주맙)의 유효 혈청 역가보다 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 관리, 치료 및/또는 개선에 더욱 효과적이기 때문에, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 관리, 치료 및/또는 개선에 유효한 혈청 역가를 얻기 위해 더 낮은 및/또는 더 적은 용량, 예를 들어 RSV 시즌당 1회 이상의 용량의 항체가 사용될 수 있다. RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명 항체를 더 낮은 및/또는 더 적은 용량으로 사용하는 것은 공지된 항체(예를 들어, 팔리비주맙)에 비해, (예를 들어, 더 낮은 혈청 역가, 더 긴 혈청 반감기 및/또는 상기도 및/또는 하기도로의 더 우수한 국재화로 인하여) 치료 과정 동안, 예를 들어 유아에게 투여하기에 더 안전하고 부작용 가능성을 줄인다. 특정 실시형태에서, 항체는 RSV 시즌당 1회 또는 2회 투여된다.
따라서, 본 발명은, 공지된 RSV 항체(예를 들어, 팔리비주맙)에 비해, RSV 항원(바람직하게는, RSV F 항원)에 대한 증가된 친화력 및/또는 증가된 결합력을 가지고/가지거나 증가된 효능을 갖는 항체 또는 이 항체의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는, 예를 들어 변형된 IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함하지 않는 항체에 비해[예를 들어, IgG 불변 도메인, 또는 그 Fc 결합성 단편 내에 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 동일한 항체(즉, 동일한 비변형 항체)에 비해], 또는 팔리비주맙과 같은 다른 RSV 항체에 비해, 증가된 혈청 반감기를 유도하는 변형된 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 피험체에게 투여되고, 여기서 상기 피험체는 인간 피험체이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 상기 피험체에게 유효량의 본원에 기재된 항체, 예를 들어 변형된 항체(즉, 본 발명의 항체)를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급성 RSV 질환, 또는 급성 RSV 질환으로의 진행을 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법으로서, 피험체에게 유효량의 본 발명 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, RSV 감염과 관련된 증상 또는 호흡기 병증은 천식, 천명, RAD, 코막힘, 코벌렁임, 기침, 빈호흡(빠른 기침), 숨가쁨, 발열, 해소성 기침 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기도 및 하기도 RSV 감염이 예방, 치료, 관리 및/또는 개선된다. 다른 실시형태에서, 상기도 감염에서 하기도 감염으로의 진행이 예방, 치료, 관리 및/또는 개선된다. 다른 실시형태에서, 급성 RSV 질환, 또는 급성 RSV 질환으로의 진행이 예방, 치료, 관리 및/또는 개선된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 피험체에게 유효량의 본 발명 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 피험체에게 유효량의 본 발명 항체와 본 발명 항체 이외의 유효량의 다른 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 치료제는 RSV 감염(바람직하게는, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI)의 관리, 치료 및/또는 개선에 유용하다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 관리 및/또는 개선되는 질환은 RSV 감염, 바람직하게는 RSV URI 및/또는 LRI에 기인하거나 이것에 의해 유발되거나 이것과 관련이 있다.
본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 상기 피험체의 혈청 항체 역가가 약 0.1 ㎍/ml∼약 800 ㎍/ml, 예컨대 0.1 ㎍/ml∼500 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml∼250 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml∼100 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml∼50 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml∼25 ㎍/ml, 또는 0.1 ㎍/ml∼10 ㎍/ml가 되도록 적어도 제1 용량의 본 발명 항체를 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 혈청 항체 역가는 0.1 ㎍/ml 이상, 0.2 ㎍/ml 이상, 0.4 ㎍/ml 이상, 0.6 ㎍/ml 이상, 0.8 ㎍/ml 이상, 1 ㎍/ml 이상, 1.5 ㎍/ml 이상, 2 ㎍/ml 이상, 5 ㎍/ml 이상, 10 ㎍/ml 이상, 15 ㎍/ml 이상, 20 ㎍/ml 이상, 25 ㎍/ml 이상, 30 ㎍/ml 이상, 35 ㎍/ml 이상, 40 ㎍/ml 이상, 45 ㎍/ml 이상, 50 ㎍/ml 이상, 55 ㎍/ml 이상, 60 ㎍/ml 이상, 65 ㎍/ml 이상, 70 ㎍/ml 이상, 75 ㎍/ml 이상, 80 ㎍/ml 이상, 85 ㎍/ml 이상, 90 ㎍/ml 이상, 95 ㎍/ml 이상, 100 ㎍/ml 이상, 105 ㎍/ml 이상, 110 ㎍/ml 이상, 115 ㎍/ml 이상, 120 ㎍/ml 이상, 125 ㎍/ml 이상, 130 ㎍/ml 이상, 135 ㎍/ml 이상, 140 ㎍/ml 이상, 145 ㎍/ml 이상, 150 ㎍/ml 이상, 155 ㎍/ml 이상, 160 ㎍/ml 이상, 165 ㎍/ml 이상, 170 ㎍/ml 이상, 175 ㎍/ml 이상, 180 ㎍/ml 이상, 185 ㎍/ml 이상, 190 ㎍/ml 이상, 195 ㎍/ml 이상, 또는 200 ㎍/ml 이상, 250 ㎍/ml 이상, 300 ㎍/ml 이상, 350 ㎍/ml 이상, 400 ㎍/ml 이상, 450 ㎍/ml 이상, 500 ㎍/ml 이상, 550 ㎍/ml 이상, 600 ㎍/ ml 이상, 650 ㎍/ml 이상, 700 ㎍/ml 이상, 750 ㎍/ml 이상, 또는 800 ㎍/ml 이상이다. 일 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 75 ㎍/ml 이하, 약 60 ㎍/ml 이하의 혈청 항체 역가, 약 50 ㎍/ml 이하, 약 45 ㎍/ml 이하, 약 30 ㎍/ml 이하, 바람직하게는 2 ㎍/ml 이상, 더 바람직하게는 4 ㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 6 ㎍/ml의 혈청 항체 역가를 형성한다.
일부 실시형태에서, 전술한 혈청 항체 농도는 피험체에서 제1 용량의 본 발명 항체를 투여한 후 후속 용량을 임의로 투여하기 전 약 12∼24시간 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 전술한 혈청 항체 농도는 피험체에서 제1 용량의 본 발명 항체를 투여한 후 후속 용량을 임의로 투여하기 전 특정 일수 동안 유지되며, 상기 특정 일수는 약 20일∼약 180일(또는 그 이상), 예컨대 20일∼90일, 20일∼60일, 또는 20일∼30일이고, 특정 실시형태에서, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 75일, 적어도 90일, 적어도 105일, 적어도 120일, 적어도 135일, 적어도 150일, 적어도 165일, 적어도 180일 또는 그 이상이다. 특정 실시형태에서, 전술한 혈청 항체 농도를 생성하는 제1 용량의 항체는 약 60 mg/kg 이하, 약 50 mg/kg 이하, 약 45 mg/kg 이하, 약 40 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 20 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 4 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1.0 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하, 또는 약 0.025 mg/kg 이하이다. 일부 실시형태에서, 제1 용량의 본 발명 항체는 전술한 혈청 항체 농도 중 어느 하나를 생성하는 치료적 유효량이다. 일 실시형태에서, 제1 용량의 본 발명 항체는 서방형 제제로 및/또는 비내 또는 폐내 전달에 의해 투여된다.
본 발명은 또한, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 상기 피험체가, 음성 대조군, 예를 들어 위약을 투여받은 피험체에 비해, 또는 제1 용량의 본 발명 항체를 투여하기 전의 피험체의 역가에 비해, 또는 다른 RSV 항체(예를 들어, 팔리비주맙)를 투여받은 피험체에 비해, (당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 측정하였을 때) 감소된 RSV 바이러스 폐내 역가 및/또는 RSV 바이러스 객담 역가를 나타내도록 상기 피험체에게 제1 용량의 본 발명 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 항체가 본 발명의 변형된 항체인 일 실시형태에서, IgG 불변 도메인에 변형을 갖지 않는 동일한 항체를 투여받은 피험체이 비해 RSV 바이러스 폐내 역가 및/또는 RSV 바이러스 객담 역가의 감소가 추가로 관찰될 수 있다.
본 발명은 또한, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 상기 피험체가 약 0.01 ㎍/ml∼약 2.5 ㎍/ml(또는 그 이상)의 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 기관지 폐포 세척액(BAL) 항체 농도를 갖도록 상기 피험체에게 제1 용량의 본 발명 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 BAL 항체 농도는 적어도 0.01 ㎍/ml, 적어도 0.011 ㎍/ml, 적어도 0.012 ㎍/ml, 적어도 0.013 ㎍/ml, 적어도 0.014 ㎍/ml, 적어도 0.015 ㎍/ml, 적어도 0.016 ㎍/ml, 적어도 0.017 ㎍/ml, 적어도 0.018 ㎍/ml, 적어도 0.019 ㎍/ml, 적어도 0.02 ㎍/ml, 적어도 0.025 ㎍/ml, 적어도 0.03 ㎍/ml, 적어도 0.035 ㎍/ml, 적어도 0.04 ㎍/ml, 적어도 0.05 ㎍/ml, 적어도 0.06 ㎍/ml, 적어도 0.07 ㎍/ml, 적어도 0.08 ㎍/ml, 적어도 0.09 ㎍/ml, 적어도 0.1 ㎍/ml, 적어도 0.11 ㎍/ml, 적어도 0.115 ㎍/ml, 적어도 0.12 ㎍/ml, 적어도 0.125 ㎍/ml, 적어도 0.13 ㎍/ml, 적어도 0.135 ㎍/ml, 적어도 0.14 ㎍/ml, 적어도 0.145 ㎍/ml, 적어도 0.15 ㎍/ml, 적어도 0.155 ㎍/ml, 적어도 0.16 ㎍/ml, 적어도 0.165 ㎍/ml, 적어도 0.17 ㎍/ml, 적어도 0.175 ㎍/ml, 적어도 0.18 ㎍/ml, 적어도 0.185 ㎍/ml, 적어도 0.19 ㎍/ml, 적어도 0.195 ㎍/ml, 적어도 0.2 ㎍/ml, 적어도 0.3 ㎍/ml, 적어도 0.4 ㎍/ml, 적어도 0.5 ㎍/ml, 적어도 0.6 ㎍/ml, 적어도 0.7 ㎍/ml, 적어도 0.8 ㎍/ml, 적어도 0.9 ㎍/ml, 적어도 1.0 ㎍/ml, 적어도 1.1 ㎍/ml, 적어도 1.2 ㎍/ml, 적어도 1.3 ㎍/ml, 적어도 1.4 ㎍/ml, 적어도 1.5 ㎍/ml, 적어도 1.6 ㎍/ml, 적어도 1.7 ㎍/ml, 적어도 1.8 ㎍/ml, 적어도 1.9 ㎍/ml, 적어도 2.0 ㎍/ml, 적어도 2.1 ㎍/ml, 적어도 2.2 ㎍/ml, 적어도 2.3 ㎍/ml, 적어도 2.4 ㎍/ml, 적어도 2.5 ㎍/ml 또는 그 이상이다.
일부 실시형태에서, 상기 피험체에서 전술한 비갑개 및/또는 비분비물 항체 농도는 제1 용량의 본 발명 항체를 투여한 후 후속 용량을 임의로 투여하기 전 약 12∼24시간 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 전술한 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 BAL 항체 농도는 제1 용량의 본 발명 항체를 투여한 후 후속 용량을 임의로 투여하기 전 특정 일수 동안 유지되며, 여기서 상기 특정 일수는 약 20일∼약 180일(또는 그 이상)이고, 특정 실시형태에서, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 75일, 적어도 90일, 적어도 105일, 적어도 120일, 적어도 135일, 적어도 150일, 적어도 165일, 적어도 180일 또는 그 이상이다. 특정 실시형태에서, 전술한 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 BAL 항체 농도를 생성하는 제1 용량의 항체는 약 60 mg/kg 이하, 약 50 mg/kg 이하, 약 45 mg/kg 이하, 약 40 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 20 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 4 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1.0 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하, 또는 약 0.025 mg/kg 이하이다. 일부 실시형태에서, 제1 용량의 본 발명 항체는 전술한 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 BAL 항체 농도 중 어느 하나를 생성하는 치료적 유효량이다. 일 실시형태에서, 제1 용량의 본 발명 항체는 서방형 제제로, 및/또는 비내 및/또는 폐내 전달에 의해 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 피험체에서, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 유효량의 본 발명 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 유효량은 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 BAL 중의 RSV 역가를 약 1배, 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배, 약 100배, 약 105배, 약 110배, 약 115배, 약 120배, 약 125배 또는 그 이상 감소시킨다. 음성 대조군(예컨대 위약)에 비해, 또는 다른 치료제(팔리비주맙을 사용한 치료를 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 항체 투여 전 환자의 역가에 비해, 또는 변형된 항체의 경우, 동일한 비변형 항체(예를 들어, 불변 부위 변형 전의 동일한 항체)와 비교할 때 비갑개 및/또는 비분비물 및/또는 BAL 중에 RSV 역가의 배수 감소가 있을 수 있다.
본 발명은, 치료적 유효 혈청 역가를 얻기 위해, 상기도 및/또는 하기도 또는 중이의 RSV를 중화시키는 방법을 제공하며, 여기서, 투여 후 상기 유효 혈청 역가는, 임의의 다른 용량의 투여 없이도, 약 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 60일, 75일, 90일, 105일, 120일, 135일, 150일, 165일, 180일 또는 그 이상 동안 30 ㎍/ml 미만(바람직하게는 약 2 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 4 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 6 ㎍/ml)이다. 본 발명의 항체는 본원에 기재된 것과 같은 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원에 대해 높은 친화력을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 공지된 항원(예를 들어, 팔리비주맙 또는 다른 야생형 항체)에 비해 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 대해 더 높은 친화력을 갖는다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 변형된 항체이고, 바람직하게는 상기 IgG 불변 도메인은 연장된 혈청 반감기 YTE 변형(예를 들어, MEDI-524 YTE)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지된 기법(예를 들어, BIAcore 분석법 또는 Kinexa 분석법)에 의해 측정시, 공지된 항RSV 항체보다 RSV 항원에 대해 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상 더 높은 친화력을 갖는다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지된 기법(예를 들어, BIAcore 분석법 또는 Kinexa 분석법)에 의해 측정시, 팔리비주맙보다 RSV F 항원에 대해 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상 더 높은 친화력을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지된 기법(예를 들어, BIAcore 분석법 또는 Kinexa 분석법)에 의해 측정시, 팔리비주맙보다 RSV F 항원에 대해 65배, 바람직하게는 70배, 또는 그 이상 더 높은 친화력을 갖는다. 이러한 실시형태에 따르면, 일 실시형태에서, 상기 항체의 친화력은 BIAcore 분석법에 의해 측정된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체의 친화력은 Kinexa 분석법에 의해 측정된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 약 105 M-1s-1∼약 108 M-1s-1(또는 그 이상), 특정 실시형태에서 105 M-1s-1 이상, 2×105 M-1s-1 이상, 4×105 M-1s-1 이상, 5×105 M-1s-1 이상, 106 M-1s-1 이상, 5×106 M-1s-1 이상, 107 M-1s-1 이상, 5×107 M-1s-1 이상, 또는 108 M-1s-1 이상의 결합 속도 상수 또는 kon 속도[항체(Ab)+항원 Ag)--kon→ Ab-Ag]를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, kon 속도가 공지된 RSV 항체보다 1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 높다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하고, kon 속도가 팔리비주맙보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 더 높다. 개별 속도 상수 및 친화력 계산의 보다 상세한 설명은 문헌[BIAevaluation Software Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) and Kuby (1994) Immunology, 2nd Ed. (W.H. Freeman & Co., New York, NY)]에서 찾아볼 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, koff 속도(Ab-Ag--Koff→Ab+Ag)가 5×10-1 s-1 미만, 10-1 s-1 미만, 5×10-2 s-1 미만, 10-2 s-1 미만, 5×10-3 s-1 미만, 10-3 s-1 미만, 바람직하게는 5×10-4 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5×10-5 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5×10-6 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5×10-7 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5×10-8 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5×10-9 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5×10-10 s-1 미만, 또는 10-10 s-1 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, koff 속도가 공지된 항RSV 항체보다 1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 더 낮다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, koff 속도가 팔리비주맙보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 더 낮다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 1종 이상의 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하고, kon 속도가 약 105 M-1s-1∼108 M-1s-1(또는 그 이상)이며, 특정 실시형태에서 105 M-1s-1 이상, 바람직하게는 2×105 M-1s-1 이상, 4×105 M-1s-1 이상, 5×105 M-1s-1 이상, 106 M-1s-1 이상, 5×106 M-1s-1 이상, 107 M-1s-1 이상, 5×107 M-1s-1 이상, 또는 108 M-1s-1 이상이며, 또한 koff 속도가 5×10-1 s-1 미만, 10-1 s-1 미만, 5×10-2 s-1 미만, 10-2 s-1 미만, 5×10-3 s-1 미만, 10-3 s-1 미만, 바람직하게는 5×10-4 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 7.5×10-5 s-1 미만, 5×10-5 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5×10-6 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5×10-7 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5×10-8 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5×10-9 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5×10-10 s-1 미만, 10-10 s-1 미만이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 kon 속도가 팔리비주맙보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 또는 약 5배 더 높다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 koff 속도가 팔리비주맙보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 또는 약 5배 더 낮다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 친화성 상수 또는 Ka(kon/koff)가 약 102 M-1∼약 5×1015 M-1이며, 특정 실시형태에서 102 M-1 이상, 5×102 M-1 이상, 103 M-1 이상, 5×103 M-1 이상, 104 M-1 이상, 5×104 M-1 이상, 105 M-1 이상, 5×105 M-1 이상, 106 M-1 이상, 5×106 M-1 이상, 107 M-1 이상, 5×107 M-1 이상, 108 M-1 이상이고, 바람직하게는 5×108 M-1 이상, 109 M-1 이상, 5×109 M-1, 이상, 1010 M-1, 5×1010 M-1 이상, 1011 M-1 이상, 5×1011 M-1 이상, 1012 M-1 이상, 5×1012 M-1 이상, 1013 M-1 이상, 5×1013 M-1 이상, 1014 M-1 이상, 5×1014 M-1 이상, 1015 M-1 이상, 또는 5×1015 M-1 이상이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 해리 상수 또는 Kd(koff/kon)가 5×10-2 M 미만, 10-2 M 미만, 5×10-3 M 미만, 10-3 M 미만, 5×10-4 M 미만, 10-4 M 미만, 5×10-5 M 미만, 10-5 M 미만, 5×10-6 M 미만, 10-6 M 미만, 5×10-7 M 미만, 10-7 M 미만, 5×10-8 M 미만, 10-8 M 미만, 5×10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 5×10-10 M 미만, 10-10 M 미만, 5×10-11 M 미만, 10-11 M 미만, 5×10-12 M 미만, 10-12 M 미만, 5×10-13 M 미만, 10-13 M 미만, 5×10-14 M 미만, 10-14 M 미만, 5×10-15 M 미만, 10-15 M 미만, 또는 5×10-16 M 미만이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 알려진 기법(예를 들어, BIAcore 분석법)을 이용하여 측정시, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 해리 상수(Kd)가 3,000 pM 미만, 2,500 pM 미만, 2,000 pM 미만, 1,500 pM 미만, 1,000 pM 미만, 750 pM 미만, 500 pM 미만, 250 pM 미만, 200 pM 미만, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 75 pM 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 알려진 기법(예를 들어, BIAcore 분석법 또는 Kinexa 분석법)을 이용하여 측정시, 해리 상수(Kd)가 25∼3,400 pM, 25∼3,000 pM, 25∼2,500 pM, 25∼2,000 pM, 25∼1,500 pM, 25∼1,000 pM, 25∼750 pM, 25∼500 pM, 25∼250 pM, 25∼100 pM, 25∼75 pM, 25∼50 pM이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 알려진 기법(예를 들어, BIAcore 분석법 또는 Kinexa 분석법)을 이용하여 측정시, 해리 상수(Kd)가 500 pM, 바람직하게는 100 pM, 더 바람직하게는 75 pM, 가장 바람직하게는 50 pM이다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 공지된 항체, 예를 들어 팔리비주맙보다 높은 친화력 및/또는 높은 결합력으로 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 본 발명 항체(예를 들어, 1종 이상의 RSV 항원에 대해 약 2×108 M-1∼약 5×1012 M-1(또는 그 이상), 바람직하게는 2×108 M-1 이상, 2.5×108 M-1 이상, 5×108 M-1 이상, 109 M-1 이상, 5×109 M-1 이상, 1010 M-1 이상, 5×1010 M-1 이상, 1011 M-1 이상, 5×1011 M-1, 이상, 1012 M-1 이상, 또는 5×1012 M-1 이상의 친화력을 갖는 항체 또는 항체 단편)를 포함하는 조성물을 (예를 들어, 폐내 전달 또는 비내 전달에 의해) 상기 피험체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
IC50은 시험관내 마이크로중화 분석에서 RSV의 50%를 중화시키는 항체의 농도이다. 특정 실시형태에서, 상기 마이크로중화 분석은 본원에 기재되어 있거나 문헌[Johnson et al., 1999, J. Infectious Diseases 180:35-40]에 기재된 마이크로중화 분석이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 시험관내 마이크로중화 분석법으로 측정시 중간 억제 농도(IC50)가 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1.75 nM 미만, 1.5 nM 미만, 1.25 nM 미만, 1 nM 미만, 0.75 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.25 nM 미만, 0.1 nM 미만, 0.05 nM 미만, 0.025 nM 미만, 또는 0.01 nM 미만이다.
따라서, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 변형된 항체의 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형으로 인해 공지된 항RSV 항체에 비해 증가된 생체내 반감기를 갖는 변형된 항체의 용도를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 높은 친화력 및/또는 높은 결합력으로 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하고, 변형된 IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 항체의 용도를 포함하며, 상기 변형된 IgG 불변 도메인은, 변형된 IgG 도메인을 포함하지 않는 동일한 항체 또는 다른 RSV 항체, 예컨대 팔리비주맙의 Fc 도메인에 비해 FcRn에 대한 변형된 IgG 불변 도메인의 친화성을 증가시키는 결과를 초래한다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 변형된 항체의 Fc 도메인의 증가된 친화력은 상기 변형된 항체의 Fc 도메인의 생체내 반감기가 약 20일∼약 180일(또는 그 이상)이 되게 하고, 일부 실시형태에서 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 75일, 적어도 90일, 적어도 105일, 적어도 120일, 적어도 135일, 적어도 150일, 적어도 165일, 적어도 180일 또는 그 이상이 되게 한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 변형된 항체는 VH 및 VL CDR, MEDI-524의 도메인 또는 사슬, 또는 그 항원 결합성 단편 및 예를 들어 팔리비주맙의 Fc 도메인에 비해 FcRn 수용체에 대한 증가된 친화력을 갖는 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명의 실시형태는 이하의 것들을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다:
1. RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 변형된 항체로서, 표 1에 기재된 것과 같은, A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, Ll-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, 또는 A4B4(1)의 VH CDR 1, 2 및 3 및 VL CDR 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 3개의 가변 중쇄 상보성 결정 부위(VH CDR) 및 3개의 가변 경쇄 CDR(VL CDR)을 포함하고, 상기 변형된 항체는 야생형 인간 IgG Fc 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG Fc 도메인을 가지며, 상기 아미노산 치환에 의해, 상기 아미노산 치환을 갖지 않는 야생형 항체와 비교할 때 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 변경된 결합 친화력을 포함하는 변형된 항체가 생성되는 것인 변형된 항체.
2. 상기 변형된 항체가, 표 1에 기재된 것과 같은, A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, 또는 A4B4(1)의 VH 도메인 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 것인 실시형태 1의 변형된 항체.
3. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 332E의 아미노산 치환을 포함하는 것인 실시형태 1의 변형된 항체.
4. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 239D 및 330L의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 실시형태 3의 변형된 항체.
5. 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 234E, 235R, 235A, 235W, 235P, 235V, 235Y, 236E, 239D, 265L, 269S, 269G, 298I, 298T, 298F, 327N, 327G, 327W, 328S, 328V, 329H, 329Q, 330K, 330V, 330G, 330Y, 330T, 330L, 330I, 330R, 330C, 332E, 332H, 332S, 332W, 332F, 332D 및 332Y로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 1의 변형된 항체.
6. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 331S의 아미노산 치환을 포함하는 것인 실시형태 1의 변형된 항체.
7. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 234F 및 235E의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 실시형태 6의 변형된 항체.
8. 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 233P, 234V, 235A, 265A, 327G 및 330S로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 1의 변형된 항체.
9. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이 야생형 인간 IgG Fc 도메인에 비해 추가의 아미노산 치환을 더 포함하고, 상기 추가의 아미노산 치환에 의해, 이 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 야생형 항체와 비교할 때 연장된 혈청 반감기를 갖는 변형된 항체가 생성되는 것인 실시형태 3 내지 7 중 어느 하나의 변형된 항체.
10. 상기 추가의 아미노산 치환이 251번, 252번, 254번, 255번, 256번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 385번, 386번, 387번, 389번, 428번, 433번, 434번 및 436번 아미노산 잔기 중 하나 이상에 위치하고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 9의 변형된 항체.
11. 상기 추가의 아미노산 치환이 251번 위치에서의 루신에 의한 치환, 252번 위치에서의 타이로신, 트립토판 또는 페닐알라닌에 의한 치환, 254번 위치에서의 트레오닌 또는 세린에 의한 치환, 255번 위치에서의 아르기닌에 의한 치환, 256번 위치에서의 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 글루타메이트에 의한 치환, 308번 위치에서의 트레오닌에 의한 치환, 309번 위치에서의 프롤린에 의한 치환, 311번 위치에서의 세린에 의한 치환, 312번 위치에서의 아스파테이트에 의한 치환, 314번 위치에서의 루신에 의한 치환, 385번 위치에서의 아르기닌, 아스파테이트 또는 세린에 의한 치환, 386번 위치에서의 트레오닌 또는 프롤린에 의한 치환, 387번 위치에서의 아르기닌 또는 프롤린에 의한 치환, 389번 위치에서의 프롤린, 아스파라긴 또는 세린에 의한 치환, 428번 위치에서의 메티오닌 또는 트레오닌에 의한 치환, 434번 위치에서의 타이로신 또는 페닐알라닌에 의한 치환, 433번 위치에서의 히스티딘, 아르기닌, 라이신 또는 세린에 의한 치환, 또는 436번 위치에서의 히스티딘, 타이로신, 아르기닌 또는 트레오닌에 의한 치환이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 10의 변형된 항체.
12. 상기 추가의 아미노산 치환이 252번 위치에서의 타이로신에 의한 치환, 254번 위치에서의 트레오닌에 의한 치환 및 256번 위치에서의 글루타메이트에 의한 치환이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 11의 변형된 항체.
13. 멸균 담체 중에 실시형태 1, 3, 6 또는 9의 변형된 항체를 포함하는 조성물.
14. RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료를 요하는 상기 환자에게 치료적 유효량의 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
15. 상기 치료적 유효량이 약 100 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 및 약 0.025 mg/kg으로 구성된 군에서 선택되는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
16. 상기 인간 환자가 골수 이식을 받았거나, 낭포성 섬유증, 기관지 폐 이형성증, 선천성 심장병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선천성 면역결핍증 또는 후천성 면역결핍증이 앓고 있는 자인 실시형태 14의 치료 방법.
17. 상기 인간 환자가 유아, 미숙아로 태어난 유아, RSV 감염으로 인해 병원 치료를 받은 유아, 또는 천식 및/또는 반응성 기도 질환(RAD) 및/또는 천명의 소인이 있는 유아, 또는 0∼5세 소아인 실시형태 14의 치료 방법.
18. 상기 인간 환자가 노인, 또는 요양소에서 생활하는 인간인 실시형태 14의 치료 방법.
19. 상기 조성물을 비내 전달, 근육내 전달, 피내 전달, 복강내 전달, 정맥내 전달, 피하 전달, 경구 전달, 폐내 전달 또는 이들의 조합에 의해 상기 인간 환자에게 투여하는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
20. 상기 조성물을 RSV 시즌 동안 5회, 4회, 3회, 2회 또는 1회 상기 환자에게 투여하는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
21. 바이러스 발산으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 RSV 복제를 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 억제하거나 하향 조절하는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
22. 생물학적 분석법으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 사이토카인의 혈청 수치를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소시키는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
23. 생물학적 분석법으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 케모카인 방출의 혈청 수치를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소시키는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
24. 표 1에 기재된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 CDR 및 이종성 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 치료 방법.
25. 상기 변형된 항체의 치료적 투여를, M.O.I 약 0.1의 RSV 바이러스 부하를 나타낸 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 48시간 후 비내 투여로 실시하는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
26. 상기 변형된 항체의 치료적 투여를, M.O.I 약 0.01의 RSV 바이러스 부하를 나타낸 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 24시간 또는 48시간 후 비내 투여로 실시하는 것인 실시형태 25의 치료 방법.
27. 상기 변형된 항체가, 표 1에 기재된 것과 같은, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493LER, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, 또는 A4B4-F52S의 VH 도메인 및 VL 도메인 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 동일한 것인 실시형태 14의 치료 방법.
28. 상기 변형된 항체가 표 1에 기재된 VH CDR 중 어느 것과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 또는 99% 이상 동일한 하나 이상의 VH CDR의 아미노산 서열을 포함하는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
29. 상기 변형된 항체가 표 1에 기재된 VL CDR 중 어느 것과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 동일한 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 것인 실시형태 14의 치료 방법.
30. 상기 변형된 항체가 Fab'2 단편인 전술한 실시형태 중 어느 하나의 치료 방법.
31. RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하고,
(a) (1) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 도메인,
(2) 서열 번호 254의 아미노산 서열을 갖는 VH 쇄;
(3) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1;
(4) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 서열;
(5) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3;
(6) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 서열;
(7) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3;
(8) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 서열 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 또는
(9) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 서열 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3
을 포함하는 중쇄; 및/또는
(b) (1) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 도메인,
(2) 서열 번호 255의 아미노산 서열을 갖는 VL 쇄;
(3) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1;
(4) 서열 번호 39의 아미노산 서열 갖는 VL CDR1 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2;
(5) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 또는
(6) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3
을 포함하는 경쇄를 포함하는 변형된 항체로서,
(c) 상기 변형된 항체가 야생형 인간 IgG Fc 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG Fc 도메인을 가지고, 상기 아미노산 치환에 의해, 이 아미노산 치환을 갖지 않는 야생형 항체에 비해 하나 이상의 FcR에 대한 변경된 결합 친화력을 포함하는 변형된 이펙터 기능을 갖는 변형된 항체가 생성되는 것인 변형된 항체.
32. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 332E의 아미노산 치환을 포함하는 것인 실시형태 31의 변형된 항체.
33. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 239D 및 330L의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 실시형태 32의 변형된 항체.
34. 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 234E, 235R, 235A, 235W, 235P, 235V, 235Y, 236E, 239D, 265L, 269S, 269G, 298I, 298T, 298F, 327N, 327G, 327W, 328S, 328V, 329H, 329Q, 330K, 330V, 330G, 330Y, 330T, 330L, 330I, 330R, 330C, 332E, 332H, 332S, 332W, 332F, 332D 및 332Y로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 31의 변형된 항체.
35. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 331S의 아미노산 치환을 포함하는 것인 실시형태 31의 변형된 항체.
36. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 234F 및 235E의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 실시형태 35의 변형된 항체.
37. 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 233P, 234V, 235A, 265A, 327G 및 330S로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템이 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 31의 변형된 항체.
38. 상기 변형된 IgG Fc 도메인이 야생형 인간 IgG Fc 도메인에 비해 추가의 아미노산 치환을 더 포함하고, 상기 추가의 아미노산 치환에 의해, 이 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 야생형 항체과 비교할 때 연장된 혈청 반감기를 갖는 변형된 항체가 생성되는 것인 실시형태 31 내지 37 중 어느 하나의 변형된 항체.
39. 상기 추가의 아미노산 치환이 251번, 252번, 254번, 255번, 256번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 385번, 386번, 387번, 389번, 428번, 433번, 434번 및 436번 아미노산 잔기 중 하나 이상에 위치하고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 38의 변형된 항체.
40. 상기 추가의 아미노산 치환이 251번 위치에서의 루신에 의한 치환, 252번 위치에서의 타이로신, 트립토판 또는 페닐알라닌에 의한 치환, 254번 위치에서의 트레오닌 또는 세린에 의한 치환, 255번 위치에서의 아르기닌에 의한 치환, 256번 위치에서의 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 글루타메이트에 의한 치환, 308번 위치에서의 트레오닌에 의한 치환, 309번 위치에서의 프롤린에 의한 치환, 311번 위치에서의 세린에 의한 치환, 312번 위치에서의 아스파테이트에 의한 치환, 314번 위치에서의 루신에 의한 치환, 385번 위치에서의 아르기닌, 아스파테이트 또는 세린에 의한 치환, 386번 위치에서의 트레오닌 또는 프롤린에 의한 치환, 387번 위치에서의 아르기닌 또는 프롤린에 의한 치환, 389번 위치에서의 프롤린, 아스파라긴 또는 세린에 의한 치환, 428번 위치에서의 메티오닌 또는 트레오닌에 의한 치환, 434번 위치에서의 타이로신 또는 페닐알라닌에 의한 치환, 433번 위치에서의 히스티딘, 아르기닌, 라이신 또는 세린에 의한 치환, 또는 436번 위치에서의 히스티딘, 타이로신, 아르기닌 또는 트레오닌에 의한 치환이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 39의 변형된 항체.
41. 상기 추가의 아미노산 치환이 252번 위치에서의 타이로신에 의한 치환, 254번 위치에서의 트레오닌에 의한 치환 및 256번 위치에서의 글루타메이트에 의한 치환이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 실시형태 40의 변형된 항체.
42. 상기 변형된 항체의 반감기가 252번 위치의 타이로신, 254번 위치의 트레오닌 및 256번 위치의 글루탐산을 갖지 않는 IgG Fc 도메인을 포함하는 동일한 항체와 비교할 때 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배 연장되는 것인 실시형태 41의 변형된 항체.
43. 상기 항체의 결합 속도(kon)가 약 2×105 M-1s-1 이상인 실시형태 1, 8, 31 또는 38의 변형된 항체.
44. kon이 약 7.5×105 s-1 이상인 실시형태 43의 변형된 항체.
45. 상기 항체의 해리 속도(koff)가 약 5×10-4 s-1 미만인 실시형태 1, 8, 31 또는 38의 변형된 항체.
46. 상기 항체의 해리 상수(Kd)가 약 1000 pM 미만인 실시형태 1, 8, 31 또는 38의 변형된 항체.
47. 상기 항체의 결합 상수(Ka)가 약 109 M-1 이상인 실시형태 1, 8, 31 또는 38의 변형된 항체.
48. 멸균 담체 중에 실시형태 31 내지 47 중 어느 하나의 변형된 항체를 포함하는 조성물.
49. RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료를 요하는 상기 환자에게 실시형태 31 내지 48 중 어느 하나의 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
50. 상기 치료적 유효량이 약 100 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 및 약 0.025 mg/kg으로 구성된 군에서 선택되는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
51. 상기 인간 환자가 골수 이식을 받았거나, 낭포성 섬유증, 기관지 폐 이형성증, 선천성 심장병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선천성 면역결핍증 또는 후천성 면역결핍증을 앓고 있는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
52. 상기 인간 환자가 유아, 미숙아로 태어난 유아, RSV 감염으로 인해 병원 치료를 받은 유아, 또는 천식 및/또는 반응성 기도 질환(RAD) 및/또는 천명의 소인이 있는 유아, 및/또는 0∼5세 소아인 실시형태 49의 치료 방법.
53. 상기 인간 환자가 고령의 인간, 또는 요양소에서 생활하는 인간인 실시형태 49의 치료 방법.
54. 상기 조성물을 상기 인간 환자에게 비내 전달, 근육내 전달, 피내 전달, 복강내 전달, 정맥내 전달, 피하 전달, 경구 전달, 폐내 전달 또는 이들의 조합에 의해 투여하는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
55. 상기 조성물을 RSV 시즌 동안 상기 환자에게 5회, 4회, 3회, 2회 또는 1회 투여하는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
56. 바이러스 발산으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 RSV 복제를 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 억제하거나 하향조절하는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
57. 생물학적 분석법으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 사이토카인의 혈청 수치를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소시키는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
58. 생물학적 분석법으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 케모카인 방출의 혈청 수치를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소시키는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
59. RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 표 1에 기재된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 CDR 및 이종성 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
60. 상기 변형된 항체의 치료적 투여를, M.O.I 약 0.1의 RSV 바이러스 부하를 나타내는 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 12시간 또는 24시간 후 비내 투여로 실시하는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
61. 상기 변형된 항체의 치료적 투여를, M.O.I 약 0.01의 RSV 바이러스 부하를 나타내는 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 48시간 후 비내 투여로 실시하는 것인 실시형태 49의 치료 방법.
62. RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료를 요하는 상기 환자에게, 표 1에 기재된 것과 같은, A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, 또는 A4B4(1)의 아미노산 서열을 갖는 3개의 가변 중쇄 상보성 결정 부위(VH CDR) 및 3개의 가변 경쇄 CDR(VL CDR)을 포함하는 F(ab)' 단편을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 투여는 폐내 투여이고 RSV 시즌 동안 실시되는 것인 치료 방법.
63. 상기 인간 환자가 성인 또는 고령 환자인 실시형태 62의 치료 방법.
64. 치료적 유효량의 상기 F(ab)' 단편 또는 위약을 투여받지 않은 유사한 환자에 비해 상기 환자에 있어서 COPD로 인한 상기 환자의 병원 치료가 완화 또는 방지되는 것인 실시형태 63의 치료 방법.
65. 상기 인간 환자의 병원 치료 기간이 위약을 투여받거나 상기 항체의 치료적 투여를 받지 않은 인간에 비해 60% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 감소되는 것인 실시형태 14 또는 49의 치료 방법.
5.1 항체
RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에 공지되어 있음이 인식되어야 한다. 예를 들어, 팔리비주맙은 소아과 환자에 있어서 RSV 감염을 예방하는 데 현재 사용되고 있는 인간화 단일클론 항체이다. 본 발명은, 표 1에 기재된 본 발명의 변형된 항RSV 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 유효량을 피험체에 투여함으로써, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 변형된 항RSV의 유효량을 피험체에 투여함으로써, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법으로서, 상기 항체가 변형된 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 상기 변형된 항체는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 치환일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 234E, 235R, 235A, 235W, 235P, 235V, 235Y, 236E, 239D, 265L, 269S, 269G, 298I, 298T, 298F, 327N, 327G, 327W, 328S, 328V, 329H, 329Q, 330K, 330V, 330G, 330Y, 330T, 330L, 330I, 330R, 330C, 332E, 332H, 332S, 332W, 332F, 332D 및 332Y이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 이러한 Fc 도메인 아미노산 치환은 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때 ADCC(3M)의 증가를 포함한다. 3M에 대한 구체적인 실시형태는 239D, 330L 및 332E를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 233P, 234F, 234V, 235A, 235E, 265A, 327G, 330S 및 331S로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 이러한 Fc 도메인 아미노산 치환은 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때 ADCC(TM)의 감소를 포함한다. TM에 대한 구체적인 실시형태는 234F, 235E 및 331S를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은, 3M 및 TM에 대해 기재된 것 이외에도, 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 위치에서의 아미노산 치환과 함께 존재하며, 여기서 넘버링은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스에 따른 것이다. 이러한 Fc 도메인 조합 아미노산 치환은 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때 생체내 반감기 증가를 보이면서 ADCC(3M)의 증가를 보이는 변형된 항체, 생체내 반감기 증가를 보이면서 ADCC(TM)의 감소를 보이는 변형된 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, IgG 불변 도메인은 239D, 330L, 332E, 252Y, 254T 및 256E를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 도메인은 234F, 235E, 331S, 252Y, 254T 및 256E를 포함한다.
본 발명은 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 (변형된) 항체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 RSV 균주에 관계없이 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 다른 RSV 균주 유래의 항원에 비해 한 RSV 균주 유래의 항원에 차별적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV F 당단백질, G 당단백질 또는 SH 단백질에 면역 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV F 당단백질에 면역 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV F 당단백질의 A, B 또는 C 항원 부위에 결합한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다중 특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, 낙타화 항체, 단일쇄 Fv(scFv) 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드 결합 Fv(sdFv) 인트라바디 및 항이디오타입(항Id) 항체(예를 들어, 본 발명 항체에 대한 항Id 항체) 및 상기 항체 중 어느 하나의 에피토프 결합성 단편을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 특히, 본 발명의 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합성 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체(변형된 항체)는 IgG 항체, 바람직하게는 IgG1이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 IgA 항체가 아니다.
본 발명의 항체는 조류 및 포유동물(예를 들어, 인간, 쥐과 동물, 당나귀, 양, 토끼, 기니 피그, 낙타, 말 또는 닭)을 비롯한 임의의 동물로부터 기원하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 또는 인간화 단일클론 항체이다. 본원에서 사용될 때, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리되거나 또는 인간 유전자로부터 항체를 발현하는 마우스로부터 단리된 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 그 이상의 다중 특이적 항체일 수 있다. 다중 특이적 항체는 RSV 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 RSV 폴리펩티드뿐만 아니라 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 재료에도 특이적일 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 및 WO 92/05793; 문헌[Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69(1991)]; 미국 특허 제4,474,893호, 제4,714,681호, 제4,925,648호, 제5,573,920호 및 제5,601,819호; 및 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]을 참조할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 분석법에서 높은 효능을 나타내는 항체를 제공한다. 고효능 항체는 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제60/168,426호, 제60/186,252호, 미국 특허 출원 공개 공보 제2002/0098189호 및 미국 특허 제6,656,467호(이들은 본원에서 그 전체를 참고로 포함함)에 개시된 방법 및 본원에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 고효능 항체는 적절한 항체 유전자 서열을 유전자 조작하여 적절한 숙주에서 그 항체 서열을 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 제조된 항체는, BIAcore 분석법으로, 예를 들어 높은 kon 값을 갖는 항체를 확인하기 위해 스크리닝할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기재된 분석법(예를 들어, BIAcore 분석법)으로 측정시, 팔리비주맙 또는 그 항원 결합성 단편보다 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 대해 약 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상 더 높은 친화력을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기재된 분석법으로 측정시 팔리비주맙 또는 그 항원 결합성 단편보다 약 1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 더 높은 Ka를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 시험관내 마이크로중화 분석법에서 팔리비주맙 또는 그 항원 결합성 단편보다 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 또는 그 이상 더 높은 효능을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 마이크로중화 분석법은 본원에 기재되어 있거나 문헌[Johnson et al., 1999, J. Infectious Diseases 180:35-40]에 기재되어 있는 마이크로중화 분석법이다. 팔리비주맙의 아미노산 서열은, 예를 들어 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Johnson et al., 1997, J. Infectious Disease 176:1215-1224]에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 서열 번호 7의 VH 도메인(또는 서열 번호 208의 VH 쇄) 및/또는 서열 번호 8의 VL 도메인(또는 서열 번호 209의 VL 쇄)을 포함하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 서열 번호 7의 VH 도메인(또는 서열 번호 208의 VH 쇄) 및/또는 서열 번호 8의 VL 도메인(또는 서열 번호 209의 VL 쇄)을 포함하는 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 서열 번호 7의 VH 도메인(또는 서열 번호 208의 VH 쇄) 및/또는 서열 번호 8의 VL 도메인(또는 서열 번호 209의 VL 쇄)을 포함하는 변형된 항체 또는 변형된 팔리비주맙 항체이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 변형된 항체로서, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5, 및/또는 A17h4(표 1 참조)의 CDR 중 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 상기 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 MEDI-524의 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 제공하며, 상기 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5 및/또는 A17h4의 VH CDR 및/또는 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR 및/또는 VL CDR의 조합을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하며, 상기 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는, MEDI-524(예를 들어, 표 1에 기재된 A4B4L1FR-S28R)의 VH CDR 및/또는 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR 및/또는 VL CDR의 조합을 포함한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 10 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 2, 서열 번호 19, 서열 번호 25, 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 45, 서열 번호 305 또는 서열 번호 329의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 3, 서열 번호 12, 서열 번호 20, 서열 번호 29, 서열 번호 79 또는 서열 번호 311의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 10 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 2, 서열 번호 19, 서열 번호 25, 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 45, 서열 번호 305 또는 서열 번호 329의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 3, 서열 번호 12, 서열 번호 20, 서열 번호 29, 서열 번호 79 또는 서열 번호 311의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 항체는 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 VH 도메인의 아미노산 서열은
Figure pct00005
(서열 번호 48)이며, 여기서 밑줄 친 3개 부위는 각각 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 부위를 나타내고; 밑줄 안친 4개 부위는 각각 VH FR1, FR2, FR3, FR4와 서로 관련이 있으며; 별표(*)는 팔리비주맙의 VH FR4(서열 번호 7)와 비교할 때 VH FR4에 있어서의 A→Q 돌연변이의 위치를 나타낸다. 상기 VH 도메인(서열 번호 48)은 본원의 다른 곳에 기재된 MEDI-524 항체의 것과 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 VH FR은 표 1에 기재된 VH CDR 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 MEDI-524 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는, 문헌[Johnson et al. (1997), J. Infect. Dis. 176, 1215-1224]에 기재된 VH 도메인(서열 번호 48) 및 C-감마-1(nG1m) 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 208의 아미노산 서열을 갖는 VH 쇄 및/또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 254의 아미노산 서열을 갖는 VH 쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 Fc 변형 항체는 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 22, 서열 번호 31, 서열 번호 39, 서열 번호 47, 서열 번호 72, 서열 번호 314, 서열 번호 320 또는 서열 번호 335의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 5, 서열 번호 15, 서열 번호 23, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 43, 서열 번호 50, 서열 번호 53, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 63, 서열 번호 66, 서열 번호 69, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 308, 서열 번호 315, 서열 번호 321, 서열 번호 326, 서열 번호 332 또는 서열 번호 336의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 6, 서열 번호 16 또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 22, 서열 번호 31, 서열 번호 39, 서열 번호 47, 서열 번호 72, 서열 번호 314, 서열 번호 320 또는 서열 번호 335의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5, 서열 번호 15, 서열 번호 23, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 43, 서열 번호 50, 서열 번호 53, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 63, 서열 번호 66, 서열 번호 69, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 308, 서열 번호 315, 서열 번호 321, 서열 번호 326, 서열 번호 332 또는 서열 번호 336의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6, 서열 번호 16 또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VLCDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 대해 높은 친화력을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열은
Figure pct00006
(서열 번호 11)이며, 여기서 밑줄 친 3개 부분은 각각 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 부위를 나타내고; 밑줄 안친 4개 부위는 각각 VL FR1, FR2, FR3, FR4와 서로 관련이 있으며; 별표(*)는 팔리비주맙의 VL FR4와 비교할 때 VL FR4에 있어서의 L→V 돌연변이의 위치를 나타낸다. 상기 VL 도메인(서열 번호 11)은 본원의 다른 곳에 기재된 MEDI-524 항체의 것과 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 VL FR 골격구조는 표 1에 기재된 VL CDR 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 MEDI-524 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는, 문헌[Johnson et al. (1997), J. Infect. Dis. 176, 1215-1224]에 기재된 VL 도메인(서열 번호 209) 및 C-카파 불변 도메인을 포함하며, 상기 항체는 변형된 IgG, 예컨대 변형된 IgG1, 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 209의 아미노산 서열을 갖는 VL 쇄 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 갖는 VL 쇄 및/또는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체는 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 17, 서열 번호 24, 서열 번호 28, 서열 번호 33, 서열 번호 36, 서열 번호 40, 서열 번호 44, 서열 번호 48, 서열 번호 51, 서열 번호 55, 서열 번호 67, 서열 번호 78, 서열 번호 304, 서열 번호 310, 서열 번호 317, 서열 번호 323 또는 서열 번호 328의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 8, 서열 번호 13, 서열 번호 21, 서열 번호 26, 서열 번호 30, 서열 번호 34, 서열 번호 38, 서열 번호 42, 서열 번호 46, 서열 번호 49, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 307, 서열 번호 313, 서열 번호 319, 서열 번호 325, 서열 번호 331 또는 서열 번호 334의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 상기 본 발명의 Fc 변형 항체는 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 대해 높은 친화력 및/또는 높은 결합력을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 10 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1 및 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 22, 서열 번호 31, 서열 번호 39, 서열 번호 47, 서열 번호 314, 서열 번호 320 또는 서열 번호 335의 서열을 갖는 VL CDR1을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 10 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 VH VDR1 및 서열 번호 5, 서열 번호 15, 서열 번호 23, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 43, 서열 번호 50, 서열 번호 53, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 63, 서열 번호 66, 서열 번호 69, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 308, 서열 번호 315, 서열 번호 321, 서열 번호 326, 서열 번호 332 또는 서열 번호 336의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 10 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1 및 서열 번호 6, 서열 번호 16 또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 항체는 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 2, 서열 번호 19, 서열 번호 25, 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 45, 서열 번호 305 또는 서열 번호 329의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 22, 서열 번호 31, 서열 번호 39, 서열 번호 47, 서열 번호 314, 서열 번호 320 또는 서열 번호 335의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 2, 서열 번호 19, 서열 번호 25, 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 45, 서열 번호 305 또는 서열 번호 329의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 5, 서열 번호 15, 서열 번호 23, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 43, 서열 번호 50, 서열 번호 53, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 63, 서열 번호 66, 서열 번호 69, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 308, 서열 번호 315, 서열 번호 321, 서열 번호 326, 서열 번호 332 또는 서열 번호 336의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 2, 서열 번호 19, 서열 번호 25, 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 45, 서열 번호 305 또는 서열 번호 329의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 6, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 61의 서열을 갖는 VL CDR2을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 항체는 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 3, 서열 번호 12, 서열 번호 20, 서열 번호 29, 서열 번호 79 또는 서열 번호 311의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 및 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 22, 서열 번호 31, 서열 번호 39, 서열 번호 47, 서열 번호 314, 서열 번호 320 또는 서열 번호 335의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 3, 서열 번호 12, 서열 번호 20, 서열 번호 29, 서열 번호 79 또는 서열 번호 311의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 및 서열 번호 5, 서열 번호 15, 서열 번호 23, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 43, 서열 번호 50, 서열 번호 53, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 63, 서열 번호 66, 서열 번호 69, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 308, 서열 번호 315, 서열 번호 321, 서열 번호 326, 서열 번호 332 또는 서열 번호 336의 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변형 항체는 서열 번호 3, 서열 번호 12, 서열 번호 20, 서열 번호 29, 서열 번호 79 또는 서열 번호 311의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 및 서열 번호 6, 서열 번호 16 또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 항체는 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체를 제공하며, 상기 Fc 변형된 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 및 VL CDR의 유도체를 포함한다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는, 표 1에 기재된 팔리비주맙, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5 또는 A17h4의 유도체를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한, 당업자에게 알려진 골격구조 부위를 포함하는 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체(예를 들어, 인간 또는 비인간 단편)을 제공한다. 상기 골격구조 부위는 천연의 부위 또는 공통 골격구조 부위일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명 항체의 골격구조 부위는 인간의 것이다(본원에 참고로 포함하는 문헌[Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 for listing of human framework regions] 참조). 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 MEDI-524의 골격구조 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체로서, 표 1에 기재된 항체의 CDR 중 하나 이상(즉, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5, 또는 A17h4 및/또는 표 1의 CDR 중 하나 이상)과, 하기 잔기, 즉, (a) 쥐과동물 항체 골격구조(즉, 도너 항체 골격구조)와 인간 항체 골격구조(즉, 억셉터 항체 골격구조) 간에 상이한 희소 골격구조 잔기; (b) 도너 항체 골격구조와 억셉터 항체 골격구조 간에 상이한 베니어(venier) 부위 잔기; (c) 도너 항체 골격구조와 억셉터 항체 골격구조 간에 상이한 VH/VL 계면에 있는 사슬간 팩킹 잔기; (d) 도너 항체 골격구조와 억셉터 항체 골격구조, 특히 쥐과동물 항체 CDR 루프의 캐논형(canonical) 클래스의 정의에 중요한 골격구조 영역 서열 간에 상이한 캐논형 잔기; (e) CDR에 인접한 잔기; (g) 항원과 상호작용할 수 있는 잔기; (h) CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 및 (i) VH 도메인과 VL 도메인 사이의 접촉 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 그 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 인간 골격구조 부위의 아미노산을 포함하는 항체를 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기에 언급된 항체는, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함한다.
본 발명은 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체로서, 골격구조 부위에 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환)를 갖는 표 1에 기재된 AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5 또는 A17h4의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 또는 그 항원 결합성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 특정 실시형태에서, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체는 VH 및/또는 VL 도메인의 골격구조 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 표 1에 기재된 AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5 또는 A17h4의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 또는 그 항원 결합성 단편의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 1종 이상의 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 항체로서, 골격구조 부위에 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환)를 갖는 MEDI-524의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체는 VH 및/또는 VL 도메인의 골격구조 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는 Fc 도메인 또는 힌지-Fdc 도메인)에 하나 이상의 변형을 갖는 MEDI-524의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 Fc 변형 항체로서, 과가변 부위 및 골격구조 부위에 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환)을 갖는 표 1에 기재된 항체(즉, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5, 또는 A17h4)의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 바람직하게는, 과가변 부위 및 골격구조 부위에서의 아미노산 치환은 RSV 항원에 대한 항체의 결합을 향상시킨다.
본 발명은 또한 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체와 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체가 융합되는 이종성 폴리펩티드는 호흡기 상피 세포에 상기 항체를 표적화하는 데 유용하다.
5.1.1 항체 Fc 부위의 변형
본 발명은 Fc 부위에 변형을 갖는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 변형된 항체를 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 변형된 항체의 생체내 반감기는, 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지된 방법(실시예 6.17 참조)을 이용하여 측정할 때, IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편에 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 동일한 항체에 비해 증가된다. 일부 실시형태에서, 상기 변형된 항체의 생체내 반감기는, IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편에 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 동일한 항체에 비해, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배 또는 그 이상 증가된다. 특정 실시형태에서, 상기 변형된 항체의 반감기는, IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편에 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 동일한 항체에 비해, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 25일, 30일 또는 그 이상 증가된다.
특정 실시형태에서, 증가된 생체내 반감기를 갖는 변형된 항체는, 하나 이상의 아미노산 변형(즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편)에 도입함으로써 생성한다. 이에 대해서는, 예를 들어 국제 공개 공보 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631; 및 미국 특허 제6,277,375호를 참조할 수 있으며, 상기 특허 문헌들은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 다른 실시형태에서, 상기 변형된 항체는 제2의 불변 CH2 도메인(인간 IgG1의 231-340번 잔기)(예를 들어, 서열 번호 339) 및/또는 제3의 불변 CH3 도메인(인간 IgG1의 341-447번 잔기)(예를 들어, 서열 번호 340)에 하나 이상의 아미노산 변형을 가지며, 여기서 넘버링은 Kabat의 상기 문헌에 기재된 EU 인덱스에 따른 것이다.
본 발명은 FcRn과 상호작용하는 불변 도메인(예를 들어, IgG 분자의 불변 도메인)의 특정 부분에 있어서의 아미노산 잔기 치환 및/또는 변형을 제공하며, 상기 변형은 FcRn에 대한 IgG 또는 그 단편의 친화력을 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 FcRn과 상호작용하는 하나 이상의 부위에 하나 이상의 아미노산 변형(즉, 치환, 삽입, 결실 및/또는 천연 잔기)을 갖는, IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는, Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편)을 포함하는 분자, 바람직하게는 단백질, 더 바람직하게는 면역글로불린(본원에 개시된 항체를 포함함)을 제공하며, 상기 변형은 FcRn에 대한 IgG 또는 그 단편의 친화력을 증가시키고, 또한 상기 분자의 생체내 반감기를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은, 다른 IgG 힌지-Fc 부위에서 아미노산 서열 정렬로 측정시, IgG 힌지-Fc 부위(서열 번호 342에 제시된 인간 IgG1 힌지-Fc 부위에서와 같이) 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 잔기 또는 이와 유사한 잔기 중 하나 이상에 발생된다. 잔기의 넘버링은 Kabat 등의 문헌(1991)[Sequences of proteins of immunological interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. ("Kabat et al.")]의 EU 인덱스에 따른 것이다. 항체 변형에 관해서는 같은 권리자의 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제10/020,354호에 기재되어 있으며, 이 특허 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 아미노산 변형은 인간 IgG1 불변 도메인(예를 들어, Kabat 등의 상기 문헌에 기재된 것), 또는 그 FcRn 결합성 단편(바람직하게는, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)과 같은 인간 IgG 불변 도메인 내에 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 IgG 불변 도메인의 252번, 254번 또는 256번 잔기에서 이루어진다(즉, 모두가 251번, 253번, 255번, 285-290번, 308-314번, 385-389번, 또는 428-436번 잔기 중 하나 이상에서 이루어짐). 일 실시형태에서, 상기 아미노산 변형은 252번 잔기에서의 루신에 의한 치환, 254번 잔기에서의 세린에 의한 치환, 및/또는 256번 잔기에서의 페닐알라닌에 의한 치환이 아니다. 특히, 특정 실시형태에서, IgG 불변 도메인, 힌지-Fc 도메인, 힌지-Fc 도메인 또는 이들의 다른 FcRn 결합성 단편이 마우스로부터 유래될 경우, 이러한 변형은 이루어지지 않는다.
상기 아미노산 변형은, IgG 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 또는 힌지-Fc 도메인) 및 이들에 부착된 임의의 분자의 생체내 반감기를 증가시키는, 예를 들어, 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 잔기 중 하나 이상에서의 임의의 변형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 변형된 항체는 표시된 아미노산 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 천연 아미노산 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 변형은 또한 pH 7.4보다 pH 6.0에서 FcRn에 대한 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편의 친화력을 더 크게 만든다. 다른 실시형태에서, 상기 변형은 분자의 생체이용률을 변경하고(즉, 증가 또는 감소시키고), 특히, 점막 표면(예를 들어, 폐 표면) 또는 표적 조직의 다른 부분으로의 분자의 수송(또는 상기 분자의 농도 또는 반감기)을 변경한다(즉, 증가 또는 감소시킨다). 또 다른 실시형태에서, 상기 아미노산 변형은 폐로의 분자의 수송 또는 분자의 농도 또는 반감기를 변경한다(바람직하게는, 증가시킨다). 다른 실시형태에서, 상기 아미노산 변형은 심장, 췌장, 간, 신장, 방광, 위, 대장 또는 소장, 기도, 림프절, 신경 조직(중추 신경계 및/또는 말초 신경계), 근육, 표피, 뼈, 연골, 관절, 혈관, 골수, 전립선, 난소, 자궁, 종양 또는 암 조직으로의 분자의 수송(또는 상기 분자의 농도 또는 반감기)를 변경한다(바람직하게는, 증가시킨다).
특정 실시형태에서, 상기 IgG 불변 도메인은 308, 309, 311, 312 및 314번 잔기 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 항체는 308번 위치에서의 트레오닌, 309번 위치에서의 프롤린, 311번 위치에서의 세린, 312번 위치에서의 아스파르트산, 및/또는 314번 위치에서의 루신을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변형된 항체는 308번 위치에서의 이소루신, 309번 위치에서의 프롤린, 및/또는 311번 위치에서의 글루탐산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 항체는 308번 위치에서의 트레오닌, 309번 위치에서의 프롤린, 311번 위치에서의 루신, 312번 위치에서의 알라닌, 및/또는 314번 위치에서의 알라닌을 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 변형된 항체는 불변 도메인을 포함하며, 여기서 308번 위치의 잔기는 트레오닌 또는 이소루신이고, 309번 위치의 잔기는 프롤린이며, 311번 위치의 잔기는 세린, 글루탐산 또는 루신이고, 312번 위치의 잔기는 알라닌이고/이며, 341번 위치의 잔기는 루신 또는 알라닌이다. 일 실시형태에서, 변형된 항체는 308번 위치에서의 트레오닌, 309번 위치에서의 프롤린, 311번 위치에서의 세린, 312번 위치에서의 아스파르트산, 및/또는 314번 위치에서의 루신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 항체는 251번, 252번, 254번, 255번 및 256번 잔기 중 하나 이상이 변형된 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 251번 잔기는 루신 또는 아르기닌이고, 252번 잔기는 타이로신, 페닐알라닌, 세린, 트립토판 또는 트레오닌이며, 254번 잔기는 트레오닌 또는 세린이고, 255번 잔기는 아르기닌, 루신, 글리신, 또는 이소루신이며/이거나, 256번 잔기는 세린, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산, 알라닌, 아스파라긴 또는 트레오닌이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 251번 잔기는 루신이고, 252번 잔기는 타이로신이며, 254번 잔기는 트레오닌 또는 세린이고, 255번 잔기는 아르기닌이며/이거나, 256번 잔기는 글루탐산이다. 특정 실시형태에서, 252번 위치의 잔기는 타이로신이고, 254번 위치의 잔기는 트레오닌이거나, 256번 위치의 잔기는 글루탐산이다. 다른 실시형태에서, 변형된 IgG, 예컨대 변형된 IgG1, 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편은 YTE 변형을 포함하며, 즉, 252번 위치의 잔기는 타이로신(Y)이고, 254번 위치의 잔기는 트레오닌(T)이며, 256번 위치의 잔기는 글루탐산(E)이다.
특정 실시형태에서, 상기 아미노산 변형은 428번, 433번, 434번 및 436번 위치의 잔기 중 하나 이상에서의 치환이다. 일부 실시형태에서, 428번 잔기는 트레오닌, 메티오닌, 루신, 페닐알라닌 또는 세린이고, 433번 잔기는 라이신, 아르기닌, 세린, 이소루신, 프롤린, 글루타민 또는 히스티딘이며, 434번 잔기는 페닐알라닌, 타이로신 또는 히스티딘이고/이거나, 436번 잔기는 히스티딘, 아스파라긴, 아르기닌, 트레오닌, 라이신 또는 메티오닌이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 428번 잔기 및/또는 434번 위치의 잔기는 각각 메티오닌 및/또는 히스티딘으로 치환된다.
다른 실시형태에서, 상기 아미노산 서열은 385번, 386번, 387번 및 389번 잔기 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 385번 잔기는 아르기닌, 아스파르트산, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 글리신이고, 386번 잔기는 트레오닌, 프롤린, 아스파르트산, 세린, 라이신, 아르기닌, 이소루신, 또는 메티오닌이며, 387번 잔기는 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌 또는 알라닌이고/이거나, 389번 잔기는 프롤린, 세린 또는 아스파라긴이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 385번, 386번, 387번 및 389번 위치 중 하나 이상은 각각 아르기닌, 트레오닌, 아르기닌 및 프롤린이다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 385번, 386번 및 389번 위치 중 하나 이상은 각각 아스파르트산, 프롤린 및 세린이다.
일부 실시형태에서, 아미노산 변형은 251번, 252번, 254번, 255번, 256번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 385번, 386번, 387번, 389번, 428번, 433번, 434번 및/또는 436번 잔기 중 하나 또는 조합에 이루어지며, 특히 이 경우 상기 변형은 이들 잔기에 대해 바로 앞서 기재된 아미노산 잔기이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 분자는 251번 잔기의 루신, 252번 잔기의 타이로신, 254번 잔기의 트레오닌 또는 세린, 255번 잔기의 아르기닌, 308번 잔기의 트레오닌, 309번 잔기의 프롤린, 311번 잔기의 세린, 312번 잔기의 아스파르트산, 314번 잔기의 루신, 385번 잔기의 아르기닌, 386번 잔기의 트레오닌, 387번 잔기의 아르기닌, 389번 잔기의 프롤린, 428번 잔기의 메티오닌, 및/또는 434번 잔기의 타이로신 중 하나 이상을 갖는 Fc 부위 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 FcRn 결합성 단편은 1번, 2번, 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 9번, 10번, 11번, 12번, 13번, 14번, 15번, 16번, 17번 잔기, 또는 251번, 252번, 254번, 255번, 256번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 385번, 386번, 387번, 389번, 428번, 433번, 434번 및/또는 436번 잔기 18개 모두에 변형을 갖는다.
일부 경우, IgG 불변 도메인 서열(예를 들어, Kabat 등의 상기 문헌 참조)에서의 자연적 변이로 인해, 특정 위치에서 제1 아미노산 잔기가 제2 아미노산 잔기로 치환되거나(또는 다른 방식으로 변형되거나), 대안으로, 제2 잔기가 항체의 특정 위치에 이미 존재할 수 있으며, 이 경우 치환은 불필요하다(예를 들어, 252번 위치의 Met가 Met로 남는다). 아미노산 변형은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 이같은 많은 방법들이 잘 알려져 있고 당업자에는 통상적인 것이다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 포함하나 이들에 한정되지 않는 변형을 임의의 잘 알려진 PCR에 기초한 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 아미노산 치환은 위치 지정 돌연변이 유발법에 의해 수행할 수 있다(예를 들어, 본원에서 그 전체를 참고로 포함하는 문헌[Zoller and Smith, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500, 1982; Kunkel, Pro. Natl. Acad. Sci USA 82:488, 1985] 참조). FcRn에 대한 증가된 친화력과 증가된 생체내 반감기를 나타내는 돌연변이체는 잘 알려진 통상의 분석법을 이용하여 쉽게 스크리닝할 수 있다. 바람직한 방법에서, 상기 IgG 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편의 하나 이상의 잔기에 아미노산 치환이 도입되고, 돌연변이된 불변 도메인 또는 단편이 박테리오파지 표면 상에서 발현되며, 그 후 이것은 증가된 FcRn 결합 친화력에 대해 스크리닝된다.
바람직하게는, 상기 변형된 아미노산 잔기는 표면에 노출된 잔기이다. 또한, 아미노산 치환을 실시함에 있어서, 바람직하게는, 치환시키고자 하는 아미노산 잔기는 보존적 아미노산 치환이며, 예를 들어, 극성 잔기는 극성 잔기로, 친수성 잔기는 친수성 잔기로, 소수성 잔기는 소수성 잔기로, 양으로 하전된 잔기는 양으로 하전된 잔기로, 또는 음으로 하전된 잔기는 음으로 하전된 잔기로 치환된다. 또한, 바람직하게는, 상기 변형된 아미노산 잔기는 종간의 보존성이 높거나 완전하지 않고/않거나, 불변 도메인 3차 구조를 유지하거나 FcRn 결합에 중요하다. 예를 들어, 한정을 의도한 것은 아니지만, 310번 잔기의 히스티딘은 바람직하지 않다.
308-314번 잔기에 돌연변이를 갖는(310번 위치의 히스티딘 및 313번 위치의 트립토판은 고정됨), FcRn에 대해 증가된 친화력을 갖는 Fc 도메인의 특정 돌연변이체는 돌연변이 인간 IgG1 분자의 라이브러리로부터 3차 패닝 후에 단리되었고, 251-256번 잔기(253번 위치의 이소루신은 고정됨)에 대해서는 라이브러리의 5차 패닝 후 단리되었으며, 428-436번 잔기(429번 위치의 히스티딘, 430번 위치의 글루탐산, 431번 위치의 알라닌, 432번 위치의 루신 및 435번 위치의 히스티딘은 고정됨)에 대해서는 라이브러리의 4차 패닝 후 단리되었고, 385-389번 잔기(388번 위치의 글루탐산은 고정됨)에 대해서는 라이브러리의 6차 패닝 후에 단리되었다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 Fc 부위 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 치환일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 234E, 235R, 235A, 235W, 235P, 235V, 235Y, 236E, 239D, 265L, 269S, 269G, 298I, 298T, 298F, 327N, 327G, 327W, 328S, 328V, 329H, 329Q, 330K, 330V, 330G, 330Y, 330T, 330L, 330I, 330R, 330C, 332E, 332H, 332S, 332W, 332F, 332D 및 332Y이며, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다. 이러한 Fc 도메인 아미노산 치환은, 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때, ADCC(3M)의 증가를 포함한다. 3M에 대한 구체적인 실시형태로는 239D, 330L 및 332E를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 3M에 대해 기재된 것 이외에도, 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 위치에 있는 것과 함께 존재하며, 여기서 넘버링은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스에 따른 것이다. 이러한 Fc 도메인 조합 아미노산 치환은, 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 때, 증가된 생체내 반감기를 나타냄과 동시에 ADCC(3M)의 증가를 나타내는 변형된 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, IgG 불변 도메인은 239D, 330L, 332E, 252Y, 254T 및 256E를 포함한다. Fc 부위의 251-256번 위치의 아미노산 잔기는 이하의 잔기로 구성된 군에서 선택된다: 252번 잔기는 타이로신, 페닐알라닌, 세린, 트립토판 또는 트레오닌이고; 254번 잔기는 트레오닌이며; 255번 잔기는 아르기닌, 루신, 글리신 또는 이소루신이고; 256번 잔기는 세린, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 또는 트레오닌이다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 변형은 이하의 잔기로 구성된 군에서 선택된다: 251번 잔기는 루신이고, 252번 잔기는 타이로신이며, 254번 잔기는 트레오닌이고, 255번 잔기는 아르기닌이며, 256번 잔기는 글루탐산이다. 특정 실시형태에서, 252번 잔기는 루신, 알라닌 또는 발린이 아니고; 253번 잔기는 알라닌이 아니며; 254번 잔기는 세린 또는 알라닌이 아니고; 255번 잔기는 알라닌이 아니며/아니거나; 256번 잔기는 알라닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 글리신 또는 아스파라긴이 아니다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 Fc 부위의 285-290번 위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 갖는, Fc 부위 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 285번 잔기는 알라닌이 아니고; 286번 잔기는 알라닌, 글루타민, 세린 또는 아스파르트산이 아니며; 288번 잔기는 알라닌이 아니고; 289번 잔기는 알라닌이 아니며/아니거나; 290번 잔기는 알라닌, 글루타민, 세린, 글루탐산, 아르기닌 또는 글리신이 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 Fc의 308-314번 위치의 아미노산 잔기 중 308번 위치의 트레오닌, 309번 위치의 프롤린, 311번 위치의 세린 및 312번 위치의 아스파르트산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 갖는 Fc 부위 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 308번 위치의 이소루신, 309번 위치의 프롤린 및 311번 위치의 글루탐산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 변형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 항체는 308번 위치의 트레오닌, 309번 위치의 프롤린 및 311번 위치의 루신으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 309번 위치는 알라닌이 아니고; 310번 위치는 알라닌이 아니며; 311번 위치는 알라닌 또는 아스파라긴이 아니고; 312번 위치는 알라닌이 아니며/아니거나; 314번 위치는 아르기닌이 아니다.
따라서, 특정 실시형태에서, 변형된 항체는 Fc 부위에 하기 잔기로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 갖는 불변 도메인을 포함한다: 308번 위치의 잔기는 트레오닌 또는 이소루신이고; 309번 위치의 잔기는 프롤린이며; 311번 위치의 잔기는 세린, 글루탐산 또는 루신이고; 312번 위치의 잔기는 아스파르트산이며; 341번 위치의 잔기는 루신 또는 알라닌이다. 일 실시형태에서, 상기 변형된 항체는 Fc 부위에 하기 잔기로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 갖는 불변 도메인을 포함한다: 308번 위치의 트레오닌, 309번 위치의 프롤린, 311번 위치의 세린, 312번 위치의 아스파르트산 및 314번 위치의 루신.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 Fc 부위의 385-389번 위치의 아미노산 중에서 하기 잔기로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 갖는 Fc 부위 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다: 385번 잔기는 아르기닌, 아스파르트산, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 글리신이고; 386번 잔기는 트레오닌, 프롤린, 아스파르트산, 세린, 라이신, 아르기닌, 이소루신 또는 메티오닌이며; 387번 잔기는 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌 또는 알라닌이고; 389번 잔기는 프롤린, 세린 또는 아스파라긴이다. 특정 실시형태에서, 385번, 386번, 387번 및 389번 위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 각각 아르기닌, 트레오닌, 아르기닌 및 프롤린이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 385번, 386번 및 389번 위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 각각 아스파르트산, 프롤린 및 세린이다. 특정 실시형태에서, 386번, 388번 및 389번 위치 중 어느 하나의 아미노산은 알라닌이 아니다.
일부 실시형태에서, 상기 아미노산 변형은 428-436번 잔기 중 하나 이상에서의 변형이다. 특정 실시형태에서, 428번 잔기는 트레오닌, 메티오닌, 루신, 페닐알라닌 또는 세린이고, 433번 잔기는 아르기닌, 세린, 이소루신, 프롤린, 글루타민 또는 히스티딘이며, 434번 잔기는 페닐알라닌, 타이로신 또는 히스티딘이고/이거나, 436번 잔기는 히스티딘, 아스파라긴, 아르기닌, 트레오닌, 라이신 또는 메티오닌이다. 더구체적인 실시형태에서, 428번 및/또는 434번 잔기는 각각 메티오닌 및/또는 히스티딘으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 430번 위치의 아미노산 잔기는 알라닌이 아니고; 433번 위치의 아미노산 잔기는 알라닌 또는 라이신이 아니며; 434번 위치의 아미노산 잔기는 알라닌 또는 글루타민이 아니며; 435번 위치의 아미노산 잔기는 알라닌, 아르기닌 또는 타이로신이 아니고/아니거나; 436번 위치의 아미노산 잔기는 알라닌 또는 타이로신이 아니다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 Fc 부위에 251번 잔기의 루신, 252번 잔기의 타이로신, 254번 잔기의 트레오닌, 255번 잔기의 아르기닌, 308번 잔기의 트레오닌, 309번 잔기의 프롤린, 311번 잔기의 세린, 312번 잔기의 아스파르트산, 314번 잔기의 루신, 385번 잔기의 아르기닌, 386번 잔기의 트레오닌, 387번 잔기의 아르기닌, 389번 잔기의 프롤린, 428번 잔기의 메티오닌 및 434번 잔기의 타이로신으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 Fc 부위 또는 그 FcRn 결합성 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 비변형 분자에 비해 증가된 생체내 반감기 및 FcRn에 대한 증가된 친화력(일부 실시형태에서는, 변경된 생체이용률, 예컨대 점막 표면 또는 다른 표적 조직으로의 증가 또는 감소된 수송)을 갖는 변형된 면역글로불린 분자를 제공한다. 이러한 면역글로불린 분자는 본래 FcRn 결합성 단편 및 다른 비IgG 면역글로불린(예를 들어, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY)을 포함하는 IgG 분자, 또는 FcRn 결합성 단편을 포함하도록 조작된 면역글로불린의 단편(즉, 비IgG 면역글로불린 또는 그 일부와 FcRn 결합성 단편을 포함하는 융합 단백질)을 포함한다. 두 경우 모두, 상기 FcRn 결합성 단편은, 전술한 것과 같은, FcRn에 대한 불변 도메인 단편의 친화력을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는다.
상기 변형된 면역글로불린은, 특이적 항원-항체 결합을 분석하기 위한 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재되어 있는 면역분석법으로 측정시, 결합하고(바람직하게는, 면역 특이적으로, 즉, 경쟁하여 비특이적 결합을 방지하고), FcRn 결합성 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린 분자를 포함한다.
본 발명의 IgG 분자 및 그 FcRn 결합성 단편은 바람직하게는 IgG의 IgG1 서브클래스이나, 특정 동물의 임의의 다른 IgG 서브클래스일 수도 있다. 예를 들어, 인간의 경우, IgG 클래스는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하고; 마우스 IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 포함한다. 특정 IgG 서브클래스, 예를 들어, 마우스 IgG2b 및 IgG2c는, 예를 들어, IgG1보다 더 높은 제거 속도를 갖는다[Medesan et al., Eur. J. Immunol., 28:2092-2100, 1998]. 따라서, IgG1 이외의 IgG 서브클래스를 사용할 경우, IgG1의 서열마다 다른 잔기 중 하나 이상, 특히 CH2 및 CH3 도메인의 잔기 중 하나 이상을 치환시킴으로써, 다른 유형의 IgG의 생체내 반감기를 증가시키는 것이 유익할 수 있다.
상기 면역글로불린 (및 본원에서 사용된 다른 단백질)은 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 기원하는 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 인간, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말 또는 닭이다. 본원에서 사용될 때, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 이하에 기재되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati 등)에 기재되어 있는 것과 같은 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 내인성 면역글로불린을 발현하지 않고 하나 이상의 인간 면역글로불린 유전자가 이식된 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
본 발명 항체 중 어느 하나(예를 들어, RSV 항원에 대한 증가된 친화력 및/또는 결합력을 갖는 항체) 및/또는 다른 치료용 항체에 대한 생체내 반감기를 증가시키기 위한 변형은 치료용 항체의 유효 용량을 낮추고/낮추거나 투여 빈도를 줄일 수 있다. 생체내 반감기를 증가시키기 위한 이같은 변형은 또한, 예를 들어 진단용 면역글로불린을 개선시키는 데에도 유용하여, 더 적은 용량의 투여로 충분한 진단 감도를 얻을 수 있다.
불변 도메인의 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 변형은 당업자에게 공지된 임의의 기법을 이용하여 도입할 수 있다. 251-256번, 285-290번, 308-314번, 385-389번 및 428-436번 아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편은, 예를 들어, FcRn 수용체에 대한 증가된 친화력을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편을 확인하기 위한 결합 분석법(예를 들어, 하기 섹션 5.5 및 5.6에 기재된 분석법)에 의해 스크리닝할 수 있다. FcRn 수용체에 대한 불변 도메인 또는 그 단편의 친화력을 증가시키는 변형을, 항체의 힌지-Fc 도메인 또는 그 단편에 도입하여, 상기 항체의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한, 불변 도메인 또는 그 단편 내의, 불변 도메인 또는 그 단편의 FcRn에 대한 친화력을 증가시키는 변형을 생물 활성 분자에 융합하여, 상기 생물 활성 분자의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다(바람직하게는, 상기 분자의 생체이용률을 변경하여(증가 또는 감소시켜서), 예를 들어 점막 표면(또는 다른 표적 조직)(예를 들어, 폐)으로의 수송을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
5.1.2 항체 접합체 및 융합 단백질
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 진단 물질, 검출 가능한 물질 또는 치료제 또는 임의의 다른 분자에 접합되거나 재조합에 의해 융합될 수 있다. 생체내 반감기를 증가시키고자 할 경우, 상기 항체는 변형된 항체일 수 있다. 접합된 또는 재조합에 의해 융합된 항체는, 예를 들어, 특정 치료법의 효능을 확인하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 RSV URI 및/또는 LRI의 개시, 발달, 진행 및/또는 중증도를 모니터링 또는 예후 판단하는 데 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 특정 생물학적 반응을 변경하는 치료용 부분 또는 약물 부분에 접합되거나 재조합에 의해 융합될 수 있다. 치료용 부분 또는 약물 부분은 전통적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 상기 약물 부분은 소정의 생물학적 활성을 갖는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, γ-인터페론, α-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 아폽토시스 유도제, 예를 들어, TNF-γ, TNF-γ, AIM I(국제 공개 공보 WO 97/33899 참조), AIM II(국제 공개 공보 WO 97/34911 참조), Fas 리간드(문헌[Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574] 참조) 및 VEGF(국제 공개 공보 WO 99/23105 참조), 혈관신생 억제제, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴 또는 응고 경로의 구성요소(예를 들어, 조직 인자); 또는 생물학적 반응 조절제, 예를 들어, 림포카인[예를 들어, 인터페론 감마, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-5("IL-5), 인터루킨-6("IL-6"), 인터루킨-7("II-7"), 인터루킨-9("IL-9"), 인터루킨-10("IL-10"), 인터루킨-12("IL-12"), 인터루킨-15("IL-15"), 인터루킨-23("IL-23"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF") 및 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF")], 또는 성장 인자[예를 들어, 성장 호르몬("GH")], 또는 응고제[예를 들어, 칼슘, 비타민 K, 조직 인자, 예컨대 하게만(Hageman) 인자(인자 XII), 고분자량 키니노겐(HMWK), 프레칼리크레인(PK), 응고 단백질 인자 II(프로트롬빈), 인자 V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, 인지질 및 피브린 단량체를 포함하나, 이들에 한정되지 않음]을 들 수 있다.
본 발명은 융합 단백질을 생성하기 위해 이종성 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 단편, 바람직하게는 약 10개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개 또는 약 100개 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합에 의해 융합되거나 화학적으로 접합된(공유 접합 및 비공유 접합을 둘 다 포함함) 본 발명 항체(예를 들어, 변형된 항체)를 포함한다. 특히, 본 발명은 본 발명 항체의 항원 결합성 단편(예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 항체가 융합되는 이종성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드는 항체를 특정 세포 유형에 표적화하는 데 유용하다. 예를 들어, 특정 세포 유형(예를 들어, 면역 세포)에 의해 발현되는 세포 표면 수용체에 면역 특이적으로 결합하는 항체가 본 발명의 변형된 항체에 융합 또는 접합될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5, 또는 A17h4 항체와 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발며의 융합 단백질은 AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8C7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5, 또는 A17h4의 항원 결합성 단편과 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 표 1에 기재된 VH 도메인 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH 도메인 또는 표 1에 기재된 VL 도메인 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL 도메인과 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 표 1에 기재된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR과 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 표 1에 기재된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR과 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 표 1에 기재된 하나 이상의 VH 도메인 및 하나 이상의 VL 도메인과 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 표 1에 기재된 하나 이상의 VH CDR 및 하나 이상의 VL CDR 도메인과 이종성 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체는 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하나 이들에 한정되지 않는 방사성 금속 이온을 폴리펩티드에 접합시키는 데 유용한 치료용 부분, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-에미터, 예컨대 213Bi 또는 거대고리 킬레이터에 접합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 거대고리 킬레이터는 링커 분자에 의해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 알려져 있고 문헌[Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Biconjug. Chem. 10(4):553-7]; 및 문헌[Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기재되어 있으며, 상기 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
치료용 부분(폴리펩티드를 포함함)을 항체에 융합 또는 접합시키는 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Arnon et al., Mononclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.　243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; 문헌[Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; 문헌[Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; 문헌["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)]; 문헌[Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]; 미국 특허 제5,336,603호, 제5,622,929호, 제5,359,046호, 제5,349,053호, 제5,447,851호, 제5,723,125호, 제5,783,181호, 제5,908,626호, 제5,844,095호 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT 공개 공보 WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 및 WO 99/04813; 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991]; 문헌[Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988]; 문헌[Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995]; 문헌[Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992]; 및 미국 가출원 제60/727,043호(2005년 10월 14일 출원, 발명의 명칭: "Methods of Preventing and Treating RSV Infections and Related Conditions); 및 미국 가출원 제60/727,042호(Genevieve Losonsky에 의해 2005년 10월 14일 출원, 발명의 명칭: "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment of RSV Infections and Respiratory Conditions")를 참조할 수 있으며, 이 문헌들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특히, 융합 단백질은, 예를 들어 유전자 셔플링, 모티프 셔플링, 엑손 셔플링 및/또는 코돈 셔플링(통틀어 "DNA 셔플링"이라 함) 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명 항체의 활성을 변경하기 위해(예를 들어, 더 높은 친화력과 더 낮은 해리 상수를 갖는 항체) 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; 문헌[Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; 문헌[Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76]; 및 문헌[Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313](상기 특허 문헌 및 간행물은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)을 참조할 수 있다. 항체, 또는 코딩된 항체는, 오류 빈발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의해 재조합 전에 무작위 돌연변이 유발을 통해 변경할 수 있다. 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합할 수 있다.
RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는, 본 발명 항체에 접합되거나 재조합에 의해 융합된 치료용 부분 또는 약물은, 원하는 치료 효과(들)을 얻도록 선택되어야 한다. 의사 또는 다른 의료진은 어떠한 치료용 부분 또는 약물을 본 발명 항체에 접합 또는 재조합적으로 융합시켜야 하는지를 결정할 때 질환의 성질, 질환의 중증도 및 피험체의 상태를 고려해야 한다.
5.2 항체의 치료 용도
본 발명은 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명, 및/또는 RAD)을 관리, 치료 및/또는 개선하기 위한 피험체, 바람직하게는 인간(예를 들어, 치료를 요하는 피험체)에 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는 항체에 기초한 치료법에 관한 것이다. 본 발명의 치료제는 본 발명의 항체(본원에 기재된 유사체 및 그 유도체를 포함함) 및 본 발명 항체(본원에 기재된 유사체 및 그 유도체 및 항이디오타입 항체를 포함함)를 코딩하는 핵산를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기재된 약학적으로 허용되는 조성물 중에 제공될 수 있다.
RSV 감염의 길항제로서 기능하는 본 발명 항체는 RSV URI 및/또는 LRI, 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)을 치료 또는 개선하기 위해 피험체, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 예를 들어, RSV 항원과 그 숙주 세포 수용체 간의 상호작용을 파괴 또는 방지하는 항체는 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하기 위해 피험체, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 경쟁 분석법 또는 마이크로중화 분석법과 같은 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 분석법으로 측정시, 상기 항체 부재하 또는 음성 대조군 존재하에서의 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합에 비해 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합을 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 방지 또는 억제한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명 항체의 조합은, 경쟁 분석법 또는 마이크로중화 분석법과 같은 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 분석법으로 측정시, 상기 항체 부재하 또는 음성 대조군 존재하에서의 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합에 비해 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합을 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 방지 또는 억제한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 변형된 항체는 단독으로 또는 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명 항체의 조합은 RSV가 그 숙주 및 수용체에 결합하는 것을 방지 또는 억제하기 위해, 및/또는 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 관리, 치료 및/또는 개선하기 위해 상승적으로 작용한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체(변형된 항체)는, 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 분석법으로 측정시, 상기 항체 부재하 또는 음성 대조군 존재하에서의 RSV 유도 융합에 비해 RSV 유도 융합을 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 방지 또는 억제한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명 항체의 조합은, 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 분석법으로 측정시, 상기 항체 부재하 또는 음성 대조군 존재하에서의 RSV 유도 융합에 비해 RSV 유도 융합을 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 방지 또는 억제한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 폐내 RSV 역가를 약 1배, 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배, 약 100배, 약 105배, 약 110배, 약 115배, 약 120배, 약 125배 또는 그 이상 감소시킨다. 음성 대조군(예컨대 위약), 다른 치료제(팔리비주맙을 사용한 치료를 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 항체 투여 전 환자의 역가에 비해 RSV 역가의 배수 감소가 관찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 분석법으로 측정시, 상기 항체 부재하 또는 음성 대조군 존재하에서의 RSV 복제에 비해 RSV 복제를 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 억제 또는 하향조절한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명 항체의 조합은, 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 분석법으로 측정시, 상기 항체 부재하 또는 음성 대조군 존재하에서의 RSV 복제에 비해 RSV 복제를 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 억제 또는 하향조절한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 상기도의 RSV 역가를 약 1배, 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배, 약 100배, 약 105배, 약 110배, 약 115배, 약 120배, 약 125배 또는 그 이상 감소시킨다. 음성 대조군(예컨대 위약), 다른 치료제(팔리비주맙을 사용한 치료를 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 항체 투여 전 환자의 역가에 비해 RSV 역가의 배수 감소가 관찰될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하기도의 RSV 역가를 약 1배, 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배, 약 100배, 약 105배, 약 110배, 약 115배, 약 120배, 약 125배 또는 그 이상 감소시킨다. 음성 대조군(예컨대 위약), 다른 치료제(팔리비주맙을 사용한 치료를 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 항체 투여 전 환자의 역가에 비해 RSV 역가의 배수 감소가 관찰될 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로 투여되거나 다른 유형의 치료제(예를 들어, 호르몬 치료제, 면역 치료제 및 항염증제)와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 다른 치료제와 상승적으로 작용한다. 일반적으로, 환자와 동일한 종 유래의 제품 또는 환자와 동일한 종 반응성(항체의 경우)을 갖는 제품의 투여가 바람직하다. 따라서, 다른 실시형태에서, 인간 또는 인간화 항체, 유도체, 유사체 또는 핵산이 치료를 위해 인간 환자에게 투여된다.
RSV에 대한 면역분석법과, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증의 치료, 관리 및/또는 개선 둘 다를 위해, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 고친화성 및/또는 고효능의 생체내 억제 항체 및/또는 중화 항체를 사용할 수 있다. 또한, RSV에 대한 면역분석법과, RSV 감염에 대한 치료[예를 들어, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 것] 둘 다를 위해, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 고친화성 및/또는 고효능의 생체내 억제 항체 및/또는 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 RSV F 당단백질 및/또는 상기 F 당단백질의 단편에 대한 친화력을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명은 현행 치료법의 대안으로서 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 현행 치료법은 환자에게 사용하기에 독성이 너무 큰 것(즉, 허용할 수 없는 또는 견딜 수 없는 부작용을 초래하는 것)으로 입증되었거나 입증될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 현행 치료법에 비해 부작용을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 상기 환자는 현행 치료법에 난치성인 것으로 입증된 환자이다. 이러한 실시형태에서, 본 발명은 어떠한 다른 항감염 치료제도 사용하지 않고서 하나 이상의 본 발명 항체를 투여하는 것을 제공한다. 특정 실시형태에서, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI) 환자가, 감염이 현저히 근절되지 않았고/않았거나 증상이 현저히 완화되지 않았을 경우, 난치성이라고 본다. 환자가 난치성인지 아닌지의 결정은, 이와 관련하여 당업계에서 인정하는 "난치성"의 의미를 이용하여, 감염 치료의 유효성을 검정하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 시험관내 또는 생체내에서 수행할 수 있다. 다양한 실시형태에서, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI) 환자는 치료 후에 바이러스 복제가 감소되지 않거나 증가하였을 때 난치성이라고 본다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 1차적 바이러스 감염에 대한 하나 이상의 2차적 반응을 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법으로서, 유효량의 본 발명의 1종 이상의 항체를 단독으로 또는 유효량의 다른 치료법(예를 들어, 다른 치료제)과 함께 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 1차적 바이러스 감염에 대한 2차적 반응의 예로는 점막 자극에 대한 천식과 유사한 반응성, 총 호흡 저항의 증가, 2차적 바이러스, 박테리아 및 진균 감염에 대한 감수성 증가, 및 세기관지염, 폐렴, 크루프 및 열성 기관지염을 포함하나 이들에 한정되지 않는 병증의 발달을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 (치료를 위한) 수동 면역요법에 사용될 수 있다. 상기 변형된 항체가 또한 연장된 반감기 Fc 변형을 포함한다는 점에서, 항체를 더 적은 용량 및/또는 더 적은 빈도로 투여하여 수동 면역요법을 실시함으로써, 부작용을 줄이고, 환자의 순응성을 개선시키고, 치료/예방의 비용을 줄이는 등의 효과를 얻을 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 치료제는 RSV에 결합하는 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 항RSV 항체이며, 여기서 상기 항체는 변형된 항체이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 수동 면역요법에 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, RSV에 감염된 인간 환자를, VH CDR 1(서열 번호 10), VH CDR 2(서열 번호 19) 및 VH CDR 3(서열 번호 20)의 아미노산 서열을 갖는 3개의 가변 중쇄 상보성 결정 부위(VH CDR) 및 VL CDR 1(서열 번호 39), VL CDR 2(서열 번호 5) 및 VL CDR 3(서열 번호 6)의 아미노산 서열을 갖는 3개의 가변 경쇄 CDR(VL CDR)을 포함하는 F(ab)' 단편을 치료적 유효량으로 치료를 요하는 환자에게 투여함으로써 치료하며, 여기서 상기 투여는 폐내 투여이고 RSV 시즌 동안 실시된다. 일반적으로 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 "급증"은 RSV 시즌 최고조에 성인 또는 노인에게서 일어난다. 상기 F(ab)' 단편을 사용한 치료 방법은 치료적 유효량의 상기 F(ab)' 단편을 투여받지 않았거나 위약을 투여받은 유사한 환자 집단(코호트)과 비교할 때 COPD로 인한 환자의 병원 치료 횟수를 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다.
5.3 항체의 투여 방법, 빈도 및 용량
일 실시형태에서,RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)의 관리, 치료 및/또는 개선에 사용하기 위한 조성물은, 본원에 기재된, 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 NEDI-524를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 융합 단백질을 포함한다.
리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐에 의한 캡슐화, 항체를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개성 내포작용(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 구성 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 치료제(예를 들어, 본 발명의 변형된 항체)를 투여하는 데 사용될 수 있다. 치료제(예를 들어, 본 발명의 항체) 또는 약학적 조성물을 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 및 점막(예를 들어, 비내 및 경구 경로)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 치료제(예를 들어, 본 발명의 항체) 또는 약학적 조성물은 비내, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여된다. 상기 치료제 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사, 상피 내막 또는 점막(예를 들어, 구강 점막, 비내 점막, 직장 점막 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저 및 에어로졸화를 함유한 제제의 사용에 의한 폐내 투여가 이용될 수도 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호 및 제4,880,078호; 및 PCT 공개 공보 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903을 참조할 수 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIRTM 폐내 약물 전달 기법(Alkermes, Inc., Cambridge, MA)을 이용하여 투여한다.
특정 실시형태에서, 치료제 또는 본 발명의 약학적 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 국소 주입, 국소 투여(예를 들어, 비내 스프레이 사용), 주사 또는 임플란트의 사용의 사용을 포함하나 이들에 한정되지 않는 방식에 의해 실시될 수 있으며, 상기 임플란트는 시알라스틱(sialastic) 막 등의 막을 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질, 또는 섬유이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 투여할 때, 항체가 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울여야 한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 2종 이상의 본 발명의 항체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 1종, 2종 또는 그 이상의 본 발명의 항체와 본 발명의 항체 이외의 치료제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제제는, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 유용한 것으로 알려져 있거나 사용된 적이 있거나 현재 사용되고 있는 것이다. 본 발명의 조성물은 치료제 이외에도 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단위 제형의 제조에 사용될 수 있는 약학적 조성물(예를 들어, 피험체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물이다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 1종 이상의 치료제(예를 들어, 본 발명의 변형된 항체 또는 다른 치료제) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 피험체에 대한 투여 경로에 적합하도록 제제화된다.
특정 실시형태에서, "담체"란 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제[예를 들어, 프로인트 보조제(완전 보조제 및 불완전 보조제)], 부형제, 또는 비이클을 말한다. 이러한 약학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 비롯한 오일 및 물, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등과 같은 멸균 액체일 수 있다. 상기 약학적 조성물이 정맥내 투여될 경우, 다른 담체로서 물이 사용된다. 염수 용액 또는 포도당 수용액 및 글리세롤 용액이, 특히 주사액을 위한 액체 담체로서 사용된다. 적절한 약학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은, 필요에 따라, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액제, 현탁제, 에멀션제, 정제, 환약, 캡슐제, 분말제, 서방형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E.W. Martin의 문헌["Reemington's Pharmaceutical Sciences"]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 투여하기에 적절한 형태를 제공하기 위해 적정량의 담체와 함께 치료적 유효량의 항체를, 바람직하게는 정제된 형태로 포함한다. 상기 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약학적 조성물로서 통상적 절차에 따라 제제화된다. 일반적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요에 따라, 상기 조성물은 주사 부위의 통증을 완화하기 위해 리그노케인과 같은 국소 마취제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 그러나 이러한 조성물은 정맥내 경로 이외의 경로로 투여될 수도 있다.
일반적으로, 본 발명 조성물의 성분들은 단위 제형으로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시한 앰플 또는 샤쉐와 같은 기밀 용기 내의 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 개별적으로 또는 서로 혼합되어 제공된다. 상기 조성물을 주입에 의해 투여하고자 할 경우, 약학적 등급의 멸균수 또는 멸균 염수를 함유한 주입병으로 조제될 수 있다. 상기 조성물이 주사에 의해 투여될 경우, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 멸균 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 항체의 양을 표시한 앰플 또는 샤쉐와 같은 기밀 용기에 포장된 본 발명 항체를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 기밀 용기 내의 건조 멸균 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되며, 예를 들어 물 또는 염수에 의해 피험체에 투여하기에 적당한 농도로 재구성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 기밀 용기에 0.5 mg 이상, 1 mg 이상, 2 mg 이상 또는 3 mg 이상, 더 바람직하게는 5 mg 이상, 10 mg 이상, 15 mg 이상, 25 mg 이상, 30 mg 이상, 35 mg 이상, 45 mg 이상, 50 mg 이상, 60 mg 이상 또는 75 mg 이상의 단위 용량으로 건조 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 상기 동결건조 항체는 그 최초 용기에서 2∼8℃에 보관될 수 있으며, 상기 항체는 재구성한 지 12시간 내에, 바람직하게는 6시간, 5시간, 3시간 또는 1시간 내에 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 항체는 항체의 양 및 농도를 표시한 기밀 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 상기 항체의 액체 형태는 기밀 용기에 0.1 mg/ml 이상, 0.5 mg/ml 이상 또는 1 mg/ml 이상, 더 바람직하게는 2.5 mg/ml 이상, 3 mg/ml 이상, 5　mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 30 mg/ml 이상 또는 60 mg/ml 이상으로 공급된다.
본 발명의 조성물은 중성 형태 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 음이온과 함께 형성된 것 및 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로케인 등으로부터 유도된 것과 같은 양이온과 함께 형성된 것을 들 수 있다.
예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 효과적인 치료제(예를 들어, 본 발명의 항체), 또는 본 발명 조성물의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 효과적인 치료제 또는 본 발명 항체를 포함하는 조성물의 용량은, 상기 조성물을 코튼 래트에 투여하고, 105 pfu의 RSV로 코튼 래트를 항원 공격한 후의 RSV 역가를 측정하고, 상기 RSV 역가를, 상기 치료제 또는 상기 조성물을 투여하지 않은 코튼 래트에 대해 얻은 RSV 역가와 비교하여 결정할 수 있다. 따라서, 105 pfu의 RSV로 항원 공격하고 치료제 또는 조성물을 투여하지 않은 코튼 래트에 비해 105 pfu의 RSV로 항원 공격한 코튼 래트에서의 RSV 역가를 2 log 또는 99% 감소시키는 용량은, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하기 위해 인간에게 투여될 수 있는 조성물의 용량이다.
예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하는 데 유효한 조성물의 용량은, 상기 조성물을 동물 모델(예를 들어, 코튼 래트 또는 원숭이)에 투여하고, RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 변형된 항체의 혈청 역가, 폐내 농도 또는 비갑개 및/또는 비분비물 농도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 따라서, 혈청 역가를 약 0.1 ㎍/ml∼약 450 ㎍/ml, 일부 실시형태에서 0.1 ㎍/ml 이상, 0.2 ㎍/ml 이상, 0.4 ㎍/ml 이상, 0.5 ㎍/ml 이상, 0.6 ㎍/ml 이상, 0.8 ㎍/ml 이상, 1 ㎍/ml 이상, 1.5 ㎍/ml 이상, 바람직하게는 2 ㎍/ml 이상, 5 ㎍/ml 이상, 10 ㎍/ml 이상, 15 ㎍/ml 이상, 20 ㎍/ml 이상, 25 ㎍/ml 이상, 30 ㎍/ml 이상, 35 ㎍/ml 이상, 40 ㎍/ml 이상, 50 ㎍/ml 이상, 75 ㎍/ml 이상, 100 ㎍/ml 이상, 125 ㎍/ml 이상, 150 ㎍/ml 이상, 200 ㎍/ml 이상, 250 ㎍/ml 이상, 300 ㎍/ml 이상, 350 ㎍/ml 이상, 400 ㎍/ml 이상 또는 450 ㎍/ml 이상이 되도록 하는 항체 또는 조성물의 용량을, 예를 들어, 천식, 천명, 반응성 기도 질환(RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 이들의 조합 등의 RSV 감염 및/또는 RSV 질환의 장기적 결과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 호흡기 병증을 치료, 관리 및/또는 개선하기 위해 인간에게 투여될 수 있다. 또한, 최적의 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 경우에 따라 시험관내 분석법을 이용할 수 있다.
제제에 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 RSV URI 및/또는 LRI의 중증도에 따라 달라지며, 의사의 판단과 환자 개개인의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델(예를 들어, 코튼 래트 또는 사이노몰거스 원숭이) 테스트 시스템으로부터 유도된 용량 반응 곡선으로부터 외삽 추정할 수 있다.
본 발명 항체의 경우, 환자에게 투여되는 용량이 일반적으로 환자 체중 kg당 0.025 mg∼100 mg이다. 일부 실시형태에서, 환자에게 투여되는 용량은 환자 체중 kg당 약 3 mg∼약 60 mg이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 용량은 환자 체중 kg당 0.025 mg∼20 mg, 더 바람직하게는 체중 kg당 1 mg∼15 mg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종 유래의 항체보다 인체 내에서의 반감기가 더 길다. 따라서, 더 적은 용량의 인간 항체를 투여할 수 있고 투여 빈도를 줄일 수 있다. 또한, 본 발명 항체의 투여량과 투여 빈도는 변형, 예를 들어 지질화에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투(예를 들어, 비도 및/또는 폐로의 침투)를 증대시킴으로써 줄일 수 있다. 다른 실시형태에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 약 100 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 2　mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 또는 약 0.025 mg/kg이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 RSV 시즌 직전에(예를 들어, 3개월, 2개월, 1개월 전에) 또는 RSV 시즌 동안 월 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 변형된 항체를 포함하는 조성물은 RSV 시즌 직전에 또는 RSV 시즌 동안 2개월마다 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 RSV 시즌 직전에 또는 RSV 시즌 동안 3개월마다 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 RSV 시즌 직전에 또는 RSV 시즌 동안 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV 시즌 동안 2회, 가장 바람직하게는 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV 시즌 직전에 투여되며, 경우에 따라 RSV 시즌 동안 1회 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은, RSV 시즌 직전에 또는 RSV 시즌 동안 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일에서 최대 1주 동안 24시간마다 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 매일 투여는 RSV 감염이 처음 인정된 후 바로(즉, 환자가 코막힘 및/또는 다른 상기도 증상을 보였을 때), 그러나, 폐에서 임상적으로 유의적인 질환이 발현되기 전(즉, 하기도 질환 징후가 나타나기 전)에 실시되어 하기도 질환을 방지한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체 또는 본 발명의 변형된 항체를 포함하는 조성물은 RSV 시즌 중에 환자가 RSV URI의 증상을 나타내는 동안 약 3일에 걸쳐 하루에 1회씩 비내 투여된다. 대안으로, 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체 또는 본 발명의 변형된 항체를 포함하는 조성물은 RSV 시즌 중에 환자가 RSV URI의 증상을 나타내는 동안 적어도 1주일에 걸쳐 2일에 1회씩 비내 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 M.O.I 약 0.1의 RSV 바이러스 부하를 나타내는 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 12시간 후 비내 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 M.O.I 약 0.1의 RSV 바이러스 부하를 나타내는 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 24시간 후 비내 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 M.O.I 약 0.01의 RSV 바이러스 부하를 나타내는 인간 환자에게 RSV 감염으로부터 48시간 후 비내 투여된다.
"RSV 시즌"이란 용어는 RSV 감염이 발생할 가능성이 가장 높은 시즌을 말한다. 일반적으로, 북반구에서의 RSV 시즌은 11월에 시작하여 4월까지 지속되나, 지역의 기후에 따라 북반구에서도 8월에서 6월까지 연장될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 본원에 기재된 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 MEDI-524의 VH 및 VL 도메인, 또는 그 항원 결합성 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, RSV 시즌 동안 약 60 mg/kg 이하, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 또는 약 1.5 mg/kg 이하의 본 발명 항체가 5회, 4회, 3회, 2회, 또는 바람직하게는 1회 피험체, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 RSV 시즌 동안 피험체에게 약 1∼12회 투여되며, 이때 투여량은 의사가 판단한 대로 필요에 따라, 예를 들어, 매주, 격주로, 매월, 격월로, 3개월에 1회씩 등으로 투여된다. 일부 실시형태에서, RSV 시즌 동안 더 적은 용량(예를 들어, 5∼15 mg/kg)을 더 많은 빈도로(예를 들어, 3∼6회) 투여한다. 다른 실시형태에서, RSV 시즌 동안 더 많은 용량(예를 들어, 30∼60 mg/kg)을 더 적은 빈도로(예를 들어, 1∼3회) 투여할 수 있다. 그러나, 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 범위 내에서 다른 투여량 및 투여 스케쥴도 용이하게 결정할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 표 1에 기재된 하나 이상의 VH 도메인 또는 사슬 및/또는 하나 이상의 VL 도메인 또는 사슬을 포함하며, 본원에 기재된 변형된 불변 도메인, 예컨대 본원에서 확인되는 IgG 불변 도메인의 잔기에서의 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, RSV 시즌 동안 약 60 mg/kg 이하, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명 항체가 피험체, 바람직하게는 인간에게 근육내 또는 비내 투여된다. 또 다른 실시형태에서, RSV 시즌 동안 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명 항체가 피험체, 바람직하게는 인간에게 근육내 또는 비내 투여된다. 또 다른 실시형태에서, RSV 시즌 동안 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명 항체가 2회, 가장 바람직하게는 1회 피험체, 바람직하게는 인간에게 근육내 또는 비내 투여된다. 또 다른 실시형태에서, RSV 시즌 동안 약 1 mg/kg 이하, 약 0.1 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg의 본 발명의 변형된 항체가 적어도 3일 동안 매일 1회 투여되거나, 대안으로, 적어도 1주일 동안 2일에 1회씩 피험체, 바람직하게는 인간에게 비내 투여된다.
특정 실시형태에서, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하기 위해, 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명의 항체가 서방형 제제로 피험체, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하기 위해, 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명 항체 볼루스가 서방형 제제로 피험체, 바람직하게는 인간에게 투여되며, 특정 기간 후에, 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명 항체가 서방형 제제로 상기 피험체(예를 들어, 비내 또는 근육내)에 2회, 3회 또는 4회(바람직하게는 1회) RSV 시즌 동안 투여된다. 이러한 실시형태에 따르면, 특정 기간은 1∼5일, 1주, 2주 또는 1개월일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하기 위해, RSV 시즌 동안 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 본 발명의 변형된 항체는 서방형 제제로 피험체, 바람직하게는 인간에게 근육내 또는 비내로 2회, 3회 또는 4회(바람직하게는 1회) 투여된다.
또 다른 실시형태에서, RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI), 및/또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(예를 들어, 천식, 천명 및/또는 RAD)을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하기 위해, 약 60 mg/kg, 약 45 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 2 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 0.50 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하 또는 약 0.025 mg/kg 이하의 하나 이상의 본 발명의 항체가 피험체에게 비내 투여된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 URI를 치료하고 하기도 감염 및/또는 RSV 질환을 예방하기 위해 피험체에게 비내 투여된다.
특정 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 변형된 항체(바람직하게는 MEDI-524 또는 변형된 MEDI-524 항체, 예컨대 MEDI-524-YTE)가 환자에게 투여되며, 여기서 상기 용량은 약 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg 또는 약 75 mg/kg으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 변형된 항체는 년 1회 또는 RSV 시즌 동안 1회, 또는 RSV 시즌으로부터 3개월, 2개월 또는 1개월 전에 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 항체는 환자에게 년간(또는 대안으로 RSV 시즌 동안) 2주마다(예를 들어, 14일) 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회, 21회, 22회, 23회, 24회, 25회 또는 26회 투여되며, 여기서 상기 용량은 약 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다(즉, 매월 투여하는 각각의 용량은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다).
또 다른 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 항체는 환자에게 년간(또는 대안으로 RSV 시즌 동안) 매월(예를 들어, 약 30일) 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회 또는 12회 투여되며, 여기서 상기 용량은 약 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다(즉, 매월 투여하는 각각의 용량은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다).
일 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 항체는 환자에게 년간(또는 대안으로 RSV 시즌 동안) 대략 격월로(예를 들어, 약 60일) 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 투여되며, 여기서 상기 용량은 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다(즉, 매월 투여하는 각각의 용량은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다).
일부 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 항체는 환자에게 년간(또는 대안으로 RSV 시즌 동안) 대략 3개월마다(예를 들어, 약 120일) 2회, 3회 또는 4회 투여되며, 여기서 상기 용량은 약 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다(즉, 매월 투여하는 각각의 용량은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다).
특정 실시형태에서, 본 발명 항체를 환자에게 투여하기 위한 투여 경로는 비내, 근육내, 정맥내 투여 경로 또는 이들의 조합이나, 본원에 기재된 다른 경로도 허용 가능하다. 매회 용량은 동일한 투여 경로에 의해 투여될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 다른 용량의 동일한 또는 상이한 본 발명 항체와 동시에 또는 후에 복수의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 피험체(예를 들어, 유아, 미숙아로 태어난 유아, 면역 손상 피험체, 의료진 또는 고령의 피험체)에게 치료를 위해 투여된다. 본 발명의 항체는, RSV 감염이 한 개체로부터 다른 개체로 전염되는 것을 방지하기 위해, 또는 전염된 감염을 약화시키기 위해, 치료 목적으로 피험체에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 피험체는 RSV 감염(예를 들어, 급성 RSV 질환, 또는 RSV URI 및/또는 LRI)에 걸린 다른 개체에 노출된 적이 있거나(무증상일 수도 있고 아닐 수도 있음) 노출될 가능성이 있다. 예를 들어, 상기 피험체는 다른 RSV 감염 어린이 또는 다른 RSV 감염 개체와 같은 학교 또는 보육시설에서 지내는 어린이, 다른 RSV 감염 개체와 같은 요양소에서 지내는 노인, 또는 RSV 감염 어린이 또는 RSV 감염 개체와 같은 집에서 지내는 개체, RSV 감염 환자와 함께 일하는 병원의 의료진 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 피험체에게 치료를 위해 투여되는 항체는 비내 투여되나, 본원에 기재된 다른 투여 경로도 허용 가능하다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 약 0.025 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg 또는 약 50 mg/kg의 용량으로 (예를 들어, 비내) 투여된다. 더 적은 용량과 더 적은 빈도의 투여가 바람직하며, 예를 들어, RSV 감염 개체에 잠재적 또는 실제적 노출 후에 약 3일, 약 5일 또는 약 7일 동안 또는 필요에 따라 다른 기간 동안 2∼4시간, 4∼6시간, 6∼8시간, 8∼10시간, 10∼12시간, 12∼14시간, 14∼16시간, 16∼18시간, 18∼20시간, 20∼22시간, 22∼24시간마다 1회씩(바람직하게는 매일 1회 또는 2회) 비내(또는 다른 경로) 투여된다. 본원에 기재된 임의의 본 발명 항체가 사용될 수 있으며, 특정 실시형태에서 상기 항체는 변형된 IgG(예를 들어, IgG1) 불변 도메인, 또는 그 FcRn 결합성 단편(예를 들어, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함한다.
5.4 항체의 진단 용도
RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 표지된 본 발명의 (변형된) 항체 및 그 유도체 및 유사체는 RSV URI 및/또는 LRI를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위해 진단 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 RSV 감염(예를 들어, RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않음)을 검출하는 방법으로서, (a) RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 하나 이상의 본 발명 항체를 사용하여 피험체의 세포 또는 조직 샘플 중의 RSV 항원의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 상기 RSV 항원 수치를 대조군 수치, 예를 들어, RSV에 감염되지 않은 정상 조직 샘플 중의 수치와 비교하는 단계[여기서, RSV 항원의 대조군 수치에 비해 RSV 항원의 분석 수치가 증가한 것은 RSV 감염(예를 들어, RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않음)을 나타냄]를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 RSV 감염(예를 들어, RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않음)을 진단하기 위한 진단 분석법으로서, (a) RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 하나 이상의 본 발명 항체를 사용하여 개체의 세포 또는 조직 샘플 중의 RSV 항원의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 상기 RSV 항원 수치를 대조군 수치, 예를 들어, RSV에 감염되지 않은 정상 조직 샘플 중의 수치와 비교하는 단계[여기서, RSV 항원의 대조군 수치에 비해 RSV 항원의 분석 수치가 증가한 것은 RSV 감염(예를 들어, RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않음)을 나타냄]를 포함하는 진단 분석법을 제공한다. RSV 감염(예를 들어, RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않음)의 보다 확정적인 진단은 의료 전문인으로 하여금 예방적 조치 또는 공격적 치료를 더 조기에 이용할 수 있도록 함으로써 RSV 감염의 발생 또는 추가 진행을 예방할 수 있다.
5.5 변형된 항체에 대한 생물학적 활성 및 분석
본 발명의 항체는 다양한 방식으로 그 특징을 분석할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석법은 용액 중에서(예를 들어, 문헌[Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421] 참조), 비드 상에서[Lam, 1991, Nature 354:82-84], 칩 상에서[Fodor, 1993, Nature 364:555-556], 박테리아 상에서[미국 특허 제5,223,409호], 포자 상에서[미국 특허 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호], 플라스미드 상에서[Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869] 또는 파지 상에서[Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; 및 Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310](이들 문헌은 각각 본원에서 그 전체가 참고로 포함됨) 수행될 수 있다. 그 후, RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 항체는 RSV 항원에 대한 특이성 및 친화성에 대해 분석이 실시될 수 있다.
본 발명의 변형된 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RSV 항원에 대한 면역 특이적 결합 및 다른 항원과의 교차 반응성에 대해 분석될 수 있다. 면역 특이적 결함 및 교차 반응성을 분석하는 데 이용될 수 있는 면역분석법은, 예를 들어 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석법, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침강 분석법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사 측정 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 등의 기법을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 분석법은 통상적인 것으로서 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본원에서 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). 대표적인 면역분석법에 대해서는 이하에 간략히 기재한다(단, 이것은 한정을 의도한 것이 아니다).
면역침강 프로토콜은 일반적으로 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 바나드산나트륨)가 보충된 RIPA 완충액(1% NP-40 또는 트리톤(Triton) X-100, 1% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨, pH 7.2, 1% 트라실롤)과 같은 용해 완충액 중에서 세포 집단을 용해시키는 단계, 관심있는 항체를 세포 용해물에 첨가하는 단계, 40℃에서 일정 시간(예를 들어, 1∼4시간) 동안 항온처리하는 단계, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로스 비드를 상기 세포 용해물에 첨가하는 단계, 40℃에서 약 1시간 이상 동안 항온처리하는 단계, 용해 완충액 중에서 비드를 세척하는 단계 및 상기 비드를 SDS/샘플 완충액 중에 재현탁시키는 단계를 포함한다. 상기 관심있는 항체가 특정 항원을 면역침강시키는 능력은, 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정할 수 있다. 당업자라면 항원에 대한 항체의 결합을 증가시키고 배경값을 감소시키기 위해 변경할 수 있는 파라미터(예를 들어, 세파로스 비드로 세포 용해물을 사전 세정하는 것)에 대해 알고 있을 것이다. 면역침강 프로토콜에 관한 추가 고찰을 위해서는, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1]을 참조할 수 있다.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 샘플을 조제하는 단계, 상기 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔(예를 들어, 항원의 분자량에 따라 8%∼20% SDS-PAGE)에서 전기영동하는 단계, 상기 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔로부터 니트로셀룰로스, PVDF 또는 나일론과 같은 멤브레인으로 이전하는 단계, 상기 멤브레인을 차단 용액(예를 들어, 3% BSA 또는 탈지유를 함유한 PBS) 중에서 항온처리하는 단계, 상기 멤브레인을 세척 완충액(예를 들어, PBS-Tween 20) 중에서 세척하는 단계, 상기 멤브레인을 차단 완충액 중에 희석된 1차 항체(관심있는 항체)와 항온처리하는 단계, 상기 멤브레인을 세척 완충액 중에서 세척하는 단계, 상기 멤브레인을 차단 완충액 중에 희석된 효소 기질(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 방사성 분자(예를 들어, 32P 또는 125I)에 접합된 2차 항체(1차 항체, 예를 들어, 항인간 항체를 인식함)와 항온처리하는 단계, 상기 멤브레인을 세척 완충액 중에서 세척하는 단계 및 상기 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 당업자라면 검출된 신호를 증가시키고 바탕값 노이즈를 감소시키기 위해 변경할 수 있는 파라미터에 대해 알 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 관한 추가 고찰을 위해서는, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1]을 참조할 수 있다.
ELISA는 항원을 조제하는 단계, 96웰 미량적정 플레이트의 웰을 상기 항원으로 코팅하는 단계, 호소 기질(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)와 같은 검출 가능한 화합물에 접합된 관심있는 항체를 상기 웰에 첨가하여 일정 시간 동안 항온처리하는 단계 및 상기 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. ELISA에서, 상기 관심있는 항체가 검출 가능한 화합물에 접합되어야 하는 것은 아니며; 대신에, 검출 가능한 화합물에 접합된 제2 항체(이것은 상기 관심있는 항체를 인식함)가 웰에 첨가될 수 있다. 또한, 웰을 항원으로 코팅하는 대신에, 상기 항체를 웰에 코팅할 수 있다. 이 경우, 검출 가능한 화합물에 접합된 제2 항체를, 상기 관심있는 항체를 코팅된 웰에 첨가한 후에 첨가할 수 있다. 당업자라면 검출된 신호를 증가시키기 위해 변경할 수 있는 파라미터뿐만 아니라 당업계에 공지된 ELISA의 다른 변형법에 대해서도 알 것이다. ELISA에 관한 추가 고찰을 위해서는, 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1]을 참조할 수 있다.
항원에 대한 항체의 결합 친화력 및 항체-항원 상호작용의 해리 속도는 경쟁적 결합 분석법에 의해 측정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석법의 일례로 비표지 항원(양을 증가시킴) 존재하에 표지된 항원(예를 들어, 3H 또는 125I)을 관심있는 항체와 항온처리하는 단계 및 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방사성 면역분석법이 있다. RSV 항원에 대한 본 발명 항체의 친화력 및 결합 해리 상수는 또한 스캐챠드 플롯 분석에 의한 데이터로부터 결정할 수 있다. 2차 항체를 사용한 경쟁 역시 방사성 면역분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 이 경우, 비표지 2차 항체의 양을 증가시키면서 비표지 2차 항체 존재하에 RSV 항원을 표지된 화합물(예를 들어, 3H 또는 125I)에 접합된 본 발명 항체와 항온처리한다.
다른 실시형태에서, RSV 항원에 대한 항체의 결합 속도 및 해리 속도를 측정하기 위해 BIAcore 키네틱 분석을 이용한다. BIAcore 키네틱 분석은 표면 상에 항체가 고정화되어 있는 칩으로부터의 RSV 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 기법을 이용하여 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합을 억제하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 항체 존재 또는 부재하에 RSV에 대한 수용체를 발현하는 세포를 RSV와 접촉시킬 수 있고, 항체가 RSV의 결합을 억제하는 능력을, 예를 들어, 유세포 분석법 또는 신틸레이션 분석법에 의해 측정할 수 있다. RSV와 그 숙주 세포 수용체와의 상호작용을 검출할 수 있도록, RSV(예를 들어, F 당단백질 또는 G 당단백질과 같은 RSV 항원) 또는 항체를 방사능 표지(예를 들어, 32P, 35S 및 125I) 또는 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 파이코에리트린, 피아코시아닌, 알로파이코시아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레스카민)와 같은 검출 가능한 화합물로 표지할 수 있다. 대안으로, RSV가 그 수용체에 결합하는 것을 억제하는 항체의 능력은 무세포 분석법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, G 당단백질과 같은 RSV 또는 RSV 항원을 항체와 접촉시킬 수 있고, 항체가 RSV 또는 RSV 항원이 그 숙주 세포 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력을 측정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체를 고체 지지체 상에 고정화시키고, RSV 또는 RSV 항원을 검출 가능한 화합물로 표지한다. 대안으로, RSV 또는 RSV 항원을 고체 지지체 상에 고정화시키고, 상기 항체를 검출 가능한 화합물로 표지한다. RSV 또는 RSV 항원은 부분적으로 또는 완전히 정제된(예를 들어, 다른 폴리펩티드가 부분적으로 또는 완전히 제거된) 것이거나 세포 용해물의 일부일 수 있다. 또한, RSV 항원은 RSV 항원과 도메인(예컨대, 글루타티온 S 트랜스퍼라제)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 대안으로, RSV 항원은 당업자에게 잘 알려져 있근 기법(예를 들어, 비오틴화 키트, 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce Chemicals 제품)을 이용하여 비오틴화할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 RSV 복제를 억제 또는 하향조절하는 그 능력에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, RSV 복제는, 예를 들어 문헌[Johnson et al., 1997, Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224]에 기재된 것과 같은 플라크 분석법에 희애 분석될 수 있다. 본 발명의 변형된 항체는 또한, RSV 폴리펩티드의 발현을 억제 또는 하향조절하는 그 능력에 대해 분석될 수 있다. 웨스턴 블롯 분석, 노던 블롯 분석 및 RT-PCR을 포함하나 이들에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 기법을, RSV 폴리펩티드의 발현을 측정하는 데 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 합포체의 형성을 방지하는 그 능력에 대해 분석될 수 있다.
세포가 RSV 바이러스가 부착된 후 본원에 기재된 항체 또는 그 단편이 RSV 유도 융합을 차단하는 능력은 융합 억제 분석에 의해 측정된다. 이 분석은, 항원 첨가 전 4시간 동안 세포를 RSV(Long)로 감염시킨 것을 제외하고는, 마이크로중화 분석과 동일하다[Taylor et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:2217-2223].
본 발명의 변형된 항체 또는 조성물은 RSV 감염 조직/세포에 의한 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 및 IL-15 등의 사이토카인의 발현을 유도 또는 억제하는 능력에 대해 시험관내 및 생체내에서 테스트될 수 있다. 사이토카인의 발현 수치를 측정하기 위해 당업자에게 공지된 기법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인의 발현 수치는, 예를 들어, RT-PCR 및 노던 블롯 분석에 의해 사이토카인의 RNA 수준을 분석하고, 예를 들어, 면역침강에 이어 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA에 의해 사이토카인 수치를 분석함으로써 측정할 수 있다. 본 발명의 변형된 항체의 결과를, 본원에 기재된 변형을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 수 있다. 사이토카인 반응의 차이는 상대 백분율로 정량할 수 있다: 약 5% 차이, 약 10% 차이, 약 15% 차이, 약 20% 차이, 약 25% 차이, 약 30% 차이, 약 35% 차이, 약 40% 차이, 약 45% 차이, 약 50% 차이, 약 55% 차이, 약 60% 차이, 약 65% 차이, 약 70% 차이, 약 75% 차이, 약 80% 차이, 약 85% 차이, 약 90% 차이, 약 95% 차이, 약 100% 차이 등. 일 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 RSV 감염 조직/세포에 의한 사이토카인의 발현을 억제할 것으로 생각된다(실시예 참조).
대안으로, 사이토카인의 발현 수치는 인간 환자에서의 사이토카인의 혈청 수치를 분석함으로써 측정할 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 처리된 환자로부터 전혈 샘플을 채취하여 튜브에 넣는다. 이 혈액 샘플을 37℃, 5% CO2 포화 함습 인큐베이터에서 항온처리할 수 있다. 상기 혈액 샘플을 회전시켜 상청액을 분리하고, 급속 냉동시켜 -20℃에서 보관한다. 그 후, 당업자에게 잘 알려진 임의의 표준의 통상적인 생물학적 분석법에 의해 사이토카인을 분석할 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 수치, 예를 들어, TNF-α는 IRMA 키트(벨기에 브뤼셀 소재의 Medgenix 제품)를 사용하여 측정할 수 있다. 대안으로, 샘플 전혈 상청액에 대해, 특정 사이토카인에 대한 상업적으로 이용 가능한 특정 항체와 함께 RIA 분석법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 조성물은, RSV 감염 조직/세포에 반응하는 어펙터(affector) 및 기억 림프구에 의한 케모카인, 예컨대 당업자에게 잘 알려진 CC, CXC 또는 C 케모카인의 발현을 유도 또는 억제하는 능력에 대해 시험관내 및 생체내에서 테스트될 수 있다. 케모카인의 발현 수치를 측정하기 위해 당업자에게 공지된 기법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 케모카인의 발현 수치는, 예를 들어 RT-PCR 및 노던 블롯 분석에 의해 케모카인의 RNA 수치를 분석하고, 예를 들어 면역침강에 이어 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA에 의해 케모카인 수치를 분석함으로써 측정할 수 있다. 본 발명의 변형된 항체의 결과는 본원에 기재된 변형을 갖지 않는 동일한 항체와 비교할 수 있다. 케모카인 반응의 차이는 상대 백분율로 정량할 수 있다: 약 5% 차이, 약 10% 차이, 약 15% 차이, 약 20% 차이, 약 25% 차이, 약 30% 차이, 약 35% 차이, 약 40% 차이, 약 45% 차이, 약 50% 차이, 약 55% 차이, 약 60% 차이, 약 65% 차이, 약 70% 차이, 약 75% 차이, 약 80% 차이, 약 85% 차이, 약 90% 차이, 약 95% 차이, 약 100% 차이 등. 일 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는, RSV 감염 조직/세포에 반응하는 어펙터 및 기억 림프구에 의한 케모카인의 발현을 억제할 것으로 생각된다(실시예 참조).
대안으로, 케모카인의 발현 수치는 인간 환자에서의 케모카인의 혈청 수치를 분석함으로써 측정할 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 전혈 샘플 상청액을 얻은 후 ELISA를 이용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 및 자연 킬러 세포)의 생물학적 활성을 조절하기 위한 능력에 대해 시험관내 및 생체내에서 테스트될 수 있다. 본 발명 항체 또는 조성물이 면역 세포의 생물학적 활성을 조절하는 능력은 항원 발현을 검출하거나, 면역 세포의 증식을 검출하거나, 신호 전달 분자의 활성화를 검출하거나, 면역 세포의 이펙터 기능을 검출하거나, 면역 세포의 분화를 검출함으로써 측정할 수 있다. 당업자에게 공지된 기법이 이러한 활성을 측정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식을 3H 티미딘 혼입 분석 및 트립판 블루 세포 카운트에 의해 측정할 수 있다. 항원 발현은, 예를 들어 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 방사성 면역분석법, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침강 분석법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사 측정 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 및 FACS 분석법 등의 기법을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하나 이들에 한정되지 않는 면역분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 신호 전달 분자의 활성화는, 예를 들어 키나제 분석법 및 전기영동 이동도 분석법(EMSA)에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 또한 시험관내, 생체외 및 생체내 분석법으로 바이러스 복제를 억제하는 능력 또는 바이러스 부하를 감소시키는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체의 중화는 마이크로중화 분석법으로 측정할 수 있다. 상기 마이크로중화 분석법은 문헌[Anderson et al., (1985), J. Clin. Microbiol. 22:1050-1052](본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재된 절차의 변형법이다. 이 절차는 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Johnson et al., 1999, J. Infectious Diseases 180:35-40]에도 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 96웰 플레이트를 사용하여 3중으로 항체 희석액을 제조한다. 96웰 플레이트의 웰에서 바이러스와 테스트하고자 하는 본 발명 항체의 계열 희석액을 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. RSV 감수성 HEp-2 세포(2.5×104)를 각 웰에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양할 수 있다. 5일 후, 배지를 흡출하고, 80% 메탄올 및 20% BSA를 사용하여 세포를 세척하여 플레이트에 고정화하였다. RSV 복제는 F 단백질 발현에 의해 측정할 수 있다. 고정화된 세포는 비오틴 접합 항F 단백질 단일클론 항체[범(pan) F 단백질, C 부위 특이적 MAb 133-1H]와 함께 항온처리하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합 아비딘 및 기질 TMB(티오니트로벤조산)를 사용하여(450 nm에서 측정) 검출할 수 있다. 중화 역가는, 바이러스 단독 대조군 세포로부터 450 nm에서의 흡광도(OD450)를 적어도 50% 감소시킨 항체 농도로서 표현할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 RSV 감염(예를 들어, RSV URI 및/또는 LRI), 또는 이와 관련된 증상 또는 호흡기 병증(천식, 천명, RAD 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않음)의 시간 추이를 감소시키는 그 능력에 대해 테스트될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 조성물은 또한 RSV 감염(바람직하게는, RSV URI 및/또는 LRI)을 앓고 있는 인간의 생존 기간을 25% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 증가시키는 그 능력에 대해 테스트될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 조성물은 RSV 감염(바람직하게는, RSV URI 및/또는 LRI)을 앓고 있는 인간의 병원 치료 기간을, 위약에 비해 또는 본 발명 항체의 치료적 투여를 받지 않은 인간에 비해 60% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 감소시키는 그 능력에 대해 테스트될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 조성물의 생체내 기능을 분석하기 위해 당업자에게 공지된 기법을 이용할 수 있다.
IgG 및 이것의 FcRn 단편의 IgG 불변 도메인을 포함하는 분자의 FcRn에 대한 결합은 다양한 시험관내 분석법으로 규명할 수 있다. PCT 공개 공보 WO 97/34631(Ward)은 다양한 방법을 상세히 개시하고 있으며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
예를 들어, FcRn에 결합하는 본 발명의 변형된 항체 또는 그 단편의 능력을 비변형 또는 야생형 IgG의 능력과 비교하기 위해, 상기 변형된 IgG 또는 그 단편과 비변형 또는 야생형 IgG를 방사능으로 표지하고 시험관내에서 FcRn 발현 세포와 반응시킬 수 있다. 그 후, 세포 결합 분획의 방사능을 계측하고 비교할 수 있다. 이 분석법에 사용하기 위한 FcRn 발현 세포는 바람직하게는 B10.DBA/2 마우스의 폐로부터 유래된 마우스 폐 모세관 내피 세포(BlO, D2.PCE) 및 C3H/HeJ 마우스로부터 유래된 SV40 형질전환 내피 세포(SVEC)[Kim et al., J. Immunol., 40:457-465, 1994]를 비롯한 내피 세포주이다. 그러나, 충분한 수의 FcRn을 발현하는, 10∼14일령의 젖먹이 마우스로부터 단리한 장의 솔 모양 가장자리와 같은 다른 유형의 세포도 사용할 수 있다. 대안으로, 선택된 종의 FcRn을 발현하는 포유동물 세포도 사용할 수 있다. 변형된 IgG의 결합 분획 또는 비변형 또는 야생형 IgG의 결합 분획의 방사능을 계측한 후, 결합된 분자를 계면활성제로 추출하고, 세포수당 방출률(%)을 계산하여 비교할 수 있다.
FcRn에 대한 변형된 IgG의 친화력은, 예를 들어 종래에 공지된 것과 같은[Popov et al., MoI. Immunol., 33:493-502, 1996; Karlsson et al., J. Immunol. Methods, 145:229-240, 1991](이 문헌들은 본원에 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) BIAcore 2000(BIAcore Inc.)을 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 측정에 의해 측정할 수 있다. 이 방법에서는, FcRn 분자를 BIAcore 센서 칩(예를 들어, Pharmacia에 의해 제조된 CM5 칩)에 커플링하고, 변형된 IgG, 불변 도메인 또는 그 단편의 FcRn에 대한 결합 및 해리 속도에 기초하여, BIA 평가 2.1 소프트웨어를 이용한 센서그램을 얻기 위해 특정 유속으로 고정화된 FcRn에 대한 변형된 IgG의 결합을 측정한다.
또한, FcRn에 대한 변형된 IgG 또는 그 단편과 비변형 또는 야생형 IgG의 상대 친화력을 간단한 경쟁 결합 분석법에 의해 측정할 수 있다. FcRn이 고정화된 96웰 플레이트의 웰에 비표지된 변형된 IgG 또는 비변형 또는 야생형 IgG를 다양한 양으로 첨가한다. 그 후, 각 웰에 방사능 표지된 비변형 또는 야생형 IgG를 첨가한다. 결합된 분획의 방사능(%)을 비표지된 변형된 IgG 또는 비변형 또는 야생형 IgG의 양에 대해 플롯을 작성하고, 변형된 힌지-Fc의 상대 친화력을 곡선의 기울기로부터 계산할 수 있다.
또한, 변형된 IgG 또는 그 단편의 친화력 및 FcRn에 대한 야생형 IgG를 포화 연구 및 스캐챠드 분석에 의해 측정할 수 있다.
FcRn에 의한 세포를 관통하는 변형된 IgG 또는 그 단편의 전달은 방사능 표지된 IgG 또는 그 단편 및 FcRn 발현 세포를 사용한 시험관내 전달 분석법에 의해 측정하고, 세포 단층의 한쪽 면의 방사능과 다른 쪽 면의 방사능을 비교할 수 있다. 대안으로, 이러한 전달은 10∼14일령의 젖먹이 마우스에게 방사능 표지된 변형된 IgG를 공급하고 주기적으로 혈액 샘플 중의 방사능[이는 장에서 순환계(또는 임의의 다른 조직, 예를 들어 폐)로의 IgG의 전달을 나타냄]을 계측함으로써 측정할 수 있다. 장을 통한 IgG 전달의 용량 의존적 억제를 테스트하기 위해, 특정 비의 방사능 표지된 IgG 및 비표지된 IgG의 혼합물을 마우스에게 투여하고 혈장의 방사능을 주기적으로 측정할 수 있다[Kim et al., Eur. J. Immunol., 24:2429-2434, 1994].
변형된 IgG 또는 그 단편의 반감기는 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Kim et al., Eur. J. of Immuno. 24:542, 1994]에 기재된 방법에 따라 약동학적 연구에 의해 측정될 수 있다. 이 방법에 따르면, 방사능 표지된 변형된 IgG 또는 그 단편을 마우스에 정맥내 주사하고, 시간의 함수로서, 예를 들어 주사 후 3분∼72시간까지 주기적으로 측정한다. 이렇게 얻은 제거 곡선은 이상, 즉, α 상 및 β 상이어야 한다. 변형된 IgG 또는 그 단편의 생체내 반감기를 측정하기 위해, β 상에서의 제거 속도를 계산하여 비변형 또는 야생형 IgG의 제거 속도와 비교한다.
본 발명의 변형된 항체의 이펙터 기능은 ADCC 분석법에 의해 측정할 수 있다(실시예 참조). 크롬 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 문헌[Brunner, K.T. et al., (1968) Quantitative Assay of the Lytic Action of Immune Lymphoid Cells on Cr-labelled Allogenic Target Cells in-vitro; Inhibition by Iso- antibody and by Drugs, Immunology 14,181] 참조). 보다 최근에는, LDH 세포독성 분석법이 이용되고 있다. 이 분석법은 일반적으로 모든 세포의 사이토졸에서 확인되는 안정한 효소이나 원형질막이 손상되면 상청액으로 급속히 방출되는 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 활성을 측정하는 것에 기초한다. 결과는 500 nm에서의 분광광도법에 의해 분석할 수 있다.
5.6 항체의 제조 방법
항체에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 항체 합성을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 화학적 합성, 또는 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는다면, 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 하이브리드화 및 당업계의 기술 범위에 속하는 관련된 분야에서의 통상적인 기법을 이용한다. 이러한 기법들은 본원에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있으며, 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌[Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates)]; 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press]; 문헌[Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press]; 문헌[Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조할 수 있다.
특이적 RSV 항원(바람직하게는, RSV F 항원)을 인식하는 항체 단편은 당업자에게 공지된 임의의 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생성함) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성함)과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질 분해 절단에 의해 의해 제조할 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 부위, 경쇄 불변 부위 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이를 이용하여 생성할 수 있다.
예를 들어, 항체는 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성할 수도 있다. 파지 디스플레이 방법의 경우, 기능성 항체 도메인은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 특히, VH 도메인 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 손상된 조직의 인간 또는 쥐과 동물 cDNA 라이브러리)로부터 증폭시킨다. VH 도메인 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합하여 파지미드 벡터로 클로닝한다. 이 벡터를 이 콜라이(E. coli)로 전기천공하고, 이 이 콜라이를 헬퍼 파지로 감염시킨다. 이 방법에 사용된 파지는 일반적으로 fd 및 M13을 비롯한 필라멘트형 파지이며, VH 도메인 및 VL 도메인이 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합에 의해 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합성 도메인을 발현하는 파지는 항원에 의해, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택 또는 확인할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 파지 디스프레이법의 예로는 문헌[Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50]; 문헌[Ames et ai, 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186]; 문헌[Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958]; 문헌[Persic et al., 1997, Gene 187:9-18]; 문헌[Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280]; PCT 출원 PCT/GB91/O1 134; 국제 공개 공보 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 및 WO 97/13844; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호(이들 문헌은 각각 본원에서 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재된 것들을 들 수 있다.
상기 참고 문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선별 후, 파지 유래의 항체 코딩 부위를 단리하여, 이것을 사용하여 인간 항체를 비롯한 전체 항체, 또는 임의의 다른 소정의 항원 결합성 단편을 생성하고, 예를 들어 후술하는 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 비롯한 임의의 소정의 숙주에서 발현시킨다. Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 제조하는 기법은 또한 PCT 공개 공보 WO 92/22324; 문헌[Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869]; 문헌[Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34]; 및 문헌[Better et al., 1988, Science 240:1041-1043](이들 참고 문헌은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PCR 프라이머, 제한 부위 및 제한 부위를 보호하기 위한 인접 서열을 사용하여 scFv 클론에서 VH 또는 VL 서열을 증폭시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기법을 이용하여, PCR 증폭 VH 도메인을 VH 불변 부위, 예를 들어 인간 감마 4 불변 부위를 발현하는 벡터로 클로닝하고, PCR 증폭 VL 도메인을 VL 불변 부위, 예를 들어 인간 카파 또는 람다 불변 부위를 발현하는 벡터로 클로닝할 수 있다. 바람직하게는, VH 또는 VL 도메인을 발현시키기 위한 벡터는 EF-1α 프로모터, 분비 서열, 불변 도메인, 가변 도메인을 위한 클로닝 부위 및 네오마이신과 같은 선별 마커를 포함한다. VH 도메인 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 부위를 발현시키는 하나의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 그 후, 당업자에게 공지된 기법을 이용하여, 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터를 세포주로 동시 형질감염시켜, 전체 길이 항체(예를 들어, IgG)를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성한다.
항체의 인체 내 사용 및 시험관내 검출 분석법을 비롯한 일부 용도를 위해서는, 인간 또는 키메라 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 인간 피험체의 치료적 처리를 위해서는 완전한 인간 항체가 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열 유래의 항체 라이브러리를 사용하여 전술한 파지 디스플레이법을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 국제 공개 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741를 참조할 수 있다.
또한, 인간 항체는 기능적인 내인성 면역글로불린을 발현시킬 수는 없으나 인간 면역글로불린 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자 이식 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 면역글로불린과 인간 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 무작위 또는 상동성 재조합을 통해 마우스 배아 줄기 세포로 도입할 수 있다. 대안으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에도 인간 가변 부위, 불변 부위 및 다양성 부위를 마우스 배아 줄기 세포로 도입할 수 있다. 상기 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 동시에 또는 별도로 비기능성이 될 수 있다. 특히, JH 부위의 동형접합 결실은 내인성 항체 생산을 막는다. 변형된 배아 줄기 세포를 증식시켜 배반포로 미세주입하여 키메라 마우스를 생성한다. 그 후, 이 키메라 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현시키는 동형 접합성 새끼를 얻는다. 이 유전자 이식 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 본 발명 폴리펩티드 전부 또는 일부를 사용하여 일반적인 방식으로 면역화한다. 통상적인 하이브리도마 기법을 이용하여, 면역화된 유전자 이식 마우스로부터 상기 항원에 대해 유도된 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 유전자 이식 마우스가 보유하는 인간 면역글로불린 이식 유전자는 B 세포 분화 과정에서 재배열되고, 그 후, 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기법을 이용하면, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 제조할 수 있다. 인간 항체를 제조하기 위한 이러한 기법에 관한 개요는, 문헌[Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]을 참조할 수 있다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 이러한 기법 및 이러한 항체를 제조하기 위한 프로토콜에 관한 상세한 고찰은, 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939,598호를 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 또한, Abgenix, Inc.(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 Genpharm(미국 캘리포니아주 산 호세 소재)는 전술한 것과 유사한 기법을 이용하여 특정 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공할 수 있다.
키메라 항체란 항체의 서로 다른 부분이 서로 다른 면역글로불린 분자로부터 유래되는 분자를 말한다. 키메라 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison, 1985, Science 229:1202]; 문헌[Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214]; 문헌[Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호, 제4,816,567호, 제4,816,397호 및 제6,331,415호를 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
인간화 항체란 특정 항원에 결합할 수 있고 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 골격구조 부위 및 실질적으로 비인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체 또는 그 변이체 또는 그 단편이다. 인간화 항체는 실질적으로 전부 적어도 1개, 일반적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv)을 포함하며, 이때 모든 CDR 부위의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린(즉, 도너 항체)에 해당하고, 골격구조 부위의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열의 것에 해당한다. 바람직하게는, 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 부위(Fc)(일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 부위)의 적어도 일부분을 포함한다. 일반적으로, 상기 항체는 경쇄뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인을 둘 다 포함한다. 상기 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 부위를 포함할 수 있다. 상기 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 면역글로불린 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 lgG4를 비롯한 임의의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 상기 불변 도메인은 인간화 항체가 세포독성 활성을 나타내는 것이 바람직한 경우 보체 고정 불변 도메인이며, 상기 클래스는 일반적으로 IgG1이다. 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우, 상기 불변 도메인은 IgG2 클래스일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 사용될 수 있는 VL 및 VH 불변 도메인으로는 문헌[Johnson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176, 1215-1224]에 기재된 C-카파 및 C-감마-1(nG1m) 및 미국 특허 제5,824,307호에 기재된 것들을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 상기 인간화 항체는 하나보다 많은 클래스 또는 이소타입을 포함할 수 있으며, 원하는 이펙터 기능을 최적화하기 위한 특정 불변 도메인의 선택은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 인간화 항체의 골격구조 및 CDR 부위는 모 서열과 정확히 일치해야 할 필요는 없으며, 예를 들어, 도너 CDR 또는 공통 골격구조는 하나 이상의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이되어, 그 위치에서의 CDR 또는 골격구조 잔기가 공통 항체 또는 임포트 항체와 일치하지 않도록 할 수 있다. 그러나, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 통상적으로, 인간화 항체 잔기의 75% 이상, 더 흔하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상이 모 FR 서열 및 CDR 서열의 것과 일치한다. 인간화 항체는 CDR 그래프팅(유럽 특허 EP 239,400; 국제 공개 공보 WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(유럽 특허 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호) 및 예를 들어, 미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000)], 문헌[Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000)], 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997)], 문헌[Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996)], 문헌[Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995)], 문헌[Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995)], 문헌[Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994)], 및 문헌[Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기법을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 출원 US 2005/0042664 A1(2005년 2월 24일)도 참조할 수 있다. 흔히, 골격구조 부위의 골격구조 잔기를 CDR 도너 항체 유래의 상응하는 잔기로 치환시켜, 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시킨다. 이러한 골격구조 치환은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 골격구조 잔기를 확인하기 위해 CDR과 골격구조 잔기의 상호작용을 모델링하고 특정 위치에서의 특이한 골격구조 잔기를 확인하기 위해 서열 비교를 행함으로써 확인한다(예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 Queen 등의 미국 특허 제5,585,089호; 및 문헌[Reichmann et al., 1988, Nature 332:323] 참조).
단일 도메인 항체, 예를 들어, 경쇄가 결여된 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본원에 각각 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231:25-38]; 문헌[Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263]; 문헌[Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277-302]; 미국 특허 제6,005,079호; 및 국제 공고 공보 WO 94/04678, WO 94/25591 및 WO 01/44301을 참조할 수 있다.
또한, RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에 잘 알려진 기법을 이용하여 항원을 "모방하는" 항이디오타입 항체를 생성하는 데 이용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444]; 및 문헌[Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438] 참조).
5.6.1 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명의 (변형된) 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 상기 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), MEDI-524, A4B4-F52S, A17d4(1), A3e2, A14a4, A16b4, A17b5, A17f5 또는 A17h4의 아미노산 서열은 알려져 있기 때문에(예를 들어, 표 1 참조), 이러한 항체 및 이러한 항체의 변형된 형태를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 결정할 수 있는데, 즉, 특정 아미노산을 코딩하는 것으로 알려진 뉴클레오티드 코돈을 상기 항체를 코딩하는 핵산을 생성하도록 조립한다. 상기 항체를 코딩하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있으며(예를 들어, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기재됨), 간략히 설명하면, 이 방법은, 항체, 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 서열의 일부분을 포함하는 중복 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계, 이러한 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 결찰시키는 단계 및 그 후 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 단계를 포함한다.
대안으로, 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 공급원 유래의 핵산으로부터 생성할 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론은 이용 가능하지 않지만, 그 항체 분자의 서열이 알려져 있다면, 그 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 화학적으로 합성하거나, 적절한 공급원(예를 들어, 본 발명 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같이 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 항체 cDNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리, 또는 그로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA)으로부터 서열의 3' 말단과 5' 말단에 하이브리드화할 수 있는 합성 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시함으로써, 또는 예를 들어 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리 유래의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 클로닝을 실시함으로써 얻을 수 있다. 그 후, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 이용하여 복제 가능한 클로닝 벡터로 클로닝할 수 있다.
5.6.2 돌연변이 유발
항체의 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 항체의 뉴클레오티드 서열을 뉴클레오티드 서열의 조작을 위한 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기법, 위치 지정 돌연변이 유발법, PCR 등(예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] 및 문헌[Ausubel et al., eds., 1998, Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]에 기재된 기법 참조)을 이용하여 조작하여, 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 항체를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 항체의 에피토프 결합성 도메인 부위에, 및/또는 FcRn과의 상호작용에 관여하는 항체의 힌지-Fc 부위에 도입된다.
특정 실시형태에서, 통상의 재조합 DNA 기법을 이용하여 하나 이상의 CDR을 골격구조 부위 내에 삽입한다. 상기 골격구조 부위는 천연 또는 공통 골격구조 부위, 바람직하게는 인간 골격구조 부위일 수 있다(예를 들어, 인간 골격구조 부위에 대해서는 문헌[Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479] 참조). 바람직하게는, 골격구조 부위와 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드 서열은 RSV F 항원과 같은 특정 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환을 골격구조 부위 내에 발생시킬 수 있으며, 바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 항체의 그 항원에 대한 결합을 개선시킨다. 또한, 이러한 방법은 하나 이상의 사슬내 디설파이드 결합이 결여된 항체 분자를 생성하기 위해 사슬내 디설파이드 결합에 관여하는 하나 이상의 가변 부위 시스테인 잔기에 아미노산 치환 또는 결실을 발생시키는 데 이용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 다른 변경도 본 발명에 포함되며 당업계의 기술 범위에 있다.
돌연변이 유발은, 변형시킬 항체 또는 그 단편의 불변 도메인(예를 들어, CH2 또는 CH3 도메인) 서열 내에 하나 이상의 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 기법에 따라 수행할 수 있다. 위치 특이적 돌연변이 유발에 의하면, 원하는 돌연변이를 갖는 DNA 서열을 코딩하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열과, 충분한 크기와 서열 복잡성을 갖는 프라이머 서열을 제공하기 위한 충분한 수의 인접 뉴클레오티드를 사용함으로써, 결실 접합부의 양측을 가로지르는 안정한 이중 가닥을 형성하는 것이 가능하다. 일반적으로, 길이가 약 17개∼약 75개 뉴클레오티드 또는 그 이상인 프라이머가 바람직하며, 서열 접합부 양측의 약 10개∼약 25개 또는 그 이상의 잔기가 변경된다. 하나 이상의 위치에 다종 다양한 돌연변이를 도입하는 다수의 그러한 프라이머가 돌연변이체 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
위치 특이적 돌연변이 유발 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 각종 간행물에 예시되어 있다(예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Kunkel et al., Methods Enzymol., 154:367-82, 1987] 참조). 일반적으로, 위치 지정 돌연변이 유발은 먼저 원하는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 서열 내에 포함하는 단일 가닥 벡터를 얻거나 이중 가닥 벡터의 두 가닥을 용융시켜 분리함으로써 수행한다. 원하는 돌연변이된 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 일반적으로 합성에 의해 제조한다. 그 후, 이 프라이머를 단일 가닥 벡터와 어닐링하고, T7 DNA 폴리머라제와 같은 DNA 중합 효소에 노출시켜, 돌연변이를 보유한 가닥의 합성을 완료한다. 이로써, 이형 이중 가닥(헤테로듀플렉스)이 형성되며, 이때 제1 가닥은 최초의 비돌연변이 서열을 코딩하고 제2 가닥은 원하는 돌연변이를 보유한다. 그 후, 상기 이형 이중 가닥 벡터를 사용하여 이. 콜라이 세포와 같은 적절한 세포를 형질전환 또는 형질감염시키고, 돌연변이된 서열 배열을 보유하는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다. 알려진 바와 같이, 이 기법은 일반적으로 단일 가닥 형태와 이중 가닥 형태 둘 다로 존재하는 파지 벡터를 이용한다. 위치 지정 돌연변이 유발에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파지와 같은 벡터를 포함한다. 이러한 파지는 상업적으로 용이하게 입수할 수 있으며, 그 용도는 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있다. 이중 가닥 플라스미드는 또한 관심있는 유전자를 플라스미드로부터 파지로 전달하는 단계를 생략한 위치 지정 돌연변이 유발에 통상적으로 사용되고 있다.
대안으로, Taq DNA 폴리머라제와 같은 시판되는 열 안정성 효소를 사용한 PCRTM을 이용하여 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 증폭된 DNA 단편으로 도입하고, 그 후 이것을 적절한 클로닝 또는 발현 벡터로 클로닝할 수 있다. PCRTM 매개성 돌연변이 유발 절차에 대해서는, 예를 들어 문헌[Tomic et al., Nucleic Acids Res., 18(6):1656, 1987] 및 문헌[Upender et al., Biotechniques, 18(1):29-30, 32, 1995]을 참조할 수 있으며, 이 문헌은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 또한, 열 안정성 폴리머라제 이외에도 열 안정성 리가제를 사용하는 PCRTM을 이용하여 인산화된 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 증폭된 DNA 단편으로 도입하고, 그 후 이것을 적절한 클로닝 또는 발현 벡터로 클로닝할 수 있다(예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Michael, Biotechniques, 16(3):410-2, 1994] 참조).
항체 또는 그 단편의 Fc 도메인의 서열 변이체를 제조하기 위한 당업자에게 공지된 다른 방법도 이용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그 단편의 불변 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 벡터를 하이드록실아민과 같은 돌연변이 유발제로 처리하여 서열 변이체를 얻을 수 있다.
5.6.3 패닝(Panning)
아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편을 발현하는 벡터, 특히, 파지를, FcRn에 대한 증가된 또는 감소된 친화력을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편을 확인하기 위해 스크리닝할 수 있다. 아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편의 FcRn에 대한 결합을 분석하는 데 이용될 수 있는 면역분석법으로는 방사성 면역분석법, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법 및 형광 면역분석법을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 분석법은 통상적인 것으로서 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). 대표적인 면역분석법에 대해서는 이하에서 간략히 설명한다(단, 이것은 한정을 의도한 것이 아니다). BIAcore 키네틱 분석은 또한 아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편의 FcRn에 대한 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. BIAcore 키네틱 분석은 표면 상에 FcRn이 고정화되어 있는 칩에 대한 또는 그 칩으로부터의 아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 갖는 불변 도메인 또는 그 단편의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
5.6.4 서열 결정
당업계에 공지된 임의의 다양한 서열 결정 반응을 이용하여, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 Fc 도메인 변형을 갖는 가변 영역 및/또는 불변 도메인 또는 그 단편을 코딩하는 뉴크레오티드 서열을 직접 결정할 수 있다. 서열 결정 반응의 예로는 Maxim 및 Gilbert가 개발한 기법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560, 1977] 또는 Sanger가 개발한 기법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463, 1977]에 기초한 기법들을 포함한다. 질량 분광분석법에 의한 서열 결정(예를 들어, PCT 공개 공보 WO 94/16101, 문헌[Cohen et al., Adv. Chromatogr., 36:127-162, 1996] 및 문헌[Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38:147-159, 1993] 참조)을 비롯한 임의의 다양한 자동 서열 결정법을 이용하는 것도 고려해 볼 수 있다[Bio/Techniques, 19:448, 1995].
5.6.5 항체의 재조합 발현
RSV 항원(예를 들어, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 중쇄 또는 경쇄 또는 본 발명의 단일쇄 항체)의 재조합 발현에는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 구성이 필요하다. 본 발명의 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그 단편(반드시는 아니지만 바람직하게는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 포함함)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 항체 분자의 제조를 위한 벡터를 당업계에 잘 알려진 기법을 이용한 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있다. 따라서, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성하기 위해 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들어 시험관내 재조합, DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 그 단편, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역(예를 들어, 국제 공개 공보 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄 또는 전체 중쇄와 전체 경쇄 둘 다의 발현을 위한 벡터로 클로닝될 수 있다.
통상적인 기법에 의해 상기 발현 벡터를 숙주 세포로 전달하고, 그 후 형질감염된 세포를 통상적인 기법에 의해 배양하여 본 발명의 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 항체 또는 그 단편, 그 중쇄 또는 경쇄, 또는 그 단편, 또는 본 발명의 단일쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 이중쇄 항체의 발현에 관한 다른 실시형태에서는, 아래에 상세히 설명하는 바와 같이, 중쇄와 경쇄를 둘 다 코딩하는 벡터를 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 동시에 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해 각종 숙주 발현 시스템이 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,807,715호 참조). 이러한 숙주 발현 시스템은 관심있는 코딩 서열을 제조한 후 정제하는 데 사용될 수 있는 운반체를 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염되었을 때 계내에서 본 발명의 항체 분자를 발현하는 세포를 나타낸다. 이러한 벡터로는 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 박테리아[예를 들어, 이 콜라이 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)]; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모[예를 들어, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)]; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터[예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV)]에 의해 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti plasmid)에 의해 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포 게놈 유래의 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구성체를 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0 및 3T3 세포)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 특히, 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 박테리아 세포, 더 바람직하게는, 진핵 세포를 재조합 항체 분자의 발현에 사용한다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로 바이러스 유래의 주요 즉시 초기 유전자 프로모터와 같은 벡터와 함께 사용되는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다[Foecking et al., 1986, Gene 45:101; 및 Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2]. 특정 실시형태에서, RSV 항원(바람직하게는, RSV F 항원)에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항상성(constitutive) 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템의 경우, 발현되는 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라, 다수의 발현 벡터를 유익하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학적 조성물의 제조를 위해 이러한 항체를 다량 제조하고자 할 경우, 정제가 용이한 융합 단백질 생성물을 고도로 발현하도록 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 이 콜라이 발현 벡터 pUR278[(Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791](여기서 항체 코딩 서열은 lac Z 코딩 부위와 프레임 내가 되도록 벡터로 개별적으로 도입되어, 융합 단백질이 생성됨); pIN 벡터[Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509] 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키기 위해, pGEX 벡터를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온 존재하에서의 용리를 수행함으로써, 용해된 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. 상기 pGEX 벡터는 클로닝된 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 유리될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인된다.
곤충 시스템의 경우, 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)를 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 상기 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 증식한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수 부위(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)로 개별적으로 클로닝되어 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 배치될 수 있다.
포유동물 숙주 세포의 경우, 다수의 바이러스에 기초한 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 관심있는 항체 코딩 서열을 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3부 리더 서열에 결찰시킬 수 있다. 그 후, 상기 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈으로 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 부위(예를 들어, 부위 E1 또는 E3)에의 삽입은 생존 가능하고 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 생성시킨다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359] 참조). 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 상기 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역이 담보되도록 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임에 맞아야 한다. 이러한 이종성 번역 신호 및 개시 코돈은 천연일 수도 있고 합성일 수도 있으며 그 기원이 다양할 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결 서열 등을 포함시켜 증대시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하고 유전자 생성물을 원하는 특이적 방식으로 가공하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 다양한 숙주 세포가 번역 후 가공 및 단백질 및 유전자 생성물의 변형에 대한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 담보하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주계를 선택할 수 있다. 이를 위해, 1차 전사체의 적절한 가공, 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포내 기관을 보유하는 진핵 숙주 세포가 이용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NSO(임의의 면역글로불린 쇄를 내인적으로 생성하지 않는 쥐과 동물 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
재조합 단백질을 장기간 동안 고수율로 발현하기 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스의 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA 및 선별 마커로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 농축 배지에서 1∼2일 동안 증식시킨 후 선택 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드 내의 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그 염색체로 안정하게 통합시켜, 콜로니를 형성할 수 있도록 하며, 이는 다시 클로닝되어 세포주로 증식될 수 있다. 이 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는 데 유익하게 이용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용하게 사용될 수 있다.
허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제[Wigler et al., 1977, Cell 11:223], 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17] 유전자를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다수의 선별 시스템이 각각 tk- 세포, hgprt- 세포 또는 aprt- 세포에 이용될 수 있다. 또한, 하기 유전자를 선별하기 위한 기초로서 대사길항물질을 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt[Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo[Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Bichem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-215]; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro[Santerre et al., 1984, Gene 30:147]. 재조합 DNA 기술 분야에 일반적으로 알려진 방법이 원하는 재조합 클론을 선택하는 데 통상적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법들은, 예를 들어 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; 문헌[Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stcokton Press, NY (1990)]; 문헌[Chapters 12 and 13, Dracopoli et al., (eds.), Current protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]; 문헌[Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다(참고 문헌: Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)]). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서의 마커가 증폭 가능한 것일 경우, 숙주 세포의 배양물 중에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 부위가 항체 유전자와 관련이 있기 때문에, 항체의 생산 역시 증가하게 된다[Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257].
상기 숙주 세포는 본 발명의 2개의 발현 벡터로 동시에 형질감염시킬 수 있으며, 이때 제1 벡터는 중쇄 유래의 폴리펩티드를 코딩하고, 제2 벡터는 경쇄 유래의 폴리펩티드를 코딩한다. 상기 2개의 벡터는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드를 동일하게 발현할 수 있도록 하는 동일한 선별 마커를 포함할 수 있다. 대안으로, 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드를 둘 다 코딩하여 발현시킬 수 있는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황에서, 상기 경쇄는 과량의 독성 유리 중쇄를 방지하기 위해 중쇄 앞에 배치되어야 한다[Proudfoot, 1986, Nature 322:52; 및 Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199]. 상기 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합 발현에 의해 제조되면, 이것을 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정제할 수 있다. 이것은 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A 등의 특정 항원에 대한 친화성을 이용한 친화성 크로마토그래피 및 크기 분별(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이를 이용한 방법, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제할 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위해, 본 발명의 항체를 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합시킬 수 있다
6. 실시예
실시예 1: MEDI-524 처리는 RSV 유도 사이토카인 반응을 조절함
MEDI-524를 감염 후 RSV 감염 상피 세포에 첨가하여, 항체의 투여가 RSV 감염 세포로부터의 사이토카인 방출을 조절할 수 있는지를 관찰하였다. 2 시점의 감염을 수행하였는데, 제1 시점은 감염 후 1시간째였고, 제2 시점은 감염 후 12시간째였다.
12시간 시점: 2∼12웰 플레이트에 HEp-2(9대 계대) 세포를 2 ml의 양으로 5×105개 세포/웰로 시딩하고, 대략 하루 배양하여 포화 상태(confluency)가 되게 하였다. 포화 상태의 Hep-2 세포를 RSV A 바이러스(WVB032302)에 의해 MOI = 1로 감염시켰다. 감염 12시간 후, 대조군 항체 MEDI-507(20 ㎍/ml) 또는 MEDI-524(52405G-0964)(20 ㎍/ml)를 해당 웰에 첨가하였다. 이 세포를 37℃/5% CO2에서 6시간 또는 24시간 동안 더 배양하였다. 6시간 또는 24시간 시점에 상청액을 수집하여(1,500 rpm으로 5분 동안 회전시킴), 분석시까지 -80℃에 보관하였다.
1시간 시점: 6∼12웰 플레이트에 HEp-2 P10 세포를 2 ml의 양으로 5×105개 세포/웰로 시딩하고, 대략 하루 배양하여 포화 상태가 되게 하였다. 포화 상태의 Hep-2 세포를 RSV A 바이러스(WVB032302)에 의해 MOI = 0.5 또는 1.0 또는 5.0으로 감염시켰다. 감염 1시간 후, 접종물을 제거하고, 10 /ml의 대조군 항체 MEDI-507(10.1 mg/ml 저장 용액), 10 ㎍/ml의 MEDI-524(52405G-0336, 10.2 mg/ml 저장 용액) 또는 10 ㎍/ml의 MEDI-524 Fab 2'(KS011107, 2.75 mg/ml 저장 용액)을 함유한 새로운 배지 1 ml를 감염된 세포에 첨가하였다. 이 세포를 37℃/5% CO2에서 6시간 및 24시간 동안 더 배양하였다. 6시간 또는 24시간 시점에 상청액을 수집하여(1,500 rpm에서 5분 동안 회전시킴), 분석시까지 -80℃에 보관하였다.
IL-6, IL-8, IL-12p70 및 TNF-알파를 분석하기 위해, MesoScale Discovery
Figure pct00007
멀티플렉스 키트 - MS6000 인간 향염증성-7 조직 배양 키트(Cat# K11008B) 및 MS6000 인간 케모카인-9 조직 배양 키트(Cat# K11001B)를 사용하여 전술한 수집된 상청액에 대해 사이토카인 분석을 수행하였다. 결과는 도 1 및 도 2에 도시되어 있다. 이 실험은 12시간째가 아니라 1시간째 더 일찍 치료 목적으로 MEDI-524를 투여하여, MEDI-524를 감염된 세포와 함께 24시간이 아니라 6시간 동안 항온처리하는 것이 RSV 감염 세포의 사이토카인 방출을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 2: MEDI-524 매개성 THP-1 활성화
MEDI-524 처리가 RSV 감염 세포에 반응하여 활성화된 THP-1 세포의 케모카인 반응을 조절할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다
4∼12웰 플레이트에 HEp-2 P10 세포(8대 계대)를 2 ml의 양으로 5×105개 세포/웰로 시딩하였다. 14대 계대한 THP-1 세포(3×105개 세포/ml, 15 ml)와 27대 계대한 THP-1 세포(3.0×105개 세포/ml, 15 ml)를 IFN-γ(최종 농도 500 U/ml, 15 ml에 대해 15 ㎕)로 48시간 동안 활성화하였다.
약 36시간 배양한 후, 24웰 플레이트 내의 포화 상태의 HEp-2 세포를 RSV A (8×106 pfu/ml)에 의해 MOI = 1로 감염시켰다. 12∼15시간 후, 감염 배지를 흡출하고 FACS 완충액(2% FBS를 함유한 1× PBS)으로 1회 세정하였다. 대조군 항체 MEDI-507, 또는 MEDI-524(52405G-0336, 10.2 mg/ml), 또는 MEDI-524 Fab'2(KS011107, 2.75 mg/ml)를 FACS 완충액에 첨가하여 최종 농도를 20 ㎍/ml로 만들어 해당 웰에 첨가하였다. 실온에서의 15분간의 항온처리 후, 항체 함유 FACS 완충액을 흡출하고 새로운 THP-1 배지로 1회 세정하였다.
48시간 동안 활성화시킨 THP-1 세포를 회전시켜 가라앉히고 (임의의 과잉 IFN-γ를 제거하기 위해) 새로운 THP-1 배지에 재현탁시켰다. (THP-1 배지 중의) THP-1 세포 1 ml를 적절한 웰의 HEp-2 세포에 첨가하여 6시간 및 24시간 동안 항온처리하였다. RSV 감염 Hep-2 세포 대 THP-1 활성화 세포의 비는 약 2:1이었다. 동시 배양 6시간 및 24시간 후, 상청액을 수집하여 회전시켜 가라앉혀서(1,500 rpm, 5분) 분석시까지 -80℃에 저장하였다.
케모카인 방출을 분석하기 위해, MesoScale Discovery
Figure pct00008
멀티플렉스 키트 - MS6000 인간 향염증성-7 조직 배양 키트(Cat# K11008B) 및 MS6000 인간 케모카인-9 조직 배양 키트(Cat# K11001B)를 사용하여 전술한 수집된 상청액에 대해 사이토카인 분석을 수행하였다. MIP-1b, MCP-1, IP-10 및 에오탁신-3만이 유도될 수 있는 것으로 측정되었다. 결과는 도 3 및 4에 도시되어 있다. 이 실험은 MEDI-524을 사용한 처리가 활성화된 THP-1 단핵구로부터의 MIP-1b, MCP-1, IP-10 및 에오탁신-3의 방출을 유도할 수 있으나, 다른 것들은 명백히 그렇지 않음을 보여준다.
실시예 3: MEDI-524 매개성 THP-1 식작용
MEDI-524 처리가 RSV 감염 세포의 단핵구 식작용을 매개할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
친유성 염료를 사용한 HEp-2 세포의 염색: 5대 계대한 HEp-2 세포의 수를 세어 50 ml 원추형 튜브 내의 HBSS에 1×106개 세포/ml로 재현탁시켰다. 그 후, HBSS-세포 현탁액 ml당 청색 염료(Vybrant® DiD 세포 표지 용액, #V22887, Invitrogen
Figure pct00009
) 2.5 ㎕를 첨가하였다. 이 세포를 37℃에서 20분 동안 항온처리하고, 5분마다 3회씩 50 ml 튜브에서 위아래로 뒤집어 주었다. HBSS를 사용하여 1,700 rpm으로 5분 동안 세포를 4회 세척하였다. 세포를 완전 배지에 재현탁시켜서, 12웰 플레이트에 2 ml 부피로 5×105개 세포/웰로 플레이팅하였다(세포는 48시간 후 포화 상태가 되었다).
THP-1 세포의 활성화: 19대 계대한 3×105개 세포/ml의 THP-1 세포 12 ml를 500 U/ml IFN-γ(THP-1 세포 12 ml당 12 ㎕)로 활성화시키고, 37℃에서 48시간 동안 항온처리하였다.
RSV에 의한 HEp-2 세포의 감염: 포화 상태의 HEp-2 세포를 MOI 1로 RSV A (WVB032302)에 의해 20시간 동안 감염시켰다. 그 후, RSV 감염 HEp-2 플레이트로부터 배지를 흡출하였다. 각각의 플레이트 웰에 세포 해리 완충액 1 ml를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 항온처리하였다. HEp-2 세포를 1000 ㎕ 피펫 팁으로 해리시켜 유동 튜브로 옮겼다. 각각의 튜브에 2 ml의 FACS 세척 완충액을 첨가하고 1,500 rpm으로 5분 동안 세척하였다. HEp-2 세포를 100 ㎕의 FACS 세척 완충액에 재현탁시키고, 세포 현탁액에 대조군 항체 MEDI-507(20 ㎍/ml), MEDI-524(20 ㎍/ml) 및 MEDI-524 FAb'2(20 ㎍/ml)를 첨가하여, 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. HEp-2 세포를 2 ml의 FACS 세척 완충액을 사용하여 1,500 rpm/5분/4℃로 세척하였다. HEp-2 세포를 100 ㎕의 THP-1 배지에 재현탁시켰다. 활성화된 THP-1 세포(3×105개 세포/ml, 12 ml)를 회전시켜 가라앉히고 12 ml의 새로운 THP-1 배지에 재현탁시켜 임의의 과잉 IFN-γ를 제거하였다. 차등적으로 처리된 HEp-2 세포가 첨가된 12웰 플레이트에 THP-1 세포 1 ml를 첨가하고, 37℃에서 16시간 동안 항온처리하였다. 16시간 후, 세포를 유동 튜브에 분액하였다(하기 참조).
세포를 FACS 세척 완충액으로 1회 세척하고 FACS 세척 완충액 100 ㎕에 재현탁시켰다. 해당 튜브를 실온의 암소에서 8 ㎕의 HLADR-PE(555812, BD Biosciences
Figure pct00010
)로 15분 동안 염색하였다. 세포를 FACS 세척 완충액으로 1회 세척하고, 1% 포름알데히드로 15분 동안 고정하였다. FACS 세척 완충액으로 고정제를 세척하고, 세포를 200 ㎕의 FACS 세척 완충액에 재현탁시켜 96웰 NUNC 플레이트로 옮겨서 LSRII(녹색) 상에서 전개하였다.
유동 튜브:
1) 비염색 THP-1 + 비염색 HEp-2
2) 비염색 HEp-2 + THP-1 + HLADR-PE
3) 염색 HEp-2 + 비염색 THP-1
4) 비감염 염색 HEp-2 + THP-1 + HLADR-PE
5) RSV 감염 염색 HEp-2 + THP-1 + HLADR-PE
6) RSV 감염 염색 HEp-2 + Medi507 + THP-1 + HLADR-PE
7) RSV 감염 염색 HEp-2 + Medi524 + THP-1 + HLADR-PE
8) RSV 감염 염색 HEp-2 + Medi524 + THP-1 + HLADR-PE
9) RSV 감염 염색 HEp-2 + Numax FAB'2 + THP-1 + HLADR-PE
10) RSV 감염 염색 HEp-2 + Numax FAB'2 + THP-1 + HLADR-PE
튜브 번호 7∼8과 9∼10은 반복용 웰이다. 모든 THP-1 세포는 IFN-γ 활성화 세포였다. 그 결과는 도 5에 도시되어 있다. 도 5는 MEDI-524를 사용한 치료가 RSV 감염 세포의 THP-1 단핵구 식작용을 매개할 수 있다(RSV-inf Hep-2+MEDI-524+THP-1 패널 참조).
실시예 4: ADCC 이펙터 기능
항체 의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)이 MEDI-524 또는 MEDI-524 3M을 사용한 RSV 처리에서 역할을 하는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
T75 조직 배양 플라스크에 11대 계대한 3.5×106개 세포 20 ml를 시딩하고 포화 상태가 될 때까지 배양하였다. 약 36시간 후, 포화 상태의 HEp-2 세포를 MOI를 1.0으로 하여 RSV A로 감염시켰다.
표적 세포: 감염 12시간 후, 감염된 HEp-2 세포를 해리시키고 5% FBS(RP-5)가 함유된 RPMI 1640(페놀 레드 비함유)에 4×105개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다.
이펙터 세포: 31대 계대한 NK 세포를 RO-5 배지에 10×105개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다.
항체: MEDI-524(52405G-0336), MEDI-524-3M(Kabat 넘버링에 따라, 239D, 330L, 332E) 및 대조군 항체 R347을 RP-5에 희석률 10배로 10 ㎍/ml∼0.1 ng/ml의 농도로 희석시켰다.
ADCC 분석: R347 50 ㎕, 표적 세포 50 ㎕ 및 이펙터 세포 50 ㎕를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 A 열에 이중으로 첨가하였다(E:T 비 = 2.5:1). MEDI-524 50 ㎕, 표적 세포 50 ㎕ 및 이펙터 세포 50 ㎕를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 B 열에 이중으로 첨가하였다(E:T 비 = 2.5:1). Medi524-3M 50 ㎕, 표적 세포 50 ㎕ 및 이펙터 세포 50 ㎕를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 C 열에 이중으로 첨가하였다(E:T 비 = 2.5:1). D 열은 하기 대조군을 이중으로 포함하였다:
Tonly - 표적 세포 50 ㎕ + RP-5 100 ㎕
Tmax - 표적 세포 50 ㎕ + RP-5 80 ㎕(+ 용해 완충액 20 ㎕)
T+E - 표적 세포 50 ㎕ + 이펙터 세포 50 ㎕ + RP-5 50 ㎕
배지 - RP-5 150 ㎕
계면활성제 - RP-5 130 ㎕(+ 용해 완충액 20 ㎕)
플레이트를 120 g로 3분 동안 회전시킨 후, 37℃/5% CO2에서 4시간 동안 항온처리하였다. 4시간 항온처리 종류 45분 전에, 용해 완충액(LDH 키트의 것) 20 ㎕를 Tmax 및 계면활성제(상기 참조)와 함께 플레이트 웰에 첨가하였다. 4시간의 항온처리 후, 플레이트를 120g로 5분 동안 회전시켰다. LDH 방출 분석(하기 참조)을 수행하기 위해, 각 웰로부터 50 ㎕를 덜어 평면 바닥의 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다.
LDH 방출 분석(Promega
Figure pct00011
, #G1780, 비방사능 세포독성 분석). Promega 키트의 분석 완충액을 실온으로 해동시켰다. (1개 플레이트 전체에 대해) 빛을 차단한 채, 키트에 포함된 1개 바이알 기질 혼합물에 분석 완충액 12 ml를 첨가하여, 즉시 사용하였다. (이미 50 ㎕의 샘플을 포함한 평면 바닥 96웰 플레이트의) 각 웰에 기질 용액 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 15∼20분 동안 항온처리하였다. 키트에 포함된 종결 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 발생된 기포를 터뜨리고, 1시간 내에 OD 490 nm에서 흡광도를 판독하였다.
이 분석의 결과는 도 6에 도시되어 있다. MEDI-524 3M은, MEDI-524에 비해 ADCC 이펙터 기능이 증대되도록 조작된 것이다. 그 결과, MEDI-524 3M은 MEDI-524보다 더 높은 ADCC 세포독성(약 10∼12%의 세포독성)을 나타내었다.
실시예 5: MEDI-524 TM의 치료 효능
(Kabat 넘버링에 따라, 234F, 235E, 331S의 아미노산 돌연변이를 갖는) 변형된 MEDI-524 항체, MEDI-524 3M 및 MEDI-524 TM를 사용한 하기 실험에서 그러한 Fc 부위 변형이 MEDI-524의 유효성을 추가로 증가시킬 수 있는지를 관찰하기 위해 치료 효능을 테스트하였다.
저장 농도 100 mg/ml로부터 MEDI-524를 멸균 염수 중에 희석하였다. 매회 연구를 위해, 어린 코튼 래트(시그모돈 히스피두스(Sigmodon hispidus), 평균 체중 100 g, 미국 매릴랜드주 록빌 소재의 Virion Systems, Inc.로부터 입수)를 군당 4마리씩 나누었다. 상이한 시점(감염 24시간 전 및 감염 24시간 또는 72시간 후)에, 래트에게 테스트 물질 0.1 ml를 복강내 주사로 투여하였으며, 한 군의 코튼 래트에게는 각각 모타비주맙 또는 대조군 항체(MEDI-507)를 투여하였다. 24시간 후, 래트를 이소플루란을 마취시키고 래트당 1×105　pfu의 RSV A2(ATCC로부터 입수)의 비내 점적에 의해 항원 공격을 실시하였다. 4일 후, 래트를 이산화탄소로 질식시키고, 그 폐를 외과적으로 적출하여, 양분하고, 액체 질소로 급속 냉동시켰다. 멸균 메스를 사용하여 비내 조직을 절제하여 역시 액체 질소로 냉동시켰다. 유리제의 조직 호모게나이저를 사용하여 20부(중량/부피)의 HBSS(카탈로그 # 14175, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen 제품) 중에서 폐를 개별적으로 균질화하고, 10부(중량/부피)의 HBSS, 멸균 규사 및 막자사발을 사용하여 비내 조직을 균질화하였다. 얻어진 현탁액을 770g로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하여, 플라크 적정에 의한 바이러스 역가 분석시까지 -80℃에 저장하였다.
플라크 감소 분석(Plaque Reduction Assay; PRA): F 폐 균질물 샘플을 HBSS에 1:10 및 1:100으로 희석하고, 원액, 1:10 희석액 및 1:100 희석액 각 50 ㎕의 분액을 24웰 플레이트의 HEp-2 세포(ATCC #CCL-23)의 웰에 이중으로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 항온처리한 후, 접종물을, 1% 메틸셀룰로스(#M0512-500G, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich, Inc. 제품)를 함유하는 배양 배지로 교체하고, 세포를 다시 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 4일 후, 덮개를 제거하고, 세포를 고정시키고 5% 글루타르알데하이드 중 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 30분 동안 염색한 후, 세척하고, 공기 건조시키고, 플라크의 수를 세었다. 이 분석의 검출 한계는 조직 g당 200 PFU였다. 바이러스 역가가 검출 한계 이하인 샘플은 < 200 PFU/g = log10 2.3이었다.
이 결과는 도 7에 도시되어 있다. MEDI-524 TM을 사용한 처리는 MEDI-524에 비해 RSV 바이러스 역가를 낮추는 명백한 효능을 나타낸다.
실시예 6: 코튼 래트 예방
전술한 항체 또는 그 단편 중 어느 하나가 정맥내(IV) 경로를 통해 투여되었을 때 코튼 래트의 기도 RSV 감염을 치료하는 능력을 확인하고 상기 항체 또는 단편의 혈청 농도와 폐내 RSV 역가의 감소를 서로 관련짓기 위한 실험을 수행하였다. 하기 실시예는 SYNAGIS
Figure pct00012
를 사용하나, 본원에 기재된 항체 또는 그 단편 중 어느 것에도 적용될 수 있다.
재료 및 방법
연구 III-47 및 III-47A를 위해 SYNAGIS
Figure pct00013
로트 L94H048을 사용하였다. 연구 III-58에는 SYNAGIS
Figure pct00014
로트 L95 K016을 사용하였다. 소 혈청 알부민(BSA)(분획 V, Sigma Chemicals). RSV-Long(A 서브타입)은 Hep-2 세포에서 증폭시켰다.
0일째, 코튼 래트(시그모돈 히스피디스, 평균 체중 100 g) 군에 SYNAGIS
Figure pct00015
, RSV-IGIV 또는 BSA를 근육내 주사로 투여하였다. 투여한 지 24시간 후, 래트로부터 혈액을 채취하고 비내 투여에 의해 105 pfu의 RSV로 감염시켰다. 24시간 후, 래트로부터 혈액을 채취하고 비내 투여에 의해 105 pfu의 RSV(Long Strain)로 감염시켰다. 감염 4일 후, 래트를 희생시키고, 그 폐 조직을 적출하고, 플라크 적정으로 폐내 바이러스 역가를 측정하였다. 연구 III-47 및 III-47A의 경우, 단일클론 항체("MAb")의 용량은 0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5.5 및 10 mg/kg(체중)으로 구성되었다. 연구 III-58의 경우, MAb의 용량은 0.63, 1.25, 2.5, 5.5 및 10 mg/kg(체중)으로 구성되었다. 3 가지 실험 모두에서, 10 mg/kg의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 사용하였다. 항원 공격시의 혈청 중의 항체 농도는 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정하였다.
결과
개별 실험들의 결과는 하기 표 2∼5에 기재하였다. 모든 실험의 결과는 표 5에 기재하였다. 3 가지 연구 모두 SYNAGIS
Figure pct00016
로 처리된 동물에서 폐내 바이러스 역가가 유의적으로 감소되었음을 보여준다. 동물들에게서 분명한 용량 반응 효과가 관찰되었다. 데이터를 종합하면, 2.5 mg/kg의 용량이 폐내 RSV 역가를 99% 이상 감소시켰음을 알 수 있었다. 바이러스 공격 시점에 이 용량에 대한 SYNAGIS
Figure pct00017
의 평균 혈청 농도는 28.6 mg/ml였다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 7: RSV 감염 A549 세포의 모타비주맙(MEDI-524) 처리 후 PD-L1 발현을 측정함
1일째, 3개의 12웰 플레이트에 A549 세포 P15를 4×105개 세포/웰로 시딩하였다. 3일째, A549 세포를 감염 다중도(MOI)를 1.0로 하여 RSV A로 감염시켰다. 감염 1시간 후, 대조군, 비관련 항체, MEDI-507(50706F-0016, 10.2 mg/ml) 또는 실험 항체 MEDI-524(52405G-0964, 10.2 mg/ml)를 10 ㎍/ml로 해당 웰에 첨가하였다. 감염 6시간 및 12시간 후, 해당 웰에 MEDI-507 또는 MEDI-524 항체를 첨가하였다.
감염 48시간 후, A549 세포(세포수 약 500,000개)를 PD-L1 PE (eBioscience
Figure pct00022
, 카탈로그 번호 12-5983-71)로 염색하였다. 세포는 LSR II 그린(샘플당 20,000개 사건)을 획득하였다. 결과를 정량하여 그래프로 나타내었다(도 8 참조).
실시예 8: RSV 감염 A549 세포의 모타비주맙(MEDI-524) 처리 후 ICAM-1 발현을 측정함
1일째, 2개의 12웰 플레이트에 A549 세포 P14를 3×105개 세포/웰로 2 ml씩 시딩하였다. 3일째, A549 세포를 MOI를 1.0로 하여 RSV A(1×108 pfu/ml)로 감염시켰다.
감염 1시간, 6시간 및 12시간 후, 대조군, 비관련 항체, MEDI-507(50706F-0016, 10.2 mg/ml) 및 실험 항체 모타비주맙 또는 MEDI-524(로트 05MO2-76, 제출일 2005년 12월 2일, 102 mg/ml)를 10 ㎍/ml로 해당 웰에 첨가하였다. 배양물을 48시간 동안 항온처리하였다.
항온처리 시간 후, 감염된 A549 세포(세포수 약 500,000개)를 ICAM-1 APC(카탈로그 번호 559771, BD
Figure pct00023
)로 염색하였다. 세포는 LSR II 그린(샘플당 50,000개 사건)을 획득하였다. 결과를 정량하여 그래프로 나타내었다(도 9 참조).
실시예 9: RSV 감염 A549 세포의 모타비주맙(MEDI-524) 처리 후 세포 아폽토시스를 측정함
1일째, 2개의 12웰 플레이트에 A549 세포 P26을 3.5×105개 세포/웰로 2 ml씩 시딩하였다. 3일째, A549 세포를 MOI를 1.0로 하여 RSV A(1×108 pfu/ml)로 감염시켰다.
감염 1시간, 6시간 및 12시간 후의 시점에 모타비주맙 또는 MEDI-524(로트 05M02-76; 제출일 2005년 12월 2일, 102 mg/ml)를 10 ㎍/ml로 해당 웰에 첨가하였다. 세포 배양물을 72시간 동안 항온처리하였다.
부착성 세포를 해리시켜 부유 세포와 함께 모아서 원심분리에 의해 펠릿화하고 배지 1 ml에 재현탁시켰다(약 1×106개 세포). 약 20,000개 세포/웰을 96웰 플레이트(백색 벽, 투명 바닥)에 100 ㎕씩 첨가하였다.
세포 역가-glo 분석법(카탈로그 번호 G7571, 발광 세포 생존율 키트, Promega
Figure pct00024
) 및 카스파제-glo 3/7 분석법(카탈로그 번호 G8091, Promega
Figure pct00025
) 시약을 해당 웰에 첨가하였다(100 ㎕/웰).
실온의 암소에서 1시간 동안 항온처리하였다. 발광은 SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices
Figure pct00026
)를 사용하여 측정하였다. 결과를 정량하여 그래프로 나타내었다(도 10 참조).
실시예 10: RSV 감염 A549 세포의 모타비주맙(MEDI-524) 처리 후 부유 세포 비율(%)을 측정함
1일째, 2개의 12웰 플레이트에 A549 세포 P26을 3.5×105개 세포/웰로 2 ml씩 시딩하였다. 3일째, A549 세포를 MOI를 1.0로 하여 RSV A로 감염시켰다.
감염 1시간, 6시간 및 12시간 후의 시점에 모타비주맙 또는 MEDI-524(로트 05M02-76; 제출일 2005년 12월 2일, 102 mg/ml)를 10 ㎍/ml로 해당 웰에 첨가하였다. 세포 배양물을 72시간 동안 항온처리하였다.
세포 배양 상청액 중의 부유 세포를 수집하여 그 수를 세었다. 부착성 세포를 해리시켜 또한 개별적으로 다음과 같이 그 수를 세었다:
부유 세포 비율(%) = (부유 세포수/세포 총수)×100
(세포 총수 = 부유 세포수 + 부착성 세포수). 결과를 정량하여 그래프로 나타내었다(도 11 참조).
실시예 11: RSV 감염 HEp-2 및 A549 세포의 모타비주맙(MEDI-524) 처리 후 세포 배양 상청액 중의 RSV 방출을 측정함
A549 세포에 대해 앞서 실시예 10에서 수집하고 HEp-2 세포에 대해 반복한 세포 배양 상청액을, 세포 배양물 중에서 일어나는 활발한 RSV 복제의 척도로서 상청액으로 방출된 RSV의 양을 정량하기 위해 분석하였다. 결과에 대해서는 도 12 참조.
실시예 12: 공기-액체 계면 시스템에서의 1차 폐 상피 세포
계획된 본 실험은 공기-액체 계면(air-liquid interface; ALI)에서의 폐 상피 세포의 분극성을 매우 가깝게 모의한다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌[Zhang et al., Respiratory Syncytial Virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells and without obvious cytopathology, J Virol Vol 76: 5654-5666, (2002)]; 및 문헌[Mellow et al., The Effect of RSV on chemokine release by differentiated airway epithelium, Expt. Lung Research 30: 43-57, (2004)]을 참조할 수 있다.
웰 플레이트에서, 공기-액체 계면(ALI)에서 배양하고 유지시킨 1차 폐 상피 세포를 환자의 임상 분리물로부터 얻은 실험 균주 RSV A 또는 RSV로 다중 감염도(MOI)를 1.0, 0.1 및 0.01로 하여 감염시키고, 각각 감염 6∼12시간, 24시간 및 48시간 후 모타비주맙(MEDI-524)을 첨가하였다. 이 배양물을 각각 24∼48시간, 48∼72시간 및 72∼96시간 동안 항온처리하였다. RSV 복제, 사이토카인 분비(단백질) 및 사이토카인 유전자 발현(IL-6, IL-8, TNF-α, MIP-1a 및 RANTES), 세포 표면 면역 마커(PD-L1, ICAM-1, TLR4) 및 세포 아폽토시스를 본원에 기재된 방법에 따라 평가한다. 이 실험은 디자인은 ALI에서 배양한 1차 폐 상피 세포를 모타비주맙(MEDI-524)으로 감염 전 약 1시간 동안 처리하는 예방 시나리오와 비교된다. 그 후, 상기 상피 세포를 환자의 임상 분리물로부터 얻은 실험 균주 RSV A 또는 RSV로 감염시킨다.　얻어진 예방 결과는 전술한 치료적 적용과 비교된다.
실시예 13: 임상 시험
시험관내 분석 및 동물 모델에서 테스트된 본 발명의 항체는 또는 그 단편을, 건강한 보통의 성인 지원자 군을 대상으로 안전성, 내성 및 약동학적 특성에 대해 추가로 평가할 수 있다. 지원자에게 RSV 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 0.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg의 단일 용량으로 근육내, 정맥내 또는 폐내 전달 시스템에 의해 투여한다. 단일 용량의 항체 또는 그 단편을 투여받기 적어도 24시간 전에 각각의 지원자를 모니터링하고, 상기 용량을 투여받은 지 적어도 48시간 후 진료소에서 각각의 지원자를 모니터링한다. 그 후, 투여 후 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 및 56일째 지원자를 외래 환자로서 모니터링한다.
유치 카테터를 통해 또는 10 ml의 진공 채혈관을 사용하는 직접적 정맥 천자를 통해 하기 간격으로 혈액 샘플을 수집한다: (1) 항체 또는 항체 단편을 투여하기 전; (2) 항체 또는 항체 단편을 투여하는 동안; (3) 항체 또는 항체 단편을 투여한 지 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 및 48시간 후; 및 (4) 항체 또는 항체 단편을 투여한 지 3일, 7일 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 및 56일 후. 샘플을 실온에서 응고되도록 하고 원심분리한 후 혈청을 수집한다.
상기 혈청 샘플로부터 항체 또는 항체 단편을 부분적으로 정제하고, 샘플 중의 항체 또는 항체 단편의 양을 ELISA로 정량한다. 간단히 설명하면, ELISA는 미량적정 플레이트를 지원자에게 투여된 항체 또는 항체 단편을 인식하는 항체로 4℃에서 밤새 코팅하는 것으로 이루어진다. 그 후, 상기 플레이트를 PBS-Tween-0.5% BSA로 실온에서 30분 동안 차단시킨다. 지원자에게 투여되지 않은 정제된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 표준 곡선을 작성한다. 샘플을 PBS-Tween-BSA에 희석시킨다. 샘플 및 표준 물질을 실온에서 약 1시간 동안 항온처리한다. 그 후, 결합된 항체를 표지된 항체(예를 들어, 염소 항인간 IgG에 접합된 호스래디쉬 퍼옥시다제)로 실온에서 약 1시간 동안 처리한다. 표지된 항체의 결합을, 예를 들어 분광광도계로 검출한다.
지원자 혈청 중의 항체 또는 항체 단편 수치의 농도를, 용량 투여 후 매회 수집 시점에서의 혈청 수치로부터 투여 전 혈청 수치(배경값 수치)를 제함으로써 보정한다. 각각의 지원자에 대해, 모델 독립적 접근법[Gibaldi et al., eds., 1982, Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, New York]에 따라, 보정된 혈청 항체 또는 항체 단편 농도로부터 약동학적 파라미터를 산출한다.
7. 균등 범위
당업자라면 본원에 기재된 발명의 특정 실시형태에 대한 다수의 균등예를 인식하고 통상적인 실험만으로 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등예는 후술하는 특허청구범위에 포함되는 것이다,
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 구체적이고 개별적으로 참고 문헌으로 포함된 것으로 표시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 45 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 1 5 10 15 <210> 46 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Pro Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Met Tyr Gln Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 47 Leu Pro Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Domain <400> 48 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr 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antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 57 Asp Thr Tyr Lys Gln Thr Ser 1 5 <210> 58 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 59 Asp Thr Arg Tyr Leu Ser Ser 1 5 <210> 60 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - 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further modified by amino acid substitutions <400> 73 Asp Thr Phe Phe His Arg Ser 1 5 <210> 74 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Leu Leu Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 75 Asp Thr Leu Leu Leu Asp Ser 1 5 <210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain 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<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 86 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 1 5 10 15 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 87 Lys Cys Gln Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 88 Asp Thr Lys Lys Leu Ser Ser 1 5 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 89 Lys Leu Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 90 Asp Thr Phe Tyr Leu Ser Ser 1 5 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 91 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 92 Lys Leu Gln Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 93 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 94 Ser Met Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 95 Lys Leu Gln Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 96 Asp Thr Phe Lys Leu Ser Ser 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 97 Ser Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 98 Lys Leu Gln 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Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 173 Ser Pro Gln Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 174 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 174 Asp Thr Arg Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 175 Asp Thr Arg Lys Leu Ser Ser 1 5 <210> 176 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 176 Ser Pro Gln Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 177 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 177 Ser Pro Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 178 Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Ser 1 5 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 179 Lys Ala Gln Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 180 Lys Ala Gln Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 181 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 181 Lys Ala Gln Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 182 Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 183 Lys Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 184 Lys Ala Ser Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 185 Lys Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 186 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 186 Lys Ala Ser Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 187 Ser Ala Ser Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 188 Ser Ala Ser Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 189 Ser Ala Gln Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 190 Ser Ala Gln Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 191 Ser Ala Gln Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 192 Leu Pro Ser Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 193 Leu Pro Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 194 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 194 Leu Pro Ser Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 195 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 195 Leu Cys Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 196 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 196 Leu Cys Ser Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 197 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 197 Leu Cys Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 198 Leu Cys Ser Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 199 Leu Pro Gln Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 200 Leu Pro Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 201 Leu Pro Gln Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 202 Leu Pro Gln Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 203 Leu Cys Gln Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 204 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 204 Leu Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 205 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 205 Leu Cys Gln Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 206 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 206 Leu Cys Gln Leu Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 207 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 207 Ser Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 208 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Chain <400> 208 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 300 gccgcgtccc gttccttcac catgacgacc 30 <210> 301 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 301 ccagcagtac cgcttccttg ccctgcggcc g 31 <210> 302 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 302 gccgcgtccc gttccttcac catgacgacc 30 <210> 303 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Chain <400> 303 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Gly Asp Lys Gly His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp 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Humanized antibody - VH Chain <400> 322 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 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Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 323 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Domain <400> 323 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 324 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Chain <400> 324 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Tyr Tyr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 325 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 325 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Tyr Tyr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 326 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 326 Asp Thr Tyr Tyr Leu Pro Ser 1 5 <210> 327 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Chain <400> 327 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 328 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Domain <400> 328 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 329 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 329 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 1 5 10 15 <210> 330 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Chain <400> 330 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Phe Arg His Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 331 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 331 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Phe Arg His Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 332 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 332 Asp Thr Phe Arg His Thr Ser 1 5 <210> 333 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Chain <400> 333 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Pro Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Tyr Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 334 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VL Domain <400> 334 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Pro Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Tyr Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 335 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 335 Ser Pro Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 336 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence derived from Murine monoclonal antibody and further modified by amino acid substitutions <400> 336 Asp Thr Tyr Tyr Leu Ala Ser 1 5 <210> 337 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human FcRn <400> 337 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 275 280 285 Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 305 310 315 320 Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 325 330 335 Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 340 345 350 Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala 355 360 365 <210> 338 <211> 365 <212> PRT <213> Murine <400> 338 Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu 20 25 30 Thr Ala Val Ser Asn Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr 35 40 45 Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln 50 55 60 Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp 65 70 75 80 Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Glu Ala Leu Lys Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn 130 135 140 Pro Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val 145 150 155 160 Ala Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu 165 170 175 Phe Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu 305 310 315 320 Trp Gly Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser 325 330 335 Gly Asp Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu 340 345 350 Ala Glu Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser 355 360 365 <210> 339 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 340 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 341 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 342 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human hinge Fc region <400> 342 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 343 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody - VH Domain <400> 343 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (25)

  1. RSV F 항원에 면역 특이적으로 결합하는 변형된 항체로서, 표 1에 기재된 것과 같은, A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, 또는 A4B4(1)의 VH CDR 1, 2 및 3과 VL CDR 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 3개의 가변 중쇄 상보성 결정 부위(VH CDR) 및 3개의 가변 경쇄 CDR(VL CDR)을 포함하고, 상기 변형된 항체는 야생형 인간 IgG Fc 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG Fc 도메인을 가지며, 상기 아미노산 치환에 의해, 이 아미노산 치환을 갖지 않는 야생형 항체와 비교할 때 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 변경된 결합 친화력을 포함하는 변형된 항체가 생성되는 것인 변형된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 표 1에 기재된 것과 같은, A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, 또는 A4B4(1)의 VH 도메인 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 변형된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스(EU index)로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 332E의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 239D 및 330L의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 변형된 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 234E, 235R, 235A, 235W, 235P, 235V, 235Y, 236E, 239D, 265L, 269S, 269G, 298I, 298T, 298F, 327N, 327G, 327W, 328S, 328V, 329H, 329Q, 330K, 330V, 330G, 330Y, 330T, 330L, 330I, 330R, 330C, 332E, 332H, 332S, 332W, 332F, 332D 및 332Y로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 변형된 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 331S의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변형된 IgG Fc 도메인이, Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스로 넘버링할 때, 아미노산 잔기 234F 및 235E의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 변형된 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 233P, 234V, 235A, 265A, 327G 및 330S로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 변형된 항체.
  9. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 IgG Fc 도메인이 야생형 인간 IgG Fc 도메인에 비해 추가의 아미노산 치환을 더 포함하고, 상기 추가의 아미노산 치환에 의해, 이 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 야생형 항체와 비교할 때 연장된 혈청 반감기를 갖는 변형된 항체가 생성되는 것인 변형된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 추가의 아미노산 치환이 251번, 252번, 254번, 255번, 256번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 385번, 386번, 387번, 389번, 428번, 433번, 434번 및 436번 아미노산 잔기 중 하나 이상에 위치하고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 변형된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 추가의 아미노산 치환이 251번 위치에서의 루신에 의한 치환, 252번 위치에서의 타이로신, 트립토판 또는 페닐알라닌에 의한 치환, 254번 위치에서의 트레오닌 또는 세린에 의한 치환, 255번 위치에서의 아르기닌에 의한 치환, 256번 위치에서의 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 글루타메이트에 의한 치환, 308번 위치에서의 트레오닌에 의한 치환, 309번 위치에서의 프롤린에 의한 치환, 311번 위치에서의 세린에 의한 치환, 312번 위치에서의 아스파테이트에 의한 치환, 314번 위치에서의 루신에 의한 치환, 385번 위치에서의 아르기닌, 아스파테이트 또는 세린에 의한 치환, 386번 위치에서의 트레오닌 또는 프롤린에 의한 치환, 387번 위치에서의 아르기닌 또는 프롤린에 의한 치환, 389번 위치에서의 프롤린, 아스파라긴 또는 세린에 의한 치환, 428번 위치에서의 메티오닌 또는 트레오닌에 의한 치환, 434번 위치에서의 타이로신 또는 페닐알라닌에 의한 치환, 433번 위치에서의 히스티딘, 아르기닌, 라이신 또는 세린에 의한 치환, 또는 436번 위치에서의 히스티딘, 타이로신, 아르기닌 또는 트레오닌에 의한 치환이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 변형된 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 추가의 아미노산 치환이 252번 위치에서의 타이로신에 의한 치환, 254번 위치에서의 트레오닌에 의한 치환 및 256번 위치에서의 글루타메이트에 의한 치환이고, 여기서 넘버링 시스템은 Kabat의 문헌에 기재된 EU 인덱스의 넘버링 시스템인 변형된 항체.
  13. 멸균 담체 중에 제1항, 제3항, 제6항 또는 제9항 중 어느 한 항의 변형된 항체를 포함하는 조성물.
  14. RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료를 요하는 상기 환자에게 치료적 유효량의 제13항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 치료적 유효량이 약 30 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 및 약 0.025 mg/kg으로 구성된 군에서 선택되는 것인 치료 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 인간 환자가 골수 이식을 받았거나, 낭포성 섬유증, 기관지 폐 이형성증, 선천성 심장병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선천성 면역결핍증 또는 후천성 면역결핍증을 앓고 있는 자인 치료 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 인간 환자가 유아, 미숙아로 태어난 유아, RSV 감염으로 인해 병원 치료를 받은 유아, 또는 천식 및/또는 반응성 기도 질환(RAD) 및/또는 천명의 소인이 있는 유아, 또는 0∼5세 소아인 치료 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 인간 환자가 노인, 또는 요양소에서 생활하는 인간인 치료 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 조성물을 비내 전달, 근육내 전달, 피내 전달, 복강내 전달, 정맥내 전달, 피하 전달, 경구 전달, 폐내 전달 또는 이들의 조합에 의해 상기 인간 환자에게 투여하는 것인 치료 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 조성물을 RSV 시즌 동안 5회, 4회, 3회, 2회 또는 1회 상기 환자에게 투여하는 것인 치료 방법.
  21. 제14항에 있어서, 바이러스 발산으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 RSV 복제를 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 45% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 35% 이상, 30% 이상, 25% 이상, 20% 이상, 또는 10% 이상 억제하거나 하향 조절하는 것인 치료 방법.
  22. 제14항에 있어서, 생물학적 분석법으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 사이토카인의 혈청 수치를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소시키는 것인 치료 방법.
  23. 제14항에 있어서, 생물학적 분석법으로 측정시, 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 상기 변형된 항체의 치료적 투여가 행해지지 않은 대조군과 비교할 때 상기 인간 환자에 있어서 케모카인 방출의 혈청 수치를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소시키는 것인 치료 방법.
  24. 표 1에 기재된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 CDR 및 이종성 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법.
  25. RSV에 감염된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료를 요하는 상기 환자에게, 표 1에 기재된 것과 같은, A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1FR, H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, 또는 A4B4(1)의 아미노산 서열을 갖는 3개의 가변 중쇄 상보성 결정 부위(VH CDR) 및 3개의 가변 경쇄 CDR(VL CDR)을 포함하는 F(ab)' 단편을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 투여는 폐내 투여이고 RSV 시즌 동안 실시되는 것인 치료 방법.
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