CN103389383A - 一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,它涉及医学免疫体外诊断领域,试剂盒是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成,试剂R1为磷酸盐缓冲体系,试剂R2的组成为交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液,校准品为重组人肌红蛋白溶于磷酸缓冲液中,同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂,叠氮钠作为防腐剂。它操作简便、灵敏度高、特异性好,能快速的测定结果、且测定结果准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断领域,具体涉及一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)是发病率和死亡率较高的疾病之一。目前AMI检测的主要生化标志物有肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDL)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和肌红蛋白(MB)等。但是CK-MB、LDL、cTnT在诊断心肌梗死时的敏感性没有MB高,MB是迄今为止公认的心肌损伤早期标志物。MB是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白,它是组成骨骼肌和心肌的主要蛋白质,分子量为17.8 KD。由于其分子量小,可以很快的从缺血的心肌组织释放入血,在心肌梗死发病后1-3小时血中浓度迅速上升,6-7小时达峰值,12小时内几乎所有心肌梗死患者MB都有升高,且升高幅度较大。而且由于MB半衰期短,只有15分钟,胸痛发作后6-12小时不升高可排除心肌梗死。MB是从肾脏清除,在发病18-30小时内可完全恢复到正常水平。所以MB测定有助于在心肌梗死病程中观察有无再梗死或者梗死再扩展。心肌梗死患者血清MB的升高幅度和持续时间与梗死面积和心肌坏死程度呈明显正相关。如果血清MB持续不降或反而升高或下降后又异常升高,说明梗死面积继续扩大,心肌坏死加重或有新的梗死发生。由于MB诊断心肌梗死的敏感性和特异性很高,所以早期测定MB对及早诊断心肌梗死有一定的参考价值。
胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法;另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似,都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体,当交联有抗体的微球与抗原结合后,在短时间内会迅速聚集在一起,改变了反应液的散光性能或透光性能。而且,反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后,直接测定反应液的吸光度值,省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤,几分钟就能获得结果,省时省力。此外,纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰,稳定性和重复性都较好,能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些,但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值,可完全满足临床检测要求。
目前检测MB的方法主要有化学发光法、酶联荧光分析法、放射性免疫法和酶联免疫法。但是这些方法都有其局限性,如,化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵,需要专门仪器和专业人员操作,只适合中心实验室使用;放射性免疫法会对环境造成污染;而酶联免疫法测定周期长,不适合急诊的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,它操作简便、灵敏度高、特异性好,能快速的测定结果、且测定结果准确性高。
为了解决背景技术所存在的问题,本发明采用以下技术方案:试剂盒是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成,试剂R1为磷酸盐缓冲体系,试剂R2的组成为交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液,校准品为重组人肌红蛋白溶于磷酸缓冲液中,同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂,叠氮钠作为防腐剂。
所述的磷酸盐缓冲体系R1,其特征在于含有PH=7.0-7.6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 60-120 mmol/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/l。
所述的交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液R2含有肌红蛋白抗体包被的致敏乳胶颗粒、PH7.0-7.6的磷酸盐缓冲液40-100 mmol/l。
所述的校准品包含肌红蛋白MB浓度分别为0,62.5,125,250,500 ng/ml的5支校准品。
所述的交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液R2致敏乳胶颗粒为聚苯乙烯乳胶粒子,颗粒直径在150-190nm之间。
所述的试剂R2抗体包被过程中,肌红蛋白抗体和聚苯乙烯乳胶粒子包被质量比为1/10-5/10。
所述的试剂R2抗体包被过程中,封闭液组分包括0.5%-1.5%脱脂奶粉、10-60 mmol的甘氨酸。
所述的试剂R2抗体包被过程中,胶乳稀释液组分包括PH7.0-7.6磷酸盐缓冲液 30-80 mmol/l,0.5%-1.5%脱脂奶粉,0.9%NaN3。
本发明具有以下有益效果:它操作简便、灵敏度高、特异性好,能快速的测定结果、且测定结果准确性高。
附图说明:
图1为本发明中MB试剂校准曲线;
图2本公司试剂与国外公司试剂血清相关性比对图;
图3为表1:本发明中试剂反应参数表;
图4为表2:实施例3中本公司试剂最低检测限实验数据;
图5为表3:实施例3中国外某知名公司试剂盒的最低检测限实验数据表;
图6为表4:实施例4中本发明试剂盒的灵敏度实验数据表;
图7为表5:实施例4中国外某知名公司试剂盒的灵敏度实验数据表。
具体实施方式:
本具体实施方式采取以下技术方案:试剂盒是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成,试剂R1为磷酸盐缓冲体系,试剂R2的组成为交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液,校准品为重组人肌红蛋白溶于磷酸缓冲液中,同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂,叠氮钠作为防腐剂。
所述的磷酸盐缓冲体系R1,其特征在于含有PH=7.0-7.6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 60-120 mmol/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/l。
所述的交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液R2,其特征在于含有肌红蛋白抗体包被的致敏乳胶颗粒PH7.0-7.6的磷酸盐缓冲液40-100 mmol/l。
所述的校准品包含肌红蛋白MB浓度分别为0,62.5,125,250,500 ng/ml的5支校准品,
所述的交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液R2致敏乳胶颗粒为聚苯乙烯乳胶粒子,颗粒直径在150-190nm之间。
所述的试剂R2抗体包被过程中,肌红蛋白抗体和聚苯乙烯乳胶粒子包被质量比为1/10-5/10。
所述的试剂R2抗体包被过程中,封闭液组分包括0.5%-1.5%脱脂奶粉、10-60 mmol的甘氨酸。
所述的试剂R2抗体包被过程中,胶乳稀释液组分包括PH7.0-7.6磷酸盐缓冲液 30-80 mmol/l,0.5%-1.5%脱脂奶粉,0.9%NaN3。
本具体实施方式具有以下有益效果:它操作简便、灵敏度高、特异性好,能快速的测定结果、且测定结果准确性高。
实施例1:测定试剂盒组成如下:
1.试剂R1为:
PH7.4磷酸盐缓冲液 45 mmol/l
聚乙二醇6000 80 mmol/l
乙二胺四乙酸二钠 17 mmol/l
NaN3 0.9%
各种成分可以室温下依次添加,或者同时添加,或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。
2. 试剂R2为:
肌红蛋白多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳颗粒以30:100的质量比混合,缓冲液采用0.02 M的磷酸缓冲液(PH7.4),将两者混匀后37℃吸附8小时,之后透析除去未连接上的抗体,加入封闭液(0.1%脱脂奶粉、0.2 mm的甘氨酸),封闭2小时。离心去上清,用胶乳稀释(PH7.4磷酸盐缓冲液 50mmol/l,乙二胺四乙酸二钠 16 mmol/l,0.1%脱脂奶粉,0.9%NaN3)至0.25%。
3.校准品制备:
用重组人肌红蛋白溶于磷酸缓冲液中,同时加入0.9% NaN3,制备不同浓度的标准品(0 ng/ml, 62.5 ng/ml, 125 ng/ml, 250 ng/ml,500 ng/ml)。
本实施例描述的MB检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如图3。分析方法:速率法,即试剂R1、R2的用量分别为150 ul和50 ul,样本量10 ul;150 ul试剂R1加入10ul样本于37℃3min后加入50 ul R2,延迟100 s后开始读点,读数时间约120 s;检测主波长为500 nm。
采用本试剂及上述测定方法,采用日立7170生化分析仪测得的5种不同含量的MB标准品(自制)的曲线(如图1所示),每个点代表一个含量的参考标准品,其中X轴表示MB 含量(ng/ml);Y轴表示吸光度。
实施例2:检测试剂的相关性试验
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1 )和对照试剂A公司的MB 胶乳增强型试剂,采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关性分析。按照与上述“MB测定方法”中的参数进行测定,测定结果见图2, X,Y轴均为测定值(MB的含量ng/ml),
由图2的结果看出,两种试剂的相关系为R2=0.9895,回归方程为y=0.9867x+8.6999。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好,具有很好的特异性和准确性。
此外,以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的,但本发明的试剂不限于上述仪器,还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
实施例3:最低检测限试验
本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本,低值样本(数值在试剂线性范围下限±1/3内的样本)。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本,然后50%稀释成5个点,和零点一起每一个样本测试5次,计算平均值,求得SD数值。
结果解析: 根据检测数据,计算SD数值和CV数值,分别计算1SD,2SD,从最小的开始,其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。
表2、3结果显示,本发明试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时,测定平均值-2SD的数值均大于零点平均值+2SD,表明本发明试剂最低检测限至少可以达到3.3 ng/ml。而对照A公司试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清,并比较血清平均值-2SD与零点平均值+2SD大小,其中1/16、1/8稀释平均值-2SD的数值小于零点平均值+2SD, 1/4、1/2稀释平均值-2SD的数值大于零点平均值+2SD,表明A公司试剂最低检测限为12.5ng/ml左右。
实施例4:灵敏度实验
本实验目的是检测试剂在测试生理盐水以及一定浓度的管理血清时的吸光度变化值。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、空白溶液、0.9%的生理食盐水,浓度的管理血清时的吸光度变化值。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水、低值样本,每个样本测试5次,计算吸光度。
表4、5显示,本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为0.6(1/10000A),理论浓度为100 ng/ml血清样本时吸光度变化为420.6(1/10000A),而A公司试剂测定生理盐水时吸光度变化为-7.8(1/10000A),理论浓度为100 ng/ml血清样本时吸光度变化为81.8(1/10000A),表明本发明试剂灵敏度要明显高于A公司试剂。
Claims (8)
1.一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于试剂盒是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成,试剂R1为磷酸盐缓冲体系,试剂R2的组成为交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液,校准品为重组人肌红蛋白溶于磷酸缓冲液中,同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂,叠氮钠作为防腐剂。
2.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的磷酸盐缓冲体系R1含有PH=7.0-7.6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 60-120 mmol/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/l。
3.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液R2含有肌红蛋白抗体包被的致敏乳胶颗粒、PH7.0-7.6的磷酸盐缓冲液40-100 mmol/l。
4.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的校准品包含肌红蛋白MB浓度分别为0,62.5,125,250,500 ng/ml的5支校准品。
5.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液R2致敏乳胶颗粒为聚苯乙烯乳胶粒子,颗粒直径在150-190nm之间。
6.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中,肌红蛋白抗体和聚苯乙烯乳胶粒子包被质量比为1/10-5/10。
7.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中,封闭液组分包括0.5%-1.5%脱脂奶粉、10-60 mmol的甘氨酸。
8.根据权利要求1所述一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒,其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中,胶乳稀释液组分包括PH7.0-7.6磷酸盐缓冲液 30-80 mmol/l,0.5%-1.5%脱脂奶粉,0.9%NaN3。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131113 |