CN101680891A - 测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具 - Google Patents

测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具 Download PDF

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Abstract

提供一种用于免疫比浊法的测定试剂，该测定试剂可以抑制不溶性载体颗粒量和单克隆抗体量，提高对于低浓度范围的测定对象的测定灵敏度，能够在宽浓度范围对测定对象进行测定，并且，还能够应用于试验片等待测物分析用具。所述测定试剂包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，其构成为：其中一种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，另一种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。优选前者为平均粒径小的不溶性载体颗粒群，后者为平均粒径大的不溶性载体颗粒群。

Description

测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具
技术领域
本发明涉及测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具。
背景技术
一直以来，作为临床检查中的免疫学测定方法，使用酶免疫分析法(EIA法)、免疫比浊法等。其中，使用胶乳颗粒作为不溶性载体颗粒的免疫比浊法，由于改良了测定灵敏度(例如，参照专利文献1～4)，并且能够利用自动分析仪器，因此近年来被广泛使用。
所述使用胶乳颗粒的免疫比浊法也被称作胶乳凝集免疫比浊法。该方法是利用以下方式的测定方法：使用负载有测定对象的抗体的胶乳颗粒，所述被负载的抗体与待测物中的测定对象(抗原)发生抗原抗体反应，从而所述胶乳颗粒凝集。所述待测物中的测定对象中具有例如像在体内发生炎症反应等时血液中所出现的C反应性蛋白(CRP)那样的、以很宽的浓度范围存在于血液中的物质。因此，所述使用胶乳颗粒的免疫比浊法，除了前述的提高灵敏度之外，还被要求能够在很宽的浓度范围内对所述测定对象进行定量。因此，提出了例如下述专利文献1～4中所记载的那样的使用2种胶乳颗粒的方法。
专利文献1中公开了一种使用附加有不同量的同一抗原或同一抗体的、平均粒径不同的2种胶乳颗粒的方法。另外，专利文献2中公开了以下方法：将抗体或抗原致敏后的、平均粒径不同的2种以上的胶乳颗粒混合，并照射特定波长的光。另外，专利文献3中公开了一种使用固定有单克隆抗体的、平均粒径不同的2种胶乳颗粒的方法。此外，专利文献4中公开了一种方法，该方法中使用了将分别用不同的单克隆抗体致敏而成的2种抗体致敏胶乳颗粒以特定比例混合后的物质。
专利文献1：日本特公昭63-14783号公报
专利文献2：日本专利第2588174号公报
专利文献3；日本特开2005-106609号公报
专利文献4：日本专利第3598701号公报
发明内容
然而，如所述专利文献1～3中所公开的那样的、使用平均粒径不同的2种胶乳颗粒的免疫比浊法，例如如下所述，难以确保测定对象(抗原)的可测定的浓度范围和测定灵敏度。即，所述免疫比浊法中，例如，为了确保对于低浓度的测定对象的测定灵敏度，需要增多平均粒径大的颗粒(大颗粒)的抗体致敏量，减少平均粒径小的颗粒(小颗粒)的抗体致敏量。然而，若减少对所述小颗粒的抗体致敏量，则为了确保测定对象的可测定的浓度范围，需要增加抗原抗体反应时的小颗粒量。其结果，胶乳颗粒所需要的成本升高。另外，由于抗原抗体反应时整体颗粒浓度变高，容易发生非特异性凝集。此外，若过量增加抗原抗体反应时的小颗粒量，则对于低浓度的测定对象的测定灵敏度反而会降低。另一方面，代替增加抗原抗体反应时的小颗粒量，而增加致敏反应时用于致敏小颗粒的抗体量，则测定对象为低浓度的情况下，小颗粒先于大颗粒而更多地与测定对象反应，因此难以确保对于低浓度的测定对象的测定灵敏度。此外，若减少小颗粒量，则可能会发生前区现象，另外，由于凝集的颗粒数减少，所以难以获得高浓度侧的灵敏度。这样，在使用平均粒径不同的2种胶乳颗粒的免疫比浊法中，例如，对最佳平均粒径的组合、用于致敏胶乳颗粒的抗体的比例、2种胶乳颗粒的混合比例、抗原抗体反应时的胶乳颗粒浓度等的控制很困难，难以确保对于低浓度的测定对象的测定灵敏度和测定对象的可测定的浓度范围。
另一方面，如所述专利文献3和4中所公开的那样的、使用负载有单克隆抗体的胶乳颗粒的方法，其目的在于防止前述非特异性凝集和确保测定灵敏度。然而，该方法由于使用单克隆抗体，因此存在成本高的问题。此外，单克隆抗体由于只有一种抗原识别部位，因此除了测定对象抗原为多价或多聚体的情况外，仅使用一种抗体则无法通过抗原抗体反应发生凝集。因此，在使用单克隆抗体的情况下，需要将多种单克隆抗体进行组合，但由于所选择的抗体需要满足相互的抗原识别部位不同、不会接近、不受位阻等条件，因此非常复杂。而且，通常仅单克隆抗体的话，则对于低浓度的测定对象的测定灵敏度较低。另外，胶乳凝集免疫比浊法中，在待测物中的测定对象(抗原)的浓度高的情况下，例如，若所述待测物的稀释率低，则稀释后的待测物(测定试样)中的测定对象的浓度依然很高，因此存在测定范围窄的问题。因此，胶乳凝集免疫比浊法无法像例如使用微芯片的测定方法那样应用于待测物稀释率低的测定方法中。
因此，本发明的目的在于提供一种例如可以抑制不溶性载体颗粒量和单克隆抗体量、提高对于低浓度范围的测定对象(抗原)的测定灵敏度、能够在宽浓度范围对测定对象进行测定，并且，还能够应用于试验片等待测物分析用具的测定试剂，以及使用该测定试剂的免疫比浊法和待测物分析用具。
为了达成所述目的，本发明的测定试剂的特征在于，其为用于免疫比浊法的测定试剂，
所述测定试剂包含含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，
所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，
所述平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群中，至少1种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
其他种类的不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
本发明的免疫比浊法的特征在于，该方法使用了具有不溶性载体颗粒群的测定试剂，所述不溶性载体颗粒群含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒，
通过使作为抗原的测定对象与所述抗体反应，
从而使所述不溶性载体颗粒群凝集，
作为所述测定试剂，使用本发明的测定试剂。
本发明的待测物分析用具的特征在于，其为用于免疫比浊法的待测物分析用具，其具有基板和测定试剂，并且在所述基板上配置有所述测定试剂，
所述测定试剂为本发明的测定试剂。
本发明人等为了达成所述目的，反复进行了一系列的研究。结果发现，如果使用以下测定试剂作为测定试剂的话，则能够以很少的颗粒量和单克隆抗体量对从低浓度至高浓度的测定对象(抗原)进行测定，从而完成了本发明。该测定试剂为：包含不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，其中，至少1种不溶性载体颗粒群负载有多克隆抗体和单克隆抗体，其他的不溶性载体颗粒群负载有所述两种抗体中的至少一种抗体。根据本发明，能够在很宽的浓度范围对测定对象进行定量，而且，能够高灵敏度地测定低浓度的测定对象。另外，根据本发明，能够利用待测物分析用具等，并且能够降低成本。
附图说明
图1为示出本发明的实施例中使用各种测定试剂对CRP浓度和吸光度变化量的关系进行测定的结果的图。
图2为示出本发明的其他实施例中使用各种测定试剂对CRP浓度和吸光度变化量的关系进行测定的结果的图。
图3为本发明的待测物分析用具的一个例子，(A)为所述待测物分析用具的平面图，(B)为所述(A)中所示的待测物分析用具的从I-I方向所观察的截面图。
图4为示出本发明的其他实施例中使用配置有干系测定试剂的待测物分析用具对CRP浓度和吸光度变化量的关系进行测定的结果的图。
附图标记说明
1         待测物分析用具
2a        上基板
2b        下基板
3         试剂部
4         测定部
5a、5b    流路
6         测定试剂
7         贯通孔、导入口
8         开口部
具体实施方式
本发明的测定试剂中，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，优选平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
优选平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。另外，本发明的测定试剂不限于上述形态，例如，也可以为以下形态。
即，也可以是以下形态：本发明的测定试剂中，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
本发明的测定试剂中，所述不溶性载体颗粒可以为胶乳颗粒。
本发明的测定试剂中，用于致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的、所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比优选为1∶9～7∶3。
本发明的待测物分析用具中，用于致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的、所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比优选为1∶9～7∶3。本发明的待测物分析用具，例如，可以为试验片、测试盒(cartridge)和微芯片中的任意一种。
以下，对本发明进行详细说明。但是，本发明不限于此。
<免疫比浊法>
本发明的免疫比浊法，如前所述，其特征在于，该方法使用了具有不溶性载体颗粒群的测定试剂，所述不溶性载体颗粒群含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒，通过使作为抗原的测定对象与所述抗体反应，从而使所述不溶性载体颗粒群凝集，作为所述测定试剂，使用本发明的测定试剂，即，使用如下测定试剂作为所述测定试剂：包含含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，所述平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群中，至少1种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，其他种类的不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
本发明中，只要使用2种以上平均粒径不同的不溶性载体颗粒群即可，例如，用以往公知的规定的方法求算平均粒径时，优选使用显示为不同平均粒径的2种以上的不溶性载体颗粒群。本发明中，“平均粒径”的种类没有特别限定，但通常可以列举数均粒径、长度平均粒径、平均(体积-面积)粒径(Volume-Surface meandiameter)、质量平均粒径、体积平均粒径、表面积平均粒径、比表面积等价粒径(equivalent specificsurface diameter)、中值粒径、众数径等，这些平均粒径的测定可以采用各自分别对应的公知的测定方法。另外，也可以使用能通过筛孔大小不同的2种筛子进行分类的2种以上的不溶性载体颗粒群。
另外，本发明中，“所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群”也可以指：例如在测定所使用的全部不溶性载体颗粒的粒径分布时，直方图中显示2个以上的峰。即，本发明中，“包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群的所述不溶性载体颗粒群”可以指：例如“其粒度分布具有2个以上的峰的不溶性载体颗粒群”。另外，作为所述粒度分布的测定方法，可以列举例如使用光学显微镜或电子显微镜的显微镜法、光散射法、遮光法、激光衍射法、电阻法、电感带法(electric sensing zone method)、筛分法、液相沉降法、离心沉降法、惯性碰撞法等。另外，也可以从这种粒度分布算出平均粒径。
另外，以各自的平均粒径作为基准，所述不溶性载体颗粒群中所含有的平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群例如可以含有粒径为平均粒径±15％的颗粒，优选含有粒径为平均粒径±5％的颗粒。
所述平均粒径不同的不溶性载体颗粒群的种类只要为2种以上，则没有特别限定，例如为2～5种，优选为2～3种，更优选为2种。
所述不溶性载体颗粒群的所述平均粒径没有特别限定，例如为0.03～2μm，优选为0.05～1μm，更优选为0.07～0.5μm。本发明中，例如，使用平均粒径不同的2种颗粒群的情况下，所述平均粒径小的颗粒(以下，称为“小颗粒”。)群的所述平均粒径例如为0.03～0.2μm，优选为0.05～0.15μm，更优选为0.07～0.12μm，相同情况下，所述平均粒径大的颗粒(以下，称为“大颗粒”。)群的所述平均粒径没有特别限定，例如为0.08～2μm，优选为0.1～1μm，更优选为0.12～0.5μm。
作为所述不溶性载体颗粒的材质，没有特别限定，可以使用例如合成高分子等有机化合物、多孔玻璃、硅胶等无机化合物等。所述不溶性载体颗粒的形态没有特别限定，可以列举例如胶乳颗粒、珠、板等，优选胶乳颗粒。
作为所述胶乳颗粒的材质，没有特别限定，可以列举例如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物等。另外，所述胶乳颗粒例如也可以在颗粒表面附加官能团等。作为所述官能团，可以列举例如羧基、氨基、磺基、甲醇基、酰氨基等。
本发明中，所述2种以上的不溶性载体颗粒群中，如前所述，至少1种不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体两者，与其平均粒径不相同的其他不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少任一者。后者的颗粒群，例如，可以仅负载多克隆抗体和单克隆抗体中的任一者，也可以负载两者，优选多克隆抗体、或多克隆抗体与单克隆抗体两者，更优选所述两者。本发明中，使用平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群的情况下，例如，可以使所述小颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者，使所述大颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体中的至少任一者。另外，也可以与之相反，例如，使所述小颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体中的至少任一者，使所述大颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者。其中，所述小颗粒优选负载多克隆抗体和单克隆抗体两者，所述大颗粒优选负载多克隆抗体或单克隆抗体中的至少任一者，更优选负载多克隆抗体、或多克隆抗体与单克隆抗体两者。
负载有多克隆抗体和单克隆抗体两者的所述不溶性载体颗粒中，所负载的所述多克隆抗体与单克隆抗体的比率没有特别限定。作为具体例子，在所述小颗粒的情况下，多克隆抗体：单克隆抗体例如优选为1∶9～7∶3，更优选为1∶9～5∶5。另一方面，在大颗粒的情况下，所述多克隆抗体：单克隆抗体例如优选为1∶9～5∶5。另外，所述不溶性载体颗粒所负载的所述多克隆抗体与单克隆抗体的比率例如为重量比或抗体分子数的比。
抗体对所述不溶性载体颗粒的负载没有特别限定，例如可以用抗体致敏所述颗粒而进行。所述抗体对所述颗粒的致敏反应没有特别限定，可以使用例如物理吸附法或化学结合法等公知的方法等而适当实施。另外，在所述不溶性载体颗粒的表面附加有所述官能团的情况下，例如，可以在对所述官能团进行了活化处理后，进行所述致敏反应。
在所述致敏反应时，所述不溶性载体颗粒的浓度没有特别限定。所述不溶性载体颗粒的浓度是指：例如，在进行用所述抗体致敏所述不溶性载体颗粒的反应时，致敏反应液中的不溶性载体颗粒的浓度。所述不溶性载体颗粒浓度例如为0.001～5w/v％，优选为0.01～2w/v％，更优选为0.1～1w/v％。
所述致敏反应中，多克隆抗体或单克隆抗体相对于所述不溶性载体颗粒的浓度没有特别限定，例如，可以根据所述不溶性载体颗粒的浓度而适当决定。所述抗体的浓度是指：例如，在进行所述抗体致敏所述不溶性载体颗粒的反应时，致敏反应液中的抗体的浓度。使所述大颗粒负载多克隆抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克隆抗体的浓度例如为0～2mg/mL，优选为0.001～2mg/mL，更优选为0.005～1.5mg/mL，进一步优选为0.01～1mg/mL。另外，使所述大颗粒负载单克隆抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述单克隆抗体的浓度优选为0～2mg/mL，更优选为0～1.5mg/mL，进一步优选为0～1mg/mL。另一方面，使所述小颗粒负载多克隆抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克隆抗体的所述抗体浓度例如为0～2mg/mL，优选为0.001～2mg/mL，更优选为0.005～1mg/mL，进一步优选为0.01～0.5mg/mL。另外，使所述小颗粒负载单克隆抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述单克隆抗体的浓度，例如为0～2mg/mL，优选为0.001～2mg/mL，更优选为0.005～1.5mg/mL，进一步优选为0.01～1mg/mL。
使所述不溶性载体颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者的情况下，所述致敏反应时的所述全部抗体的浓度没有特别限定。使所述小颗粒负载两种抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的全部抗体的浓度例如为0.001～5mg/mL，优选为0.01～1mg/mL，更优选为0.1～0.5mg/mL。使所述大颗粒负载两种抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的全部抗体的浓度例如为0.001～5mg/mL，优选为0.01～2mg/mL，更优选为0.1～1mg/mL。
另外，如前所述，使所述不溶性载体颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者的情况下，所述致敏反应时，所述多克隆抗体与单克隆抗体相对于所述不溶性载体颗粒的抗体浓度比没有特别限定。所述抗体浓度比是指：例如，在进行所述两抗体致敏所述不溶性载体颗粒的反应时，致敏反应液中的所述两抗体浓度比(多克隆抗体：单克隆抗体)。另外，所述抗体浓度比例如为重量比。使所述大颗粒负载所述多克隆抗体和单克隆抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克隆抗体与所述单克隆抗体的抗体浓度比没有特别限定，例如优选为1∶9～5∶5。另一方面，使所述小颗粒负载所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的情况下，例如，含有1w/v％不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克隆抗体与所述单克隆抗体的浓度比例如优选为1∶9～7∶3，更优选为1∶9～5∶5。
作为所述抗体，只要是与作为测定对象的抗原发生抗原抗体反应的抗体即可，可以列举例如Fab、Fab’、F(ab’)2等抗体片段、免疫球蛋白分子等。所述多克隆抗体可以使用以往公知的方法从例如小鼠、兔、山羊、绵羊、鸡等来源的血清中采集，或者也可以是市售的各种抗体。另外，所述单克隆抗体也没有特别限定，例如，可以使用市售的各种抗体，也可以适当使用通过采用了细胞融合技术或基因重组技术等公知方法而制作的抗体。
接着，就本发明的免疫比浊法，示出具体方法的一个例子，但本发明不限于此。
首先，使用前述2种以上的不溶性载体颗粒群，使这些颗粒所负载的抗体与待测物中的测定对象(抗原)发生抗原抗体反应，使所述不溶性载体颗粒群凝集。
作为所述测定对象(抗原)，只要可以发生抗原抗体反应，则没有任何限制。作为具体例子，可以列举例如C反应性蛋白、ASO(抗链球菌溶血素O)、类风湿因子、HbAlc、肌酐、肝炎病毒、各种酶等。
含有所述测定对象(抗原)的待测物没有特别限定，可以列举例如临床检查中的一般的待测物。作为所述待测物，可以列举例如全血、血细胞、血清、血浆、尿等生物试样。本发明中，例如，可以将所采集的所述待测物直接作为测定试样使用，也可以将在抗原抗体反应之前预先对待测物实施了稀释处理、过滤处理、加热处理等的待测物作为测定试样使用。作为用于所述稀释处理的溶剂，没有特别限定，可以列举水、生理盐水、缓冲液等。作为所述缓冲液的缓冲剂，例如，只要不妨碍所述反应即可，可以列举例如ME S(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等。所述缓冲液中例如还可以添加其他成分，例如，为了稳定反应，可以添加BSA(牛血清白蛋白)等。另外，所述稀释处理中的待测物的稀释率没有特别限定，例如，在使用后述那样的试验片的测定的情况下，也可以为低稀释率，作为稀释率的具体例子，例如优选为5～100倍，更优选为10～80倍，进一步优选为15～50倍。
作为使负载有所述抗体的不溶性载体颗粒与所述测定对象(抗原)发生抗原抗体反应的方法，没有特别限定，例如，可以使用公知的方法。作为所述反应方法，例如，可以向所述测定试样中添加分散有所述不溶性载体颗粒群的分散液而进行反应，也可以向所述不溶性载体颗粒群中添加所述测定试样而进行反应。后者的情况下，所述不溶性载体颗粒群例如可以是分散液，也可以是干燥状态。作为所述后者的方法，例如可以应用后述的试验片、微芯片、测试盒等待测物分析用具。具体而言，将所述不溶性载体颗粒群以例如分散液或干燥状态预先配置在基板的试剂部，向所述试剂部添加所述测定试样，从而能够进行抗原抗体反应。
所述抗原抗体反应时的所述不溶性载体颗粒浓度没有特别限定。所述不溶性载体颗粒浓度是指：例如，在所述不溶性载体颗粒的抗体与测定对象发生抗原抗体反应时，抗原抗体反应液中的不溶性载体颗粒的浓度。作为所述不溶性载体颗粒浓度，例如优选为0.011～1w/v％，更优选为0.033～0.5w/v％，进一步优选为0.055～0.3w/v％。另外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述小颗粒群的所述颗粒浓度优选为0.01～0.5w/v％，更优选为0.03～0.3w/v％，进一步优选为0.05～0.2w/v％。另外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述大颗粒群的颗粒浓度优选为0.001～0.05w/v％，更优选为0.003～0.04w/v％，进一步优选为0.005～0.03w/v％。
所述抗原抗体反应时，所述小颗粒群的颗粒与所述大颗粒群的颗粒的比例没有特别限定。作为具体例子，所述小颗粒群的颗粒与所述大颗粒群的颗粒的重量比优选为100∶1～1∶100，更优选为10∶1～1∶10，进一步优选为5∶1～1∶5。
作为具体例子，以血液作为待测物，将用于通过免疫比浊检测CRP的反应液的条件示于以下，但本发明不限于此。所述抗原抗体反应时的所述不溶性载体颗粒浓度没有特别限定。所述不溶性载体颗粒浓度是指：例如，在所述不溶性载体颗粒的抗体与测定对象发生抗原抗体反应时，抗原抗体反应液中的不溶性载体颗粒的浓度。作为所述不溶性载体颗粒浓度，例如优选为0.011～1w/v％，更优选为0.033～0.5w/v％，进一步优选为0.055～0.3w/v％。另外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述小颗粒群的所述颗粒浓度优选为0.01～0.5w/v％，更优选为0.03～0.3w/v％，进一步优选为0.05～0.2w/v％。另外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述大颗粒群的颗粒浓度优选为0.001～0.05w/v％，更优选为0.003～0.04w/v％，进一步优选为0.005～0.03w/v％。
接着，测定前述的抗原抗体反应。即，例如，通过检测由于所述抗原抗体反应而生成的所述不溶性载体颗粒群的凝集程度，从而测定所述抗原抗体反应。由此，可以间接地定量所述测定对象。
作为所述抗原抗体反应的测定方法，没有特别限定，例如，可以列举通过光学方法测定抗原抗体反应后的反应液的吸光度或散射光等的方法。所述光学方法中，例如，可以使用通用的光学测定仪器。另外，测定结果的评价方法也没有特别限定，例如，可以将所述抗原抗体反应的反应开始后一定时间内的吸光度变化量作为指标。此时，作为所述反应开始后一定时间，没有特别限定，优选反应开始后0～5分钟，更优选30～180秒，进一步优选30～150秒。
所述定量，例如，可以基于含有已知浓度的测定对象的标准试样的标准曲线而进行。作为具体例子，首先，准备多种设定为目标浓度范围的标准试样，使这些标准试样在同样的条件下发生抗原抗体反应，检测其凝集程度。然后，由表示所述凝集程度的吸光度等的测定值和所述已知浓度制作标准曲线，并将待测物的测定值代入所述标准曲线，从而定量所述待测物中的测定对象。
<测定试剂>
本发明的测定试剂为用于本发明的免疫比浊法的测定试剂，含有前述的所述不溶性载体颗粒群。本发明的测定试剂只要含有前述的所述不溶性载体颗粒群，则其他构成和条件没有任何限制。另外，只要没有特别表明，则如所述本发明的免疫比浊法中所述。
本发明中，所述2种以上的不溶性载体颗粒群各自的含有比例没有特别限定，例如，将本发明的测定试剂用于免疫比浊法时，优选按照抗原抗体反应时的各颗粒群的比例为所述本发明的免疫比浊法中所述那样的条件的方式而含有所述各颗粒群。
本发明的测定试剂，除了所述不溶性载体颗粒群以外，还可以含有例如如前所述的缓冲剂、分散剂、稳定剂等。另外，本发明的测定试剂例如可以是干燥体，也可以是液体。
<待测物分析用具>
本发明的待测物分析用具，如前所述，其特征在于含有本发明的测定试剂。具体而言，本发明的待测物分析用具的特征在于，其为用于免疫比浊法的待测物分析用具，其具有基板和测定试剂，并且在所述基板上配置有所述测定试剂，所述测定试剂为本发明的测定试剂。本发明的待测物分析用具只要含有本发明的测定试剂，则其他构成和条件没有任何限制。本发明的待测物分析用具中，所述测定试剂例如根据其形态，可以以干燥体形式进行配置，也可以以液体(分散液)形式进行配置。
本发明的待测物分析用具的形态没有任何限定，可以列举例如测试盒、试验片、微芯片等芯片等。所述待测物分析用具，优选能够连接到例如用于检测通过前述那样的抗原抗体反应的凝集程度的通用的测定仪器上。作为所述测试盒，例如可以列举以下形态：所述基板具备配置有所述测定试剂的试剂槽。关于所述测试盒，例如，在连接到所述测定仪器上之前或之后，将测定试样导入配置有所述测定试剂的所述试剂槽，在抗原抗体反应后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂槽内的凝集程度。另外，关于所述测试盒，例如，所述基板可以进一步具有通过流路而与所述试剂槽连结的反应槽。此时，可以向所述试剂槽导入测定试样，使所述测定试样与所述测定试剂的混合液通过所述流路而移动到所述反应槽中，从而测定所述反应槽内的凝集程度。配置于所述测试盒的所述试剂槽中的所述本发明的测定试剂，例如可以是液体(分散液)，也可以是干燥体。另外，作为所述试验片，例如可以列举：在长方形等的基板上配置有具有本发明的测定试剂的试剂部的形态。作为所述试剂部的材质，可以列举例如滤纸或各种聚合物制的多孔质体。这种试验片，例如，将测定试样添加到配置有所述测定试剂的所述试剂部，在抗原抗体反应后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂部中的凝集程度。在所述试验片中，所述本发明的测定试剂优选例如以干燥状态进行配置。例如，在将所述多孔质体等配置于所述基板之前或之后，向所述多孔质体等供给分散液状的所述测定试剂，然后将其干燥即可。另外，所述微芯片等芯片例如可以列举以下形态：所述基板具有试样的导入口、试剂部和流路，所述导入口和所述试剂部通过所述流路而连结。这种芯片，例如，从所述导入口导入测定试样，使所述测定试样通过所述流路向所述试剂部移动，在所述试剂部进行抗原抗体反应后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂部内的凝集程度。配置于所述芯片的所述试剂部的所述本发明的测定试剂，例如可以为液体，也可以为干燥体。另外，这些待测物分析用具的例如所述试剂部或试剂槽根据需要可以进一步含有用于检测凝集体的检测试剂。
以下，结合比较例而对本发明的实施例进行说明。另外，本发明不受以下的实施例和比较例的限制。
[实施例]
〔实施例1〕
本例中，作为平均粒径不同的不溶性载体颗粒群，使用负载有单克隆抗体和多克隆抗体的小颗粒群、和负载有多克隆抗体的大颗粒群，通过下述A和B工序，调制测定试剂。
A.不溶性载体颗粒的调制
本例中，使用平均粒径0.096μm的羧基改性聚苯乙烯胶乳颗粒(ceradyne，inc.制)作为所述小颗粒群的不溶性载体颗粒(小颗粒)，使用平均粒径0.213μm的羧基改性聚苯乙烯胶乳颗粒(ceradyne，inc.制)作为所述大颗粒群的不溶性载体颗粒(大颗粒)。首先，一边搅拌含有所述小颗粒的下述组成的活化液一边混合，在室温(25℃)下反应1小时，使颗粒表面的官能团活化。反应结束后，离心分离(6000rpm，15分钟)，除去上清，将活化了官能团的所述小颗粒悬浮于4mL 50mmol/L MES缓冲液(pH6.1)中，用超声波使其再分散，然后清洗。再次进行所述清洗操作后，离心分离(6000rpm，15分钟)，除去上清。使用50mmol/L MES缓冲液(pH6.1)悬浮所获得的所述小颗粒，用超声波使其再分散，获得小颗粒的胶乳分散液。另外，使所述胶乳分散液中的所述小颗粒的浓度为2w/v％。另一方面，使用所述大颗粒作为所述羧基改性聚苯乙烯胶乳颗粒，除此之外与调制所述小颗粒的胶乳分散液同样，调制大颗粒的胶乳分散液。
(活化液的组成)
※1NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，ナカライテスク公司制)
※2EDAC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，Sigma公司制)
接着，一边以不起泡的方式搅拌，一边向所述小颗粒的胶乳分散液2mL中添加下述组成的用于致敏小颗粒的抗体液2mL，在室温(25℃)下反应1小时，进行对小颗粒的致敏反应。下述组成中所示的浓度为致敏反应液中的各成分的最终浓度，使所述致敏反应液中的小颗粒的最终浓度为1w/v％。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的多克隆抗体与单克隆抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝7∶3。
(用于致敏小颗粒的抗体液的组成)
Figure A20088001770600222
※1兔来源的抗人CRP单克隆抗体液
(抗体浓度10.5mg/mL，克隆号No.8，Immuno Probe Co.，Ltd.制)
※2兔来源的抗人CRP多克隆抗体液
(蛋白质浓度12.2mg/mL，贝克尔(Becker)滴定度3.5mg/mL，Oriental Yeast Co.，ltd.制)
反应结束后，离心分离(6000rpm，15分钟)，除去上清，将致敏的所述小颗粒悬浮于50mmol/L MES缓冲液(pH6.1)4mL中，通过超声波处理使其分散，然后清洗。再次离心分离(6000rpm，15分钟)，除去上清后，将清洗后的所述小颗粒悬浮于50mmol/L MES缓冲液(pH6.1)2mL中，通过超声波处理使其再分散。将再分散的所述小颗粒与封闭缓冲液(50mmol/LMES缓冲液(pH6.1)，4w/v％BSA)2mL混合，通过超声波处理使其分散后，在4℃下静置一晚，进行封闭处理。封闭处理结束后，离心分离(6000rpm，15分钟)，除去上清，使用下述组成的分散液分散所述小颗粒，使小颗粒的分散浓度为3.33w/v％。
(分散液的组成)
另一方面，所述大颗粒使用下述组成的用于致敏大颗粒的抗体液，使致敏反应液中的大颗粒的最终浓度为0.5w/v％，使多克隆抗体的最终浓度为0.5mg/mL，不添加单克隆抗体，除此以外与所述小颗粒同样地进行致敏反应，进而，使大颗粒的分散浓度为1.67w/v％，除此之外与所述小颗粒同样地分散于分散液中。所述致敏反应液中，使所述大颗粒负载的多克隆抗体与单克隆抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝10∶0。另外，下述组成所示的浓度表示致敏反应液中的各成分的最终浓度。
(用于致敏大颗粒的抗体液的组成)
Figure A20088001770600241
※兔来源的抗人CRP多克隆抗体液
(蛋白质浓度12.2mg/mL，贝克尔(Becker)滴定度3.5mg/mL，Oriental Yeast Co.，ltd.制)
B.测定试剂的调制
首先，将所调制的所述含有小颗粒的分散液和所述含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与所述大颗粒的浓度比(重量比)为10∶1进行混合，获得胶乳混合液。然后，用所述分散液稀释所述胶乳混合液，使所述小颗粒浓度为0.372w/v％，所述大颗粒浓度为0.036w/v％，调制本例的测定试剂。另外，所述胶乳混合液中，所述小颗粒与所述大颗粒的重量比为小颗粒∶大颗粒＝10∶1。
〔实施例2〕
在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体液和单克隆抗体液的最终浓度分别为0.2mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝5∶5。
〔实施例3〕
在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.12mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.28mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝3∶7。
〔实施例4〕
在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。
〔比较例1〕
本例的测定试剂中，使小颗粒仅负载多克隆抗体。具体而言，在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为0.4mg/mL(未添加单克隆抗体)，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝10∶0。
〔比较例2〕
本例的测定试剂中，使小颗粒仅负载单克隆抗体。具体而言，在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的单克隆抗体的最终浓度为0.4mg/mL(未添加多克隆抗体)，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比为多克隆抗体∶单克隆抗体＝0∶10。
使用所述实施例1～4、比较例1和2的测定试剂，如下所述，通过免疫比浊法进行CRP的测定。CRP使用的是高纯的C反应性蛋白抗体(C-Reactive Protein Antigen，High Pure)(Capricon公司制)。
即，首先，将所述CRP用稀释液(50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，100mmol/L NaCl(ナカライテスク公司制)，1w/v％BSA)稀释，调制规定浓度(0、0.05、0.1、0.15、0.5、1、2.5、5、10、20mg/100mL)的CRP溶液(待测物)。然后，将所述各CRP溶液(待测物)用所述稀释液进一步稀释至1.66倍，调制测定试样。向所述各测定试样6μL中添加反应缓冲液(1.28w/v％NaCl)63μL和所述各测定试剂21μL，在37℃下使其反应。反应开始(添加)后5分钟，使用自动通用测定仪器(商品名Bio-majesty(BM-8)，日本电子公司制)测定所述反应液的658nm处的吸光度。然后，从所述反应开始150秒后的吸光度测定值减去所述反应开始30秒后的吸光度测定值，算出吸光度的变化量，将该变化量用于测定评价。另外，所述反应液中的胶乳颗粒浓度为：所述小颗粒的所述浓度为0.087w/v％，所述大颗粒的所述浓度为0.008w/v％，全部胶乳颗粒的浓度为0.095w/v％。
图1的图中示出了通过实施例1～4、比较例1和2的测定试剂的测定结果。该图中，横轴为各CRP溶液(待测物)的CRP的浓度(mg/100mL)，纵轴为各CRP浓度下的所述吸光度的变化量。另外，该图的图中，各实施例和比较例的图标为：实施例1为◆，实施例2为▲，实施例3为■，实施例4为●，比较例1为○，比较例2为□。如该图中所示，在使用使所述小颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体两者的实施例1～4的测定试剂时，伴随CRP浓度的增加，吸光度的变化量增大。与其相对，在使用使所述小颗粒仅负载任一者的抗体的比较例的测定试剂时，若CRP浓度超过10mg/100mL，则比较例2中吸光度变化量几乎没有变化，比较例1中则反而减少了。这样表明：通过使所述小颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者，能够在从低浓度至高浓度的很宽的浓度范围内，以高灵敏度进行测定。并且，如使用了实施例1～4的测定试剂的测定结果所示，通过改变负载的多克隆抗体和单克隆抗体的比例，能够容易地调整灵敏度。另外，即使所述反应液中的所述CRP溶液(待测物)的稀释率为非常低的约25倍，在使用实施例1～4的测定试剂时，随着CRP浓度的增加，吸光度变化量增大，可以获得良好的测定结果。此外，在使用减少了负载的单克隆抗体的比例的实施例1～4的测定试剂的测定中，与使用仅负载单克隆抗体的比较例2的测定试剂的情况相比，吸光度增加量变大，测定灵敏度均提高。
〔实施例5〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。另一方面，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.25mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.25mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝5∶5。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5∶1进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v％，所述大颗粒的浓度为0.083w/v％，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。
〔实施例6〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。另一方面，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.15mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.35mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝3∶7。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5∶1进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v％，所述大颗粒的浓度为0.083w/v％，除此之外与实施例1同样地调制本例的测定试剂。
〔实施例7〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。另一方面，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.1mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.4mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝2∶8。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5∶1进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v％，所述大颗粒的浓度为0.083w/v％，除此之外与实施例1同样地调制本例的测定试剂。
〔实施例8〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。另一方面，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.05mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.45mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5∶1进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v％，所述大颗粒的浓度为0.083w/v％，除此之外与实施例1同样地调制本例的测定试剂。
〔实施例9〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。另一方面，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.5mg/mL，不添加单克隆抗体，除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝10∶0。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5∶1进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v％，所述大颗粒的浓度为0.083w/v％，除此之外与实施例1同样地调制本例的测定试剂。
作为所述测定试剂，使用所述实施例5～9的测定试剂，关于抗原抗体反应时的所述反应液中的胶乳颗粒浓度，使所述小颗粒的所述浓度为0.097w/v％，使所述大颗粒的所述浓度为0.019w/v％(全部胶乳颗粒浓度为0.116w/v％)，除此之外与前述的实施例1～4、比较例1和2的测定同样，通过免疫比浊法进行测定。
图2的图中示出了通过实施例5～9的测定试剂的测定结果。该图中，横轴为各CRP溶液(待测物)的CRP的浓度(mg/100mL)，纵轴为各CRP浓度下的所述吸光度的变化量。另外，各实施例在该图中的图标为：实施例5为◆，实施例6为■，实施例7为▲，实施例8为●，实施例9为□。如该图所示，在使用实施例5～9中任一者的测定试剂时，伴随CRP的浓度的增加，吸光度的变化量均增大，能够在宽浓度范围进行测定。另外，使用了使大颗粒负载所述两抗体的大颗粒的实施例5～8的测定试剂的测定，与使用了仅负载多克隆抗体的实施例9的测定试剂的测定相比，高浓度范围的测定灵敏度进一步提高。
〔实施例10〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝1∶9。另一方面，与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体∶单克隆抗体＝10∶0。另外，本例中，含有小颗粒的分散液和含有大颗粒的分散液的调制，分别使用下述组成的分散液进行分散，使所述分散液中的所述小颗粒的浓度为2w/v％，所述分散液中的所述大颗粒的浓度为0.4w/v％，除此之外与实施例1同样地进行。并且，将所述小颗粒的分散液与所述大颗粒的分散液按照1∶1的体积比混合，调制下述组成的测定试剂。另外，本例的测定试剂中，所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5∶1。
(分散液的组成)
Figure A20088001770600311
(测定试剂的组成)
Figure A20088001770600312
接着，制作以下所示的本例的待测物分析用具1。图3示出了本例的待测物分析用具1。图3的(A)为所述待测物分析用具1的平面图，图3的(B)为从I-I方向观察该图的(A)的所述待测物分析用具1的截面图。另外，该图为本例的待测物分析用具1的概略图，整体和各结构的大小和比率等与实际不同。待测物分析用具1具备上基板2a和下基板2b，在所述下基板2b上层压有所述上基板2a。所述下基板2b在长度方向的左端附近和中央附近分别形成有凹部，前者成为配置测定试剂6的试剂部3，后者成为反应液的测定部4。所述下基板2b中，所述试剂部3和所述测定部4之间、以及所述测定部4和长度方向的右端部之间分别形成有槽，这些槽通过所述上基板2a的层压而形成流路5a、5b。另外，待测物分析用具1中，流路5b的右端的开口部8为与用于使流路5a、5b内部为负压的负压产生装置(例如，吸量管)的连结部。另一方面，上基板2a在长度方向的左端附近、且与所述下基板2b的试剂部3对应的部位具有贯通孔7，其成为测定试样的导入口7。上基板2a的材质为PET(聚对苯二甲酸乙二酯)，下基板2b的材质为PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)。
本例中，首先，在下基板2b上层压上基板2a，使用吸量管，通过所述导入口7向所述下基板2b的所述试剂部3添加所述测定试剂2.45μL，在室温下干燥2小时后，在湿度1％以下的环境下放置3天，制作待测物分析用具1。所述待测物分析用具1直到使用时保存在装有硅胶的铝包中。
将血液采集到采血管中，离心分离后，除去血浆。将所获得的血细胞用生理盐水清洗3次，调制洗净血细胞。另一方面，向无CRP的血清(Biopool公司)中以规定浓度(0、0.2、0.4、20、40、80mg/100mL)添加CRP，调制CRP溶液。然后，向所述无CRP的血清60μL和所述洗净血细胞90μL中添加所述CRP溶液50μL，使合计为200μL。将该混合液200μL中的25μL，使用生理盐水600μL进一步稀释至25倍，调制CRP-洗净血细胞溶液。以此作为测定试样。所述CRP-洗净血细胞溶液中的CRP浓度分别为0、0.05、0.1、5、10、20mg/100mL。将所述CRP-洗净血细胞溶液21μL滴入所述试剂部3，将干燥的所述测定试剂6悬浮。然后，立即通过连结到流路5b端部的开口部8的吸量管，向图3的(B)的箭头方向吸引，使所述流路5b内部为负压，使所述悬浮液移动到测定部4，使CRP与本例的测定试剂反应。另外，所述反应时的所述悬浮液中的不溶性载体颗粒浓度为：小颗粒为0.117w/v％，大颗粒为0.023w/v％，总颗粒浓度为0.14w/v％。以所述悬浮液移动到所述测定部4的时刻作为反应开始，在所述反应开始1分钟后和4分钟后，使用分光光度计，对测定波长660nm处的所述测定部4的吸光度进行测定。从所述反应开始4分钟后的吸光度减去所述反应开始1分钟后的吸光度，算出3分钟的吸光度变化量。
图4的图中示出所述吸光度变化量的测定结果。该图中，纵轴为吸光度变化量，横轴为CRP-洗净血细胞溶液中的CRP浓度(mg/100mL)。如该图所示，在使用本例的待测物分析用具1的测定中，伴随CRP的浓度的增加，吸光度的变化量增大，能够在宽浓度范围进行测定。
产业上的可利用性
本发明的用途可以列举例如临床检查或各种筛查等，其用途不受限制，能够在很广泛的领域中使用。

Claims (15)

1.一种用于免疫比浊法的测定试剂，其特征在于，所述测定试剂包含含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，
所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，
所述平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群中，
至少1种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
其他种类的不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
2.根据权利要求1所述的测定试剂，其中，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
3.根据权利要求1所述的测定试剂，其中，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，
平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
4.根据权利要求1所述的测定试剂，其中，所述不溶性载体颗粒为胶乳颗粒。
5.根据权利要求2所述的测定试剂，其中，用于致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比为1∶9～7∶3。
6.一种免疫比浊法，其特征在于，该方法使用了具有不溶性载体颗粒群的测定试剂，所述不溶性载体颗粒群含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒，通过使作为抗原的测定对象与所述抗体反应，从而使所述不溶性载体颗粒群凝集，
作为所述测定试剂，使用权利要求1所述的测定试剂。
7.根据权利要求6所述的免疫比浊法，其中，所述测定试剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
8.根据权利要求6所述的免疫比浊法，其中，所述测定试剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，
平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
9.根据权利要求6所述的免疫比浊法，其中，所述测定试剂中的所述不溶性载体颗粒为胶乳颗粒。
10.根据权利要求7所述的免疫比浊法，其中，致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比为1∶9～7∶3。
11.一种用于免疫比浊法的待测物分析用具，其特征在于，其具有基板和测定试剂，并且在所述基板上配置有所述测定试剂，
所述测定试剂为权利要求1所述的测定试剂。
12.根据权利要求11所述的待测物分析用具，其中，所述测定试剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
13.根据权利要求11所述的待测物分析用具，其中，所述测定试剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，
平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
14.根据权利要求12所述的待测物分析用具，其中，致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比为1∶9～7∶3。
15.根据权利要求11所述的待测物分析用具，其中，所述待测物分析用具为试验片、测试盒或微芯片。
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