CN103389385A - 一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，它涉及医学免疫体外诊断领域，它是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为Tris缓冲体系，其组成为Tris缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 70-140mmol/l和乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/l；试剂R2为cTnI抗体包被的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒、Tris缓冲液40-100mmol/l；校准品为0-130U/ml牛血清基质，还包括防腐剂0.2-2.2%、稳定剂1-10%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。它的重复性好，试剂稳定，操作简便、灵敏度高、特异性好，测定快速、测定结果准确可靠。

Description

一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒

技术领域

 本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒。

背景技术

急性心肌梗塞（AMI）是发病率和死亡率较高的疾病之一。在诸多诊断AMI的酶学指标中，含M和B亚基的肌酸激酶同工酶（CK-MB）曾一度被认为是诊断的“金标准”而广泛应用多年。随着对心肌损伤标志物的不断深入研究，逐渐发现若干灵敏性、特异性较好的标志物。其中，心肌肌钙蛋白（cTn）以其优异的灵敏度和特异性正逐步取代CK-MB，成为判断心肌损伤坏死的新的确定标志物。

cTn检测主要用于心肌缺血损伤如急性冠状动脉综合征（包括隐性心绞痛和不稳定心绞痛以及AMI）等的临床诊断、危害性估计和预后判断，此外还可用于MI后溶栓治疗效果判定；心肌缺血损伤面积的估计、临床诊断心肌炎、心肌创伤（心脏手术）、围手术期心脏并发症、严重脓毒血症或脓毒血症导致的左心衰竭、充血性心功能不全，以及某些治疗药物的临床疗效观察。cTn包括心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)两种亚型。大量的临床研究资料证实，cTnI或cTnT在检测心肌损伤时的临床价值相同。

胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。

目前测定cTnI的常用方法有：酶联免疫法吸附法、化学发光法、酶联荧光分析法、胶体金免疫层析法和免疫比浊法。目前比较常用的方法是胶体金免疫层析法，但是此方法敏感性不好，重复性不好，尤其是只能作为定性检查，对于临床病人的疗效观察有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，它的重复性好，试剂稳定，操作简便、灵敏度高、特异性好，测定快速、测定结果准确可靠。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：它是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为Tris缓冲体系，其组成为Tris缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 70-140mmol/l和乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/l；试剂R2为cTnI抗体包被的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒、Tris 缓冲液40-100mmol/l；校准品为0-130U/ml牛血清基质，还包括防腐剂0.2-2.2%、稳定剂1-10%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。

所述的试剂R2中的聚苯乙烯乳胶粒子为胶乳颗粒直径在150-190nm之间。

所述的试剂R2抗体包被过程中cTnI抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-5/10。

所述的试剂R2抗体包被过程中，封闭液组分包括0.5%-1.5%脱脂奶粉、20-60mm的甘氨酸。

所述的试剂R2抗体包被过程中，胶乳稀释液组分包括 Tris 缓冲液30-80mmol/l，0.5%-1.5%脱脂奶粉，0.9%NaN3。

所述的校准品为心肌肌钙蛋白cTnI浓度分别为1.56，3.13，6.25，12.5，25.0ng/ml的五支校准品。

所述的牛血清基质由无HBV、HIV、HAV、HCV、TP传染源，同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂，叠氮钠作为防腐剂。

    本发明具有以下有益效果：它的重复性好，试剂稳定，操作简便、灵敏度高、特异性好，测定快速、测定结果准确可靠。

附图说明：

图1为本发明中试剂盒定标曲线图；

图2 为采用本发明试剂和国外某知名公司试剂血清相关性比对图；

图3为表1：本发明中实施1的中本发明试剂盒反应参数表；

图4为表2：实施例3中本发明试剂盒最低检测限实验数据表；

图5为表3：实施例3中国外某知名公司试剂盒的最低检测限实验数据表；

图6为表4：实施例4中本发明试剂盒的灵敏度实验数据表；

图7为表5：实施例4中国外某知名公司试剂盒的灵敏度实验数据表。

具体实施方式：

本具体实施方式采取以下技术方案：它是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为Tris缓冲体系，其组成为Tris缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 70-140mmol/l和乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/l；试剂R2为cTnI抗体包被的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒、Tris 缓冲液40-100mmol/l；校准品为0-130U/ml牛血清基质，还包括防腐剂0.2-2.2%、稳定剂1-10%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。

所述的试剂R2中的聚苯乙烯乳胶粒子，特征为胶乳颗粒直径在150-190nm之间。

所述的试剂R2抗体包被过程中cTnI抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-5/10。

所述的试剂R2抗体包被过程中，封闭液组分包括0.5%-1.5%脱脂奶粉、20-60mm的甘氨酸。

所述的试剂R2抗体包被过程中，胶乳稀释液组分包括 Tris 缓冲液30-80mmol/l，0.5%-1.5%脱脂奶粉，0.9%NaN3。

所述的校准品为心肌肌钙蛋白cTnI浓度分别为1.56，3.13，6.25，12.5，25.0ng/ml的五支校准品。

所述的牛血清基质由无HBV、HIV、HAV、HCV、TP传染源，同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂，叠氮钠作为防腐剂。

本具体实施方式具有以下有益效果：它的重复性好，试剂稳定，操作简便、灵敏度高、特异性好，测定快速、测定结果准确可靠。

实施例1 ：

测定试剂盒组成如下：本发明检测试剂盒及标准所需主要原料如下：

1   cTnI抗体，外购Abcam公司cTnI抗原，按照常规抗体制备方法制得，该抗体仅于人cTnI反应与其他抗原无免疫交叉反应，效价达到1：16以上。

2   聚苯乙烯胶乳，购买自德国FIT公司；乳胶颗粒粒径在150-190nm之间，在进行实验则相应试剂的检测主波长为500nm。

3 重组人cTnI（购自Abcam公司），用于制备本试剂所需标准品及质控品。

试剂配制如下：

试剂R1：

Tris缓冲液         70mmol/l

聚乙二醇6000      120mmol/l

乙二胺四乙酸二钠   10mmol/l

NaN3                0.9%

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。

试剂R2：

190nm的聚苯乙烯胶乳粒和cTnI抗体以100：30的质量比混合（缓冲液采用Tris缓冲液）,将两者混匀后37℃吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液（0.1%脱脂奶粉、0.2mm的甘氨酸），封闭2小时。离心去上清，用胶乳稀释（Tris缓冲液 55mmol/l，乙二胺四乙酸二钠 10.5mmol/l，0.05%脱脂奶粉，0.9%NaN3）至0.18%。

牛血清基质校准品制备：

将经过处理的牛血清，加入BAS 0.1%，NaN3 0.9%得到校准品稀释液。用重组cTnI溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品（1.56ng/ml，3.13ng/ml，6.25 ng/ml，12.50 ng/ml，25.0 ng/ml）。

本实施例描述的cTnI检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1；R2的用量分别为150ul和50ul，样本量20ul；150ul试剂R1加入20ul样本于37℃3min后加入50ulR2，延迟100秒开始读点，读数时间约120秒；检测波长分别主波长500nm。

实施例2：检测试剂的相关性试验

1 相关性试验

使用本法发明试剂（具体配方同实施例1 ）和对照试剂A公司的cTnI胶乳增强型试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清（包括正常和异常标本）按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述” cTnI测定方法”中的参数进行测定测定结果见图2， X，Y轴均为测定值（cTnI的含量ng/ml），

由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R2=0.9985，回归方程为y = 0.9678x + 0.0104。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

实施例3：最低检测限试验

本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。

采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、空白溶液（一般是生理食盐水和精制水）、正常人血清样本，低值样本（数值在试剂线性范围下限±1/3内的样本）。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

结果解析： 根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值＋2SD以上的就是试剂的最小检出感度。

表2、3结果显示，本发明试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值－2SD的数值均大于零点平均值＋2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到0.3ng/ml。而对照A公司试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值－2SD与零点平均值＋2SD大小。表中看出本公司试剂最低检测限为0.25 ng/ml左右，A公司试剂最低检测限为0.5ng/ml左右。

实施例4：灵敏度实验

本实验目的是检测试剂在测试生理盐水以及一定浓度的管理血清时的吸光度变化值。

采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、空白溶液、0.9％的生理食盐水，浓度的管理血清时的吸光度变化值。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水、低值样本，每个样本测试5次，计算吸光度。

表4、5显示，本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为0.0008（1/10000A），理论浓度为1.80ng/ml血清样本时吸光度变化为112.6（1/10000A），而A公司试剂测定生理盐水时吸光度变化为0.0004（10000A），理论浓度为1.80ng/ml血清样本时吸光度变化为90.2（1/10000A），表明本发明试剂灵敏度要显著高于A公司试剂。

Claims (7)

1.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于它是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为Tris缓冲体系，其组成为Tris缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 70-140mmol/l和乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/l；试剂R2为cTnI抗体包被的聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒、Tris 缓冲液40-100mmol/l；校准品为0-130U/ml牛血清基质，还包括防腐剂0.2-2.2%、稳定剂1-10%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。

2.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2中的聚苯乙烯乳胶粒子，特征为胶乳颗粒直径在150-190nm之间。

3.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中cTnI抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-5/10。

4.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中，封闭液组分包括0.5%-1.5%脱脂奶粉、20-60mm的甘氨酸。

5.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中，胶乳稀释液组分包括 Tris 缓冲液30-80mmol/l，0.5%-1.5%脱脂奶粉，0.9%NaN3。

6.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的校准品为心肌肌钙蛋白cTnI浓度分别为1.56，3.13，6.25，12.5，25.0ng/ml的五支校准品。

7.一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的牛血清基质由无HBV、HIV、HAV、HCV、TP传染源，同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂，叠氮钠作为防腐剂。

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