CN104215770A - 一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，具体是一种基于双粒子的乳胶增强免疫比浊法视黄醇结合蛋白检测试剂盒。本发明试剂盒由彼此独立的试剂R1、试剂R2和校准品三部分组成；所述试剂R1的组成为pH7.0～8.4缓冲液、表面活性剂、螯合剂、加速剂、防腐剂和纯化水；所述试剂R2的组成为包被抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒、pH7.0～8.4缓冲液；所述校准品为含有6个RBP重组蛋白浓度梯度的混合溶液体系。与现有技术相比，本发明试剂盒能快速测定血清或血浆中视黄醇结合蛋白的含量，可用于肾功能疾病的辅助诊断，同时也能用于营养不良的辅助诊断，具有很高的临床应用价值。

Description

一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒。
背景技术
视黄醇类结合蛋白(retinoids binding protein，简称RBP)是体内负责结合并转运维生素A的各种活性代谢物(视黄醇类)的一类蛋白质，主要包括血浆视黄醇结合蛋白(RBP)、胞内视黄醇结合蛋白(CRBP)、胞内视黄酸结合蛋白(CRABP)、胞内视黄醛结合蛋白(CRALBP)和光受体视黄醇类结合蛋白(IRBP)五大类。它们空间结构高度保守，分布广泛，功能多样，与多种疾病的发生发展关系密切视黄醇结合蛋白是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度。
与肾脏病的关系：RBP稳定性好，是一个比β2-MG更实用、可靠的肾功能指标，当肾小管功能受损时，尿中RBP可明显增高，较肌酐、尿素更准确灵敏。
与肝病的关系：肝病患者血清中RBP显著低于正常人，且急性病毒性肝炎病程早期血清RBP含量降低较晚期更明显。血清RBP水平能准确、灵敏地反映肝功能变化。
与其它疾病关系：RBP水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标，甲亢患者RBP水平较正常人低，甲减患者RBP水平高于正常人。此外，当血清RBP低于正常一半时，患者才出现暗适应能力降低，提示血清RBP含量能更灵敏地反映维生素A缺乏症。
胶乳颗粒增强比浊法(PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种：一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。
视黄醇结合蛋白检测方法，有免疫电泳的定性检测，到放射免疫、荧光免疫和酶免疫的定量检测，以及免疫比浊的自动化检测。
一、间接免疫荧光法
该法的基本原理是用特异性的抗体与载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物，继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗体。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。但是其不足也是明显的：
(1)在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别；
(2)操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，在很多基层医院难以推广，也不太适用于标本量较多的实验室；
(3)荧光测定中的本底较高，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难；
(4)结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足；
(5)只能进行定性检测，不能进行定量测定。
二、放射免疫分析法
放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应，是一种在无须采用生物测定方法的情况下用于检测抗原的实验室测定方法。该法极其敏感而又极其特异，但其却需要具备尖端复杂的设备，且成本也不低。同时，还需要特殊的预防措施，因为其要用到放射性物质。因此，如今放射免疫分析法在很大程度上已经被ELISA所取代。
三、免疫印迹法
免疫印迹是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。其不足之处在于：
(1)只能进行定性和半定量分析，无法得出被检物质具体的量。
(2)操作步骤繁琐，试验用时较长。
(3)检测的灵敏度还有待提高。
四、酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法(ELISA)被广泛应用于检测抗环瓜氨酸多肽抗体，但该方法也存在着下述的不足之处：
酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小。乳胶增强免疫比浊法也是测定血清或血浆中RBP浓度的常用方法，其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点。因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值，但是目前市场上的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好等问题，有待改进。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，是一种乳胶增强免疫比浊法的检测试剂盒来检测血清或血浆中的RBP含量，以达到操作简便、抗干扰能力强、特异性高、试剂稳定性好等快速测定结果准确可靠的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品；
所述试剂R1的溶剂为50～400mmol/L pH7.0～8.4的缓冲液，溶质及其在所述试剂R1中的含量为：表面活性剂50～300mmol/L，螯合剂50～100mmol/L，加速剂3～10％，防腐剂0.1～5％；所述百分比为质量体积比；
所述试剂R2的溶剂为50～400mM pH7.0～8.4缓冲液，溶质及其在所述试剂R2中的含量为：包被抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒2～15％，无关蛋白1～10％，无机盐150～400mmol/L；所述百分比为质量体积比；
所述校准品包含6支RBP重组蛋白浓度梯度的溶液；所述校准品中溶质及其在校准品中的含量为磷酸氢二钠2～5g/L、磷酸二氢钠3～6g/L、氯化钠15～35mmol/L、乙二胺四乙酸二钠25～50mmol/L、牛血清白蛋白1～5％、蔗糖3～8％、叠氮化钠0.2～2.2‰；所述比例为质量体积比。
优选地，所述试剂R1、试剂R2中缓冲液包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tirs缓冲液、MES缓冲液、PBS缓冲液、DIPSO缓冲液、MOPSO缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或几种。
优选地，所述试剂R1中表面活性剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂中的一种。
优选地，所述非离子表面活性剂包括吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温80、吐温81、吐温85、曲拉通100或甘油；所述阳离子表面活性剂包括乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺中的一种或几种；所述阴离子表面活性剂包括烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛黄酸钠中的一种或几种；所述两性表面活性剂包括羧酸基甜菜碱、磺基甜菜碱、十八烷基二羟乙基氧化胺、十四烷基二羟乙基氧化胺、十八酰胺丙基氧化胺中的一种或几种。
优选地，所述试剂R1中螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、二亚乙基三胺五乙酸盐中的一种或几种。
优选地，所述试剂R1中加速剂包括PEG2000-8000、葡聚糖4000-12000中的一种或几种。
优选地，所述试剂R1中防腐剂包括山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚中的一种或几种。
优选地，所述试剂R2中无关蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或明胶；所述无机盐为氯化钠或氯化钾。
优选地，所述试剂R2中抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒上的抗体包括鼠抗人视黄醇结合蛋白抗体、羊抗人抗人视黄醇结合蛋白抗体、兔抗人视黄醇结合蛋白抗体的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选地，所述试剂R2中抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒的胶乳为聚苯乙烯材质的纳米微球，表面带有羧基、氨基、羟基或酰肼基中的一种或几种。
优选地，所述聚苯乙烯材质的纳米微球为直径在50～500nm之间的两种不同粒径的胶乳微球的组合；所述组合中两种不同粒径微球的质量比是(1～6):1；所述质量比可以是大直径纳米微球比小直径纳米微球，也可以是小直径纳米微球比大直径纳米微球。
优选地，所述校准品包含的6个RBP重组蛋白浓度梯度为0mg/L、8.75mg/L、17.5mg/L、35mg/L、70mg/L、140mg/L。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明试剂盒采用复合胶乳颗粒包被抗体，灵敏度高、重复性好、准确度好、抗干扰能力强、提高了线性值，同时大大提高了抗体的纯度和效价，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为显示6种不同含量的RBP参考标准的标准曲线；
其中，每个点代表不同含量RBP的参考标准，X轴表示RBP的含量，Y轴表示吸光度；
图2为采用日立全自动生化分析仪，利用本发明试剂盒和北京利德曼公司的RBP的乳胶增强免疫比浊法试剂盒，按各自参数同时进行测定对50份人血清(包含正常和异常标本)，并对测定值进行相关分析。
其中，X轴表示的是本发明试剂盒测定的病人血清结果，Y轴表示的是北京利德曼公司试剂盒测定的病人血清结果，相关系数R2＝0.9955，回归方程为y＝1.0038x+0.5378。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种视黄醇结合蛋白的双粒子乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备。
试剂R1制备如下：
组分 具体种类 含量
缓冲液 MOPSO缓冲液 300mmol/L
表面活性剂 吐温20 150mmol/L
螯合剂 乙二胺四乙酸二钠 80mmol/L
加速剂 聚乙二醇8000 5％
防腐剂 NaN3 1‰
各种成分可以室温下依次添加，密封保存，备用。
试剂R2制备如下：
羊抗人RBP抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤：
步骤1：将直径80nm带羟基胶乳和直径150nm带羟基的乳胶按照3:1的比例混合，然后在40mM pH6.0的MOPSO溶液用EDC(50mg/ml)活化，使胶乳在体系中浓度达到的浓度为1.5mg/ml，再加入EDC溶液使EDC在体系中浓度达到50μg/ml；
步骤2：洗涤去掉溶液中的EDC，加pH6.0MOPSO(40mM)的缓冲液，加入羊抗人RBP多克隆抗体(15mg/ml)，至抗体终浓度2.0mg/mL，室温反应2小时；
步骤3：将步骤2所得的液体离心去上清液并加入pH6.0MOPSO(40mM)的缓冲液使之重悬浮；
步骤4：将步骤3所得的液体离心去上清液并加入pH7.4的Tirs缓冲液使之重悬浮；
步骤5：将步骤4所得的液体离心去上清液，取沉淀后用含有BSA，氯化钠，1.0mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液7.4封闭，避免非特异性反应和提高了试剂的稳定性。
最终制备所得试剂R2中溶剂甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，羊抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒含量为8％，BSA含量为5％，氯化钾含量为280mmol/L。
RBP校准品的制备：
在纯化水中依次加入磷酸氢二钠3.2g/L、磷酸二氢钠4.3g/L、氯化钠25mmol/L、乙二胺四乙酸二钠35mmol/L、BSA3％、蔗糖5％、叠氮化钠1‰得到校准品稀释液。
用RBP的重组蛋白溶于制备校准品稀释液，制备不同浓度的校准品(0mg/L、8.75mg/L、17.5mg/L、35mg/L、70mg/L、140mg/L)。
实施例2
本实施例描述的RBP检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1；R2的用量分别为225ul和75ul，样本量3ul。
采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的6种不同含量的RBP校准品(自制)的曲线(如图1所示)，每个点代表一个含量的参考校准品，其中X轴表示RBP含量(mg/L)；Y轴表示吸光度。
表1
实施例3：检测试剂的相关性试验
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂北京利德曼公司的RBP乳胶增强免疫比浊法试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述RBP测定方法中的参数进行测定，测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(RBP的含量mg/L)，由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R2＝0.9955，回归方程为y＝1.0038x+0.5378。结果表明本试剂与北京利德曼公司试剂盒测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
实施例4：重复性和准确度
用伯乐标示值分别为21.44mg/L和65.10mg/L的RBP质控品作为样本，按各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值()和标准差(S)。分别以计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为2.21％和1.90％，表明本试剂盒重复性好；以(/标示值)计算相对偏差进行准确度考察，其相对偏差分别为-2.54％和-1.41％，表明本试剂盒准确度高。
表2 本发明所述试剂盒的重复性和准确度考察
实施例5：干扰物质的影响
将浓度为140.00mg/L RBP校准品溶液，分别加入相同体积的各干扰物质溶液，加入后浓度分别为胆红素(20mg/L)、血红蛋白(500mg/L)，乳糜(福尔马肼)浊度为3000和类风湿因子(RF)(500IU/mL)，每个样本重复测定3次，取平均值，与加入同体积的蒸馏水比较，观察加入干扰物质与加入蒸馏水后RBP测定值的相对误差。结果表明：加入以上浓度干扰物质的与加入同体积蒸馏水后测定值的相对误差不超过3％，可以认为在中轻度溶血、黄疸或乳糜时，此测定方法的检测结果基本不受干扰。
表3 本发明所述试剂盒的干扰物质影响实验
加入的抗干扰物质 测定均值(mg/L) 相对误差
蒸馏水 62.35
胆红素(20mg/L) 63.25 1.44％
血红蛋白(500mg/L) 63.78 2.3％
乳糜(福尔马肼)浊度为3000 61.98 -0.59％
类风湿因子(RF)(500IU/ml) 61.59 -1.22％
实施例6
本实施例提供一种视黄醇结合蛋白的双粒子乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，其制备方法与实施例1相同，所设不同组分种类及含量如下：
试剂R1：
组分 具体种类 含量
缓冲液 Tirs缓冲液 50mmol/L
表面活性剂 乙醇胺 50mmol/L
螯合剂 氨基三乙酸 100mmol/L
加速剂 葡聚糖8000 10％
防腐剂 山梨酸钠 0.2‰
试剂R2：
校准品：校准品含有2g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钠、15mmol/L氯化钠、25mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1％BSA、3％蔗糖、0.2‰叠氮化钠。
实施例7
本实施例提供一种视黄醇结合蛋白的双粒子乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，其制备方法与实施例1相同，所设不同组分种类及含量如下：
试剂R1：
组分 具体种类 含量
缓冲液 巴比妥缓冲液 400mmol/L
表面活性剂 脂肪酸钠 300mmol/L
螯合剂 二亚乙基三胺五乙酸钠 50mmol/L
加速剂 葡聚糖12000 3％
防腐剂 苯酚 2.2‰
试剂R2：
校准品：5g/L磷酸氢二钠、6g/L磷酸二氢钠、35mmol/L氯化钠、50mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5％BSA、8％蔗糖、2.2‰叠氮化钠。
对比例1、2、3
对比例1、对比例2和对比例3是实施例6的对比例，制备方法、试剂R1、校准品均与实施例6相同，不同的是试剂R2，具体如下表所示。
通过对北京利德曼公司试剂、实施例6试剂、对比例1、对比例2、对比例3在抗干扰性、重复性和准确性方面的比较，结果显示：与单粒子乳胶技术相比，双粒子乳胶增强免疫比浊法在抗干扰、重复性和准确性(回收率)方面具有明显优势。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和校准品；
所述试剂R1的溶剂为50～400mmol/L pH7.0～8.4的缓冲液，溶质及其在所述试剂R1中的含量为：表面活性剂50～300mmol/L，螯合剂50～100mmol/L，加速剂3～10％，防腐剂0.1～5％；
所述试剂R2的溶剂为50～400mmol/L pH7.0～8.4的缓冲液，溶质及其在所述试剂R2中的含量为：包被抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒2～15％，无关蛋白1～10％，无机盐150～400mmol/L；
所述校准品包含6支视黄醇结合蛋白重组蛋白浓度梯度的溶液；所述校准品中溶质及其在校准品中的含量为磷酸氢二钠2～5g/L、磷酸二氢钠3～6g/L、氯化钠15～35mmol/L、乙二胺四乙酸二钠25～50mmol/L、牛血清白蛋白1～5％、蔗糖3～8％、叠氮化钠0.2～2.2‰。
2.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中缓冲液包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tirs缓冲液、MES缓冲液、PBS缓冲液、DIPSO缓冲液、MOPSO缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中表面活性剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂；
所述非离子表面活性剂包括吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温80、吐温81、吐温85，曲拉通100或甘油中的一种或几种；
所述阳离子表面活性剂包括乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺中的一种或几种；
所述阴离子表面活性剂包括烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛黄酸钠中的一种或几种；
所述两性表面活性剂包括羧酸基甜菜碱、磺基甜菜碱、十八烷基二羟乙基氧化胺、十四烷基二羟乙基氧化胺、十八酰胺丙基氧化胺中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、二亚乙基三胺五乙酸盐中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的加速剂包括PEG2000-8000、葡聚糖4000-12000中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中防腐剂包括山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中无关蛋白为BSA或明胶；所述无机盐为氯化钠或氯化钾。
8.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒上的抗体包括鼠抗人视黄醇结合蛋白抗体、羊抗人抗人视黄醇结合蛋白抗体、兔抗人视黄醇结合蛋白抗体的单克隆抗体或多克隆抗体中的一种。
9.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒的胶乳为聚苯乙烯材质的纳米微球，表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基中的一种或几种；所述聚苯乙烯材质的纳米微球为直径在50～500nm之间的两种不同粒径的胶乳微球的组合；所述两种不同粒径微球的用量比例是(1～6)：1。
10.根据权利要求1所述的基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述校准品包含的6个视黄醇结合蛋白重组蛋白浓度梯度为0mg/L、8.75mg/L、17.5mg/L、35mg/L、70mg/L、140mg/L。
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