CN102353770A - 胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。本发明具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。
背景技术
肌酐，到目前为止被广泛作为肾小球滤过滤(GFR)的标志物，它是一种由肌肉产生的小分子物质，因此肌酐形成和分泌的速率和机体内肌肉含量密切相关。众所周知，在一个种群中，个体的肌肉含量是相对不同的，老年人比青壮年的肌肉含量要低，许多病人在他们疾病的进程存在肌肉含量的损失，孩子的肌肉含量也与成人不同，男人的肌肉平均含量要比女人高。当血清肌酐浓度作为肾小球滤过率标志物时，检测到的血清肌酐值要比实际低50％。而且饮食能够显著影响血清肌酐水平，特别是富含蛋白质的饮食。因此，血清肌酐浓度作为肾小球滤过率标志物时，受影响的因素很多，不易检测准确。目前，检测肌酐的方法中，有“金标法”和“静脉内注射放射性物质的方法”两种，但是“金标法”一般存在检测的可靠性差的不足；而采用在静脉内注射放射性物质的方法目前虽然受到普遍欢迎，但是，该方法昂贵、耗时，并且必须要进行注射、给患者带来痛苦。
有文献报道，胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cys-c，分子量为13kD)，能够滤过正常的肾小球，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物，采用简单的透射比浊法检测血清中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量可以代替目前复杂的肾小球滤过率测定方法。应用最多的就是胶乳增强免疫透射比浊法，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。
而胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到胶乳上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较化学偶联法要差，抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来；而且用物理吸附法得到的胶乳，有可能受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，IgM、IgG型RF可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的Fc段结合，这样嗜异性抗体可与包被在胶乳上的抗体结合，造成检测结果假阳性或假性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，因随机偶联的抗体随机偶联到抗体不同部位，将导致抗体损失结合力；所以，完全随机偶联会损失抗体大部分结合力，增加了抗体用量和生产成本。同时，若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒中，会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。
本发明上述试剂盒中R1与R2的容积比为5∶1。
本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。
本发明上述试剂盒中R1所用的缓冲液与配置R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。
本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品)，其平均粒径在0.01～1.5μm之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05～0.5μm之间。
本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体(人、羊、兔、鸡)及单克隆抗体。
在本发明所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒中，还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品；进一步的，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量为0～8mg/L。
本发明所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2制备步骤包括：
(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；
(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球。
本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：
步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝0.5～5∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝50～250∶100(重量比)；
步骤(2)中高碘酸钠∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝0.5～3∶100(重量比)；
步骤(3)中抗体∶激活的胶乳颗粒＝2～22∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒＝(25～50)∶100。加入的是原料胶乳，可以改成抗体：胶乳。都是重量比
本发明所述胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的胱氨酸蛋白酶抑制剂C与结合在胶乳颗粒表面的抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集；在546nm，700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明的试剂盒是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。
2.本发明试剂盒中的试剂R2制备是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于，本发明采用定向偶联法将胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到胶乳颗粒上；本发明将抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到胶乳颗粒上，不会发生类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰所导致的检测结果假阳性或假性升高，该方法定向偶联的抗体偶联到胶乳颗粒上后，其抗原结合位点指向流动相，抗体偶联部位为Fc片段，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。
3.本发明试剂盒中的R2制备采用定向化学偶联法，得到的致敏胶乳颗粒稳定性较好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，Fc段发生了结构上的改变，因此不会受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的制备
本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：
1.胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体：采用间接ELISA法测定效价为1∶100000。
2.胶乳：本发明仅示例性的采用直径为100～200nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。
本实施例的主要试剂的配制如下：
试剂R1：含1.5％PEG6000(聚乙二醇6000)，0.8％NaCl的氯化铵缓冲液。该试剂为无色透明溶液。
试剂R2：用抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下：
1.取1ml(100mg/ml)胶乳，用0.1M(mol/L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；
2.加入0.2ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(10mg/ml)混合完全，室温混和15min；
3.加入0.8ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(83mg/ml)，4℃反应过夜；
4.用0.1M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；
5.取1.5ml抗体(3.9mg/ml)溶液，加入0.2ml用0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min，
6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中，4℃反应过夜；
7.加入0.32ml 10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；
8.加入0.4ml 10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；
9.用0.1M，pH7.5Tris溶液洗涤3次，加入0.1M，pH7.5Tris溶液(含1％BSA，0.2％NaN3的Tris缓冲液)至胶乳终浓度为0.25％。
胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品：在缓冲溶液中加入不同含量的胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白，除菌过滤，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量控制在0～8mg/L之间，这些校准品均为无色透明液体。
实施例2 胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定
检测工具：日立7060型自动分析仪。
分析方法：两点终点法；主波长：546nm，副波长：700nm：样品量：3.0ul；R1：250ul；R2：50ul；校准方式：样条函数Spline；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与R1混匀后，于第30秒读取吸光度A1；于5分钟时加入R2，于5分钟时读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。
计算方法：多点定标，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
参考范围：0.55～1.05mg/L
实施例3 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒各项性能指标测试
1.灵敏度试验
测定6种不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品，每个样品测10次，通过计算均值和SD值(标准差值)，从表1可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为0.08mg/L。
表1
| CYS-C(mg/L) | 测定次数 | 均值 | 2.6SD | M+2.6SD | M-2.6SD |
| 0 | 10 | 0.02 | 0.031 | 0.05 | -0.02 |
| 0.04 | 10 | 0.05 | 0.044 | 0.10 | 0.01 |
| 0.08 | 10 | 0.10 | 0.031 | 0.13 | 0.07 |
| 0.12 | 10 | 0.15 | 0.058 | 0.21 | 0.10 |
| 0.16 | 10 | 0.19 | 0.044 | 0.23 | 0.14 |
| 0.20 | 10 | 0.22 | 0.032 | 0.25 | 0.19 |
2.高值线性测定
测定10个不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品，每个样品测2次，从表2可见，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到8mg/L，判定依据r2≥0.990。
表2
| CYS-C理论值(mg/L) | CYS-C实际值(mg/L) | |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 1.5 | 1.51 |
| 3 | 2.5 | 2.55 |
| 4 | 3.5 | 3.52 |
| 5 | 4.5 | 4.58 |
| 6 | 5.5 | 5.57 |
| 7 | 6.5 | 6.54 |
| 8 | 7.5 | 7.43 |
| 9 | 8.5 | 8.02 |
| 10 | 9.5 | 8.22 |
3.精密度试验
使用2个不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为1.36％和1.62％(见表3)，而批间相对极差为4.03％(见表4)。
表3
| 样品1 | 样品2 | |
| 测定次数 | 20 | 20 |
| 平均值(mg/L) | 0.715 | 5.659 |
| 最小值(mg/L) | 0.700 | 5.42 |
| 最大值(mg/L) | 0.730 | 5.78 |
| 标准差(SD) | 0.0097 | 0.0920 |
| 变异系数(CV％) | 1.36 | 1.62 |
表4
4.干扰试验
在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率，试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白以及乳糜微粒的浓度分别在200mg/dl，200mg/dl，5000mg/dl以及21000FTU以下时，它们对测定结果的干扰均在2％以下(见表5)。
表5
5.稳定性试验
在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月、12月和14月对同一血清样本进行测定，每个样本测5次，取均值(结果见表6)。结果表明，4月、8月、12月和14月与0月相比，测得值差异很小，说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定一年。
表6
| 项目 | 0月 | 4月 | 8月 | 12月 | 14月 |
| 试剂空白吸光度A0 | 0.7871 | 0.7780 | 0.7809 | 0.7951 | 0.7885 |
| 样本测得值 | 0.821 | 0.830 | 0.835 | 0.840 | 0.841 |
| 批内CV(％) | 1.30 | 1.32 | 1.25 | 1.42 | 1.57 |
从上述实施例可知本发明的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
Claims (10)
1.一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。
2.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的R1与R2的容积比为5∶1。
3.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.01～1.5μm。
5.根据权利要求4所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。
6.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒中，还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品。
8.根据权利要求7所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量为0～8mg/L。
9.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括：
(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；
(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球。
10.根据权利要求9所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳＝0.5～5∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶胶乳＝50～250∶100(重量比)；步骤(2)中高碘酸钠∶胶乳＝0.5～3∶100(重量比)；步骤(3)中抗体∶激活的胶乳颗粒＝2～22∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒＝(25～50)∶100。
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Address after: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Patentee after: MEDICAL SYSTEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Patentee before: NINGBO MEDICAL SYSTEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
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Application publication date: 20120215 Assignee: Ningbo Shengyuan Biotechnology Co., Ltd. Assignor: MEDICAL SYSTEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Contract record no.: X2022330000361 Denomination of invention: Cystatin C Detection Kit Granted publication date: 20131106 License type: Common License Record date: 20220809 |