CN102662064A - 检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒及制备方法,应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,应用液瓶中装有应用液,其组分:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;抗体悬浮液瓶中装有包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶悬液,其组分:包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;标准品瓶中装有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。实现在生化仪上大批量定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫比浊的检测方法,尤其涉及检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白快速检测酶免试剂盒,可用于人尿液、血浆和血清检测。急性肾功能衰竭(ARF)是心脏手术、肾毒性、肾移植常见的并发症。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL),也称为Lipocalin-2(脂质运载蛋白-2),是脂质运载蛋白家族的一个新成员,是肾功能损伤早期的生物标志物。NGAL不仅仅存在于嗜中性粒细胞中,也会出现在特定的上皮细胞内,例如发生缺血性和毒性肾损伤过程中,肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加,在开始的两个小时内,尿液和血液中NGAL水平将显著增加,因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。
急性肾功能损伤过程中NGAL 水平偏高,预后将发展成为急性肾功能衰竭。NGAL水平偏高通常出以下情况:心血管手术患者、病危人员、脓血性或出血性休克、肾移植、静脉X射线造影剂的反应和肾毒性治疗反映。50%以上的病人都会出现一定程度的急性肾功能衰竭,通常大病后期出现使得死亡率大大增加。
急性肾衰竭的预后一直没有得到改善,在今后的四十年里将引起显著关注。通用的诊断方法如测定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)都只能在肾功能退化后检测出,那只能损伤后一天甚者几天内检测。用NGAL蛋白快速检测酶免试剂盒,医生可在损伤几小时内对急性肾功能障碍做适当的处理。
颗粒增强免疫透射比浊法(particle—enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法,其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克降抗体,当交联有抗体的微球与抗原结合后,在短时间内会迅速聚集在一起,改变了反应体系的吸光度。这种改变与被测抗原的浓度有一定的相关性,在一定范闹内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式,放大了抗原抗体反应,弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点,同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点,克服扎ELISA和RIA方法的缺点,已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。日前,胶乳增强免疫透射比浊法区广泛用于胱抑索C、脂蛋白a、C反应蛋白、抗链球菌溶血素0的检测,取得了良好的社会效益,但国内外至今尚未见有此类中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒问世。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现:
检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒,特点是:包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶,所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,所述应用液瓶中装有应用液,应用液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;所述抗体悬浮液瓶中装有包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶悬液,乳胶悬液的组分及其重量百分比为:包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;所述标准品瓶中装有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。
进一步地,上述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒,所述应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物;所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物;所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
本发明检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
a)制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;
b)制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;
c)配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L。
更进一步地,上述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,在步骤a)中,乳胶微球的粒径为100nm~500nm;所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2,质量比为20~200mmol/L;所述清洗储存液pH为7.4~9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸;所述乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
更进一步地,上述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,步骤b)中,所述缓冲液pH为7.4~9.0,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
再进一步地,上述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,步骤c)中,所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在:
通过颗粒增强的方式,放大了抗原抗体反应,弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点,同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点,克服扎ELISA和RIA方法的缺点,实现人血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在生化仪上大批量定量检测,操作简单,灵敏度高,不易受人为因素干扰,检测稳定性和重复性好,能真实反映被检测物的含量,能利用生化分析仪进行检测,容易实现自动化,适于临床推广应用。
具体实施方式
检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒,包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶,应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,应用液瓶中装有应用液,应用液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;抗体悬浮液瓶中装有包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶悬液,乳胶悬液的组分及其重量百分比为:包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;标准品瓶中装有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。
其中,应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物;应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物;乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备工艺步骤为:
a)制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为100nm~500nm;磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2,质量比为20~200mmol/L;清洗储存液pH为7.4~9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸;乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合;
b)制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物,缓冲液pH为7.4~9.0,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸;
c)配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L;其中,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
实施例1
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为100nm;磷酸盐缓冲液的pH为7.2,质量比为30mmol/L;清洗储存液pH为7.4,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.2%,防腐剂0.05%,缓冲液30mmol/L,表面活性剂为Triton-X405,防腐剂为Proclin-300,缓冲液为甘氨酸;乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.1%,防腐剂0.05%,氯化钠5%,缓冲液30mmol/L,表面活性剂为Tween-80,防腐剂为叠氮钠,缓冲液pH为8.0,缓冲液为甘氨酸。
配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L;其中,缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷。
实施例2
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为500nm;磷酸盐缓冲液的pH为9.2,质量比为60mmol/L;清洗储存液pH为9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.4%,防腐剂0.2%,缓冲液60mmol/L,表面活性剂为Triton-X100,防腐剂为叠氮钠,缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷;乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.4%,防腐剂0.2%,氯化钠10%,缓冲液60mmol/L,表面活性剂为Tween-20,防腐剂为Proclin-300,缓冲液pH为8.0,缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷。
配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L;其中,缓冲液为碳酸盐。
实施例3
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为200nm;磷酸盐缓冲液的pH为8.0,质量比为120mmol/L;清洗储存液pH为8.4,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.6%,防腐剂0.4%,缓冲液120mmol/L,表面活性剂为Tween-20,防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物,缓冲液为碳酸盐;乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.6%,防腐剂0.4%,氯化钠15%,缓冲液120mmol/L,表面活性剂为Tween-40,防腐剂为叠氮钠,缓冲液pH为9.0,缓冲液为碳酸盐。
配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L;其中,缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷。
实施例4
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为150nm;磷酸盐缓冲液的pH为8.2,质量比为150mmol/L;清洗储存液pH为8.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.8%,防腐剂0.8%,缓冲液180mmol/L,表面活性剂为Tween-80,防腐剂为叠氮钠,缓冲液为磷酸盐;乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.8%,防腐剂0.8%,氯化钠20%,缓冲液180mmol/L,表面活性剂为Triton-X100,防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物,缓冲液pH为7.4,缓冲液为磷酸盐。
配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L;其中,缓冲液为甘氨酸。
以下结合采用所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒在生化分析仪上进行中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测的具体条件:
在日立7080生化仪上的的设定参数:
反应温度:37度
分析方法:2点终点法
主波长:570nm,副波长800nm(可不选)
样本量/应用液/包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的乳胶悬液:3ul/200ul/50ul
反应方向:上升
读点分别为19点及31点
选择多点定标后,仪器自动完成定标,定标OK后,进行常规中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测。
本发明通过颗粒增强的方式,放大了抗原抗体反应,弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点,同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点,克服扎ELISA和RIA方法的缺点,实现人血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在生化仪上大批量定量检测,有以下几个方面突出优点:1)操作简单;2)灵敏度高;3)不易受人为因素干扰,检测稳定性和重复性好,能真实反映被检测物的含量;4)能利用生化分析仪进行检测,容易实现自动化,适于临床推广应用。
需要理解到的是:以上所述仅是本发明的优选实施方式,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒,其特征在于:包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶,所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,所述应用液瓶中装有应用液,应用液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;所述抗体悬浮液瓶中装有包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶悬液,乳胶悬液的组分及其重量百分比为:包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;所述标准品瓶中装有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。
2.根据权利要求1所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒,其特征在于:所述应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物;所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒,其特征在于:所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物;所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
4.权利要求1所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
a)制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;
b)制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;
c)配制中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品:选用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L。
5.根据权利要求4所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:在步骤a)中,乳胶微球的粒径为100nm~500nm。
6.根据权利要求4所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤a)中,所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2,质量比为20~200mmol/L。
7.根据权利要求4所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤a)中,所述清洗储存液pH为7.4~9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
8.根据权利要求4所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤a)中,所述乳胶微球与包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
9.根据权利要求4所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤b)中,所述缓冲液pH为7.4~9.0,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
10.根据权利要求4所述的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤c)中,所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
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