CN108593940B - 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒 - Google Patents

一种尿液转铁蛋白检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿液转铁蛋白检测试剂盒，属于医疗器械体外诊断技术领域，避免了常规比浊法临床结果被低估甚至出现假阴性的结果的问题。本发明提供的尿转铁蛋白检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品，所述R1试剂为含有Tris‑HCl、NaCl和防腐剂的溶液；所述R2试剂为含有偶联胶乳微球的抗体、保护剂和防腐剂的溶液；所述校准品含有人转铁蛋白抗原、缓冲剂和防腐剂。本发明提供的尿转铁蛋白检测试剂盒，试剂为液体即用型，检测线性范围宽，极大提高了检测效率；减少了人工稀释等步骤，节约成本；试剂稳定性和重复性好，适用于多种全自动生化分析仪，具有更广泛的通用性，可替代进口试剂，节约病患开支。

Description

一种尿液转铁蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医疗器械体外诊断技术领域，尤其涉及一种基于乳胶增强免疫比浊法检测人尿液转铁蛋白含量的试剂盒。
背景技术
转铁蛋白(transferrin，TRF)是血浆中主要的含铁蛋白质，主要由肝细胞合成，半衰期为7天。TRF可逆地结合多价离子，包括铁、铜、锌、钴等。TRF主要生理功能为结合，运输三价铁离子，每一分子TRF可结合两个三价铁原子，承担对铁的吸收，存储和利用部位之间的转运。TRF负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。其以TRF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。血浆中TRF的浓度受铁供应的调节，在缺铁状态时，血浆TRF浓度上升，经铁有效治疗后恢复到正常水平。
TRF正常情况下不能通过肾小球滤过膜，尿液中TRF含量极低。尿中TRF升高与肾小球破坏程度正相关。主要反映肾小球滤过膜电荷选择屏障受损。糖尿病肾病，高血压，妊娠期高血压，过敏性紫癜性肾损伤，原发性肾小球肾炎等病人的尿液中TRF的含量都会有不同程度的增加。早期肾损伤时肾小球基底膜内外疏松层硫酸肝素糖蛋白含量减低，使负电荷位点明显减少，使带负电荷(PI＝5.7)的循环中分子蛋白TRF小球滤过膜滤过，从而出现在尿液中。因此测量尿液的TRF含量变化有利于监测糖尿病肾病，小儿紫癜性肾病，妊娠期高血压和原发性肾小球肾炎等。
目前国内外市场上检测转铁蛋白的方法有ELISA，胶体金层析法，免疫比浊法。ELISA方法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。金标方法虽然稳定性较好，但灵敏度较低，只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了这些检测技术在临床上的应用，尤其不适合用于需要通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。免疫比浊法操作简单，可在几分钟内快速、准确地检测血清蛋白含量，真实反映病情进展和评估治疗效果，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义；几分钟就能获得结果，省时省力。免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。且能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。然而，常规比浊法检测灵敏度低，线性范围窄，当抗原过剩时，临床结果被低估甚至出现假阴性的结果，无法早期检测尿液转铁蛋白含量的变化，故而急需开发一种经济适用的人尿液转铁蛋白检测试剂盒。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一种尿液转铁蛋白检测试剂盒，通过乳胶微球增强的方法，提高了检测灵敏度，线性范围宽，避免了临床结果被低估甚至出现假阴性的结果。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种尿液转铁蛋白检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品，
所述R1试剂为含有Tris-HCl、NaCl和防腐剂的溶液；
所述R2试剂为含有偶联胶乳微球的抗体、保护剂和防腐剂的溶液；
所述校准品含有人转铁蛋白抗原、缓冲剂和防腐剂；
其中，Tris-HCl缓冲液的浓度为40～200mM；
NaCl的浓度为0.7％～1.2％；
保护剂的浓度为0.1％～2％；
防腐剂的浓度为0.03％～0.25％；
偶联胶乳微球的粒径为95nm～220nm；
抗体选自羊抗人转铁蛋白多抗或兔抗人转铁蛋白多抗；
人转铁蛋白抗原的浓度为43.2mg/L-64.8mg/L。
进一步地，偶联胶乳微球的抗体的制备方法包括以下步骤：取浓度10％偶联胶乳微球，加入偶联胶乳微球15～20倍体积的缓冲剂悬浮，再加入偶联胶乳微球2.5倍体积的抗体，混匀；12000rmp/min离心20min，弃上清；再加入偶联胶乳微球10～15倍体积且含有25mg/mL EDC的缓冲剂悬浮，功率500W超声5s，间隔5s再超声，时间共30min，混匀即得。
进一步地，偶联胶乳微球的粒径为155nm。
进一步地，缓冲剂选自Tris-HCl、PBS、MES和HEPES中的一种或多种。
进一步地，保护剂选自酪蛋白、BSA、脱脂奶粉、蔗糖和甘氨酸中的一种或多种。
进一步地，保护剂选自BSA或甘氨酸。
进一步地，防腐剂选自叠氮纳、硫柳贡、庆大霉素和Proclin 300中的一种或几种。
进一步地，R1中防腐剂为Proclin 300，R2中防腐剂为叠氮纳。
进一步地，所述校准品的缓冲剂选自Tris-HCl。
进一步地，所述校准品的防腐剂选自叠氮纳。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的尿转铁蛋白检测试剂盒，试剂为液体即用型，检测线性范围宽，最高可检测浓度为54mg/L的样本，试剂抗原过剩范围达到856mg/L，有效避免临床结果被低估和假阴性的结果，极大提高了检测效率；
(2)同时，由于线性范围较宽，减少了人工稀释等步骤，节约成本；
(3)此外，本发明采用化学偶联胶乳标记方法，试剂稳定性和重复性好，适用于多种全自动生化分析仪，具有更广泛的通用性，便于推广；
(4)采用本发明的尿转铁蛋白检测试剂盒进行检测，可替代进口试剂，节约病患开支。
综上，本发明提供了一种经济、适用的尿液转铁蛋白(乳胶增强免疫比浊法)检测试剂盒。
附图说明
图1为本发明提供的尿液转铁蛋白检测试剂盒校准曲线；
图2为本发明提供的尿液转铁蛋白检测试剂盒线性范围图。
具体实施方式
一种尿液转铁蛋白检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品，
所述R1试剂为含有Tris-HCl、NaCl和防腐剂的溶液；
所述R2试剂为含有偶联胶乳微球的抗体、保护剂和防腐剂的溶液；
所述校准品含有人转铁蛋白抗原、缓冲剂和防腐剂；
其中，Tris-HCl缓冲液的浓度为40～200mM；
NaCl的浓度为0.7％～1.2％；
保护剂的浓度为0.1％～2％；保护剂选自酪蛋白、BSA、脱脂奶粉、蔗糖和甘氨酸中的一种或几种，优选甘氨酸和BSA；
防腐剂的浓度为0.03％～0.25％；防腐剂选自叠氮纳，硫柳贡，庆大霉素和Proclin 300中的一种或几种，R1中优选Proclin 300，R2和校准品中优选叠氮纳；
偶联胶乳微球的粒径为95nm～220nm；例如95nm、123nm、155nm、186nm和220nm几种粒径中的一种或几种，优选155nm粒径的微球；
缓冲剂选自Tris-HCl、PBS、MES和HEPES中的一种或几种，R2中优选HEPES；校准品种优选Tris-HCl；
抗体选自羊抗人转铁蛋白多抗或兔抗人转铁蛋白多抗；
人转铁蛋白抗原的浓度为43.2mg/L-64.8mg/L。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1尿液转铁蛋白检测试剂盒的制备
R1为含有Tris-HCl的缓冲液，pH＝7.5±0.05(25±1℃)。
R2为含有偶联胶乳微球抗体的溶液，pH＝7.5±0.05(25±1℃)。
其中，偶联胶乳微球抗体的制备方法为：
1.取400ul 10％95nm胶乳粒子(JSR公司生产)微球加入到试剂瓶中；
2.在试剂瓶中加入7ml MES缓冲液；
3.加入1ml羊抗人TRF多抗；
4.将试剂瓶放置于混匀器上混匀60min；
5.12000rmp/min离心20min，弃上清；
6.加入5ml含有25mg/mL EDC的MES缓冲液；
7.溶液进行超声，超声条件为：功率500W，超声5s，间隔5s，超声时间共30min
8.将超声完的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min；
9.加入20ml的保存液(HEPES缓冲液)；
10.将配制好的溶液进行超声，超声条件为：功率500W，超声5s，间隔5s，超声时间共15min。
试剂R1的配方为：
Tris-HCl 40mM
NaCl 0.7％
叠氮纳 0.03％
pH 7.5±0.05(25±1℃)
试剂R2的配方为：
偶联胶乳微球的抗体 上述方法制备
BSA 0.1％
叠氮纳 0.03％
pH 7.5±0.05(25±1℃)
实施例2尿液转铁蛋白检测试剂盒的制备
试剂R1的配方为：
Tris-HCl 100mM
NaCl 1％
Proclin300 0.15％
pH 7.5±0.05(25±1℃)
试剂R2的配方为：
Figure BDA0001737424140000051
Figure BDA0001737424140000061
其中，偶联胶乳微球抗体的制备方法为：
1.取400ul 10％155nm胶乳粒子(JSR公司生产)微球加入到试剂瓶中；
2.在试剂瓶中加入6ml MES缓冲液；
3.加入1ml羊抗人TRF多抗；
4.将试剂瓶放置于混匀器上混匀60min；
5.12000rmp/min离心20min，弃上清；
6.加入6ml含有25mg/mL EDC的MES缓冲液；
7.溶液进行超声，超声条件为：功率500W，超声5s，间隔5s，超声时间共30min
8.将超声完的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min；
9.加入20ml的保存液(HEPES缓冲液)；
10.将配制好的溶液进行超声，超声条件为：功率500W，超声5s，间隔5s，超声时间共15min。
实施例3尿液转铁蛋白检测试剂盒的制备
试剂R1的配方为：
Tris-HCl 200mM
NaCl 1.2％
叠氮纳 0.15％
硫柳贡 0.1％
pH 7.5±0.05(25±1℃)
试剂R2的配方为：
Figure BDA0001737424140000062
Figure BDA0001737424140000071
其中，偶联胶乳微球抗体的制备方法为：
1.取400ul 10％220nm胶乳粒子(JSR公司生产)微球加入到试剂瓶中；
2.在试剂瓶中加入8ml MES缓冲液；
3.加入1ml羊抗人TRF多抗；
4.将试剂瓶放置于混匀器上混匀60min；
5.12000rmp/min离心20min，弃上清；
6.加入4ml含有25mg/mL EDC的MES缓冲液；
7.溶液进行超声，超声条件为：功率500W，超声5s，间隔5s，超声时间共30min
8.将超声完的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min；
9.加入20ml的保存液(HEPES缓冲液)；
10.将配制好的溶液进行超声，超声条件为：功率500W，超声5s，间隔5s，超声时间共15min。
实施例4校准曲线制作
按实例1的方法配制试剂R1和试剂R2。
校准品的制备方法：校准品缓冲液的配制：分别称取1.21gTris-HCl，0.585gNaCl，1gBSA，0.1ml proclin300放入100mL纯化水中，称取一定量的人转铁蛋白放入缓冲液中，使之浓度在64.8mg/L，混合均匀后用稀盐酸或3M NAOH调节PH至6.5±0.1，使用0.22um的滤膜过滤后即可得到校准品。
1.打开仪器预热15分钟，在全自动生化分析仪上添加项目，设置项目参数，登记试剂位，放置R1和R2试剂，测试试剂余量，保证试剂R1和R2≥15mL/瓶。
2.取出校准品，用校准品和缓冲剂按照以下浓度配制校准液，0mg/L，3.8mg/L，6.7mg/L，13.5mg/L，27mg/L，54mg/L用全自动生化分析仪对校准样本进行检测，将吸光度变化率(ΔA/min)，和对应样本浓度(mg/L)采取对数线性方程做出标准曲线，如图1所示。
实施例5线性范围检测
将接近线性范围上限的高值样本(尿液样本)按一定比例稀释为至少5种浓度(见表1)，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每一浓度样本采用实施例1制备的试剂R1和试剂R2均重复检测2次，计算平均值(见表1)，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性系数R2(见图2)。
表1线性范围测试结果
相对浓度 第一次测试 第二次测试 平均值 绝对偏差 相对偏差
0.22mg/L 0.22 0.21 0.215 -0.005 -2％
10.8mg/L 10.5 10.1 10.3 -0.5 -5％
21.6mg/L 22.5 21.3 21.9 0.3 1％
32.4mg/L 30.9 31.6 31.25 -1.15 -4％
43.2mg/L 43.1 43.5 43.3 0.1 0％
54mg/L 53.1 53.6 53.35 -0.65 -1％
从表1可以看出在0.2mg/L～54mg/L内满足线性稀释实测值与估计值偏差小于±5％，图2中方程为线性回归方程，线性系数为0.9993，说明线性关系很好。
实施例6重复性考察
采用实施例2制备的试剂R1和试剂R2，对2个不同浓度的样品(尿液样本0～2mg/L与尿液样本5～54mg/L)分别重复测定10次，计算10次测定结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据下列公式得出变异系数。
CV＝SD/M×100％
式中：CV为变异系数；
SD为10次测量结果的标准差；
M为10次测量结果的平均值。
表2重复性测试结果
Figure BDA0001737424140000081
Figure BDA0001737424140000091
从表2中可以看出本发明检测结果相对偏差小于5％，重复性符合要求。
实施例7高剂量钩状效应测试
采用实施例3制备的试剂R1和试剂R2，测试理论浓度超过线性范围浓度的样本，重复测试2次，取平均值作为测试值，测试结果不会出现假性结果。
表3高剂量钩状效应测试结果
理论值(mg/L) 测试值(mg/L) 备注
1.5 1.48 线性范围内
3 2.35 线性范围内
9 9.01 线性范围内
29 28.6 线性范围内
58 57.6 超线性
106 90.3 超线性
212 156.9 超线性
428 123.4 超线性
856 95.2 超线性
从表3可以看出本发明可以满足抗原过剩范围达到856mg/L。
实施例8稳定性考察
加速稳定性：将实施例1制备的试剂R1和试剂R2分别放置于37℃恒温箱和4℃冰箱中，分别于第3天、第5天和第8天取出37℃试剂与冷藏试剂同时进行测试。分别测试正常/异常水平尿液或高/低值质控品，重复测试3次，取平均值，加速试剂测试结果均值与冷藏试剂测试结果比较，计算相对偏差(％)。
注：加速试剂从恒温箱中取出后，放置和冷藏试剂至相同温度再进行测试。
表4加速稳定性测试结果
Figure BDA0001737424140000101
机载稳定性：将实施例1制备的试剂R1和试剂R2开瓶后，放置在全自动生化分析仪内，分别测试高/低质控品，并于第7、14、21、28天取出开瓶试剂与冷藏试剂同时进行测试。重复测试3次，取平均值，加速试剂测试结果均值与冷藏试剂测试结果比较，计算相对偏差(％)。
表5机载稳定性测试结果
Figure BDA0001737424140000102
Figure BDA0001737424140000111
从表4和表5结果可以看出本发明试剂在37度高温环境下可稳定8天，4度开封条件下可以稳定28天，说明稳定性很好。
应当理解的是，本发明不限于上述的举例，对本领域的普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种尿液转铁蛋白检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品，其特征在于，
所述R1试剂为含有Tris-HCl、NaCl和防腐剂的溶液；
所述R2试剂为含有偶联胶乳微球的抗体、保护剂和防腐剂的溶液；
所述校准品含有人转铁蛋白抗原、缓冲剂和防腐剂；
其中，Tris-HCl缓冲液的浓度为40～200mM；
NaCl的浓度为0.7％～1.2％；
保护剂的浓度为0.1％～2％；
防腐剂的浓度为0.03％～0.25％；
偶联胶乳微球的粒径为95nm、123nm、155nm、186nm和220nm中的一种或几种；
抗体选自羊抗人转铁蛋白多抗或兔抗人转铁蛋白多抗；
人转铁蛋白抗原的浓度为43.2mg/L-64.8mg/L；
偶联胶乳微球的抗体的制备方法由以下步骤组成：取浓度10％偶联胶乳微球，加入偶联胶乳微球15～20倍体积的缓冲剂悬浮，再加入偶联胶乳微球2.5倍体积的抗体，混匀；12000rmp/min离心20min，弃上清；再加入偶联胶乳微球10～15倍体积且含有25mg/mL EDC的缓冲剂悬浮，功率500W超声5s，间隔5s再超声，时间共30min，混匀即得。
2.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，偶联胶乳微球的粒径为155nm。
3.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，缓冲剂选自Tris-HCl、PBS、MES和HEPES中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，保护剂选自酪蛋白、BSA、脱脂奶粉、蔗糖和甘氨酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，保护剂选自BSA或甘氨酸。
6.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，防腐剂选自叠氮纳、硫柳贡、庆大霉素和Proclin 300中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，R1中防腐剂为Proclin 300，R2中防腐剂为叠氮纳。
8.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述校准品的缓冲剂选自Tris-HCl。
9.根据权利要求1所述的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述校准品的防腐剂选自叠氮纳。
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