CN103399160A

CN103399160A - 一种免疫比浊法载脂蛋白e检测试剂盒

Info

Publication number: CN103399160A
Application number: CN2013103415191A
Authority: CN
Inventors: 赵小凤; 李伟奇; 房君江; 张秀文; 林清玉
Original assignee: SHANGHAI REIGNCOM BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI REIGNCOM BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2013-11-20

Abstract

一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒，它涉及试剂盒技术领域，它由R1试剂、R2试剂及校准品三部分组成，R1试剂组成为pH=7.0-7.6的缓冲液40-50mmol/L、表面活性剂70-150mmol/L、乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/L和防腐剂1-10‰；R2试剂为在一定量的R1试剂加入体积比为30-50%的抗人载脂蛋白E抗血清；校准品为80-200g/LApoE抗原，其还包括防腐剂0.2-15%、稳定剂1-4%、表面活性剂1-10%，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比；它能达到操作简便、灵敏度高、特异性好、快速测定结果准确可靠的目的。

Description

一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒。

背景技术

载脂蛋白E（ApoE）是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白。其分子量为34kD。ApoE可以在各种组织中合成，但肝脏为主，首先合成的是含有317个氨基酸的前肽，这个前肽在内质网中经过蛋白水解作用除去18个氨基酸的信号肽，再经过糖基化作用和细胞外液的脱唾液酸形成成熟的ApoE；ApoE分泌入血液后转移到脂蛋白中。ApoE是脂蛋白所必须的结构蛋白，可通过与各组织细胞的受体结合，参与脂蛋白代谢，调节胆固醇水平，激活卵磷脂腿固醇脂舫蘸转移酶（LCAT），并具有某种免疫调节作用。测定ApoE对诊断和治疗高脂血症动脉粥样硬化等疾病提供了重要理论依据。

已知测定ApoE的方法有层析法、电泳法、免疫分析法、其中层析法和电泳法操作繁琐，不能进行批量样本分析和直接上全自动生化分析仪等缺点，而免疫分析法中的免疫扩散法、放射免疫分析法、荧光标记免疫分析法、酶标记免疫分析法、化学发光免疫分析法也存在诸多不足之处；如需特殊的设备，样品需处理，不能上全自动生化分析仪进行批量监测分析等。临床常用的免疫比浊法因其样本用量少，可直接在全自动生化分析仪上批量样本分析、操作简单受其欢迎；但目前建立的方法及试剂都存在一些缺点和不足，主要表现在：一是抗体效价不高，特异性、亲合力、亲和力不好；二是校准血清是以人血清为基，虽然乙肝表面抗原阴性、HIV检测阴性、丙氨酸氨基转移酶正常的人血清，但这也很难排除没有其他传染病的可能，给操作者带来不很大的危险性；而且校准血清为冻干品，每批的定值不一，使用前需用水复溶，操作极其不方便；另外，复溶后必须冰冻保存，特别是不能反复解冻使用，不但造成试剂浪费，而且质量得不到保证，测定结果差异大，其稳定性也不好；三是对高脂、黄疸、溶血样本抗干扰能力差；四是采用单点校准液定标，不符合曲线回归方程计算，导致出现高值偏低，低值偏高的现象，所测结果不准确；五是抗血清在短时间内出现沉淀，使上机操作困难，影响检测效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒，它能达到操作简便、灵敏度高、特异性好、快速测定结果准确可靠的目的。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用如下技术方案：它由R1试剂、R2试剂及校准品三部分组成，R1试剂组成为PH=7.0-7.6的缓冲液40-50mmol/L、表面活性剂 70-150mmol/L、乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/L和防腐剂1-10‰；R2试剂为在一定量的R1试剂加入体积比为30-50%的抗人载脂蛋白E抗血清；校准品为80-200g/L ApoE抗原，其还包括防腐剂0.2-15%、稳定剂1-4%、表面活性剂1-10%，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。

所述的防腐剂可选用叠氮化钠、硫柳汞或苯酚中的一种或多种，本发明优选为叠氮化钠，其浓度为1-10‰。

所述的稳定剂可选用BSA或明胶，其优选BSA。

所述的表面活性剂可选用非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂，其优选的是非离子表面活性剂Tween20。

所述的校准品为0-5mg/l牛血清基质，其还包括防腐剂0.2-2.2%、稳定剂1-6%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。

本发明的检测原理是利用抗原抗体反应，加入R1试剂接触样本中抗原周围的电子层和水化层，是抗原微点充分暴露，然后加入试剂R2使有高强度特异反应的抗ApoE抗体与样本中相应的抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的ApoE含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体的吸光度值，与已知恒定的校准液比较，则可计算出样本中ApoE的含量。

附图说明：

图1为实施例中五种不同含量的ApoE参考标准的标准曲线示意图；

图2为分别采用本发明试剂和国外某知名公司的ApoE 的免疫比浊法试剂示意图；

图3为实施例一中操作配比示意图；

图4为实施例三中试剂最低检测限结果示意图；

图5为实施例三中A公司试剂最低检测限结果示意图；

图6为实施例四中试剂灵敏度示意图；

图7为实施例四中A公司试剂灵敏度示意图。

具体实施方式：

本具体实施方式采用如下技术方案：它由R1试剂、R2试剂及校准品三部分组成，R1试剂组成为PH=7.0-7.6的缓冲液40-50mmol/L、表面活性剂 70-150mmol/L、乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/L和防腐剂1-10‰；R2试剂为在一定量的R1试剂加入体积比为30-50%的抗人载脂蛋白E抗血清；校准品为80-200g/L ApoE抗原，其还包括防腐剂0.2-15%、稳定剂1-4%、表面活性剂1-10%，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。

所述的防腐剂可选用叠氮化钠、硫柳汞或苯酚中的一种或多种，本发明优选叠氮化钠。

所述的R1试剂中缓冲液选自Tirs缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选Tirs缓冲液，pH7.0-7.6，浓度为40-50mmol/L。

所述的R1试剂表面活性剂选自聚乙二醇6000-10000，优选为聚乙二醇8000，浓度为70-150mmol/L。

所述的R1试剂中防腐剂优选为NaN₃，浓度为1-10‰。

所述的载脂蛋白E试剂参考标准，为载脂蛋白E浓度分别为1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl、10mg/dl的四支校准品。

所述的稳定剂可选用BSA或明胶，其优选BSA。

实施例：

实施例一：

测定试剂盒组成如下：

本发明检测试剂盒及标准所需主要原料如下：

抗人载脂蛋白E抗血清外购Mildland公司，ApoE抗原（购自Mildland公司），用于制备本试剂所需标准品及质控品。

R1试剂配制如下：

试剂R1：

PH7.4 Tris缓冲液 45mmol/L

聚乙二醇8000 100mmol/L

乙二胺四乙酸二钠 30mmol/L

NaN3 9‰

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。

试剂R2：

PH7.4 Tris缓冲液 45mmol/L

聚乙二醇8000 100mmol/L

乙二胺四乙酸二钠 30mmol/L

抗人载脂蛋白E抗血清 40%

NaN3 9‰

牛血清基质校准品制备：

将经过处理的牛血清，加入BSA 2%、NaN3 0.9%、Tween20 4%得到校准品稀释液。用ApoE抗原溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品（1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl、10mg/dl）。

本实施例描述的ApoE检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作参数如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1；R2的用量分别为300ul和100ul，样本量3ul；300ul试剂R1加入3ul样本于37℃ 5min后加入100ul R2，即开始读点，反应5min后读取另一点；检测波长分别主波长340nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的5种不同含量的ApoE标准品（自制）的曲线（如图1所示），每个点代表一个含量的参考标准品，其中X轴表示ApoE含量（mg/dl）；Y轴表示吸光度。

实施例二：

检测试剂的相关性试验：

1、相关性试验：

使用本法发明试剂（具体配方同实施例一）和对照试剂A公司的ApoE 免疫比浊法试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清（包括正常和异常标本）按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述” ApoE测定方法”中的参数进行测定测定结果见图2， X，Y轴均为测定值（ApoE的含量mg/dL），

由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R²=0.9898，回归方程为y = 0.9856x + 1.4783。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

实施例三：

最低检测限试验：

本实施的目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。采用实施例一试剂、对照试剂、标准品、空白溶液（一般是生理食盐水和精制水）、正常人血清样本，低值样本（数值在试剂线性范围下限±1/3内的样本）。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值＋2SD以上的就是试剂的最小检出感度。

表2、3结果显示，本实施试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值－2SD的数值均大于零点平均值＋2SD，表明本实施试剂最低检测限至少可以达到0.2mg/dl。而对照A公司试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值－2SD与零点平均值＋2SD大小，其中1/16、1/8、1/4稀释平均值－2SD的数值小于零点平均值＋2SD， 1/2稀释平均值－2SD的数值大于零点平均值＋2SD，表明A公司试剂最低检测限为0.5mg/dl左右。

实施例四：

灵敏度实验：

本实验目的是检测试剂在测试生理盐水以及一定浓度的管理血清时的吸光度变化值。

采用实施例一试剂、对照试剂、标准品、空白溶液、0.9％的生理食盐水，浓度的管理血清时的吸光度变化值。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水、低值样本，每个样本测试5次，计算吸光度。

表4、5显示，本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为0.0435（1/10000A），理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为0.0126（1/10000A），而A公司试剂测定生理盐水时吸光度变化为0.2143（10000A），理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为0.0156（1/10000A），表明本发明试剂灵敏度要显著高于A公司试剂。

Claims

1.一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于它由R1试剂、R2试剂及校准品三部分组成，R1试剂组成为PH=7.0-7.6的缓冲液40-50mmol/L、表面活性剂 70-150mmol/L、乙二胺四乙酸二钠15-30mmol/L和防腐剂1-10‰；R2试剂为在一定量的R1试剂加入体积比为30-50%的抗人载脂蛋白E抗血清。

2.根据权利要求1所述的一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于所述的R1试剂中防腐剂优选为NaN₃，浓度为1-10‰。

3.根据权利要求1所述的一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于所述的R1试剂表面活性剂选自聚乙二醇6000-10000，优选为聚乙二醇8000，浓度为70-150mmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种免疫比浊法载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于所述的校准品为0-5mg/l牛血清基质，其还包括防腐剂0.2-2.2%、稳定剂1-6%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。