KR20140091765A

KR20140091765A - Ｏｘ-2/ｃｄ200에 대한 항체 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20140091765A
Application number: KR1020147016937A
Authority: KR
Inventors: 캐쓰린 에스. 보우디시; 안케 크레츠-롬멜; 수잔 파스 맥나이트; 제레미 피. 스프링호른; 다양 우
Original assignee: 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Priority date: 2006-01-12
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2014-07-22
Also published as: DK2463305T3; EP2463305B1; PL2463305T3; AU2007207764B2; WO2007084321A2; HUE028179T2; EP2463305A1; JP2009528263A; ES2586825T3; JP2012193215A; KR20080099262A; US8075884B2; JP5911391B2; NZ599035A; TW200804422A; CA2636577A1; SG10201400426XA; PT2463305T; EP1984403A2; JP5404052B2

Abstract

본 출원에서는 CD200 양성 세포를 조절하고 및/또는 격감시키기 위한 방법과 조성물을 제시한다.

Description

ＯＸ-2/ＣＤ200에 대한 항체 및 이들의 용도{ANTIBODIES TO OX-2/CD200 AND USES THEREOF}

관련된 출원

본 출원은 2006년 1월 12일자 제출된 U.S. 가출원 제60/758,426호, 2006년 1월 12일자 제출된 U.S. 가출원 60/759,085 및 2006년 5월 18일자 제출된 60/801,991에 우선권을 주장한다.

본 발명의 기술 분야

본 발명은 OX-2/CD200(이후, CD200) 길항물질 및 암 또는 자가면역 질환으로 고통받는 개체 내에서 CD200을 과다발현하는 세포를 격감시키거나 제거하는 방법에 관계한다. 암 치료를 위한 이러한 치료 방법은 2가지 기전의 조합을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 (1) CD200과 이의 수용체 사이에 상호작용을 간섭하여 면역 억제(immune suppression)를 차단하고 암 세포의 제거를 촉진하며; 및/또는 (2) (a) 항체-의존성 세포독성 또는 보체-매개된 세포독성에 의해, 또는 (b) CD200-표적화 부분을 포함하는 융합 분자를 이용하여 세포를 표적함으로써 암 세포를 직접적으로 사멸시키는 치료제를 이용한 암 치료에 관계한다. 본 발명은 또한, CD200-양성 면역 세포의 항체-의존성 세포독성 및/또는 보체-매개된 세포독성을 증가시키는 치료제로 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관계한다.

다양한 기전이 암을 비롯한 질병 상태(disease state)에 대한 신체 반응에서 일정한 역할을 수행한다. 가령, CD4⁺T 보조 세포는 작동체 세포(effector cell)에 자극 인자를 제공함으로써 다양한 악성 종양에 대한 효과적인 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다. 세포독성 T 세포는 암 세포를 제거하는데 가장 효과적인 세포로서 간주되며, T 보조 세포는 Th1 사이토킨, 예를 들면, IL-2와 IFN-γ를 분비함으로써 세포독성 T 세포를 기폭시킨다. 다양한 악성 종양에서, T 보조 세포는 건강한 개체에서 발견되는 세포에 비하여 변경된 표현형을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 변경된 주요 특징 중의 하나는 감소된 Th1 사이토킨 생산 및 Th2 사이토킨 생산으로의 전환이다(참조: Kiani, et al., Haematologica 88:754-761 (2003); Maggio, et al., Ann Oncol 13 Suppl 1:52-56 (2002); Ito, et al.,; Cancer 85:2359-2367 (1999); Podhorecka, et al., Leak Res 26:657-660 (2002); Tatsumi, et al., J Exp Med 196:619-628 (2002); Agarwal, et al., Immunol Invest 32:17-30 (2003); Smyth, et al., Ann Surg Oncol 10:455-462 (2003); Contasta, et al., Cancer Biother Radiopharm 18:549-557 (2003); Lauerova, et al., Neoplasma 49:159-166 (2002)). Th1 프로필로 사이토킨 전환의 반전은 T 세포의 항-종양 효과를 강화시키는 것으로 입증되었다(참조: Winter, et al., Immunology 108:409-419 (2003); Inagawa, et al., Anticancer Res 18:3957-3964 (1998)).

T 보조 세포의 사이토킨 발현을 Th1에서 Th2로 전환시키는 종양 세포 능력의 기초 기전은 IL-10 또는 TGF-β와 같은 사이토킨의 분비뿐만 아니라 면역계 세포와 상호작용하는 표면 분자의 발현을 포함한다. 면역글로분린 유전자 계통의 분자와 상당한 수준의 상동성을 보유하는 수상돌기 세포의 표면에서 발현되는 분자인 CD200은 면역 억제에 관여한다(Gorczynski et al., Transplantation 65:1 106-1114(1998)). 가령, CD200-발현 세포는 Th1 사이토킨 생산의 자극을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

면역 세포가 암 세포를 공격하고 제거하는데 도움이 될 수 있지만, 자가면역 질환, 알레르기 및 조직이나 장기 이식물의 거부반응과 같은 특정 사례에서, 면역계는 질병의 원인이 될 수 있다. 이들 사례에서 유해한 면역 반응(immune reaction)을 저해하기 위하여, 면역억제제, 예를 들면, 코르티코스테로이드와 사이토킨 길항물질이 환자에 투여될 수 있다. 하지만, 이들 포괄적인 면역억제제는 독성 및 감염에 대한 감소된 저항성을 비롯한 원치 않는 부작용을 유발할 수 있다. 따라서, 자가면역(autoimmunity)을 치료하는 대안적이고 더욱 특이적인 방법이 요구된다.

항체 치료제를 비롯한 여러 면역조절제가 특정한 암과 자가면역 질환의 치료에서 유효한 것으로 증명되었다. 하지만, 암과 자가면역 질환 모두의 치료를 위한 추가적인 항체 치료제에 대한 임상적 요구가 여전히 존재한다. 더 나아가, 인간화 또는 다른 키메라 인간/생쥐 단클론 항체가 요구된다. 널리 공포된 연구에서, 뮤린 항-TNF(종양, 괴사 인자, tumor necrosis factor) 단클론 항체가 투여된 환자는 상기 투여된 항체에 대한 항-뮤린 항체 반응이 나타났다(Exley A. R., et al., Lancet 335: 1275-1277 (1990)). 인간 항-생쥐 항체(HAMA) 반응으로 통칭되는, 치료 섭생(treatment regimen)에 대한 이러한 유형의 면역 반응(Mirick et al. Q J Nucl Med MoI Imaging 2004; 48: 251-7)은 치료의 효능을 감소시키고, 심지어 이러한 치료를 완전히 무효화시킬 수도 있다. 인간화 또는 키메라 인간/생쥐 단클론 항체는 HAMA 반응을 현저하게 감소시키고, 항체 치료제의 치료 효능(therapeutic effectiveness)을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(참조: LoBuglio et al., P.N.A.S. 86:4220-4224 (June 1989)). 더 나아가, 특정 기능성(functionality)이 강화되거나 감소된 항체가 임상에서 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 CD200의 기능을 조절하기 위한 작용제와 방법에 관계한다. CD200의 기능을 조절하는 작용제에는 CD200 및/또는 이의 수용체(CD200R)의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제가 포함된다. 일부 구체예에서, 작용제는 CD200의 기능 또는 활성을 저해한다. 따라서, 특정 측면에서, 상기 작용제는 CD200에 대한 길항물질로서 기능한다. 특정 길항물질은 CD200에 결합하여, CD200과 이의 수용체의 상호작용을 저해하거나 교란한다. 다른 길항물질은 CD200에 결합하지만 CD200:CD200R 상호작용을 차단하지 않을 수도 있다. 따라서, CD200 길항물질에는 CD200:CD200R 상호작용의 차단을 수반하거나 수반하지 않는 기전으로 CD200의 효과를 조절할 수 있는 임의의 작용제가 포함된다. CD200 길항물질에는 폴리펩티드, 소형 분자, 유기금속 화합물, 올리고뉴클레오티드 구조체, RNAi 구조체, 압타머(aptamer), 거울상 압타머(spiegelmer), 안티센스 핵산, 잠금 핵산(LNA) 저해물질, 펩티드 핵산(PNA) 저해물질, 면역조절제, 항체, 항원-결합 단편, 프로드러그 및/또는 펩티드모방 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

특정 구체예에서, 상기 길항물질은 항-CD200 항체이다. 본 명세서에서 항체에는 항원-결합 단편, Fab, Fv, scFv, Fab'와 F(ab')₂, 단클론과 다클론 항체, 조작된 항체(키메라, 단일 사슬, CDR-합체된, 인간화, 완전 인간 항체 및 인공적으로 선택된 항체) 및 합성 또는 반-합성 항체가 포함된다.

특정 측면에서, 본 발명은 키메라, 인간화, 인간과 면역 제거된 항-CD200 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관계한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 7, 9, 11 또는 20에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 여기에는 SEQ ID NO: 7, 9, 11, 또는 20에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편(리더 서열(leader sequence)이 없는 서열에 상응하는 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항체 역시 포함된다. 상기 항체는 SEQ ID NO: 24, 26, 28, 또는 32에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 최소한 90% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 부가적으로 포함할 수도 있다. 유사하게, 상기한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 24, 26, 28, 또는 32에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편(리더 서열(leader sequence)이 없는 서열에 상응하는 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사할 수도 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 24에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 7 또는 24에 열거된 하나이상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 7 또는 24에 열거된 서열에 상응하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 6에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 23에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO: 6 또는 23에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 26에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 9 또는 26에 열거된 하나이상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 9 또는 26에 열거된 서열에 상응하는 서열 역시 포함된다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 8에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 25에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO: 8 또는 25에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 26에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 11 또는 26에 열거된 하나이상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 11 또는 26에 열거된 서열에 상응하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 10에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 25에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO: 10 또는 25에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%s 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다.

추가적인 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 28에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 11 또는 28에 열거된 하나이상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 11 또는 28에 열거된 서열에 상응하는 서열이 포함된다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 10에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 27에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO: 10 또는 27에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 32에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 20 또는 32에 열거된 하나이상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 20 또는 32에 열거된 서열에 상응하는 서열이 포함된다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 31의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 19에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 31에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 이런 이유로, SEQ ID NO: 19 또는 31에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동하거나 유사한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다.

본 발명에 제시된 항-CD200 항체에는 변경된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항체와 항원-결합 단편이 포함된다. 여기에는 증가되거나 감소된 작동체 기능을 나타내는 변형된 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하는 항체가 포함된다. 본 발명은 또한, 가변 영역(variable region)에서 변화로 인하여 발생하는 증가된 또는 감소된 결합 친화성(binding affinity)에 기인한 변경된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항체에 관계한다. 변경된 작동체 기능에는 예로써, 하나이상의 Fc 수용체 (FcR) 또는 작동체 세포에 결합하는 증가된 또는 감소된 능력, 증가된 또는 감소된 항원-의존성 세포독성(ADCC) 및/또는 증가된 또는 감소된 보체-의존성 세포독성(CDC)이 포함된다. 변이성 항체에는 불변 영역 또는 Fc 영역이 하나이상의 아미노산 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하는 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 추가적인 구체예에서, 이들 변이성 항체는 불변 영역을 보유하는데, 여기서 CH1과 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG2로부터 유래되고, CH2와 CH3 영역은 인간 IgG4로부터 유래된다. 여기에는 불변 또는 Fc 영역이 변경된 당화를 나타내는 항체가 포함된다. 상기한 항체와 항원-결합 단편(단일-사슬 항체 포함)은 뮤린, 키메라, 인간화, 완전 인간, 또는 면역 제거된 항체일 수 있다; 여기에는 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgA, IgD, 또는 IgE 골격을 포함하는 항체가 포함된다. 더 나아가, 상기 항체 및 이의 단편과 변이체는 차단성 또는 비-차단성 항체 또는 이의 단편이다.

특정 측면에서, 본 발명에서는 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체를 제시한다. 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항체는 변이성 또는 변형된 Fc 또는 불변 영역, 예를 들면, 하나이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 불변 영역, 또는 당화에서 하나이상의 변화를 포함하는 불변 영역을 보유한다. 변이성 불변 영역에는 예로써, 하나이상의 아미노산이 알라닌으로 치환(가령, 본 명세서에서 기술된 Ala-Ala 돌연변이)된 영역, 또는 하나이상의 탄수화물 기가 변화되거나, 추가되거나, 또는 제거된 영역이 포함된다. 탄수화물 기의 총수 및/또는 위치에서 변형은 번역후 수식(post-translational modification)이 감소되거나, 부재하거나, 또는 증가된 특정 세포 타입 내에서 상기 항체를 생산함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 항-CD200 항체의 작동체 기능은 IgGl 불변 도메인을 IgG2/4 융합 도메인으로 치환함으로써 제거된다. 작동체 기능을 제거하는 다른 방법, 예를 들면, FcR 상호작용에 요구되는 결정적인 부위를 제거하기 위하여 FcR과 상호작용하는 것으로 알려져 있는 부위의 돌연변이 또는 힌지 영역 내에 펩티드의 삽입이 고려될 수 있다.

본 발명의 특정 측면과 방법에서, 변경된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체에는 하나이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 항-CD200 항체가 포함된다. 특정 구체예에서, 이런 변이성 항-CD200 항체는 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없다. 특정 구체예에서, 변이성 불변 영역(상기 변이성 항체에서)은 고유 서열 불변 또는 Fc 영역 및/또는 부모 항체 또는 이의 단편의 불변 또는 Fc 영역과 최소한 70% 상동성을 보유한다; 다른 구체예에서, 변이성 불변 또는 Fc 영역은 이들과 최소한 80% 상동성 또는 유사성을 보유한다; 다른 구체예에서, 변이성 불변 또는 Fc 영역은 이들과 최소한 90% 상동성 또는 유사성 및 추가적인 구체예에서, 이들과 최소한 95% 상동성 또는 유사성을 보유한다. 특정 구체예에서, 변이성 항체는 G2/G4 구조체(construct)를 포함한다. 따라서, 본 발명은 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체의 불변 또는 Fc 영역에 관계하는데, 여기서 상기 불변 영역은 SEQ ID NO: 13, 15, 18 또는 22에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄를 포함한다. 본 발명은 또한, 항-CD200 항체의 변이성 불변 영역에 관계하는데, 여기서 항체는 SEQ ID NO: 13, 15, 18 또는 22에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 최소한 90% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 여기에는 SEQ ID NO: 13, 15, 18 또는 22에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 부가적으로, 일부 구체예에서, 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없고 G2/G4 구조체를 포함하는 항-CD200 항체의 불변 영역은 SEQ ID NO: 12, 14, 16, 17 또는 21, 또는 이의 단편과 보체에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다. 특정 구체예에서, 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체는 SEQ ID NO: 12, 14, 16, 17 또는 21에서 선택되는 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동하거나 유사한 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 변이성 항-CD200 항체는 SEQ ID NO: 12, 14, 16, 17 또는 21에서 선택되는 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%, 98%, 99%, 또는 100% 상동하거나 유사한 서열을 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구체예에서, 변이성 항-CD200 항체를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 12, 14, 16, 17 또는 21에서 선택되는 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 여기에는 항원-결합 단편 및 차단성과 비-차단성 항체 또는 이의 단편이 포함된다.

한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 28에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 13 또는 28에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 하나이상의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 13 또는 28에 열거된 서열에 상응하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 12에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 27에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 이런 이유로, SEQ ID NO: 12 또는 27에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 24에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 15 또는 24에 열거된 하나이상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 15 또는 24에 열거된 서열(가령, 아미노산 20 또는 21에서 시작되는 SEQ ID NO: 15의 단편)에 상응하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 14에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 23에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 이런 이유로, SEQ ID NO: 14 또는 23에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다.

추가적인 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 28에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 13 또는 28에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 하나이상의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 단편에는 리더 서열이 없는 SEQ ID NO: 13 또는 28에 열거된 서열에 상응하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 16에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 27에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 이런 이유로, SEQ ID NO: 16 또는 27에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 30에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 18 또는 30에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 29의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 17에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 29에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 이런 이유로, SEQ ID NO: 17 또는 29에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO. 34에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 22 또는 34에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 21의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 33의 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다. 여기에는 SEQ ID NO: 21에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 33에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 최소한 80% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다. 이런 이유로, SEQ ID NO: 21 또는 33에 열거된 핵산 서열(이의 단편과 보체 포함)에 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD200 항체 역시 포함된다.

변경된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체는 증가된 작동체 기능 역시 나타낼 수 있다. 증가된 작동체 기능에는 하나이상의 Fc 수용체에 증가된 결합, ADCC를 유도하는 증가된 능력 및/또는 CDC를 유도하는 증가된 능력이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 증가된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 변이성 Fc 또는 불변 영역을 보유할 수 있다. 게다가, 변경된 작동체 기능을 나타내는 상기한 항-CD200 항체는 차단성 또는 비-차단성 항체일 수도 있다. 가령, 증가된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체는 CD200에 결합하지만 CD200:CD200R 상호작용을 차단하지 않는다. 이런 항체는 작동체 기능(가령, ADCC 또는 CDC)을 CD200-발현 세포로 표적하는데 유용하다. 앞서 언급된 바와 같이, 변경된 작동체 기능을 나타내는 상기한 항-CD200 항체를 비롯한 본 명세서에 기술된 항체에는 차단성과 비-차단성 형태로 뮤린, 키메라, 인간화, 완전 인간과 면역 제거된 항체 및 이들의 단편이 포함된다.

특정 측면에서, 본 발명에서는 CD200-양성 세포를 조절하거나 격감시키기 위한 방법과 조성물을 제시한다. CD200-양성 세포는 CD200 길항물질을 개체에 투여함으로써 조절되거나 격감된다. 상기 길항물질은 작동체 기능에 대하여 CD200-양성 세포를 표적하고 및/또는 CD200:CD200R 상호작용을 파괴한다. 특정 구체예에서, 상기 길항물질은 항-CD200 항체이다. 상기 항-CD200 항체는 본 명세서에 기술된 항체 및 이들의 단편과 변이체이다. 여기에는 변경된 작동체 기능을 나타내는 항체와 항원-결합 단편, 예를 들면, 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체가 포함된다. 여기에는 뮤린, 키메라, 인간화, 완전 인간과 면역 제거된 항체 및 단일-사슬 항체를 비롯한 항원-결합 단편이 포함된다. 상기한 항체는 비-차단성 또는 차단성 항체이고, 여기에는 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgA, IgD, 또는 IgE 골격을 포함하는 항체가 포함된다.

CD200-양성 세포는 특정 유형의 암과 자가면역 질환에 관여한다. 따라서, CD200-양성 세포에는 면역 세포(가령, B-세포와 T-세포) 및 암 세포(가령, 난소, 피부, 폐, 신장, 유방, 전립선의 암 세포, 신경아세포종, 림프종, 골수종, 백혈병, 갑상선암, 형질 세포암)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 여기에는 신경관 세포로부터 유래된 임의의 조직이나 장기로부터 암 세포 역시 포함된다. 따라서, CD200-양성 세포를 조절하거나 격감시키는 방법이 필요한 개체는 암 또는 자가면역 질환으로 고통받는 환자, 또는 장기 이식 수술을 받았거나 받을 예정인 환자이다.

한 측면에서, 본 발명에서는 자가면역 질환을 치료하기 위한 방법과 조성물을 제시한다. 본 명세서에 제시된 방법과 조성물에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환에는 류머티스 관절염, 염증성 장 질환(궤양성 대장염과 크론병 포함), 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 악성 빈혈, 부신기능부전, I형 당뇨병, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 홍반성 낭창, 중증근무력증, 라이터 증후군, 그레이브스병, 건선 및 자가면역 용혈성 질환(autoimmune hemolytic disease)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환으로 고통받는 환자는 CD200에 대한 길항물질이 투여되고, 특정 구체예에서, 상기 길항물질은 항-CD200 항체이다. 이러한 항-CD200 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 변이성 불변 영역을 보유한다. 따라서, 항-CD200 항체는 변경된 작동체 기능, 예를 들면, 증가된 작동체 기능을 나타낸다. 상기 항체는 예로써, 하나이상의 Fc 수용체에 증가된 결합을 나타낸다. 부가적으로, 상기 항체는 증가된 ADCC 및/또는 CDC를 유도할 수 있다. 게다가, 상기 항체는 차단성 또는 비-차단성 항체 또는 이의 단편이고, 뮤린, 키메라, 인간화, 완전 인간 또는 면역 제거된 항체 또는 이의 단편일 수 있다.

이들 개시된 방법이 이용될 수 있는 암에는 흑색종, 난소암, 신장암, 신경아세포종, 폐암, 유방암, 전립선암, 림프종, 골수종, 백혈병과 형질 세포암이 포함된다. 여기에는 신경관 세포로부터 유래된 암 및 CD200을 발현하는 암 역시 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명에서는 혈액 악성(hematological malignancy), 예를 들면, 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)을 비롯한 백혈병을 치료하는 방법을 제시한다.

특히 유용한 구체예에서, 본 발명에 따른 암 치료는 (1) CD200과 이의 수용체 사이에 상호작용을 간섭하여 면역 억제를 차단하고 암 세포의 제거를 촉진하는 항-CD200 항체 또는 길항물질을 투여하는 단계 및/또는 (2) 암 세포를 직접적으로 사멸시키는 CD-200 표적화 부분을 포함하는 융합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 대안으로, 상기 항체는 보체-매개된 및/또는 항체-의존성 세포독성을 통하여 암 세포를 직접적으로 사멸시킨다. 다양한 구체예에서, 항-CD200 항체의 작동체 기능이 변경된다. 특정 구체예에서, 항-CD200 항체는 작동체 기능이 감소되거나 제거된 변이성 또는 변이성 불변 영역을 보유한다; 이런 항체는 예로써, 상기 (1)과 (2)에서 기술된 방법에 유용하다.

특정 구체예에서, 본 발명은 항-CD200 항체 또는 항원-결합 단편이 두 번째 분자에 결합된 융합 분자에 관계한다. 상기 융합 분자는 예로써, 소형 분자, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 불규칙 펩티드, 화학치료제, 면역조절제, 표적화 모이어티(targeting moiety), 또는 핵산 구조체(가령, 안티센스, RNAi, 또는 유전자-표적화 구조체)를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, CD200에 항원-결합 단편에 관계하는데, 여기서 상기 단편은 폴리펩티드, 단백질 도메인, 혈청 단백질, 알부민, PEG(폴리에틸렌 글리콜), 또는 생체내에서 상기 단편의 반감기를 증가시키는 임의의 다른 분자에 융합되거나 결합된다. 상기 항원-결합 단편에는 예로써, Fab, Fv, 단일-사슬 단편 또는 scFv, Fab'와 F(ab')₂가 포함된다.

본 발명은 또한, 항-CD200 항체를 이용하여 환자로부터 획득된 세포 또는 조직 샘플의 CD200 발현 상태를 결정하는 방법에 관계한다. 이런 방법에는 조직 샘플의 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining) 및 환자로부터 CD200-염색된 세포의 유세포분석법(flow cytometry analysis)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 환자는 예로써, 암 환자이다.

본 명세서에 기술된 방법과 조성물에 따라, 본 발명은 이식 환자 또는 동종이식 환자를 치료하는 방법에 관계한다. 본 발명의 항-CD200 항체 또는 다른 CD200 길항물질은 이식된 장기 또는 조직의 환자 순응도(patient's acceptance)를 감소시킬 수 있는 CD200-양성 면역 세포를 감소 또는 제거하기 위하여 이식 또는 동종이식 절차 이전에, 또는 이러한 절차 이후에 환자에 투여된다. 특정 구체예에서, 증가된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체가 이식 환자에 제공된다.

다른 구체예에서, 항-CD200 치료를 포함하는 복합 치료(combination therapy) 방법이 제시된다. 가령, CD200 길항물질(가령, 본 명세서에 기술된 항-CD200 항체)을 포함하는 첫 번째 치료제를 복용하는 환자에 두 번째 치료제가 제공될 수 있다. CD200 길항물질은 두 번째 치료제와 동시에 제공된다. 대안으로, CD200 길항물질은 두 번째 치료 전후에 제공된다. 두 번째 치료제에는 화학치료제, 방사선 치료, 백신, 항생제와 항-바이러스 작용제 및 면역조절제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에서, 치료적 처리의 진행을 모니터하는 방법이 제시된다. 이러한 방법은 치료제(가령, 면역조절제, 화학치료제 등)를 투여하는 단계 및 개체 내에서 CD200 수준을 최소한 2회 측정하여 이러한 치료제의 효능을 결정하는 단계를 수반한다. 치료제의 효능을 결정하는 다른 방법에는 암 세포의 탐지, 전체 림프구 계산(total lymphocyte count), 비장, 간 및/또는 림프절 크기, 조절 T 세포의 총수, 세포내 또는 혈청 사이토킨 프로필, 또는 ELISPOT - 세포 기초(cell basis)에서 사이토킨 또는 다른 분비된 분자의 탐지가 가능한 검사 시스템(assay system)에 의한 측정에서 T 또는 B 세포에 의한 사이토킨의 분비가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

이들 구체예에서 열거된 조성물과 방법에 따라, 본 발명은 항-CD200 항체를 함유하는 임의의 제약학적 조성물에 관계한다. 여기에는 키메라, 인간화, 인간과 면역 제거된 항-CD200 항체 및 단일-사슬 항체를 비롯한 항원-결합 단편이 포함된다. 여기에는 본 명세서에 기술된 바와 같이 변경된 작동체 기능을 나타내는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간과 면역 제거된 변이성 항-CD200 항체 및 항원-결합 단편 역시 포함된다. 상기한 항체와 변이성 항체는 차단성 또는 비-차단성 항체 또는 항원-결합 단편이다.

특정 구체예에서, 항-CD200 치료가 유용한 환자 또는 CD200 길항물질 치료제(가령, 항-CD200 항체)를 포함하는 치료제를 복용할 예정인 환자는 이전에 받았던 치료와 절차 또는 현재의 의학적 상태에 대하여 조사받는다. 가령, 한 구체예에서, 여성 환자는 임신에 대하여 미리-조사받고 피임(contraception)에 동의하는데, 그 이유는 CD200이 유산(abortion)으로부터 보호에 중요한 역할을 수행하기 때문이다. 따라서, 이러한 치료를 받는 환자는 한 가지이상의 피임 방법을 수행하는데 동의할 수도 있다. 상기 환자는 이러한 치료를 시작하기에 앞서 및/또는 이러한 치료 동안 지정된 기간 동안 한 가지이상의 피임 방법을 이용하는데 동의할 수도 있다. 특정 구체예에서, 여성 환자는 이런 항-CD200 치료에 대한 태아 노출(fetal exposure)과 관련된 위험에 관한 상담(counseling)을 받는다. 추가적인 구체예에서, 이들 환자는 이런 치료에 앞서 서면 동의서(informed consent form)에 서명할 것으로 예상된다. 다른 측면에서, 항-CD200 치료와 관련하여 환자를 상담하는 의사는 항-CD200 치료제를 투여하기에 앞서, 이들 환자들에게 피임 기구 또는 제제를 이용하도록 요구할 수 있다(참조: US6,908,432 및 관련된 특허, 이들의 내용은 순전히 참조로서 본 명세서에 편입된다). 유사하게, 다른 구체예에서, 환자는 이전에, 뇌 수술을 받았거나 뇌에 방사선 치료를 받은 환자를 확인하기 위하여 조사받을 수도 있다; 항-CD200 치료제는 이들 환자에게 처방이 금지된다.

도 1에서는 G2/G4 구조체를 산출하는데 이용되는 프라이머 C7mhHF에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 1)을 도시한다.
도 2에서는 G2/G4 구조체를 산출하는데 이용되는 프라이머 Rev Age Pri에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 2)을 도시한다.
도 3에서는 G2/G4 구조체를 산출하는데 이용되는 프라이머 C2aB7 rev에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 3)을 제시한다.
도 4에서는 G2/G4 구조체를 산출하는데 이용되는 lacpri에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 4)을 도시한다.
도 5에서는 LeadVHpAX에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 5)을 도시한다.
도 6A-F에서는 항체 chC2aB7-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 6, 7, 23, 24, 37, 38)을 도시한다. 도 6C에서는 SEQ ID NO: 37(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 7(아미노산 서열)을 도시한다. 상기 도면에 도시된 SEQ ID NO: 7은 인접하지만, 인트론(intron)을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도시된다. 도 6F에서는 SEQ ID NO: 38(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 24(아미노산 서열)를 도시한다.
도 7A-F에서는 항체 hB7V4V1-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 8, 9, 25, 26, 39, 40)을 도시한다. 도 7C에서는 SEQ ID NO: 39(핵산 서열)와 SEQ ID NO: 9(아미노산 서열)를 도시한다. 도 7F에서는 SEQ ID NO: 40(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 26(아미노산 서열)을 도시한다.
도 8A-F에서는 항체 hB7V3V1-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 10, 11, 25, 26, 40, 41)을 도시한다. 도 8C에서는 SEQ ID NO: 41(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 11(아미노산 서열)을 도시한다. 도 8F에서는 SEQ ID NO: 41(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 26(아미노산 서열)을 도시한다.
도 9A-F에서는 항체 hB7V3V2-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 10, 11, 27, 28, 41, 42)을 도시한다. 도 9C에서는 SEQ ID NO: 41(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 11(아미노산 서열)을 도시한다. 도 9F에서는 SEQ ID NO: 42(핵산 서열)와 SEQ ID NO: 28(아미노산 서열)을 도시한다.
도 10A-F에서는 항체 hB7V3V2-hG2G4의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 12, 13, 27, 28, 42, 43)을 도시한다. 도 10C에서는 SEQ ID NO: 43(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 13(아미노산 서열)을 도시한다. 상기 도면에 도시된 SEQ ID NO: 13은 인접하지만, 인트론을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도시된다. 도 1OF에서는 SEQ ID NO: 42(핵산 서열)와 SEQ ID NO: 28(아미노산 서열)을 도시한다.
도 11A-F에서는 항체 chC2aB7-hG2G4의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 14, 15, 23, 24, 44, 45, 46, 47)을 도시한다. 도 11C에서는 SEQ ID NO: 44(핵산 서열)와 SEQ ID NO: 45(아미노산 서열)를 도시한다. SEQ ID NO: 45는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1-337에 상응한다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, SEQ ID NO: 45는 인접하지만, 인트론을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도시된다. 도 11F에서는 SEQ ID NO: 46(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 47(아미노산 서열)을 도시한다.
도 12A-F에서는 항체 hB7V3V2-cG2G4의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 13, 16, 27, 28, 48, 49)을 도시한다. 도 12C에서는 SEQ ID NO: 48(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 13(아미노산 서열)을 도시한다. 도 12F에서는 SEQ ID NO: 49(핵산 서열)와 SEQ ID NO: 28(아미노산 서열)을 도시한다.
도 13A-D에서는 항체 chC7-hG2G4의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 17, 18, 29, 30)을 도시한다.
도 14A-F에서는 항체 D1B5-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 19, 20, 31, 32, 50, 51)을 도시한다. 도 14C에서는 SEQ ID NO: 50(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 20(아미노산 서열)을 도시한다. 상기 도면에 도시된 SEQ ID NO: 20은 인접하지만, 인트론을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도시된다. 도 14F에서는 SEQ ID NO: 51(핵산 서열)과 SEQ ID NO: 32(아미노산 서열)를 도시한다.
도 15A-D에서는 항체 G2G4 63L1D의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 21, 22, 33, 34)을 도시한다.
도 16에서는 CD200 cDNA를 클로닝하기 위한 전방 프라이머에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 35)을 도시한다.
도 17에서는 CD200 cDNA를 클로닝하기 위한 후방 프라이머에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO: 36)을 도시한다.
도 18에서는 RAJI_CD200/PBL 모형에서, 인간화 항-CD200 항체를 투여하는 효과를 도시한다. 인간화 항-CD200 항체는 종양 성장의 저해를 결과하였다.
도 19에서는 Namalwa_CD200 동물 모형에서, 작동체 기능을 나타내거나 나타내지 않는 인간화 CD200 항체를 투여하는 효과를 도시한다. 작동체 기능을 나타내지 않은 항체는 종양 성장을 저해하는데 효능을 보였다.
도 20은 정상 샘플과 비교하여, 만성 림프성 백혈병(CLL) 환자 샘플에서 CD200의 발현 수준을 도시하는 표이다.
도 21에서는 암 세포주에서 탐지된 CD200 발현의 상대적인 수준을 도시한다.
도 22에서는 인간 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocytes, PBL)에서 탐지된 발현 수준과 비교하여, 인간 난소암 샘플에서 CD200 항원의 발현 수준을 도시한다.
도 23에서는 PBL에서 탐지된 발현 수준과 비교하여, 인간 흑색종 환자 샘플에서 CD200 항원의 발현 수준을 도시한다.
도 24에서는 흑색종 환자 샘플의 CD200의 면역조직화학적 염색을 도시한다.
도 25에서는 사이토킨 생산에서 항-CD200 항체의 효과를 도시한다. 혼성 세포 개체군 분석에서 IL-2 생산의 수준은 CD200 항체의 존재와 부재에서 측정하였다. 이용된 항체는 작동체 기능이 없는 키메라 항-CD200 항체이다.
도 26에서는 종양이 CD200을 발현하지 않는 Namalwa/PBL 모형에서, 작동체 기능을 나타내거나 나타내지 않는 항-CD200 항체를 투여하는 효과를 도시한다.
도 27에서는 활성화된 T-세포에서 CD200 발현의 유세포분석을 도시한다. CD3+ 세포는 mOKT3으로 활성화되고, 회수되고, 세척되고, 인간 CD25, CD200, CD5, CD4와 CD8에 특이적인 지정된 공액된 항체로 염색되었다. 세포는 세척되고, CellQuest 소프트웨어를 이용하여 FacsCaliber 유세포분석기(flow cytometer) 상에서 면역형광(immunofluorescence)이 분석되었다.
도 28에서는 활성화된 T-세포의 ADCC에 대한 항-CD200 항체의 효과를 도시한다. CD3+ 인간 T 세포는 72 시간동안, 10 ㎍/㎖ 고정된(평판-코팅된) mOKT3으로 자극되었다. 이후, 활성화된 T 세포는 표적으로서 이용을 위하여 크롬산염 처리되고, 작동체 세포로서 정제된 자가조직 CD56+(NK) 세포와 함께 배양되었다. 세포는 작동체 기능을 매개할 수 있는 인간화 항-CD200 항체(V3V2-G1), 또는 작동체 기능이 부재하도록 조작된 인간화 항-CD200 항체(V3V2-G2G4)의 존재 또는 부재에서, 25:1(A) 또는 10:1(B) 작동체 : 표적 세포 비율로 37℃에서 4 시간동안 공동 배양되었다. 데이터는 특이적인 용해 비율(percent specific lysis)로서 표시된다. 항-CD200 항체는 활성화된 T-세포의 ADCC를 증가시키는 반면, 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체는 ADCC를 유도하지 않았다.
도 29는 형질 세포에 대한 CD200의 발현 수준을 도시하는 표이다.

I. CD200 길항물질

CD200은 면역계 세포(가령, T-세포, B-세포와 수상돌기 세포(Barclay et al., TRENDS Immunol. 2002: 23)) 및 본 명세서에 기술된 특정 암 세포를 비롯한 다양한 세포 타입에서 발현되는 고도로 보존된 I형 막통과 당단백질이다. 상기 단백질은 골수 세포 및 T 세포의 계군(sub-population) 상에서 수용체 CD200R과 상호작용한다(Wright et al. J. Immunol. 2003 (171): 3034-3046 및 Wright et al., Immunity 2000 (13):233-242); CD200:CD200R 상호작용은 세포에 면역조절 신호를 전달하고 아폽토시스-연관된 면역 관용(apoptosis-associated immune tolerance)을 비롯한 면역억제(immunosuppression)를 유도한다(Rosenblum et al. 2004 Blood (103): 2691-2698). 따라서, CD200 및/또는 이의 수용체의 기능 또는 활성을 간섭하는 작용제는 CD200:CD200R 상호작용의 면역억제 효과를 저해하거나 반전시킬 수 있다. 이에 더하여, CD200에 특이적으로 결합하는(하지만, CD200:CD200R 상호작용을 저해하거나 저해하지 않는) 작용제는 CD200의 효과를 반전시키거나 소멸시키는 하류 현상(downstream event)을 유인할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 CD200 길항물질에 관계한다. 본 명세서에서, 길항물질은 CD200 또는 이의 수용체의 활성, 기능 및/또는 발현을 저해할 수 있는 임의의 작용제를 포괄한다. 실례에는 폴리펩티드, 항체, 소형 분자, 압타머, 거울상 압타머, 잠금 핵산(LNA) 저해물질, 펩티드 핵산(PNA) 저해물질, 핵산 구조체(가령, 유전자-표적화 구조체, 안티센스 구조체, RNA 간섭(RNAi) 구조체 등) 및 펩티드모방체가 포함된다. 특정 구체예에서, 이들 길항물질은 CD200과 CD200R의 상호작용을 파괴한다. 다른 구체예에서, 이들 CD200 길항물질은 CD200의 면역억제 효과를 감소시키거나, 또는 격감 또는 제거를 위하여 CD200-발현 세포를 표적할 수 있다.

특정 측면에서, 이들 CD200 길항물질은 폴리펩티드이다. 본 발명에 이용되는 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 상이한 기술을 이용하여 구성될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 화학적 합성으로 획득된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 하나이상의 항체의 단편 또는 복수 단편으로부터 구성된 항체이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 항-CD200 항체이다.

따라서, 특정 구체예에서, 이들 CD200 길항물질은 항-CD200 항체이다. 본 명세서에서, "항체"는 CD200 또는 CD200R에 결합할 수 있는 완전 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 여기에는 Fab, Fv, scFv, Fab'와 F(ab')₂, 단클론과 다클론 항체, 조작된 항체(키메라 항체, 단일 사슬 항체, CDR-합체된 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체, 인공적으로 선택된 항체 포함), 파지 전시 또는 대체 기술을 이용하여 생산된 합성이나 반-합성 항체 등이 포함된다. 여기에는 하나이상의 작동체 세포에 결합하는 증가된 또는 감소된 능력을 나타내는 변이성 또는 변형된 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하도록 하는 방식으로 가공되거나 생산된 항체 역시 포함된다; 이들 변이성 항체에는 불변 영역 또는 Fc 영역이 변경된 당화 패턴을 보유하는 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 소형 단편, 예를 들면, Fv와 scFv는 작은 크기 및 이에 따른 우수한 조직 분산으로 인하여 진단과 치료 용도에 유리한 특성을 보유한다. 조작된 또는 변이성 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하는 항체는 작동체 기능, 예를 들면, ADCC와 CDC를 조절하는데 유용할 수 있다. 조작된 또는 변이성 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하는 이들 항체는 예로써, CD200이 정상 조직에서 발현되는 사례에서 유용하다; 이들 사례에서 작동체 기능이 없는 변이성 항-CD200 항체는 정상 조직을 손상시키지 않으면서 바람직한 치료 반응을 유도한다. 더 나아가, 항체, 변이성 항체 및 이의 단편은 차단성(즉, 상기 항체 또는 단편은 CD200과 CD200R의 상호작용을 저해한다) 또는 비-차단성(즉, 상기 항체 또는 단편은 CD200에 결합하지만 CD200R과의 상호작용을 차단하지 않는다).

본 발명은 또한, 본 명세서에 제시된 중쇄와 경쇄, 또는 본 명세서에 제시된 중쇄 및/또는 경쇄에 상동하거나 유사한 중쇄와 경쇄를 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 또는 2개의 핵산 분자 사이에 서열 유사성을 지칭한다. 상동성과 동일성은 각각, 비교의 목적으로 정렬되는 각 서열에서 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서 동등한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다; 비교된 서열에서 동등한 위치가 동일하거나 유사한 아미노산 잔기(가령, 입체적 및/또는 전자적 특성에서 유사한)에 의해 점유되면, 이들 분자는 상기 위치에서 상동한(유사한) 것으로 지칭될 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 비율로서 표시는 비교된 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산의 총수의 함수를 지칭한다. "상동성"은 유사한 기능 또는 모티프(motif)를 보유하는 유전자 또는 단백질을 확인하는데 이용되는, 서열 유사성의 수학적으로 기초된 비교를 설명한다. 본 명세서에서, "동일성"은 서열 정합(sequence matching)이 극대화되도록 서열을 정렬할 때, 다시 말하면, 갭(gap)과 삽입을 고려하여 2개 이상의 서열 내에 상응하는 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. 따라서, 동일성을 결정하는 방법은 조사된 서열 사이에 최대 정합(largest match)을 제공하도록 설계된다(참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 1988, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) 및 Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)), BLAST X (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. MoI. Biol. 215: 403-410 (1990). "무관한" 또는 "비-상동한" 서열은 본 발명의 서열과 40% 이하, 바람직하게는, 25% 이하의 동일성을 공유한다. 두 서열을 비교할 때, 잔기(아미노산 또는 핵산)의 부재 또는 추가 잔기의 존재 역시 동일성 및 상동성/유사성을 감소시킨다.

따라서, 본 발명은 리더 서열이 없는 본 명세서에 기술된 항체에 관계한다. 따라서, 본 발명의 항체는 리더 서열이 부재하거나 다른 리더 서열로 치환된 중쇄와 경쇄(본 명세서에 기술된 바와 같음)를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하기 위하여 숙주 세포가 이용되면, 이용된 특정 숙주 세포에 따라 적절한 리더 서열이 선택될 수 있다.

항체는 당분야에 널리 공지된 방법으로 생산될 수 있다. 가령, 단클론 항-CD200 항체는 면역원(immunogen)으로서 CD200 양성 세포, CD200 폴리펩티드, 또는 CD200 폴리펩티드의 단편을 이용하여 동물 내에서 면역 반응을 발생시킴으로써 산출되는데, 이들 동물로부터 항체-생산 세포 및 결과로써, 단클론 항체가 분리된다. 이런 항체의 서열은 결정되고, 상기 항체 또는 이의 변이체는 재조합 기술에 의해 생산된다. 재조합 기술은 상기 단클론 항체의 서열에 기초한 키메라 항체, CDR-합체된 항체, 인간화 항체와 완전 인간 항체 및 CD200에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 생산하는데 이용될 수 있다.

게다가, 재조합 라이브러리("파지 항체")로부터 유래된 항체는 표적 특이성(target specificity)에 기초하여 항체 또는 폴리펩티드를 분리하는 미끼(bait)로서, CD200-양성 세포, 또는 이로부터 유래된 폴리펩티드를 이용하여 선택될 수도 있다. 비-인간과 키메라 항-CD200 항체의 생산과 분리는 당업자의 이해 범위에 속한다.

비-인간 세포에서 생산된 항체를 개선하기 위하여 재조합 DNA 기술이 이용된다. 따라서, 키메라 항체는 진단 또는 치료 적용에서 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위하여 구성될 수 있다. 게다가, 면역원성은 CDR 합체(grafting) 및 임의적으로, 골격 변형(framework modification)으로 항체를 인간화함으로써 최소화될 수도 있다(참조: U.S. Patent No. 5,225,539).

항체는 동물 혈청으로부터 획득되거나, 또는 단클론 항체 또는 이의 단편의 경우에, 세포 배양액 내에서 생산될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 세균 배양액, 또는 포유동물 세포 배양액 내에서 절차를 비롯한 확립된 절차에 따라 항체를 생산할 수 있다. 적절하게는, 선택된 세포 배양 시스템은 항체 산물을 분비한다.

다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항체의 생산 과정은 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주, 예를 들면, 대장균(E. coli) 또는 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 벡터는 적절한 해독 틀 내에서, 항체 단백질을 인코딩하는 두 번째 DNA 서열에 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 첫 번째 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유하는 하나이상의 발현 카세트를 포함한다. 이후, 항체 단백질은 회수되고 분리된다. 임의적으로, 발현 카세트는 적절한 해독 틀 내에서 신호 펩티드에 각각 작동가능하게 개별적으로 연결된 항체 단백질을 인코딩하는 폴리시스트론, 가령 이중시스트론 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유한다.

시험관내에서 하이브리도마 세포 또는 포유동물 세포의 증폭은 적절한 배양 배지에서 수행되는데, 상기 배지에는 포유동물 혈청(가령, 소 태아 혈청), 또는 미량 원소와 성장 지속 보충물질(가령, 정상 생쥐 복막 삼출액 세포, 비장 세포, 골수 대식세포, 2-아미노에탄올, 인슐린, 트랜스페린, 저밀도 지단백, 올레산 등과 같은 영양 세포)에 의해 임의적으로 보충된 통상적인 표준 배양 배지(가령, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 또는 RPMI 1640 배지)이다. 박테리아 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포의 증폭은 당분야에 공지된 적절한 배양 배지에서 유사하게 수행된다. 가령, 세균에 적합한 배양 배지는 LE, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 x YT, 또는 M9 최소 배지이다. 효모에 적합한 배양 배지는 YPD, YEPD, 최소 배지, 또는 완전 최소 탈락 배지(Complete Minimal Dropout Medium)이다.

시험관내 생산은 상대적으로 순수한 항체 제조물을 제공하고, 원하는 항체를 다량으로 제공하는 규모 확대(scale-up)가 가능하다. 세균 세포, 효모, 식물, 또는 포유동물 세포의 배양 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 균질성 현탁액 배양(가령, 공기리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기에서), 영속화되거나 포획된 세포 배양(가령, 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트라이지에서) 등이 포함된다.

다량의 원하는 항체는 생체내에서 포유동물 세포를 증폭함으로써 획득될 수 있다. 이를 위하여, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 항체-생산 종양의 성장을 유도하기 위하여 조직적합성 포유동물에 주입된다. 임의적으로, 동물은 주입에 앞서, 탄화수소, 바람직하게는, 프리스탄(pristane)(테트라메틸-펜타데칸)과 같은 미네랄 오일로 기폭된다. 1주 내지 3주후, 항체는 이들 포유동물의 체액으로부터 분리된다. 가령, 적절한 골수종 세포와 Balb/c 생쥐로부터 유래된 항체-생산 비장 세포의 융합으로 수득되는 하이브리도마 세포, 또는 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 Sp2/0으로부터 유래된 형질감염된 세포는 임의적으로 프리스탄으로 미리-처리된 Balb/c 생쥐에 복강내 주입된다. 1주 내지 2주후, 이들 동물로부터 복수를 채취한다.

상기한 기술은 예로써, Kohler and Milstein,(1975) Nature 256:495-497; U.S. Patent No. 4,376, 110; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual,(1988) Cold Spring Harbor에서 기술된다. 재조합 항체 분자의 제조 기술은 상기한 참고 문헌 및 예로써, W097/08320; U.S. Patent No. 5,427,908; U.S. Patent No. 5,508,717; Smith, 1985, Science, Vol.225, pp 1315-1317; Parmley and Smith 1988, Gene 73, pp 305-318; De La Cruz et al, 1988, Journal of Biological Chemistry, 263 pp 4318-4322; U.S. Patent No. 5,403,484; U.S. Patent No. 5223409; W088/06630; WO92/15679; U.S. Patent No. 5780279; U.S. Patent No. 5571698; U.S. Patent No. 6040136; Davis et al., Cancer Metastasis Rev.,1999;18(4):421-5; Taylor, et al., Nucleic Acids Research 20(1992): 6287-6295; Tomizuka et al.,Proc. Nat. Academy of Sciences USA 97(2)(2000): 722-727에서 기술한다. 이들 참고문헌은 순전히 참조로서 편입된다.

세포 배양 상층액은 CD200-양성 세포의 면역형광 염색, 면역블랏팅, 효소 면역법, 예를 들면, 샌드위치 검사 또는 다트-검사, 또는 방사선면역법으로 원하는 항체를 선별한다.

항체의 분리를 위하여, 배양 상층액 또는 복수 내에서 면역글로불린은 예로써, 황산암모늄을 이용한 침전, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 흡습성 물질에 대한 투석, 선별 막을 통한 여과 등으로 농축될 수 있다. 필요한 경우, 항체는 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스에서 크로마토그래피 및/또는 (면역-)친화성 크로마토그래피, 가령, CD200-양성 세포주로부터 유래된 한가지이상의 표면 폴리펩티드, 또는 단백질-A 또는 -G 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제된다.

다른 구체예에서, 적절한 포유동물 내에서 CD200에 대항하는 항체를 분비하는 세균 세포주의 제조 공정을 제시한다. 가령, 토끼는 CD200-양성 조직이나 세포, 또는 CD200 폴리펩티드 또는 이의 단편으로부터 집합된 환자 샘플로 면역된다. 면역된 토끼로부터 생산된 파지 전시 라이브러리는 당분야에 공지된 방법(가령, 다양한 참고문헌에 개시된 방법)에 따라 원하는 항체가 작제되고 패닝된다.

단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포 역시 제시된다. 바람직한 하이브리도마 세포는 유전적으로 안정하고, 원하는 특이성의 본 명세서에 기술된 단클론 항체를 분비하며, 해동과 재클로닝(recloning)에 의해 심온-동결(deep-frozen) 배양액으로부터 활성화될 수 있다.

다른 구체예에서, CD200에 대항하는 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주의 제조 공정을 제시한다. 상기 공정에서, 적절한 포유동물, 예를 들면, Balb/c 생쥐는 CD200의 하나이상의 폴리펩티드 또는 항원성 단편, 또는 CD200-양성 세포, CD200-양성 세포 자체, 또는 본원에 기술된 정제된 폴리펩티드를 보유하는 항원성 담체로 면역된다. 면역된 포유동물의 항체-생산 세포는 배양액 내에서 짧게 성장되거나, 또는 적절한 골수종 세포주의 세포와 융합된다. 이런 융합에서 수득된 하이브리드 세포는 클론되고, 원하는 항체를 분비하는 세포 클론은 선별된다. 가령, CD200-양성 만성 림프구 백혈병(CLL) 세포주로 면역된 Balb/c 생쥐의 비장 세포는 골수종 세포주 PAI 또는 골수종 세포주 Sp2/0-Ag 14의 세포와 융합된다. 수득된 하이브리드 세포는 원하는 항체의 분비를 선별되고, 양성 하이브리도마 세포는 클론된다.

수개월, 예를 들면, 2 내지 4개월 동안 수회, 예를 들면, 4 내지 6회, CD200-양성 세포주의 10⁶ 내지 10⁷개 세포를 피하 및/또는 복강내 주입함으로써 Balb/c 생쥐를 면역시키는 것으로 특성화되는, 하이브리도마 세포주의 제조 공정이 바람직하다. 면역된 생쥐로부터 비장 세포는 최종 주입이후 2 내지 4일 시점에 채취되고, 융합 프로모터, 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 골수종 세포주 PAI의 세포와 융합된다. 적절하게는, 골수종 세포는 대략 4000 분자량의 대략 30% 내지 50% 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 용액 내에서, 면역된 생쥐로부터 유래된 3- 내지 20-배 과량의 비장 세포와 융합된다. 융합이후, 세포는 앞서 기술된 바와 같이 적절한 배양 배지에서 확대되고, 통상의 골수종 세포가 원하는 하이브리도마 세포보다 커지지 않도록 규칙적인 간격으로 선별 배지, 예를 들면, HAT 배지로 보충된다.

상기 항체와 이들의 단편은 "키메라(chimeric)"일 수 있다. 키메라 항체 및 이의 항원-결합 단편은 2개 이상의 상이한 종(가령, 생쥐와 인간)으로부터 부분을 포함한다. 키메라 항체는 인간 불변 도메인 유전자 분절 내로 특이성의 생쥐 가변 영역을 절단접합함으로써 생산될 수 있다(참조: U.S. patent No. 4,816,567). 이러한 방식으로, 비-인간 항체는 인간 임상 적용에 더욱 적합하게 변형될 수 있다.

본 발명의 단클론 항체에는 비-인간(즉, 생쥐) 항체의 "인간화"형태가 포함된다. 인간화 또는 CDR-합체된 mAb는 인간에 대한 치료제로서 특히 유용한데, 그 이유는 이들이 생쥐 항체처럼 순환계로부터 급속하게 제거되지 않고 전형적으로, 유해한 면역 반응을 유발하지 않기 때문이다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 하나이상의 아미노산 잔기가 내부로 도입된다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종, "수입(import)" 잔기로 지칭되는데, 이들은 전형적으로, "수입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 인간화 항체를 제조하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 가령, 인간화는 본질적으로, Winter 등(Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verheoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))의 방법에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 또한, Staelens et al. 2006 MoI Immunol 43: 1243-1257을 참조한다. 특정 구체예에서, 비-인간(가령, 생쥐) 항체의 인간화 형태는 수용자 항체의 초가변(CDR) 영역 잔기가 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼, 또는 원하는 특이성(specificity), 친화성(affinity)과 결합 능력(binding capacity)을 갖는 비-인간 영장류로부터 초가변 영역 잔기로 치환된 인간 항체(수용자 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 골격 영역 잔기 역시 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다(일명, "역 돌연변이(back mutation)"). 이에 더하여, 항체 서열 내에서 선택된 위치에서 아미노산을 변화시키기 위하여 파지 전시 라이브러리(phage display library)가 이용될 수 있다. 인간화 항체의 특성 역시 인간 골격의 선택에 의해 영향을 받는다. 더 나아가, 인간화 항체와 키메라 항체는 항체 특성, 예를 들면, 친화성 또는 작동체 기능을 더욱 개선하기 위하여, 수용자 항체 또는 공여자 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다.

완전 인간 항체 역시 본 발명에서 제시된다. "인간 항체"에는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변과 불변 영역(존재하면)을 보유하는 항체가 포함된다. 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(가령, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, "인간 항체"에는 다른 포유동물 종, 예를 들면 생쥐의 생식세포주로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 융합된 항체(즉, 인간화 항체)가 포함되지 않는다. 완전 인간 또는 인간 항체는 인간 항체 유전자를 보유하는(가변(V), 다양성(D), 접합(J)과 불변(C) 엑손을 보유하는) 유전자도입(transgenic) 생쥐로부터, 또는 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 가령, 면역화이후, 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 완전 레퍼토리(repertoire)의 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자도입 동물(가령, 생쥐)을 생산하는 것이 현재 가능하다(참조: Jakobovits et al., PNAS, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). 유전자도입 생쥐 계통은 정렬되지 않은 인간 면역글로불린 유전자로부터 유전자 서열을 보유하도록 조작될 수 있다. 이들 인간 서열은 인간 항체의 중쇄와 경쇄 모두를 코딩하고, 생쥐 내에서 정확하게 기능하여 인간에서와 유사한 광범위한 항체 레퍼토리를 제공하는 재정렬(rearrangement)을 진행한다. 유전자도입 생쥐는 다양한 정렬의 특이적인 항체와 이들의 인코딩 RNA를 산출하기 위하여 표적 단백질(가령, CD200, 이의 단편, 또는 세포 발현 CD200)로 면역될 수 있다. 이후, 이런 항체의 항체 사슬 성분을 인코딩하는 핵산이 상기 동물로부터 전시 벡터(display vector) 내로 클론될 수 있다. 전형적으로, 중쇄와 경쇄 서열을 인코딩하는 핵산의 독립된 개체군이 클론되고, 이들 독립된 개체군은 이후, 벡터 내로 삽입으로 재조합되고, 따라서, 상기 벡터의 임의의 정해진 사본은 중쇄와 경쇄의 무작위 조합을 수용한다. 벡터는 항체 사슬이 상기 벡터를 보유하는 전시 패키지(display package)의 외부 표면 상에서 조합되고 전시될 수 있도록 상기 항체 사슬을 발현하도록 설계된다. 가령, 항체 사슬은 파지의 외부 표면으로부터 파지 외피 단백질(phage coat protein)과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이후, 전시 패키지는 표적에 대한 항체 결합의 전시가 조사될 수 있다.

이에 더하여, 인간 항체는 파지-전시 라이브러리로부터 유래될 수 있다(Hoogenboom et al., J. MoL Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. MoI. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)). 합성 인간 항체 V-영역의 무작위 조합을 이용하는 합성 파지 라이브러리가 산출될 수 있다. 항원 상에서 선별에 의해, V-영역이 성격상 상응하는 인간 영역과 매우 유사한 완전 인간 항체가 만들어질 수 있다(참조: 특허 US 6,794,132, 6,680,209, 4,634,666 및 Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367).

인간 항체의 산출을 위하여, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) 및 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) 역시 참조하는데, 이들은 순전히 참조로서 편입된다. 인간 항체는 U.S. 특허 5,939,598과 6,673,986에서 더욱 구체적으로 논의되고 기술된다. 또한, 1995년 6월 5일자 제출된 U.S. 특허 6,114,598, 6,075,181과 6,162,963을 참조한다. 또한, 1996년 10월 2일자 제출된 U.S. 특허 6,150,584 및 US 특허 6,713,610과 6,657,103, 그리고 U.S. 특허 출원 10/421,011(US 2003-0229905 A1), 10/455,013 (US 2004-0010810 A1), 10/627,250 (US 2004-0093622 A1), 10/656,623 (US 2006-0040363 A1), 10/658,521 (US 2005-0054055 A1), 10/917,703 (US 2005-0076395 A1)과 10/978,297 (US 2005-0287630 A1)을 참조한다. 또한, 1993년 7월 23일자 제출된 PCT/US93/06926, 1996년 6월 12일자 특허 공개된 유럽 특허 No., EP 0 463 151 B1, 1994년 2월 3일자 공개된 국제 특허 출원 No., WO 94/02602, 1996년 10월 31일자 공개된 국제 특허 출원 No., WO 96/34096 및 1998년 6월 11일자 공개된 WO 98/24893을 참조한다. 앞서 언급된 특허, 출원 및 참고문헌은 순전힌 참조로서 편입된다.

대안적 접근법에서, GenPharm International, Inc. 등은 "소형좌위(minilocus)"접근법을 이용하였다. 소형좌위 접근법에서, 외인성 Ig 좌위는 상기 Ig 좌위로부터 조각(개별 유전자)의 통합을 통하여 모방된다. 따라서, 하나이상의 V_H 유전자, 하나이상의 D_H 유전자, 하나이상의 J_H 유전자, mu 불변 영역 및 두 번째 불변 영역(바람직하게는, 감마 불변 영역)이 동물 내로 삽입을 위한 구조체 내에 형성된다. 이러한 접근법은 U.S. Pat. No. 5,545,807 (Surani et al.); U.S. Pat. No. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650과 5,814,318 (각각, Lonberg and Kay); U.S. Pat. No. 5,591,669 (Krimpenfort and Bems); U.S. Pat. No. 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 (Berns et al.); U.S. Pat. No. 5,643,763 (Choi and Dunn); GenPharm International을 참조한다. 또한, U.S. 특허 5,569,825, 5,877,397, 6,300,129, 5,874,299, 6,255,458과 7,041,871을 참조하는데, 이들은 순전히 참조로서 편입된다. 또한, 유럽 특허 No. 0 546 073 B1 및 국제 특허 출원 No. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852와 WO 98/24884를 참조하는데, 이들은 순전히 참조로서 편입된다. 또한, Taylor et al. (1992 Nuc. Acids. Res., 20:6287), Chen et al. (1993 Int. Immunol. 5: 647), Tuaillon et al. (1993 PNAS U S A. 90: 3720-4), Choi et al., (1993 Nature Genetics 4: 117), Lonberg et al. (1994 Nature 368: 856-859), Taylor et al. (1994 International Immunology 6: 579-591), Tuaillon etal. (1995 J Immunol. 154: 6453-65), Fishwild et al. (1996 Nature Biotechnology 14: 845), Tuaillon et al. (2000 Eur J Immunol. 10: 2998-3005)를 참조하는데, 이들은 순전히 참조로서 편입된다.

특정 구체예에서, 면역 제거된 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제시된다. 면역 제거된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 일정한 종에 대하여 면역성이 없거나 감소된 면역성을 나타내도록 변형될 수 있다. 면역 제거(de-immunization)는 당업자에게 공지된 다양한 기술을 이용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 변형함으로써 달성될 수 있다(참조: PCT 출원 No. WO 04/108158과 WO 00/34317). 가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 내에서 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 확인하고, 예로써, 재조합 기술을 이용하여 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 하나이상의 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 제거함으로써 면역 제거될 수 있다. 변형된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이후, 하나이상의 바람직한 생물학적 활성, 예를 들면, 결합 친화성을 유지하지만 면역원성이 감소된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 확인하기 위하여 임의적으로 생산되고 검사될 수 있다. 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 확인하는 방법은 당분야에 공지된 기술, 예를 들면, 계량적 방법(참조: PCT Publication No. WO 02/069232), in vitro 또는 in silico 기술 및 생물학적 검사 또는 물리적 방법(가령, MHC 분자에 펩티드 결합의 결정, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 종으로부터 T 세포 수용체에 펩티드:MHC 복합체 결합의 결정, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 종의 MHC 분자를 포함하는 유전자도입 동물로 상기 단백질 또는 이의 펩티드 일부의 검사, 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 종으로부터 면역계 세포로 재구성된 유전자도입 동물로 검사 등)을 이용하여 수행될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 면역 제거된 항-CD200 항체에는 면역 제거된 항원-결합 단편, Fab, Fv, scFv, Fab'와 F(ab')₂, 단클론 항체, 뮤린 항체, 조작된 항체(가령, 키메라, 단일 사슬, CDR-합체된, 인간화, 완전 인간 항체 및 인공적으로 선택된 항체) 및 합성 또는 반-합성 항체가 포함된다.

다른 구체예에서, CD200 또는 CD200-양성 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체(insert)를 포함하는 재조합 DNA가 생산된다. DNA는 코딩 단일 가닥 DNA, 상기 코딩 DNA와 이의 상보성 DNA로 구성되는 이중 가닥 DNA, 또는 이들 상보성(단일 가닥) DNA 자체를 포괄한다.

더 나아가, CD200 또는 CD200-양성 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 인증된 DNA 서열, 또는 이의 변이체를 포함하는 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 DNA일 수 있다. 인증된 DNA의 변이체는 하나이상의 아미노산이 결실되거나, 삽입되거나, 또는 하나이상의 다른 아미노산으로 치환된 상기한 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA이다. 적절하게는, 상기 변형은 인간화와 발현 최적화 적용에서 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 CDR 외부에서 발생한다. 변이체 DNA에는 하나이상의 뉴클레오티드가 동일한 아미노산을 코딩하는 새로운 코돈(codon)을 갖는 다른 뉴클레오티드로 치환된 침묵 변이체(silent mutant) 역시 포함된다. 변이체 서열에는 축퇴(degenerate) 서열 역시 포함된다. 축퇴 서열은 무제한의 뉴클레오티드가 최초 인코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 다른 뉴클레오티드로 치환된다는 점에서, 유전자 코드(genetic code)의 의미에서 축퇴이다. 이들 축퇴 서열은 그들의 상이한 제한 부위(restriction site) 및/또는 특정 숙주, 특히, 대장균(E. coli)에 의해 선호되는 특정 코돈의 빈도로 인하여 유용하고, 중쇄 뮤린 가변 도메인 및/또는 경쇄 뮤린 가변 도메인의 최적 발현을 달성할 수 있다.

변이체는 당분야에 공지된 방법에 따라, 인증된 DNA의 시험관내 돌연변이유발에 의해 획득되는 DNA 변이체를 포괄하도록 의도된다.

완전 4합체 면역글로불린 분자의 조립(assembly) 및 키메라 항체의 발현을 위하여, 중쇄와 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 삽입체는 중쇄와 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 상응하는 DNA와 융합되고, 예로써, 하이브리드 벡터 내로 통합이후 적절한 숙주 세포 내로 전달된다.

인간 불변 도메인 IgG, 예를 들면, γl, γ2, γ3 또는 γ4; 특정 구체예에서, γ1 또는 γ4에 융합된 CD200 또는 CD200-양성 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 뮤린 가변 도메인을 코딩하는 삽입체를 포함하는 재조합 DNA가 이용될 수 있다. 인간 불변 도메인 κ 또는 λ, 바람직하게는, κ에 융합된 본 명세서에 기술된 세포주를 지향하는 항체의 경쇄 뮤린 가변 도메인을 코딩하는 삽입체를 포함하는 재조합 DNA 역시 제시된다.

다른 구체예는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA에 관계하는데, 여기서 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인은 스페이서(spacer) 기에 의해 연결되고, 숙주 세포 내에서 항체의 가공을 용이하게 하는 신호 서열 및/또는 상기 항체의 정제를 용이하게 하는 펩티드 및/또는 절단 부위 및/또는 펩티드 스페이서 및/또는 작용제를 인코딩하는 DNA 서열을 임의적으로 포함한다. 작용제를 코딩하는 DNA는 진단 또는 치료 적용에서 유용한 작용제를 코딩하는 DNA인 것으로 의도된다. 따라서, 독소 또는 효소, 특히, 프로드러그의 활성화를 촉매할 수 있는 효소인 작용제 분자가 특히 바람직하다. 이런 작용제를 인코딩하는 DNA는 자연 발생 효소 또는 독소 인코딩 DNA의 서열, 또는 이의 변이체를 보유하고, 당분야에 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명의 단클론 항체 또는 항원-결합 단편은 다른 작용제, 예를 들면, 치료제 또는 탐기가능 라벨(detectable label)에 공액되지 않은 나신 항체 또는 항원-결합 단편일 수 있다. 대안으로, 이러한 단클론 항체 또는 항원-결합 단편은 작용제, 예를 들면, 세포독성제, 소형 분자, 호르몬, 효소, 성장 인자, 사이토킨, 리보자임, 펩티드모방체, 화학물질, 프로드러그, 코딩 서열을 비롯한 핵산 분자(가령, 안티센스, RNAi, 유전자-표적화 구조체 등), 또는 탐지가능 라벨(가령, NMR 또는 X-선 조영제(contrasting agent), 형광 분자 등)에 공액될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD200 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편(가령, Fab, Fv, 단일-사슬 scFv, Fab'와 F(ab')₂)은 상기 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키는 분자에 연결된다. 상기 항-CD200 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편에 연결되는 분자에는 알부민을 비롯한 혈청 단백질, 폴리펩티드, 다른 단백질 또는 단백질 도메인, PEG 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

포유동물 세포 내에서 클론된 중쇄와 경쇄 유전자의 발현을 위하여 여러 벡터 시스템이 가용하다. 한 종류의 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 원하는 유전자 서열의 통합에 의존한다. 안정적으로 통합된 DNA를 보유하는 세포는 대장균(E. coli) gpt(Mulligan, R. C. and Berg, P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)) 또는 Tn5 neo(Southern, P. J. and Berg, P., J. MoI. Appl. Genet., 1: 327 (1982))와 같은 약제 저항성 유전자(drug resistance gene)를 동시에 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택가능 마커 유전자는 발현되는 DNA 유전자 서열에 연결되거나, 또는 공동-트랜스펙션(co-transfection)에 의해 동일 세포 내로 도입될 수 있다(Wigler, M. et al., Cell, 16: 77 (1979)). 두 번째 종류의 벡터는 염색체외(extrachromosomal) 플라스미드에 자기 복제 능력을 공여하는 DNA 요소를 이용한다. 이들 벡터는 소 유두종 바이러스(bovine papillomavirus)(Sarver, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7147 (1982)), 폴리오마 바이러스(polyoma virus)(Deans, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 : 1292 (1984)), 또는 SV40 바이러스(Lusky, M. and Botchan, M., Nature, 293: 79 (1981))와 같은 동물 바이러스로부터 유래될 수 있다.

면역글로불린 cDNA는 항체 단백질을 인코딩하는 성숙 mRNA를 나타내는 서열로만 구성되기 때문에, 유전자의 전사와 RNA의 처리를 조절하는 부가적인 유전자 발현 요소가 면역글로불린 mRNA의 합성에 요구된다. 이들 요소에는 절단접합 신호(splice signal), 유도성 프로모터(inducible promoter)를 비롯한 전사 프로모터(transcription promoter), 인핸서(enhancer) 및 종결 신호(termination signal)가 포함될 수 있다. 이들 요소를 통합하는 cDNA 발현 벡터에는 Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell Biol., 3: 280 (1983); Cepko, C. L. et al., Cell, 37: 1053 (1984) 및 Kaufman, R. J., Proc. NatL Acad. Sci., USA, 82: 689 (1985)에 기술된 것들이 포함된다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체는 차단성 또는 비-차단성 항체이다. 본 명세서에서, 차단성 항체는 CD200과 CD200R 사이에 상호작용을 차단하는 항체이다. 비-차단성 항체는 CD200에 결합하고 및/또는 상호작용하지만 CD200R과의 상호작용을 차단하지 않는다. 따라서, 특정 구체예에서, 항-CD200 항체는 차단성 또는 비-차단성 뮤린, 키메라, 인간화 인간 또는 면역 제거된 항체이다.

II. 변경된 작동체 기능을 나타내는 CD200 길항물질

CD200 길항물질은 최초 또는 부모 길항물질과 비교하여, 증가된 또는 감소된 효과를 유도하도록 변형될 수 있다. 가령, CD200에 결합하는 길항물질은 CD200에 결합 이후에 2차 기능을 유도하고, 일부 사례에서, CD200:CD200R 상호작용을 저해한다. 가령, 길항물질은 수용체 또는 세포외 단백질을 비롯한 다른 리간드에 대한 추가적인 결합 부위를 보유할 수 있다. 이들 다른 리간드에 결합은 다른 세포의 유인(attraction) 또는 동원(recruitment) 및 세포 사멸(cell death)을 비롯한 다양한 현상의 활성화와 같은 다른 현상을 유인할 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 변경된 2차 기능(이후, 작동체 기능)을 유도하는 CD200 길항물질에 관계한다. 특정 구체예에서, 변경된 2차 또는 작동체 기능을 나타내는 CD200 길항물질은 증가되거나 감소된 2차 또는 작동체 기능을 보이거나, 또는 이러한 기능이 없고, CD200:CD200R 상호작용을 차단하거나 차단하지 않는다. 특정 구체예에서, 변경된 2차 또는 작동체 기능을 나타내는 CD200 길항물질은 항-CD200 항체이다.

A) 작동체 기능

항체와 항체-항원 복합체의 면역계 세포와의 상호작용은 본 명세서에서 작동체 기능으로 지칭되는 다양한 반응에 영향을 준다. 전형적인 작동체 기능에는 Fc 수용체 결합, 식세포작용(phagocytosis), 세포 표면 수용체(가령, B 세포 수용체; BCR)의 하향-조절(down-regulation) 등이 포함된다. 다른 작동체 기능에는 항체가 세포 사멸을 유도하는 자연 킬러(natural killer, NK) 세포 또는 대식세포 상에서 Fc 수용체에 결합하는 ADCC 및 보체 캐스케이드(complement cascade)의 활성화를 통하여 유도된 세포 사멸인 CDC가 포함된다(Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995); Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)). 이들 작동체 기능은 일반적으로, Fc 영역과 결합 도메인(가령, 항체 가변 도메인)의 합체를 요하고, 예로써, 본 명세서에 기술된 다양한 검사법을 이용하여 평가될 수 있다.

ADCC를 비롯한 여러 항체 작동체 기능은 항체의 Fc 영역에 결합하는 Fc 수용체(FcR)에 의해 매개된다. ADCC에서, NK 세포 또는 대식세포는 항체 복합체의 Fc 영역에 결합하고, 표적 세포의 용해를 촉진한다. NK 세포 상에서 FcR의 교차-연결(cross-linking)은 퍼포린(perforin)/그랜자임(granzyme)-매개된 세포독성을 유인하는 반면, 대식세포에서 이러한 교차-연결은 산화질소(nitric oxide, NO), TNF-α 및 반응성 산소 종(reactive oxygen species)과 같은 매개인자(mediator)의 방출을 촉진한다. CD200-양성 표적 세포의 경우에, 항-CD200 항체는 표적 세포에 결합하고, Fc 영역은 작동체 기능을 표적 세포로 지향시킨다. 특정 FcR에 대한 항체의 친화성 및 결과로써, 상기 항체에 의해 매개되는 작동체 활성은 상기 항체의 Fc 및/또는 불변 영역의 아미노산 서열 및/또는 번역후 수식을 변화시킴으로써 조절될 수 있다.

FcR은 면역글로불린 아이소타입(isotype)에 대한 그들의 특이성으로 정의된다; 예로써, IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로 지칭되고, IgE 항체에 대한 Fc 수용체는 FcεR로 지칭되고, IgA 항체에 대한 Fc 수용체는 FcαR로 지칭된다. FcγR의 3가지 하위분류가 확인되었다: FcγRI(CD64), FcγRlI(CD32) 및 FcγRIII(CD16). 각 FcγR 하위분류가 2개 또는 3개의 유전자에 의해 인코딩되고, 대안적 RNA 절단접합이 복수의 전사체를 결과하기 때문에, FcγR 동등형(isoform)에서 광범위한 다양성이 존재한다. FcγRI 하위분류를 인코딩하는 3개의 유전자(FcγRIA, FcγRIB와 FcγRIC)는 염색체 1의 장완(long arm)의 영역 1 q21.1 내에 밀집한다; FcγRII 동등형을 인코딩하는 유전자(FcγRIIA, FcγRIIB와 FcγRIIC) 및 FcγRIII을 인코딩하는 2개의 유전자(FcγRIIIA와 FcγRIIIB)는 영역 Iq22 내에 밀집한다. 이들 상이한 FcR 아형(subtype)은 상이한 세포 타입에서 발현된다(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)). 가령, 인간에서, FcγRIIIB은 호중구(neutrophil)에서 관찰되는 반면, FcγRIIIA는 대식세포, 단핵구, 자연 킬러(NK) 세포 및 T-세포의 계군에서 관찰된다. 흥미롭게도, FcγRIIIA는 ADCC에 관여하는 세포 타입 중의 하나인 NK 세포 상에 존재하는 유일한 FcR이다.

FcγRI, FcγRII와 FcγRIII은 면역글로불린 대과(superfamily)(IgSF) 수용체이다; FcγRI은 세포외 도메인 내에 3개의 IgSF 도메인을 보유하는 반면, FcγRII와 FcγRIII은 세포외 도메인 내에 단지 2개의 IgSF 도메인을 보유한다. 다른 유형의 Fc 수용체는 신생아 Fc 수용체(FcRn)이다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)와 구조적으로 유사하고, β2 -마이크로글로불린(microglobulin)에 비-공유 결합된 α-사슬로 구성된다.

인간과 뮤린 항체 상에서 FcγR에 대한 결합 부위는 잔기 233-239로 구성되는 "하부 힌지 영역"에 미리 배치되었다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); Woof et al. Molec. Immunol. 23:319-330 (1986); Duncan et al. Nature 332:563 (1988); Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9036-9040 (1991)에서처럼 EU 인덱스 넘버링(index numbering)). 잔기 233-239 중에서, P238과 S239가 결합에 관여할 가능성이 높은 것으로 언급되었다.

FcγR에 대한 결합에 관여할 가능성이 높은 것으로 기존에 언급된 다른 부위는 아래와 같다: 인간 FcγRI의 경우에 G316-K338(인간 IgG)(서열 비교 단독에 의해; 치환 변이체 평가되지 않음)(Woof et al. Molec Immunol. 23:319-330 (1986)); 인간 FcγRIII의 경우에 K274-R301(인간 IgGl)(펩티드에 기초됨)(Sarmay et al. Molec. Immunol. 21:43-51 (1984)); 인간 FcγRIII의 경우에 Y407-R416(인간 IgG)(펩티드에 기초됨)(Gergely et al. Biochem. Soc. Trans. 12:739-743 (1984)); 뮤린 FcγRII의 경우에 N297과 E318(뮤린 IgG2b)(Lund et al., Molec. Immunol., 29:53- 59 (1992)).

인간 작동체 세포는 하나이상의 FcR을 발현하고 작동체 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 구체예에서, 이들 세포는 최소한 FcγRIII을 발현하고 ADCC 작동체 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 실례에는 말초혈 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 자연 킬러(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포와 호중구가 포함된다. 작동체 세포는 자연 공급원, 예를 들면, 혈액 또는 PBMC로부터 분리될 수 있다.

CDC에서, 항체-항원 복합체는 보체에 결합하고, 보체 캐스케이드의 활성화 및 막 공격 복합체(membrane attack complex)의 생성을 결과한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 동계(cognate) 항원에 결합된 항체(적절한 하위분류의)에 보체 시스템의 첫 번째 성분(C1q)의 결합에 의해 시작된다; 따라서, 이러한 보체 캐스케이드의 활성화는 C1q 단백질에 면역글로불린의 결합 친화성에 의해 부분적으로 조절된다. C1q 및 2개의 세린 프로테아제(serine proteases), C1r과 C1s는 CDC 경로의 첫 번째 성분인 복합체 C1을 형성한다. C1q는 대략 460,000의 분자량(molecular weight) 및 6개의 교원질(collagenous) "줄기(stalk)"가 6개의 구형 두부(globular head) 영역에 연결된 구조를 보유하는 6가(hexavalent) 분자이다(Burton and Woof, Advances in Immunol. 51 :1-84 (1992)). 보체 캐스케이드를 활성화시키기 위하여, C1q는 최소한 2개의 IgGl, IgG2, 또는 IgG3 분자에 결합해야 하지만 항원성 표적에 부착된 IgM에서는 한 분자에만 결합한다(Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) p. 80). 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예로써, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.Methods 202: 163 (1996)에 기술된 CDC 검사가 수행될 수 있다.

CH2 도메인 상에서 Glu318, Lys320과 Lys322 잔기; 동일한 베타 가닥(beta strand) 인근에서 회전(turn) 상에 위치하는 아미노산 잔기 331; 하부 힌지 영역 내에 위치하는 Lys235와 Gly237 잔기; CH2 도메인의 N-말단 영역 내에 위치하는 잔기 231 내지 238을 비롯한 IgG 분자의 다양한 잔기가 C1q에 대한 결합에 관여하는 것으로 제안되었다(참조: Xu et al., J. Immunol. 150:152A (Abstract) (1993), WO94/29351; Tao et al, J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol, 24:2542-47 (1994); Burton et al; Nature, 288:338-344 (1980); Duncan and Winter, Nature 332:738-40 (1988); U.S. Pat No. 5,648,260; U.S. Pat. No. 5,624,821). 또한, C1q에 결합하고 보체 캐스케이드를 활성화시키는 IgG의 능력이 2개의 CH2 도메인 사이에 위치한 탄수화물 모이어티(이는 통상적으로, Asn297에 정착한다)의 존재, 부재 또는 변형에 좌우되는 것으로 제안되었다(Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)). 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-CD200 항체의 CDC 활성을 강화시키거나 감소시키기 위하여, 이들 잔기 중에서 하나이상의 잔기가 변형되거나, 치환되거나, 제거되고, 또는 하나이상의 아미노산 잔기가 삽입될 수 있다.

B) 조절된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체

표적-특이적 항체의 불변 영역을 필요로 하는 작동체 기능은 불변 영역 또는 Fc 영역의 특성을 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 변경된 작동체 기능에는 예로써, 아래의 활성: ADCC, CDC, 아폽토시스(apoptosis), 하나이상의 Fc-수용체에 결합 및 친염증성 반응(pro-inflammatory response) 중에서 하나이상에서 조절이 포함된다. 조절은 두 번째 항체의 활성과 비교하여, 활성의 증가, 감소, 또는 제거를 지칭한다. 특정 구체예에서, 두 번째 항체는 작동체 기능을 나타내는 항체이다. 두 번째 항체는 조작된 항체 또는 자연 발생 항체이고, 비-변이성, 고유, 또는 부모 항체로 지칭될 수 있다. 특정 구체예에서, 조절에는 활성이 소멸되거나 완전히 부재하는 상황이 포함된다. 더 나아가, 일부 사례에서, 비-변이성 항체는 본 명세서에 기술된 chC2aB7-hG1 또는 hB7V3V2-hG1 항체의 활성과 유사하거나 동등한 작동체 기능 활성을 나타낸다. 유사하게, 기능성 또는 비- 변이성 불변 영역 또는 Fc 영역은 고유 불변 또는 Fc 도메인의 작동체 기능을 나타낼 수 있다; 일부 사례에서, chC2aB7-hG1 또는 hB7V3V2-hG1의 불변 영역 또는 Fc 영역은 비-변이성 도메인일 수 있다. 본 발명에서, chC2aB7-hG1과 hB7V3V2-hG1은 다른 항체의 활성이 비교되는 기준이고, hB7V3V2-hG1이 더욱 선호된다.

변경된 FcR 결합 친화성 및/또는 ADCC 활성 및/또는 변경된 CDC 활성을 나타내는 폴리펩티드 이형은 고유 또는 부모 폴리펩티드, 또는 고유 서열 Fc 또는 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 강화된 또는 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 나타내는 폴리펩티드이다. FcR에 증가된 결합을 나타내는 폴리펩티드 이형은 부모 폴리펩티드보다 높은 친화성으로 최소한 하나의 FcR에 결합한다. FcR에 감소된 결합을 나타내는 폴리펩티드 이형은 부모 폴리펩티드보다 낮은 친화성으로 최소한 하나의 FcR에 결합한다. FcR에 감소된 결합을 나타내는 이들 이형은 FcR에 대한 고유 서열 면역글로불린 불변 영역 또는 Fc 영역의 결합 수준과 비교하여, FcR에 대한 극히 미미한 결합, 예를 들면, FcR에 0-20% 결합을 나타낸다. 유사하게, 변경된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내는 폴리펩티드 이형은 고유 또는 부모 폴리펩티드와 비교하여, 증가된 또는 감소된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 보인다. 감소된 ADCC 및/또는 CDC을 나타내는 폴리펩티드 이형은 예로서, 본 명세서에 제시된 바와 같이, 감소된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 보이거나 이러한 활성이 없다. 특정 구체예에서, 부모 또는 고유 폴리펩티드 및 이의 이형은 항체 또는 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 CD200에 결합하고, CD200:CD200R 상호작용을 차단하거나 차단하지 않는다.

고유 서열 Fc 또는 불변 영역은 자연에서 관찰되는 Fc 또는 불변 사슬 영역의 아미노산 서열에 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 변이성 또는 변형된 Fc 또는 불변 영역은 예로써, 최소한 하나의 아미노산 변형, 삽입, 또는 결실에 의해 고유 서열 중쇄 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 변이성 또는 변형된 불변 영역은 고유 서열 불변 영역 또는 부모 폴리펩티드의 불변 영역과 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 예를 들면, 고유 서열 불변 영역 또는 부모 폴리펩티드의 불변 영역에서 대략 1개 내지 대략 100개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이성 또는 변형된 불변 영역은 고유 서열 불변 영역 및/또는 부모 폴리펩티드의 불변 영역과 최소한 70% 상동성(유사성) 또는 동일성, 일부 사례에서 최소한 75%, 다른 사례에서 최소한 80% 상동성 또는 동일성, 다른 구체예에서, 최소한 85%, 90% 또는 95% 상동성 또는 동일성을 나타낸다. 이러한 변이성 또는 변형된 불변 영역은 하나이상의 아미노산 결실 또는 삽입 역시 포함할 수 있다. 대안으로, 변이성 불변 영역은 예로써, 변경된 당화 패턴을 비롯한 변경된 번역후 수식을 결과하는 하나이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.

본 발명에 제시된 변이성 항-CD200 항체는 고유 또는 부모 폴리펩티드 서열과 비교하여, 하나이상의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 게다가, 변이성 항체는 변이성 항-CD200 항체를 인코딩하는 핵산 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수도 있다. 혼성화를 탐지하는데 다양한 조건이 이용될 수 있는데, 엄격도(stringency)는 혼성화 검사의 세척 단계에 의해 주로 결정된다. 일반적으로, 높은 온도와 낮은 염 농도(salt concentration)는 높은 엄격도를 제공하는 반면, 낮은 온도와 높은 염 농도는 낮은 엄격도를 제공한다. 낮은 엄격도 혼성화는 예로써, 50℃에서 대략 2.0 x SSC에서 세척으로 달성되고, 높은 엄격도 혼성화는 50℃에서 대략 0.2 x SSC로 달성된다.

변경된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 변이성 불변, Fc, 또는 중쇄 영역을 포함하는 항체를 조작하거나 생산함으로써 산출될 수 있다; 변경된 기능 및/또는 활성을 나타내는 항체를 생산하기 위하여 재조합 DNA 기술 및/또는 세포 배양과 발현 조건이 이용될 수 있다. 가령, 작동체 기능을 비롯한 항체 기능에 영향을 주는 영역(가령, Fc 또는 불변 영역) 내에서 하나이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 조작하는데 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 대안으로, 번역후 수식, 예를 들면, 당화 패턴에서 변화는 항체가 생산되는 세포 배양과 발현 조건을 조작함으로써 달성될 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정 측면과 방법은 하나이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하고 변경된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체에 관계한다. 특정 구체예에서, 이런 변이성 항-CD200 항체는 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없다. 특정 구체예에서, 변이성 항체는 G1 도메인 대신에 G2/G4 구조체를 포함한다(예로써, 도 10, 11, 12, 13, 15 참조).

G1 도메인을 본 명세서에 제시된 G2/G4 구조체로 교체하는 것 이외에, 감소된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체는 상기 항체의 특정 영역의 아미노산 서열에서 다른 유형의 변화를 도입함으로써 산출될 수 있다. 이런 아미노산 서열 변화에는 Bluestone 등에 의해 기술된 Ala-Ala 돌연변이가 포함되지만 이에 국한되지 않는다(참조: WO 94/28027과 WO 98/47531; Xu et al. 2000 Cell Immunol 200; 16-26). 따라서, 특정 구체예에서, Ala-Ala 돌연변이를 비롯한 불변 영역 내에 돌연변이를 포함하는 항-CD200 항체는 작동체 기능을 감소시키거나 소멸시키는데 이용될 수 있다. 이들 구체예에 따라, 항-CD200 항체의 불변 영역은 234 위치에서 알라닌으로의 돌연변이, 또는 235 위치에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 부가적으로, 불변 영역은 이중 돌연변이: 234 위치에서 알라닌으로의 돌연변이 및 235 위치에서 알라닌으로의 두 번째 돌연변이를 포함할 수도 있다. 한 구체예에서, 항-CD200 항체는 IgG4 골격을 포함하는데, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 234 위치에서 페닐알라닌의 알라닌으로의 돌연변이 및/또는 235 위치에서 루이신의 알라닌으로의 돌연변이를 기술한다. 다른 구체예에서, 항-CD200 항체는 IgGl 골격을 포함하는데, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 234 위치에서 루이신의 알라닌으로의 돌연변이 및/또는 235 위치에서 루이신의 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 항-CD200 항체는 대안적으로 또는 부가적으로, CH2 도메인 내에서 점 돌연변이(point mutation) K322A를 비롯한 다른 돌연변이를 보유한다(Hezareh et al. 2001 J Virol. 75: 12161-8). 더 나아가, 불변 영역 내에서 이러한 돌연변이를 포함하는 항체는 차단성 또는 비-차단성 항체이다.

힌지 영역 내에서 변화 역시 작동체 기능에 영향을 준다. 가령, 힌지 영역의 결실은 Fc 수용체에 대한 친화성을 감소시키고, 보체 활성화를 감소시킨다(Klein et al. 1981 PNAS USA 78: 524-528). 이런 이유로, 본 발명은 힌지 영역 내에서 변형을 포함하는 항체에 관계한다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 강화하거나 저해하도록 변형된다. 조절된 CDC 활성은 항체의 Fc 영역 내에서 하나이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 도입함으로써 달성될 수 있다(참조: U.S. Pat. No. 6,194,551). 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 영역 내에 사슬간 이황화 결합(disulfide bond) 형성이 가능하도록 시스테인 잔기가 Fc 영역 내에 도입될 수 있다. 이렇게 산출된 동종이량체(homodimeric) 항체는 향상되거나 감소된 내재화 능력(internalization capability) 및/또는 증가되거나 감소된 보체-매개된 세포 사멸을 나타낼 수 있다(참조: Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)와 Shopes, B. J.Immunol. 148:2918-2922 (1992), WO99/51642, Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); U.S. Pat. No. 5,648,260; U.S. Pat. No. 5,624,821; WO94/29351). 강화된 항-종양 활성을 나타내는 동종이량체 항체는 Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)에 기술된 바와 같이, 이종이중기능성 교차-링커(cross-linker)를 이용하여 제조될 수도 있다. 대안으로, 항체는 이중 Fc 영역을 보유하고, 따라서 강화된 보체 용해와 ADCC 능력을 나타내도록 조작될 수 있다(참조: Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)).

항체의 작동체 기능을 조절하는 다른 잠재적인 수단에는 당화에서 변화가 포함된다. 이 문제는 최근에, Raju에 의해 재검토되었는데, 상기 저자는 인간 IgG 상에서 관찰되는 올리고사카라이드의 제안된 중요성을 작동체 기능의 정도로 요약하였다(Raju, TS. BioProcess International April 2003. 44-53). Wright와 Morrison에 따라, 인간 IgG 올리고사카라이드의 미세이질성(microheterogeneity)은 CDC와 ADCC, 다양한 Fc 수용체에 결합 및 C1q 단백질에 결합과 같은 생물학적 기능에 영향을 줄 수 있다(Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32). 항체의 당화 패턴은 생산 세포 및 세포 배양 조건에 따라 달라질 수 있는 것으로 상세하게 보고되었다(Raju, TS. BioProcess International April 2003. 44-53). 이런 차이는 작동체 기능과 약물동력학(pharmacokinetics) 모두에서 변화를 유도할 수 있다(Israel et al. Immunology. 1996; 89(4):573-578; Newkirk et al. P. Clin. Exp. 1996; 106(2):259-64). 작동체 기능에서 차이는 작동체 세포 상에서 Fcγ 수용체(FcγRs)에 결합하는 IgG 능력에 관련될 수 있다. Shields 등은 FcγR에 향상된 결합을 나타내는 아미노산 서열에서 이형을 포함하는 IgG가 인간 작동체 세포를 이용하여 최대 100% 향상된 ADCC를 나타낼 수 있다는 것을 증명하였다(Shields et al. J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604). 이들 이형에는 결합 접촉면(binding interface)에서 관찰되지 않는 아미노산에서 변화를 포함하지만, 당 성분의 본성 및 이의 구조적 패턴 역시 관찰된 이들 차이에 기여할 수 있다. 이에 더하여, IgG의 올리고사카라이드 성분에서 푸코오스(fucose)의 존재 또는 부재는 결합과 ADCC를 향상시킬 수 있다(Shields et al. J Biol Chem. 2002; 277(30):26733-40). Asn297에 연결된 푸코실화된 탄수화물이 부재하는 IgG는 Fcγ 수용체에 정상적인 수용체 결합을 보였다. 대조적으로, FcγRIIA 수용체에 결합은 50% 향상되었고, 특히, 낮은 항체 농도에서 향상된 ADCC를 동반하였다.

Shinkawa 등의 논문은 쥐 하이브리도마에서 생산된 인간 IL-5 수용체에 대한 항체가 중국 햄스터 난소 세포(CHO)에서 생산된 항체에 비하여 50% 이상 높은 ADCC를 보인다는 것을 증명하였다(Shinkawa et al. J Biol Chem. 2003 278(5):3466-73). 모노사카라이드 조성물과 올리고사카라이드 프로파일링(profiling)은 쥐 하이브리도마-생산된 IgG가 CHO-생산된 단백질보다 적은 함량의 푸코오스를 보유한다는 것을 증명하였다. 이들 저자는 IgGl의 푸코실화(fucosylation) 부재가 ADCC 활성의 강화에서 결정적인 역할을 한다고 결론하였다.

상이한 접근법이 Umana 등에 의해 시도되었는데, 이들은 키메라 IgGl 항-신경아세포종 항체인 chCE7의 당화 패턴을 변화시켰다(Umana et al. Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17(2): 176-80). 테트라사이클린(tetracycline)을 이용하여, 이들은 ADCC 활성에 관여하는 올리고사카라이드를 양분하는 글리코실전이효소(glycosyltxansferase) 효소(GnnII)의 활성을 조절하였다. 부모 항체의 ADCC 활성은 배경 수준(background level)을 거의 초과하지 못하였다. 상이한 테트라사이클린 수준에서 생산된 chCE7의 ADCC 활성의 측정은 최대 chCE7 in vitro ADCC 활성을 위한 GnTIH 발현의 최적 범위를 확인하였다. 이러한 활성은 불변 영역-연합되고 양분된 복합체 올리고사카라이드의 수준과 상관하였다. 새로이 최적화된 이형은 실질적인 ADCC 활성을 나타냈다. 유사하게, Wright와 Morrison은 당화가 결함된 CHO 세포주에서 항체를 생산하고(1994 J Exp Med 180: 1087-1096), 상기 세포주에서 생산된 항체가 보체-매개된 세포용해(cytolysis)에서 무능함을 증명하였다. 따라서, 작동체 기능에 영향을 주는 공지된 변형에 당화 패턴에서 변형 또는 당화된 잔기의 총수에서 변화가 포함되기 때문에, 본 발명은 ADCC와 CDC를 비롯한 작동체 기능을 강화시키거나 감소시키도록 당화가 변경된 CD200 항체에 관계한다. 변경된 당화에는 당화된 잔기의 총수에서 감소 또는 증가 및 당화된 잔기의 패턴 또는 위치에서 변화가 포함된다.

항체의 작동체 기능을 변경하기 위한 또 다른 접근법이 존재한다. 가령, 항체-생산 세포는 전체 항체 분자 전역에서 무작위로 변형된 뉴클레오티드와 폴리펩티드 잔기를 포함하는 항체를 산출하는 초돌연변이성(hypermutagenic) 일 수 있다(참조: WO 2005/011735). 초돌연변이성 숙주 세포에는 DNA 미스매치 복구(mismatch repair)가 결함된 세포가 포함된다. 이러한 방식으로 생산된 항체는 항원성이 더욱 적고 및/또는 유익한 약물동력학적 특성을 보유한다. 부가적으로, 이런 항체는 강화된 또는 감소된 작동체 기능과 같은 특성에 대하여 선택될 수도 있다.

또한, 작동체 기능은 항체의 결합 친화성에 따라 변화될 수도 있다. 가령, 높은 친화성을 나타내는 항체는 상대적으로 낮은 친화성을 나타내는 항체와 비교하여, 보체 시스템을 활성화시키는데 더욱 효과적이다(Marzocchi-Machado et al. 1999 Immunol Invest 28: 89-101). 따라서, 항체는 항원에 대한 결합 친화성이 감소하도록(가령, 하나이상의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실과 같은 방법으로 항체의 가변 영역을 변화시킴으로써) 변형될 수 있다. 감소된 결합 친화성을 나타내는 항-CD200 항체는 예로써, 감소된 ADCC 및/또는 CDC를 비롯한 감소된 작동체 기능을 나타낼 수 있다.

III. CD200을 과다발현하는 세포를 격감시키거나 제거하는 방법

본 발명에 따라, CD200 길항물질을 함유하는 치료제를 개체에 투여함으로써 CD200을 발현하는 세포를 개체 내에서 격감시키는 방법이 제시된다. 앞서 언급된 바와 같이, CD200은 특정 면역 세포 상에서 발현된다; 본 발명에서 증명된 바와 같이, CD200은 특정 악성 세포에서도 발현된다. CD200의 이러한 본질적으로 상이한 발현은 치료를 위하여 암 세포(즉, CD200-양성 세포)를 표적하는 방법을 제공한다. 유사하게, CD200-양성 면역 세포는 자가면역 질환을 치료하는 방법에서 격감을 위하여 표적될 수도 있다.

CD200은 골수 세포 상에서 CD200R과의 상호작용을 통하여, 골수 활성 및/또는 이동을 위한 저해 신호를 전달함으로써 면역억제를 조절한다. CD200-적중(knockout) 생쥐는 예로써, 면역 자극(immunogenic stimuli)이후 더욱 활발한 면역 반응을 나타내고(Hoek et al. Science 2000), CD200-발현 세포는 자극된 면역 세포의 사이토킨 프로필에서 전환(shift)을 유도함으로써 면역억제를 이끌어낸다(본 명세서에 제시된 데이터 참조). 구체적으로, CD200-양성 세포는 혼성 세포 개체군 분석에서 Th1에서 Th2 사이토킨 생산으로의 전환을 유도할 수 있다. CD200-양성 세포가 이러한 면역 반응을 억제할 수 있긴 하지만, CD200-양성 암 세포는 면역 세포 공격(immune cell attack)을 회피할 수 있다. 하지만, 암 세포와 면역 세포의 막 상에서 CD200의 발현은 치료 시에 이들 세포를 표적하는데 이용될 수 있다. 가령, 항-CD200 길항물질은 CD200-양성 세포를 특이적으로 표적하고, CD200:CD200R 상호작용을 파괴하여 면역 억제를 저해하며, CD200-양성 세포를 면역 작동체 세포에 표적시킬 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 구체예는 CD200에 결합하고, 일부 사례에서 CD200:CD200R 상호작용을 파괴하는 길항물질을 포함하는 격감을 위한 CD200-양성 세포를 표적시키는 방법에 관계한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 면역 반응을 강화시키는 방법에 관계한다. 이들 방법은 CD200 길항물질을 함유하는 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 특정 구체예에서, 상기 길항물질은 본 명세서에 기술된 항-CD200 항체 또는 항원-결합 단편이다. 특정 기전에 한정됨 없이, 차단성 항-CD200 항체, 항원-결합 단편, 폴리펩티드, 또는 다른 길항물질은 면역 세포가 CD200-양성 세포를 공격하고 제거하도록 차단성 면역 억제로 CD200-양성 세포를 제거하는 것이다. 대안으로 또는 상기한 기전과의 조합으로, 항-CD200 항체(차단성 또는 비-차단성) 또는 다른 길항물질은 작동체 세포 또는 다른 리간드(가령, 보체 성분)를 상기 항체 또는 길항물질이 결합된 CD200-양성 세포로 동원하고, 작동체-매개된 세포 사멸(cell death)을 위하여 상기 CD200-양성 세포를 표적한다.

한 측면에서, 본 발명은 뮤린, 키메라, 인간화, 또는 인간 항-CD200 항체를 필요 개체에 투여함으로써 CD200-양성 표적 세포의 ADCC 및/또는 CDC를 조절하는 방법에 관계한다. 본 발명은 증가된 ADCC 및/또는 CDC를 유도하는 변이성 항-CD200 항체 및 감소된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내거나 이러한 활성이 없는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다.

한 구체예에서, 변이성 항-CD200 항체는 변이성 또는 변형된 Fc 또는 불변 영역을 포함하는데, 여기서 변이성 Fc 또는 불변 영역은 증가된 작동체 기능을 나타낸다. 이들 변이성 영역은 하나이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함한다. 대안으로 또는 부가적으로, 변이성 또는 변형된 Fc 또는 불변 영역은 예로써, 변경된 당화 패턴을 비롯한 변경된 번역후 수식을 포함할 수 있다. 변경된 당화 패턴에는 배당 결합(glycosydic bond)의 총수에서 증가 또는 감소 및/또는 하나이상의 배당 결합의 위치(즉, 아미노산 잔기 번호)에서 변경이 포함된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 감소된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내거나 이러한 활성이 없는 변이성 항-CD200 항체를 포함하는 CD200-양성 세포를 격감시키거나 제거하는 방법에 관계한다. 한 구체예에서, 변이성 항-CD200 항체는 변이성 또는 변형된 Fc 또는 불변 영역을 포함하는데, 여기서 변이성 Fc 또는 불변 영역은 감소된 작동체 기능을 나타내거나 이러한 기능이 없다. 이들 변이성 또는 변형된 Fc 또는 불변 영역은 하나이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 변이성 Fc 또는 불변 영역은 변경된 당화 패턴이 포함되지만 이에 국한되지 않는 변경된 번역후 수식을 포함할 수도 있다. 변경된 당화 패턴의 실례는 앞서 기술된다.

다른 구체예에서, 환자에 투여되는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간 또는 면역 제거된 항-CD200 항체는 비-차단성 항체이다. 이러한 비-차단성 항-CD200 항체는 앞서 기술된 바와 같은 변이성 항체이고, 결과적으로, 조절된 작동체 기능을 나타낼 수 있다. 가령, 변이성 항-CD200 항체는 CD200:CD200R 상호작용을 차단하지 않고, 증가된 작동체 기능, 예를 들면, 증가된 ADCC를 유도하는 변이성 불변 영역을 포함할 수 있다.

A) 자가면역 질환으로 고통받는 환자를 치료하는 방법

특정 측면에서, 본 발명은 CD200 길항물질을 함유하는 치료제로 자가면역 질환 환자를 치료하는 것에 관계한다. 특정 구체예에서, 상기 길항물질은 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 다른 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 단편은 조절된 작동체 활성을 나타내는 변이성 항-CD200 항체이다. 가령, 변이성 항체는 증가된 또는 강화된 작동체 기능, 예를 들면, ADCC를 유도할 수 있는 변이성 또는 변형된 불변 영역을 포함할 수 있다. 부가적으로, 상기 항체는 비-차단성 항체이고, 뮤린, 키메라, 인간화, 인간 또는 면역 제거된 항-CD200 항체일 수 있다. 따라서, 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법은 본 명세서에 기술된 CD200 길항물질과 항체 중에서 하나를 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 CD200 길항물질은 예로써, T-세포, B-세포와 수상돌기 세포와 같은 면역 세포를 비롯하여, 표면 상에 CD200을 발현하는 임의 유형의 세포를 격감시키는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 항-CD200 항체는 원치 않는 면역 반응, 예를 들면, 자가면역 질환, 이식, 알레르기, 또는 염증 장애와 연관된 면역 반응에 관여하는 면역 세포의 표적된 파괴에 유용할 수 있다. 본 명세서에 제시된 항-CD200 항체로 치료될 수 있는 전형적인 자가면역 질환과 질병에는 예로써, 건선과 피부염(가령, 아토피성 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환과 같은 염증 반응; 피부근염; 전신 경피증과 경화증; 염증성 장 질환(가령, 크론병과 궤양성 대장염)과 연관된 반응; 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome)(성인성 호흡 장애 증후군(adult respiratory distress syndrome, ARDS) 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체 신염; 습진과 천식 및 T 세포의 침윤과 만성 염증성 반응을 수반하는 다른 질환과 같은 알레르기 질환; 죽상경화증; 백혈구 접합물질 결핍증(leukocyte adhesion deficiency); 류머티스 관절염; 전신 홍반성 낭창(SLE); 당뇨병(가령, I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 증후군(Reynaud's syndrome); 자가면역 갑상선염; 알레르기 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 유년 발병형 당뇨병(juvenile onset diabetes); 결핵, 유사 육종증, 다발성근염, 육아종증과 혈관염에서 전형적으로 관찰되는 사이토킨과 T-림프구에 의해 매개되는 급성과 지연 과민증과 연관된 면역 반응; 악성 빈혈(부신기능부전); 백혈구 누출(leukocyte diapedesis)을 수반하는 질환; 중추신경계(CNS) 염증 질환; 복수 장기 손상 증후군(multiple organ injury syndrome); 용혈성 빈혈(hemolytic anemia)(글로빈혈증(cryoglobinemia) 또는 특발성 혈소판 감소증(Coombs positive anemia)이 포함되지만 이들에 국한되지 않음); 중증근무력증; 항원-항체 복합체 매개된 질환; 항-사구체 기저막 질환(anti-glomerular basement membrane disease); 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome); 알레르기 신경염; 그레이브스병; 중증근무력증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성 유천포창(pemphigoid bullous); 천포창; 자가면역 다발성신경병증; 라이터병(Reiter's disease); 근강직 증후군(stiff-man syndrome); 베체트병; 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis); 면역 복합체 신염; IgA 신증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증(immune thrombocytopenic purpura, ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증과 자가면역 용혈성 질환, 하시모토 갑상선염 등이 포함된다.

본 명세서에 기술된 방법과 조성물에 따라, 본 발명은 이식 또는 동종이식 환자를 치료하는 방법에 관계한다. 본 발명의 항-CD200 항체 또는 다른 CD200 길항물질은 이식된 장기 또는 조직의 환자 수용을 감소시킬 수 있는 CD200-양성 면역 세포를 감소시키거나 제거하기 위하여, 이식 또는 동종이식 절차 이전에 또는 이러한 절차 이후에 환자에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 증가된 작동체 기능을 나타내는 항-CD200 항체는 이식 환자에 제공된다. 이에 더하여, 항-CD200 항체는 비-차단성 항체이다.

CD200 길항물질 또는 항체를 함유하는 치료제는 복합 요법으로 환자에 투여될 수 있다. 따라서, 자가면역 질환을 치료하거나 예방하기 위한, 이식 생존(transplant survival)을 강화하거나 연장하기 위한, 알레르기를 치료하거나 예방하기 위한, 또는 염증 질환을 치료하거나 예방하기 위한 면역 세포의 특정 개체군의 표적된 사멸이 복합 요법의 일부로서 수행될 수 있다. 가령, CD200 길항물질(가령, 본 명세서에 기술된 항-CD200 항체)을 함유하는 첫 번째 치료제를 복용하는 환자에 두 번째 치료제 역시 제공될 수 있다. CD200 길항물질은 두 번째 치료제와 동시에 제공될 수 있다. 대안으로, CD200 길항물질은 두 번째 치료제 이전에 또는 이후에 제공될 수도 있다. 두 번째 치료제에는 소염제, 면역억제제 및/또는 항-감염제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 복합 요법에는 예로써, 스테로이드, 항-말라리아제, 아스피린, 비-스테로이드성 소염제, 면역억제제, 또는 세포독성제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는 본 명세서에 기술된 CD200 길항물질이 포함된다. 코르티코스테로이드(가령, 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone)과 프레드니솔론(predisolone)), 메토트렉세이트(methotrexate), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 마크로라이드 면역역제제(macrolide immunosuppressant)(가령, 시롤리무스(sirolimus)와 타크롤리무스(tacrolimus)), 유사분열 저해물질(가령, 아자티오프린(azathioprine), 사이클로포스파마이드(cyclosphamide)와 메토트렉세이트(methotrexate), T 림프구의 활성을 저해하는 진균 대사물질(가령, 사이클로스포린(cyclosporine)), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate) 및 세포독성과 DNA-손상 작용제(가령, 클로람부실(chlorambucil))가 포함된다. 자가면역 질환 및 동종이식과 이식 환자의 경우에, 항-CD200 치료제는 다클리주맙(daclizumab), 인터루킨-2 수용체의 α-사슬에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 인간 IgGl 단클론 항체 및 면역 세포 또는 다른 세포를 표적하는 다양한 다른 항체를 비롯한 항체 치료제와 복합될 수 있다. 이런 복합 요법은 1형 당뇨병, 류머티스 관절염, 낭창, 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura) 및 다른 자가면역 증상의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한, 하나이상의 작용제에 공액된 CD200 길항물질(가령, 본 명세서에 기술된 항체와 이의 이형)을 함유하는, 자가면역 질환과 이식 환자용 치료제에 관계한다.

B) 암으로 고통받는 환자를 치료하는 방법

한 측면에서, 본 발명에서는 암을 치료하는 방법을 제시하는데, 여기서 CD200과 이의 수용체의 상호작용을 파괴하거나 저해하는 작용제가 개체에 투여된다. CD200:CD200R 상호작용의 파괴는 차후에, 면역 억제를 반전시키거나 저해하여 면역 반응을 강화시킨다. CD200:CD200R 상호작용의 파괴를 위한 가능한 작용제에는 예로써, 소형 분자, 화학물질, 폴리펩티드, 무기 분자, 유기금속 화합물 등이 포함된다. CD200:CD200R 상호작용은 또한, 안티센스, RNAi, 또는 유전자 치료를 통하여 막 단백질 또는 이의 수용체의 발현을 감소시킴으로써 저해될 수 있다. 부가적으로, CD200 또는 CD200R에 특이적인 폴리펩티드, 예를 들면, 항-CD200- 또는 항-CD200R-특이적 항체 또는 이의 단편은 CD200:CD200R 상호작용의 면역억제 효과를 저해할 수 있다.

CD200 길항물질에 의해 치료될 수 있는 암 세포에는 CD200 발현 또는 CD200 상향-조절을 나타내는 임의의 암 세포가 포함된다. 항-CD200 치료제가 이용될 수 있는 암에는 예로써, 난소암, 흑색종, 골수종, 신경아세포종, 신장암, 유방암, 전립선암, 혈액 악성(가령, 림프종과 백혈병) 및 형질 세포암이 포함된다. 여기에는 신경관 세포로부터 유래된 암 세포 역시 포함된다. 일부 구체예에서, CD200 길항물질은 항-CD200 항체이다. 항암제로서 이용되는 이들 항체는 CD200과 이의 수용체의 상호작용을 간섭할 수 있다. 이러한 간섭은 CD200의 면역-억제 효과를 차단할 수 있다. 이러한 방식으로 면역 반응을 향상시킴으로써, 이들 항체는 암 세포의 소멸을 촉진할 수 있다. 항-CD200 항체는 또한, 작동체-매개된 세포 사멸을 위하여 암 세포를 표적할 수도 있다.

한 구체예에서, 조절된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내는 변이성 항-CD200 항체는 CD200-양성 암 세포가 존재하는 개체에 투여될 수 있다. 가령, 암 치료에 이용되는 변이성 항-CD200 항체는 부모 또는 고유 항체와 비교하여, 강화된 작동체 활성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 변이성 항-CD200 항체는 고유 항체와 비교하여, 감소된 ADCC를 비롯한 감소된 작동체 기능을 나타낸다. 상기 항체는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간 또는 면역 제거된 항체일 수 있다. 변이성 항-CD200 항체가 치료에 이용될 수 있는 암에는 신경관 세포암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 여기에는 형질 세포암, 난소암, 피부암, 폐암, 신장암, 유방암, 전립선암, 신경아세포종, 림프종, 골수종 및 백혈병 역시 포함된다.

본 발명의 항체는 암 환자, 특히, CLL, 형질 세포암, 난소암, 피부암, 폐암, 신장암, 유방암, 전립선암, 신경아세포종, 림프종, 골수종, 백혈병 및 신경관 세포로부터 유래된 임의의 암으로 고통받는 환자에 치료제로서 투여될 수 있다. 특히 유용한 구체예에서, 본 발명에 따른 암 치료는 (1) CD200과 이의 수용체 사이에 상호작용을 간섭하여 면역 억제를 차단함으로써 암 세포의 소멸을 촉진하는 항-CD200 항체 또는 길항물질을 투여하는 단계 및/또는 (2) 암 세포를 직접적으로 사멸시키는 CD-200 표적화 부분을 포함하는 융합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 대안으로, 상기 항체는 보체-매개된 또는 항체-의존성 세포독성을 통하여 암 세포를 직접적으로 사멸시킨다. CD200이 암 세포 상에서보다 낮은 수준이긴 하지만 내피 세포와 같은 정상 세포 상에서도 발현되기 때문에, 정상 세포에 대한 손상을 최소화시키기 위하여 ADCC 또는 CDC가 감소되거나 제거되도록 불변 영역이 변형된 항-CD200 항체를 투여하는 것이 유리할 수도 있다. 가령, CD200 발현이 일부 활성화된 정상 세포(가령, 활성화된 T 세포) 상에서 상향조절되어 이들 세포가 작동체 기능을 갖는 항-CD200 항체에 의한 사멸에 취약해지면, 암 세포를 파괴하는데 도움을 주는 이들 세포의 격감을 피하기 위하여 작동체 기능이 부재하는 항-CD200 항체를 이용하는 것이 유리할 수도 있다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체의 작동체 기능은 IgGl 불변 도메인을 IgG2/4 융합 도메인으로 교체함으로써 제거된다. 작동체 기능을 제거하는 다른 방법, 예를 들면, FcR과 상호작용하는 것으로 알려져 있는 부위의 돌연변이 또는 힌지 영역 내에서 펩티드의 삽입으로 FcR 상호작용에 요구되는 중요 부위를 제거하는 방법이 고안될 수 있다. 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 없는 변이성 항-CD200 항체에는 본 명세서에서 앞서 기술된 이형 역시 포함된다.

CD200:CD200R 상호작용의 저해 또는 예방을 위한 상기한 작용제는 다른 치료제 또는 다른 작용제와 병용될 수 있다. 다른 작용제에는 폴리펩티드, 소형 분자, 화학물질, 금속, 유기금속 화합물, 무기 화합물, 핵산 분자, 올리고뉴클레오티드, 압타머, 거울상 압타머, 안티센스 핵산, 잠금 핵산(LNA) 저해물질, 펩티드 핵산(PNA) 저해물질, 면역조절제, 항원-결합 단편, 프로드러그, 또는 펩티드모방 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

특정 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체와 면역조절 화합물, 백신 또는 화학치료제를 비롯한 CD200 길항물질을 포함하는 복합 요법에 관계한다. 이런 복합 요법에 이용될 수 있는 적절한 면역조절제의 전형적인 실례에는 단독으로 또는 저해물질, 예를 들면, IMiD, 탈리도마이드(thalidomide), 또는 탈리도마이드 유사체와의 조합으로, T 세포 또는 항원 제시 세포의 음성 조절을 차단하는 작용제(가령, 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PDL-2 항체, 항-PD-1 항체 등), 또는 T 세포의 양성 보조-자극(co-stimulation)을 강화시키는 작용제(가령, 항-CD40 항체 또는 항 4-1BB 항체), 또는 NK 세포 총수 또는 T-세포 활성을 증가시키는 작용제(가령, 항-CD200 항체)가 포함된다. 더 나아가, 면역조절제에는 종양 세포, 단백질, 펩티드, RNA, 또는 이들 세포로부터 유래된 DNA, 환자 유래된 열-충격 단백질(hsp's), 또는 다양한 수준에서 면역계를 자극하는 일반적인 어쥬번트, 예를 들면, CpG, Luivac, Biostim, Ribominyl, Imudon, Bronchovaxom 또는 선천성 면역계(innate immune system)의 수용체를 활성화시키는 임의의 다른 화합물이나 다른 어쥬번트(가령, 톨 유사(toll like) 수용체 항진제, 항-CTLA-4 항체 등)로 적하된 수상돌기 세포와 같은 암 백신이 포함될 수 있다. 또한, 면역조절 요법에는 IL-2, GM-CSF와 IFN-감마와 같은 사이토킨으로 치료가 포함될 수 있다.

추가적인 구체예에서, 항-CD25, 플루다라빈, 또는 사이클로포스파마이드와 같은 반응물로 현존하는 조절 T 세포의 제거는 항-CD200 치료를 시작하기에 앞서 달성된다. 또한, 골수소멸성 요법(myeloablative therapy) 및 차후의 골수 이식(bone marrow transplantation) 또는 CLL 세포와 반응하는 T 세포의 입양 전이(adoptive transfer)의 치료 효능(therapeutic efficacy)은 항-CD200 치료에 의해 강화된다. 또 다른 구체예에서, 항-CD200 치료의 효능은 항-PDL1 및/또는 2 항체, 항-IL-10 항체, 항-IL-6 항체 등과 같은 작용제를 이용한 차단성 면역억제 기전에 의해 향상된다. 더 나아가, 암 환경에서 면역억제성인 것으로 밝혀진 형질세포양(plasmacytoid) 수상돌기 세포를 제거하는 것이 유리할 수 있다. 항-CD200 항체의 전달이 면역 억제를 차단함으로써 면역 반응을 증폭시키는 구체예에서, 예로써, 작동체 기능이 부재하는 변이성 항-CD200 항체 역시 이용될 수 있다.

특히 유용한 구체예에서, 면역 반응을 강화시키는 치료는 단독으로 또는 앞서 언급된 면역조절 요법과의 조합으로, CD200에 결합하는 폴리펩티드의 투여이다. 따라서, CD200 길항물질(본 명세서에 기술된 항-CD200 항체 포함)은 공액된 단클론 항체(가령, 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 또는 토시투모맙(tositumomab))를 비롯하여, 단클론 항체(가령, 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 세툭시맙(cetuximab), 또는 베바시주맙(bevacizumab))와의 조합으로 이용될 수 있다.

더 나아가, 항-CD200 치료제와 화학치료제의 조합은 전체 종양 부담(tumor burden)을 감소시키고, 혈관신생(angiogenesis)을 제한하고, 종양 접근성(tumor accessibility)을 강화시키고, ADCC에 대한 취약성(susceptibility)을 강화시키고, 더욱 많은 종양 항원을 제공함으로써 증가된 면역 기능을 유도하고, 또는 T 세포 유인물질(attractant) LIGHT의 발현을 증가시키는데 특히 유용할 수 있다. 항-CD200 치료제가 다른 통상적인 항-신생물 작용제와의 조합으로, 동시에 또는 순차적으로 개체에 투여될 때, 항-CD200 치료제는 작용제 단독의 치료 효과를 강화시키는 것으로 보인다. 복합 항-종양 요법에 이용될 수 있는 제약학적 화합물에는 예로써, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 암사크린(amsacrine), 아나스트로졸(anastrozole), 아스파라기나아제(asparaginase), 베그(beg), 비칼루타마이드(bicalutamide), 블레오마이신(bleomycin), 부세렐린(buserelin), 부설판(busulfan), 캄포테신(camptothecin), 카페시타빈(capecitabine), 카보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 클라드리빈(cladribine), 클로드로네이트(clodronate), 콜히친(colchicine), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 시프로테론(cyproterone), 시타라빈(cytarabine), 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 다이엔에스트롤(dienestrol), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에스트라디올(estradiol), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposide), 엑세메스탄(exemestane), 필그라스팀(filgrastim), 플루다라빈(fludarabine), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 플루타마이드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine), 제니스테인(genistein), 고세렐린(goserelin), 수산화요소(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드(ifosfamide), 이마티닙(imatinib), 인터페론(interferon), 이리노테칸(irinotecan), 레트로졸(letrozole), 레우코보린(leucovorin), 레우프롤리드(leuprolide), 레바미솔(levamisole), 로무스틴(lomustine), 메클로로에타민(mechlorethamine), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 메게스트롤(megestrol), 멜팔란(melphalan), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 닐루타마이드(nilutamide), 노코다졸(nocodazole), 옥트레오티드(octreotide), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 파미드로네이트(pamidronate), 펜토스타틴(pentostatin), 플리카마이신(plicamycin), 포르피머(porfimer), 프로카르바진(procarbazine), 토뮤덱스(raltitrexed), 리툭시맙(rituximab), 스트렙토조신(streptozocin), 수라민(suramin), 타목시펜(tamoxifen), 테모졸로미드(temozolomide), 테니포시드(teniposide), 테스토스테론(testosterone), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 이염화티타노센(titanocene dichloride), 토포테칸(topotecan), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레티노인(tretinoin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine) 등이 포함된다.

이들 화학치료 항-종양 화합물은 그들의 작용 기전에 따라, 아래의 종류: 항대사물질, 예를 들면, 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 엽산염 길항물질 및 관련된 저해물질(메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 항증식성/세포분열 방지제, 예를 들면, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈)와 같은 천연 산물, 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론과 나벨빈(navelbine)과 같은 미소관 파괴인자, 에피디포도필로(epidipodophyllo) 독소(에토포시드, 테니포시드), DNA 손상 작용제(악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄포테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파마이드, 시톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파마이드, 멜팔란, 메클로로에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소요소, 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔, 탁소텔, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아마이드와 에토포시드(VPl 6)); 항생제, 예를 들면, 닥티노마이신(actinomycin D), 다우노루비신, 독소루비신(adriamycin), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(mithramycin)과 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 전체적으로 물질대사하고 아스파라긴을 자체적으로 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나아제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예를 들면, 질소 겨자(메클로로에타민, 사이클로포스파마이드와 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민과 메틸멜라민(헥사메틸멜라민과 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소요소(카르무스틴(BCNU)과 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카르바지닌(DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예를 들면, 엽산 유사체(메토트렉세이트); 백금 배위 복합체(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카르바진, 수산화요소, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타마이드, 닐루타마이드)와 아로마타아제(aromatase) 저해물질(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염과 트롬빈(thrombin)의 다른 저해물질); 섬유소 분해제(가령, 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 스트렙토키나아제와 우로키나아제), 아스피린, 디피리다몰(dipyridamole), 티클로피딘(ticlopidine), 클로피도그렐(clopidogrel), 압식시맙(abciximab); 이동방지제; 분비억제제(breveldin); 면역억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 면역조절제(탈리도마이드와 이의 유사체, 예를 들면, 레날리도마이드 (Revlimid, CC-5013)와 CC-4047 (액티미드)), 사이클로포스파마이드; 항-혈관신생 화합물(TNP-470, 제니스테인)과 성장 인자 저해물질(혈관 내피세포 성장 인자(VEGF) 저해물질, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 저해물질); 앤지오텐신 수용체 차단물질; 산화질소 공여자; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스투주맙); 세포 주기 저해물질과 분화 유도인자(트레티노인); mTOR 저해물질, 토포아이소머라아제 저해물질(독소루비신(adriamycin), 암사크린, 캄포테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신과 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나아제 저해물질; 미토콘드리아 기능장애 유도인자와 카스파제 활성인자; 염색질 파괴인자로 분류될 수 있다.

특정 구체예에서, 복합 항-혈관신생 요법에 이용되는 제약학적 화합물에는 (1) "혈관신생" 분자의 방출의 저해물질, 예를 들면, bFGF(염기성 섬유아세포 성장 인자); (2) 혈관신생 분자의 중화물질, 예를 들면, 항-βbFGF 항체; (3) 혈관신생 자극에 대한 내피세포 반응의 저해물질, 예를 들면, 콜라게나아제 저해물질, 기저 막 반전 저해물질, 혈관억제(angiostatic) 스테로이드, 진균-유래된 혈관신생 저해물질, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘(thrombospondin), D-페니실라민(penicillamine)과 골드 티오말레이트(gold thiomalate)와 같은 관절염 약, 비타민 D₃ 유사체, 알파-인터페론 등이 포함된다. 혈관신생의 추가적인 제안된 저해물질은 Blood et al., Biochim. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990); Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest, 59:44-51 (1988); U.S. Pat. No. 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744, 5,202,352와 6,573,256을 참조한다. 이에 더하여, 혈관신생을 저해하는데 이용될 수 있는 매우 다양한 화합물, 예를 들면, VEGF-매개된 혈관신생 경로를 차단하는 펩티드 또는 작용제, 엔도스타틴(endostatin) 단백질 또는 유도체, 안지오스타틴(angiostatin)의 리신(lysine) 결합 단편, 멜라닌 또는 멜라닌-촉진 화합물, 플라스미노겐 단편(가령, 플라스미노겐의 Kringles 1-3), 트로포닌 아단위(troponin subunit), 비트로넥틴(vitronectin) α_vβ₃의 길항물질, Saposin B로부터 유래된 펩티드, 항생제 또는 유사체(가령, 테트라사이클린, 또는 네오마이신), 디에노제스트(dienogest)-함유 조성물, 펩티드에 결합된 MetAP-2 저해 코어를 포함하는 화합물, 화합물 EM-138, 칼론(chalcone)과 이의 유사체, Naaladase 저해물질이 존재한다(참조: U.S. Pat. No. 6,395,718, 6,462,075, 6,465,431, 6,475,784, 6,482,802, 6,482,810, 6,500,431, 6,500,924, 6,518,298, 6,521,439, 6,525,019, 6,538,103, 6,544,758, 6,544,947, 6,548,477, 6,559,126, 6,569,845).

복합 요법의 성격에 따라, 항-CD200 항체의 투여는 다른 치료제의 투여 동안 및/또는 투여 이후에 지속될 수 있다. 항체의 투여는 단일 분량(single dose), 또는 복수 분량(multiple dose)으로 수행될 수 있다. 일부 사례에서, 항- CD200 항체의 투여는 통상적인 치료제에 최소한 수일 앞서 시작되고, 다른 사례에서, 투여는 통상적인 치료제의 투여 직전에 또는 투여 시점에 시작된다. 일부 사례에서, 항-CD200 항체는 다른 치료제 이후에 투여되거나, 또는 다른 치료제와 교대로 투여될 수 있다.

본 발명의 항체는 생체내에서 암 세포를 직접적으로 사멸시키거나 제거하는데 이용될 수 있다. 직접적인 사멸은 이런 치료를 요하는 개체에 항체(이는 세포독성제에 임의로 융합된다)의 투여를 필요로 한다. 이러한 항체가 암 세포 상에서 CD200을 인식하기 때문에, 상기 항체가 결합하는 임의의 이와 같은 세포는 파괴된다. 상기 항체가 암 세포를 사멸시키거나 제거하는데 단독으로 이용되는 경우에, 이런 사멸 또는 제거는 내인성 면역 기능, 예를 들면, CDC 및/또는 ADCC를 시작함으로써 달성될 수 있다. 항체가 이러한 방식으로 세포를 사멸시키는 지를 결정하는 검사법은 당업자의 이해 범위 내에 속한다.

따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 다양한 세포독성 화합물을 전달하는데 이용될 수 있다. 임의의 세포독성 화합물이 본 발명의 항체에 용합될 수 있다. 융합은 화학적으로 또는 유전적으로(가령, 단일의 융합된 분자로서 발현을 통하여) 달성될 수 있다. 세포독성 화합물은 생물학적 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드, 또는 소형 분자일 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 소형 분자의 경우에 화학적 융합이 이용되는 반면, 생물학적 화합물의 경우에 화학적 또는 유전적 융합이 이용될 수 있다.

세포독성 화합물의 무-제한적 실례에는 치료 약제, 방사선 방출 화합물, 식물, 진균 또는 세균 기원의 분자, 생물학적 단백질, 이들의 혼합물 등이 포함된다. 세포독성 약제는 세포내 작용 세포독성 약제, 예를 들면, 근거리, 높은 에너지 α-방사체를 비롯한 근거리 방사선 방사체일 수 있다. 효소 활성 독소와 이의 단편은 예로써, 디프테리아 독소 A 단편, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편 , 외독소 A(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래됨), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파-사크린(alpha-sacrin), 특정의 유동(Aleurites fordii) 단백질, 특정의 디안틴(Dianthin) 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAP, PAPII와 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 저해물질, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 저해물질, 젤로닌(gelonin), 미토길린(mitogillin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin)과 에노마이신(enomycin)에 의해 예시된다. 면역 독소의 효소 활성 폴리펩티드를 제조하는 절차는 WO84/03508과 WO85/03508에 기술된다. 특정의 세포독성 모이어티는 예로써, 아드리아마이신, 클로람부실, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 또는 백금으로부터 유래된다.

항체를 세포독성 작용제로 공액하는 절차는 기존 문헌에서 기술되었고, 당업자의 이해 범위 내에 속한다.

대안으로, 항체는 종양 부위에 국지화되면 여러 세포 직경의 사멸을 유도하는 높은 에너지 방사선 방사체, 예를 들면, γ-방사체인 ¹³¹I와 같은 방사성동위원소(radioisotope)에 결합될 수 있다(참조: S. E. Order, "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al. (eds.), pp 303-316 (Academic Press 1985)). 다른 적절한 방사성동위원소에는 ²¹²Bi, ²¹³Bi와 ²¹¹At와 같은 α-방사체 및 ¹⁸⁶Re와 ⁹⁰Y와 같은 β-방사체가 포함된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 CD200 결합 항체는 CD200을 통하여 백혈병 세포를 직접적으로 표적함으로써 CLL에서 면역 억제를 차단하는 이점을 제공한다. 구체적으로, 면역계 자극은 비장과 림프절로부터 CLL 세포의 소멸을 가능하게 할 수 있다. 본 출원인들은 B 세포를 단순히 표적하는 작용제(가령, 알렘투주맙(alemtuzumab))로 달성되는, 이들 미소환경으로부터 CLL 세포의 성공적인 제거에 관하여 아는 바가 없다. 대조적으로, CLL 반응성 T 세포는 이들 장기에 항체보다 더욱 용이하게 접근할 수 있다. 다른 구체예에서, 직접적인 세포 사멸은 CLL 세포에 항-CD200 Ab를 부착함으로써 달성된다.

본 발명의 조성물과 방법에 따라, 특히 유용한 구체예에서, 직접적인 세포 사멸 및 면역 반응의 Th1 프로필로의 구동의 조합은 암 치료에 특히 강력한 접근법을 제공한다. 따라서, 한 구체예에서, CD200에 결합하고 a) CD200과 이의 수용체 사이에 상호작용을 차단하고 b) CD200을 발현하는 암 세포를 직접적으로 사멸시키는 항체 또는 항체 단편이 환자에 투여되는 암 치료법이 제공된다. 암 세포가 사멸되는 기전에는 ADCC 및/또는 CDC; 독소와의 융합; 방사성라벨(radiolabel)과의 융합; 세포 사멸에 관여하는 생물학적 작용제, 예를 들면, 그랜자임(granzyme) B 또는 퍼포린(perforin)과의 융합; 세포독성 바이러스와의 융합; TNF-α 또는 IFN-α와 같은 사이토킨과의 융합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 대안적 구체예에서, 암 치료는 a) CD200과 이의 수용체 사이에 상호작용을 차단하고 b) 종양에 대항하는 세포독성 T 세포 또는 NK 세포 활성을 강화시키는 항체를 투여하는 단계를 필요로 한다. 세포독성 T 세포 또는 NK 세포 활성의 이와 같은 강화는 예로써, IL-2, IL-12, IL-18, IL-13, IL-5와 같은 사이토킨과 항체를 융합함으로써 달성될 수 있다. 이에 더하여, 이런 강화는 IMiD, 탈리도마이드, 또는 탈리도마이드 유사체와 같은 저해물질과의 조합으로, 항-CD200 항체의 투여에 의해 달성될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 암 치료는 (1) CD200과 이의 수용체 사이에 상호작용을 차단하고 (2) T 세포를 종양 세포로 유인하는 항체를 투여하는 단계를 필요로 한다. T 세포 유인(attraction)은 MIG, IP-IO, I-TAC, CCL21, CCL5 또는 LIGHT와 같은 케모킨(chemokine)과 Ab를 융합함으로써 달성될 수 있다. 또한, 화학치료제로 치료는 LIGHT의 원하는 상향 조절을 결과할 수 있다. 차단성 면역 억제 및 항체 표적화(antibody targeting)를 통한 종양 세포의 직접적인 사멸의 통합된 작용은 증가된 효능을 제공하는 독특한 접근법이다.

본 발명에 따른 항-CD200 항체는 진단 도구(diagnostic tool)로서 이용될 수도 있다. 생검 또는 암 세포 조직 샘플은 단독으로 또는 다른 작용제 또는 방법(가령, 화학치료제, 방사선 치료, 면역조절제 등)과의 조합으로, 항-CD200 치료의 효능을 예측하기 위하여 치료에 앞서 CD200 발현이 조사된다. 가령, 혈액암 환자로부터 획득된 혈액을 이용하여, CD200의 발현은 CLL 세포 상에서 적절한 암 세포 마커, 예를 들면, CD38과 CD19와의 조합으로 항-CD200 항체를 이용한 FACS 분석으로 암 세포에서 평가할 수 있다. 정상 B 세포에서 관찰되는 수준보다 최소한 1.4-배 높은 CD200 수준을 나타내는 환자가 항-CD200 항체로 치료를 위하여 선택될 수 있다. 다른 실례로써, 환자로부터 조직 샘플은 환자의 악성 세포와 정상 세포에서 CD200의 발현을 결정하기 위하여 항-CD200 항체로 염색될 수 있다.

본 발명의 항-CD200 항체를 진단 또는 예측 도구로서 이용하는 다른 실례에서, 악성 종양 환자로부터 생검이 획득되고, CD200의 발현은 항-CD200 항체를 이용한 FACS 분석에 의해 또는 항-CD200을 이용한 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의해 결정된다. 종양 세포가 상응하는 정상 조직과 비교하여 최소한 1.4-배 높은 수준으로 CD200을 발현하면, 암 환자는 면역조절 요법(항-CD200 치료를 포함하는 요법이 포함되지만 이에 국한되지 않음)에 대하여 선택된다. 정상 상태에서 CD200을 발현하지 않는 세포로부터 유래된 암의 경우에, 암 생검 상에서 임의의 탐지가능 CD200은 항-CD200 치료의 잠재적인 유용성을 지시한다. 면역조절 요법은 항-CD200 치료일 수 있지만, 환자의 면역계에 영향을 주는 임의의 다른 치료일 수도 있다. 적절한 면역조절 요법의 실례에는 T 세포 또는 항원 제시 세포의 음성 조절을 차단하는 작용제(가령, 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PDL-2 항체, 항-PD-1 항체 등)의 투여, 또는 T 세포의 양성 보조-자극(co-stimulation)을 강화시키는 작용제(가령, 항-CD40 항체 또는 항 4-1BB 항체)의 투여가 포함된다. 더 나아가, 면역조절 요법은 종양 세포로 적하된 세포독성 T 세포 또는 수상돌기 세포를 산출하는 불규칙 펩티드 또는 종양 세포 펩티드와 같은 암 백신, 또는 NK 세포 총수 또는 T-세포 활성을 증가시키는 작용제(가령, 단독으로, 또는 IMiD, 탈리도마이드, 또는 탈리도마이드 유사체와 같은 저해물질과의 조합으로 항-CD200 항체)의 투여, 또는 조절 T 세포 또는 형질세포양 수상돌기 세포를 격감시키는 작용제(가령, 단독으로, 또는 ONTAK와의 조합으로 항-CD200 항체)의 투여가 포함될 수 있다. T 세포 또는 수상돌기 세포 이동을 증가시키는 작용제, 예를 들면, SPARC를 차단하는 임의의 작용제와의 조합 역시 유익하다. 더 나아가, 면역조절 요법은 종양 세포, 환자 유래된 엑소좀(exosome) 종양 RNA 또는 종양 DNA, 종양 단백질 또는 종양 펩티드, 환자 유래된 열-충격 단백질(hsp's), 종양 항원으로 적하된 hsp's, 또는 다양한 수준에서 면역계를 자극하는 일반적인 어쥬번트, 예를 들면, CpG, Luivac, Biostim, Ribominyl, Imudon, Bronchovaxom 또는 선천성 면역계(innate immune system)의 수용체(가령, 톨 유사(toll like) 수용체)를 활성화시키는 임의의 다른 화합물로 적하된 수상돌기 세포와 같은 암 백신이 포함될 수 있다. 또한, 면역조절 요법에는 IL-2, GM-CSF와 IFN-감마와 같은 사이토킨으로 치료가 포함될 수 있다. 종양 환경 내에서 수상돌기 세포의 약화된 활성을 복구시키는 작용제, 예를 들면, MAP 키나아제 저해물질과의 조합 역시 고려된다.

한 구체예에서, 본 발명의 항체는 생체내에서 암 세포를 탐지하는데 이용될 수도 있다. 생체내 탐지는 항체를 표지하고, 표지된 항체를 개체에 투여하고, 이후 개체를 영상함으로써 달성된다. 본 발명에 따른 진단 영상(diagnostic imaging)에 유용한 라벨의 실례는 ¹³¹I, ¹¹¹In, ¹²³I, ^99mTc, ³²P, ¹²⁵I, ³H, ¹⁴C와 ¹⁸⁸Rh와 같은 방사성라벨(radiolabel), 플루오레세인(fluorescein)과 로다민(rhodamine)과 같은 형광 라벨, 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance) 활성 라벨, 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography. "PET") 스캐너에 의해 탐지될 수 있는 양전자 방출 동위원소(positron emitting isotope), 루시페린(luciferin)과 같은 화학발광체(chemiluminescer) 및 과산화물(peroxidase) 또는 인산분해효소(phosphatase)와 같은 효소 마커(enzymatic marker)이다. 근거리 방사선 방사체, 예를 들면, 경직장 프로브(transrectal probe)와 같은 근거리 탐지기 프로브에 의해 탐지되는 동위원소 역시 이용될 수 있다. 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 이들 반응물로 표지될 수 있다. 가령, 항체의 방사성표지(radiolabeling)에 관련된 기술은 Wensel and Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983)을 참조한다. 또한, D. Colcher et al., "Use of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts in Athymic Mice", Meth. Enzymol. 121: 802-816 (1986)을 참조한다.

본 발명에 따른 방사성표지된 항체는 시험관내 진단 검사에 이용될 수 있다. 항체, 이의 결합 부분, 프로브, 또는 리간드의 특이적인 활성은 반감기, 방사성 라벨의 동위원소 순도(isotopic purity) 및 라벨이 생물학적 작용제 내로 통합되는 방식에 좌우된다. 면역분석 검사에서, 일반적으로, 특이적인 활성이 높을수록 감도가 우수하다. 방사성 동위원소로 항체를 표지하는 절차는 당분야에 전반적으로 공지되어 있다.

방사성표지된 항체는 환자에 투여될 수 있는데, 여기서 상기 항체는 항체가 반응하는 항원을 보유하는 암 세포에 국지화되고, 예로써 감마 카메라(gamma camera)를 이용한 방사능 핵 스캔(radionuclear scanning) 또는 방출 단층촬영(emission tomography)과 같은 공지된 기술을 이용하여 생체내에서 탐지되거나 "영상"된다(참조: A. R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp. 65-85 (Academic Press 1985)). 대안으로, Pet VI로 명명된 양전자 방출 수평단면상 단층촬영 스캐너(positron emission transaxial tomography scanner)(Brookhaven National Laboratory)는 방사성라벨이 양전자(가령, ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O와 ¹³N)를 방출하는 경우에 이용될 수 있다.

형광단(fluorophore)과 발색단(chromophore) 표지된 생물학적 작용제는 당분야에 공지된 표준 모이어티로부터 제조될 수 있다. 항체와 다른 단백질이 최대 310 nm 파장을 갖는 광을 흡수하기 때문에, 이러한 형광 모이어티는 310 nm 초과, 바람직하게는, 400 nm 초과의 파장에서 실질적인 흡광을 나타내도록 선택된다. 다양한 적절한 형광단과 발색단은 Stryer, Science, 162:526 (1968) 및 Brand, L. et al., Annual Review of Biochemistry, 41 :843-868 (1972)에서 기술된다. 항체는 U.S. 특허 No. 3,940,475, 4,289,747과 4,376,110에 기술된 바와 같은 통상적인 절차에 의해 형광 발색단 기로 표지될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명에 따라, 치료적 처리의 진행 및/또는 효능을 모니터하기 위한 방법이 제시된다. 상기 방법은 면역조절제를 투여하는 단계 및 개체 내에서 CD200 수준을 최소한 2회 측정하여 이러한 치료의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 가령, CD200의 사전 처리 수준이 확정될 수 있고, 이러한 치료제의 최소한 1회 투여후, CD200의 수준이 다시 결정될 수 있다. CD200 수준에서 감소는 효과적인 치료를 지시한다. CD200 수준의 측정은 치료의 용량 또는 빈도를 증가시키기 위한 가이드로서 의사에 의해 활용될 수 있다. 당연히, CD200 수준이 직접적으로 모니터되거나, 또는 대안으로, CD200과 상관하는 임의의 마커가 모니터될 수 있다. 이러한 치료의 효능을 결정하는 다른 방법에는 암 세포의 탐지, 전체 림프구 계산(total lymphocyte count), 림프절 크기, 조절 T 세포의 총수, 세포내 또는 혈청 사이토킨 프로필, 또는 ELISPOT에 의한 측정에서 T 또는 B 세포에 의한 사이토킨의 분비가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

C. 다른 CD200 길항물질

본 발명에 이용되는 CD200 길항물질과 폴리펩티드 및/또는 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단과 치료 적용에 특히 적합하다. 따라서, CD200 길항물질 및 항-CD200 항체와 이의 이형은 질병의 진단과 예측 및 질병 진행의 모니터링에서 복합 요법을 비롯한 요법에 이용될 수 있다.

본 발명의 치료 구체예에서, 이중특이성 항체가 고려된다. 이중특이성 항체는 최소한 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 보유하는 단클론, 바람직하게는, 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명에서, 결합 특이성 중에서 하나는 세포(가령, 암 세포 또는 면역 세포) 상에서 CD200 항원에 대한 결합 특이성이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는, 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 아단위에 대한 결합 특이성이다.

이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업자의 이해 범위 내에 속한다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현(co-expression)에 기초하는데, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 보유한다(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 원하는 결합 특이성을 보유하는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 적절하게는, 이러한 융합은 힌지, CH2와 CH3 영역 중에서 최소한 일부를 비롯한 면역글로불린 중쇄 불변 도메인으로 달성된다. 이러한 면역글로불린 중쇄 융합 및 원하는 경우에, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 독립된 발현 벡터 내로 삽입되고, 적절한 숙주 생물체 내로 공동-형질감염된다. 이중특이성 항체를 산출하기 위한 현재 공지된 방법의 더욱 상세는 예로써, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986); WO 96/27011; Brennan et al., Science 229:81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994); Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)을 참조한다. 이중특이성 항체에는 교차-연결된 또는 이형공액(heteroconjugate) 항체 역시 포함된다. 이형공액 항체는 임의의 통상적인 교차-연결 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 적절한 교차-연결 작용제는 당분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 교차-연결 기술과 함께 U.S. Pat. No. 4,676,980에 기술된다.

재조합 세포 배양액으로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 분리하는 다양한 기술 역시 보고되었다. 가령, 이중특이성 항체는 루이신 지퍼(leucine zipper)를 이용하여 산출되었다(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos와 Jun 단백질로부터 루이신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해, 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결될 수 있다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고, 이후 재-산화되어 항체 이형이량체를 형성한다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에도 이용될 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 기술된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에 짝지음(pairing)이 불가능하도록 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H와 V_L 도메인은 다른 단편의 상보성 V_L과 V_H 도메인과 쌍을 이루도록 강요되고, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv(scFv) 이량체의 이용으로 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략 역시 보고되었다(참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)). 대안으로, 항체는 Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)에 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 간단히 말하면, 이들 항체는 항원-결합 영역의 쌍을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 분절(V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

D. 투여 방식과 제제

본 발명의 항체(순수한 항체, 표지된 항체, 독소에 융합된 항체 등인 지에 상관없이)의 투여 경로는 정맥내(intravenous), 복막내(intraperitoneal), 뇌내(intracerebral), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 안구내(intraocular), 동맥내(intraarterial), 척수강내(intrathecal), 흡입이나 또는 병소내 경로에 의해, 또는 서방 제제(sustained release system)에 의해, 공지된 방법, 예를 들면, 주사 또는 주입에 따른다. 적절하게는, 항체는 주입 또는 순간 주사(bolus injection)에 의해 연속적으로 투여된다. 이들 항체는 국소 또는 전신 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 항체는 제약학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)와의 혼합물로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 제제화와 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition에서 확인할 수 있다. 이러한 치료 조성물은 정맥내, 또는 코 또는 폐를 통하여, 바람직하게는, 액상 또는 분말 에어로졸(동결 건조된)로서 투여될 수 있다. 조성물은 또한, 원하는 경우에 비경구 또는 피하 투여될 수 있다. 전신 투여되는 경우에, 이러한 치료 조성물은 무균이고, 실질적으로 발연원이 없고, pH, 등장성(isotonicity)과 안정성의 관면에서 적당한 비경구 허용가능 용액에 용해되어야 한다. 가령, 제약학적 조성물은 인간 치료제로서 투여에 적합하도록 발열원 물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 이들 조건은 당업자에게 공지되어 있다.

이용하기 적합한 제약학적 조성물에는 본 발명의 하나이상의 항체가 그들의 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 내포된 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료 효과량(therapeutically effective amount)은 질병을 예방하거나, 완화시키거나 또는 상기 질환의 증상을 개선하는데 효과적인, 또는 치료되는 개체의 생존을 연장시키는데 효과적인 항체의 양을 의미한다. 치료 효과량의 결정은 본 명세서에 제공된 상세한 설명에 비추어, 당업자의 능력 범위 내에 속한다. 치료 효과량은 시험관내와 생체내 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

상기 상세한 설명은 항체에 관하지만, 일부 구체예에서 이들 항체로부터 유래된 폴리펩티드가 본 발명에 따라 이용될 수 있다.

생쥐 모형 및 CD200+ 세포 작제

Raji/PBL 모형

NOD.CB17-Prkdc<scid> 생쥐(Jackson Laboratory)는 0, 1, 5 또는 10 백만 PBL과 함께, 4x10⁶ RAJI 세포(ATCC)를 포함하는 200㎕ RPMI를 s.c 주입하였다. 군당 9마리 또는 10마리 생쥐가 포함되었다. PBL은 histopaque 농도 구배 상에서 250 ㎖ 전혈(whole blood)로부터 분리하고, 이후 0.9% 염화암모늄(ammonium chloride)을 이용하여 적혈구 세포 용해(red blood cell lysis)를 수행하였다. 종양 성장은 캘리퍼스(caliper)로 길이와 너비를 측정함으로써 주3회 모니터하였다. 종양 체적(tumor volume)은 길이 x 너비 x 너비/2에 기초하여 산정하였다.

PBL이 주입된 군 및 종양 세포 단독이 주입된 군 사이의 차이는 2-꼬리 짝없는 스튜던트 t-검증(2-tailed unpaired Student's t-test)으로 분석하였다. 유의한 차이(significant difference)는 Day 32부터, 5 또는 10 백만 PBL이 주입된 군에서 관찰되지만 1 백만 PBL이 주입된 군에서는 관찰되지 않았다.

Namalwa PBL 모형

NOD.CB17-Prkdc<scid> 생쥐(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)는 0, 2 또는 10 백만 PBL과 함께, 4x10⁶ Namalwa 세포(ATCC)를 포함하는 200㎕ RPMI를 s.c 주입하였다. 군당 9마리 또는 10마리 생쥐가 포함되었다. PBL은 histopaque 농도 구배 상에서 250 ㎖ 전혈(whole blood)로부터 분리하고, 이후 0.9% 염화암모늄(ammonium chloride)을 이용하여 적혈구 세포 용해(red blood cell lysis)를 수행하였다. 종양 성장은 캘리퍼스(caliper)로 길이와 너비를 측정함으로써 주3회 모니터하였다. 종양 체적(tumor volume)은 길이 x 너비 x 너비/2에 기초하여 산정하였다.

안정적인 CD200-발현 세포주의 산출

안정적인 CD200-발현 Raji와 Namalwa 세포주는 Virapower 렌티바이러스 발현 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 산출하였다. CD200 cDNA는 전방 프라이머 5'-GACAAGCTTGCAAGGATGGAGAGGCTGGTGA-3'(SEQ ID NO: 34) 및 후방 프라이머 5'-GACGGATCCGCCCCTTTTCCTCCTGCTTTTCTC-3'(SEQ ID NO: 35)을 이용한 RT-PCR로 일차 CLL 세포로부터 분리하였다. PCR 산물은 Gateway 입구 벡터 pCR8/GW/TOPO-TA 내로 클론하고, 개별 클론은 염기서열분석하였다. 정확한 서열을 보유하는 클론은 Gateway 기술(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 센스와 안티센스 방향 모두에서, 렌티바이러스 벡터 pLenti6/V5/DEST와 pLenti6/UbC/V5/DEST 내로 재조합시켰다. 이들 두 벡터 사이에 일차적인 차이는 CD200 발현을 구동하는데 이용되는 프로모터이다: pLenti6/V5/DEST는 인간 CMV 극초기 프로모터를 포함하는 반면, pLenti6/UbC/V5/DEST는 인간 유비퀴틴 C 프로모터를 포함한다.

고-역가, VSV-G 의사형 렌티바이러스 스톡(stock)은 제조업체에 의해 권장되는 293-FT 세포의 일시적인 공동-형질감염으로 생산하였다. Raji 또는 Namalwa 세포는 12 ㎍/㎖ Polybrene을 포함하는 1 ㎖의 성장 배지 내에서 10⁶개 세포를 재현탁시키고 1 ㎖의 렌티바이러스 스톡을 추가함으로써 형질도입하였다. 이들 세포를 37℃에서 하룻밤동안 배양한 이후, 바이러스를 포함하는 배지는 제거하고 4 ㎖의 새로운 배지로 교체하였다. 2일후, 감염된 세포는 유세포분석법(flow cytometry)으로 CD200 발현을 분석하였다. 모든 실험에서, 이들 세포의 ≥70%는 CD200+인 반면, CD200은 부모 세포주 및 음성 대조(안티센스 CD200) 바이러스로 형질도입된 세포에서 탐지되지 않았다.

CD200을 과다발현하는 클론 세포주를 분리하기 위하여, 감염된 세포는 13일 동안 블라스티시딘(blasticidin)으로 선택하였다. 이용된 블라스티시딘의 농도는 Raji 세포의 경우에 6 ㎍/㎖ 및 Namalwa 세포의 경우에 2 ㎍/㎖이었다. 이후, 96-웰 평판 내로 블라스티시딘-저항성 세포의 희석을 제한함으로써 안정적인 클론을 분리하였다. 클론은 PE-공액된 생쥐 항-인간 CD200(클론 MRC OX104, Serotec) 및 고성능 샘플채취장치(high throughput sampler)가 구비된 BD FACSCalibur을 이용한 유세포분석으로 96-웰 형식에서 선별하였다. 총 2000개의 Raji와 2000개의 Namalwa 클론을 선별한 이후, 최대 CD200 발현을 나타내는 클론은 통상적인 기술을 이용한 추가적인 특성화를 위하여 증폭하였다.

실시예 1

RAJI_CD200/PBL 모형에서 C2aB7의 인간화 변형의 효능

A) C2aB7의 인간화 변형이 생체내 종양 모형 내에서 그들의 효능을 유지하는 지를 평가하기 위하여, 키메라 C2aB7(U.S. 특허 출원 공개 번호 2005/0129690 참조)과 3가지 인간화 변형(C2aB7V4Vl, C2aB7V3Vl과 C2aB7V3V2) 및 음성 대조 항체 alxn4100을 RAJI-CD200/PBL 모형에서 조사하였다. CD200으로 형질도입된 RAJI 세포는 NOD.CB17-Prkdc<scid> 생쥐 내로 s.c. 주입하고, 키메라 또는 인간화 C2aB7 항체 또는 대조 항체 alxn4100(이는 종양 세포에 결합하지 않는다)의 존재 또는 부재에서 종양 성장을 감소시키는 PBL의 능력을 평가하였다. 항체는 먼저, 하기에 지정된 농도에서 종양 세포에 투여하고, 이후 2회/주 i.v 투여하였다. 아래의 군은 각 10마리 생쥐로 설정되었다:

1 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c.

2 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL

3 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ C2aB7

4 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ C2aB7V4V1

5 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ C2aB7V4V1

6 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ C2aB7V3V1

7 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ C2aB7V3V1

8 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL +5 ㎎/㎏ C2aB7V3V2

9 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ alxn4100

종양 길이와 너비는 주3회 측정하고, 종양 체적은 종양 길이* 너비*너비/2로 산정하였다. 도 18에서는 예상된 바와 같이, 종양 세포 상에서 CD200 발현이 면역 세포가 종양 성장을 감소시키는 것을 예방한다는 것을 보여준다. C2aB7의 모든 인간화 변형은 20 ㎎/㎏의 용량에서 최대 97%까지 종양 성장을 차단하였다. 대조 항체 alxn4100은 종양 성장에 영향을 주지 않았다. 이들 데이터는 모든 인간화 항체가 종양 성장을 차단하는데 있어 매우 유효하다는 것을 증명한다.

B) CD200에 의한 면역 회피(immune evasion)

인간 면역계가 여러 암 유형에 대한 면역 반응을 발생시킬 수 있긴 하지만, 상기 반응은 아마도, 종양에 의한 면역계의 음성 조절(negative regulation)을 통한 면역 회피로 인하여 대부분의 환자에서 암을 제거하는데 불충분하다. 면역-억제성 분자 CD200은 검사된 모든 환자(n=80)에서 만성 림프성 백혈병(CLL) 세포 상에서 1.5-5.4-배 상향 조절되는 것으로 확인되었다. CD200과 이의 수용체의 상호작용은 혼성 림프구 반응에서 사이토킨 프로필을 Th1에서 Th2로 변화시키고, 종양-특이적 작동체 T 세포 면역을 방해하는 것으로 생각되는 조절 T 세포의 유도를 결과하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서, 종양 세포 상에서 CD200 발현이 면역 회피에서 중요한 역할을 수행하여 이종이식편 hu/SCID 생쥐 모형에서 면역계에 의한 종양 세포의 제거를 예방하는 지의 여부 및 길항성 항-CD200 항체로 치료가 상기 모형에서 종양 성장에 영향을 주는 지의 여부를 평가하였다.

인간 비-호지킨 림프종 세포주 RAJI와 Namalwa는 인간 CD200으로 형질도입하고, 인간 말초혈 림프구(PBMC)와 함께 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입하였다. CD200 발현 종양 세포가 주입된 생쥐에서 종양 성장은 시간의 흐름에서, CD200을 발현하지 않는 종양 세포가 주입된 생쥐에서 종양 성장과 비교하였다. 차후 실험에서, 생쥐는 정맥내 주입으로, 키메라 또는 인간화 항-CD200 항체(용량 범위 1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏)로 처리하였다. 치료는 종양 세포 주입 직후에 또는 7일후에 시작하였다.

PBMC는 CD200 발현의 부재에서 최대 75%까지 RAJI 또는 Namalwa 종양 성장을 감소시켰다. 대조적으로, CLL에 필적하는 수준에서 CD200을 발현하는 RAJI 또는 Namalwa 종양의 성장은 PBMC에 의해 감소되지 않았다. 5 ㎎/㎏에서 항-CD200 항체의 투여는 치료가 종양 세포 주입후 7일 시점에 시작되는 경우에도 연구 과정 동안 거의 완전한 종양 성장 저해(1/10 생쥐에서 소형 종양이 발생하였다)를 결과하였다.

종양 세포 상에서 인간 CD200의 존재는 종양 세포를 제거하는 인간 림프구의 능력을 저해한다. 길항성 항-CD200 항체로 CD200-발현 종양의 치료는 종양 성장을 저해하는데, 이는 CLL에 대한 유망한 접근법으로서 항-CD200 치료의 잠재력을 지시한다.

C) C2aB7Gl vs C2aB7G2/G4 구조체의 효능

작동체 기능이 없는 항-CD200 항체(하기에 기술된 C2aB7의 G2/G4 융합 구조체)는 G1 구조체와 동등하게 또는 이보다 더욱 유효한 지를 평가하기 위하여, G1과 G2/G4 변형 및 C2aB7의 인간화 변형(alxn5200)을 Raji_CD200/PBL 모형에서 검사하였다. 앞서 기술된 바와 같이 CD200으로 형질도입된 RAJI 세포는 NOD.CB17- Prkdc<scid> 생쥐 내로 s.c 주입하고, 키메라 항-CD200 항체 c2aB7Gl(c2aB7), c2aB7G2/G4 또는 인간화 변형 hC2aB7V3VlGl(V3V1), 또는 hC2aB7V3V2Gl(V3V2) 또는 대조 항체 aIxn4100의 존재 또는 부재에서 종양 성장을 감소시키는 PBL의 능력을 평가하였다. 항체는 먼저, 하기에 지정된 농도에서 종양 세포에 투여하고, 이후 2회/주 i.v 투여하였다. 아래의 군은 각 10마리 생쥐로 설정되었다

1 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c.

2 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL

3 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ hV3V2-G1

4 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c.+ 6 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ alxn 5200

5 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 2.5 ㎎/㎏ alxn 5200

6 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 1 ㎎/㎏ alxn 5200

7 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ chC2aB7G2/G4

8 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ chC2aB7G2/G4

9 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 2.5 ㎎/㎏ chC2aB7G2/G4

10 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 1 ㎎/㎏ chC2aB7G2/G4

11 군: 4 x 10⁶ RAJI_CD200 s.c. + 6 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ alxn4100

종양 길이와 너비는 주3회 측정하고, 종양 체적은 종양 길이* 너비*너비/2로 산정하였다. 도 19에서는 예상된 바와 같이, 종양 세포 상에서 CD200 발현이 면역 세포가 종양 성장을 감소시키는 것을 예방한다는 것을 보여준다. 하지만, 항-CD200 항체의 추가는 종양 체적을 최대 100 %까지 감소시켰다. 20 ㎎/㎏ C2aB7G1이 6/10 생쥐에서 소형 종양의 성장을 유도하는 반면, 20 ㎎/㎏ C2aB7G2/G4로 치료된 생쥐 군에서는 1마리에서만 종양이 발생하였는데, 이는 G2/G4 변형이 Gl 변형보다 우수하거나 최소한 동등한 효능을 유도할 수 있음을 암시한다. 인간화 변형을 비롯한 모든 항-CD200 항체는 5 ㎎/㎏에서 종양 성장을 완전히 차단하였다. 대조 항체로 치료는 종양 성장을 감소시키지 않았다. 이들 데이터는 C2aB7의 G2/G4 변형이 CD200 발현 종양의 종양 성장을 차단시키는데 매우 유효하다는 것을 증명한다. 이들 데이터는 C2aB7의 인간화 변형이 상기 모형에서 종양 성장을 차단하는데 매우 유효하다는 것을 더욱 뒷받침한다.

D) G2/G4 구조체의 산출

플라스미드는 2 단계로 변형하였는데, 먼저 인간 CH1 영역 내에서 종결 코돈(stop codon)을 통과하는 Age I 부위에서부터 SV40 폴리 A 신호 이후에 배치된 BamH I 부위까지 IgGl 영역을 치환하였다. C2aB7-6과 cC7 G2G4(L-SIGN 항체)는 Age I과 BamH I으로 절단하고, C2aB7-6은 CIP로 처리하였다. C2AB7-6로부터 10,315 bp 단편 및 cC7 G2G4로부터 1752 bp 단편은 전기영동(electrophoresis)과 겔 추출(gel extraction)로 정제하였다. 이들 단편은 결찰하고, XLl Blue 대장균(E. coli) 내로 전기천공하고, LB/carb/gluc 평판 상에 도말하였다. 콜로니는 용액에서 성장시키고, DNA는 Qiagen miniprep 칼럼을 이용하여 분리하였다. IgGl 단편에 대조적으로, IgG2G4 Age I/BamH I 단편의 존재는 Pvu II 절단으로 결정하였는데, 이는 1419 bp의 하나의 밴드에 대조적으로 267과 1152 bp의 2개의 밴드의 존재를 결과한다. 클론 21은 추가 이용을 위하여 선택하였다.

가변 영역의 말단에서부터 Age I 부위까지 CH1 영역의 나머지 부분은 중복 PCR을 이용함으로써 IgG2/G4 양식으로 산출하였다. Age I 부위를 통과하는 CH1 영역의 시작을 포함하는 PCR 단편은 플라스미드 cC7 G2G4의 생산에서 미리 산출되었다. 프라이머 C7mhHF(TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCC, SEQ ID NO:1)와 Rev Age Pri(GGGCGCCTGAGTTCCACGAC, SEQ ID NO: 2)는 142 bp 단편을 산출하는 주형으로서 G2G4 63L1D를 이용한 PCR 반응에 이용되었다. 프라이머 C2aB7 rev(GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAAACTGTGAGAGTGGTGC, SEQ ID NO: 3)와 lacpri(GCTCCCGGCTCGTATGTTGTGT, SEQ ID NO: 4)는 대략 1250 bp의 단편에서 뮤린 중쇄 가변 영역(및 상류 물질)을 산출하는 주형으로서 Fab C2aB7과 함께 이용하였다. 이들 단편은 전기영동과 겔 추출로 정제하고, 프라이머 Rev Age Pri(GGGCGCCTGAGTTCCACGAC, SEQ ID NO: 2)와 LeadVHpAX (ATATGAAATATCTGCTGCCGACCG, SEQ ID NO: 5)를 이용한 중복 PCR에 이용하여 558 bp 단편을 산출하고, 상기 단편은 PCR 정제 칼럼에서 정제하였다. 상기 558 bp 단편과 클론 21은 Xho I과 Age I로 절단하여 458 bp 단편을 산출하고, 상기 단편은 전기영동과 겔 추출로 정제하였다. 클론 21 역시 Xho I과 Age I로 절단하고, CIP로 처리하고, 11.6 kb 단편은 전기영동과 겔 추출로 정제하였다. 이들 단편은 결찰하고 XL1 Blue 대장균(E. coli) 내로 전기천공하고 LB/carb/gluc 평판 상에 도말하였다. 클론 C2aB7G2G4.11은 Pvu II로 절단되면 예상된 제한 단편을 갖는 것으로 밝혀졌다.

최종 구조체 C2AB7G2G4.1l은 염기서열분석하였다. 경쇄의 TAA 종결 코돈은 6개의 추가 아미노산이 상기 경쇄의 카르복시 말단에 부가되도록 서열 TCA로 돌연변이되었다. 이는 C2AB7G2G4.11의 모체인 IgGl 변형 클론 C2AB7-6 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. G2G4 구조체를 포함하는 항체는 도 10, 11, 12, 13, 15에서 도시된다.

실시예 2

암 세포 상에서 CD200 발현

A. CLL 환자에서 CD200 상향 조절의 결정

15명의 CLL 환자로부터 림프구는 FITC-공액된 항-CD5(e-bioscience), APC-공액된 항-CD 19(e-bioscience) 및 PE-공액된 항-CD200(Serotec)으로 염색하였다. 건강한 공여자로부터 림프구 역시 동일하게 염색하였다. CD5+CD19+ 세포 상에서 CD200 발현을 측정하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, CD200 발현 수준이 CLL 환자 샘플 간에 변하긴 하지만, 모든 CLL 샘플은 정상 B 세포 상에서 CD200 발현과 비교하여 상승된 수준(1.6-4-배 범위)의 CD200 발현을 보였다. 상승된 수준의 CD200 발현을 보이는 CLL 환자는 본 명세서에 기술된 방법에 따라 항-CD200 치료를 위하여 선택되었다.

B. 암 세포주 상에서 FACS 분석

CD200 발현은 흑색종 암 환자, 전립선암 환자, 아교모세포종 환자, 별아교세포종 환자, 신경아세포종 환자, 난소암 환자, 폐암 환자 및 신장암 환자로부터 한 무리의 NCI60 세포주를 이용한 FACS 분석으로 평가하였다. C2aB7은 제조업체(Invitrogen)의 지시에 따라 Zenon-Alexa488로 표지하였다. 5 십만 내지 1 백만 세포는 1 ㎍의 표지된 항체로 20분 동안 염색하고, 이후 PBS 세척을 수행하였다. 세포 염색은 FACSCalibur(Becton Dickinson)을 이용하여 평가하였다. 항체-표지된 세포의 염색은 표지되지 않고 남아있는 샘플과 비교하고, 염색/비염색의 비율을 측정하였다. 도 21에서, 1보다 크지만 2보다 작은 비율은 +/-로서 표시되고, 2 내지 3의 비율은 +로 표시되고, 3 내지 10의 비율은 ++로 표시되고, >10은 +++로 표시된다. 아교모세포종, 별아교세포종, 전립선암 또는 폐암에 대하여 검사된 세포주 중에서 어느 것도 CD200을 발현하지 않았고, 아래 목록에 기재되지 않는다. 4/5 흑색종 세포주, 2/2 난소암 세포주, 2/3 신장 세포주, 2/2 신경아세포종 세포주 및 1/3 유방암 세포주는 세포 표면 상에서 탐지가능 수준에서 CD200을 발현하는데, 이는 고형 종양이 CD200을 면역 회피 기전(immune escape mechanism)으로서 이용할 수 있음을 암시한다.

C. 환자 샘플 상에서 RT-QPCR

CD200이 세포주에서뿐만 아니라 일차 환자 샘플에서도 상향 조절되는 지를 검증하기 위하여, 일차 환자 샘플 상에서 RT-QPCR 및 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 난소암과 흑색종 환자로부터 RNA 샘플은 Cytomix로부터 구입하였다. cDNA를 준비하고, 샘플은 10 ng/㎖ 효모 RNA에서 1:100과 1:1000 희석하였다. 샘플은 ABL에 의해 제공된 CD200 검사 Hs00245978_㎖를 이용한 QPCR을 수행하였다. 18S 정규화(normalization)를 위하여, 1:10,000 희석된 샘플로 18S 검사(ABI)를 수행하였다. 각 희석은 중복 수행되었다. 난소암과 흑색종 환자 샘플은 CLL 환자 샘플과 함께, 18S에 정규화시키고, 이후 정상적인 PBL에 상대적인 발현 배수를 측정하였다. 도 22에서는 난소암 샘플 상에서 CD200 발현을 도시한다. 장액(serous)/전이성 장액(serous metastatic)/유두상 장액(papillary serous)은 정상 PBL보다 대략 10-배 내지 20-배 높은 CD200의 최대 발현을 나타내는 것으로 관찰되었다. CD200 발현은 자궁내막양(endometroid), 점액성(mucinous)과 투명한 세포 샘플에서 상대적으로 낮은데, 정상적인 난소 발현 수준(정상적인 PBL보다 1-5배) 이하이었다. 도 23에서는 여러 흑색종 전이 샘플: 공장(jejunum), 소장, 림프절, 폐, 피부와 뇌)의 CD200 발현 수준을 도시한다. 이들 샘플 중에서 일부는 매치된 정상/종양이고, 번호(-1 쌍 또는 -2 쌍)로 표시된다. 매치된 정상이 없는 다른 샘플 역시 비교를 위하여 제조하였다. 공장 샘플은 정상 장기보다 현저하게 높은 CD200 발현 수준을 보였는데, 전이성 샘플은 정상 공장보다 대략 4-7-배 높았다.

D. 일차 환자 샘플에서 면역조직화학

IHC는 2개의 동결된 흑색종 환자 샘플(LifeSpan)에서 수행하였다. D1B5와 C2aB7 Fab 단편이 염색에 이용되었다. IgGl 항체는 아이소타입 대조(isotype control)로서 이용되었다. 일차 항체의 결합은 항-생쥐 2차 항체와 DAB 색원체(chromagen)로 탐지하였다.

도 24에 도시된 바와 같이, 조사된 양쪽 흑색종 샘플 모두 항-CD200 항체에 의한 강한 막 염색을 보이지만, 아이소타입 대조에 의한 염색을 보이지 않았다. 정상 피부 조직은 CD200 염색을 보이지 않았다. 이들 데이터는 CD200이 흑색종과 난소암 세포주 상에서 뿐만 아니라 일차 환자 샘플 상에서 상향 조절된다는 것을 증명한다.

E. 면역억제성 분자 CD200의 상향 조절을 통한 흑색종과 난소 종양 세포의 면역 회피

면역 회피는 암 진행의 중요한 특징이다. 종양은 복수의 기전으로 면역계를 회피할 수 있는데, 이들 각각은 면역요법(immunotherapy)에 상당한 장애를 유발한다. 새롭고 더욱 효과적인 형태의 면역요법을 실행하는 데에는 이들 과정 및 전체 암에서 이들의 유사성과 차이에 관한 이해가 요구될 것이다. 본 출원인들은 면역억제성 분자 CD200이 만성 림프성 백혈병 세포 상에서 상향 조절된다는 것을 이미 확인하였다. CD200의 존재는 효과적인 세포독성 T 세포 반응에 필요한 Th1 사이토킨 생산을 하향 조절한다. 본 출원인들은 동물 모형에서, 인간 종양 세포에 의한 CD200 발현이 인간 림프구가 상기 종양을 거부하는 것으로 예방하고, 길항성 항-CD200 항체로 치료가 종양 성장을 저해한다는 것을 증명하였다. 본 연구에서는 CD200 상향 조절이 다른 암에서 발견되는 지의 여부 및 이들 암 세포 상에서 CD200 발현이 면역 반응에 영향을 주는 지의 여부를 평가하였다.

상대적인 CD200 메시지 수준(message level)은 난소 선암종(ovarian adenocarcinoma)(장액성/전이성 장액성/유두상 장액성, 자궁내막양, 점액성과 투명한 세포) 및 악성 흑색종 전이성 환자 샘플에서 RT-QPCR로 정량하였다.

CD200의 세포 표면 발현은 정상 피부와 정상 난소와 비교하여, 2명의 흑색종과 3명의 난소 암종(장액) 환자 동결된 조직 샘플에서 IHC로 평가하였다. 흑색종 암 세포주 SK-MEL-5, SK-MEL-24와 SK-MEL-28 및 난소암 세포주 OV-CAR-3의 세포 표면 상에서 CD200 발현은 PE-표지된 항-CD200 항체를 이용한 FACS 분석으로 평가하였다. 림프구 반응물 내에 혼성의 사이토킨 프로필에 대한 CD200-발현 암 세포주의 효과는 동종이계 인간 T 세포를 포함하는 인간 단핵구-유래된 수상돌기 세포의 배양액에 이들 세포를 추가함으로써 평가하였다. 사이토킨 생산(Th1의 경우에 IL-2와 IFN-γ, Th2의 경우에 IL4와 IL1O)은 상층액 내에서 ELISA로 탐지하였다.

정량적 PCR은 장액성 난소 선암종 샘플에서, 정상 PBL보다 최대 20배 및 정상 난소보다 최대 4배 높은 CD200 발현 수준을 보였다. CD200 발현은 자궁내막양, 점액성과 투명한 세포 난소 선암종 샘플에서 정상 난소 수준 이하이었다. 공장으로 악성 흑색종 전이에서, CD200 발현 수준은 정상 샘플보다 현저하게 높은 것으로 관찰되었다. 악성 흑색종 폐 전이에서, 2/6는 정상 샘플보다 높은 CD200 발현을 보였다.

IHC는 양쪽 흑색종 환자의 악성 세포에서 강하고 특이적인 막-연관된 CD200 염색을 보였다. 정상 피부 샘플은 내피 세포의 희미한 염색을 보였다. 3명의 난소암 환자 중에서, 1명은 강한 CD200 염색을 보이고, 1명은 중간 정도의 양성이었고, 1명은 희미하게 염색된 종양 세포의 부분집합을 보였다. 3가지 사례 모두에서, 스트로마(stroma)는 강한 염색을 보였다.

CD200은 흑색종 암 세포주 SK-MEL-24와 SK-MEL-28의 세포 표면 및 난소암 세포주 OV-CAR-3의 세포 표면 상에서 고도로 발현되고, 흑색종 세포주 SK-MEL-5 상에서 중간 정도로 발현된다. 혼성 림프구 반응물에 이들 세포 중에서 하나의 추가는 Th1 사이토킨의 생산을 하향 조절하는 반면, CD200을 발현하지 않는 세포주는 그렇지 않았는데, 이는 직접적인 상관관계를 증명한다. 배양 동안 길항성 항-CD200 항체의 포함은 이런 효과를 상쇄시켰다.

흑색종과 난소 종양 세포는 CD200을 상향 조절하여 효과적인 면역 반응을 잠재적으로 억제할 수 있다. 길항성 항-CD200로 치료는 면역계가 종양 세포에 대항하는 효과적인 세포독성 반응을 나타낼 수 있도록 하는 것으로 생각된다.

F. 혼성 림프구 반응물 내에서 사이토킨 프로필에 대한 CD200-발현 암 세포주의 효과

사이토킨 반응을 TH1 반응(IL-2, IFN-γ)에서 Th2 반응(1L-4, IL-10)으로 전환시키는, CD200을 과다발현하는 세포의 능력은 혼성 림프구 반응물에서 평가하였다. CD200-발현 세포의 공급원으로써, CD200 형질감염된 세포 또는 CD200 양성 암 세포주로부터 세포가 이용되었다.

혼성 림프구 반응물은 IL-4, GM-CSF와 IFN-γ 및 1x10⁶개 반응자 세포(responder cell)를 이용하여 인간 말초 단핵구로부터 성숙된 250,000 수상돌기 세포를 이용하여 24 웰 평판에 공급하였다. 반응자 세포는 Ficoll을 이용하여 말초혈(peripheral blood)로부터 정제된 T 세포 농축된 림프구이었다. T 세포는 조직 배양 플라스크 내에서 1시간 동안 이들 세포를 배양하고, 비-부착성 세포 분획물을 채취함으로써 농축하였다. 흑색종 암 세포주 SK-MEL-1, SK-MEL-24, SK-MEL-28, 난소암 세포주 OVCAR3 및 양성 대조로서 비-호지킨 림프종 세포주 Namalwa 또는 일차 CLL 세포로부터 500,000개 세포를 30 ㎍/㎖ 항-CD200 항체의 존재 또는 부재에서 수상돌기 세포에 추가하였다. 상층액은 48시간과 68시간후 회수하고, 사이토킨의 존재를 분석하였다.

조직 배양 상층액에서 관찰되는 IL-2, IFN-γ와 IL-10과 같은 사이토킨은 ELISA를 이용하여 정량하였다. 각 사이토킨에 대한 매치된 포획과 탐지 항체 쌍은 R+D Systems(Minneapolis, MN)로부터 구입하고, 재조합 인간 사이토킨을 이용하여 각 사이토킨에 대한 표준 곡선(standard curve)을 산출하였다. 항-사이토킨 포획 항체는 평판 상에서 PBS 내에 최적 농도로 표면을 덮었다. 하룻밤 배양후, 이들 평판은 세척하고 1% BSA와 5% 수크로오스를 포함하는 PBS로 1시간 동안 차단하였다. 0.05% Tween을 포함하는 PBS로 3회 세척후, 1% BSA를 포함하는 PBS에서 2배 또는 10배 희석된 상층액을 추가하였다. 포획된 사이토킨은 적절한 비오틴화된 항-사이토킨 항체로 탐지하고, 이후 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase) 공액된 스트렙타비딘(streptavidin)과 SigmaS 기질(substrate)을 추가하였다. 현색(color development)은 ELISA 평판 판독기(Molecular Devices)로 평가하였다.

도 25A에 도시된 바와 같이, 높은 CD200 발현을 나타내는 세포주(MEL-24, MEL-28, OVCAR-3)의 존재는 Th1 사이토킨, 예를 들면, IL-2와 IFN-γ의 하향-조절을 결과하였다. 대조적으로, MEL-1(낮은 CD200 발현) 또는 Namalwa(CD200 발현 없음)의 추가는 사이토킨 프로필에 영향을 주지 않았다. 50 ㎍/㎖에서 항-CD200 항체 hB7VH3VL2의 추가는 Th1 반응을 완전히 회복시켰는데(도 25B), 이는 흑색종 또는 난소암 환자의 항-CD200 항체 치료가 치료적으로 유익함을 지시한다.

실시예 3

C2aB7-G1과 이의 유도체에 의한 활성화된 T 세포의 제거

항-CD200 치료가 CD200을 발현하지 않는 종양 세포를 이용한 암 모형에서 효과를 나타내는 지를 평가하기 위하여, Namalwa 세포와 인간 PBL을 NOD/SCID 생쥐 내로 주입하고, 이들 생쥐는 아래에 개설된 바와 같이 치료하였다. 상기 모형에서, CD200은 CD200을 자연적으로 발현하는 면역 세포, 예를 들면, B 세포와 여포성(follicular) T-보조 세포 상에만 존재한다.

군 설계:

10마리 동물/군

1 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c.

2 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL

3 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ hV3V2-G1

4 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ hV3V2-Gl

5 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL + 2.5 ㎎/㎏ hV3V2-Gl

6 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 4 x 10⁶ PBL

7 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ chC2aB7-G2G4

8 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL + 5 ㎎/㎏ chC2aB7-G2G4

9 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 1O⁶ PBL + 2.5 ㎎/㎏ chC2aB7-G2G4

10 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 4 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ chC2aB7-G2G4

11 군: 4 x 10⁶ Namalwa s.c. + 8 x 10⁶ PBL + 20 ㎎/㎏ alxn4100

상기 용량의 l/10은 주입 혼합물 내에 포함되었다. 차후 투약은 3주 동안 2x/주(week) i.v.이었다.

종양 길이(L)와 너비(W)는 3회/주(week) 측정하고, 종양 체적은 L*W*W/2로 산정하였다. 도 26에서는 앞서 확립된 바와 같이, 인간 PBL과 Namalwa 세포의 동시 주입이 종양 성장을 저해한다는 것을 도시한다. PBL-매개된 종양 성장 저해에 대한 chC2aB7-G2G4의 효과는 관찰되지 않았다. 대조적으로, ALXN5200(hB7VH3VL2-Gl)의 투여는 PBL 매개된 종양 성장 저해를 차단하였다. 종양 세포 상에서 CD200의 부재에서는 작동체 기능을 매개하는 항체, 예를 들면, PBL 개체군에서 핵심적인 작동체 세포인 Gl 구조체로 항-CD200 항체 치료가 배제되는 것으로 보인다. 이들 데이터는 작동체 기능이 없는 항체가 이용될 때와 비교하여 작동체 기능이 있는 항체가 이용될 때, 항-CD200 암 치료가 덜 효과적이라는 것을 암시한다. 하지만, 작동체 기능이 있는 구조체를 이용한 항-CD200 치료는 면역 세포의 제거가 바람직한 상황, 예를 들면, 이식 환경 또는 자가면역 질환에서 치료적으로 유익할 수 있다.

실시예 4

hB7VH3VTL2에 의한 T 세포 사멸

작동체 기능을 매개하는 불변 영역을 포함하는 항-CD200 항체(가령, G1)와 함께, 활성화된 T 세포의 배양이 T 세포의 사멸을 유도하는 지를 평가하기 위하여, T 세포는 활성화시키고 아래에 기술된 바와 같이 설정된 사멸 검사를 수행하였다.

A) CD3+ T 세포 분리

인간 말초혈 림프구(PBL)는 Accuspin™System을 이용한 헤파린화된 전혈의 밀도 기울기 원심분리(density gradient centrifugation)로 정상적인 건강한 지원자로부터 획득하였다. 15 ㎖의 Histopaque-1077(Sigma, St. Louis, MO; cat# H8889)을 각 Accuspin 튜브(Sigma, St. Louis, MO; car# A2055)에 추가하고, 상기 튜브는 이후, Histopaque가 프릿(frit)을 통과할 수 있도록 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 30 ㎖의 전혈은 프릿 위에 층을 만들고, 튜브는 브레이크(brake) 없이 실온에서 15분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. PBL 접촉면은 회수하고, 단핵 세포는 2% 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 PBS(Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; cat# F-0500-D)에서 2회 세척하고 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. CD3+ T 세포는 제조업체의 지시에 따라, HTCC-5 칼럼(R&D Systems) 통과로 분리하였다. 용출된 세포는 세척하고, 계산하고, 5% 열-불활성화된 단일 공여자 혈청, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 재현탁시켰다.

B. 평판-결합된 mOKT3으로 활성화

12-웰 평판(Falcon)의 웰은 PBS에 희석된 10 ㎍/㎖ mOKT3(Orthoclone)과 함께 4℃에서 하룻밤 배양으로 표면을 덮었다. 잔류 항체는 제거하고, 이들 평판은 PBS로 부드럽게 씻어냈다. 앞서 기술된 바와 같이 분리되고 정제된 CD3+ T 세포는 5% 열-불활성화된 단일 공여자 혈청, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 2x10⁶/웰의 최종 농도로 이들 평판에 추가하였다. 세포는 5% CO₂를 포함하는 습식 배양기(humidified incubator) 내에서 37℃에서 72시간 동안 유지시켰다.

C. mOKT3-활성화된 CD3+ 표적 세포의 ⁵¹ 크롬 표지화

배양 기간의 종결 시점에서, mOKT3-활성화된 CD3+ 세포를 회수하고, 세척하고, 혈청이 없는 RPMI 1640에서 10⁷개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포는 37℃에서 2시간 동안 125 μCi의 ⁵¹크롬(Perkin Elmer, Billerica, MA)/10⁶개 세포의 추가로 크롬산염 처리하였다. 표지된 세포는 회수하고, 5% 열-불활성화된 단일 공여자 혈청을 포함하는 RPMI에서 세척하고, 동일한 매체 내에서 2x10⁵개 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다.

D. 자기조직 NK 작동체 세포의 제조

동일한 개체로부터 인간 말초혈 림프구(PBL)는 앞서 기술된 바와 같이 밀고 기울기 원심분리로 획득하였다. PBL 접촉면은 회수하고, 단핵 세포는 2% 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 PBS(Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; cat# F-0500-D)에서 2회 세척하고 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. CD56+ 세포는 제조업체의 지시에 따라, 항-CD56-공액된 자성 비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, Cat # 120-000-307) 위에서 양성 선택(positive selection)으로 분리하였다. 용출된 세포는 세척하고, 계산하고, 5% 열-불활성화된 단일 공여자 혈청, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 1.3x10⁶개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포는 3 ㎖의 동일한 매체 내에서 4x10⁶개 세포/웰의 최종 농도로 5% CO2를 포함하는 습식 배양기 내에서 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양 기간의 종결 시점에서, 이들 세포는 회수하고, 세척하고, 계산하고, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes, 2 x 10^-5M 2-메르캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 혈청-없는 RPMI에서 재현탁시켰다.

E. ADCC 검사

앞서 기술된 바와 같이 준비된 ⁵¹Cr-표지된 mOKT3-활성화된 CD3+ 표적 세포는 96-웰 평판의 웰 내에서 50 ㎕에 10⁴개 세포/웰로 분포시켰다. CD56+ 작동체 세포는 수집하고, 세척하고, 계산하고, 2.5x10⁶개 세포/㎖(25:1의 작동체 : 표적 세포 비율의 경우에) 또는 10⁶개 세포/㎖ (10:1의 작동체 : 표적 세포 비율의 경우에)로 재현탁시키고, 표적 세포를 포함하는 웰에 분포시켰다(100 ㎕/웰). 항-CD200 항체(V3V2-G1 또는 V3V2-G2/G4)의 10배 희석액은 10, 1, 0.1과 0.01 ㎍/㎖의 최종 농도로 이들 작동체와 표적에 추가하였다. 포함된 검사 대조(Assay control)는 아래와 같다: 1) 항체의 부재(0 Ab)에서 작동체와 표적; 2) 작동체의 부재(자발적 용해)에서 표적 세포; 3) 0.2% Tween-80(최대 방출)과 함께 배양된 작동체와 표적. 모든 세포 배양 조건은 삼중으로 수행되었다. 세포는 5% CO₂를 포함하는 습식 배양기 내에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 기간의 종결 시점에서, 이들 평판은 원심분리하여 이들 세포를 펠릿으로 만들고, 150 ㎕의 세포 상층액은 신틸레이션 바이알(scintillation vial)로 이전하고 감마 신틸레이션 계수기(gamma scintillation counter)(Wallac)에서 계산하였다. 결과는 아래의 공식에 따라, 특이적인 용해 비율(percent specific lysis)로서 표시된다:

(분당 평균 샘플 수(cpm) - 평균 자발적 용해) X 100

(평균 최대 용해 - 평균 자발적 용해)

F. 유세포분석법

앞서 기술된 바와 같이 준비된 100 ㎕의 세포 현탁액(mOKT3 -활성화된 CD3+ 세포 또는 정제된 CD56+ NK 세포)은 96-웰 둥근 바닥 평판(Falcon, Franklin Lakes NJ; cat# 353077)의 웰에 분포시켰다. 세포는 아래의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-, 피코에리트린(PE)-, PerCP-Cy5.5-, 또는 알로피코시아닌(APC)-공액된 항체(Becton-Dickinson, San Jose, CA); 항-인간 CD25-FITC(cat# 555431); 항-인간 CD3-APC(cat# 555335); 항-인간 CD200-PE(cat # 552475); 항-인간 CD8-PerCP-Cy5.5(cat# 341051); 항-인간 CD4-APC(cat# 555349); 항-인간 CD5-APC(cat# 555355) 및 항-인간 CD56-APC(cat# 341025)의 지정된 조합과 함께, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 각 표지된 항체에 대한 아이소타입 대조 역시 포함되었다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척(3분 동안 1800 rpm 원심분리)한 이후, 세포는 300 ㎕의 PBS(Mediatech, Herndon, VA; cat# 21-031-CV)에 재현탁시키고, FacsCaliber 기계와 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용한 유세포분석법으로 분석하였다.

도 27에 도시된 바와 같이, 활성화된 T 세포는 그들의 표면 상에서 높은 CD200 발현을 나타낸다. 활성화된 T 세포는 NK 세포가 작동체 세포로 이용되는 경우에, VH3VL2-G1의 존재에서 효율적으로 사멸되지만 VH3VL2-G2G4의 존재에서는 그렇지 않다(도 28). 이들 데이터는 작동체 기능을 보유하는 항-CD200 항체가 활성화된 T 세포를 제거할 수 있음을 증명한다. 이런 항체는 이식 환경에서 또는 자가면역 질환을 치료하기 위하여 치료적으로 유용할 수 있다.

조절 T 세포 이외에, 형질세포양 수상돌기 세포가 인간 암에서 음성 면역조절 역할(negative immunoregulatory role)을 수행하는 것으로 밝혀졌다(Wei S, Kryczek I, Zou L, Daniel B, Cheng P, Mottram P, Curiel T, Lange A, Zou W Plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ regulatory T cells in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 2005 Jun 15; 65(12):5020-6). 이런 이유로, 항-CD200 요법과 형질세포양 수상돌기 세포를 제거하는 요법의 복합이 유익할 수 있다.

실시예 5

형질 세포 상에서 CD200

10명의 다발성 골수종 환자와 3명의 정상 공여자로부터 골수 세포는 먼저, 염화암모늄(ammonium chloride)을 이용하여 적혈구 세포를 용해시킴으로써 준비하였다. 세포는 FACS 완충액에서 재현탁시키고 아래의 항체 칵테일(antibody cocktail)로 표지하였다:

- Kappa-FITC/CD38-PE/CD138-PerCP-Cy5.5

- Lambda-FITC/CD38-PE/CD138-PerCP-Cy5.5

- 아이소타입 대조-FITC/CD38-PE

- CD200-FITC/CD38-PE

데이터는 BD FACS Canto를 이용하여 수집하고 BD DiVA 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. CD38 bright 세포(형질 세포) 상에서 CD200의 발현을 분석하였다. 도 29에 도시된 바와 같이, 형질 세포 중에서 일부는 정상 공여자에서 높은 강도에서 CD200을 발현한다. 다발성 골수종 환자에서는 대부분의 형질 세포가 CD200을 발현한다.

다발성 골수종 배경에서, CLL 또는 CD200을 발현하는 다른 암과 유사하게, 상기 종양 세포에 의한 CD200 발현은 면역계가 이들 종양 세포를 제거하는 것을 예방하는 것으로 생각된다. 길항성 항-CD200 치료는 면역계가 암 세포를 제거하는 것을 후속적으로 가능하게 하는 것으로 생각된다. 형질 세포를 표적하는 소멸성 항-CD200 치료는 자가면역 또는 이식 환경에서 치료적으로 유익할 수 있다.

실시예 6

바이러스 상에서 CD200

CD200은 또한, 점액종(myxoma) 바이러스 M141R 또는 인간 헤르페스바이러스 8과 같은 다수의 바이러스 상에서 발현된다. 종양 세포 상에서 CD200의 발현과 유사하게, 바이러스 상에서 CD200은 면역계가 상기 바이러스를 효과적으로 제거하는 것을 예방할 것으로 생각된다. 길항성 항-CD200 항체로 치료는 CD200 발현 바이러스로 감염에 치료적으로 유익할 수 있고, 면역계가 상기 바이러스를 제거할 수 있도록 한다. 대안으로, 소멸성(ablative) 항-CD200 항체가 이용될 수 있다.

본원에 개시된 구체예에 대한 다양한 개변이 가능하다. 가령, 당업자가 인지하는 바와 같이, 본원에 기술된 특정 서열은 OX-2/CD200 결합에 이용되는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서 다소 변형될 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편의 기능을 파괴하지 않는, 항체 서열에서 단일 또는 복수 아미노산의 치환이 빈번하게 수행될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 특정 항체에 70% 이상의 상동성을 보유하는 폴리펩티드 또는 항체는 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 특정 항체에 80% 이상의 상동성을 보유하는 항체가 고려된다. 다른 바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 특정 항체에 90% 이상의 상동성을 보유하는 항체가 고려된다. 이런 이유로, 상기한 상세는 바람직한 구체예의 예시일 뿐이며 본 발명을 한정하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다른 개변 역시 본 발명에 속한다.

참고문헌

아래의 참고문헌은 본원에 순전히 참조로 한다. 참고문헌에 기술된 내용 중에서 본원에 기술된 내용과 상충되는 부분은 본원을 우선한다.

1) Agarwal, et al., (2003). Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest 32:17-30.

2) Almasri, NM et al. (1992). Am J Hemato140 259-263.

3) Contasta, et al., (2003). Passage from normal mucosa to adenoma and colon cancer: alteration of normal sCD30 mechanisms regulating TH1/TH2 cell functions. Cancer Biother Radiopharm 18:549-557.

4) Gorczynski, et al., (1998). Increased expression of the novel molecule OX-2 is involved in prolongation of murine renal allograft survival. Transplantation 65:1106-1114.

5) Gorczynski, et al., (2001). Evidence of a role for CD200 in regulation of immune rejection of leukaemic tumour cells in C57BL/6 mice. Clin Exp Immunol 126:220-229.

6) Hainsworth, JD (2000). Oncologist 2000; 5(5):376-84.

7) Inagawa, et al., (1998). Mechanisms by which chemotherapeutic agents augment the antitumor effects of tumor necrosis factor: involvement of the pattern shift of cytokines from Th2 to Th1 in tumor lesions. Anticancer Res 18:3957-3964.

8) Ito, et al., (1999). Lung carcinoma: analysis of T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1 and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry. Cancer 85:2359-2367.

9) Kiani, et al., (2003). Normal intrinsic Th1/Th2 balance in patients with chronic phase chronic myeloid leukemia not treated with interferon-alpha or imatinib. Haematologica 88:754-761.

10) Lauerova, et al., (2002). Malignant melanoma associates with Thl/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response. Neoplasma 49:159-166.

11) Maggio, et al., (2002). Chemokines, cytokines and their receptors in Hodgkin's lymphoma cell lines and tissues. Ann Oncol 13 Suppl 1: 52-56.

12) Nilsson, K (1992). Burn Cell. 5(1):25-41.

13) Podhorecka, et al., (2002). T type 1/type 2 subsets balance in B-cell chronic lymphocytic leukemia-the three-color flow cytometry analysis. Leuk Res 26:657-660.

14) Pu, QQ and Bezwoda, W (2000). Anticancer Res. 20(4):2569-78.

15) Smyth, et al., (2003). Renal cell carcinoma induces prostaglandin E2 and T-helper type 2 cytokine production in peripheral blood mononuclear cells. Ann Surg Oncol 10:455-462.

16) Tatsumi, et al., (2002). Disease-associated bias in T helper type 1 (Th1)/Th2 CD4(+) T cell responses against MAGE-6 in HLA-DRB10401(+) patients with renal cell carcinoma or melanoma. J Exp Med 196:619-628.

17) Walls A Vet al. (1989). Int. J Cancer 44846-853.

18) Winter, et al., (2003). Tumour-induced polarization of tumour vaccine-draining lymph node T cells to a type 1 cytokine profile predicts inherent strong immunogenicity of the tumour and correlates with therapeutic efficacy in adoptive transfer studies. Immunology 108:409-419.

19) Cameron, C. M., J. W. Barrett, L. Liu, A. R. Lucas, and G. McFadden. 2005. Myxoma virus M141R expresses a viral CD200 (vOX-2) that is responsible for down-regulation of macrophage and T-cell activation in vivo. J Virol 79:6052.

20) Foster-Cuevas, M., G. J. Wright, M. J. Puklavec, M. H. Brown, and A. N. Barclay. 2004. Human herpesvirus 8 K14 protein mimics CD200 in down-regulating macrophage activation through CD200 receptor. J Virol 78:7667.

21) Nicholas, J. 2003. Human herpesvirus-8-encoded signalling ligands and receptors. J Biomed Sci 10:475.

22) Shiratori, I., M. Yamaguchi, M. Suzukawa, K. Yamamoto, L. L. Lanier, T. Saito, and H. Arase. 2005. Down-regulation of basophil function by human CD200 and human herpesvirus-8 CD200. J Immunol 175:4441.

23) Voigt, S., G. R. Sandford, G. S. Hayward, and W. H. Burns. 2005. The English strain of rat cytomegalovirus (CMV) contains a novel captured CD200 (vOX2) gene and a spliced CC chemokine upstream from the major immediate-early region: further evidence for a separate evolutionary lineage from that of rat CMV Maastricht. J Gen Virol 86:263.

24) Zhang, J., J. Wang, C. Wood, D. Xu, and L. Zhang. 2005. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 replication and transcription activator regulates viral and cellular genes via interferon-stimulated response elements. J Virol 79:5640.

SEQUENCE LISTING <110> Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bowdish, Katherine Kretz-Rommel, Anke Faas McKnight, Susan J. Springhorn, Jeremy P. Wu, Dayang <120> ANTIBODIES TO OX-2/CD200 AND USES THEREOF <130> ALEX-PW3-060 <140> PCT/US2007/000711 <141> 2007-01-11 <150> US 60/758,426 <151> 2006-01-12 <150> US 60/759,085 <151> 2006-01-12 <150> US 60/801,991 <151> 2006-05-18 <160> 51 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer C7mhHF <400> 1 tcctcagcct ccaccaaggg cc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Rev Age Pri <400> 2 gggcgcctga gttccacgac 20 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer C2aB7 rev <400> 3 ggcccttggt ggaggctgag gaaactgtga gagtggtgc 39 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer lacpri <400> 4 gctcccggct cgtatgttgt gt 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LeadVHpAX <400> 5 atatgaaata tctgctgccg accg 24 <210> 6 <211> 2010 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain chC2aB7-hG1, genomic sequence hG1 <400> 6 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc actgaagatg 120 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tactctgggt gaagcagaac 180 catggaaaga gccttgagtg gattggacat attgatcctt actatggtag ttctaactac 240 aatctgaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 300 atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgg aagatctaag 360 agggactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtttcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttggtga gaggccagca 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagcgct cctgcctgga cgcatcccgg 780 ctatgcagtc ccagtccagg gcagcaaggc aggccccgtc tgcctcttca cccggaggcc 840 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttcccc aggctctggg 900 caggcacagg ctaggtgccc ctaacccagg ccctgcacac aaaggggcag gtgctgggct 960 cagacctgcc aagagccata tccgggagga ccctgcccct gacctaagcc caccccaaag 1020 gccaaactct ccactccctc agctcggaca ccttctctcc tcccagattc cagtaactcc 1080 caatcttctc tctgcagagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc 1140 aggtaagcca gcccaggcct cgccctccag ctcaaggcgg gacaggtgcc ctagagtagc 1200 ctgcatccag ggacaggccc cagccgggtg ctgacacgtc cacctccatc tcttcctcag 1260 cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc 1320 tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 1380 ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc 1440 cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc 1500 aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc 1560 ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag gtgggacccg tggggtgcga gggccacatg 1620 gacagaggcc ggctcggccc accctctgcc ctgagagtga ccgctgtacc aacctctgtc 1680 cctacagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1740 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1800 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1860 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1920 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1980 aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga 2010 <210> 7 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain chC2aB7-hG1 <400> 7 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 35 40 45 Phe Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Lys Gln Asn His Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 8 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V4V1-hG1 Heavy chain (cDNA hG1) <400> 8 atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt gttctctgag 60 gtccagctgg tggagtccgg acctgaggtg aagaagcctg gggcttcagt gaaggtgtcc 120 tgcaaggctt ctggttattc attcactgac tacatcatac tctggatcag gcagcatagc 180 ggaaagggcc ttgagtggat tggacatatt gatccttact atggtagttc taactacaat 240 ctgaaattca agggcagggt cacaatcact gcagacaaat ctaccaggac aacctacatg 300 gagctcacca gtctgacatc tgaggacact gcagtctatt actgtggaag atctaagagg 360 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tttcctcagc ctccaccaag 420 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 9 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V4V1-hG1 Heavy chain <400> 9 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Phe Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Ile Arg Gln His Ser Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg 85 90 95 Thr Thr Tyr Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 10 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V1-hG1 Heavy chain (cDNA hG1) <400> 10 atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ttgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc aacagtctgg atctgagctg aagaagcctg gggcttcagt gaagatctcc 120 tgcaaggctt ctggttattc attcactgac tacatcatac tctgggtgag gcagaaccct 180 ggaaagggcc ttgagtggat tggacatatt gatccttact atggtagttc taactacaat 240 ctgaaattca agggcagagt gacaatcacc gccgaccagt ctaccaccac agcctacatg 300 gagctctcca gtctgagatc tgaggacact gcagtctatt actgtggaag atctaagagg 360 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tttcctcagc ctccaccaag 420 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 11 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V1-hG1 Heavy chain <400> 11 Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 12 <211> 2002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-hG2G4 Heavy chain (genomic sequence hG2G4) <400> 12 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc actgaagatg 120 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tactctgggt gaagcagaac 180 catggaaaga gccttgagtg gattggacat attgatcctt actatggtag ttctaactac 240 aatctgaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 300 atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgg aagatctaag 360 agggactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtttcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780 ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 840 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900 gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960 tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa 1020 ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1080 ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140 cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200 agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1560 accatctcca aagccaaagg tgggacccac ggggtgcgag ggccacatgg acagaggtca 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc 1980 cctgtctctg ggtaaatgat ga 2002 <210> 13 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-hG2G4 Heavy chain <400> 13 Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 14 <211> 1999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG2G4 Heavy chain (genomic sequence hG2G4) <400> 14 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc actgaagatg 120 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tactctgggt gaagcagaac 180 catggaaaga gccttgagtg gattggacat attgatcctt actatggtag ttctaactac 240 aatctgaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 300 atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgg aagatctaag 360 agggactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtttcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780 ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 840 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900 gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960 tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa 1020 ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1080 ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140 cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200 agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1560 accatctcca aagccaaagg tgggacccac ggggtgcgag ggccacatgg acagaggtca 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc 1980 cctgtctctg ggtaaatga 1999 <210> 15 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG2G4 Heavy chain <400> 15 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 35 40 45 Phe Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Lys Gln Asn His Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 16 <211> 1391 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-cG2G4 Heavy chain (cDNA G2G4) <400> 16 atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ttgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc aacagtctgg atctgagctg aagaagcctg gggcttcagt gaagatctcc 120 tgcaaggctt ctggttattc attcactgac tacatcatac tctgggtgag gcagaaccct 180 ggaaagggcc ttgagtggat tggacatatt gatccttact atggtagttc taactacaat 240 ctgaaattca agggcagagt gacaatcacc gccgaccagt ctaccaccac agcctacatg 300 gagctctcca gtctgagatc tgaggacact gcagtctatt actgtggaag atctaagagg 360 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tttcctcagc ctccaccaag 420 ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc 720 gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 840 gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 1380 ggtaaatgat g 1391 <210> 17 <211> 2005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ChC7-hG2G4 Heavy chain (genomic sequence hG2G4) <400> 17 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccaac tgcagcagtc tggacctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 120 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacaaca tgaactgggt gaagcagagc 180 agtggaaaga gccttgagtg gattggaaat tttgatcctt actatggtgt tattacctac 240 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 300 atgcagctca agagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaacggct 360 acggctctct atactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 420 tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tggtgagagg 720 ccagctcagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agccctcctg cctggacgca 780 ccccggctgt gcagccccag cccagggcag caaggcaggc cccatctgtc tcctcacccg 840 gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccaccagg 900 ctccaggcag gcacaggctg ggtgccccta ccccaggccc ttcacacaca ggggcaggtg 960 cttggctcag acctgccaaa agccatatcc gggaggaccc tgcccctgac ctaagccgac 1020 cccaaaggcc aaactgtcca ctccctcagc tcggacacct tctctcctcc cagatccgag 1080 taactcccaa tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag 1140 gtaagccagc ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct 1200 gcatccaggg acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca 1260 ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 1320 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 1380 gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1440 gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1500 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1560 gagaaaacca tctccaaagc caaaggtggg acccacgggg tgcgagggcc acatggacag 1620 aggtcagctc ggcccaccct ctgccctggg agtgaccgct gtgccaacct ctgtccctac 1680 agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa 1740 gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga 1800 gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc 1860 cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg 1920 gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag 1980 cctctccctg tctctgggta aatga 2005 <210> 18 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChC7-hG2G4 Heavy chain (genomic sequence hG2G4) <400> 18 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 35 40 45 Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Asn Phe Asp Pro Tyr Tyr Gly Val Ile Thr Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Thr Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Gly Lys Pro Ala Pro Pro Val 245 250 255 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Gly Lys 465 <210> 19 <211> 2025 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1B5-hG1 Heavy chain (genomic sequence hG1 constant region) <400> 19 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccaac tgcagcagcc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcaagttg 120 tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gactactata tacactgggt gaagcagagg 180 cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agattggtgc tactaaatat 240 gtcccgaagt tccagggcaa ggccactatg actacagaca catcctccaa cacagcctac 300 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtaa tgccctctat 360 ggtaactacg accgttacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctggcggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gccaggctca gcgctcctgc 780 ctggacgcat cccggctatg cagtcccagt ccagggcagc aaggcaggcc ccgtctgcct 840 cttcacccgg aggcctctgc ccgccccact catgctcagg gagagggtct tctggctttt 900 tccccaggct ctgggcaggc acaggctagg tgcccctaac ccaggccctg cacacaaagg 960 ggcaggtgct gggctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg cccctgacct 1020 aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc ggacaccttc tctcctccca 1080 gattccagta actcccaatc ttctctctgc agagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac 1140 atgcccaccg tgcccaggta agccagccca ggcctcgccc tccagctcaa ggcgggacag 1200 gtgccctaga gtagcctgca tccagggaca ggccccagcc gggtgctgac acgtccacct 1260 ccatctcttc ctcagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa 1320 aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg 1380 tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata 1440 atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc 1500 tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca 1560 aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaaggtggg acccgtgggg 1620 tgcgagggcc acatggacag aggccggctc ggcccaccct ctgccctgag agtgaccgct 1680 gtaccaacct ctgtccctac agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1740 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1800 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1860 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1920 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1980 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aatga 2025 <210> 20 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1B5-hG1 Heavy chain <400> 20 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val 20 25 30 Arg Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Ile Gly Ala Thr Lys Tyr 65 70 75 80 Val Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ser 85 90 95 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Arg Tyr Tyr Ala 115 120 125 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 210 215 220 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 225 230 235 240 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 21 <211> 2026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G2G4 63L1D Heavy chain (genomic sequence hG2G4) <400> 21 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 atgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120 tgcaaggcct ctggaggcac cttcagcaac tatgctacca gttgggtgcg acaggcccct 180 ggacaaggtc ttgagtggct gggagggatc atccccgtct tcggtactgc aaactacgca 240 cagaagtttc agggcagagt caccattacc gcggacgagt ccacgagcac agcctacatg 300 gagttgaata gtctgacatt tgacgacacg gccgtctatt actgtgcgag agggggtggg 360 ggatggggag gccggaacta ctactactac tactacatgg acgtctgggg caaagggacc 420 actgtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc 480 tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 600 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660 aacttcggca cccagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 720 gacaagacag ttggtgagag gccagctcag ggagggaggg tgtctgctgg aagccaggct 780 cagccctcct gcctggacgc accccggctg tgcagcccca gcccagggca gcaaggcagg 840 ccccatctgt ctcctcaccc ggaggcctct gcccgcccca ctcatgctca gggagagggt 900 cttctggctt tttccaccag gctccaggca ggcacaggct gggtgcccct accccaggcc 960 cttcacacac aggggcaggt gcttggctca gacctgccaa aagccatatc cgggaggacc 1020 ctgcccctga cctaagccga ccccaaaggc caaactgtcc actccctcag ctcggacacc 1080 ttctctcctc ccagatccga gtaactccca atcttctctc tgcagagcgc aaatgttgtg 1140 tcgagtgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 1200 acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agctgggtgc tgacacgtcc 1260 acctccatct cttcctcagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1320 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1380 gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1440 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1500 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1560 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg 1620 gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc 1680 tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc 1740 atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1800 ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1860 cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga 1920 caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1980 caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatga 2026 <210> 22 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2G4 63L1D Heavy chain <400> 22 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Phe Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gly Arg Asn Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 145 150 155 160 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 340 345 350 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 465 470 <210> 23 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain chC2aB7-hG1, human Ck <400> 23 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactctaga 60 gacatccaga tgacacagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 120 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 180 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggttccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 300 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 24 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain chC2aB7-hG1, human Ck <400> 24 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 25 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V4V1-hG1 light chain <400> 25 atggacatga gggtctctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggagcc 60 agatgtgaca tccagatgac acagtctcca tcttccctgt ctgcatctat aggagacaga 120 gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaatagct atttaagctg gtaccagcag 180 aaaccaggga aagctcctaa gtccctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtt 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagattata ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag atttcgcagt ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gtacacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711 <210> 26 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V4V1-hG1 Light chain (human Ck) <400> 26 Met Asp Met Arg Val Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 27 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-hG1 Light Chain <400> 27 atggacatga gggtctctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggggcc 60 aggtgtgaca tccagatgac acagtctcca tcttccctgt ctgcatctat aggagacaga 120 gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaatagct atttaagctg gttccagcag 180 aaaccaggga aagctcctaa gctgctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtt 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagattata ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag atttcgcagt ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gtacacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711 <210> 28 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-hG1 Light Chain (human Ck) <400> 28 Met Asp Met Arg Val Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 29 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ChC7-hG2G4 Light chain <400> 29 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactctaga 60 gaaattgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 120 atgacctgca gggccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 180 tcaggtgcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acttggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagtgtggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtacagtg gttacccact cacgttcggc 360 tcggggacaa agttggaaat aaaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatccgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaa 708 <210> 30 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChC7-hG2G4 Light chain (human Ck) <400> 30 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser 50 55 60 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 31 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1B5-hG1 Light chain <400> 31 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactctaga 60 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120 atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 300 gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atcctctcac gttcggtgct 360 gggaccaagc tggagctgaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcaa caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 32 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1B5-hG1 Light chain (human Ck) <400> 32 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Val Arg Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp 100 105 110 Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 33 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G2G4 63L1D Light chain <400> 33 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcttcc 60 tatgtgctga ctcagccacc ctcggagtca gtggccccag gacagacggc caggatttcc 120 tgtgggggga gcaacattgg aagttacggt gtgcactggt accagcagaa ggcaggacag 180 gcccctgtgc tggtcgtcca tgatgattcc gaccggccct cagggattcc tgagcgattc 240 tctggctcca attctgggaa cacggccacc ctgaccatca gcagtgtcga agccggcgat 300 gaggccgact attactgtca ggtgtgggat aatagtgctg tgatattcgg cggagggacc 360 aaactaaccg tcctaagtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt cccgccctcc 420 tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 480 ggagctgtga cagtggcttg gaaagcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 540 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 600 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 660 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tcataa 696 <210> 34 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2G4 63L1D Light chain (human CL) <400> 34 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Glu Ser Val Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser 35 40 45 Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Val Val His Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 85 90 95 Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Ser 100 105 110 Ala Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro 115 120 125 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 165 170 175 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 180 185 190 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 195 200 205 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 210 215 220 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 35 gacaagcttg caaggatgga gaggctggtg a 31 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 36 gacggatccg ccccttttcc tcctgctttt ctc 33 <210> 37 <211> 2160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG1 Heavy chain <400> 37 gcgcgccacc agacataata gctgacagac taacagactg ttcctttcca tgggtctttt 60 ctgcagtcac cgtccttgac acgaggcgcg ccgccaccat gggatggagc tgtatcatcc 120 tcttcttggt agcaacagct acaggtgtcc actccctcga ggtccagctg caacagtctg 180 gacctgagct ggtgaagcct ggggcttcac tgaagatgtc ctgcaaggct tctggttatt 240 cattcactga ctacatcata ctctgggtga agcagaacca tggaaagagc cttgagtgga 300 ttggacatat tgatccttac tatggtagtt ctaactacaa tctgaaattc aagggcaagg 360 ccacattgac tgtagacaaa tcttccagca cagcctacat gcagctcaac agtctgacat 420 ctgaggactc tgcagtctat tactgtggaa gatctaagag ggactacttt gactactggg 480 gccaaggcac cactctcaca gtttcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 540 tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 600 actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 660 acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg 720 tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca 780 acaccaaggt ggacaagaga gttggtgaga ggccagcaca gggagggagg gtgtctgctg 840 gaagccaggc tcagcgctcc tgcctggacg catcccggct atgcagtccc agtccagggc 900 agcaaggcag gccccgtctg cctcttcacc cggaggcctc tgcccgcccc actcatgctc 960 agggagaggg tcttctggct ttttccccag gctctgggca ggcacaggct aggtgcccct 1020 aacccaggcc ctgcacacaa aggggcaggt gctgggctca gacctgccaa gagccatatc 1080 cgggaggacc ctgcccctga cctaagccca ccccaaaggc caaactctcc actccctcag 1140 ctcggacacc ttctctcctc ccagattcca gtaactccca atcttctctc tgcagagccc 1200 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag gtaagccagc ccaggcctcg 1260 ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg acaggcccca 1320 gccgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca cctgaactcc tggggggacc 1380 gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 1440 ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta 1500 cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1560 cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 1620 gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa 1680 agccaaaggt gggacccgtg gggtgcgagg gccacatgga cagaggccgg ctcggcccac 1740 cctctgccct gagagtgacc gctgtaccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagaac 1800 cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga 1860 cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc 1920 agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc 1980 tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct 2040 ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtccccgg 2100 gtaaatgagt gcgacggcca gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag 2160 <210> 38 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG1 Light chain <400> 38 aagcttgccg ccaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60 ggtgtccact ctagagacat ccagatgaca cagtctccat cttccatgta tgcatctcta 120 ggagagagag tcactatcac ttgcaaggcg agtcaggaca ttaatagcta tttaagctgg 180 ttccagcaga aaccagggaa atctcctaag accctgatct atcgtgcaaa cagattggta 240 gatggggttc catcaaggtt cagtggcagt ggatctgggc aagattattc tctcaccatc 300 agcagcctgg agtatgaaga tatgggaatt tattattgtc tacagtatga tgagtttccg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa 720 <210> 39 <211> 1402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V4V1-hG1 Heavy chain <400> 39 catgggatgg agctggatct ttctctttct cctgtcagta actgcaggtg tgttctctga 60 ggtccagctg gtggagtccg gacctgaggt gaagaagcct ggggcttcag tgaaggtgtc 120 ctgcaaggct tctggttatt cattcactga ctacatcata ctctggatca ggcagcatag 180 cggaaagggc cttgagtgga ttggacatat tgatccttac tatggtagtt ctaactacaa 240 tctgaaattc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa tctaccagga caacctacat 300 ggagctcacc agtctgacat ctgaggacac tgcagtctat tactgtggaa gatctaagag 360 ggactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtttcctcag cctccaccaa 420 gggcccatcg gtcttcccgc tagcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc 480 cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg 540 cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc 600 cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa 660 cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga 720 caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt 780 cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg 840 cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg 900 cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg 960 tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg 1020 caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg 1080 gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa 1140 ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg 1200 ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga 1260 cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa 1320 cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct 1380 ctccctgtct ccgggtaaat ga 1402 <210> 40 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V4V1-hG1 and hB7V3V1-hG1 Light chains <400> 40 tttccatggg tcttttctgc agtcaccgtc cttgacacga agcttgccgc caccatggac 60 atgagggtct ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctctcagg agccagatgt 120 gacatccaga tgacacagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcact 180 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 240 gggaaagctc ctaagtccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggttccatca 300 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag cctgcagcct 360 gaagatttcg cagtttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 420 gggaccaagc tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 480 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 540 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 600 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 660 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 720 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 765 <210> 41 <211> 1402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V1-hG1 and hB7V3V2-hG1 Heavy chains <400> 41 catgggatgg agccggatct ttctcttcct cctgtcaata attgcaggtg tccattgcca 60 ggtccagctg caacagtctg gatctgagct gaagaagcct ggggcttcag tgaagatctc 120 ctgcaaggct tctggttatt cattcactga ctacatcata ctctgggtga ggcagaaccc 180 tggaaagggc cttgagtgga ttggacatat tgatccttac tatggtagtt ctaactacaa 240 tctgaaattc aagggcagag tgacaatcac cgccgaccag tctaccacca cagcctacat 300 ggagctctcc agtctgagat ctgaggacac tgcagtctat tactgtggaa gatctaagag 360 ggactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtttcctcag cctccaccaa 420 gggcccatcg gtcttcccgc tagcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc 480 cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg 540 cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc 600 cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa 660 cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga 720 caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt 780 cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg 840 cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg 900 cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg 960 tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg 1020 caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg 1080 gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa 1140 ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg 1200 ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga 1260 cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa 1320 cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct 1380 ctccctgtct ccgggtaaat ga 1402 <210> 42 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-hG1 and hB7V3V2-hG2G4 Light chains <400> 42 tttccatggg tcttttctgc agtcaccgtc cttgacacga agcttgccgc caccatggac 60 atgagggtct ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctctcagg ggccaggtgt 120 gacatccaga tgacacagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcact 180 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 240 gggaaagctc ctaagctgct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggttccatca 300 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag cctgcagcct 360 gaagatttcg cagtttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 420 gggaccaagc tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 480 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 540 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 600 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 660 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 720 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 765 <210> 43 <211> 2159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-hG2G4 Heavy chain <400> 43 ccaccagaca taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca 60 gtcaccgtcc ttgacacgaa gcttgccgcc accatgggat ggagccggat ctttctcttc 120 ctcctgtcaa taattgcagg tgtccattgc caggtccagc tgcaacagtc tggatctgag 180 ctgaagaagc ctggggcttc agtgaagatc tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact 240 gactacatca tactctgggt gaggcagaac cctggaaagg gccttgagtg gattggacat 300 attgatcctt actatggtag ttctaactac aatctgaaat tcaagggcag agtgacaatc 360 accgccgacc agtctaccac cacagcctac atggagctct ccagtctgag atctgaggac 420 actgcagtct attactgtgg aagatctaag agggactact ttgactactg gggccaaggc 480 accactctca cagtttcctc agcctccacc aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc 540 tgctccagga gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 600 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 660 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 720 agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 780 gtggacaaga cagttggtga gaggccagct cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag 840 gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc 900 aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag 960 ggtcttctgg ctttttccac caggctccag gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag 1020 gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc tcagacctgc caaaagccat atccgggagg 1080 accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa ggccaaactg tccactccct cagctcggac 1140 accttctctc ctcccagatc cgagtaactc ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt 1200 gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc 1260 gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccgctgggt gctgacacgt 1320 ccacctccat ctcttcctca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc ctcttccccc 1380 caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg 1440 acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc 1500 ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg 1560 tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca 1620 acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt gggacccacg 1680 gggtgcgagg gccacatgga cagaggtcag ctcggcccac cctctgccct gggagtgacc 1740 gctgtgccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1800 ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1860 taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1920 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1980 gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 2040 cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatgatg agaattcatt 2100 gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccac 2159 <210> 44 <211> 1600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG2G4 Heavy chain <400> 44 gctgacagac taacagactg ttcctttcca tgggtctttt ctgcagtcac cgtccttgac 60 acgaggcgcg ccgccaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120 acaggtgtcc actccctcga ggtccagctg caacagtctg gacctgagct ggtgaagcct 180 ggggcttcac tgaagatgtc ctgcaaggct tctggttatt cattcactga ctacatcata 240 ctctgggtga agcagaacca tggaaagagc cttgagtgga ttggacatat tgatccttac 300 tatggtagtt ctaactacaa tctgaaattc aagggcaagg ccacattgac tgtagacaaa 360 tcttccagca cagcctacat gcagctcaac agtctgacat ctgaggactc tgcagtctat 420 tactgtggaa gatctaagag ggactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca 480 gtttcctcag cctccaccaa gggcccatcc gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 540 acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 600 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 660 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc 720 acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 780 gttggtgaga ggccagctca gggagggagg gtgtctgctg gaagccaggc tcagccctcc 840 tgcctggacg caccccggct gtgcagcccc agcccagggc agcaaggcag gccccatctg 900 tctcctcacc cggaggcctc tgcccgcccc actcatgctc agggagaggg tcttctggct 960 ttttccacca ggctccaggc aggcacaggc tgggtgcccc taccccaggc ccttcacaca 1020 caggggcagg tgcttggctc agacctgcca aaagccatat ccgggaggac cctgcccctg 1080 acctaagccg accccaaagg ccaaactgtc cactccctca gctcggacac cttctctcct 1140 cccagatccg agtaactccc aatcttctct ctgcagagcg caaatgttgt gtcgagtgcc 1200 caccgtgccc aggtaagcca gcccaggcct cgccctccag ctcaaggcgg gacaggtgcc 1260 ctagagtagc ctgcatccag ggacaggccc cagctgggtg ctgacacgtc cacctccatc 1320 tcttcctcag caccacctgt ggcaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 1380 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag 1440 gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag 1500 acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1560 ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca 1600 <210> 45 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG2G4 Heavy chain <400> 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 35 40 45 Phe Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Lys Gln Asn His Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys <210> 46 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG2G4 Light chain <400> 46 aagcttgccg ccaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60 ggtgtccact ctagagacat ccagatgaca cagtctccat cttccatgta tgcatctagg 120 agagagagtc actatcactt gcaaggcgag tcaggacatt aatagctatt aagctggttc 180 cagcagaaac cagggaaatc tcctaagacc ctgatctatc gtgcaaacag attggtagat 240 ggggttccat caaggttcag tggcagtgga tctgggcaag attattctct caccatcagc 300 agcctggagt atgaagatat gggaatttat tattgtctac agtatgatga gtttccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttcagcg 720 gccgcaattc attga 735 <210> 47 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chC2aB7-hG2G4 Light chain <400> 47 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ala Ala Ala Ile His 225 230 235 240 <210> 48 <211> 1560 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-cG2G4 Heavy chain <400> 48 ccaccagaca taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca 60 gtcaccgtcc ttgacacgaa gcttgccgcc accatgggat ggagccggat ctttctcttc 120 ctcctgtcaa taattgcagg tgtccattgc caggtccagc tgcaacagtc tggatctgag 180 ctgaagaagc ctggggcttc agtgaagatc tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact 240 gactacatca tactctgggt gaggcagaac cctggaaagg gccttgagtg gattggacat 300 attgatcctt actatggtag ttctaactac aatctgaaat tcaagggcag agtgacaatc 360 accgccgacc agtctaccac cacagcctac atggagctct ccagtctgag atctgaggac 420 actgcagtct attactgtgg aagatctaag agggactact ttgactactg gggccaaggc 480 accactctca cagtttcctc agcctccacc aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc 540 tgctccagga gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 600 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 660 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 720 agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 780 gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct 840 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 960 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1140 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200 caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc 1260 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag 1380 agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440 cactacacac agaagagcct ctccctgtct ctgggtaaat gatgagaatt cattgatcat 1500 aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc 1560 <210> 49 <211> 772 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7V3V2-cG2G4 Light chain <400> 49 ctgttccttt ccatgggtct tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttgccgccac 60 catggacatg agggtctctg ctcagctcct ggggctcctg ctgctctggc tctcaggggc 120 caggtgtgac atccagatga cacagtctcc atcttccctg tctgcatcta taggagacag 180 agtcactatc acttgcaagg cgagtcagga cattaatagc tatttaagct ggttccagca 240 gaaaccaggg aaagctccta agctgctgat ctatcgtgca aacagattgg tagatggggt 300 tccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagattat actctcacca tcagcagcct 360 gcagcctgaa gatttcgcag tttattattg tctacagtat gatgagtttc cgtacacgtt 420 cggagggggg accaagctgg aaataaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt 480 cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 540 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa 600 ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac 660 cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 720 tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 772 <210> 50 <211> 2158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIB5-hG1 Heavy chain <400> 50 gcgcgccacc agacataata gctgacagac taacagactg ttcctttcca tgggtctttt 60 ctgcagtcac cgtccttgac acgaggcgcg ccgccaccat gggatggagc tgtatcatcc 120 tcttcttggt agcaacagct acaggtgtcc actccctcga ggtccaactg cagcagcctg 180 gggcagagct tgtgaggtca ggggcctcag tcaagttgtc ctgcaaagct tctggcttca 240 acattaaaga ctactatata cactgggtga agcagaggcc tgaacagggc ctggagtgga 300 ttggatggat tgatcctgag attggtgcta ctaaatatgt cccgaagttc cagggcaagg 360 ccactatgac tacagacaca tcctccaaca cagcctacct gcagctcagc agcctgacat 420 ctgaggacac tgccgtctat tactgtaatg ccctctatgg taactacgac cgttactatg 480 ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc 540 catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tggcggcaca gcggccctgg 600 gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 660 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca 720 gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 780 atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag 840 ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc cggctatgca 900 gtcccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag gcctctgccc 960 gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct gggcaggcac 1020 aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg gctcagacct 1080 gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca aaggccaaac 1140 tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac tcccaatctt 1200 ctctctgcag agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccaggtaag 1260 ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc 1320 cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct cagcacctga 1380 actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat 1440 ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 1500 caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga 1560 ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg 1620 gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga 1680 gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac atggacagag 1740 gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct gtccctacag 1800 ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga 1860 accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 1920 gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 1980 acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 2040 acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc 2100 tctccctgtc cccgggtaaa tgagtgcgac ggccagaatt cattgatcat aatcagcc 2158 <210> 51 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIB5-hG1 Light chain <400> 51 aagcttgccg ccaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60 ggtgtccact ctagagacat tgtgatgacc cagtctcaaa aattcatgtc cacatcagta 120 ggagacaggg tcagcatcac ctgcaaggcc agtcagaatg ttcgtactgc tgtagcctgg 180 tatcaacaga aaccagggca gtctcctaaa gcactgattt acttggcatc caaccggcac 240 actggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatt 300 agcaatgtgc aatctgaaga cctggcagat tatttctgtc tgcaacattg gaattatcct 360 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcaacaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa 720

Claims

CD200-양성 암 세포를 포함하는 암을 치료하는데 이용되는 항-CD200 항체에 있어서, 이 항체는 CD200과 CD200R 사이의 상호작용을 저해하고, 다음을 특징으로 하는 항체:
(i) 이 항체는 다음과 같은 변경된 불변 영역을 포함하고:
(a) G2/G4 불변 영역이며;
(b) 234A 돌연변이와 235A 돌연변이중 하나 또는 둘 다를 포함하고;
(c) CH2 도메인 안에 K322A 돌연변이를 포함하거나; 또는
(d) 힌지 영역이 없다;
또는
(ii) 이 항체는
(a) 당화(glycosylation)가 불완전한 세포계통에서 제조되며; 또는
(b) 당화가 결핍된다.
청구항 1에 있어서, 암은 혈장 세포 암, 임파종 또는 백혈병인, 항체.
청구항 1에 있어서, 암은 난소암, 피부암, 폐암, 신장암, 유방암, 전립선암, 신경아종, 그리고 골수종으로 구성된 집단에서 선택되는, 항체.
청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 항-CD200 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화된(humanized) 항체, 탈면역화된(deimmunized) 항체, 또는 인간 항체인, 항체.
청구항 1 내지 4중 임의의 한 항에 있어서, 변경된 불변 영역은 G2/G4 불변 영역인, 항체.
청구항 5에 있어서, G2/G4 불변 영역은 서열 번호:13의 아미노산 잔기 137 내지 462를 포함하는, 항체.
청구항 1 내지 4중 임의의 한 항에 있어서, 다음을 포함하는 항-CD200 항체:
(a) 다음을 포함하는 경쇄:
(i) 서열 번호:24의 잔기 44 내지 54에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열 번호: 24의 잔기 70 내지 76에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 그리고 서열 번호: 24의 잔기 109 내지 117에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(ii) 서열 번호:24의 잔기 21 내지 127을 포함하는 아미노산 서열; 또는
(iii) 서열 번호:24의 잔기 21 내지 234를 포함하는 아미노산 서열; 그리고
(b) 다음을 포함하는 중쇄:
(i) 서열 번호: 15의 잔기 46 내지 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열 번호: 15의 잔기 70 내지 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 그리고 서열 번호:15의 잔기 119 내지 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(ii) 서열 번호: 15의 잔기 21 내지 137을 포함하는 아미노산 서열; 또는
(iii) 서열 번호: 15의 잔기 21 내지 463을 포함하는 아미노산 서열.
청구항 1 내지 4중 임의의 한 항에 있어서,
다음을 포함하는 항-CD200 항체:
(a) 다음을 포함하는 경쇄:
(i) 서열 번호:32의 잔기 44 내지 54에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열 번호: 32의 잔기 70 내지 76에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 그리고 서열 번호: 32의 잔기 109 내지 117에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
(ii) 서열 번호:32의 잔기 21 내지 127을 포함하는 아미노산 서열; 또는
(iii) 서열 번호:32의 잔기 21 내지 234를 포함하는 아미노산 서열; 그리고
(b) 다음을 포함하는 중쇄:
(i) 서열 번호: 20의 잔기 46 내지 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열 번호:20의 잔기 70 내지 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 그리고 서열 번호:20의 잔기 119 내지 131의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
(ii) 서열 번호: 15의 잔기 21 내지 142를 포함하는 아미노산 서열.
청구항 1 내지 4중 임의의 한 항에 있어서, 다음을 포함하는 항-CD200 항체:
(a) 다음을 포함하는 경쇄:
(i) 서열 번호:28의 잔기 23 내지 129를 포함하는 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열 번호:28의 잔기 23 내지 236을 포함하는 아미노산 서열; 그리고
(b) 다음을 포함하는 중쇄:
(i) 서열 번호:13의 잔기 20 내지 136을 포함하는 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열 번호:13의 잔기 20 내지 462를 포함하는 아미노산 서열.
CD200-양성 암 세포를 포함하는 암에 걸린 환자의 치료에 이용되는 항-CD200 항체에 있어서, 이때 항-CD200 항체는 제2물질 또는 치료와 병용하여 환자에게 투여되고, 이 항체는 CD200과 CD200R 사이의 상호작용을 저해하고, 다음을 특징으로 하는 항체:
(i) 이 항체는 다음과 같은 변경된 불변 영역을 포함하고:
(a) G2/G4 불변 영역이며;
(b) 234A 돌연변이와 235A 돌연변이중 하나 또는 둘 다를 포함하고;
(c) CH2 도메인 안에 K322A 돌연변이를 포함하거나; 또는
(d) 힌지 영역이 없다;
또는
(ii) 이 항체는
(a) 당화(glycosylation)가 불완전한 세포계통에서 제조되며; 또는
(b) 당화가 결핍된다.
청구항 10에 있어서, 제2물질은 화학요법제인 것을 특징으로 하는 항체.
청구항 10에 있어서, 치료는 방사선 요법인 것을 특징으로 하는 항체.