CN105254764A

CN105254764A - ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用途

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Publication number: CN105254764A
Application number: CN201510534850.4A
Authority: CN
Inventors: 陈羿; 蔡则玲; 张克勤
Original assignee: SHANGHAI KANDA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI KANDA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2016-01-20
Also published as: US20190062402A1; WO2017032216A1

Abstract

本发明涉及ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用途。具体而言，本发明涉及含ACVR1元件和Fc元件的融合蛋白ACVR1-Fc；编码该融合蛋白的DNA序列；含该编码序列的载体；含该载体的宿主细胞；制备该融合蛋白的方法；以及上述物质在预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状(如骨化过度相关的疾病、癌症等)中的应用。本发明融合蛋白表达稳定、产量高、纯化工艺简单，且具有高活性(如有效抑制成骨和软骨分化)，由此可有效用于与ACVR1异常相关的疾病或症状的预防和治疗。

Description

ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及活化蛋白A受体1-Fc(activinAreceptor,typeI-Fc，ACVR1-Fc)融合蛋白、其制备方法以及其在预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状(例如骨化过度相关的疾病、扩散型内因性脑桥神经胶质瘤、卵巢癌等)中的应用。

背景技术

ACVR1，即骨形态发生蛋白(BMP)I型受体的亚型之一Activin受体IA型(ActRIA)，也被称为Activin受体样激酶2(Activinreceptor-likekinase2，ALK2)。

ACVR1属于转化生长因子β(TGF-β)超家族受体I型，整个受体蛋白是由胞外段、穿膜段和胞内段组成。胞内段的C末端是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，起着向下传递信号的作用。胞内段靠近膜区域是GS区域。胞外段接受外来因子的刺激，将信号传递到胞内。ACVR1接受信号的方式有2种，一种是直接和骨形态发生蛋白(比如BMP-2或BMP-6)结合，另一种也是主要的方式是，骨形态发生蛋白(如BMP-4)和TGFβ超家族受体II型(ACVR2)结合，结合了细胞因子的ACVR2再和ACVR1结合，然后把外来信号传递到胞内。

进行性骨化性纤维增殖不良症(fibrodysplasiaossificansprogressiva，FOP)，也称进行性骨化性肌炎(myositisossificansprogressiva，MOP)，是一种灾难性、罕见的先天性致残性疾病，其以自发产生的肌肉炎症或肌肉受损伤诱导的进行性异位成骨为特征，并导致关节融合和活动障碍^[1]。

目前对此病没有确切的有效治疗方法。手术切除异位骨只会招致原位病灶复发或病情加重。在早期诊断出的情况下，临床上通常用的治疗方法有预防进一步的伤害、调节局部区域功能、抗炎症等^[2]。有报道，在个别病人身上，用糖皮质激素、非甾体抗炎药NSAID、二膦酸盐(bisphosphonates)、罗格列酮和放射治疗有一定效果，但效果不明显。

过去对FOP的研究进展缓慢，而近几年对其研究进展迅速，在其致病机理上有了许多新的发现：

I)部份FOP致病细胞的性质得到鉴定：

虽然已知在骨骼肌炎症部位有多种炎症细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和T/B淋巴细胞)侵润，但关键性的致病细胞(即软骨细胞和成骨细胞的来源细胞)种类不完全清楚。Lounev等^[3]用谱系追踪(lineagetracing)方法在近似FOP表型的转基因小鼠发现病灶区约40-50％的软骨细胞和成骨细胞带有血管内皮细胞标志物Tie2；Medici等^[4]进一步证明体外培养的转染了R206H突变体的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)可分化为软骨细胞和成骨细胞，这可以证明血管内皮细胞是FOP致病细胞的一部份，但另外约50％的致病细胞性质不明。

II)ACVR1基因突变是FOP发生的中心环节：

在2006年，研究证明骨形态发生蛋白(BMP)I型受体的亚型ACVR1的基因突变和FOP的发生有直接的关联。

在中国某个病例组(70多例)显示，高达98.4％的患者ACVR1基因外显子发生了杂合型单个碱基突变(617G>A)，该突变导致ACVR1的第206位精氨酸被组氨酸代替(R206H)，使ACVR1功能增强。ACVR1的结构属于单次跨膜蛋白(其序列如图1所示)，R206H的突变位于其中的甘氨酸/丝氨酸富含区(GS区，178-207位)，此区域氨基酸序列在包括人类的多种动物间高度保守，提示其功能非常重要。

ACVR1的蛋白质分子模拟结果显示^[1]：ACVR1活性增强的基因突变(R206H)位于胞内段靠近膜区域是GS区域。该第206位的精氨酸(R)所形成的小侧链与主链α螺旋紧贴，对全分子的结构稳定有重要作用，在FOP患者该精氨酸被换成组氨酸(H)，则组氨酸与主链α螺旋远离，导致ACVR1分子不稳定，相关的表现是患者淋巴细胞受体下游的P38MAPK信号通路活性增强^[5](BMP-Smad信号通路活性并不增强)，以及体外培养的牙髓细胞BMP-Smad和BMP-MAPK信号通路活性都增强^[6]。这些研究结果提示患者R206H突变导致了ACVR1活性组成型增强(constitutivelyactive)。

III)FOP动物模型的建立：

贴近病人实际情况的ACVR1基因杂合型突变或敲入(knock-in)动物模型难以建立，但已经建立的三种动物模型也可借鉴用于研究。历史上已经建立了几种近似FOP表型的模式动物，这些模式动物种类有：

(A)因为早先已经认识到ALK2的Q207D突变可致ALK2活性变为组成型活化，所以Fukuda等^[7]用含Q207D的ALK2突变体做转基因动物，结果胚胎于孕中期胎死宫内，这个失败的结果提示要建立全身R206H突变的小鼠模型有失败的可能性，所以Yu等^[8]在此基础上改用带Cre酶的腺病毒(Ad.Cre)对已经装配有条件性表达ALK2Q207D的小鼠肌肉注射，导致ALK2Q207D在小鼠骨骼肌表达并诱发肌炎(腺病毒会诱发肌炎)，获得了FOP患者的部份表型(即肌肉中发生骨化，关节活动受限)；

(B)Glaser等^[9]用混合了BMP4或BMP2的基底膜蛋白基质胶(Matrigel)植入小鼠腹部肌肉中，植入部位产生了与FOP患者相似的异位骨化；

(C)Kan等^[10]发现神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子-BMP4转基因小鼠会在神经-肌肉接头处过度表达BMP4，导致骨骼肌炎症和异位骨化(当然还伴有脑组织异常)^[11]。

虽然这些模型动物不能准确反映FOP患者的体内异常，但仍然可以用于FOP的治疗研究，特别是上述(A)种模型动物，其病因和致病方式与人类FOP已经很相似，ACVR1或ACVR2的配体对疾病的发生和发展起了触发作用。

本领域中虽然对FOP的机理和治疗方法有一定的研究，但仍然缺乏有效的治疗药物和方法，因此仍存在开发出相关药物和方法的迫切需求。

除了ACVR1基因突变导致FOP外，ACVR1基因突变还和高级别胶质瘤(简称HGG，也称为小儿脑瘤)有关联。在2014年，包括美国和欧洲在内的的4个研究小组几乎同时发现，在被诊断为扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(简称DIPG，高级别胶质瘤的一种亚型)的患者中，20-30％的患者发生了ACVR1基因突变，而且这些突变会反复的出现^[12-15]。对DIPG患者ACVR1基因突变的分析显示，它们和FOP患者ACVR1基因的突变非常类似，也导致ACVR1蛋白的BMP/TGFβ信号通道的持续激活。有15-20％的儿童脑瘤和脊髓肿瘤属于高级别胶质瘤，目前有效的治疗手段有手术治疗，放疗和化疗，但长期存活率仍低于20％。

此外，研究还显示正常ACVR1基因及蛋白与肿瘤有关。有报道称^[16-17]，卵巢癌病人血液中含有高于正常人含量的应急诱导磷蛋白1(STIP1)。研究人员发现，STIP1由卵巢癌细胞表达分泌，通过自分泌或旁分泌方式，和卵巢癌细胞表面的ACVR1蛋白结合，激活SMAD信号通道，促进卵巢癌细胞的生长。

综上，以ACVR1蛋白为靶点，不仅可以探索治疗罕见的可怕疾病(如FOP和DIPG)，还能研究和发现治疗频发率较高的肿瘤(如卵巢癌)。本领域需要开发出相关的药物和方法以预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的各种疾病和/或症状。

发明内容

本发明正是提供了一种具有生物活性的融合蛋白ACVR1-Fc及其制备方法，以及该融合蛋白在预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状(例如FOP、DIPG、卵巢癌等)中的应用。

在本发明的第一方面中，提供了一种融合蛋白，其特征在于，它包括以下元件：

(a)ACVR1元件，其具有ACVR1或其活性片段的氨基酸序列；

(b)Fc元件，其包含人IgGFc片段；

(c)任选的，信号肽元件；以及

(d)任选的，位于以上元件之间的连接肽序列。

在一些实施方式中，所述的融合蛋白由元件(a)、(b)和(c)构成。

在一些实施方式中，所述ACVR1元件具有BMP-2结合活性。

在一些实施方式中，所述ACVR1元件具有ACVR1的胞外区序列。

在一些实施方式中，所述ACVR1元件选自：①具有SEQIDNO:4的序列；②与SEQIDNO:4所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:4所示的序列相同生物活性的序列；③与SEQIDNO:4所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:4所示的序列相同生物活性的序列。

在一些实施方式中，所述Fc元件包含人IgGγ1、IgGγ2、IgGγ3或IgGγ4的Fc片段。所述Fc元件包含铰链区、CH2和CH3区。

在一些实施方式中，所述Fc元件选自：①具有SEQIDNO:6的序列；②与SEQIDNO:6所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:6所示的序列相同生物活性的序列；③与SEQIDNO:6所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:6所示的序列相同生物活性的序列。

在一些实施方式中，所述信号肽元件选自：CD33蛋白信号肽(优选具有SEQIDNO:2所示序列)、其它任何表明抗原蛋白信号肽，抗体蛋白信号肽或其它任何分泌蛋白分子信号肽。

在一些实施方式中，所述连接肽序列的长度通常为1～50个氨基酸，例如5～50、5～40、10～40个氨基酸。

在一些实施方式中，所述融合蛋白中元件从5'至3'端的排列顺序选自下组，其中(d)、(d1)和(d2)代表相同或不同的连接肽序列：

(a)-(b)；(b)-(a)；(c)-(a)-(b)；(c)-(b)-(a)；(a)-(d)-(b)；(b)-(d)-(a)；

(c)-(d)-(a)-(b)；(c)-(a)-(d)-(b)；(c)-(d)-(b)-(a)；(c)-(b)-(d)-(a)；

(c)-(d1)-(a)-(d2)-(b)；(c)-(d1)-(b)-(d2)-(a)。

在一些实施方式中，所述融合蛋白具有选自下组的一种或多种功能：结合天然ACVR1结合的细胞因子、结合细胞因子与ACVR2的复合物、抑制Smad-1/5/8蛋白的磷酸化、抑制p38MAP激酶的磷酸化及其活化、抑制成骨分化、抑制软骨分化、降低细胞间质的钙离子浓度。

在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白中的元件独立地选自下组：

所述的ACVR1元件具有SEQIDNO:4所示的序列；

所述的Fc元件具有SEQIDNO:6所示的序列；

所述的信号肽具有SEQIDNO:2所示的序列。

在另一优选例中，所述的DNA分子具有SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列

在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白选自：

①具有SEQIDNO:8的序列；

②与SEQIDNO:8所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:8所示的序列相同生物活性的序列；

③与SEQIDNO:8所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:8所示的序列相同生物活性的序列。

在本发明的第二方面中，提供了一种分离的核酸分子，其为本发明所述融合蛋白的编码序列或为所述编码序列的互补序列。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包含：SEQIDNO:3所示的序列；SEQIDNO:5所示的序列；以及任选的，SEQIDNO:1所示的序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子的序列选自：

①具有SEQIDNO:7的序列；

②与SEQIDNO:7所示序列有一个或多个核苷酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:7所示的序列相同生物活性的序列；

③与SEQIDNO:7所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:7所示的序列相同生物活性的序列。

在本发明的第三方面中，提供了一种载体，所述载体含有本发明的核酸分子。

在一些实施方式中，所述载体选自：能在细菌、真菌、酵母、植物或哺乳细胞中表达重组蛋白的载体。

在一些实施方式中，所述载体还包含与所述核酸分子序列操作性连接的表达调控序列。

在本发明的第四方面中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的载体。

在一些实施方式中，所述宿主细胞选自：CHODG44、CHO-S、NS/0细胞以及其它哺乳细胞。

在本发明的第五方面中，提供了一种生产本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(a)在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养本发明的宿主细胞，从而表达出所述融合蛋白；和

(b)分离所述的融合蛋白。

在一些实施方式中，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：

将本发明的核酸分子引入合适的载体，以获得本发明的载体；将本发明的载体导入合适的宿主细胞中，以获得本发明的宿主细胞；采用选自蛋白A亲和层析法、阴离子层析柱、阳离子层析柱以及疏水层析柱的方法分离和/或纯化所述融合蛋白。

在本发明的第六方面中，提供了本发明的融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞在制备预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述疾病或症状是：骨化过度相关的疾病、与ACVR1突变和/或过度活化相关的癌症。

在一些实施方式中，所述骨化过度因ACVR1和/或ACVR2信号通路过度活化导致。

在一些实施方式中，所述骨化过度相关的疾病或症状选自：进行性骨化性纤维增殖不良症、限制性骨化性肌炎(后天获得性创伤后骨化性肌炎)、软骨增生、骨质增生。

在一些实施方式中，所述癌症选自：高级别胶质瘤，如扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(也称小儿脑瘤)；卵巢癌。

在本发明的第七方面中，提供了一种药物组合物，其包含：选自下组的活性物质：本发明的融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞；以及药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，所述药物组合物用于预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状。

在一些实施方式中，所述疾病或症状是：骨化过度相关的疾病、与ACVR1突变和/或过度活化相关的癌症。在一些实施方式中，所述骨化过度因ACVR1和/或ACVR2信号通路过度活化导致。在一些实施方式中，所述骨化过度相关的疾病或症状选自：进行性骨化性纤维增殖不良症、限制性骨化性肌炎(后天获得性创伤后骨化性肌炎)、软骨增生、骨质增生。

在本发明的其他方面中，还提供了一种预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的对象有效量的本发明的融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞。

在一些实施方式中，所述方法还包括联用用于预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状的其他药物或疗法。

在一些实施方式中，所述方法用于预防和/或治疗FOP。所述方法还包括同时或先后采用临床上用于FOP治疗的其他方法，所述其他方法包括但不限于：预防进一步的伤害、调节局部区域功能、抗炎症、施用糖皮质激素、非甾体抗炎药NSAID、二膦酸盐、罗格列酮和放射治疗。

在一些实施方式中，所述方法用于预防和/或治疗癌症，且还包括同时或先后采用临床上用于治疗癌症的其他方法，所述其他方法包括但不限于：放疗、化疗、手术等。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：ACVR1的蛋白质结构示意图。氨基酸(aa)1-20是蛋白质穿膜信号肽；aa21-123是细胞膜胞外段(黄色部分)；aa124-146是蛋白质穿膜序列(框里序列)；aa147-509是胞内段，其中aa178-207是甘氨酸/丝氨酸富含区(Glycine/Serine，GS区)(绿色部分)，aa208-502是丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine)蛋白激酶区。

图2：重组融合蛋白ACVR1-Fc构建示意图。

图3：ACVR1-Fc的基因序列和氨基酸序列。其中，aa1-16是人源CD33蛋白的信号肽；aa17-119是人源ACVR1跨膜蛋白胞外段；aa120-351是人源IgGγ1链236-437的Fc片段。

图4：重组腺病毒载体构建：

a：表达ACVR1R206H的腺病毒质粒构建图；

b：在光学显微镜下观察的正常培养HUVEC细胞；

c：在荧光显微镜下观察的ACVR1R206H重组表达腺病毒感染后的HUVEC细胞；

图5：SDS-PAGE电泳分析蛋白A亲和纯化的融合蛋白ACVR1-Fc，其中3μg蛋白质经4-12％NuPAGESDS-PAGE电泳分离后，电泳胶用考马斯亮蓝R-250染色。图中从左向右依次为：泳道1，非还原电泳；泳道2，还原电泳；泳道3，分子量标记。

图6：HPLC-SEC分析蛋白A亲和纯化的融合蛋白ACVR1-Fc。红色代表ACVR1-Fc融合蛋白，绿色代表细胞膜胞外段TNFR2的Fc融合蛋白(上海赛金生物医药有限公司)，做为对照，蓝色代表凝胶过滤分子量标准。

图7：ACVR1-Fc融合蛋白特异性结合BMP-2的ELISA研究。

图8：HUVEC成骨分化模型的构建：

a：ACVR1R206H腺病毒感染HUVEC细胞5天后，细胞再在成骨诱导培养基里培养7天，细胞用ALP染色；

b：ACVR1R206H腺病毒感染的HUVEC细胞在成骨诱导培养基里培养21天，茜素红染色；

c：ACVR1R206H腺病毒感染HUVEC细胞5天后，细胞再在软骨诱导培养基里培养14天，阿新蓝染色。在明视野显微镜下观测细胞并拍照。

图9：ALP染色研究ACVR1-Fc抑制HUVEC成骨分化的程度。在细胞分化培养的第7天，用ALP染色方法鉴定HUVEC细胞的成骨分化。对照实验所用的蛋白是重组人免疫球蛋白Fc区域(ChimerigenLaboratories，Cat.#CHI-HF-210IgG1)：

a：分化培养基含3μg/ml的对照蛋白(重组人IgG1Fc)；

b：分化培养基含1.5μg/ml的ACVR1-Fc融合蛋白；

c：分化培养基含3μg/ml的ACVR1-Fc融合蛋白。

图10：茜素红染色研究ACVR1-Fc抑制HUVEC成骨分化的程度。在细胞分化培养的第21天，用茜素红染色方法鉴定HUVEC细胞的成骨分化：

a：分化培养基含3μg/ml的对照蛋白Fc(重组人IgG1Fc)；

b：分化培养基含1.5μg/ml的ACVR1-Fc融合蛋白；

c：分化培养基含3μg/ml的ACVR1-Fc融合蛋白。

图11：阿新蓝染色研究ACVR1-Fc抑制HUVEC软骨分化的程度。在细胞分化培养的第21天，用阿新蓝染色方法鉴定HUVEC细胞的软骨分化：

a：分化培养基含3μg/ml的对照蛋白Fc(重组人IgG1Fc)；

b：分化培养基含1.5μg/ml的ACVR1-Fc融合蛋白；

c：分化培养基含3μg/ml的ACVR1-Fc融合蛋白。

图12：原子吸收分析法研究ACVR1-Fc抑制成骨分化。细胞成骨分化培养在含有对照Fc蛋白(重组人IgG1Fc)或ACVR1-Fc融合蛋白培养基中21天后，收集细胞，用原子发射光谱仪检测细胞中的钙离子浓度，图中的***表示P值小于0.001。

图13：免疫印迹研究ACVR1-Fc对成骨和软骨分化标志蛋白表达的影响：

a：免疫印迹法显示ACVR1-Fc对5种成骨标志蛋白的表达；

b：以GAPDH表达为基数，计算各标志蛋白表达抑制的程度。

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，构建了ACVR1-Fc融合蛋白表达载体，获得了相应的ACVR1-Fc融合蛋白，并发现所述融合蛋白具有优异的生物学活性，由此可用于与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状的预防和治疗。例如，本发明的融合蛋白可有效抑制ACVR1和ACVR2通路的活化，进而抑制细胞的成骨和软骨分化，由此可用于与因ACVR1和/或ACVR2信号通路过度活化所致骨化过度相关疾病和/或症状(例如进行性骨化性纤维增殖不良症FOP)的预防和/或治疗。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

在本发明中，术语“分离的”在用于核酸分子或蛋白质时，表示核酸分子或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。

融合蛋白及其组成元件

如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，其是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。

本发明的融合蛋白包含元件(a)和(b)以及任选的元件(c)和任选的(d)连接肽：

(a)ACVR1元件，其具有ACVR1或其活性片段的氨基酸序列；

(b)Fc元件，其包含人IgGFc片段；

(c)任选的，信号肽元件；以及

(d)任选的，位于以上元件之间的连接肽序列。

如本文所用，术语“元件”是指构成融合蛋白中一部分的氨基酸序列。

在本发明中，(a)ACVR1元件具有与天然的或变异的ACVR1全长序列或其胞外区序列基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然ACVR1基本上相同的生物活性。本发明的元件(a)优选具有ACVR1的胞外区序列，更优选具有SEQIDNO:4所示的序列。

在本发明的一些实施方式中，所述ACVR1元件选自：①具有SEQIDNO:4的序列；②与SEQIDNO:4所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:4所示的序列相同生物活性的序列；③与SEQIDNO:4所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:4所示的序列相同生物活性的序列。

在本发明中，术语Fc区或Fc片段是指铰链区+CH2区+CH3区。在本发明中，(b)Fc元件具有与天然的或变异的IgGFc片段基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然Fc片段基本上相同的生物活性。除了IgG的CH2和CH3区以外，本发明的Fc元件还可包含IgG的铰链区。本发明的元件(b)可为IgGγ1-4的Fc区，优选具有IgGγ1的Fc区，更优选具有SEQIDNO:6所示的序列。

在本发明的一些实施方式中，所述Fc元件选自：①具有SEQIDNO:6的序列；②与SEQIDNO:6所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:6所示的序列相同生物活性的序列；③与SEQIDNO:6所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:6所示的序列相同生物活性的序列。

在本发明中，(c)信号肽元件是指具有引导融合蛋白分泌、定位和/或输送功能的氨基酸序列，其长度通常为5-30个氨基酸。

在本发明的一些实施方式中，所述信号肽元件选自：CD33蛋白信号肽(优选具有SEQIDNO:2所示序列)、和任何有将蛋白分泌到细胞外功能的信号肽。

在本发明中，(d)连接肽序列是指在本发明的融合蛋白中起到连接不同元件作用的短肽，其长度通常为1～50(如5～50、5～40、10～40个氨基酸)。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS1998；95:5929-5934；ProteinEng，2000；13(5):309-312；ProteinEng，2003；15(11):871–879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响本发明的融合蛋白形成正确的折叠和空间构象。

在本发明中，所述融合蛋白中的各部分从5'至3'端的排列顺序可选下组：

(a)-(b)；(b)-(a)；(c)-(a)-(b)；(c)-(b)-(a)；(a)-(d)-(b)；(b)-(d)-(a)；(c)-(d)-(a)-(b)；(c)-(a)-(d)-(b)；(c)-(d)-(b)-(a)；(c)-(b)-(d)-(a)；(c)-(d1)-(a)-(d2)-(b)；(c)-(d1)-(b)-(d2)-(a)，

其中，(a)为ACVR1元件；(b)为Fc元件；(c)为信号肽元件；(d)为连接肽序列；(d)、(d1)和(d2)代表相同或不同的连接肽序列。

在本发明中，优选的融合蛋白可具有如下序列：

①具有SEQIDNO:8的序列；

本发明各元件的含义还包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代。另外，所述缺失或***(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了细胞抑制因子和人白蛋白的片段或衍生物，较佳的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。

上述变异形式还包括上述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的元件还包括与其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、甚至99％以上的同源性或相同性的多肽。

根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组DNA法，人工合成等[参见MurrayKM,DahlSLAnn；Pharmacother1997Nov；31(11):1335-8]。例如本发明的融合蛋白可用固相技术通过直接合成肽而加以生产，也可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

融合蛋白编码序列、载体及宿主细胞

本发明另一方面提供了一种分离的核酸分子，其具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。编码本发明融合蛋白的核酸分子，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法获得各元件的编码序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的核酸分子序列。

本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠(overlapping)扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。

在本发明中，融合蛋白编码核酸分子可包含：SEQIDNO:3所示的序列，以编码ACVR1元件；SEQIDNO:5所示的序列，以编码Fc元件；以及任选的，SEQIDNO:1所示的序列，以编码信号肽元件。

在本发明的优选例中，所述核酸分子的序列选自：

①具有SEQIDNO:7的序列；

③与SEQIDNO:7所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:7所示的序列相同生物活性的序列；

④在严格条件下与前述序列杂交且具有相应活性的分子。

本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与相同(同源)或基本上相同(同源)以下的核酸序列，如有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、甚至99％以上的同源性或相同性的核酸序列。两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个核酸序列在高度严谨条件下相互杂交。因此，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与本发明核酸序列(尤其是SEQIDNO:7的核酸序列)杂交的核酸序列。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。

在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体；能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体；能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体；以及原核表达载体。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHODG44。

本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。较佳的方法是电转化方法。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。最后，可用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的纯化，其包括离心，沉淀，过滤，层析等手段。具体地，层析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以及反向层析等。本发明提供的CIF/HSA融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。

本发明的应用

本发明的融合蛋白、其编码序列、包含该编码序列的载体或宿主细胞可以用作药物，以预防和/或治疗与ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病或症状的预防和治疗，例如与骨化过度相关的疾病或症状、与ACVR1突变和/或过度活化相关的癌症等。

所述骨化过度优选因ACVR1和/或ACVR2信号通路过度活化导致。在本发明的一些实施方式中，所述骨化过度相关的疾病或症状选自：进行性骨化性纤维增殖不良症、软骨增生、骨质增生等。所述与ACVR1突变和/或过度活化相关的癌症选自：高级别胶质瘤，如扩散型内因性脑桥神经胶质瘤；卵巢癌等。

由此，本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该组合物含有：(a)有效量的本发明融合蛋白、其编码序列、包含该编码序列的载体或宿主细胞；以及(b)药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。

本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的融合蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的药效。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子可参见例如：Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明登：药物科学与实践》)(2005)21世纪版，宾西法利亚州费城，LippincottWilliams和Wilkins。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量，通过是注射，口服，鼻内，呼吸道等方式进行施用。

如果用于本发明方法的治疗性物质为多核苷酸，该多核苷酸可作为裸多核苷酸、联合递送试剂、或作为包括和/或表达该多核苷酸试剂的重组质粒或病毒载体给予个体。适当的给药递送试剂包括密如斯M(Mirus)TransitTKO亲脂试剂、脂质转染试剂、脂质转染胺试剂、细胞转染试剂(cellfectin)、或阳离子聚合物(例如聚赖氨酸)、或脂质体。

为了提高用药效果，本发明的融合蛋白也可以与其他药物或疗法联用。例如，如果本发明的融合蛋白用于预防和/或治疗FOP，则可同时或先后采用临床上用于FOP治疗的其他药物或方法，所述其他药物或方法包括但不限于：预防进一步的伤害、调节局部区域功能、抗炎症、施用糖皮质激素、非甾体抗炎药NSAID、二膦酸盐、罗格列酮和放射治疗。如果本发明的融合蛋白用于预防和/或治疗与ACVR1突变和/或过度活化相关的癌症，则可同时或先后采用临床上用于癌症治疗的其他药物或方法，所述其他药物或方法包括但不限于：放疗、化疗、手术等。

本发明的优点

本发明中克服了本领域中要构建的重组蛋白不容易表达、难获得高表达的表达细胞株、表达的重组蛋白不能形成正确的结构形态导致在细胞里不溶或形成多聚体或者没有生物活性等技术困难，构建了可在哺乳动物细胞中表达的受体胞外段重组蛋白分子。

本发明融合蛋白表达稳定、产量高、纯化工艺简单，且具有高生物活性，可有效用于ACVR1异常(例如ACVR1突变和/或过度活化)相关的疾病和/或症状的预防和/或治疗，例如本发明的融合蛋白可有效抑制成骨和软骨分化，由此可有效用于骨化过度疾病或症状的预防和治疗；本发明的融合蛋白还可对与ACVR1突变和/或过度活化相关的肿瘤(如卵巢癌)的发生、恶化和转移起抑制作用。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.融合蛋白表达质粒的构建

ACVR1-Fc表达基因由3个片段组成(如图3所示)，从5'端到3'端依次为：

片段1：位于5'端的蛋白CD33的信号肽序列(其编码序列如SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)；

片段2：位于中间的ACVR1胞外段氨基酸21-123表达基因(其编码序列如SEQIDNO:3所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示)；

片段3：位于3'端的人源IgGγ1氨基酸序列的编码序列(其编码序列如SEQIDNO:5所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示)，其编码人源IgGγ1从第216至447位的氨基酸残基，含有绞链区和第2、第3个CH区(即铰链区+CH2+CH3)。

这3个基因分别由聚合酶链反应(PCR)合成，再用延伸重叠PCR技术把它们连接起来。聚合酶链反应是用Invitrogen公司的高保真聚合酶Plantiumpfx来完成。根据厂家提供的产品信息和各本身PCR特点设定PCR反应的条件。用Qiagen公司的胶提纯DNA片段试剂盒来提纯各个PCR片段。

片段1的合成

PCR扩增片段1的模板含有编码CD33蛋白16个氨基酸信号肽的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。

5'端引物CMV-P是质粒载体的序列(SEQIDNO:9)：

5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'；

3'端的引物SP-3(SEQIDNO:10)：5'-AGCCAGGGCCCCTGCC-3'。

片段2的cDNA合成

PCR扩增片段2的模板质粒含有ACVR1的完整胞外区基因(SEQIDNO:3)。

5'端引物ACVR1-5(SEQIDNO:11)：

5'-GGGCAGGGGCCCTGGCTATGGAGGACGAGAAGCCC-3'，

为了能和片段1cDNA连接，在它5'端引进和片段1的3'互补的17个核糖核苷酸。

3'端的引物序列ACVR1-3(SEQIDNO:12)：

5'-TATCACAGCTCTTGGGCTCCTCCAGGTGGAAGTTCTGGG-3'，

同样，为了和片段3cDNA连接，在它5'端引进和片段3的5'互补的19个核糖核苷酸。

片段3的cDNA的合成

PCR扩增片段3的模板质粒含有编码人源IgGγ1Fc氨基酸序列(aa216至447)的基因(SEQIDNO:5)。

5'端的引物Fc-5(SEQIDNO:13)：

5'-GAGCCCAAGAGCTGTGATA-3'，其与片段2cDNA3'端序列互补；

3'端的引物序列BGH-R(SEQIDNO:14)：

5'-AACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'。

片段的连接

首先用重叠延伸PCR法把片段1和2的cDNA连接。模板是提纯的二个片段的混合物，用片段1的5'端的引物CMV-P和片段2的3'端的引物ACVR1-3来实施聚合酶链反应。然后把连接的PCR片段和片段3连接，所用引物是CMV-P和BGH-R。

重组质粒的获得

用限制性内切酶NotI和XbaI酶切合成的PCR片段，用T4DNA连接酶把ACVR1-Fc表达基因片段克隆到改进的pcDNA3.1哺乳细胞表达载体(Invitrogen)。pcDNA3.1里的抗neomycin(新霉素)基因被DHFR(二氢叶酸还原酶)基因取代，改进后的载体适用于筛选稳定转染的哺乳细胞。将重组质粒转染进DH5a感受态细菌，用菌落PCR方法鉴定含有正确重组质粒的阳性菌落，提纯重组质粒。经酶切和测序鉴定，重组基因具有正确的序列。

实施例2.融合蛋白表达细胞株的建立

宿主细胞CHODG44来源于(购自Invitrogen公司，USA，货号12609-012)，细胞培养和传代的方法参照该公司的CHODG44手册。无转染细胞悬浮培养在CDDG44培养基里(Invitrogen)，培养基含有8mML-谷氨酰胺和5μg/ml重组人胰岛素。

用稳定转染方法建立了稳定高效蛋白表达的CHODG44细胞系。将克隆出来的CHODG44细胞悬浮培养在无血清、无动物蛋白的培养基里。

构建融合蛋白稳定表达细胞系方法和步骤简述如下：用TianGen的质粒大抽试剂盒制备融合蛋白表达载体质粒，并用限制性内切酶PuvI酶切100μg质粒，使质粒线形化。在表达载体质粒转染细胞前，DG44细胞至少要传三代。取DG44细胞总数1×10⁷个，与酶切的质粒混匀在0.8ml的CDDG44生长培养基里，转入0.4cm电击杯里(Bio-Rad)，用电转染仪(Bio-Rad，GenePulserXcell)电击细胞/质粒混合液，然后将转染的细胞培养在一个T-75细胞培养方瓶里，加入20ml细胞生长培养基。把含有转染细胞的T-75方瓶置于37℃，8％CO₂的培养箱里培养24个小时。

用有限稀释法在96孔培养板里筛选转染的细胞。筛选培养基是OptiCHO，含有8mML-谷氨酰胺，5μg/ml重组人胰岛素和100nM的氨甲碟呤(MTX)。在37℃，8％CO₂的培养箱里培养细胞。3周后，用ELISA方法(碱性磷酸酶偶联的羊抗人IgGFc抗体，JacksonImmuneResearch)对每个长有细胞克隆的孔的细胞培养液进行分析，把蛋白高表达的克隆进一步扩增，再ELISA检测，再扩增，最后得到高表达稳定细胞株。

实施例3.融合蛋白的蛋白A亲和层析和HPLC-SEC分析

用蛋白A亲和层析柱从稳定表达细胞培养液上清中纯化ACVR1-Fc融合蛋白。纯化方法参照标准的蛋白A(POROS，MabcaptureA)亲和层析方法，纯化的蛋白用还原和非还原SDS-PAGE电泳分析，并进行HPLC-SEC(高压液相-分子筛)分析。

实施例4.融合蛋白体外结合BMP-2蛋白的ELISA分析

将3.5μM的重组人BMP-2蛋白(SinoBiologicalInc.China)溶解在50mMNaCO₃溶液中，在96-孔ELISA板加入50μlBMP-2蛋白，于4℃冰箱里过夜。次日，用TBST洗ELISA板3次，加入100μl/孔TBST含3％BSA的封闭溶液。在同样数量的空白孔里也加入100μl的封闭液，用以检测ACVR1-Fc的非特异性结合。将ELISA板放置于37℃恒温箱里1小时。

在TBST含1％BSA的结合溶液里稀释融合蛋白，制备3倍系列稀释的融合蛋白。倒掉封闭液，加入50μl/孔3倍系列稀释的融合蛋白，在37℃恒温箱里反应1小时。倒掉融合蛋白溶液，用TBST清洗ELISA3次，加入50μl/孔的第二抗体(碱性磷酸酶偶联的羊抗人IgGFc抗体，JacksonImmuneResearch)，在37℃恒温箱里反应1小时。倒掉显色抗体，在ELISA板里加200μl/孔TBST清洗溶液，置ELISA板于水平摇床上5分钟，转速100转/分钟，倒掉清洗溶液。重复5次。加50μl/孔抗体显色液(PNPP)于ELISA板里，置板于37℃恒温箱里。在波长405nm下读板。

实施例5.重组腺病毒载体构建

用2种限制性内切酶，SmalI和XhoI，把ACVR1基因从载体Sport-ACVR1(人)(Invitrogen公司)中切下来，用定位突变技术把ACVR1基因片段中位于617位点的碱基G变为A，形成ACVR1(M)。然后，把ACVR1(M)片段克隆进pIRES2-EGFP(Invitrogen公司)质粒上，加载上pMD18-T简单载体(Takara)后产生重组质粒。将产生的重组质粒包装进pAdCMV/V5-DEST(Invitrogen公司)建立重组腺病毒ACVR1(M)-IRES-GFP。构建的病毒载体用DNA序列测序证实，蛋白表达被GFP绿色荧光证实(图4)。获得的病毒滴度为1×10¹⁰ifu/ml。图4a所示为表达ACVR1R206H的腺病毒质粒构建图。

实施例6.被重组病毒感染的HUVEC细胞的成骨分化和软骨分化诱导

将HUVEC细胞(ATCC，CRL-1739)培养维持在EGM(Lonza，CC-3162)培养基里，该培养基含有10％FBS(Gibco，10099-141)、1％青霉素-链霉素(Gibco15070-063)。在用重组病毒感染细胞前，饥饿培养细胞24个小时，培养基是人内皮-SFM培养基(HumanEndothelial-SerumFreeMedium，Gibco,11111-044)，其中含有2％FBS、1％青霉素和链霉素和2种生长因子，EGF(终浓度10ng/ml)和bFGF(终浓度20ng/ml)。然后，将ACVR1(M)-IRES-GFP腺病毒加入到细胞里(MOI：200)参见图4c)，培养5天后，更换培养基，用成骨分化培养基(GibcoStemProosteogenicmedium,A10072-01)或软骨分化培养基(GibcoStemProosteogenicmedium,A10071-01)继续培养，开始成骨或软骨过程。每2天换一次分化培养基。每个实验做3个平行，并重复一次。

实施例7.HUVEC模型的成骨细胞分化程度检测——碱性磷酸酶染色和茜素红S染色

为了鉴定实施例5中所得HUVEC模型的成骨细胞分化程度，在成骨过程的第7天和21天分别对细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(SalizarinredS)染色。在培养第7天，用PBS洗细胞3次，然后用4％甲醛固定细胞。PBS再洗细胞，加入底物工作溶液，在闭光下培养细胞30分钟。最后，用水洗细胞，在明视野显微镜下观测细胞并拍照。

在细胞成骨分化培养第21天，对细胞进行茜素红染色检测细胞基质钙化。和碱性磷酸酶染色处理细胞一样，PBS洗细胞，4％甲醛固定细胞，PBS再洗细胞，加入1％的茜素红S染色液(pH4.2)染色细胞10分钟。在明视野显微镜下观测细胞并拍照。

实施例8.HUVEC模型的软骨分化潜力检测——阿新蓝染色(AlcianBlueStaining)

在实施例5软骨分化培养第14天，收集细胞，PBS洗细胞3次，用4％甲醛固定细胞。PBS再洗细胞3次，加入0.3％的阿新蓝染色8GX(Sigma)和细胞培育，检测硫酸化蛋白多糖(sulfatedproteoglycan)，以验证细胞模型进行软骨分化的潜力。

实施例9.钙的原子吸收分析(Atomicabsorptionanalysisofcalcium)

如实施例5所述在6-孔板中对细胞进行成骨诱导，培养21天后，收集细胞，用钙的原子吸收分析来比较细胞之间的钙浓度。

用PBS(无钙和镁离子)洗细胞3遍，加入1ml裂解液(0.1％TritonX-100，10mMTris，pH7.5)。然后，在室温下用11.6N的HCl对细胞进行脱钙处理16小时，使钙离子尽量被释放出来。转裂解液入1.5ml小管，离心6000rpm，10分钟，收集上清，用原子发射光谱仪(Agilent,7200)测溶液中钙离子浓度。

实施例10.成骨分化和软骨分化标志蛋白表达水平的检测——免疫印迹法(Westernblot)

免疫印迹法检测成骨分化和软骨分化标志蛋白表达水平，以及BMP-Smad1/5/8的磷酸化。加入细胞RIPA裂解溶液(含蛋白酶抑制剂PMSF)裂解细胞，离心13000rpm，5分钟取上清。BCA法测定上清中蛋白含量。含有等量蛋白细胞裂解液用SDS-PAGE电泳分离，转到PVDF膜上，用标准的免疫印迹法检测蛋白。第一抗体是针对各蛋白或蛋白磷酸化的特异抗体(成骨和成软骨相关标志物的抗体来自Abcam公司，信号通路蛋白抗体及磷酸化的抗体均购自CellSignalingTechnology公司)，第二抗体是peroxidae偶联的羊抗兔或鼠IgG(JacksonImmunoresearchLaboratories)，ECLPlus(Millipore)显示所要检测的蛋白质。

采用实施例1～9中所述的方法获得的测试结果如下：

测试结果1.融合蛋白ACVR1-Fc稳定表达CHODG44细胞株的鉴定

采用实施例2所述方法，构建获得ACVR1-Fc高表达稳定细胞株，其表达量可达到600mg/L。

采用实施例3所述蛋白A亲和层析柱纯化的融合蛋白用还原和非还原SDS-PAGE电泳分析的结果如图5所示。结果显示ACVR1-Fc在自然状态下是二聚体，分子量为80kDa左右，接近其理论值75kDa。

HPLC-SEC分析结果如图6所示，结果显示ACVR1-Fc蛋白的分子量约为80kDa。该结果证明：所构建的稳定表达细胞株表达的融合蛋白ACVR1-Fc可以形成正确高级结构并可被分泌出细胞。

测试结果2.ACVR1-Fc体外结合BMP-2蛋白

有报道显示，ACVR1可以与骨形态发生蛋白-2(BMP-2)结合。实施例4的ELISA试验结果如图7所示，该结果证明：ACVR1-Fc在体外可以特异性结合BMP-2重组蛋白。ACVR1-Fc与BMP-2结合的EC₅₀是0.42μM。

测试结果3.HUVEC成骨分化模型的构建

有报道，ACVR1R206H在上皮细胞中表达可以诱导细胞转化成类似有干细胞功能的细胞，然后可以分化为成骨细胞和软骨细胞。在本研究中，我们重新构建HUVEC体系，观察ACVR-1融合蛋白作为潜在的治疗药物，对成骨过程和软骨形成以及BMP信号通道里蛋白磷酸化的抑制效果。

图4b和4c所示结果证明了实施例5中构建的重组腺病毒已成功感染HUVEC细胞，并可表达ACVR1R206H。

采用碱性磷酸酶、茜素红S和阿新蓝染色分化诱导的表达ACVR1R206H细胞的结果如图8所示。图8的结果证明了我们构建的表达ACVR1R206H腺病毒可以诱导HUVEC细胞成为成骨细胞和软骨细胞。

测试结果4.ACVR1-Fc抑制成骨和软骨分化的研究

图9、图10和图11所示分别为采用实施例7和8所述方法，在HUVEC细胞成骨或软骨分化培养过程中，加入ACVR1-Fc蛋白对HUVEC细胞成骨或软骨分化影响的碱性磷酸酶染色、茜素红S和阿新蓝染色结果。对照Fc为重组人IgG1Fc蛋白(rhIgG1Fc，ChimerigenLaboratories，Cat.#CHI-HF-210IgG1)。

图9和图10的结果显示：在分化培养的第7天，ALP染色显示，加入ACVR1-Fc蛋白培养的细胞分化程度要小于加入对照蛋白(rhIgG1Fc)培养的细胞(图9)，培养基中ACVR1-Fc浓度越高，HUVEC细胞成骨分化的程度越小。用茜素红染色方法检测分化培养第21天的细胞，得到相同的结果(图10)。该结果表明：在HUVEC细胞成骨分化培养过程中，加入ACVR1-Fc蛋白可以抑制HUVEC细胞的成骨分化。

图11的结果显示：在软骨分化培养过程中加入不同浓度的ACVR1-Fc融合蛋白较对照而言减小了细胞的分化程度。在培养第14天，阿新蓝染色显示ACVR1-Fc也同样能抑制HUVEC细胞的软骨分化。该结果表明：ACVR1-Fc也能抑制HUVEC细胞的软骨分化。

在成骨细胞分化的过程中，细胞间质钙离子浓度会增加。我们用钙的原子吸收方法分析ACVR1-Fc处理的HUVEC细胞在培养21天时的细胞间质钙离子浓度(如实施例9所述)，结果如图12所示。图12的结果显示：ACVR1-Fc融合蛋白处理的细胞中钙离子浓度极显著低于对照蛋白Fc处理的细胞。该结果证明了ACVR1-Fc融合蛋白确实抑制了HUVEC细胞的成骨分化。

测试结果5.细胞成骨分化标志蛋白的检测

采用实施例10中所述方法用免疫印迹法研究ACVR1-Fc对成骨细胞标志蛋白表达的影响，结果如图13所示。HUVEC细胞培养在含有对照Fc蛋白或ACVR1-Fc融合蛋白的成骨分化培养基9天后，收集细胞做免疫印迹。结果表明ACVR1-Fc可以降低所有所检测的成骨分化标志蛋白的表达，这和ACVR1-Fc抑制HUVEC成骨分化的功能一致。

测试结果6.成骨分化信号通道蛋白的磷酸化

Smad-1/5/8蛋白和p38MAPK信号通道和成骨和软骨分化功能有关，因此我们检测ACVR1-Fc是否影响Smad-1/5/8蛋白的磷酸化以及p38MAPK通道中蛋白的磷酸化。

结果证明ACVR1-Fc确实能显著抑制Smad-1/5/8蛋白的磷酸化以及p38MAP激酶的磷酸化，因此抑制p38MAP激酶的激活。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

附1.序列表对应关系

SEQ ID NO:	序列名称
		1	片段1(CD33的信号肽)的编码序列
2	片段1的氨基酸序列
		3	片段2(ACVR1胞外段)的编码序列
4	片段2的氨基酸序列
		5	片段3(人源IgGγ1)的编码序列
6	片段3的氨基酸序列
		7	ACVR1-Fc融合蛋白编码序列
8	ACVR1-Fc融合蛋白氨基酸序列
		9	片段1的5'端引物CMV-P
10	片段1的3'端引物SP-3
		11	片段2的5'端引物ACVR1-5
12	片段2的3'端引物ACVR1-3
		13	片段3的5'端引物Fc-5
14	片段3的3'端引物BGH-R
		15	ACVR1的全长氨基酸序列

附2.参考文献

1.KaplanFS,ChakkalakalSA,ShoreEM.Fibrodysplasiaossificansprogressiva:mechanismsandmodelsofskeletalmetamorphosis.DisModelMech,2012,5:756-762.

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3.LounevVY,RamachandranR,WosczynaMN.etal.IdentificationofProgenitorCellsThatContributetoHeterotopicSkeletogenesis.JBoneJointSurgAm.2009；91:652-663.

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Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括以下元件：

(a)ACVR1元件，其具有ACVR1或其活性片段的氨基酸序列，优选ACVR1胞外段序列；

(b)Fc元件，其包含人IgGFc片段；

(c)任选的，信号肽元件；以及

(d)任选的，位于以上元件之间的连接肽序列。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中的元件独立地选自下组：

(a)所述ACVR1元件选自：①具有SEQIDNO:4的序列；②与SEQIDNO:4所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:4所示的序列相同生物活性的序列；③与SEQIDNO:4所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:4所示的序列相同生物活性的序列；

(b)所述Fc元件选自：包含人IgGγ1、IgGγ2、IgGγ3或IgGγ4的Fc片段，优选选自：①具有SEQIDNO:6的序列；②与SEQIDNO:6所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或***且具有与SEQIDNO:6所示的序列相同生物活性的序列；③与SEQIDNO:6所示的序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO:6所示的序列相同生物活性的序列；

(c)所述信号肽元件选自：CD33蛋白信号肽、表面抗原蛋白信号肽、抗体蛋白信号肽、分泌蛋白分子信号肽，优选具有SEQIDNO:2所示序列。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白选自：

①具有SEQIDNO:8的序列；

4.一种分离的核酸分子，其为权利要求1-3中任一项所述融合蛋白的编码序列或为所述编码序列的互补序列。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含：SEQIDNO:3所示的序列；SEQIDNO:5所示的序列；以及任选的，SEQIDNO:1所示的序列；

优选，所述核酸分子选自：

①具有SEQIDNO:7的序列；

6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4或5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体。

8.一种生产权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达出所述融合蛋白；和

(b)分离所述的融合蛋白。

9.权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体和/或权利要求7所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗与ACVR1异常相关的疾病或症状的药物中的应用，优选所述疾病或症状选自：骨化过度相关的疾病、与ACVR1突变和/或过度活化相关的癌症，优选所述癌症选自：高级别胶质瘤，如扩散型内因性脑桥神经胶质瘤；卵巢癌。

10.一种药物组合物，其包含：

选自下组的一种或多种活性物质：权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体和/或权利要求7所述的宿主细胞；以及

药学上可接受的载体。