CN202066863U

CN202066863U - 检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒

Info

Publication number: CN202066863U
Application number: CN 201020585719
Authority: CN
Inventors: 张忠英; 陈美珺; 游攀; 金宏伟
Original assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Current assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2020-10-29

Abstract

检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒，涉及免疫透射比浊的检测。包括盒体、应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶，应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶置于盒体内，应用液瓶中装应用液，应用液的组成为表面活性剂0.1％～0.5％、防腐剂0.05％～1％、高分子加速剂2％～8％、氯化钠0.1％～10％和缓冲剂50～200mmol/L；包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳0.5％～5％、表面活性剂0.1％～0.5％、稳定剂0.1％～0.5％和缓冲剂10～100mmol/L。

Description

检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种免疫透射比浊的检测，尤其是涉及一种检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒。

背景技术

脂联素(adiponectin)亦称Acrp30、GBP28或AdipoQ，是由脂肪细胞分泌一种激素蛋白，能在人体血浆中稳定存在，浓度范围约为3.0～17.0mg/L，约占血浆蛋白的0.01％([1]Arita Y，Kihara S，Ouchi N，et al.Paradoxical decrease of an adipose-specific protein，adiponectin，inobesity[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，257(1)：79-83)。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加([2]Zhang MH，Spies C，Ali S，et al.Adiponectinand inducible ischemia in patients with stable coronary heart disease：data from the Heart and Soulstudy[J].Atherosclerosis，2009，205(1)：233-238；[3]Kawano J，Arora R.The role of adiponectin inobesity，diabetes，and cardiovascular disease[J].J Cardiometab Syndr.2009，4(1)：44-49)。测定血中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。

目前，脂联素的临床诊断技术主要包括：放射免疫法(RIA)([4]Schulze MB，Shai I，RimmEB，et al.Adiponectin and future coronary heart disease events among men with type 2 diabetes[J].Diabetes，2005，54(2)：534-539)、酶联免疫试验(ELISA)([5]Urbonaviciene G，Frystyk J，Flyvbjerg A，et al.Association of serum adiponectin with risk for cardiovascular events in patientswith peripheral arterial disease[J].Atherosclerosis，2010，210(2)：619-624)等方法，它们的优点是灵敏度较高，缺点是操作繁琐，耗时长，易受人为操作和外界因素干扰，自动化程度低，而且放射性标记物会对操作者产生危害，对环境造成污染。这些缺点限制了现有的脂联素检测方法的推广应用，使其无法广泛地应用于临床诊断与科研工作。

颗粒增强免疫透射比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的吸光度。而且，这种改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不高的不足，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服ELISA和RIA方法的缺点，已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。目前，胶乳增强免疫透射比浊法已广泛用于胱抑素C([6]Al-Turkmani MR，Law T，Kellogg MD.Performance evaluation of a particle-enhanced turbidimetric cystatin C assay on theHitachi 917 analyzer[J].Clin Chim Acta.2008，398(1-2)：75-77)、脂蛋白(a)、C反应蛋白、超敏C反应蛋白、抗链球菌溶血素O的检测，取得良好的社会效益，但国内外至今尚未见有此类脂联素检测试剂盒问世。

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒。

本实用新型包括盒体、应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶，所述应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装应用液，所述应用液的组成及其按质量百分比的含量为表面活性剂0.1％～0.5％、防腐剂0.05％～1％、高分子加速剂2％～8％、氯化钠0.1％～10％和缓冲剂50～200mmol/L；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成及其按质量百分比的含量为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳0.5％～5％、表面活性剂0.1％～0.5％、稳定剂0.1％～0.5％和缓冲剂10～100mmol/L。

所述应用液中的表面活性剂可选自Tween 20或Triton-X100等。

所述应用液中的防腐剂可选自Proclin 300或叠氮钠等。

所述应用液中的高分子加速剂可选自聚乙二醇6000(PEG6000)或聚乙二醇8000(PEG8000)等。

所述应用液中的缓冲剂可选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或甘氨酸等。

所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的表面活性剂可选自Tween 20或Triton-X100等。

所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的稳定剂可选自牛血清白蛋白(BSA)等。

所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或甘氨酸等。

所述应用液缓冲剂与胶乳悬液缓冲剂最好保持一致。

本实用新型可采用以下方法制备：

1)制备胶乳抗体

将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，得两种胶乳抗体悬液；

所述将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，可采用以下具体方法：在碳酸盐缓冲液中将醛基微球分别与两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体混匀，37℃旋转反应后，加入碳酸盐缓冲液配制的NaBH₄溶液，4℃旋转反应后，再加入碳酸盐缓冲液配制的甘氨酸溶液，再4℃旋转反应后，用清洗贮存液进行清洗，所得胶乳抗体沉淀重悬于清洗贮存液中，得胶乳抗体悬液，置于4℃环境放置；

所述两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体可采用clone:Adn37抗体和clone:Adn26抗体；

所述醛基微球可采用上海照康生物科技有限公司提供的醛基微球，所述醛基微球的粒径可为100～300nm，最好为150nm，醛基微球的质量百分比为0.5％～5％；

所述碳酸盐缓冲液pH可为8.5～9.6，最好为9.6；质量百分比为20～100mmol/L，最好为50mmol/L。

所述37℃旋转反应的时间可为4～16h，最好为16h；

所述NaBH₄溶液的质量百分比为0.05～0.5g/L，最好为0.1g/L；

所述4℃旋转反应的时间可为2～4h，最好为4h；

所述甘氨酸溶液的质量百分比可为10～100mmol/L，最好为50mmol/L；

所述再4℃旋转反应的时间可为2～24h，最好为16h；

所述清洗贮存液pH可为7.4～8.8，最好为8.0，包括缓冲剂、表面活性剂和稳定剂。缓冲剂可以是磷酸盐，也可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)或甘氨酸，缓冲剂在清洗贮存液中所占的质量百分比为10～100mmol/L，最好为25mmol/L，表面活性剂和稳定剂的质量百分比分别为0.1％～0.5％和0.05％～0.5％，最好为0.2％和0.1％。

2)制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液

分别将步骤1)制备的两种胶乳抗体悬液混合，得包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液；所述两种胶乳抗体悬液混合最好是两种胶乳抗体悬液等体积混合。

3)制备应用液

将表面活性剂、防腐剂、高分子加速剂、氯化钠和缓冲剂一并完全溶解于水中，得应用液；所述缓冲剂种类与步骤2)中清洗贮存液中缓冲剂保持一致；所述应用液pH值可为7.4～8.0，最好为8.0；所述表面活性剂所占的质量百分比可为0.1％～0.5％，最好为0.2％，防腐剂所占的质量百分比可为0.05％～1％，最好为0.1％，高分子加速剂所占的质量百分比可为2％～8％，最好为4％；氯化钠所占的质量百分比可为0.1％～10％，最好为1.2％，缓冲剂的质量百分比可为50～200mmol/L，最好为100mmol/L。

4)配制脂联素系列标准品

选用脂联素标准品，使用小牛血清进行系列稀释：S6：40μg/ml，S5：20μg/ml，S4：10μg/ml，S3：5μg/ml，S2：1μg/ml S1：0.2μg/ml S0：小牛血清，分装即可。

所述脂联素标准品可选用商品化高纯度脂联素标准品；所述分装可采用0.5ml/瓶分装。

以下给出采用所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒在生化分析仪上进行脂联素检测的具体条件：

在生化分析仪上设定参数：

反应温度：37℃；

分析方法：2点终点法；

主波长：570nm，副波长：800nm(可不用)；

样品量/应用液(R1)/包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液(R2)：5μl/200μl/50μl；

反应方向：上升。

本实用新型采用抗人脂联素单克隆抗体包被醛基微球，通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不高的不足，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服ELISA和RIA方法操作复杂、重复性不好等的缺点，实现人血脂联素在生化仪上大批量定量快速检测人脂联素水平，归纳起来有以下几个方面的突出优点：(1)灵敏度较高，可达0.2μg/ml；(2)不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性好，能较真实地反映被测物质的含量；(3)能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。

附图说明

图1为本实用新型实施例的结构组成示意图。

具体实施方式

参见图1，本实用新型所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒实施例包括盒体1、应用液瓶2和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶3，所述应用液瓶2和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶3放置于盒体1内，所述应用液瓶中装应用液，所述应用液的组成及其按质量百分比的含量为表面活性剂0.1％～0.5％、防腐剂0.05％～1％、高分子加速剂2％～8％、氯化钠0.1％～10％和缓冲剂50～200mmol/L；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成及其按质量百分比的含量为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳0.5％～5％、表面活性剂0.1％～0.5％、稳定剂0.1％～0.5％和缓冲剂10～100mmol/L。

实施例1

制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒

以4mg醛基微球为例，本实施例的主要步骤包括：

1.制备胶乳抗体

选用高纯度、高亲和力的两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体(clone:Adn37，clone:Adn26)。使用20mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将醛基微球分别与两种抗体以10∶1的质量比混匀，37℃，旋转反应16h，此时总反应体积为400μl；反应结束后，加入上述碳酸盐缓冲液配制的4mg/mlNaBH₄溶液20μl，4℃，反应4h；再加入封闭试剂1mol/L甘氨酸溶液20μl，4℃，反应16h；25mmol/L TBS缓冲液(含Tween 20 0.2％，BSA 0.1％，pH7.4)清洗3次；沉淀重悬于4ml25mmol/L TBS缓冲液(含Tween 20 0.2％，BSA 0.1％，pH7.4)，胶乳悬液浓度为1mg/ml。

2.两种胶乳抗体混合，制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液

分别将制备的两种胶乳抗体悬液等体积混合，此为R2胶乳悬液。

3.制备应用液

pH8.0的50mmol/Ltris缓冲液，内含1.2％的NaCl，4％的PEG6000，0.1％Proclin 300。

4.脂联素系列标准品的配制

选用商品化高纯度脂联素标准品，使用小牛血清进行系列稀释：S6：40μg/ml，S5：20μg/ml，S4：10μg/ml，S3：5μg/ml，S2：1μg/ml，S1：0.2μg/ml S0：小牛血清，0.5ml/瓶分装即可。

实施例2

制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒

以4mg醛基微球为例，本实施例的主要步骤包括：

1.制备胶乳抗体

将醛基微球分别与两种抗体以20∶1的质量比混匀，余同实施例1。

同实施例1。

3.制备应用液

pH7.4的50mmol/Ltris缓冲液，内含1.2％的NaCl，6％的PEG6000，0.1％Proclin 300。

4.脂联素系列标准品的配制

同实施例1。

实施例3

制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒

1.制备胶乳抗体

将步骤1制备胶乳抗体中加入4mg/ml NaBH₄溶液的量改为10μl，4℃，反应时间改为2h，余同实施例1。

同实施例1。

3.制备应用液

pH8.0的200mmol/Ltris缓冲液，内含5.0％的NaCl，6％的PEG8000，0.1％Proclin 300。

4.脂联素系列标准品的配制

同实施例1。

实施例4

制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒

1.制备胶乳抗体

将实施例1步骤1)制备胶乳抗体中加入封闭试剂1mol/L甘氨酸溶液的量改为10μl，4℃，反应时间改为4h，25mmol/L TBS缓冲液中Tween 20改为0.5％，BSA改为0.5％，pH改为8.0，余同实施例1。

同实施例1。

3.制备应用液

同实施例1。

4.脂联素系列标准品的配制

同实施例1。

实施例5

生化分析仪上进行脂联素的检测

在7060型生化分析仪上设定参数：反应温度37℃；分析方法：2点终点法；主波长：570nm，副波长：800nm；样品量/R1/R2：5μl/250μl/50μl；反应方向：上升。读点分别在20点及34点。选择多点定标后，仪器自动完成定标，定标OK后，进行常规血清标本的脂联素检测，结果经仪器自动换算直接以mg/L为单位报告数值。

Claims

1.检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒，其特征在于包括盒体、应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶，所述应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶放置于盒体内。