CN102636653A - 复合胶乳粒子包被胱抑素c检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学免疫体外诊断领域,特别是一种检测血清中的胱抑素C测定试剂盒,包括试剂R1,试剂R2及校准品;所述试剂R1为磷酸盐缓冲体系,其组分为,PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液30-60mmol/l,聚乙二醇6000-800060-95mmol/l和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/l。所述试剂R2包括羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的两种大小不同的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒;还包括乳胶稀释液,以及封闭液。所述校准品为0-10mg/l牛血清基质,还包括0.2-2.2%的防腐剂以及1-10%的稳定剂。本发明同现有技术相比,具有灵敏度高、特异性好,快速、测定结果准确可靠的特点。
Description
[技术领域]
本发明涉及医学免疫体外诊断领域,特别是一种检测血清中的胱抑素C测定试剂盒。
[背景技术]
肾脏疾病是临床上一种常见的疾病,各种原因导致的肾功能损害是进展为终末性肾病及心血管疾病的危险因素。唯一能阻止肾脏疾病恶化的方法就是早诊断、早治疗以逆转损伤的肾功能。胱抑素C的浓度几乎不受肾前因素的影响,能自由通过肾小球滤过,没有肾小管的重吸收和***,也没有肾外的***途径。较多研究发现胱抑素C是反映肾功能损害的敏感指标。
胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法;另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似,都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体,当交联有抗体的微球与抗原结合后,在短时间内会迅速聚集在一起,改变了反应液的散光性能或透光性能。而且,反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后,直接测定反应液的吸光度值,省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤,几分钟就能获得结果,省时省力。此外,纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰,稳定性和重复性都较好,能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些,但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值,可完全满足临床检测要求。
由于血清胱抑素C的含量很低,其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。由最初免疫电泳的定性检测,到放射免疫、荧光免疫和酶免疫的定量检测,以及到免疫比浊的自动化检测,发展十分迅速。单向免疫扩散(SRID)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定发(FIA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、胶乳颗粒法、颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)、颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)。目前,胶乳颗粒增强比浊法是最为普遍通用的方法,但是胶乳颗粒增强比浊法最高最高检测限只能达到0.1mg/l,线性只能达到8mg/l,在临床应用上存在着局限性。
[发明内容]
本发明为了克服现有技术的不足,发明提供了一种复合粒径乳胶粒子包被抗体的测试试剂盒来检测血清中的胱抑素C含量,以达到操作简便、灵敏度高、特异性好,快速、测定结果准确可靠的目的。
为了实现上述目的,本发明设计了一种复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,包括试剂R1,试剂R2及校准品,其中:
试剂R1为磷酸盐缓冲体系,其组分为,PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液30-60mmol/l,聚乙二醇6000-8000 60-95mmol/l和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/l。
试剂R2包括羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的两种大小不同的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒;还包括乳胶稀释液,以及封闭液。
校准品为0-10mg/l牛血清基质,还包括0.2-2.2%的防腐剂以及1-10%的稳定剂。
所述试剂R2中,所述封闭液包括0.01%-0.1%脱脂奶粉,以及0.1-0.6mm的甘氨酸。
所述试剂R2中,乳胶稀释液包括PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/l,乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l,0.01%-0.1%的脱脂奶粉,0.9%的NaN3。
所述试剂R2中,两种聚苯乙烯乳胶粒子的直径分别为40-70nm和150-190nm。
所述试剂R2中,大粒径胶乳与小粒径胶乳以1/3-1/5的比例混合。
所述试剂R2中,羊抗人胱抑素C多克隆抗体和包被的聚苯乙烯乳胶粒子的质量比为1/10-3/10。
所述的校准品中,防腐剂为叠氮钠。
所述的校准品中,稳定剂为甘油、蔗糖、BSA、甘露醇或山梨醇中的一种或多种混合物。
本发明同现有技术相比,具有灵敏度高、特异性好,快速、测定结果准确可靠的特点。
[附图说明]
图1为本发明五种不同浓度的胱抑素C参考标准的标准曲线。
图2为本发明临床相关性曲线分析图。
[具体实施方式]
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明不用于限制本发明的范围。
实施例1:
本发明稀释液由如下物质配置而成。
试剂R1制备如下:
PH7.4磷酸盐缓冲液 45mmol/l;
聚乙二醇6000 85mmol/l;
乙二胺四乙酸二钠 8.5mmol/l;
NaN3 占总试剂R1的0.9%。
各种成分可以室温下依次添加,或者同时添加,或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。
试剂R2制备如下:
取直径为186nm的聚苯乙烯胶乳粒子以及直径为45nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照1∶4的比例混合。羊抗人胱抑素C多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳粒子以30∶100的质量比混合,将两者混匀后37℃吸附8小时,之后透析除去未连接上的抗体,加入0.1%脱脂奶粉与0.2mm的甘氨酸组成的封闭液,封闭2小时。
用PH值为7.4的磷酸盐缓冲液45mmol/l,乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l,0.05%脱脂奶粉,0.9%的NaN3组成的乳胶稀释液,离心去上清。
牛血清基质校准品制备:
将经过处理的牛血清,加入BSA 0.1%,NaN3 0.9%得到校准品稀释液。用重组胱抑素C蛋白溶于制备的类似人血清基质的溶液,制备不同浓度的标准品其浓度分别为0;0.5mg/l;1.5mg/l;3.0mg/l;6.0mg/l;10.0mg/l。
本实施例描述的胱抑素C检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如表1。分析方法:两点终点法,即试剂R1;R2的用量分别为230ul和50ul,样本量3ul;230ul试剂R1加入3ul样本于37C5min后加入50ulR2,即开始读点,反应5min后读取另一点;检测波长分别主波长546nm副波长800nm。
采用本试剂及上述测定方法,采用日立7170生化分析仪测得的5种不同含量的胱抑素C标准品(自制)的曲线,如图1所示,每个点代表一个含量的参考标准品,其中X轴表示胱抑素C含量(mg/L);Y轴表示吸光度。
表1:
实验一,检测试剂的相关性试验:
相关性试验:
使用本法发明试剂,具体配方同实施例1和对照现有的胱抑素C胶乳增强型试剂,采用自动7170全自动生化分析仪对40份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关性分析。按照与上述“胱抑素C测定方法”中的参数进行测定,测定结果见图2,X,Y轴均为测定值(胱抑素C的含量mg/L),
由图2的结果看出,两种试剂的相关系为R2=0.984,回归方程为y=1.004x。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好,具有很好的特异性和准确性。
此外,以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的,但本发明的试剂不限于上述仪器,还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
试验例二,最低检测限试验:
本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本,低值样本(数值在试剂线性范围下限±1/3内的样本)。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本,然后50%稀释成5个点,和零点一起,每一个样本测试5次,计算平均值,求得SD数值。
结果解析:根据检测数据,计算SD数值和CV数值,分别计算1SD,2SD,从最小的开始,其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。
表2、3结果显示,本发明试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时,测定平均值-2SD的数值均大于零点平均值+2SD,表明本发明试剂最低检测限至少可以达到0.038mg/。而对照现有试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清,并比较血清平均值-2SD与零点平均值+2SD大小,其中1/16、1/8稀释平均值-2SD的数值小于零点平均值+2SD,1/4、1/2稀释平均值-2SD的数值大于零点平均值+2SD,表明现有试剂最低检测限为0.124mg/l左右。
表2:
表3:
试验例三,灵敏度实验:
本实验目的是检测试剂在测试生理盐水以及一定浓度的管理血清时的吸光度变化值。
采用实验例1的试剂、对照试剂、标准品、空白溶液、0.9%的生理食盐水,浓度的管理血清时的吸光度变化值。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水、低值样本,每个样本测试5次,计算吸光度。
表4、5显示,本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为-2.8(1/10000A),理论浓度为0.35mg/l血清样本时吸光度变化为323.6(1/10000A),而A公司试剂测定生理盐水时吸光度变化为-21.75(10000A),理论浓度为0.35mg/l血清样本时吸光度变化为31.5(1/10000A),表明本发明试剂灵敏度要显著高于现有试剂。
表4:
表5:
Claims (8)
1.一种复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,包括试剂R1,试剂R2及校准品,其中:
试剂R1为磷酸盐缓冲体系,其组分为,PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液30-60mmol/l,聚乙二醇6000-8000 60-95mmol/l和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/l;
试剂R2包括羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的两种大小不同的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒;还包括乳胶稀释液,以及封闭液;
校准品为0-10mg/l牛血清基质,还包括0.2-2.2%的防腐剂以及1-10%的稳定剂。
2.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中,所述封闭液包括0.01%-0.1%脱脂奶粉,以及0.1-0.6mm的甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中,乳胶稀释液包括PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/l,乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l,0.01%-0.1%的脱脂奶粉,0.9%的NaN3。
4.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中,两种聚苯乙烯乳胶粒子的直径分别为40-70nm和150-190nm。
5.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中,大粒径胶乳与小粒径胶乳以1/3-1/5的比例混合。
6.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中,羊抗人胱抑素C多克隆抗体和包被的聚苯乙烯乳胶粒子的质量比为1/10-3/10。
7.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述的校准品中,防腐剂为叠氮钠。
8.根据权利要求1所述的复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒,其特征在于:所述的校准品中,稳定剂为甘油、蔗糖、BSA、甘露醇或山梨醇中的一种或多种混合物。
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