CN109358009A - 胱抑素c测定试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胱抑素C测定试剂盒及其制备方法和检测方法，该胱抑素C测定试剂盒包括试剂R1和试剂R2，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：甘氨酸7.3～7.7g/L、聚乙二醇18.0～22.0g/L、生物防腐剂0.8～1.2mL/L以及氢氧化钠，聚乙二醇的分子量范围为5000～8000；试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：甘氨酸7.3～7.7g/L、保护剂1.8～2.2g/L、生物防腐剂0.8～1.2mL/L、抗人Cys‑C抗体胶乳颗粒147.0～153.0mL/L以及氢氧化钠。该胱抑素C测定试剂盒通过筛选包含特定配比的各组分分别形成试剂R1和试剂R2，使得对血清中Cys‑C的检测下限达0.2mg/L，灵敏度高，整体的线性范围可达10.0mg/L，精密度高，对血清中其他成分的干扰能力强，特异性好。

Description

胱抑素C测定试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种胱抑素C测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
胱抑素C(CystatinC，Cys-C)又称半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，是一种由122个氨基酸组成、带正电荷(等电点为9.3)的低分子量蛋白质，能够自由通过肾小球滤过膜。人机体所有的有核细胞均以恒定的速率产生Cys-C，其在血清中的浓度与肾小球的滤过率(GFR)密切相关。在肾功能不全、肝硬化、肿瘤等多种疾病的诊断中，能够很好的替代血清肌酐、肌酐消除率，成为一种新的可反映GFR的理想标志物。
胱抑素C是一种分泌性蛋白质，广泛存在于各种体液中，如脑脊液、血液、尿液、唾液、***等。在人体的脑脊液及***中浓度较高，尿液中的浓度最低。正常血浆Cys-C浓度为1.0mg/L，Cys-C在羊水中的浓度与血浆浓度相近，脑脊液Cys-C达5.8mg/L，比正常血浆水平高5-6倍；在***中浓度最高，平均51mg/L；平均尿浓度:血浆浓度为0.1:0.8mg/L。
在临床上，胱抑素C在肾功能和甲状腺等的检测中的应用越来越广泛。随着Cys-C在临床上的应用，检测血清胱抑素C的方法也越来越多，按原理大体分为以下两种：
(1)非均相法，例如单向免疫扩散法(RID)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫检测法(FIA)、酶联免疫测定法(ELISA)等；
(2)均相法，例如颗粒计数免疫测定法、颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)、颗粒增强散射免疫比浊法(PENIT)等。
由于血清中胱抑素C浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。Lofberg等首先用单向免疫扩散法及酶免疫测定法对胱抑素C含量进行测定，然而这两种方法不仅费时，而且检测限也差(分别为300ug/L和30ug/L)。随后出现较为简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定的方法报道，检测限有所降低，但是测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。也就是采用非均相测定方法，很难实现自动化。而采用均颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)和颗粒增强散射免疫比浊法(PENIT)的灵敏度和特异性相对较高，但仍然受血清中的胆红素、血红蛋白、乳糜等组分的较大影响。
发明内容
基于此，有必要针对提供一种灵敏度高的胱抑素C测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
一种胱抑素C测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
其中，所述聚乙二醇的分子量范围为5000～8000；
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
在其中一个实施例中，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
在其中一个实施例中，所述试剂R1和所述试剂R2中的生物防腐剂均为Proclin300。
在其中一个实施例中，所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白。
在其中一个实施例中，所述聚乙二醇的分子量为5500-7500。
在其中一个实施例中，所述抗人Cys-C抗体胶乳颗粒选自元升生物科技(上海)有限公司生产的抗人Cys-C抗体胶乳颗粒。
在其中一个实施例中，所述胱抑素C测定试剂盒还包括校准品；所述校准品选自北京世纪沃德生物技术有限公司生产的Cys-C校准品，浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L和8mg/L。
一种上述任一项所述的胱抑素C测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
配制试剂R1：按照上述任一项所述的试剂R1的组成称量各组分，将甘氨酸用4/5倍的预配制溶液总体积的纯化水搅拌使之溶解，加入氢氧化钠调节溶液的pH值至8.60±0.1，再依次加入聚乙二醇和生物防腐剂，溶解，定容，至于2～8℃储存；
配制试剂R2：按照上述任一项所述的试剂R2的组成称量各组分，将甘氨酸用4/5倍的预配制溶液总体积的纯化水搅拌使之溶解，加入氢氧化钠调节溶液的pH值至8.60±0.1，加入生物防腐剂，溶解，再蛋白保护剂和抗人Cys-C抗体胶乳颗粒，混匀，定容，至于2～8℃储存；
再将制备获得的试剂R1和试剂R2照体积比4:1的比例分别分装，再将分装后的试剂R1和分装后的试剂R2一对一组装，即得。
一种上述任一项所述的胱抑素C测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
选取的试验条件如下表：
主波长 530nm～550nm 副波长 无
分析方法 两点终点法 反应时间 10min
校正方法 Spline 反应方向 向上
按照下表内容进行测试：
计算：采用6点获取标准曲线：第1管取蒸馏水，输入值为0.00g/L，第2管～6管取校准品，输入测试获取的各校准品的吸光度差值，以△A为纵坐标，以浓度值为横坐标，绘出标准曲线；采用非线性法Spline模式或Logit-Log5P模式修正该标准曲线，获得修正后的标准曲线；根据该修正后的标准曲线计算测定的待测样本中的胱抑素C的含量。
本发明的有益效果是：
本发明的胱抑素C(CysC)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)采用乳胶增强免疫比浊法，通过筛选包含特定配比的各组分分别形成试剂R1和试剂R2，使得对血清中Cys-C的检测下限可达0.2mg/L，灵敏度高，整体的线性范围可达10.0mg/L，精密度高，对血清中其他成分的抗干扰能力强，特异性好。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)，包括独立包装的试剂R1、试剂R2以及校准品，其中，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
颗粒选自元升生物科技(上海)有限公司生产的抗人Cys-C抗体胶乳颗粒，货号为C0323。
校准品选自北京世纪沃德生物技术有限公司生产的Cys-C校准品，浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L和8mg/L。
本实施例提供的胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)的制备方法，包括如下步骤：
试剂R1的制备：准确称取甘氨酸，用4/5倍预配制体积的纯化水搅拌使之溶解，再加入适量氢氧化钠调节溶液pH值至8.60±0.1，依次加入准确称取的聚乙二醇6000和Proclin300，搅拌，溶解混匀，待完全溶解后，加入余量纯化水定容至预配制体积，缓慢混匀后，2-8℃储存。
试剂R2的制备：准确称取甘氨酸，用4/5倍预配制体积的纯化水搅拌使之溶解，再加入适量氢氧化钠调节溶液pH值至8.60±0.1，依次加入准确称取的Proclin300，搅拌，溶解混匀，待完全溶解后，加入牛血清白蛋白和抗人CysC抗体胶乳颗粒搅拌混匀，最后加入余量纯化水，定容至预配制体积，缓慢混匀，置于2-8℃储存。
分装；将制备的试剂R1和试剂R2照体积比4:1的比例分别进行分装，将分装后的试剂R1、分装后的试剂R2以及校准品进行一对一组装，即得。
对比例1
本对比例提供一种胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)，包括独立包装的试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
对比例2
本对比例提供一种胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)，包括独立包装的试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
可靠性验证
本发明还提供一种的胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)的检测方法，包括如下步骤：
选取试验条件(可根据不同检测仪器索取不同的上机参数)如下表1：
表1试验条件
主波长 548(530～550)nm 副波长 无
分析方法 两点终点法 反应时间 10min
校正方法 Spline 反应方向 向上
测试步骤见下表2：
表2具体测试步骤
备注：试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。
计算：
采用6点确定标准曲线：第1管取蒸馏水，输入值为0.00g/L，第2～6管取校准品，输入测试获取的各校准品的吸光度差值，以△A为纵坐标，以浓度值为横坐标，绘出标准曲线，并采用非线性法Spline、Logit-Log5P等模式修正该标准曲线，且保存此修正后的标准曲线，用于计算结果。不同批号的试剂一定要重新制作标准曲线。
建议各实验室建立自己的质控体系，选用适当的质控品进行质量控制。质控品测定值应该在规定的范围内。若超出规定范围，有必要采取相应的措施或联系生产厂家。
按照本发明的检测方法进行检测，测试的血清样本均来源于医院检验科，分别对实施例1、对比例1、对比例2以及常规市售九强以及宁波瑞源的胱抑素C(CysC)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)进行线性范围测试、精密度测试、抗干扰性测试，统计结果见下表3和表4：
表3结果统计表
表4实施例1的精密度试验结果统计(N＝8)
通过上表3和上表4可以看出，与对比例1和对比例2相比，实施例1的胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒(胶乳增强比浊法)通过特定配比的各组分形成试剂R1和试剂R2，使得对血清中Cys-C的检测下限达0.2mg/L，灵敏度高，整体的线性范围可达10.0mg/L，精密度高，可达到常规市售的胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒的线性要求。与常规售的胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒相比，实施例1的胱抑素C(Cys-C)测定试剂盒还对血清中其他成分的抗干扰能力强，尤其是β2-MG无交叉反应，特异性更好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
其中，所述聚乙二醇的分子量范围为5000～8000；
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
2.根据权利要求1所述的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
3.根据权利要求1或2所述的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和所述试剂R2中的生物防腐剂均为Proclin300。
4.根据权利要求1或2所述的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为5500-7500。
6.根据权利要求1或2所述的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述抗人Cys-C抗体胶乳颗粒选自元升生物科技(上海)有限公司生产的抗人Cys-C抗体胶乳颗粒。
7.根据权利要求1或2所述的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述胱抑素C测定试剂盒还包括校准品；
所述校准品浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L和8mg/L。
8.一种权利要求1至7任一项所述的胱抑素C测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制试剂R1：按照权利要求1至7任一项所述的试剂R1的组成称量各组分，将甘氨酸用4/5倍的预配制溶液总体积的纯化水搅拌使之溶解，加入氢氧化钠调节溶液的pH值至8.60±0.1，再依次加入聚乙二醇和生物防腐剂，溶解，定容，至于2～8℃储存；
配制试剂R2：按照权利要求1至7任一项所述的试剂R2的组成称量各组分，将甘氨酸用4/5倍的预配制溶液总体积的纯化水搅拌使之溶解，加入氢氧化钠调节溶液的pH值至8.60±0.1，加入生物防腐剂，溶解，再蛋白保护剂和抗人Cys-C抗体胶乳颗粒，混匀，定容，至于2～8℃储存；
再将制备获得的试剂R1和试剂R2按照体积比4:1的比例分别分装，再将分装后的试剂R1和分装后的试剂R2一对一组装，即得。
9.一种权利要求1至7任一项所述的胱抑素C测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
选取如下表所示的试验条件：
主波长 530nm～550nm 副波长 无 分析方法 两点终点法 反应时间 10min 校正方法 Spline 反应方向 向上
按照下表所示的步骤进行测试：
计算：采用6点获取标准曲线：第1管取蒸馏水，输入值为0.00g/L，第2管～6管分别取校准品，输入测试获取的各校准品的吸光度差值，以△A为纵坐标，以浓度为横坐标，绘出标准曲线；采用非线性法Spline模式或Logit-Log5P模式修正该标准曲线，获得修正后的标准曲线；根据该修正后的标准曲线计算测定的待测样本中的胱抑素C的含量。
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