CN103018465A - 一种人胱抑素c化学发光定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人胱抑素C的定量检测方法。该方法将磁微粒分离技术和酶促化学发光技术相结合，采用双抗体夹心一步反应法原理，可用于血清、血浆和尿液样本中人胱抑素C的含量测定，辅助各种肾功能损害疾病的诊断和治疗。该方法灵敏度≤0.01μg/L，定量检测范围：0.05-8μg/L,分析内精密度＜5%，检测用时10min，血清和尿液添加回收率在90-115%之间，与胶乳增强免疫比浊法试剂血清测值相关分析R²=0.9862。

Description

一种人胱抑素C化学发光定量检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了一种准确、灵敏、快速、定量检测人血清、血浆和尿液样本中胱抑素C(CYS-C)的化学发光免疫检测方法。

背景技术

胱抑素C是一种非糖化的蛋白质，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂的一种，由122个氨基酸组成，相对分子量约为13kDa。它由大多数有核细胞以一种恒定的方式产生，由肾小球滤过，在近曲小管完全冲吸收并分解。其分子量小，生成率稳定，由于其在血清中的浓度与肾小球滤过率（GFR）有密切的关系，并且对肾小球滤过率比肌酐更为敏感，因此胱抑素C对测定肾小球滤过率有极其重要的意义。胱抑素C完全由近曲小管重吸收，正常情况下不出现在尿液中。如果近曲小管重吸收功能有损害，尿液中胱抑素C浓度会出现明显升高。血清和血浆胱抑素C参考值范围，正常男性：（0.63-1.25）μg/ml，正常女性：（0.54-1.15）μg/ml，大于50岁正常人：（0.6-1.55）μg/ml。正常人尿液参考值范围：0.25-0.317μg/ml。

目前检测胱抑素C的方法主要有胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫法、化学发光法等。乳胶增强免疫比浊法的优点是检测特异性好、操作简单、精密度高、检测范围宽，缺点是灵敏度较低。酶联免疫法和化学发光法（申请号：201010245894.2）灵敏度很高，但是操作复杂，检测耗时长，检测范围窄，样本需要预稀释处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的化学发光免疫检测方法。该方法准确性好、精密度高、灵敏度高，样本无需预稀释，操作简单省时，检测范围宽。

本发明制备的人胱抑素C（CYS-C）定量测定试剂盒（磁微粒化学发光法）的试剂组成和试剂主要成分包括：

试剂1（R1）：含荧光素（FITC）标记的抗人CYS-C抗体的溶液；

试剂2（R2）：含碱性磷酸酶（ALP）标记的抗人CYS-C抗体的溶液；

磁分离试剂：含包被着抗FITC抗体的磁微粒的悬浊液。

本发明的技术解决方案如下：

磁分离试剂的制备：用碳二亚胺（EDC）作偶联剂,将抗FITC抗体共价连接在含羧基（COOH）的磁微粒的表面，然后用缓冲液稀释到工作浓度，完成磁分离试剂的制备。

试剂1的制备：将抗人CYS-C抗体与FITC按摩尔比1:20-1:200在0.1-0.2mol/LpH=9.0-10.0的碳酸盐缓冲液内混合，室温反应超过12h。用G-25凝胶柱将抗人CYS-C抗体-FITC连接物与游离FITC分离，获得偶联有FITC分子的抗人CYS-C抗体浓溶液，然后将该溶液用缓冲液稀释到工作浓度，完成试剂1的制备。

试剂2的制备：将抗人CYS-C抗体与ALP用SMCC、2IT作为交联剂进行连接。抗人CYS-C抗体与ALP摩尔比为1:1-1:2。交联后用凝胶层析的方法纯化，获得连接ALP的抗人CYS-C抗体浓溶液，将该溶液用缓冲液稀释到工作浓度完成试剂2的制备。

附图说明

图1.血清样本检测结果相关性

具体实施方式

实施例1：抗FITC抗体与磁微粒偶联，制备磁分离试剂。

材料与仪器

1.磁微粒：含羧基（COOH）活性基团，每克（g）磁微粒（干重）羧基含量不低于0.4毫摩尔（mmol），具有超顺磁性，直径在0.5-2μm之间。

2.抗FITC抗体：可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，纯度应超过90%，稀释效价应超过1:100万。

3.2-吗啉乙磺酸（MES）、碳二亚胺（EDC）、TRIS和其他试剂应达到化学纯。

操作步骤

1.取100mg磁微粒，磁分离去上清，用0.05mol/L, pH=4.5-5.0的MES缓冲液10ml重悬；

2.加入2-4mg的抗FITC抗体，室温混悬30-60min；

3.加入0.5-1ml，新鲜配制的10mg/ml的EDC水溶液，室温混悬2-12h；

4.磁分离，去上清，用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH=8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液重悬到1mg/ml，完成磁分离试剂的制备。

实施例2： FITC与抗CYS-C抗体连接制备试剂1

材料与仪器

1.抗人CYS-C单克隆抗体，由北京利德曼生化股份有限公司制备，纯度超过95%，浓度超过1mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；

2.异硫氰酸荧光素（FITC），碳酸钠等试剂应达到化学纯；

3.G-25凝胶纯化柱采购自GE公司。

操作步骤

1.用0.1-0.2 mol/L pH=9.0-10.0的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/ml的FITC溶液；

2.按照抗人CYS-C抗体与FITC摩尔比为1:20-1:200的比例在抗人CYS-C抗体溶液中加入FITC溶液，混合均匀，室温静置超过12h；

3.用G-25凝胶柱将抗人CYS-C抗体-FITC连接物与游离FITC分离，获得偶联有FITC分子的抗人CYS-C抗体浓溶液，将该溶液用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH=8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5-1μg/ml，完成试剂1的制备。

实施例3： ALP与抗人CYS-C抗体连接制备试剂2

材料与仪器

1.抗人CYS-C单克隆抗体，由北京利德曼生化股份有限公司制备，纯度超过95%，浓度超过5mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；

2.碱性磷酸酶纯度应超过95%，比活性应超过1000 U/mg，浓度超过5mg/ml；

3.偶联剂SMCC,2-IT购自THERMO公司,TRIS等化学试剂应达到化学纯；

4.AKTA-purifier蛋白纯化仪和Supperdex200凝胶纯化柱为GE公司产品。

操作步骤

1.取1mg抗人CYS-C抗体，加入10mg/ml的偶联剂2-IT溶液2-4μl，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min。用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的抗体，2-8℃保存备用；

2.取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液10-20μl，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

3.将上述活化的抗人CYS-C抗体与活化的ALP混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得抗人CYS-C抗体-ALP连接物浓溶液， 2-8℃保存备用。

4.将抗人CYS-C抗体-ALP连接物浓溶液用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH=8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5-1μg/ml，完成试剂2的制备。

实施例3：检测的实施和检测效果的评价

材料与仪器

1.胱抑素C试剂1，胱抑素C试剂2和磁分离试剂，由上述实施例1、2、3制备。

2.胱抑素C校准品、胱抑素C质控品、发光底物、清洗液、胱抑素C测定试剂盒（免疫比浊法）由北京利德曼生化股份有限公司生产。

3.CI1000全自动化学发光分析仪由北京利德曼生化股份有限公司生产。

4.AU400生化分析仪由奥林巴斯生产。

检测实施

下述检测步骤由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。

1.检测管内依次加入5μl样本、100μl试剂1、100μl试剂2、50μl磁分离试剂，混合均匀，37±0.5℃条件下反应5min；

2.使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入600μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬。重复此操作，共操作3次。

3.将磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入100μl的发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值（RLU）。

灵敏度评价

检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M+2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法灵敏度≤0.01μg/ml。

线性评价

将（8.0±1.0）μg/ml 的样本2倍稀释为9个浓度水平。将每一浓度的样本重复检测2次，计算检测结果平均值，将结果平均值和稀释比例进行直线拟合，计算线性相关系数r。本方法在0.05-8μg/ml检测范围内，相关系数r≥0.9990。

精密度评价

用（1.0±0.2）μg/ml和（3.0±0.6）μg/ml的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV=SD/M×100%计算变异系数CV。本方法CV≤5%。

准确度评价

在1例混合血清样本和1例混合尿液样本中添加不同量人CYS-C国际标准品，形成3个浓度水平的血清或尿液添加样本，添加物体积小于总体积的10%。检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法尿液和血清基质回收率在90-115%之间。数据参见表1.

$R=\frac{C\×(V_0+V)-C_0\×V_0}{V\×C_S}\×100\%$

R：回收率；

V：加入标准溶液的体积；

V₀：人源样品的体积；

C ：人源样品加入标准溶液后的检测浓度；

C₀：人源样品的检测浓度；

C_s：标准溶液的浓度。

表1.准确度评价——添加回收实验数据

注：人CYS-C标准溶液浓度=100μg/ml；添加前样本体积=1.0ml。相关性评价

用研制方法和胱抑素C测定试剂盒（免疫比浊法）同时检测100例血清样本。以胶乳增强比浊法测值为横坐标，研制方法测值为纵坐标做相关分析，相关系数R²=0.9862，斜率=1.01，截距=0.0581。参见图1。

热稳定性评价

取有效期内的样品，在37℃放置7天后，检测准确性、最低检测限、线性、重复性仍符合上述要求。

参考文献

[1].Abrahamson M, Olafsson I, Palsdottir A, et al. Structure and expression of the human cystatin C gene. Biochem J, 268:287–94。

[2].弓孟春，胡蓉蓉，李雪梅，等. 胱抑素C的临床应用进展. 中华内科杂志, 2009 年48卷10期。

[3].Ying Ma, Qi Li, Jiuping Wang, Zhuwei Xu, et al.Cystatin C, a novel urinary biomarker for sensitivedetection of acute kidney injury during haemorrhagicfever with renal syndrome. Biomarkers, 2010, 15(5):410–417。

Claims (6)

1.一种人胱抑素C的化学发光定量检测方法，其特征在于其是一种基于磁微粒分离技术和酶促化学发光技术的双抗体夹心一步反应法免疫检测方法，该检测方法包含了免疫反应、洗涤和加底物溶液检测发光强度的步骤，使用的试剂盒主要由试剂1、试剂2和磁分离试剂组成，其中试剂1为含荧光素（FITC）标记的抗人胱抑素C抗体的缓冲液，试剂2为含碱性磷酸酶（ALP）标记的抗人胱抑素C抗体的缓冲液，磁分离试剂为含包被有抗FITC抗体的磁微粒的缓冲液。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于其检测步骤包含：

1) 免疫反应：将待测样本原液与试剂1、试剂2和磁分离试剂混匀，温育；

2) 洗涤：使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁场，震荡，磁分离，再去除上清，此步骤重复2-3次；

3) 加底物溶液检测发光强度：在检测管中加入碱性磷酸酶催化的化学发光底物，震荡，检测单位时间内发光强度。

3.根据权利要求书1或2所述的检测方法，其特征在于其检测步骤包含：

1) 免疫反应：在检测管中加入2-10μl待测样本原液，然后加入100-200μl试剂1，100-200μl试剂2，20-100μl磁分离试剂，混匀，37±1℃条件下温育2-15min；

2) 洗涤：使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入300-1000μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后磁分离，去除上清；此步骤重复2-3次；

3) 加底物溶液检测发光强度：在检测管中加入100-300μl碱性磷酸酶催化的化学发光底物，震荡使磁微粒充分混悬，检测单位时间内发光强度。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于主要由试剂1、试剂2和磁分离试剂组成，其中试剂1为含荧光素（FITC）标记的抗人胱抑素C抗体的缓冲液，试剂2为含碱性磷酸酶（ALP）标记的抗人胱抑素C抗体的缓冲液，磁分离试剂为含包被有抗FITC抗体的磁微粒的缓冲液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，磁分离试剂由下述方法制备：用碳二亚胺（EDC）作偶联剂,将抗FITC抗体共价连接在含羧基的磁微粒的表面，然后用缓冲液稀释到工作浓度；试剂1由下述方法制备：将抗人CYS-C抗体与FITC混合，室温反应，将抗人CYS-C抗体-FITC连接物与游离FITC分离，稀释分离得到的溶液；试剂2由下述方法制备：将抗人CYS-C抗体与ALP进行交联，纯化，将获得的连接ALP的抗人CYS-C抗体浓溶液稀释。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，磁分离试剂由下述方法制备：用碳二亚胺（EDC）作偶联剂,将抗FITC抗体共价连接在含羧基的磁微粒的表面，然后用缓冲液稀释到工作浓度；试剂1由下述方法制备：将抗人CYS-C抗体与FITC按摩尔比1:20-1:200在0.1-0.2mol/L pH=9.0-10.0的碳酸盐缓冲液内混合，室温反应超过12h，用G-25凝胶柱将抗人CYS-C抗体-FITC连接物与游离FITC分离，获得偶联有FITC分子的抗人CYS-C抗体浓溶液，然后将该溶液用缓冲液稀释到工作浓度；试剂2由下述方法制备：将抗人CYS-C抗体与ALP用SMCC、2IT作为交联剂进行连接，抗人CYS-C抗体与ALP摩尔比为1:1-1:2，交联后用凝胶层析的方法纯化，获得连接ALP的抗人CYS-C抗体浓溶液，将该溶液用缓冲液稀释到工作浓度。

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