CN106568978A - 血清淀粉样蛋白a检测方法及试剂 - Google Patents

血清淀粉样蛋白a检测方法及试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清淀粉样蛋白A检测方法，包括：将受测体的血清SAA抗原和包被有SAA抗体的胶***联物混合，在体外进行凝集反应，定量测定血清中SAA含量。本发明还公开了一种血清淀粉样蛋白A检测试剂。本发明的血清淀粉样蛋白A检测方法及试剂所具有的优点如下：线性范围宽、检测快速、检测灵敏度高、准确度高、成本低、试剂稳定。

Description

血清淀粉样蛋白A检测方法及试剂
技术领域
本发明涉及检测试剂技术领域，尤其是涉及一种血清淀粉样蛋白A检测方法。本发明还涉及一种血清淀粉样蛋白A检测试剂。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)是一类多基因编码的多形态蛋白家族，组织淀粉样蛋白A的前体物质，属于急性时相反应蛋白。炎症或疾病感染期SAA在48～72h内迅速升高，可升高至最初浓度的1000倍，并且在疾病恢复期迅速下降(UrieliShoval S，et,al.Expression and function of serum amyloid A，a major acutephaseprotein，in normal and disease states[J].Curr Opin Hematol，2000，7(1):64-69.)。SAA在病毒和细菌感染中均升高，而病毒感染中CRP几乎不升高或升高不明显，两者联合检测有助于鉴别细菌感染和病毒感染。杨兰辉等研究表明手足口病患儿SAA明显升高，且与病情的严重程度呈正相关(杨兰辉，等.C‐反应蛋白和淀粉样蛋白A在手足口病诊疗中的应用研究，检验医学与临床，2012，11(22)，2838-2839)。此外，监测SAA/CRP比值比单独检测SAA或CRP具有更大的应用价值。SAA在肺癌、肝癌、乳腺癌、***癌、子宫内膜癌等多种肿瘤患者体内均有不同程度升高，且其水平与肿瘤的活动期、恶性程度及侵袭转移有明显的相关性，反映肿瘤患者的疗效及预后(Cocco E，et al.Serumamyloid A:a novel biomarkerfor endometrial cancer[J].Cancer，2010，116(4):843-851.)。SAA水平还与淀粉样变性疾病、冠心病、排斥反应(Muller T，et al.Prospective analysis of 10differentparameters of acute renal allograft rejection[J].Transplant Proc，1992，24(6):2731-2734.)等疾病(陈长强，等.血清淀粉样蛋白A在疾病应用中的研究进展[J].检验医学，2012，27(9):776-779.)密切相关，为临床诊断提供更好的参考信息。
目前，用于临床血清SAA检测的方法主要包括免疫胶体金法、乳胶增强速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶乳增强免疫比浊法等。乳胶增强速率散射比浊法只能在配套的特定蛋白分析仪上使用且检测成本相对较高，免疫胶体金法只能与金标数码定量分析仪配套使用，无法满足自动化快速批量检测的要求，近两年相关专利公开的胶乳增强免疫比浊法，采用多克隆抗体胶乳增强法，适用于全自动生化分析仪，但其线性范围较窄，临床应用中若遇到高浓度SAA样本需不断稀释，操作繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清淀粉样蛋白A检测方法，它具有可以同时满足线性宽和自动化快速批量检测的要求，具有良好的准确度、精密度、抗干扰性及灵敏度，能够满足临床检验要求的特点。本发明还公开了一种血清淀粉样蛋白A检测试剂。
本发明所采用的第一个技术方案是：
血清淀粉样蛋白A检测方法，包括：将受测体的血清S AA抗原和包被有SAA抗体的胶***联物混合，在体外进行凝集反应，定量测定血清中SAA含量。
所述SAA抗原与包被有SAA抗体的胶***联物通过相应的稀释后在液相中发生凝集反应，所述液相环境pH为6.0-9.0、温度为15℃-40℃。
所述检测方法采用的检测仪器为：自动生化分析仪；
分析方法为：两点终点法；
反应方向为：上升反应；
校准方式为：Spline；
测定波长为：546nm；
测定温度为：37℃；
样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl；
步骤为：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2，计算A2-A1差值，得出样本中血清淀粉样蛋白A含量。
本发明所采用的第二个技术方案是：
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2，
试剂R1包括：pH为6.5-8.5、浓度为10-100mmol/L的缓冲液，质量百分比为0.01％-2.00％的表面活性剂，质量百分比为0.01％-5.00％的反应促进剂，质量百分比为0.05％-3.00％的电解质，质量百分比为0.01％-1.00％的防腐剂，以及质量百分比为0.01％-4.00％的稳定剂；
试剂R2包括：质量百分比为0.05％-3.00％的表面活性剂，质量百分比为0.02％-12.00％的稳定剂，质量百分比为0.01％-1.00％防腐剂，质量百分比为0.05％-3.00％的电解质，pH为6.5-8.5、浓度为10-100mmol/L的缓冲液，胶***联物；以及
该胶***联物是标记有SAA多克隆抗体的大胶乳颗粒和标记有SAA单克隆抗体的小胶乳颗粒。
所述SAA多克隆抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，选自兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体；所述SAA单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体。
所述大胶乳颗粒，其粒径为110-380nm，质量百分比为0.01％-0.06％，所述小胶乳颗粒，其粒径为20-120nm，质量百分比为0.10％-0.50％，所述试剂R2中的大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:2～1:16。
所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸缓冲液中的一种。
所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂为Tween20、Tween80、Emulgen B-66、Triton X-100中的至少一种。
所述反应促进剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、溴化乙二甲氨、聚凝胺中的至少一种。
所述电解质为正价金属离子中的一种或多种，所述防腐剂为叠氮钠、叠氮锂、苯甲酸及其盐类、山梨酸盐类、亚硝酸钠、PC300中的至少一种，所述稳定剂为蛋白质、金属络合剂、助悬剂中的至少一种，所述蛋白质为牛血清蛋白或明胶中的至少一种，所述金属络合剂为HEDTA、CMOM、CMOS中的至少一种，所述助悬剂包括乙二醇、乳糖、蔗糖、甘油中的至少一种。
本发明的血清淀粉样蛋白A检测方法及试剂所具有的优点如下：
1、线性范围宽：为5-500mg/L，健康人参考范围为≤10mg/L，基本满足临床需要；
2、检测快速：适用自动生化分析仪，满足批量检测需求，检测快速简便；
3、检测灵敏度高：试剂缓冲液、界面活性剂等成分的配比提高了反应的灵敏度；
4、准确度高：采用优化的试剂配比，并溯源至国际参考物质NIBSC 92/680，保证测定结果的准确度；
5、成本低：与进口试剂的相关性达到0.9988，可替代进口试剂，进入市场后可降低使用成本；
6、试剂稳定：试剂各成分配比优化，试剂在2-8℃密闭条件下可稳定18个月。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：
图1是本发明的血清淀粉样蛋白A检测方法的操作步骤；
图2是本发明SAA试剂和西门子对比试剂/方法相关性；
图3是本发明SAA试剂线性范围测定；
图4是本发明SAA的溯源性。
具体实施方式
实施例1
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为6.5、浓度为100mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为0.01％的Tween20，反应促进剂为质量百分比为5.00％的聚乙二醇2000，电解质为质量百分比为1.20％的氯化钠，防腐剂为质量百分比为0.20％的叠氮钠，稳定剂为质量百分比为0.90％的牛血清蛋白。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:2，大胶乳颗粒的百分含量为0.06％，包被有SAA兔抗人多克隆抗体，粒径大小为110nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.12％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为120nm；表面活性剂为质量百分比为0.05％的Tween20；稳定剂为质量百分比为0.20％的牛血清蛋白；防腐剂为质量百分比为0.90％的叠氮钠；电解质为质量百分比为1.20％的氯化钠；缓冲液为pH值为6.5、浓度为100mmol/L的Tris缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例2
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为8.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为2.00％的Tween80，反应促进剂为质量百分比为0.01％的聚乙二醇4000，电解质为质量百分比为0.01％的氯化镁，防腐剂为质量百分比为0.01％的叠氮锂，稳定剂为质量百分比为0.01％的明胶。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:16，大胶乳颗粒的百分含量为0.01％，包被有SAA兔抗人多克隆抗体，粒径大小为380nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.16％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为20nm；表面活性剂为质量百分比为3.00％的Tween80；稳定剂为质量百分比为0.10％的明胶；防腐剂为质量百分比为0.01％的叠氮锂；电解质为质量百分比为0.05％的氯化钾；缓冲液为pH值为8.5、浓度为10mmol/L的甘氨酸缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例3
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为7.0、浓度为50mmol/L的HEPES缓冲液，表面活性剂为质量百分比为0.50％的Emulgen B-66，反应促进剂为质量百分比为2.50％的聚乙二醇8000，电解质为质量百分比为1.50％的氯化钾，防腐剂为质量百分比为1.00％的苯甲酸及盐类，稳定剂为质量百分比为4.00％的明胶(2.00％)和牛血清蛋白(2.00％)混合物。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:8，大胶乳颗粒的百分含量为0.03％，包被有SAA羊抗人多克隆抗体，粒径大小为200nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.24％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为100nm；表面活性剂为质量百分比为1.50％的Emulgen B-66；稳定剂为质量百分比为0.02％的HEDTA；防腐剂为质量百分比为0.50％的苯甲酸及其盐类；电解质为质量百分比为1.50％的氯化镁；缓冲液为pH值为7.0、浓度为50mmol/L的硼酸缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例4
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为7.5、浓度为60mmol/L的硼酸盐缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.00％的Tritonx-100，反应促进剂为质量百分比为1.00％的溴化乙二甲氨，电解质为质量百分比为3.00％的氯化钠(1.50％)和氯化镁(1.50％)混合物，防腐剂为质量百分比为0.50％的山梨酸盐类，稳定剂为质量百分比为2.00％的HEDTA。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:5，大胶乳颗粒的百分含量为0.02％，包被有SAA羊抗人多克隆抗体，粒径大小为160nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.10％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为80nm；表面活性剂为质量百分比为2.00％的Tritonx-100；稳定剂为质量百分比为1.00％的CMOS；防腐剂为质量百分比为1.00％的山梨酸盐类；电解质为质量百分比为0.10％的氯化钠；缓冲液为pH值为7.5、浓度为20mmol/L的HEPES缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例5
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为8.0、浓度为70mmol/L的磷酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.60％的Tritonx-100(0.80％)和Tween20(0.80％)混合物，反应促进剂为质量百分比为3.00％的聚凝胺，电解质为质量百分比为2.00％的氯化钠，防腐剂为质量百分比为0.07％的亚硝酸钠，稳定剂为质量百分比为3.00％的CMOM。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:10，大胶乳颗粒的百分含量为0.05％，包被有SAA羊抗人多克隆抗体，粒径大小为320nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.50％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为40nm；表面活性剂为质量百分比为3.00％的Tween20(1.50％)和Tritonx-100(1.50％)；稳定剂为质量百分比为2.00％的牛血清蛋白(1.00％)和明胶混合物(1.00％)；防腐剂为质量百分比为0.05％的亚硝酸钠；电解质为质量百分比为0.30％的氯化钾；缓冲液为pH值为7.0、浓度为30mmol/L的磷酸缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例6
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为6.5、浓度为80mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为0.80％的Tween80，反应促进剂为质量百分比为2.00％的聚凝胺(1.00％)和聚乙二醇2000(1.00％)混合物，电解质为质量百分比为3.00％的氯化钠，防腐剂为质量百分比为1.00％的PC300，稳定剂为质量百分比为1.50％的CMOS。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:4，大胶乳颗粒的百分含量为0.04％，包被有SAA兔抗人多克隆抗体，粒径大小为250nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.16％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为60nm；表面活性剂为质量百分比为0.10％的Tween20；稳定剂为质量百分比为2.50％的CMOM；防腐剂为质量百分比为0.10％的PC300；电解质为质量百分比为0.40％的氯化钠(0.20％)和氯化镁(1.20％)混合物；缓冲液为pH值为8.0、浓度为30mmol/L的Tris缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例7
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为7.0、浓度为50mmol/L的甘氨酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.20％的Tween20，反应促进剂为质量百分比为3.00％的聚乙二醇4000(1.00％)、聚乙二醇2000(1.00％)和溴化乙二甲氨(1.00％)混合物，电解质为质量百分比为1.50％的氯化钠，防腐剂为质量百分比为1.00％的PC300(0.50％)和叠氮锂(0.50％)，稳定剂为质量百分比为2.00％的乙二醇。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:6，大胶乳颗粒的百分含量为0.02％，包被有SAA兔抗人多克隆抗体，粒径大小为180nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.12％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为110nm；表面活性剂为质量百分比为1.00％的Tween80；稳定剂为质量百分比为12.00％的乙二醇；防腐剂为质量百分比为0.20％的叠氮钠(0.10％)和PC300(0.10％)混合物；电解质为质量百分比为1.00％的氯化钠；缓冲液为pH值为6.5、浓度为60mmol/L的甘氨酸缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例8
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为6.5、浓度为10mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为2.00％的Tween80，反应促进剂为质量百分比为4.00％的聚乙二醇4000，电解质为质量百分比为2.00％的氯化钠，防腐剂为质量百分比为1.00％的叠氮钠，稳定剂为质量百分比为1.00％的乳糖。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:3，大胶乳颗粒的百分含量为0.05％，包被有SAA羊抗人多克隆抗体，粒径大小为150nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.15％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为90nm；表面活性剂为质量百分比为1.20％的Tween80；稳定剂为质量百分比为3.00％的乳糖；防腐剂为质量百分比为0.30％的叠氮钠；电解质为质量百分比为2.00％的氯化钾；缓冲液为pH值为8.5、浓度为70mmol/L的Tris缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例9
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为7.0、浓度为20mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.50％的Tween20，反应促进剂为质量百分比为2.50％的溴化乙二甲氨，电解质为质量百分比为1.00％的氯化钠，防腐剂为质量百分比为0.30％的叠氮钠，稳定剂为质量百分比为4.00％的牛血清蛋白(2.00％)和蔗糖混合物(2.00％)。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:12，大胶乳颗粒的百分含量为0.03％，包被有SAA羊抗人多克隆抗体，粒径大小为120nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.36％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为100nm；表面活性剂为质量百分比为3.00％的Tween20(1.00％)、Tween80(1.00％)和Emulgen-66(1.00％)混合物；稳定剂为质量百分比为4.00％的蔗糖，防腐剂为质量百分比为0.40％的叠氮钠；电解质为质量百分比为0.40％的氯化钠；缓冲液为pH值为7.0、浓度为80mmol/L的Tris缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
实施例10
血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：
试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、反应促进剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：缓冲液为pH值为8.5、浓度为30mmol/L的HEPES缓冲液，表面活性剂为质量百分比为0.60％的Tween80，反应促进剂为质量百分比为0.05％的聚乙二醇2000，电解质为质量百分比为0.10％的氯化钾，防腐剂为质量百分比为0.05％的叠氮锂，稳定剂为质量百分比为3.00％的明胶(1.00％)、HEDTA(1.00％)和甘油混合物(1.00％)。
试剂R2包括：胶***联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、电解质、缓冲液。其中：胶***联物中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:11，大胶乳颗粒的百分含量为0.02％，包被有SAA兔抗人多克隆抗体，粒径大小为300nm，小胶乳颗粒的百分含量为0.22％，包被有SAA单克隆抗体，粒径大小为30nm；表面活性剂为质量百分比为1.60％的Tween80；稳定剂为质量百分比为6.00％的牛血清蛋白(2.00％)、CMOS(2.00％)和甘油(2.00％)混合物；防腐剂为质量百分比为0.60％的叠氮锂；电解质为质量百分比为1.50％的氯化钠；缓冲液为pH值为8.5、浓度为30mmol/L的HEPES缓冲液。
见图1所示，采用前述血清淀粉样蛋白A检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：
分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。
操作方法：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算样本中血清淀粉样蛋白A含量。
抗干扰性测试
使用SAA含量正常和异常的两个人全血样本，分别加入不同含量的干扰物质，采用实施例3配比的试剂R1、R2进行测定(其余实施例试剂同样具有相似的实验结果)，干扰效应结果如下：
当SAA浓度为10mg/L，胆红素≤60mg/dL，脂肪乳≤500mg/dL，血红蛋白≤750mg/dL。
当SAA浓度为40mg/L，胆红素≤60mg/dL，脂肪乳≤500mg/dL，血红蛋白≤750mg/dL。
效果例
1.本发明试剂与其他品牌试剂比较
本发明试剂和某厂家试剂进行性能分析比较，分别比较其精密度、稳定性、有效期、相关性等。精密度测定：本发明试剂(采用实施例1配比的试剂R1、R2，其余实施例试剂同样具有相似的实验结果)与某厂家试剂分别测定血清浓度正常(≤10mg/L)和异常的两个样本，批内精密度由1h内重复测定20次等到结果计算；批间精密度由每天分别测定1次，连续测定20d，计算批间精密度。相关性测定：本发明试剂(采用实施例2配比的试剂R1、R2，其余实施例试剂同样具有相似的实验结果)和某厂家试剂分别与西门子SAA试剂作比对，结果如表1所示。
表1本发明试剂与其他品牌试剂比较
2.本发明方法学与其他方法学比较
随机抽取某医院检验科的300例血清样本，分别采用本发明方法(胶乳增强免疫比浊法，(采用实施例4配比的试剂R1、R2，其余实施例试剂同样具有相似的实验结果))和免疫散射比浊法(西门子方法学)，结果如下表，两种方法学之间差异无统计学意义(P＞0.05)，如表2所示。由图2可得两种方法学相关系数(r)＝0.998。
表2两种方法SAA检测结果的比较(mg/L)
见图3所示，经测试，本发明SAA的线性范围宽，为5-500mg/L，健康人参考范围为≤10mg/L，基本满足临床需要。
准确度测试
见图4所示，采用优化的试剂配比，并溯源至国际参考物质NIBSC 92/680，保证了测定结果的准确度。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.血清淀粉样蛋白A检测方法，包括：将受测体的血清SAA抗原和包被有SAA抗体的胶***联物混合，在体外进行凝集反应，定量测定血清中SAA含量。
2.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的检测方法，其特征在于：所述SAA抗原与包被有SAA抗体的胶***联物通过相应的稀释后在液相中发生凝集反应，所述液相环境pH为6.0-9.0、温度为15℃-40℃。
3.根据权利要求1或2所述的血清淀粉样蛋白A的检测方法，其特征在于：
所述检测方法采用的检测仪器为：自动生化分析仪；
分析方法为：两点终点法；
反应方向为：上升反应；
校准方式为：Spline；
测定波长为：546nm；
测定温度为：37℃；
样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl；
步骤为：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2，计算A2-A1差值，得出样本中血清淀粉样蛋白A含量。
4.血清淀粉样蛋白A检测试剂，包括试剂R1、试剂R2，其特征在于：
试剂R1包括：pH为6.5-8.5、浓度为10-100mmol/L的缓冲液，质量百分比为0.01％-2.00％的表面活性剂，质量百分比为0.01％-5.00％的反应促进剂，质量百分比为0.05％-3.00％的电解质，质量百分比为0.01％-1.00％的防腐剂，以及质量百分比为0.01％-4.00％的稳定剂；
试剂R2包括：质量百分比为0.05％-3.00％的表面活性剂，质量百分比为0.02％-12.00％的稳定剂，质量百分比为0.01％-1.00％防腐剂，质量百分比为0.05％-3.00％的电解质，pH为6.5-8.5、浓度为10-100mmol/L的缓冲液，胶***联物；以及
该胶***联物是标记有SAA多克隆抗体的大胶乳颗粒和标记有SAA单克隆抗体的小胶乳颗粒的混合物。
5.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂，其特征在于：所述SAA多克隆抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，选自兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体；所述SAA单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体。
6.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂，其特征在于：所述大胶乳颗粒，其粒径为110-380nm，质量百分比为0.01％-0.06％，所述小胶乳颗粒，其粒径为20-120nm，质量百分比为0.10％-0.50％，所述试剂R2中的大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1:2～1:16。
7.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂，其特征在于：所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸缓冲液中的一种。
8.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂，其特征在于：所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂为Tween20、Tween80、Emulgen B-66、Triton X-100中的至少一种。
9.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂，其特征在于：所述反应促进剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、溴化乙二甲氨、聚凝胺中的至少一种。
10.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂，其特征在于：所述电解质为正价金属离子中的一种或多种，所述防腐剂为叠氮钠、叠氮锂、苯甲酸及其盐类、山梨酸盐类、亚硝酸钠、PC300中的至少一种，所述稳定剂为蛋白质、金属络合剂、助悬剂中的至少一种，所述蛋白质为牛血清蛋白或明胶中的至少一种，所述金属络合剂为HEDTA、CMOM、CMOS中的至少一种，所述助悬剂包括乙二醇、乳糖、蔗糖、甘油中的至少一种。
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