JP6822849B2 - 多重特異的NKp46結合タンパク質 - Google Patents
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Description
本出願は、全ての図面を含め、参照により両方の全内容が本明細書に組み入れられる、2014年6月27日出願の米国仮特許出願第62/017,886号明細書及び2015年1月27日出願の米国仮特許出願第62/108,088号明細書の利益を主張するものである。
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、2015年6月23日に作成された303KBサイズの「NKp46−3 PCT_ST25 txt」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
(a)NKp46発現NK細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときのNKp46におけるアゴニスト活性、及び
(b)標的細胞の非存在下でNK細胞、例えば、NKp46発現NK細胞と共にインキュベートされたときのNKp46におけるアゴニスト活性の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、NK細胞は、精製NK細胞である。
(a)NKp46発現NK細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、NKp46発現NK細胞を活性化する能力、及び
(b)標的細胞の非存在下でNKp46発現NK細胞と共にインキュベートされたときの、NKp46発現NK細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、NK細胞は、精製NK細胞である。
(a)NKp46発現NK細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、NKp46発現NK細胞に標的細胞を溶解させる能力、及び
(b)標的細胞の非存在下でNKp46発現NK細胞と共に(例えば、NKp46発現NK細胞のみで)インキュベートされたときの、NKp46発現NK細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、NK細胞は、精製NK細胞である。
(a)NKp46発現NK細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、NKp46発現NK細胞を活性化させ、且つ/又はNK細胞の細胞毒性を媒介する能力、及び
(b)NKp46−CD16+NK細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、NKp46陰性、CD16陽性(NKp46+CD16−)NK細胞を活性化させ、且つ/又はNK細胞毒性を媒介する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、NK細胞は、精製NK細胞である。
(a)NKp46発現細胞(例えば、NK細胞)及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときのNKp46におけるアゴニスト活性、及び
(b)Fcγ受容体発現細胞(例えば、Fcγ受容体発現リンパ球)の存在下で、且つ標的細胞(目的の抗原を発現する細胞)の非存在下で、NK細胞と共にインキュベートされたときのNKp46におけるアゴニスト活性の欠如
によって特徴付けることができる。
(a)NKp46発現細胞(例えば、NK細胞)及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときの、NKp発現NK細胞を活性化する能力、及び
(b)Fcγ受容体発現細胞(例えば、Fcγ受容体発現リンパ球)の存在下で、且つ標的細胞(目的の抗原を発現する細胞)の非存在下で、NK細胞と共にインキュベートされたときの、NKp46発現NK細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。
(a)多重特異的タンパク質が、NKp46発現細胞(例えば、NK細胞)及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときにNKp46におけるアゴニスト活性を有するか否かを決定するステップ、及び
(b)多重特異的タンパク質が、標的細胞の非存在下で(任意選択により、さらにFcγ受容体発現細胞の存在下で)NK細胞と共にインキュベートされたときにNKp46におけるアゴニスト活性を有するか否かを決定するステップ
を含む。
(a)各多重特異的タンパク質を、NKp46発現細胞(例えば、NK細胞)及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときのNKp46におけるアゴニスト活性について評価するステップ、
(b)各多重特異的タンパク質が、標的細胞の非存在下でNK細胞と共に(任意選択により、さらにFcγ受容体発現細胞と共に)インキュベートされたときのNKp46におけるアゴニスト活性について評価するステップ、及び
(c)多重特異的タンパク質が、
a.NKp46発現細胞(例えば、NK細胞)及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときに、NKp46におけるアゴニスト活性を有し、且つ
b.標的細胞の非存在下で(任意選択により、さらにFcγ受容体発現細胞の非存在下で)NK細胞と共にインキュベートされたときにNKp46におけるアゴニスト活性を欠いている場合に、(例えば、薬剤として使用するため、さらなる評価のため、さらなる産生などのために)多重特異的タンパク質を選択するステップ
を含む。
(a)N末端からC末端にかけて、第1の可変ドメイン(V)、CH1又はCK定常領域、Fcドメイン又はその一部、第2の可変ドメイン、及び第3の可変ドメインを含む、第1のポリペプチド鎖、及び
(b)N末端からC末端にかけて、第1の可変ドメイン(V)、CH1又はCK定常領域、及び任意選択によりFcドメイン又はその一部を含む、第2のポリペプチド鎖
を含み、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチドの第1の可変ドメインとが、目的の第1の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第2の可変ドメインと第3の可変ドメインとが、目的の第2の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する。第2のポリペプチド鎖にFcドメインが欠如している場合、第1のポリペプチド鎖は、CH3−CH3二量体化(例えば、置換又は直列型CH3ドメイン)を防止するための改変されたFcドメインを含む。
(a)N末端からC末端にかけて、第2の可変ドメイン及び第3の可変ドメイン、Fcドメイン又はその一部、第1の可変ドメイン(V)、並びにCH1又はCK定常領域を含む、第1のポリペプチド鎖、及び
(b)N末端からC末端にかけて、第1の可変ドメイン(V)、CH1又はCK定常領域、及び任意選択によりFcドメイン又はその一部を含む、第2のポリペプチド鎖
を含み、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチドの第1の可変ドメインとが、目的の第1の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第2の可変ドメインと第3の可変ドメインとが、目的の第2の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する。第2のポリペプチド鎖にFcドメインが欠如している場合、第1のポリペプチド鎖は、CH3−CH3二量体化(例えば、置換又は直列型CH3ドメイン)を防止するための改変されたFcドメインを含む。
(a)N末端からC末端にかけて、第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)、Fcドメイン又はその一部、及び第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン(V)を含む、第1のポリペプチド鎖、
(b)第2のポリペプチド鎖であって、N末端からC末端にかけて、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の(第2ではなく)第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメイン、及び任意選択によりFcドメイン又はその一部を含む、第2のポリペプチド鎖、及び
(c)N末端からC末端にかけて、CH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含み、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖の(第1ではなく)第2の可変領域及び第2のCH1又はCK定常領域と相補的であるように選択される、第3のポリペプチド鎖
を含む。従って、第1のポリペプチドと第3のポリペプチドとは、第3のポリペプチドのCH1又はCK定常領域と第1のポリペプチドの第1のCH1又はCK定常領域との間ではなく、第3のポリペプチドのCH1又はCK定常領域と第1のポリペプチドの第2のCH1又はCK定常領域との間にCH1−CKヘテロ二量体を形成する。第1のポリペプチドと第2のポリペプチドと第3のポリペプチドとは、CH1−CKヘテロ三量体を形成し、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチド鎖の可変ドメインとは、目的の第1の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインと第3のポリペプチド鎖の可変ドメインとは、目的の第2の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。
(a)配列番号3のVH領域及び配列番号4のVL領域を有する抗体(NKp46−1)、
(b)配列番号5のVH領域及び配列番号6のVL領域を有する抗体(NKp46−2)、
(c)配列番号7のVH領域及び配列番号8のVL領域を有する抗体(NKp46−3)、
(d)配列番号9のVH領域及び配列番号10のVL領域を有する抗体(NKp46−4)、
(e)配列番号11のVH領域及び配列番号12のVL領域を有する抗体(NKp46−6)、及び
(f)配列番号13のVH領域及び配列番号14のVL領域を有する抗体(NKp46−9)。
(a)配列番号3のVH領域及び配列番号4のVL領域を有する抗体(NKp46−1)、
(b)配列番号5のVH領域及び配列番号6のVL領域を有する抗体(NKp46−2)、
(c)配列番号7のVH領域及び配列番号8のVL領域を有する抗体(NKp46−3)、
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(e)配列番号11のVH領域及び配列番号12のVL領域を有する抗体(NKp46−6)、及び
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(a)配列番号3のVH領域及び配列番号4のVL領域を有する抗体(NKp46−1)、
(b)配列番号5のVH領域及び配列番号6のVL領域を有する抗体(NKp46−2)、
(c)配列番号7のVH領域及び配列番号8のVL領域を有する抗体(NKp46−3)、
(d)配列番号9のVH領域及び配列番号10のVL領域を有する抗体(NKp46−4)、
(e)配列番号11のVH領域及び配列番号12のVL領域を有する抗体(NKp46−6)、及び
(f)配列番号13のVH領域及び配列番号14のVL領域を有する抗体(NKp46−9)。
(a)(i)表AのNKp46−1の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに(ii)表AのNKp46−1の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(b)(i)表AのNKp46−2の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに(ii)表AのNKp46−2の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(c)(i)表AのNKp46−3の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに(ii)表AのNKp46−3の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(d)(i)表AのNKp46−4の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに(ii)表AのNKp46−4の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(e)(i)表AのNKp46−6の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに(ii)表AのNKp46−6の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、又は
(f)(i)表AのNKp46−9の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに(ii)表AのNKp46−9の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖。
(a)配列番号3の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号4の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(b)配列番号5の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号6の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(c)配列番号7の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号8の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(d)配列番号9の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号10の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(e)配列番号11の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号12の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、又は
(f)配列番号13の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号14の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖。
本明細書で使用される「1つの(a)」又は「1つの(an)」は1つ以上を意味し得る。請求項において「含む(comprising)」という語と共に使用される場合、「1つの(a)」又は「1つの(an)」という語は1つ又は2つ以上を意味し得る。
本明細書に記載のタンパク質に使用される抗原結合ドメインは、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインAのZドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたKunitzドメイン、ヒトフィブロネクチンIIIの第10細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、DARPin(設計アンキリン反復ドメイン、多量体化LDLR−Aモジュール、アビマー、又はシステインリッチknottinペプチド)から容易に得ることができる。例えば、参照により開示内容が本明細書に組み入れられる、Gebauer and Skerra(2009)Current Opinion in Chemical Biology 13:245-255を参照されたい。
単量体多特異タンパク質は、様々な形式によって産生することができる。一例では、多特異タンパク質は、単一ポリペプチド鎖に、NKp46に結合する第1の抗原結合ドメイン、及びNKp46以外の抗原に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、抗体は、任意選択により別のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合された、直列型scFvである。一実施形態では、単一ポリペプチド鎖は、Fcドメイン(例えば、完全長Fcドメイン又はその一部)をさらに含み、任意選択により、Fcドメインは、第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとの間に配置される。
(ABD1)−(ABD2)−CH2−CH3
(ABD2)−(ABD1)−CH2−CH3
CH2−CH3−(ABD1)−(ABD2)
CH2−CH3−(ABD2)−(ABD1)
を含むことができ、ABD1及びABD2の一方が目的の抗原に結合し、且つ他方がNKp46に結合し、任意選択により、CH1ドメイン又はその断片及び/又はヒンジドメインが、ABD1とCH2との間、又はABD2とCH2との間に配置される。任意選択により、各ABDは、VL及びVHドメインを含む。任意選択により、これらの任意のポリペプチドが直列型CH3ドメインを含み、第2のCH3ドメインが第1のCH3ドメインのC末端に可撓性リンカーを介して融合される。
(ABD1)−CH2−CH3−(ABD2)
(ABD2)−CH2−CH3−(ABD1)
を含むことができ、ABD1及びABD1の一方が目的の抗原に結合し、且つ他方がNKp46に結合し、任意選択により、CH1ドメイン及び/又はヒンジドメインが、ABD1とCH2との間、又はABD2とCH2との間に配置される。任意選択により、各ABDは、VL及びVHドメインを含む。任意選択により、これらの任意のポリペプチドが、可撓性リンカーを介して第1のCH3ドメインのC末端に融合された第2のCH3ドメインを有する。このようなポリペプチドの例は、図6Aの形態1、3、及び4として示されている。
−CH3−リンカー−CH3−
を有するように同じポリペプチド鎖上に配置することができる。
(ABD1)−CH2−CH3−リンカー−CH3−(ABD2)
(ABD2)−CH2−CH3−リンカー−CH3−(ABD1)
(ABD1)−(ABD2)−CH2−CH3−リンカー−CH3
(ABD2)−(ABD1)−CH2−CH3−リンカー−CH3
CH2−CH3−リンカー−CH3−(ABD1)−(ABD2)
CH2−CH3−リンカー−CH3−(ABD2)−(ABD1)。
多量体二重特異的タンパク質、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及び四量体(この四量体は、例えば、2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する抗体を含む)は、様々な形態に従って産生することができる。
Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−Vb−2、及び
Va−2−Vb−2−Fcドメイン−Va−1−(CH1又はCK)a
が挙げられ、Va−1は、軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Vb、及び
Vb−Fcドメイン−Va−1−(CH1又はCK)a
が挙げられ、Vbは、単一可変ドメイン(例えば、dAb、VhH)である。
Vb−1−(CH1又はCK)b、又は
Vb−1−(CH1又はCK)b−Fcドメイン
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)2が中心鎖の(CH1又はCK)1と二量体化し、Vb−1が中心鎖のVa−1と共に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のVa−1が軽鎖可変ドメインである場合、Vb−1は重鎖可変ドメインであり、中心鎖のVa−1が重鎖可変ドメインである場合、Vb−1は軽鎖可変ドメインである。
Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−(CH1又はCK)b。
Vb−1−(CH1又はCK)c、又は
Vb−1−(CH1又はCK)c−Fcドメイン
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)cが中心鎖の(CH1又はCK)1と二量体化し、Va−1とVb−1とが抗原結合ドメインを形成する。
Vb−2−(CH1又はCK)d
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)dが中心鎖の(CH1又はCK)b単位と二量体化し、Va−2とVb−2とが抗原結合ドメインを形成する。
(a)第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン(V)、及び第1の可変ドメインと第2の可変ドメインとの間に配置されたFcドメイン又はその一部を含む、第1のポリペプチド鎖、
(b)第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域にそのC末端で融合された可変ドメイン、及び任意選択によりFcドメインを含む、第2のポリペプチド鎖、及び
(c)CH1又はCK定常領域に(例えば、そのC末端で)融合された可変ドメインを含む、第3のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及び定常領域が、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第3のポリペプチドが、第3のポリペプチドのCH1又はCK定常領域と第1のポリペプチドの第1のCH1又はCK定常領域との間ではなく、第3のポリペプチドのCH1又はCK定常領域と第1のポリペプチドの第2のCH1又はCK定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によって結合されたCH1−CKヘテロ二量体を形成する、第3のポリペプチド鎖
を含み、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドと第3のポリペプチドとがCH1−CKヘテロ三量体を形成し、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第1の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、且つ第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインと第3のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第2の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。
−CH3−リンカー−CH3−。
一実施形態では、ABD(例えば、scFv、VH又はVLドメイン)のCH2又はCH3への連結に使用されるペプチドリンカーは、CH1ドメインの断片を含む。例えば、CH1のN末端アミノ酸配列は、抗体の天然の構造を可能な限り模倣するために、ABD(例えば、scFv、VH又はVLドメインなど)に融合することができる。一実施形態では、リンカーは、2〜4の残基、2〜4の残基、2〜6の残基、2〜8の残基、2〜10の残基、2〜12の残基、2〜14の残基、2〜16の残基、2〜18の残基、2〜20の残基、2〜22の残基、2〜24の残基、2〜26の残基、2〜28の残基、又は2〜30の残基のN末端CH1アミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列RTVAを含む、又はアミノ酸配列RTVAからなる。
定常領域ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。特に興味深いのは、定常重(CH)ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。IgG抗体との関連では、IgGアイソタイプは、それぞれ3つのCH領域を有する。従って、IgGとの関連での「CH」ドメインは、次の通りである:「CH1」は、Kabatと同様のEUインデックスによると118〜220位を指す。「CH2」は、Kabatと同様のEUインデックスによると237〜340位を指す。「CH3」は、Kabatと同様のEUインデックスによると341〜447位を指す。「ヒンジ」、「ヒンジ領域」、又は「抗体ヒンジ領域」とは、抗体における第1及び第2の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドのことである。構造的に、IgG Ch1ドメインは、EU220位で終端し、IgG CH2ドメインは、EU237位の残基で始まる。従って、IgGでは、ヒンジは、本明細書では、221位(IgG1のD221)〜236位(IgG1のG236)を含むように定義され、付番は、Kabatと同様のEUインデックスに従った。ポリペプチド内に見られる定常領域ドメイン内のアミノ酸残基について言及する場合、特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、IgG抗体との関連で、Kabatに準拠するものとする。
−CH3−リンカー−CH3−
を有するようにポリペプチド鎖に配置することができる。
一実施形態では、本明細書のタンパク質及び抗体は、配列番号1のNKp46ポリペプチドのNKp46のD1ドメイン、NKp46のD2ドメイン、又は(D1とD2ドメインの境界、D1/D2接合部において)D1及びD2ドメインの両方に跨る領域に結合する。一実施形態では、タンパク質又は抗体は、10−8M未満、10−9M未満、又は10−10M未満のKDによって特徴付けられるヒトNKp46に対する親和性を有する。
(a)任意選択により1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Bに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9の重鎖可変領域、
(b)任意選択により1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Bに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9の軽鎖可変領域、
(c)任意選択により1つ以上のこれらのアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Bに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9の重鎖可変領域、及び任意選択により1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Bに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9のそれぞれの軽鎖可変領域、
(d)任意選択によりCDRの1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Aに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9の重鎖CDR1、2、及び3(HCDR1、HCDR2)アミノ酸配列、
(e)任意選択によりCDRの1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Aに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9の軽鎖CDR1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)アミノ酸配列、又は
(f)任意選択によりCDRの1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Aに示されているNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9の重鎖CDR1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)アミノ酸配列、並びに任意選択によりCDRの1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Aに示されているそれぞれのNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、NKp46−6、又はNKp46−9抗体の軽鎖CDR1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)アミノ酸配列
を含む。
a)本明細書に記載の単量体二重特異的ポリペプチド(例えば、(a)NKp46に結合する第1の抗原結合ドメイン、(b)標的細胞で発現されるポリペプチドに結合する第2の抗原結合ドメイン、及び(c)ヒトFcドメインの少なくとも一部を含むポリペプチド、ここで、多重特異的ポリペプチドは、ヒト新生児Fc受容体(FcRn)に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトIgG1抗体と比較して、ヒトFcγ受容体に対する低い結合性を有する)をコードする核酸を用意するステップ、及び
b)それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて前記ポリペプチドを産生し、且つ単量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、ステップ(b)は、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和***換カラム、任意選択によりプロテインA支持体又はカラムにローディングし、且つ単量体タンパク質を収集するステップを含む。
a)本明細書に記載の第1のポリペプチド鎖(例えば、CH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)、第2の可変ドメイン(及び任意選択により第3の可変ドメイン、ここで、第2及び第3の可変ドメインは第1の抗原結合ドメインを形成する)、及び第1の可変ドメインと第2の可変ドメインとの間に配置されたFcドメイン又はその一部を含むポリペプチド鎖)をコードする第1の核酸を用意するステップ、
b)本明細書に記載の第2のポリペプチド鎖(例えば、第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域にそのC末端で融合された第1の可変ドメイン(V)を含み、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチドの第1の可変ドメインとが第2の抗原結合ドメインを形成する、ポリペプチド鎖)をコードする第2の核酸を用意するステップであって、第1又は第2の抗原結合ドメインの一方がNKp46に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する、ステップ、及び
c)それぞれ前記第1及び第2の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第1及び第2のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前の総タンパク質(例えば、二重特異的タンパク質)の少なくとも20%、25%、又は30%を占める。任意選択により、ステップ(c)は、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和***換カラム、任意選択によりプロテインA支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(又は親和***換若しくはプロテインAカラムにローディングした後に収集されたタンパク質)をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ二量体画分を収集するステップを含む。一実施形態では、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインは、(任意選択により第3の可変ドメインと共に)NKp46に結合する。
a)複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、(例えば、同じ又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる)複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれについて、重鎖候補可変領域をコードする1つの核酸及び軽鎖候補可変領域をコードする1つの核酸を含む、ステップ、
b)複数の核酸対のそれぞれについて、ヘテロ二量体タンパク質を、
(i)CH1又はCK定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の一方、第2の可変ドメイン(及び任意選択により第3の可変ドメイン、ここで、第2及び第3の可変ドメインは第1の抗原結合ドメインを形成する)、及び候補と第2の可変ドメインとの間に配置されたFcドメイン又はその一部を含む、第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を作製するステップ、
(ii)第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域にそのC末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の他方を含む、第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を作製するステップであって、重鎖と軽鎖候補可変ドメインとが第2の抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
(iii)それぞれ第1及び第2のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記第1及び第2のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
によって作製するステップ、及び
c)産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示される活性について評価するステップ
を含む。この方法では、第1又は第2の抗原結合ドメインの一方がNKp46に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する。一実施形態では、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインは、(任意選択により第3の可変ドメインと共に)NKp46に結合する。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも20%、25%、又は30%を占める。任意選択により、(iii)の回収するステップは、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和***換カラム、任意選択によりプロテインA支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(又は親和***換若しくはプロテインAカラムにローディングした後に収集されたタンパク質)をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ二量体画分を収集するステップを含む。一実施形態では、第1の抗原結合ドメインはNKp46に結合し、第2の抗原結合ドメインは目的の抗原に結合し、任意選択により、第1の抗原結合ドメインは抗NKp46 scFvである。一実施形態では、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインは、(任意選択により第3の可変ドメインと共に)NKp46に結合する。
(a)本明細書に記載の第1のポリペプチド鎖(例えば、第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン、及び第1の(V−CH1/CK)単位と第2の(V−CH1/CK)単位との間に配置されたFcドメイン若しくはその一部を含むポリペプチド鎖)をコードする第1の核酸を用意するステップ、
(b)本明細書に記載の第2のポリペプチド鎖(例えば、第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する、CH1又はCK定常領域にそのC末端で融合された可変ドメイン(V)を含みポリペプチド鎖)をコードする第2の核酸を用意するステップ、
(c)本明細書に記載の第3のポリペプチド鎖(例えば、そのC末端でCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含むポリペプチド鎖であって、このCH1又はCK定常領域が、第1及び第3のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、第1のポリペプチドの第2の可変ドメインと第3のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する、ポリペプチド鎖)を含む、第3の核酸を用意するステップ、及び
(d)それぞれ前記第1、第2、及び第3の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第1、第2、及び第3のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも20%、25%、又は30%を占める。任意選択により、ステップ(d)は、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和***換カラム、任意選択によりプロテインA支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(例えば、親和***換又はプロテインAカラムにローディングした後に収集されたタンパク質)をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ三量体画分を収集するステップを含む。この方法では、抗原結合ドメインの一方はNKp46に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。一実施形態では、第2又は第3のポリペプチドは、(例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して)CH1又はCKドメインのC末端に融合されたFcドメイン若しくはその断片をさらに含む。一実施形態では、第1のポリペプチドの第2の可変ドメインと第3のポリペプチドの可変ドメインとは、NKp46に結合する抗原結合ドメインを形成する。
a)複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、(例えば、同じ又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる)複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれについて、重鎖候補可変領域をコードする1つの核酸及び軽鎖候補可変領域をコードする1つの核酸を含む、ステップ、
b)複数の核酸対のそれぞれについて、ヘテロ三量体タンパク質を、
(i)第1のCH1又はCK定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の一方、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン、及び第1の(V−CH1/CK)単位と第2の(V−CH1/CK)単位との間に配置されたFcドメイン若しくはその一部を含む、第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を作製するステップ、
(ii)第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域にそのC末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の他方を含む、第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を作製するステップであって、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが抗原結合ドメインを形成する、ステップ、
(ii)そのC末端でCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含む、第3のポリペプチド鎖をコードする第3の核酸を作製するステップであって、このCH1又はCK定常領域が、第1及び第3のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、第1のポリペプチドの第2の可変ドメインと第3のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
(iii)それぞれ第1及び第2のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記第1及び第2のポリペプチド鎖を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
によって作製するステップ、及び
c)産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示される活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、第2又は第3のポリペプチドは、(例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して)CH1又はCKドメインのC末端に融合されたFcドメイン若しくはその断片をさらに含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも20%、25%、又は30%を占める。任意選択により、(iii)の回収するステップは、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和***換カラム、任意選択によりプロテインA支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を収集するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(例えば、親和***換若しくはプロテインAカラムにローディングした後に収集されたタンパク質)をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ三量体画分を収集するステップを含む。
本開示の、ドメイン配置が異なる複数の多重特異的タンパク質を別個に(例えば、別の容器で)産生するステップ、及び
産生された複数の多重特異的タンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示の活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、異なるドメイン配置を有するタンパク質は、NKp46及び/又は目的の抗原について抗原結合ドメイン(例えば、同じCDR又は可変ドメイン)を共有する。一実施形態では、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又はそれを超える異なるタンパク質が産生され、評価される。一実施形態では、タンパク質の1つ以上(又は全て)が、本明細書に開示のドメイン配置を有するタンパク質、例えば、形態F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15、F16、及びF17のタンパク質の群から選択される。一実施形態では、タンパク質は、本明細書に開示の方法に従って産生される。任意選択により、複数の多重特異的タンパク質は、単量体Fcドメインを有する1つのタンパク質及び二量体Fcドメインを有する1つのタンパク質を含む。
(a)本明細書に記載の抗NKp46二重特異的タンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
(b)それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記タンパク質を産生し、及び前記タンパク質を回収するステップ、及び
(c)産生されたタンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示の活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、複数の異なる抗NKp46二重特異的タンパク質が産生され、評価される。
(i)(目的の抗原を発現する)標的細胞の存在下で、NKp46を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ(i)の後に、前記エフェクター細胞を活性化するタンパク質を(例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために)選択するステップを含む。
(i)(目的の抗原を発現する)標的細胞の非存在下で、NKp46を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ(i)の後に、前記エフェクター細胞を実質的に活性化しないタンパク質を(例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために)選択するステップを含む。
(i)(目的の抗原を発現する)標的細胞の存在下で、NKp46を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ、及び
(ii)(目的の抗原を発現する)標的細胞の非存在下で、NKp46を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、この方法は、標的細胞の非存在下でインキュベートされたときに前記エフェクター細胞を実質的に活性化せず、且つ標的細胞の存在下でインキュベートされたときに前記エフェクター細胞を活性化するタンパク質を(例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために)選択するステップをさらに含む。
(i)(目的の抗原を発現する)標的細胞の存在下で、NKp46を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、ポリペプチドが、このようなエフェクター細胞に(目的の抗原を発現する)標的細胞を溶解させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ(i)の後に、標的細胞の存在下で、NKp46を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞に標的細胞を溶解させるタンパク質を(例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために)選択するステップを含む。
(i)標的細胞の存在下で、CD16を発現するがNKp46を発現しないエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化させるタンパク質の能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ(i)の後に、標的細胞の存在下で前記エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を実質的に活性化しないタンパク質を(例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために)選択するステップを含む。
一態様では、必要とする哺乳動物の処置又は診断用の医薬製剤の製造における本明細書で定義される任意の化合物の使用が提供される。また、薬剤として、又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質として上記定義された任意の化合物の使用も提供される。さらなる態様では、経口投与、局所投与、又は注射用の固体又は液体製剤を提供するために、上記定義された化合物を含む医薬組成物を調製する方法が提供される。このような方法又はプロセスは、少なくとも化合物を薬学的に許容され得る担体と混合するステップを含む。
抗huNKp46抗体の作製
Balb/cマウスを、組換えヒトNKp46細胞外ドメイン組換えFcタンパク質で免疫した。マウスは、50μgのNKp46タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、50μgのNKp46タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により2回目の免疫を行い、最後に、10μgのNKp46タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を、追加免疫の3日後にX63.Ag8.653不死化B細胞に融合し、これを、放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
この実験の目的は、Fcドメインを、抗NKp46結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することにあった。二重特異的タンパク質は、その抗NKp46結合ドメインを介してNKp46に一価で結合する。単量体Fcドメインは、ヒト新生児Fc受容体(FcRn)に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトCD16及び/又は他のヒトFcγ受容体には実質的に結合しない。結果として、二重特異的タンパク質は、Fcγ媒介(例えば、CD16媒介)標的細胞溶解を誘導しない。
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗NKp46二重特異的抗体が作製されていないため、NKp46を介したNK細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の機能を調べるために、NKp46の代わりにCD3をモデル抗原として使用した。
コード配列を、直接合成及び/又はPCRによって構築した。PCRは、PrimeSTAR MAX DNAポリメラーゼ(Takara,#R045A)を用いて行い、PCR産物を、NucleoSpinゲル及びPCR clean−upキット(Macherey−Nagel,#740609.250)を用いて1%アガロースゲルから精製した。精製した後、PCR産物を定量してから、製造者のプロトコル(ClonTech,#ST0345)に記載されているようにIn−Fusion連結反応を行った。プラスミドは、Nucleospin 96プラスミドキット(Macherey−Nagel,#740625.4)を用いてEVO200(Tecan)で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、CHO細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
細胞を回収して、抗CD19−F1−抗CD3産生細胞の細胞上清で、4℃で1時間染色した。染色緩衝液(PBS 1X/BSA 0.2%/EDTA 2mM)で2回洗浄した後、細胞を、ヤギ抗ヒト(Fc)−PE抗体(IM0550 Beckman Coulter−1/200)で、4℃で30分間染色した。2回の洗浄後、染色物をBD FACS Canto IIで得て、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
精製抗CD19−F1−抗CD3によるT細胞及びB細胞の凝集
精製抗CD19−F1−抗CD3をT/B細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、CD19及びCD3発現細胞の凝集において機能するか否かを評価した。
二重特異的単量体FcポリペプチドのFcRnに対する結合性
表面プラズモン共鳴(SPR)による親和性試験
Biacore T100の一般的な手順及び試薬
SPR測定を、Biacore T100装置(Biacore GE Healthcare)で、25℃で行った。全てのBiacore実験では、酢酸緩衝液(50mM酢酸 pH5.6、150mM NaCl、0.1%界面活性剤p20)及びHBS−EP+(Biacore GE Healthcare)がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Biacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。組換えマウスFcRnをR&D Systemsから購入した。
組換えFcRnタンパク質を、Sensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、EDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。FcRnタンパク質を、結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
一価親和性試験を、Single Cycle Kinetic(SCK)プロトコルに従って行った。5段階希釈の41.5〜660nMの可溶性分析物(抗体及び二重特異的分子)を(再生なしで)FcRnに添加し、再生の10分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、1:1SCK結合モデルを用いてフィッティングした。
そのCH2−CH3ドメインが2つの抗原結合ドメイン(ここでは2つのscFv)間に配置された抗CD19−F1−抗CD3を評価して、このような二重特異的単量体Fcタンパク質が、FcRnに対する結合性を維持することができ、それにより、従来の二重特異的抗体と比較して改善されたin vivo半減期を有するか否かを決定した。結果は、FcRN結合性が維持されたことを示し、このモデルは、正常なIgGに対して、2:1の比率(各抗体に対して2つのFcRn)ではなく1:1の比率(各単量体Fcに対して1つのFcRn)を示唆している。結果は図5に示されている。
抗CD19x抗NKp46二重特異的単量体Fcドメインポリペプチドの作製
NK細上の活性化受容体が標的細胞の溶解に寄与し得るかは不明であり、抗NKp46抗体がNKp46をブロックし得るため、細胞毒性がNKp46のトリガーによって媒介することができたか否かは不明であった。本発明者らは、二重特異的タンパク質形態が、NKp46のトリガーを引き起こすことができたか否か、さらに標的細胞の非存在下でNKp46アゴニズムを誘導することなく、標的から離れた不適切なNK活性化及び/又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらすことができたかを調べた。
形態1(F1)のドメイン構造が図6Aに示されている。二重特異的Fc含有ポリペプチドを、腫瘍抗原CD19(抗CD19 scFv)に特異的なscFv及びNKp46受容体に特異的なscFvをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−(VH−VK)抗NKp46
F2ポリペプチドのドメイン構造が図6Aに示されている。単量体CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、実施例2−1と同様であり、CH3ドメイン変異(変異(EU付番)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A、及びK409Y)を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(VK-VH)抗CD19−CH2−CH3−VH抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CK。
F3ポリペプチドのドメイン構造が図6Aに示されている。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖上の2つのCH3ドメインが互いに結合し、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止される直列型CH3ドメインを含んでいた。
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−(VH−VK)抗NKp46
F4ポリペプチドのドメイン構造が図6Aに示されている。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F3と同様に直列型CH3ドメインを含むが、さらに、N連結グリコシル化を防止してFcγR結合性を消失させるN297S変異を含んでいた。タンパク質を、実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、1mg/Lの良好な産生収率を示し、単純なSECプロフィール有していた。NKp46−3可変ドメインを有するF4タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号143に示されている。
F8ポリペプチドのドメイン構造が図6Bに示されている。単量体CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、CH3ドメイン変異(変異(EU付番)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A、及びK409Y、並びにN連結グリコシル化を防止してFcγR結合性を消失させるためのN297S変異)を含む形態F2と同様であった。F8タンパク質の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである(野生型、F8Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている(F8B)、及び(c)リンカー配列GGGSSがヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換している(F8C)。変異型F8B及びF8Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH抗CD19−CH1−CH2−CH3−VH抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CH1、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK抗CD19−CK
F9ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びそれぞれCH1−CKの二量体化によって中心鎖に結合された2つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。三量体F9タンパク質のドメイン構造が図6Bに示されており、CH1とCKドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。2つの抗原結合ドメインは、抗体がscFv形態で機能を支持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするF(ab)構造を有する。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F4と同様の直列型CH3ドメイン及びN297S置換を含むCH2ドメインを含んでいた。F9タンパク質の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである(野生型、F9Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている(F9B)、及び(c)リンカー配列GGGSSがヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換している(F9C)。変異型F9B及びF9Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−VH抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CH1、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK抗CD19−CK
F10ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びCH1−CKの二量体化によって中心鎖に結合された第2のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。二量体F10タンパク質のドメイン構造が図6Bに示され、CH1とCKドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。2つの抗原結合ドメインの一方はFab構造を有し、且つ他方はscFvである。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F4と同様の直列型CH3ドメイン及びN297S置換を有するCH2ドメインを含んでいた。加えて、F10タンパク質の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである(野生型、F10Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている(F10B)、及び(c)リンカー配列GGGSSがヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換している(F10C)。変異型F10B及びF10Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。(VK−VH)単位は、VHドメイン、リンカー、及びVK単位(scFv)から構成されていた。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−(VH−VK)抗NKp46、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗CD19−CK。
F11ポリペプチドのドメイン構造が図6Cに示されている。このヘテロ二量体タンパク質は、F10に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。2つの抗原結合ドメインの一方はFab様構造を有し、且つ他方はscFvである。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−VH抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CH1。
二量体F12ポリペプチドのドメイン構造が図6Cに示されており、CH1とCKドメインとの間の結合は、ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質は、F11に類似しているが、F(ab)構造内のCH1とCKドメインが逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−VH抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CK。
三量体F17ポリペプチドのドメイン構造が図6Cに示されており、CHとCKドメインとの間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質は、F9と同様であるが、VH及びVKドメイン、並びにC末端F(ab)構造内のCH1及びCKドメインは、それぞれ、それらのパートナーと逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−VK抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VH抗NKp46−CK、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK抗CD19−CK
二量体Fcドメインを有する二重特異的NKp46抗体形態
二量体Fcドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発し、このタンパク質構築物は、実施例3の単量体Fcドメインタンパク質の利点を共有するが、高い親和性でFcRnに結合し、さらにFcγRに対して低い結合性を有する、又は結合性が消失している。このポリペプチド形態を、(VH−(CH1/CK)−CH2−CH3−)単位又は(VK−(CH1又はCK)−CH2−CH3−)単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験した。次いで、CH3ドメインの一方又は両方は、任意選択により介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン(分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン)、直列型可変ドメイン(例えば、scFv)、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。次いで、2つの鎖が、CH1−CK二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成する、又は第3鎖と結合して三量体を形成する。形態のこのファミリーのメンバーは、ナイーブ抗体又は他の二重特異的構築物と比較して低い配座柔軟性を有し得る。
三量体F5ポリペプチドのドメイン構造が図6Dに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合(鎖上のCH1/CKとCH2ドメイン間に図形で示されている)及びCH1とCKドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH抗CD19−CH1−CH2−CH3−VH抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗CD19−CK−CH2−CH3、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CH1
ヘテロ三量体F6ポリペプチドのドメイン構造が図6Dに示されている。F6タンパク質は、F5と同じであるが、N連結グリコシル化を防止するためのN297S置換を有する。タンパク質を、実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、12mg/Lの高い産生収率を示し、単純なSECプロフィールを有していた。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号172(第2鎖)、173(第1鎖)、及び174(第3鎖)に示されている。
ヘテロ三量体F7ポリペプチドのドメイン構造が図6Dに示されている。F7タンパク質は、F6と同じであるが、中心鎖とVK抗NKp46−CH1鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのC末端でFcドメインに連結されたCH1及びCKドメインにシステインのセリンでの置換を有する。タンパク質を、実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、11mg/Lの高い産生収率を示し、単純なSECプロフィールを有していた。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号175(第2鎖)、176(第1鎖)、及び177(第3鎖)に示されている。
二量体F13ポリペプチドのドメイン構造が図6Dに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合(鎖上のCH1/CKとCH2ドメイン間に示されている)及びCH1とCKドメイン間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH抗CD19−CH1−CH2−CH3−(VH−VK)抗NKp46、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗CD19−CK−CH2−CH3。
二量体F14ポリペプチドのドメイン構造が図6Eに示されている。F14ポリペプチドは、F13形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Fcドメイン(CH2−CH3)の代わりに、F14は、N連結グリコシル化をなくすためにCH2ドメイン変異N297Sを有する。タンパク質を、実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、2.4mg/Lの高い産生収率を示し、単純なSECプロフィールを有していた。2つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号180(第2鎖)及び181(第1鎖)に示されている。
三量体F15ポリペプチドのドメイン構造が図6Eに示されている。F15ポリペプチドは、F6形態の構造を共有するが、中心鎖と第2鎖との間のN末端VH−CH1とVK−CK単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を、実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、0.9mg/Lの良好な産生収率を示し、単純なSECプロフィールを有していた。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号182(第2鎖)、183(第1鎖)、及び184(第3鎖)に示されている。
三量体F16ポリペプチドのドメイン構造が図6Eに示されている。F16ポリペプチドは、F6形態の構造を共有するが、中心鎖と第2鎖との間のC末端VH−CKとVK−CH1単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を、実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号185(第2鎖)、186(第1鎖)、及び187(第3鎖)に示されている。
表面プラズモン共鳴(SPR)による、二重特異的タンパク質によるNKp46結合親和性
Bacore T100の一般的な手順及び試薬
SPR測定を、Biacore T100装置(Biacore GE Healthcare)で、25℃で行った。全てのBiacore実験では、HBS−EP+(Biacore GE Healthcare)及びNaOH 10mMは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Biacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。プロテインAを(GE Healthcare)から購入した。ヒトNKp46組換えタンパク質を、クローニングし、産生し、且つInnate Pharmaで精製した。
プロテインAタンパク質を、Sensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、EDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。プロテインAを、結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
まず、二重特異的タンパク質を、NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、又はNKp46−4の抗体からの異なる抗NKp46可変領域を有する実施例2に記載の形態F1で試験した。次に、抗体を、NKp46−3抗体からの抗NKp46可変領域を有する異なる形態F3、F4、F5、F6、F9、F10、F11、F13、F14として試験し、完全長ヒトIgG1のようなNKp46−3抗体と比較した。
一価親和性試験を、製造者(Biacore GE Healthcare kinetic wizard)が推奨する正規のCapture−Kineticプロトコルに従って行った。62.5〜400nMの範囲のヒトNKp46組換えタンパク質の7段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の10分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、1:1動態結合モデルを用いてフィッティングした。
SPRは、NKp46−1、2、3、及び4 scFv結合ドメインを有する形態F1の二重特異的ポリペプチドは、NKp46に結合したが、他の抗NKp46抗体のscFvを有する他の二重特異的ポリペプチドは、NKp46結合性を維持しなかったことを示した。単量体二重特異的形態で結合性を維持しなかった結合ドメインは、当初はNKp46に結合したが、二重特異的形態への変換時に結合性を失った。形態F1、F2、F3、F4、F5、F6、F9、F10、F11、F13、F14の二重特異的ポリペプチドの全ては、NKp46−3可変領域を用いる場合にNKp46に対する結合性を維持した。
Daudi腫瘍標的に対するNK細胞とFc含有NKp46xCD19二重特異的タンパク質との結合
単量体Fcドメイン及び実施例3に記載の一本鎖F1又は二量体F2形態に従って配置されたドメイン、及びNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、又はNKp46−4をベースとするNKp46結合領域を有する二重特異的抗体を、NK細胞にCD19陽性腫瘍標的細胞(Bリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるDaudi)を溶解させる機能的能力について試験した。F2タンパク質は、scFv形態ではNKp46に対する結合性を失うが、F2のF(ab)様形態では結合性を維持するNKp46−9の可変領域をさらに含んでいた。
KHYG−1 hNKp46 NK実験モデルでは、各二重特異的抗体NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、又はNKp46−9が、陰性対照(ヒトIgG1アイソタイプ対照(IC)及びCD19/CD3二重特異的抗体)と比較して、ヒトKHYG−1 hNKp46 NK細胞株によるDaudi細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、CD19/NKp46架橋によってKHYG−1 hNKp46によるDaudi標的細胞の溶解を誘導することが示された。
完全長抗NKp46 mAbと枯渇抗腫瘍mAbとの比較:NKp46xCD19二重特異的タンパク質が非特異的NK活性化を防止する
これらの試験は、二重特異的抗体が、非特異的NK細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するNKp46媒介NK活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。
(a)完全長単一特異的抗NKp46抗体(ヒトIgG1のようなNKp46−3)、及び
(b)ADCC誘導抗体対照比較(ADCC inducing antibody control comparator)としての完全長ヒトIgG1のような抗CD19抗体。
>NK細胞のみ
>NK細胞対Daudi(C19+)
>NK細胞対HUT78(CD19−)
1.NK細胞のみ
結果は図9Aに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下で、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)はいずれも、CD69又はCD107の発現による評価によるとNK細胞を活性化しなかった。完全長抗CD19もNK細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗NKp46抗体は、NK細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでNK細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
結果は図9Bに示されている。標的抗原発現細胞の存在下で、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の結合ドメインのそれぞれを含む)は全て、NK細胞を活性化した。完全長抗CD19は、最良でも非常に低いNK細胞の活性化のみを示した。完全長抗NKp46抗体もアレムツヅマブも、NK細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図9は、完全長抗NKp46抗体が、NK細胞のみの存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示すことを示す。アレムツヅマブも、NK細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのNK細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度(ET 2.5:1)では、活性化は、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
結果は図9Cに示されている。標的抗原陰性HUT78細胞の存在下で、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)は全て、NK細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗NKp46抗体及びアレムツヅマブは、NK細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでNK細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
低いET比での枯渇抗腫瘍mAb:NKp46xCD19二重特異的タンパク質の効果の比較
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター:標的比で、癌標的細胞に対するNKp46媒介NK細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるET比は、実施例7で使用された2.5:1のET比又は実施例6の10:1のET比よりもin vivoで遭遇するであろう設定に近いと考えられる1:1とした。
(a)完全長単一特異的抗NKp46抗体(ヒトIgG1のようなNKp46−3)、及び
(b)ADCC誘導抗体対照比較としての完全長ヒトIgG1のような抗CD19抗体。
結果は図10に示されている(図10A:CD107及び図10B:CD69)。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)は全て、Daudi細胞の存在下でNK細胞を活性化した。
動作機序の試験
NKp46−3からの抗NKp46可変ドメインを有する実施例3又は4に記載のF2、F3、F5、又はF6形態に従った配置を有するNKp46x抗CD19二重特異的抗体を、CD16−/NKp46+NK細胞株にCD19陽性腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、リツキシマブ(抗CD20 ADCC誘導抗体)、及びヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と比較した。
結果は、図11A(KHYG−1対Daudi)及び図11B(KHYG−1対B221)に示されている。KHYG−1 hNKp46 NK実験モデルでは、各NKp46xCD19二重特異的タンパク質(形態F2、F3、F5、及びF6)は、ヒトKHYG−1 hNKp46 NK細胞株によるDaudi細胞又はB221細胞の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトIgG1アイソタイプ対照(IC)抗体は誘導しなかった。
様々な二重特異的形態のFcRnに対する結合性
様々な抗体形態のヒトFcRNに対する親和性を、実施例2〜6に記載されているように、組換えFcRnタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することによって、表面プラズモン共鳴(SPR)によって試験した。
Fcγに対する結合性
ここでは2つのscFvである2つの抗原結合ドメイン間に配置されたそのCH2−CH3ドメインを有する抗CD19−F1−抗NKp46を、このような二重特異的単量体Fcタンパク質が、Fcγ受容体に対する結合性を維持できるか否かを決定するために評価した。
抗NKp46抗体のエピトープマッピング
A.競合アッセイ
競合アッセイを、以下に記載の方法に従って表面プラズモン共鳴(SPR)によって行った。
SPR測定を、Biacore T100装置(Biacore GE Healthcare)で、25℃で行った。全てのBiacore実験では、HBS−EP+(Biacore GE Healthcare)及びNaOH 10mM NaCl 500mMがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Biacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。抗6xHis標識抗体をQIAGENから購入した。ヒト6xHis標識NKp46組換えタンパク質(NKp46−His)をクローニングし、産生し、且つInnate Pharmaで精製した。
抗His抗体を、Sensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、EDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。プロテインA及び抗His抗体を、結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2000〜2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、又はNKp46−4に一致するNKp46結合領域を有する正常なヒトIgG1キメラ親抗体を、抗6xHis標識抗体チップを用いて行われた競合試験に使用した。
抗NKp46抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、NKp46の2つのドメイン上の分子表面に露出された1つ、2つ、又は3つのアミノ酸置換によって定義されるNKp46変異体を設計した。このアプローチにより、以下の表に示されている、Hek−293T細胞でトランスフェクトされた42の変異体が作製された。以下の表5の標的アミノ酸変異は共に、配列番号1の付番を用いて示されている(Jaron−Mendelson et al.(2012)J.Immunol.88(12):6165−74で使用された付番にも一致している)。
NKp46変異体をPCRによって生成した。増幅された配列をアガロースゲルにかけて、Macherey Nagel PCR Clean−Up Gel Extractionキット(参照番号740609)を用いて精製した。次いで、それぞれの変異体について生成された2つ又は3つの精製PCR産物を、ClonTech InFusionシステムで発現ベクターに連結した。変異配列を含むベクターを、Miniprepで調製し、配列決定した。配列決定後、変異配列を含むベクターを、Promega PureYield(商標)Plasmid Midiprep Systemを用いてMiniprepで調製した。HEK293T細胞をDMEM培地(Invitrogen)で増殖させ、InvitrogenのLipofectamine 2000を用いてベクターでトランスフェクトし、導入遺伝子発現の試験前にCO2インキュベーターで、37℃で24時間インキュベートした。
全ての抗NKp46抗体を、それらのそれぞれの変異体に対する結合性についてフローサイトメトリーによって試験した。1つ又はいくつかの変異体に対する結合性をある濃度(10μg/ml)で失う抗体を決定するために最初の実験を行った。結合性の消失を確認するために、抗体の滴定を、結合性がNKp46変異体(1〜0,1〜0.01〜0.001μg/ml)によって影響を受けると思われる抗体に対して行った。
結果は図12〜図17に示されている。抗体NKp46−1は、(図12B(変異体2)と比較して図12A(NKp46野生型)に示されているように、残基K41、E42、及びE119に変異を有する)変異体2に対して低い結合性を有していた。同様に、NKp46−1はまた、(図13B(変異Supp7)と比較して図13A(NKp46野生型)に示されているように、残基Y121及びY194に変異を有する)追加変異Supp7に対して低い結合性を有していた。
既存の形態と比較して改善された様々な二重特異的形態の産生プロフィール及び産生収率
ブリナツモマブ、並びにF1〜F7形態及びNKp46−3をベースとするNKp46及びCD19結合領域を有する2つの二重特異的抗体、並びにブリナツモマブをそれぞれ同じプロトコルに従って、同じ発現系を用いて形態6(F6)、DART形態、及びBITE形態の下でクローニングし、産生した。F6、DART、及びBITE二重特異的タンパク質を、F6にはprot−Aビーズを用い、DART及びBITEにはNI−NTAビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。精製されたタンパク質をさらに分析し、且つSECによって精製した(図19A)。BITE及びDARTは、F6と比較して非常に低い産生収率を示し、非常に複雑なSECプロフィールを有していた。図19B(矢印)に示されているように、DART及びBITEは、予想SEC画分(BITEでは3及び4、DARTでは4及び5)でのクマーシー染色後のSDS−PAGEによってわずかに検出可能であり、F6形態は、多量体二重特異的タンパク質を含む主ピーク(画分3)を有する、明確で単純なSEC及びSDS−PAGEプロフィールを示した。F6形態の主ピークは、全タンパク質の約30%に一致する。これらの観察は、F1〜F17タンパク質にも当てはまり(データは不図示)、これらの形態中に存在するFcドメイン(又はFc由来ドメイン)が産生を促進し、二重特異的タンパク質の質及び溶解性を改善することを示唆している。
Claims (47)
- 第1の抗原結合ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む単離された多重特異的タンパク質であって、前記第1又は第2の抗原結合ドメインの一方がヒトNKp46ポリペプチドに結合する、Fab又はリンカーによって分離される可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメイン(”scFv”)を含み、且つ他方が目的の抗原に結合し、前記多重特異的タンパク質が一価で前記NKp46ポリペプチドに結合し、前記多重特異的タンパク質が、NKp46発現NK細胞に前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができ、前記タンパク質が、ヒト新生児Fc受容体(FcRn)に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトIgG1抗体と比較して、ヒトFcγ受容体に対して低い結合性を有するヒトFcドメインを少なくとも含み、
ヒトNKp46ポリペプチドに結合する前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号3の重鎖可変領域の重鎖CDR1、2、及び3、並びに配列番号4の軽鎖可変領域の軽鎖CDR1、2、及び3、
(b)配列番号5の重鎖可変領域の重鎖CDR1、2、及び3、並びに配列番号6の軽鎖可変領域の軽鎖CDR1、2、及び3、
(c)配列番号7の重鎖可変領域の重鎖CDR1、2、及び3、並びに配列番号8の軽鎖可変領域の軽鎖CDR1、2、及び3、
(d)配列番号9の重鎖可変領域の重鎖CDR1、2、及び3、並びに配列番号10の軽鎖可変領域の軽鎖CDR1、2、及び3、又は
(f)配列番号13の重鎖可変領域の重鎖CDR1、2、及び3、並びに配列番号14の軽鎖可変領域の軽鎖CDR1、2、及び3
を含み、ここにCDRはKabatにしたがって定められる、
単離された多重特異的タンパク質。 - 前記標的細胞の前記溶解がNKp46シグナル伝達によって媒介される、請求項1に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記多重特異的タンパク質が、前記目的の抗原を発現する細胞の非存在下で、NKp46発現NK細胞と共にインキュベートされたときに前記NK細胞の活性化をもたらさない、請求項1又は2に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記多重特異的タンパク質が、前記目的の抗原を発現する細胞の存在下で、NKp46陰性、CD16陽性リンパ球と共にインキュベートされたときに前記NK細胞の活性化をもたらさない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記多重特異的タンパク質が、(a)NKp46発現NK細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときにNK細胞を活性化し、且つ(b)標的細胞の非存在下でNK細胞と共にインキュベートされたときにNKp46発現NK細胞を活性化しない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記多重特異的タンパク質が、Fcγ発現細胞の存在下で、NK細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときにNKp46発現NK細胞の活性化をもたらさない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記ヒトNKp46ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、ヒト新生児Fc受容体(FcRn)に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトIgG1抗体と比較して、ヒトFcγ受容体に対して低い結合性を有するように改変された、ヒトIgG1アイソタイプのFcドメインを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記Fcドメインが前記2つの抗原結合ドメイン間に配置されている、請求項8に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記多重特異的タンパク質が、
a.残基R101、V102、E104、及び/又はL105に変異を有する変異NKp46ポリペプチド、
b.残基K41、K42、E119、Y121、及び/又はY194のいずれか1つ以上に変異を有する変異NKp46ポリペプチド、及び
c.残基P132、E133、I135、及び/又はS136のいずれか1つ以上に変異を有する変異NKp46ポリペプチド
からなる群から選択される変異NKp46ポリペプチドに対して低い結合性を有し、各場合において、前記結合性の低下が野生型NKp46ポリペプチドと比較される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記タンパク質がヒトFcγ受容体に対する結合性を実質的に欠いている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記多重特異的タンパク質が、(a)NKp46に結合する第1の抗原結合ドメイン、(b)標的細胞で発現されるポリペプチドに結合する第2の抗原結合ドメイン、及び(c)ヒトFcドメインを含む一本鎖タンパク質であり、前記多重特異的ポリペプチドがヒト新生児Fc受容体(FcRn)に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトIgG1抗体と比較して、ヒトFcγ受容体に対して低い結合性を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記Fcドメインが、(i)CH2ドメイン、及び(ii)CH3−CH3二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するCH3ドメインを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記CH3ドメインが、L351位、T366位、L368位、P395位、F405位、T407位、及び/又はK409位(Kabatと同様のEU付番)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つにアミノ酸置換を含む、請求項13に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記Fcドメインが、(i)CH2ドメイン、及び(ii)リンカーペプチドによって分離された第1及び第2のCH3ドメインを含み、前記2つのCH3ドメインが、非共有相互作用によって互いに結合している、請求項1〜14のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、前記第1の抗原結合ドメインと前記第2の抗原結合ドメインとの間に配置されたFcドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、ドメイン配置:(ABD1)−CH2−CH3−(ABD2)を有するポリペプチドを含む、請求項16に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、ドメイン配置:(ABD1)−リンカー−CH2−CH3−リンカー−(ABD2)を有するポリペプチドを含む、請求項16又は17に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、ドメイン配置:(ABD1)−リンカー−CH2−CH3−リンカー−CH3−リンカー−(ABD2)を有するポリペプチドを含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、単離されたヘテロ二量体ポリペプチドであり、前記ヘテロ二量体ポリペプチドが、
(a)N末端からC末端にかけて、第2の可変ドメイン及び第3の可変ドメイン、Fcドメイン、第1の可変ドメイン(V)、並びにCH1又はCK定常領域を含む、第1のポリペプチド鎖、及び
(b)N末端からC末端にかけて、第1の可変ドメイン(V)、及びCH1又はCK定常領域を含む、第2のポリペプチド鎖、ここに、該CH1又はCK定常領域は、前記第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、前記第1のポリペプチド鎖の前記CH1又はCK定常領域に相補的であるように選択される、
を含み、
前記第1のポリペプチド鎖の前記第1の可変ドメインと前記第2のポリペプチドの前記第1の可変ドメインとが、目的の第1の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第2の可変ドメインと第3の可変ドメインとが、目的の第2の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記タンパク質が、単離されたヘテロ二量体ポリペプチドであり、前記ヘテロ二量体ポリペプチドが、
(a)N末端からC末端にかけて、第1の可変ドメイン(V)、CH1又はCK定常領域、Fcドメイン、第2の可変ドメイン、及び第3の可変ドメインを含む、第1のポリペプチド鎖、及び
(b)N末端からC末端にかけて、第1の可変ドメイン(V)、及びCH1又はCK定常領域を含む、第2のポリペプチド鎖、ここに、該CH1又はCK定常領域は、前記第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、前記第1のポリペプチド鎖の前記CH1又はCK定常領域に相補的であるように選択される、
を含み、
前記第1のポリペプチド鎖の前記第1の可変ドメインと前記第2のポリペプチドの前記第1の可変ドメインとが、目的の第1の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第2の可変ドメインと第3の可変ドメインとが、目的の第2の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記タンパク質が、ヘテロ二量体であり、且つ、
(a)Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−Vb−2、及びVa−2−Vb−2−Fcドメイン−Va−1−(CH1又はCK)bから選択されるドメイン配置を有する第1のポリペプチド、及び
(b)ドメイン配置:Vb−1−(CH1又はCK)bを有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
Va−1及びVb−1の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
(CH1又はCK)bが中心鎖上の前記(CH1又はCK)aと二量体化し、且つ前記Vb−1が前記中心鎖のVa−1と共に抗原結合ドメインを形成し、Va−2とVb−2とが共に抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜11、20、又は21のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記タンパク質が、ヘテロ二量体であり、且つ、
(a)ドメイン配置:Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−Vb−2を有する第1のポリペプチド、及び
(b)ドメイン配置:Vb−1−(CH1又はCK)b−Fcドメインを有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
Va−1及びVb−1の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
(CH1又はCK)bが中心鎖上の前記(CH1又はCK)aと二量体化し、且つ前記Vb−1が前記中心鎖のVa−1と共に抗原結合ドメインを形成し、Va−2とVb−2とが共に抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜11又は21のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - Va−2とVb−2とが共に、NKp46に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、単離されたヘテロ三量体ポリペプチドであり、前記ヘテロ三量体ポリペプチドが、
(a)N末端からC末端にかけて、第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)、Fcドメイン、及び第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン(V)を含む、第1のポリペプチド鎖、
(b)第2のポリペプチド鎖であって、N末端からC末端にかけて、前記第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、前記第1のポリペプチド鎖の(前記第2ではなく)前記第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含む、第2のポリペプチド鎖、及び
(c)N末端からC末端にかけて、CH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含み、該CH1又はCK定常領域が、前記第1のポリペプチド鎖の(前記第1ではなく)前記第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域と相補的であるように選択される、第3のポリペプチド鎖
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記タンパク質が、ヘテロ三量体であり、且つ、
(a)ドメイン配置:Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−(CH1又はCK)bを有する第1のポリペプチド鎖、
(b)ドメイン配置:Vb−1−(CH1又はCK)cを有する第2のポリペプチド鎖、及び
(c)ドメイン配置:Vb−2−(CH1又はCK)dを有する第3のポリペプチド鎖
を含み、
Va−1及びVb−1の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
(CH1又はCK)cが中心鎖上の前記(CH1又はCK)aと二量体化し、且つ前記Va−1と前記Vb−1とが抗原結合ドメインを形成し、
(CH1又はCK)dが前記中心鎖上の前記(CH1又はCK)b単位と二量体化し、且つ前記Va−2と前記Vb−2とが抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜11又は25のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記Fcドメインが、(i)CH2ドメイン、及び(ii)CH3−CH3二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するCH3ドメインを含む、請求項25又は26に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記Fcドメインが、(i)CH2ドメイン、及び(ii)リンカーペプチドによって分離された第1及び第2のCH3ドメインを含み、前記2つのCH3ドメインが、非共有相互作用によって互いに結合している、請求項25又は26に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質が、ヘテロ三量体であり、且つ、
(a)ドメイン配置:Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−(CH1又はCK)bを有する第1のポリペプチド鎖、
(b)ドメイン配置:Vb−1−(CH1又はCK)c−Fcドメインを有する第2のポリペプチド鎖、及び
(c)ドメイン配置:Vb−2−(CH1又はCK)dを有する第3のポリペプチド鎖
を含み、
Va−1及びVb−1の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
(CH1又はCK)cが中心鎖上の前記(CH1又はCK)aと二量体化し、且つ前記Va−1と前記Vb−1とが抗原結合ドメインを形成し、
(CH1又はCK)dが前記中心鎖上の前記(CH1又はCK)b単位と二量体化し、且つ前記Va−2と前記Vb−2とが抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜11又は25のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - 前記タンパク質が、異なる親抗体からの2つの軽鎖及び重鎖の対を含む四量体抗体であり、抗体がヘテロ二量体を優先的に形成するように改変CH3ドメイン界面を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 各抗原結合ドメインが、抗体の超可変領域を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記Fcドメインが、ヒトFcγ受容体に対する結合性を低下させるためのアミノ酸置換を含むヒトCH2ドメインを含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 標的細胞で発現される前記ポリペプチドが癌抗原である、請求項1〜34のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- 標的細胞で発現される前記ポリペプチドが、ウイルス又は細菌抗原である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
- NKp46に結合する前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号3の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号4の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(b)配列番号5の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号6の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(c)配列番号7の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号8の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、又は
(d)配列番号9の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号10の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖
を含む、請求項1〜36のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。 - NKp46に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
(a)配列番号3の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号4の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(b)配列番号5の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号6の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(c)配列番号7の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号8の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(d)配列番号9の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号10の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、
(e)配列番号11の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号12の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖、又は
(f)配列番号13の重鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む重鎖、並びに配列番号14の軽鎖可変領域のCDR1、2、及び3を含む軽鎖
を含む、単離されたモノクローナル抗体。 - 前記抗体又は抗原結合ドメインが、ヒトフレームワーク領域からのフレームワーク残基を含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質又はモノクローナル抗体。
- 請求項1〜39のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質又はモノクローナル抗体及び薬学的に許容され得る担体を含む、疾患の処置用の医薬組成物。
- 疾患の処置用の薬剤の製造における、請求項1〜39のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質又はモノクローナル抗体の使用。
- 前記疾患が、癌、感染疾患、又は炎症性若しくは自己免疫疾患である、請求項40又は41に記載の医薬組成物又は使用。
- 請求項40〜42のいずれか一項に記載の医薬組成物又は使用であって、前記医薬組成物又は薬剤が第2の治療薬との併用で投与され、前記第2の治療薬が、抗体であって、該抗体に結合される抗原を発現する細胞に対するADCCを媒介することができる抗体である、医薬組成物又は使用。
- ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、
a)請求項20〜24又は30のいずれか一項に記載の第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を用意するステップ、
b)請求項20〜24又は30のいずれか一項に記載の第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を用意するステップ、及び
c)それぞれ前記第1及び第2の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第1及び第2のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、産生された前記タンパク質を親和性精製支持体にローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。 - ヘテロ三量体タンパク質を産生する方法であって、
(a)請求項25〜29のいずれか一項に記載の第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を用意するステップ、
(b)請求項25〜29のいずれか一項に記載の第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を用意するステップ、
(c)請求項25〜29のいずれか一項に記載の第3のポリペプチド鎖を含む、第3の核酸を用意するステップ、及び
(d)それぞれ前記第1、第2、及び第3の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第1、第2、及び第3のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、産生された前記タンパク質を親和性精製支持体にローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。 - ポリペプチドを特定又は評価する方法であって、
(a)請求項1〜37のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
(b)それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記多重特異的タンパク質を産生し、且つ前記多重特異的タンパク質を回収するステップ、及び
(c)産生された前記多重特異的タンパク質をNKp46発現細胞の活性化について評価するステップ
を含む、方法。 - 前記多重特異的タンパク質を評価するステップが、
(a)(目的の抗原を発現する)標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するNKp46発現エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、前記多重特異的タンパク質が前記エフェクター細胞を活性化する能力を試験するステップ、及び
(b)(目的の抗原を発現する)標的細胞の非存在下で、NKp46発現エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、前記多重特異的タンパク質が前記エフェクター細胞を活性化する能力を試験するステップ
を含む、請求項46に記載の方法。
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