BR112014018005B1 - Uso de um complexo não covalente imobilizado - Google Patents

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Abstract

uso de um complexo não covalente imobilizado e variante de região fc de isotipo igg1 humano. é relatado no presente o uso de um complexo não covalente de receptor fc neonatal (fcrn) e beta-2-microglobulina (b2m) com o ligante de cromatografia de afinidade em geral e, por exemplo, para determinação da meia vida in vivo de um anticorpo por meio de determinação da razão entre os tempos de retenção do anticorpo e um anticorpo de referência.

Description

[001] É relatado no presente o uso de uma coluna de cromatografia de afinidade que compreende receptor Fc neonatal humano imobilizado como ligante de afinidade e seu uso.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Uma imunoglobulina compreende geralmente dois dos chamados polipeptídeos de cadeia leve (cadeia leve) e dois dos chamados polipeptídeos de cadeia pesada (cadeia pesada). Cada um dos polipeptídeos de cadeia leve e pesada contém um domínio variável (região variável) (geralmente a parte amino terminal da cadeia de polipeptídeo) que compreende regiões de ligação que são capazes de interagir com um antígeno. Cada um dos polipeptídeos de cadeia leve e pesada compreende uma região cosntante (geralmente, a parte terminal carboxila). A região constante da cadeia pesada media a ligação do anticorpo (i) a células que contêm um receptor Fc gama (FCYR), tais como células fagocíticas, ou (ii) a células que contêm o receptor Fc neonatal (FcRN) também conhecido como receptor Brambell. Ela também media a ligação a alguns fatores, incluindo fatores do sistema de complemento clássico, tal como o componente (C1q).
[003] O receptor Fc neonatal (FcRn) também é conhecido como o receptor relativo a classe I MHC (para análise, vide Ward, E. S. e Ober, R. J., Advances in Immunology 103 (2009) 77-115). Estudos demonstraram não apenas que esse receptor serve para regular os níveis e a distribuição de IgG ao longo de toda a vida adulta (Ghetie, V. et al, Nat. Biotechnol. 15 (1997) 637-640; Israel, E. J., Immunology 89 (1996) 573-578; Junghans, R. P. e Anderson, C. L., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 (1996) 5512-5516), mas também que ele possui diversos outros papéis em vários tipos de células e tecidos (vide, por exemplo, Akilesh, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (2008) 967-972; Dickinson, B. L. et al, J. Clin. Invest. 104 (1999) 903-911; Kim, H. et al, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (2008) 2025-2029; Spiekermann, G. M. et al, J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310; Zhu, X. et al, J. Immunol. 166 (2001) 3266-3276). Ortólogos de FcRn foram isolados de muitas espécies, incluindo camundongos, ratos, seres humanos, carneiros, vacas, possums, porcos e camelos (Adamski, F. M. et al, Mol. Immunol. 37 (2000) 435-444; Ahouse, J. J. et al, J. Immunol. 151 (1993) 6076-6088; e Kacskovics, I. et al, J. Immunol. 164 (2000) 1889-1897; Kacskovics, I. et al, Dev. Comp. Immunol. 30 (2006) 1203-1215; Kandil, E. et al, J. Immunol. 154 (1995) 5907-5918; Mayer, B. et al, Immunology 107 (2002) 288-296; Schnulle, P. M. e Hurley, W. L., Vet. Immunol. Immunopathol. 91 (2003) 227-231; Simister, N. E. e Mostov, K. E., Nature 337 (1989) 184-187; Story, C. M. et al, J. Exp. Med. 180 (1994) 2377-2381), o que indica que esse receptor está presente em essencialmente todas as espécies de mamíferos. As diversas funções de FcRn são dependentes da sua capacidade de selecionar IgG fora da degradação lisossomal dentro das células e liberar carga unida durante eventos exocíticos na membrana de plasma (Ober, R. J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (2004) 11076-11081; Ober, R. J. et al, J. Immunol. 172 (2004) 2021-2029; Prabhat, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (2007) 5889-5894). Além disso, considerando o potencial de modulação de processos de tráfego de IgG e o comportamento in vivo, o relatório anterior de engenharia de anticorpos para aumentar sua meia vida em camundongos (Ghetie et al, acima) expandiu-se para uma área de interesse intenso na indústria biofarmacêutica (Dall’Acqua, W. F. et al, J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524; Hinton, P. R. et al, J. Biol. Chem. 279 (2004) 6213-6216; Hinton, P. R. et al, J. Immunol. 176 (2006) 346-356; Shields, R. L. et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
[004] Em WO 2005/047327, são relatadas variantes de polipeptídeos de ligação a receptores Fc neonatais (FcRN), proteínas de ligação Fc dimérica e métodos a elas relacionados. Variantes de polipeptídeos com função efetora alterada são relatadas em WO 2006/031370. Em WO 2009/041643, é relatado um método de modificação do ponto isoelétrico de anticorpos por meio da substituição de aminoácidos em CDR. Em WO 2010/048313, é relatado FcRn recombinante e suas variantes para purificação de proteínas de fusão que contêm Fc. Magistrelli, G. et al relatam produção robusta de FcRn recombinante em células de mamíferos, permitindo imobilização orientada para estudos de ligação de IgG (J. Immunol. Meth. em fase de impressão, disponível online em 12.09.2011).
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[005] Um aspecto conforme relatado no presente é o uso de um complexo não covalente imobilizado de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta- 2-microglobulina (b2m) como ligante de cromatografia de afinidade.
[006] Descobriu-se que, com o método/uso conforme relatado no presente, é agora possível separar, isolar e caracterizar com relação às suas propriedades in vivo espécies de anticorpos com relação próxima, ou seja, com um único ou uma quantidade limitada de resíduos de aminoácidos diferentes.
[007] Desta forma, as diferentes espécies de anticorpos, ou seja, uma diferença de resíduo de aminoácidos, isoladas com o método conforme relatado no presente podem ser utilizadas para caracterizar/identificar posições de aminoácidos que influenciam a meia vida relativas a FcRn.
[008] Desta forma, com o método conforme relatado no presente, é possível separar diferentes variantes de um anticorpo parental e determinar a razão específica entre essas variantes, o que não é possível com os métodos conhecidos atualmente, pois estes fornecem apenas a soma das modificações e não as espécies individuais (ou seja, para uma mistura de pai, variante 1, variante 2 e variante 1/2, a espectrometria de massa fornece o total de moléculas que compreendem variante 1, ou seja, variantes que compreendem uma única variação (1) e ainda os que também compreendem a segunda variação (1/2)).
[009] Isso pode ser atingido pela combinação de (i) imobilização sobre um suporte de cromatografia de FcRn humano produzido de forma recombinante em combinação com beta 2 microglobulina humana produzida de forma recombinante e (ii) um gradiente de pH linear.
[010] Descobriu-se que, para as dadas condições, um anticorpo IgG1 do tipo selvagem possui tempo de retenção de cerca de 42 a 49 minutos. Em uma realizçaão, um anticorpo de proteína de fusão Fc que compreende uma região Fc do tipo selvagem da subclasse IgG1 possui tempo de retenção de cerca de 45 minutos.
[011] Um anticorpo que possui região Fc modificada com ligação de FcRn reduzida possui tempo de retenção que é menor, enquanto um anticorpo que possui região Fc modificada com ligação de FcRn aprimorada possui tempo de retenção que é maior. Em uma realização, o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) é ligado a uma fase sólida. Em uma realização, a fase sólida é um material de cromatografia. Em uma realização, o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) é biotinilado e a fase sólida é derivatizada com estreptavidina.
[012] Em uma realização, o uso é em cromatografia de afinidade com gradiente de pH. Em uma realização, o gradiente de pH é de um primeiro valor de pH a um segundo valor de pH, de forma que o primeiro valor de pH é de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 7,5 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 6,0 a cerca de pH 9,5. Em uma realização, o gradiente de pH é um gradiente com valor de pH crescente ou um gradiente com valor de pH decrescente. Em uma realização, o primeiro valor de pH é de cerca de pH 5,5 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 8,8 ou o primeiro valor de pH é de cerca de pH 7,4 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 6,0.
[013] Em uma realização, a beta-2-microglobulina é da mesma espécie do FcRn.
[014] Em uma realização, o uso destina-se à determinação da meia vida in vivo de um anticorpo por meio de determinação da razão dos tempos de retenção do anticorpo e um anticorpo de referência.
[015] Em uma realização, o uso destina-se à separação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma região Fc.
[016] Em uma realização, o uso destina-se à determinação da oxidação de metionina de um anticorpo.
[017] Em uma realização, o uso destina-se à determinação do nível de oligomerização de anticorpos.
[018] Em uma realização, o uso destina-se à seleção de uma biblioteca de anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados de anticorpos parentais ou polipeptídeos de fusão parentais, que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para esses anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental.
[019] Em uma realização, o uso destina-se à identificação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc que exibem ligação alterada ao receptor Fc neonatal.
[020] Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão ou um anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou um anticorpo triespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou anticorpo tetraespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão.
[021] Em uma realização, o uso destina-se à remoção de anticorpos pela metade (half-antibodies) de preparações de IgG.
[022] Em uma realização, o uso destina-se à remoção de agregados de anticorpos e oligômeros de anticorpos de preparações de IgG.
[023] Um aspecto conforme relatado no presente é uma variante de região Fc de isotipo IgG1 humano na qual o aminoácido na posição 252 é alterado de metionina para histidina e o aminoácido na posição 428 é alterado de metionina para ácido glutâmico.
[024] Um aspecto conforme relatado no presente é um método de seleção de antiorpos com meia viva in vivo previamente determinada, em que é realizada cromatografia e é selecionado um anticorpo que possui tempo de retenção dentro de uma janela de tempo de retenção fornecida com relação a um IgG1 do tipo selvagem.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[025] Figura 1: linearidade de anticorpo aplicado e área sob a curva de cromatografia utilizando uma coluna de FcRn conforme relatado no presente.
[026] Figura 2: cromatograma de anticorpo anti-IGF-1R do tipo selvagem e mutante YTE sobre coluna de FcRn conforme relatado no presente.
[027] Figura 3: cromatografia de FcRn (fileira superior A/B/C) de diferentes preparações de anticorpos contendo quantidades diferentes de anticorpos pela metade como se pode observar em análise SDS CE (fileira inferior A/B/C).
[028] Figura 4: cromatografia de FcRn de diferentes preparações de anticorpos que contêm diferentes quantidades de monômero de anticorpo e agregados.
[029] Figura 5: influência do tempo de retenção em cromatografia de FcRn pelo número de regiões Fc na molécula cromatografada.
[030] Figura 6: impacto sobre a oxidação de anticorpos sobre o tempo de retenção de cromatografia de FcRn.
[031] Figura 7: cromatograma de anticorpo anti-Abeta do tipo selvagem e mutante HE sobre coluna de FcRn conforme relatado no presente.
[032] Figura 8: impacto da oxidação de Met252 e Met428 sobre a interação de FcRn. Aplicação de uma amostra de um anticorpo IgG1 armazenado por dois meses a 40 °C (curva 2) à coluna de FcRn gera uma substância em eluição precoce com pico duplo que indica anticorpo IgG1 oxidado, enquanto a aplicação de amostras de anticorpo IgG1 armazenado por dois meses a 25 °C (curva 1) e -80 °C (curva 3) à coluna de FcRn gera eluição posterior, com picos virtualmente sobrepostos. Condições cromatográficas: tampão A (20 mM de MES, 150 mM de NaCl, pH 5,5), tampão B (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 8,2), fluxo de 0,5 ml/min, gradiente entre tampão A e tampão B: 60 minutos (padrão).
[033] Figura 9: análise de ressonância de plasma de superfície (SPR) de anticorpo IgG1 com estresse. Aplicação de amostra ao anticorpo IgG1 armazenado por dois meses a 40 °C ao BIAcore para análise SPR exibe sensogramas diferentes para espécies de anticorpos IgG1 oxidados por Met252 e Met428 e do tipo selvagem.
[034] Figura 10: impacto de agregados de anticorpos sobre a interação de FcRn. Análise cromatográfica de FcRn de anticorpo anti-IL13R alfa na amostra original, seus monômeros isolados e agregados isolados. Condições cromatográficas: tampão A (20 mM de MES, 150 mM de NaCl, pH 5,5), tampão B (20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 8,8), fluxo de 0,5 ml/min, gradiente entre tampão A e tampão B: 50 minutos (padrão).
[035] Figura 11: análise SPR de agregados de anticorpos anti- IL3R alfa. Sensogramas de anticorpo anti-IL13R alfa como padrão de referência (curva 1), na amostra original (3), de monômeros de anticorpos anti-IL13R alfa isolados (curva 2) e agregados de anticorpos anti-IL13R alfa isolados (curva 4).
[036] Figura 12: impacto de mutações Fc sobre farmacocinéticos em camundongos transgênicos FcRn. Anticorpo do tipo selvagem ou seu YTE mutante triplo foram fornecidos como uma injeção de mistura intravenosa isolada de 10 mg/kg a oito animais por grupo. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (SD), análise ANOVA significativa em comparação com anticorpo do tipo selvagem (+++, p<0,001). A: área sob a curva de tempo e concentração de soro do momento 0 até 672 horas (AUC(0-672)). B: meia vida terminal.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[037] O receptor Fc neonatal (FcRn) é importante para o destino metabólico de anticorpos IgG in vivo.
[038] Cromatografia de afinidade de FcRn pode diferenciar amostras de IgG pela sua área de pico e perfil de tempo de retenção. Ela permite a análise da interação entre FcRn e IgG in vitro e pode fornecer visão da integridade estrutural e funcional de IgG terapêutico com relação à farmacocinética in vivo.
[039] Desta forma, cromatografia de afinidade de FcRn de IgGs mutantes e do tipo selvagem pode ser utilizada como previsão semiquantitativa de farmacocinética in vivo. Além disso, pode-se utilizar cromatografia de afinidade de FcRn para monitorar a interação de FcRn-IgG, por exemplo, para caracterização de bateladas de IgG ou para estudos de comparação.
[040] Método de cromatografia de líquidos de afinidade de FcRn com gradiente de pH padronizado foi considerado com condições que relembram de perto o mecanismo de interação entre IgG e FcRn in vivo. FcRn humano foi imobilizado sobre a coluna como ligante de afinidade e foi aplicado gradiente de pH linear, por exemplo, de pH 5,5 a 8,8.
[041] Cromatografia de afinidade de FcRn analítica, por exemplo, permite a identificação e caracterização de amostras de IgG e variantes por padrão de pico e perfil de tempo de retenção. O método pode diferenciar (1) o mesmo IgG com diferentes fragmentos de Fab, (2) formas de IgG oxidadas de formas de IgG não oxidadas; (3) agregados de monômeros; e (4) anticorpos com variações na região Fc.
[042] Descobriu-se que mudanças no perfil de cromatografia de afinidade de FcRn de IgGs variantes (variantes de região Fc) com relação ao IgG do tipo selvagem preveem o perfil farmacocinético in vivo. Estes resultados demonstram que cromatografia de afinidade de FcRn é um novo método útil de caracterização de interações entre FcRn e IgG ou integridade de IgG e, no máximo de um IgG como tal.
I. DEFINIÇÕES
[043] A expressão “cerca de” indica uma faixa de +/- 20% do valor numérico seguinte. Em uma realização, a expressão “cerca de” indica uma faixa de +/- 10% do valor numérico seguinte. Em uma realização, a expressão “cerca de” indica uma faixa de +/- 5% do valor numérico seguinte.
[044] O termo “alteração” indica a substituição, adição ou exclusão de um ou mais resíduos de aminoácidos em um anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para obter um polipeptídeo de fusão ou anticorpo modificado.
[045] A expressão “substituição de aminoácido” indica a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente por outro resíduo de aminoácido diferente (resíduo de aminoácido substituto). O resíduo de aminoácido substituto pode ser um “resíduo de aminoácido de ocorrência natural” selecionado a partir do grupo que consiste de alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tyr, Y) e valina (val, V).
[046] A expressão “inserção de aminoácidos” indica a incorporação de pelo menos um resíduo de aminoácido em posição previamente determinada em uma sequência de aminoácidos. Em uma realização, a inserção será a inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos. O(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) pode(m) ser qual(is)quer resíduo(s) de aminoácido(s) de ocorrência natural ou de ocorrência não natural.
[047] A expressão “exclusão de aminoácidos” indica a remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido em posição previamente determinada em uma sequência de aminoácidos.
[048] O termo “anticorpo” é utilizado no presente no sentido mais amplo e engloba diversas estruturas de anticorpos, incluindo, mas sem limitações, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a propriedade de ligação de FcRn.
[049] A expressão “substância tampão” indica uma substância que, quando em slução, pode nivelar alterações do valor de pH da solução, por exemplo, devido à adição ou liberação de substâncias ácidas ou básicas.
[050] A expressão “domínio CH2” indica a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição EU 231 à posição EU 340 (sistema de numeração EU de acordo com Kabat). Em uma realização, um domínio CH2 possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 1: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK.
[051] A expressão “domínio CH3” indica a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição EU 341 à posição EU 446. Em uma realização, o domínio CH3 possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 2: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.
[052] O termo “classe” de um anticorpo designa o tipo de domínio constante ou região constante da sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, ye μ, respectivamente.
[053] A expressão “região Fc de origem humana” indica a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina de origem humana que contém pelo menos uma parte da região de articulação, o domínio CH2 e o domínio CH3. Em uma realização, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana estende-se de Cys226 ou de Pro230 até o terminal carboxila da cadeia pesada. Em uma realização, a região Fc possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 10. A lisina C-terminal (Lys447) da região Fc, entretanto, pode ou não estar presente. A menos que especificado em contrário no presente, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat, E. A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), Publicação NIH 91-3242.
[054] O termo “FcRn” indica o receptor Fc neonatal humano. FcRn funciona para salvar IgG do processo de degradação lisossomal, o que resulta em liberação reduzida e meia vida longa. FcRn é uma proteína heterodimérica que consiste de dois polipetídeos: uma proteína similar a complexo de histocompatibilidade principal classe I de 50 kDa (α-FcRn) e uma microglobulina β2 de 15 kDa (β2m). FcRn liga-se com alta afinidade à porção CH2-CH3 do domínio Fc de IgG. A interação entre IgG e FcRn é estritamente dependente de pH e ocorre em estequiometria 1:2, com um IgG que se liga a duas moléculas FcRn por meio das suas duas cadeias pesadas (Huber, A. H. et al, J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). Ligação de FcRn ocorre no endossomo sob pH ácido (pH < 6,5) e IgG é liberado na superfície de célula neutra (pH de cerca de 7,4). A natureza sensível ao pH da interação facilita a proteção mediada por FcRn de IgGs pinocitosados em células contra a degradação intracelular por meio de ligação ao receptor dentro do ambiente ácido de endossomos. FcRn facilita em seguida a reciclagem de IgG para a superfície celular e a liberação subsequente para o fluxo sanguíneo mediante exposição do complexo de FcRn-IgG para o ambiente de pH neutro fora da célula.
[055] A expressão “parte de ligação de FcRn de uma região Fc” indica a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição EU 243 à posição EU 261, aproximadamente da posição EU 275 à posição EU 293, aproximadamente da posição EU 302 à posição EU 319, aproximadamente da posição EU 336 à posição EU 348, aproximadamente da posição EU 367 à posição EU 393 e posição 408 e aproximadamente da posioção EU 424 à posição EU 440. Em uma realizapão, um ou mais dos resíduos de aminoácidos a seguir de acordo com a numeração EU de Kabat são F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 e S440 alterados (numeração EU).
[056] A expressão “anticorpo com comprimento total” indica um anticorpo que possui uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que possui cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente.
[057] A expressão “região de articulação” indica a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que liga o domínio CH1 e o domínio CH2, por exemplo, de cerca da posição 216 até cerca da posição 230 de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat. A região de articulação é normalmente uma molécula dimérica que consiste de dois polipeptídeos com sequência de aminoácidos idêntia. A região de articulação compreende geralmente cerca de 25 resíduos de aminoácidos e é flexível, permitindo que as regiões de ligação de antígenos movam-se independentemente. A região de articulação pode ser subdividida em três domínios: o domínio de articulação superior, o intermediário e inferior (Roux et al, J. Immunol. 161 (1998) 4083).
[058] As expressões “célula hospedeira”, “linhagem de células hospedeiras” e “cultivo de células hospedeiras” são utilizadas de forma intercambiável e designam células nas quais o ácido nucleico exógeno tenha sido introduzido, incluindo a prole dessas células. As células hospedeiras incluem “transformadores” e “células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a prole delas derivada sem considerar o número de passagens. A prole pode não ter teor de ácido nucleico completamente idêntico a uma célula parental, mas pode conter mutações. Inclui-se no presente prole mutante que possui a mesma função ou atividade biológica conforme selecionado na célula transformada originalmente.
[059] Anticorpo “humanizado” designa um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de regiões hipervariáveis (HVRs) não humanas e resíduos de aminoácidos de regiões de cadeia principal (FRs) humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (tais como CDRs) correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem às de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. “Forma humanizada” de anticorpo, tal como anticorpo não humano, designa um anticorpo que tenha sofrido humanização.
[060] A expressão “região hipervariável” ou “HVR”, da forma utilizada no presente, indica cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são de sequência hipervariável e/ou formam circuitos definidos estruturalmente (“circuitos hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos com quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs compreendem geralmente resíduos de aminoácidos dos circuitos hipervariáveis e/ou das “regiões de determinação de complementaridade” (CDRs), em que estas últimas possuem variabilidade de sequências mais alta e/ou estão envolvidas no reconhecimento de antígenos. Exemplos de circuitos hipervariáveis ocorrem nos resíduos de aminoácidos 2632 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia, C. e Lesk, A. M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Exemplos de CDRs (CDR- L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 e 95-102 de H3 (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), Publicação NIH 91-3242). Com exceção de CDR1 em VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam os circuitos hipervariáveis. CDRs também compreendem “resíduos de determinação da especificidade” ou “SDRs”, que são resíduos que entram em contato com antígeno. SDRs estão contidas em regiões das CDRs denominadas CDRs abreviadas ou a-CDRs. Exemplos de a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 3134 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3 (vide Almagro, J. C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que indicado em contrário, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (tais como resíduos de FR) são numerados no presente de acordo com Kabat et al, acima.
[061] “Indivíduo” ou “paciente” é mamífero. Os mamíferos incluem, mas sem limitações, animais domesticados (tais como vacas, carneiros, gatos, cães e cavalos), primatas (tais como seres humanos e primatas não humanos como macacos), coelhos e roedores (tais como ratos, hamsters e camundongos). Em certas realizações, o indivíduo ou paciente é um ser humano.
[062] A expressão “anticorpo monoclonal” designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam o mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, que contêm mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, em que essas variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é dirigido a um único determinante sobre um antígeno. Desta forma, o adjetivo “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo por meio de nenhum método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser elaborados, por exemplo, por meio de uma série de métodos, incluindo, mas sem limitações, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos que utilizam animais transgênicos que contêm, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, em que esses métodos e outros exemplos de métodos de elaboração de anticorpos monoclonais são descritos no presente.
[063] “Anticorpos nativos” designam moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Anticorpos de IgG nativos, por exemplo, são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150.000 Daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. Do terminal N ao C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também denominada domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguida por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De forma similar, do terminal N ao C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também denominada domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguida por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos, denominados capa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.
[064] A expressão “resíduo de aminoácido não de ocorrência natural” indica um resíduo de aminoácido, diferente dos resíduos de aminoácidos de ocorrência natural conforme relacionado acima, que pode ser ligado covalentemente aos resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia de polipeptídeos. Exemplos de resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural são norleucina, ornitina, norvalina e homosserina. Exemplos adicionais são relacionados em Ellman et al, Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336. Exemplos de métodos de síntese de resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural são relatados, por exemplo, em, Noren et al, Science 244 (1989) 182 e Ellman et al, acima.
[065] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos”, com relação a uma sequência de polipeptídeos de referência, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma possível sequência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados de alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório Norte- Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TUX510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operativo UNIX, incluindo UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[066] Em situações nas quais ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente expressa como uma dada sequência de aminoácidos A que possui ou compreende certo percentual de identidade de sequências de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado conforme segue: 100 vezes a fração X/Y em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliados como coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos entre A e B não será igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos entre B e A. A menos que indicado especificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2.
[067] A expressão “formulação farmacêutica” designa uma preparação que se encontra em uma forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja efetiva e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um paciente a quem a formulação seria administrada.
[068] “Veículo farmaceuticamente aceitável” designa um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente do ingrediente ativo, que é atóxico para o paciente. Veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas sem limitações, tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[069] A expressão “gradiente de pH linear positivo” indica um gradiente de pH que começa em valor de pH baixo (ou seja, mais ácido) e termina em valor de pH mais alto (ou seja, menos ácido, neutro ou alcalino). Em uma realização, o gradiente de pH linear positivo começa em valor de pH de cerca de 5,5 e termina em valor de pH de cerca de 8,8.
[070] A expressão “gradiente de pH linear negativo” indica um gradiente de pH que começa em valor de pH alto (ou seja, neutro ou alcalino) e termina em valor de pH mais baixo (ou seja, neutro ou ácido). Em uma realização, o gradiente de pH linear negativo começa em valor de pH de cerca de 7,4 e termina em valor de pH de cerca de 6,0.
[071] Da forma utilizada no presente, “tratamento” (e suas variações gramaticais tais como “tratar” ou “tratando”) indica intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas sem limitações, a prevenção da ocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progresso da doença, melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para reduzir a velocidade do progresso de uma doença.
[072] A expressão “região variável” ou “domínio variável” indica o domínio de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas similares, em que cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs) (vide, por exemplo, Kindt, T. J. et al, Kuby Immunology, sexta edição, W. H. Freeman & Co., Nova Iorque (2007), pág. 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígenos. Além disso, anticorpos que ligam um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL de um anticorpo que liga o antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente (vide, por exemplo, Portolano, S. et al, J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al, Nature 352 (1991) 624-628).
[073] As expressões “variante”, “anticorpo modificado” e “polipeptídeo de fusão modificado” indicam moléculas que possuem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de uma molécula parental. Tipicamente, essas moléculas possuem uma ou mais alterações, inserções ou exclusões. Em uma realização, o anticorpo modificado ou o polipeptídeo de fusão modificado compreende uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma parte de uma região Fc que normalmente não é de ocorrência natural. Essas moléculas possuem menos de 100% de identidade de sequências com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental. Em uma realização, o anticorpo variante ou o polipeptídeo de fusão variante possui uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequência de aminoácidos de cerca de 75% a menos de 100% com a sequência de aminoácidos do anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental, especialmente cerca de 80% a menos de 100%, especialmente cerca de 85% a menos de 100%, especialmente cerca de 90% a menos de 100% e, especialmente, cerca de 95% a menos de 100%. Em uma realização, o anticorpo parental do polipeptídeo de fusão parental e o anticorpo variante ou o polipeptídeo de fusão variante diferem em um (um único), dois ou três resíduos de aminoácidos.
II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS
[074] O receptor Fc (FcRn) neonatal humano desempenha papel importante no catabolismo de IgG. As propriedades/características de ligação de FcRn in vitro de um IgG indicam suas propriedades farmacocinéticas in vivo. Esses métodos in vitro seriam de grande importância durante o desenvolvimento de anticorpos, pois repetidos estudos in vivo podem ser evitados (experimentos com animais, tempo e custos reduzidos). Até agora, essas análises foram geralmente realizadas utilizando testes de ressonância da superfície de plasma (SPR) (Wang, W. et al, Drug Metab. Disp. 39 (2011) 1469-1477; Datta-Mannan, A. et al, Drug Metab. Disp. 40 (2012) 1545-1555; Vaughn, D. E. e Bjorkman, P. J., Biochemistry 36 (1997) 9374-9380; Raghavan, M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995) 11200-11204; Martin, W. L. e Bjorkman, P. J., Biochemistry 38 (1999) 12639-12647). Métodos de fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico e calorimétrico também foram descritos para determinar a afinidade de ligação de IgG a FcRn (Huber, A. H. et al, J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083; Pollastrini, J. et al, Anal. Biochem. 414 (2011) 88-98). Além de serem testes complexos, diversos estudos que investigam a correlação entre parâmetros de ligação de FcRn in vitro determinados por meio de SPR e a meia vida em soro de anticorpos in vivo até aqui deixaram de demonstrar essa correlação apesar de condições de reação de ligação aprimoradas e modelagem apropriada (Gurbaxani, B. et al, Mol. Immunol. 43 (2006) 1462-1473; Gurbaxani, B. M. e Morrison, S. L., Mol. Immunol. 43 (2006) 1379-1389; Gurbaxani, B., Clin. Immunol. 122 (2007) 121-124). Elaboração da região Fc de IgG1 para aumentar a afinidade de IgG1 a FcRn sob pH 6 e sob pH neutro conforme medido por meio de tecnologa SPR não resultou em aumento da farmacocinética em macacos cynomolgus (Yeung, Y. A. et al, J. Immunol. 182 (2009) 7663-7671). Somente aumentos modestos da afinidade de FcRn sob pH 6 na variante de IgG1 N434A sem ligação significativa simultânea a FcRn sob pH 7,4, entretanto, resultaram em aumento da farmacocinética em primatas, o que demonstra a importância da liberação de FcRn sob pH 7,4 (vide Yeung, Y. A., acima).
[075] Uma combinação de métodos conhecidos poderá atingir resultados analíticos comparáveis aos da cromatografia de afinidade de FcRn, mas à custa de maior complexidade e esforços.
[076] Os métodos padrão atuais não refletem adequadamente a dependência de pH fisiológico das características de ligação de FcRn que necessitam de pH ácido para ligação endossomal, mas pH neutro para liberação de IgG na superfície celular. O pH do meio exerce influência sobre as propriedades de autoassociação da molécula de FcRn. Os métodos atuais funcionam sob condições padrão em um dado pH e, portanto, detectam apenas um instantâneo da interação do complexo FcRn-IgG, evitando avaliação cinética robusta da interação IgG-FcRn. Esta pode também ser uma das razões da falta de correlação da afinidade de FcRn entre análise de FcRn in vitro e farmacocinética in vivo encontrada em diversos estudos (vide acima).
[077] Análise SPR da interação de IgG-FcRn fornece um resultado qualitativo que indica propriedades de ligação esperadas ou aberrantes de uma amostra, mas não indicam a causa da ligação aberrante nem uma estimativa quantitativa da quantidade de anticorpo com ligação aberrante. Espectrometria de massa também fornece apenas informações qualitativas de uma integridade prejudicada da molécula de IgG. Por outro lado, a cromatografia de afinidade de FcRn permite a análise da amostra sob condições fisiológicas apropriadas com estequiometria 2:1 predominante em uma mistura de estequiometrias, incluindo estequiometrias 1:2, 1:1 e 2:2 e gradiente de pH que pode ser ajustado para sintonia fina da separação dos diferentes picos encontrados em uma amostra. Os diferentes picos podem ser quantificados pela sua área sob a curva correspondente e o eluído correspondente a cada pico é propenso a análise secundária, por exemplo, para determinações de funcionalidade, recromatografia ou análise espectrométrica de massa.
[078] Além disso, a fim de fornecer regimes terapêuticos para tratar as diversas doenças conhecidas atualmente e também aquelas a serem descobertas no futuro, existe a necessidade de anticorpos específicos bem com polipeptídeos que contenham parte Fc.
[079] Para definir especificamente as características de ligação de FcRn de um anticorpo ou um polipeptídeo de fusão que contém parte Fc, os resíduos envolvidos em funções efetoras mediadas por parte Fc são modificados e os polipeptídeos de fusão e anticorpos modificados resultantes necessitam ser testados. Caso as características necessárias não sejam atendidas, o mesmo processo é realizado novamente.
[080] Em uma realização, a parte Fc é a fração de uma região Fc que media a ligação a FcRn.
[081] Desta forma, seria vantajoso fornecer um método que preveja as mudanças das propriedades características de um anticorpo modificado com base em um método cromatográfico simples e que não necessita de estudos in vivo para analisar as mudanças das características no anticorpo modificado.
[082] Em alguns casos, são desejados anticorpos com meia vida estendida. Drogas com meia vida maior na circulação de pacientes necessitados de tratamento necessitam, por exemplo, de dose mais baixa ou intervalos de dosagem maiores. Esses anticorpos também possuem a vantagem de maior exposição a um local de doença, tal como um tumor.
[083] Um aspecto conforme relatado no presente é o uso de um complexo não covalente imobilizado de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta- 2-microglobulina como ligante de cromatografia de afinidade.
[084] Descobriu-se que uma coluna de cromatografia de afinidade que compreende um complexo não covalente imobilizado de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante de cromatografia de afinidade possui estabilidade inesperada. Ela pode ser utilizada por pelo menos mais de cem ciclos de cromatografia e até cerca de duzentos ciclos de cromatografia (equilíbrio - separação - regeneração) sem perda de desempenho (seletividade e/ou capacidade de ligação).
[085] Também é relatada uma coluna de cromatografia de afinidade que compreende uma matriz e grupos funcionais cromatográficos ligados por matriz, caracterizada porque o grupo funcional cromatográfico ligado por matriz compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina.
[086] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para determinação da meia vida in vivo de um anticorpo por meio de determinação da razão entre os tempos de retenção do anticorpo e um anticorpo de referência. Em uma realização, o anticorpo de referência é um anticorpo IgG1 humano com comprimento total.
[087] Também é relatado no presente um método de determinação da meia vida in vivo de um anticorpo com relação a um anticorpo de referência por meio da determinação da razão entre os tempos de retenção determinados sobre uma coluna de afinidade de FcRn conforme relatado no presente do anticorpo e o anticorpo de referência.
[088] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para separação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte Fc.
[089] Também é relatado no presente um método de separação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte Fc.
[090] Em uma realização, a separação é selecionada por meio de purificação, produção e análise.
[091] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para separação de anticorpos da subclasse IgG1 e anticorpos da subclasse IgG3.
[092] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para determinar a oxidação de metionina de um anticorpo.
[093] É relatado no presente um método de determinação do impacto sobre a ligação de FcRn de resíduos de metionina oxidados na parte Fc de um anticorpo utilizando um método de cromatografia de afinidade relatado no presente.
[094] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para determinar o nível de oligomerização de um anticorpo.
[095] É relatado no presente um método de determinação do nível de oligomerização de um anticorpo utilizando um método de cromatografia de afinidade conforme relatado no presente.
[096] Geralmente, o ponto inicial do método relatado no presente é um anticorpo parental ou um polipeptídeo de fusão parental que é caracterizado pela ligação ao FcRn.
[097] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante de seleção de uma biblioteca de anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados de anticorpos parentais ou polipeptídeos de fusão parentais, que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para esses anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental.
[098] É relatado no presente um método de seleção de uma biblioteca de anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados de anticorpos parentais ou polipeptídeos de fusão parentais, que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para esses anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental, em que o método compreende as etapas a seguir: a. aplicação dos membros individuais da biblioteca e do anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental a uma coluna de cromatografia de afinidade FcRn conforme relatado no presente; b. recuperação dos membros individuais da biblioteca com um gradiente de pH e determinação dos tempos de retenção individuais; e c. seleção dos anticorpos ou polipeptídeos de fusão que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental.
[099] É relatado no presente um método de purificação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão, que compreende pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc, a partir de uma mistura de polipeptídeos, em que o método compreende a aplicação da mistura a uma coluna de afinidade de FcRn conforme relatado no presente e eluição dos anticorpos ou do polipeptídeo de fusão, que compreende pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc, com gradiente de pH, de forma a purificar o anticorpo ou o polipeptídeo de fusão. Em uma realização, a parte FcRn de uma região Fc é de uma região Fc humana, região Fc de camundongo, região Fc de cynomolgus, região Fc de coelho ou região Fc de hamster.
[0100] Os termos “um” e “uma” indicam um, dois, três, quatro, cinco ou seis e até 109.
[0101] Em uma realização, a mistura de produção/reação ou o sobrenadante de cutivo bruto ou parcialmente purificado é aplicado à coluna de afinidade FcRn em primeiro valor de pH e o anticorpo ou o polipeptídeo de fusão é recuperado da coluna de afinidade FcRn em segundo valor de pH.
[0102] Em uma realização, o primeiro valor de pH é de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 7,5. Em uma realização, o primeiro valor de pH é de cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Em uma realização, o primeiro valor de pH é de cerca de pH 4,5 a cerca de pH 6,5. Em uma realização, o primeiro valor de pH é de cerca de pH 5 a cerca de pH 6. Em uma realização, o primeiro valor de pH é de cerca de pH 5, cerca de pH 5,5 ou cerca de pH 6.
[0103] Em uma realização, o primeiro valor de pH é selecionado a partir de cerca de pH 3,5, cerca de pH 3,6, cerca de pH 3,7, cerca de pH 3,8, cerca de pH 3,9, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,1, cerca de pH 4,2, cerca de pH 4,3, cerca de pH 4,4, cerca de pH 4,5, cerca de pH 4,6, cerca de pH 4,7, cerca de pH 4,8, cerca de pH 4,9, cerca de pH 5,0, cerca de pH 5,1, cerca de pH 5,2, cerca de pH 5,3, cerca de pH 5,4, cerca de pH 5,5, cerca de pH 5,6, cerca de pH 5,7, cerca de pH 5,8, cerca de pH 5,9, cerca de pH 6,0, cerca de pH 6,1, cerca de pH 6,2, cerca de pH 6,3, cerca de pH 6,4, cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, cerca de pH 7,4 e cerca de pH 7,5.
[0104] Em uma realização, o segundo valor de pH é de cerca de pH 8 a cerca de pH 9,5. Em uma realização, o segundo valor de pH é de cerca de pH 8,5 a cerca de pH 9. Em uma realização, o segundo valor de pH é de cerca de pH 8. 8.
[0105] Em uma realização, o segundo valor de pH é selecionado a partir de cerca de pH 8,0, cerca de pH 8,1, cerca de pH 8,2, cerca de pH 8,3, cerca de pH 8,4, cerca de pH 8,5, cerca de pH 8,6, cerca de pH 8,7, cerca de pH 8,8, cerca de pH 8,9, cerca de pH 9,0, cerca de pH 9,1, cerca de pH 9,2, cerca de pH 9,3, cerca de pH 9,4 e cerca de pH 9,5.
[0106] Em uma realização, cada um dos primeiros valores de pH fornecidos de cerca de pH 3,5, cerca de pH 3,6, cerca de pH 3,7, cerca de pH 3,8, cerca de pH 3,9, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,1, cerca de pH 4,2, cerca de pH 4,3, cerca de pH 4,4, cerca de pH 4,5, cerca de pH 4,6, cerca de pH 4,7, cerca de pH 4,8, cerca de pH 4,9, cerca de pH 5,0, cerca de pH 5,1, cerca de pH 5,2, cerca de pH 5,3, cerca de pH 5,4, cerca de pH 5,5, cerca de pH 5,6, cerca de pH 5,7, cerca de pH 5,8, cerca de pH 5,9, cerca de pH 6,0, cerca de pH 6,1, cerca de pH 6,2, cerca de pH 6,3, cerca de pH 6,4, cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, cerca de pH 7,4 e cerca de pH 7,5 é combinado com cada um dos segundos valores de pH fornecidos de cerca de pH 8,0, cerca de pH 8,1, cerca de pH 8,2, cerca de pH 8,3, cerca de pH 8,4, cerca de pH 8,5, cerca de pH 8,6, cerca de pH 8,7, cerca de pH 8,8, cerca de pH 8,9, cerca de pH 9,0, cerca de pH 9,1, cerca de pH 9,2, cerca de pH 9,3, cerca de pH 9,4 e cerca de pH 9,5.
[0107] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para identificar anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc (tal como um domínio constante de uma imunoglobulina tal como IgG1) que exibem ligação alterada ao receptor Fc neonatal (FcRn).
[0108] É fornecido no presente um método de identificação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc (tal como um domínio constante de uma imunoglobulina tal como IgG1) que exibem ligação alterada ao receptor Fc neonatal (FcRn).
[0109] Esses polipeptídeos de fusão ou anticorpos modificados exibem ligação maior ou menor a FcRn em comparação com um polipeptídeo de fusão ou anticorpo parental ou em comparação com um anticorpo de referência ou proteína de fusão de referência e, portanto, possuem meia vida em soro maior ou menor, respectivamente.
[0110] Prevê-se que variantes de região Fc com maior afinidade para FcRn (ou seja, maior tempo de retenção sobre uma coluna FcRn mas ainda em eluição antes de um valor de pH 7,4 conforme relatado no presente em comparação com um anticorpo parental ou anticorpo de referência) possuem meias vidas em soro mais longas em comparação com aquelas com menor afinidade para FcRn. Variantes de região Fc com maior afinidade para FcRn possuem aplicação em métodos de tratamento de mamíferos, especialmente seres humanos, em que se deseja meia vida longa do polipeptídeo de fusão ou anticorpo administrado, tal como no tratamento de uma doença ou distúrbio crônico. Variantes de região Fc com menor afinidade para FcRn possuem aplicação em métodos de tratamento de mamíferos, especialmente seres humanos, em que se deseja meia vida curta do polipeptídeo de fusão ou anticorpo administrado, tal como em formação de imagens de diagnóstico in vivo.
[0111] É muito provável que variantes de região Fc com menor afinidade de ligação de FcRn sejam capazes de cruzar a placenta e, portanto, podem ser utilizados no tratamento de doenças ou distúrbios em mulheres grávidas, especialmente de crianças em gestação. Além disso, pode-se desejar afinidade de ligação de FcRn reduzida para as drogas destinadas a aplicação/transporte para o cérebro, rim e/ou fígado.
[0112] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para identificar anticorpos ou polipeptídeos de fusão que exibem transporte reduzido através do epitélio de glomérulos renais a partir da vasculatura.
[0113] Em uma realização, o anticorpo ou polipeptídeo de fusão que compreende uma região Fc modificada conforme relatado no presente exibe transporte reduzido através do epitélio de glomérulos renais a partir da vasculatura.
[0114] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para identificar anticorpos ou polipeptídeos de fusão que exibem transporte reduzido através da barreira de sangue do cérebro a partir do cérebro para o espaço vascular.
[0115] Em uma realização, o anticorpo ou polipeptídeo de fusão que compreende uma região Fc modificada de origem humana conforme relatado no presente exibe transporte reduzido através da barreira de sangue do cérebro (BBB) do cérebro para o espaço vascular.
[0116] São relatados no presente métodos de elaboração desses polipeptídeos de fusão e anticorpos modificados que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região FcRn e métodos de uso desses polipeptídeos de fusão e anticorpos modificados.
[0117] Em uma realização, o anticorpo ou o polipeptídeo de fusão relatado no presente compreende pelo menos um local de ligação (tal como em pelo menos um local de ligação de antígenos, pelo menos um local de ligação de receptor ou pelo menos um local de ligação de ligante). Em uma realização, o anticorpo ou polipeptídeo de fusão relatado no presente compreende pelo menos dois locais de ligação (tais como pelo menos dois locais de ligação de antígenos, pelo menos dois locais de ligação de receptores, pelo menos dois locais de ligação de ligantes, pelo menos um local de ligação de antígenos e pelo menos um local de ligação de receptores ou pelo menos um local de ligação de antígenos e pelo menos um local de ligação de ligantes, ou pelo menos um local de ligação de receptores e pelo menos um local de ligação de ligantes). Em uma realização, o anticorpo ou o polipeptídeo de fusão relatado no presente compreende três locais de ligação (tais como pelo menos três locais de ligação de antígenos, pelo menos três locais de ligação de receptores, pelo menos três locais de ligação de ligantes ou qualquer mistura de pelo menos três locais de ligação do anterior). Em uma realização, o anticorpo ou os polipeptídeos de fusão relatados no presente compreendem quatro locais de ligação.
[0118] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a pelo menos uma parte de uma região Fc é pelo menos uma parte de uma região Fc de origem humana. Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o FcRn é selecionado a partir de FcRn humano, FcRn de cynomolgus, FcRn de camundongo, FcRn de rato, FcRn de carneiro, FcRn de cachorro e FcRn de coelho.
[0119] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a beta-2-microglobulina é da mesma espécie do FcRn.
[0120] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a beta-2-microglobulina é de uma espécie diferente do FcRn.
[0121] Em uma realização, as regiões Fc ou as partes de ligação de FcRn de uma região Fc são derivadas de cadeias pesadas de qualquer isotipo.
[0122] Em uma realização, a pelo menos uma parte de uma região Fc compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos 282-340 de um domínio CH2 de origem humana (SEQ ID N° 1, numeração de acordo com Kabat). Em uma realização, a pelo menos uma parte de uma região Fc compreende um domínio CH2 completo (cerca dos resíduos de aminoácidos 231-340 de uma região Fc de polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo de origem humana de acordo com a numeração EU segundo Kabat). Em uma realização, a pelo menos uma parte de uma região Fc compreende pelo menos um domínio CH2 e pelo menos um dentre uma região de articulação (cerca dos resíduos de aminoácidos 216-230 de uma região Fc de polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo de origem humana de acordo com a numeração EU) ou um domínio CH3 (cerca dos resíduos de aminoácidos 341-446 de uma região Fc de polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo de origem humana de acordo com a numeração EU). Em uma realização, a pelo menos uma parte de região Fc compreende um domínio CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo de origem humana. Em uma realização, a pelo menos uma parte de região Fc compreende uma articulação, domínio CH2 e domínio CH3 de uma região Fc de cadeia pesada de anticorpo de origem humana. Regiões Fc de origem humana ou partes de ligação de FcRn de uma região Fc de partes de origem humana podem ser derivadas de cadeias pesadas de qualquer isotipo, tal como IgG1 (SEQ ID N° 3), IgG2 (SEQ ID N° 4), IgG3 (SEQ ID N° 5) e IgG4 (SEQ ID N° 6). Em uma realização, o isotipo humano é IgG1.
[0123] A região Fc do anticorpo parental ou compreendida no polipeptídeo de fusão parental pode ser derivada de moléculas de imunoglobulina diferentes e/ou isotipos de imunoglobulina diferentes. Um anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental, por exemplo, pode compreender um domínio CH2 derivado de uma imunoglobulina de isotipo IgG1 e uma região de articulação derivada de uma imunoglobulina de isotipo IgG3. Além disso, por exemplo, um anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental pode compreender uma região de articulação derivada, em parte, do subtipo de imunoglobulina IgG1 e, em parte, do subtipo de imunoglobulina IgG3, desde que estes sejam de origem humana. Um anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental, por exemplo, pode compreender uma região de articulação quimérica derivada, em parte, de um isotipo de imunoglobulina IgG1 e, em parte, de um isotipo de imunoglobulina IgG4.
[0124] O anticorpo parental do polipeptídeo de fusão parental relatado no presente compreende pelo menos uma região Fc ou uma de suas partes de ligação de FcRn. Em uma realização, o anticorpo parental ou polipeptídeo parental compreende adicionalmente pelo menos um domínio de ligação (em uma realização, selecionado a partir de um domínio de ligação de antígeno, domínio de ligação de receptor ou domínio de ligação de ligante). Em uma realização, o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental compreende pelo menos um domínio de ligação e pelo menos uma região Fc ou uma de suas partes de ligação de FcRn. Em uma realização, o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental compreende dois domínios de ligação e duas regiões Fc ou duas de suas partes de ligação de FcRn.
[0125] Em uma realização, o anticorpo parental ou o polipeptídeo de fusão parental relatado no presente compreende pelo menos um domínio de ligação que se liga especificamente a um alvo que media um efeito biológico (em uma realização, um ligante capaz de ligar-se a um receptor da superfície celular ou a um receptor da superfície celular capaz de ligar um ligante) e media a transmissão de um sinal positivo ou negativo para uma célula junto com pelo menos uma região Fc ou uma de suas partes de ligação de FcRn. Em uma realização, a mediação do efeito biológico é realizada em valor de pH de cerca de pH 7,4. Em uma realização, o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental compreende pelo menos um domínio de ligação específico para um antígeno dirigido para redução ou eliminação (em uma realização, um antígeno da superfície celular ou antígeno solúvel) e pelo menos uma região Fc ou uma de suas partes de ligação de FcRn.
[0126] Anticorpos que se ligam especificamente a um alvo podem ser levantados em mamíferos por meio de diversas injeções subcutâneas ou intraperitoneais do antígeno relevante (tal como antígeno purificado, células ou extratos celulares que compreendem esses antígenos ou DNA que codifica esse antígeno) e, opcionalmente, um adjuvante.
[0127] Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0128] Em uma realização, o polipeptídeo de fusão relatado no presente compreende um fragmento de anticorpo (tal como uma molécula scFv, um minicorpo, um minicorpo tetravalente ou um diacorpo) ligado operativamente a uma parte de ligação de FcRn. Em uma realização, a parte de ligação de FcRn é uma região Fc de cadeia pesada de anticorpo completo.
[0129] Em uma realização, o anticorpo parental é um anticorpo biespecífico ou o polipeptídeo de fusão parental compreende um anticorpo biespecífico ou um fragmento de anticorpo biespecífico.
[0130] Em uma realização, o anticorpo parental é um anticorpo quimérico.
[0131] Em uma realização, o polipeptídeo de fusão parental compreende pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc. Em uma realização, o polipeptídeo de fusão parental relatado no presente compreende um ou mais domínios de ligação que, por sua vez, podem compreender um local de ligação cada um. O polipeptídeo de fusão parental pode ser biespecífico (com um local de ligação que se liga especificamente a um primeiro alvo e um segundo local de ligação que se liga especificamente a um segundo alvo) ou multivalente (com dois locais de ligação que se ligam especificamente ao mesmo alvo).
[0132] Em uma realização de todos os aspectos anteriores, o pH é um gradiente de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 8,8.
[0133] Em uma realização, o pH é gradiente de cerca de pH 5 a pH 6, cerca de pH 6 a cerca de pH 7 ou cerca de pH 7 a cerca de pH 8.
[0134] Geralmente, o domínio de ligação é fundido ao terminal C ou ao terminal N da pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc.
[0135] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para seleção de anticorpos com ligação ao FcRn em valor de pH 7,4 para (co)direcionamento in vivo. Em uma realização, o codirecionamento é a internalização.
[0136] Em uma realização, portanto, o primeiro pH é de cerca de pH 7,4. Em uma realização, o segundo pH é de cerca de pH 6. 0.
[0137] Geralmente, o domínio extracelular solúvel de FcRn (SEQ ID N° 7 para FcRn humano) com marca His-Avi C-terminal (SEQ ID N° 8) foi coexpresso com β2-microglobulina (SEQ ID N° 9 para beta-2-microglobulina humana) em células de mamíferos. O complexo de microglobulina FcRn não covalente foi biotinilado e carregado sobre sepharose derivatizada de estreptavidina.
[0138] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2- microglobulina (b2m) é ligado a uma fase sólida.
[0139] Uma “fase sólida” indica uma substância não fluida e inclui partículas (incluindo micropartículas e esferas) feitas de materiais tais como polímero, metal (partículas paramagnéticas e ferromagnéticas), vidro e cerâmica; substâncias em gel tais como géis de sílica, alumina e polímero; capilares, que podem ser feitos de polímero, metal, vidro e/ou cerâmica; zeólitos e outras substâncias porosas; eletrodos; placas de microtítulos; fitas sólidas; e cubetas, tubos ou outros recipientes de amostra de espectrômetro. Um componente de fase sólida de um teste é diferenciado de superfícies sólidas inertes porque um “suporte sólido” contém pelo menos uma porção sobre a sua superfície, que se destina a interagir quimicamente com uma molécula. Uma fase sólida pode ser um componente estacionário, tal como um chip, tubo, fita, cubeta ou placa de microtítulos, ou pode ser um componente não estacionário, tal como esferas e micropartículas. Micropartículas podem também ser utilizadas como suporte sólido para formatos de teste homogêneos. Diversas micropartículas que permitem ligação covalente ou não covalente de proteínas e outras substâncias podem ser utilizadas. Essas partículas incluem partículas de polímero tais como poliestireno e metacrilato de (póli)metila; partículas de ouro, tais como nanopartículas de ouro e coloides de ouro; e partículas cerâmicas, tais como partículas de sílica, vidro e óxido metálico. Vide, por exemplo, Martin, C. R. et al, Analytical Chemistry-News & Features, 1° de maio (1998) 322A-327A, que é incorporado ao presente como referência. Em uma realização, o suporte sólido é sepharose.
[0140] Em uma realização, a conjugação do complexo não covalente à fase sólida é realizada por meio de ligação química por meio de grupos N-terminais e/ou ε-amino (lisina), grupos ε-amino de diferentes lisinas, grupos funcionais carbóxi, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos da cadeia principal de aminoácidos do anticorpo e/ou grupos de álcool de açúcar da estrutura de carboidratos do anticorpo.
[0141] Em uma realização, o complexo não covalente é conjugado à fase sólida por meio de um par de ligação específico. Em uma realização, o complexo não covalente é conjugado a biotina e a imobilização a um suporte sólido é realizada por meio de avidina ou estreptavidina imobilizada em suporte sólido.
[0142] Um par de ligação específico (primeiro componente/segundo componente), em uma realização, é selecionado a partir de estreptavidina ou avidina/biotina, anticorpo/antígeno (vide, por exemplo, Hermanson, G. T. et al, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), lectina/polissacarídeo, esteroide/proteína de ligação de esteroide, hormônio/receptor de hormônio, enzima/substrato, IgG/Proteína A e/ou G etc.
[0143] A recuperação de anticorpo ligado à coluna de afinidade FcRn relatada no presente nos usos e métodos relatados no presente é realizada por meio de eluição de gradiente linear. Em uma realização, o gradiente linear é um gradiente de pH ou gradiente de condutividade.
[0144] Em princípio, qualquer substância tampão pode ser utilizada nos métodos relatados no presente.
[0145] Resíduos de Fc críticos para interação de Fc de camundongo e FcRn de camundongo foram identificados por meio de mutagênese dirigida a local (vide, por exemplo, Dall’Acqua, W. F. et al, J. Immunol. 169 (2002), 5171-5180). Os resíduos I253, H310, H433, N434 e H435 (numeração EU de acordo com Kabat) estão envolvidos na interação (Medesan, C. et al, Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M. et al, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J. K. et al, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). Os resíduos I253, H310 e H435 foram considerados críticos para interação de Fc humano com FcRn murino (Kim, J. K. et al, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). Os resíduos M252Y, S254T e T256E foram descritos por Dall’Acqua et al para aumentar a ligação de FcRn por meio de estudos de interação entre proteínas (Dall’Acqua, W. F. et al, J .Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). Estudos do complexo de Fc humano e FcRn humano demonstraram que os resíduos I253, S254, H435 e Y436 são fundamentais para a interação (Firan, M. et al, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R. L. et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Em Yeung, Y.A. et al (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671), diversos mutantes dos resíduos 248 a 259, 301 a 317, 376 a 382 e 424 a 437 foram relatados e examinados.
[0146] O tempo de retenção de diferentes anticorpos obtidos com diferentes tampões de eluiçlão é exibido na tabela a seguir. TABELA
Figure img0001
[0147] A expressão mutante YTE indica o mutante triplo M252Y/S254T/T256E.
[0148] Em uma realização, é utilizada uma substância tampão farmaceuticamente aceitável, tal como ácido fosfórico ou seus sais, ácido acético ou seus sais, ácido cítrico ou seus sais, morfolina, ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico (MES) ou seus sais, histidina ou seus sais, glicina ou seus sais, tris (hidroximetil)aminometano (TRIS) ou seus sais, ácido (4-(2- hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) ou seus sais.
[0149] Em uma realização, a substância tampão é selecionada a partir de ácido fosfórico ou seus sais, ácido acético ou seus sais, ácido cítrico ou seus sais, histidina ou seus sais.
[0150] Em uma realização, a substância tampão possui concentração de 10 mM a 500 mM. Em uma realização, a substância tampão possui concentração de 10 mM a 300 mM. Em uma realização, a substância tampão possui concentração de 10 mM a 250 mM. Em uma realização, a substância tampão possui concentração de 10 mM a 100 mM. Em uma realização, a substância tampão possui concentração de 15 mM a 50 mM. Em uma realização, a substância tampão possui concentração de cerca de 20 mM.
[0151] Em uma realização, a substância tampão na primeira solução e a substância tampão na segunda solução são a mesma substância tampão.
[0152] Em uma realização, a substância tampão na primeira solução e a substância tampão na segunda solução são substâncias tampão diferentes.
[0153] Em uma realização, a primeira solução possui valor de pH de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 7,5. Em uma realização, a primeira solução possui valor de pH de cerca de pH 5 a cerca de pH 6. Em uma realização, a primeira solução possui valor de pH de cerca de pH 5. 5.
[0154] Em uma realização, a segunda solução possui valor de pH de cerca de pH 7,0 a cerca de pH 9,5. Em uma realização, a segunda solução possui valor de pH de cerca de pH 8 a cerca de pH 9. Em uma realização, a segunda solução possui valor de pH de cerca de pH 8,2 a cerca de pH 8,8.
[0155] Um exemplo de primeira solução compreende 20 mM de MES e 150 mM de NaCl, ajustados até pH 5,5.
[0156] Um exemplo de segunda solução compreende 20 mM de TRIS e 150 mM de NaCl, ajustados até pH 8,8.
[0157] Um exemplo de segunda solução compreende 20 mM de HEPES ajustados até pH 8,6.
[0158] Um exemplo de segunda solução compreende 20 mM de TRIS ajustados até pH 8,2.
[0159] Em uma realização, a solução tamponada compreende um sal adicional. Em uma realização, o sal adicional é selecionado a partir de cloreto de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, sufato de potássio, citrato de sódio ou citrato de potássio. Uma realização compreende a solução tamponada de 50 mM a 1000 mM do sal adicional. Uma realização compreende a solução tamponada de 50 mM a 750 mM do sal adicional. Uma realização compreende a solução tamponada de 50 mM a 500 mM do sal adicional. Uma realização compreende a solução tamponada de 50 mM a 750 mM do sal adicional. Uma realização compreende a solução tamponada de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM do sal adicional.
[0160] Em uma realização, a primeira e/ou segunda solução compreende cloreto de sódio. Em uma realização, a primeira e/ou segunda solução compreende cerca de 50 mM a cerca de 300 mM de cloreto de sódio.
[0161]Descobriu-se que o tipo de sal e substância tampão influencia o tempo de retenção e a resolução. Pode ser determinada uma concentração de sal ideal para ligação de anticorpos a FcRn (150 mM de NaCl). Caso a concentração de sal seja mais alta (300 mM), a ligação a FcRn é reduzida e é obtido tempo de retenção mais curto. O mesmo é verdadeiro para concentração de sal mais baixa (50 mM). 20 mM de HEPES, pH 8,6, prolongaram o tempo de retenção para todos os anticorpos testados.
[0162]Como se pode observar na Figura 1, a quantidade de anticorpo aplicado exibe correlação linear com a área sob a curva do pico que sofreu eluição.
[0163]Oito anticorpos foram analisados como anticorpos completos e após a divisão com a enzima IDES. A divisão foi controlada por meio de SDS Page e SEC analítico. A parte Fc e a parte Fab do anticorpo foram separadas por meio de SEC preparativo. Na Tabela a seguir, são fornecidos os tempos de retenção do anticorpo completo, da parte Fab e da parte Fc. TABELA
Figure img0002
[0164] A expressão mutante YTE indica o mutante triplo M252Y/S254T/T256E.
[0165] Geralmente, o tempo de retenção de anticorpos que possuem uma parte Fc do tipo selvagem (IgG1, IgG2 ou IgG4) varia de 45 a 49 minutos (testado com 35 anticorpos terapêuticos contra 36 antígenos, dados não exibidos).
[0166] Na tabela a seguir, é exibido o tempo de retenção com relação à quantidade de receptor FcRn imobilizado por grama de material de coluna. TABELA
Figure img0003
Figure img0004
[0167] A expressão mutante YTE indica o mutante triplo M252Y/S254T/T256E.
[0168] O fragmento FAB de anticorpo anti-Abeta compreende um local de glicosilação.
[0169] Desta forma, um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para detectar a modificação de FAB. Em uma realização, a modificação é glicosilação ou distribuição de carga.
[0170] Geralmente, o tempo de retenção nos métodos e usos relatados no presente depende da inclinação do gradiente de pH e da concentração de sal empregada. O anticorpo do tipo selvagem é utilizado como referência e ligação mais fraca é indicada por tempo de retenção mais curto (= eluição precoce), enquanto ligação mais forte é indicada por tempo de retenção mais longo (= eluição posterior), mas ainda antes de valor de pH 7,4.
[0171] Descobriu-se que mutantes diferentes da parte Fc do IgG apresentam comportamento diferente sobre a coluna de FcRn, exibindo tempos de retenção modificados.
[0172] O mutante de anticorpo anti-Abeta YTE, por exemplo, exibe tempo de retenção maior. O segundo pico do mutante YTE de anticorpo anti- Abeta deve-se a um local de glicosilação adicional introduzido na parte Fab.
[0173] O mutante de anticorpo anti-IGF-1R YTE, por exemplo, exibe tempo de retenção maior (vide a Figura 2). TABELA
Figure img0005
[0174] A expressão mutante YTE indica o mutante triplo M252Y/S254T/T256E.
[0175] Descobriu-se que, com a coluna FcRn conforme relatado no presente, é possível identificar aminoácidos relevantes para ligação de FcRn e avaliar os mutantes em comparação com o anticorpo do tipo selvagem não modificado.
[0176] Aspectos conforme relatado no presente são o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para identificar aminoácidos relevantes para ligação de FcRn para avaliar os mutantes em comparação com o anticorpo do tipo selvagem não modificado.
[0177] Os resultados obtidos com um anticorpo anti-Her2 são apresentados na tabela a seguir (vide, por exemplo, WO 2006/031370 como exemplo de referência). TABELA
Figure img0006
Figure img0007
[0178] Descobriu-se que anticorpos que exibiram eluição posterior da coluna FcRn, ou seja, que possuíam tempo de retenção mais longo sobre a coluna FcRn, apresentaram meia vida mais longa in vivo. Os dados in vivosão exibidos na tabela a seguir. TABELA
Figure img0008
[0179] A expressão mutante YTE indica o mutante triplo M252Y/S254T/T256E.
[0180] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para determinar a meia vida in vivo de um anticorpo.
[0181] O conjunto de experimentos in vitro e in vivo conduzidos com IgG do tipo selvagem e variantes de IgG com mutações YTE na parte Fc permitiu exibir correlação semiquantitativa das descobertas na cromatografia de afinidade de FcRn com as dos estudos farmacocinéticos in vivo com camundongos transgênicos para FcRn humano (Spiekerman, G. M. et al, J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310; Dall’Acqua, W. F. et al, J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). A mutação de YTE gera meia vida significativamente prolongada e liberação de plasma mais lenta. A meia vida in vivo mais longa correspondeu a tempo de retenção mais longo na cromatografia de FcRn. Demonstrou-se recentemente que meia vida estendida de uma variante de trastuzumab elaborada com Fc possui ligação in vitro aprimorada a FcRn, conforme medido por meio de citometria de fluxo (Petkova, S. B. et al, Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769). Demonstrou-se que uma variante do anticorpo de IgG1 anti-VEGF bevacizumab com afinidade de FcRn aumentada em onze vezes possui meia vida estendida em cinco vezes em camundongos transgênicos de FcRn humanos e meia vida três vezes mais longa em macacos cynomolgus (Zalevsky, J. et al, Nat. Biotechnol. 28 (2010) 157-159).
[0182] Descobriu-se que a análise e a remoção de anticorpos pela metade em preparações de IgG pode ser atingida utilizando uma coluna de FcRn conforme relatado no presente. Um exemplo de cromatografia de coluna de FcRn é exibido na Figura 3.
[0183] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para remoção de anticorpos pela metade de preparações de IgG.
[0184] Descobriu-se que oligômeros e agregados podem ser separados por meio de cromatografia de FcRn conforme relatado no presente (vide a Figura 4).
[0185] Um aspecto relatado no presente é o uso de um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante para remoção de agregados de anticorpos e oligômeros de anticorpos de preparações de IgG.
[0186] Descobriu-se que o tempo de retenção é influenciado pelo número de partes Fc compreendidas na molécula de analisado. Isso foi demonstrado utilizando construções que contêm uma ou duas partes Fc (vide a Figura 5).
[0187] Descobriu-se que a oxidação apresentou impacto sobre a ligação de FcRn e poderá ser observada sobre coluna de FcRn (vide a Figura 6).
[0188] Demonstrou-se que o formato de anticorpo não apresentou impacto sobre a ligação à coluna de FcRn. Isso foi demonstrado para o formato knob-em-hole e para diversos formatos de anticorpos biespecíficos. Desta forma, a coluna de FcRn pode ser utilizada para avaliação de novos formatos de anticorpos.
[0189] Em uma realização, o complexo é monobiotinilado.
[0190] Em uma realização, o material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta- 2-microglobulina como ligante possui estabilidade de pelo menos cem ciclos nos métodos e usos relatados no presente. Um ciclo é um gradiente de pH do primeiro valor de pH para o segundo valor de pH do método ou uso correspondente, em que, para regeneração do material, nenhuma mudança adicional de condições é necessária além das condições finais do método ou uso. Desta forma, em uma realização, um ciclo é um gradiente de pH de valor de pH de cerca de pH 5,5 até valor de pH de cerca de pH 8,8.
[0191] Descobriu-se que uma troca de aminoácidos de M para H na posição 252 em combinação com uma troca de aminoácidos de M para E na posição 428 resulta em tempo de retenção reduzido (vide a Figura 7).
[0192] A amostra de anticorpo com produtos de oxidação Met252 e Met428 ilustra a diferença entre o método SPR e a cromatografia de afinidade FcRn. Embora análise de SPR das amostras detectasse diferença relativa de ligação da amostra de cerca de 20% em comparação com o padrão de referência, ela não forneceu detalhes da heterogeneidade dessa amostra. Por outro lado, cromatografia de afinidade de FcRn da mesma amostra exibiu dois picos distintos, um no tempo de retenção do padrão de referência e o segundo pico significativamente alterado para a esquerda, indicando interação mais fraca do anticorpo na amostra com estresse com o material de coluna de FcRn sob pH mais baixo.
[0193] Um material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante, conforme relatado no presente, pode ser utilizado para isolamento/separação de fragmentos de anticorpos e, portanto, fornece alternativa para cromatografia de afinidade de Proteína A convencional. Além disso, utilizando o material de cromatografia relatado no presente, a separação pode ser realizada sob condições mais fisiológicas, tais como valor de pH, em comparação com cromatografia de afinidade de Proteína A convencional.
[0194] O material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante pode ser utilizado para determinação/separação/enriquecimento de espécies de anticorpos que compreendem modificações tais como oxidação, variantes de carga, glicosilação e desamidação. O material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta- 2-microglobulina como ligante pode ser utilizado dependendo do gradiente de pH selecionado (valor de pH inicial/final) para o enriquecimento de certas espécies de anticorpos.
[0195] O material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante pode ser utilizado para o isolamento/enriquecimento de espécies de anticorpos por variação/diferença de peso molecular.
[0196] O material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante pode ser utilizado para o isolamento/enriquecimento de anticorpos pelo número de local de ligação de FcRn na molécula.
[0197] O material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante pode ser utilizado para o isolamento de modificações de aminoácidos. O material de cromatografia que compreende um complexo não covalente de receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina como ligante pode ser utilizado para isolamento/separação de desemparelhamentos de anticorpos biespecíficos tais como dímeros de hole-hole e anticorpos pela metade. REALIZAÇÃO ESPECÍFICA 1. Uso de complexo não covalente imobilizado de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) como ligante de cromatografia de afinidade em cromatografia de afinidade com gradiente de pH linear positivo. 2. Uso de acordo com o item 1, caracterizado porque é em cromatografia de afinidade com gradiente de pH linear positivo para separar anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma região Fc. 3. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 2, caracterizado porque o receptor Fc neonatal e a beta-2-microglobulina são, independentemente entre si, de origem humana, ou originado de camundongo, ou originado de cynomolgus, ou originado de ratos ou originado de coelho. 4. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 3, caracterizado porque a beta-2-microglobulina é da mesma espécie do receptor Fc neonatal. 5. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado porque o receptor Fc neonatal e a beta-2-microglobulina são o receptor Fc neonatal do tipo selvagem humano e a beta-2-microglobulina do tipo selvagem humana cada, independentemente entre si, com zero a dez modificações de resíduos de aminoácidos. 6. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 5, caracterizado porque o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2- microglobulina (b2m) é ligado a uma fase sólida. 7. Uso de acordo com o item 6, caracterizado porque a fase sólida é um material de cromatografia. 8. Uso de acordo com qualquer dos itens 6 ou 7, caracterizado porque o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2- microglobulina (b2m) é biotinilado e a fase sólida é derivatizada com estreptavidina. 9. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 8, caracterizado porque o gradiente de pH é de um primeiro valor de pH a um segundo valor de pH, de forma que o primeiro valor de pH é de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 7,5 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 6,0 a cerca de pH 9,5. 10. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 9, caracterizado porque o primeiro valor de pH é de cerca de pH 5,5 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 8,8. 11. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à determinação da meia vida in vivo de um anticorpo por meio de determinação da razão dos tempos de retenção do anticorpo e um anticorpo de referência. 12. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à determinação da oxidação de metionina de um anticorpo. 13. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à determinação do nível de oligomerização de um anticorpo. 14. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à seleção de uma biblioteca de anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados de anticorpos parentais ou polipeptídeos de fusão parentais, que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para esses anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental. 15. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à identificação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc que exibem ligação alterada ao receptor Fc neonatal. 16. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à remoção de anticorpos pela metade de preparações de IgG. 17. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado porque o uso destina-se à remoção de agregados de anticorpos e oligômeros de anticorpos a partir de preparações de IgG. 18. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 17, caracterizado porque o anticorpo é um anticorpo monoespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão ou um anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou um anticorpo triespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou anticorpo tetraespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão. 19. Uso de complexo não covalente imobilizado de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) como ligante de cromatografia de afinidade em cromatografia de afinidade com gradiente de pH linear negativo. 20. Uso de acordo com o item 19, caracterizado porque é em cromatografia de afinidade com um gradiente de pH linear negativo para separar anticorpos ou polipeptideos de fusão que compreendem pelo menos uma região Fc. 21. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 ou 20, caracterizado porque o receptor Fc neonatal e a beta-2-microglobulina são, independentemente entre si, de origem humana, ou originado de camundongo, ou originado de cynomolgus, ou originado de rato ou originado de coelho. 22. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 21, caracterizado porque a beta-2-microglobulina é da mesma espécie do receptor Fc neonatal. 23. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 22, caracterizado porque o receptor Fc neonatal e a beta-2-microglobulina são o receptor Fc neonatal do tipo selvagem humano e a beta-2-microglobulina do tipo selvagem humana cada, independentemente entre si, com zero a dez modificações de resíduos de aminoácidos. 24. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 23, caracterizado porque o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) é ligado a uma fase sólida. 25. Uso de acordo com o item 24, caracterizado porque a fase sólida é um material de cromatografia. 26. Uso de acordo com qualquer dos itens 24 ou 25, caracterizado porque o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) é biotinilado e a fase sólida é derivatizada com estreptavidina. 27. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 26, caracterizado porque o gradiente de pH é de um primeiro valor de pH a um segundo valor de pH, de forma que o primeiro valor de pH é de cerca de pH 7,0 a cerca de pH 8,5 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,9. 28. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 27, caracterizado porque o primeiro valor de pH é de cerca de pH 7,4 e o segundo valor de pH é de cerca de pH 6,0. 29. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à determinação da meia vida in vivo de um anticorpo por meio da determinação da razão dos tempos de retenção do anticorpo e um anticorpo de referência. 30. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à determinação da oxidação de metionina de um anticorpo. 31. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à determinação do nível de oligomerização de um anticorpo. 32. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à seleção de uma biblioteca de anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados de anticorpos parentais ou polipeptídeos de fusão parentais, que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para esses anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação com o anticorpo parental ou polipeptídeo de fusão parental. 33. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à identificação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc que exibem ligação alterada ao receptor Fc neonatal. 34. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à remoção de anticorpos pela metade de preparações de IgG. 35. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 28, caracterizado porque o uso destina-se à remoção de agregados de anticorpos e oligômeros de anticorpos de preparações de IgG. 36. Uso de acordo com qualquer dos itens 19 a 35, caracterizado porque o anticorpo é um anticorpo monoespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão ou um anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou um anticorpo triespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou anticorpo tetraespecífico ou fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão. 37. Uso de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, 18, 19 a 28 e 35, caracterizado porque o uso destina-se à separação de anticorpos da subclasse IgG1 de anticorpos da subclasse IgG3. 38. Variante de região Fc de isotipo IgG1 humano na qual o aminoácido na posição 252 é alterado de metionina para histidina e o aminoácido na posição 428 é alterado de metionina para ácido glutâmico.
1. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
[0198] Em certas realizações, um polipeptídeo de fusão fornecido no presente compreende um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpos incluem, mas sem limitações, fragmentos de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv, bem como outros fragmentos descritos abaixo. Para análise de certos fragmentos de anticorpos, vide Hudson, P. J. et al, Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para análise de fragmentos de scFv, vide, por exemplo, Plueckthun, A., em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore (eds.), Springer-Verlag, Nova Iorque (1994), págs. 269-315; vide também WO 93/16185, US 5.571.894 e US 5.587.458. Para discussão de fragmentos de Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores salvos e possuem maior meia vida in vivo, vide US 5.869.046.
[0199] Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação de antígenos que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, EP 0.404.097; WO 1993/01161; Hudson, P. J. et al, Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993) 6444-6448. Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson, P. J. et al, Nat. Med. 9 (2003) 129-134.
[0200] Anticorpos com domínio simples são fragmentos de anticorpos que compreendem, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia pesada ou, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo com domínio simples é um anticorpo com domínio simples humano (Domantis, Inc., Waltham MA; vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.248.516 B1).
[0201] Podem ser elaborados fragmentos de anticorpos por meio de diversos métodos, incluindo, mas sem limitações, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (tais como E. coli ou fago), conforme descrito no presente.
2. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[0202] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, em US 4.816.567; e Morrison, S. L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 (1984) 6851-6855). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (tal como uma região variável derivada de camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “classe trocada” no qual a classe ou subclasse foi alterada com relação ao anticorpo parental. Anticorpos quiméricos incluem seus fragmentos de ligação de antígenos.
[0203] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para seres humano, mantendo ao mesmo tempo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, tais como CDRs (ou suas partes), são derivadas de um anticorpo não humano e FRs (ou suas partes) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (tal como o anticorpo do qual são derivados os resíduos de HVR), por exemplo, para restaurar ou aumentar a especificidade ou afinidade de anticorpos.
[0204] Anticorpos humanizados e os métodos de sua elaboração são analisados, por exemplo, em Almagro, J. C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann, I. et al, Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (1989) 10029-10033; US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 e US 7.087.409; Kashmiri, S. V. et al, Methods 36 (2005) 25-34 (que descreve enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, E. A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que descreve “nova formação de superfície”); Dall’Acqua, W. F. et al, Methods 36 (2005): 4360 (que descreve “mudança de FR”); e Osbourn, J. et al, Methods 36 (2005) 6168 e Klimka, A. et al, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que descreve a abordagem de “seleção orientada” para troca de FR).
[0205] As regiões de estrutura humana que podem ser utilizadas para humanização incluem, mas sem limitações: regiões de estrutura selecionadas utilizando o método de "melhor adequação"(vide, por exemplo, Sims, M. J. et al, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308); regiões de estrutura derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (1992), 4285-4289; e Presta, L. G. et al, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiões de cadeia principal maduras humanas (que sofreram mutação somática) ou regiões de cadeia principal de linhagem de germens humanos (vide, por exemplo, Almagro, J. C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); e regiões de estrutura derivadas de bibliotecas de FR de seleção (vide, por exemplo, Baca, M. et al, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684; e Rosok, M. J. et al, J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).
3. ANTICORPOS HUMANOS
[0206] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Anticorpos humanos são descritos de forma geral em van Dijk, M. A. e van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 e Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.
[0207] Anticorpos humanos podem ser preparados por meio da administração de imunogenes a animais transgênicos que tenham sido modificados para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a desafio antigênico. Esses animais contêm tipicamente, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, que substituem os locais de imunoglobulina endógenos ou que estão presentes de forma extracromossômica ou são integrados aleatoriamente aos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os locais de imunoglobulina endógena foram, de forma geral, desativados. Para análise de métodos de obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Vide também, por exemplo, US 6.075.181 e US 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSE®; US 5.770.429 que descreve a tecnologia HuMab®; US 7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSE®; e US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VelociMouse®. Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, por meio de combinação com uma região constante humana diferente.
[0208] Anticorpos humanos podem também ser elaborados por meio de métodos com base em hibridoma. Também foram descritas linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos para a produção de anticorpos monoclonais humanos (vide, por exemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B. R. et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987), págs. 51-63; e Boerner, P. et al, J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Os anticorpos humanos gerados por meio da tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (2006) 3557-3562. Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, em US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens de células de hibridoma) e Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que descreve hibridomas humanos-humanos). A tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers, H. P. e Brandlein, S., Histology and Histopathology, 20 (2005) 927-937 e Vollmers, H. P. e Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (2005): 185-191.
[0209] Anticorpos humanos podem também ser gerados por meio do isolamento de sequências de domínio variável de clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de seres humanos. Essas sequências de domínios variáveis podem ser combinadas em seguida com um domínio constante humano desejado. Métodos de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritos abaixo.
4. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECAS
[0210] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser isolados por meio da seleção de bibliotecas combinatórias em busca de anticorpos com a(s) atividade(s) desejada(s). Diversos métodos são conhecidos na técnica, por exemplo, para gerar bibliotecas de exibição de fagos e selecionar essas bibliotecas em busca de anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Esses métodos são analisados, por exemplo, em Hoogenboom, H. R. et al em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 e adicionalmente descritos, por exemplo, em McCafferty, J. et al, Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al, Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J. D. et al, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J. D. e Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S. S. et al, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C. V. et al, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F. A., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (2004) 12467-12472; e Lee, C. V. et al, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
[0211] Em certos métodos de exibição de fagos, repertórios de genes VH e VL são clonados separadamente por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) e novamente combinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem ser pesquisadas em seguida em busca de fago de ligação de antígenos conforme descrito em Winter, G. et al, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, seja na forma de fragmentos de Fv de fita simples (scFv) ou de fragmentos de Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunogene sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório nativo pode ser clonado (por exemplo, de seres humanos) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla variedade de antígenos próprios e também não próprios sem nenhuma imunização, conforme descrito por Griffiths, A. D. et al, EMBO J., 12 (1993) 725-734. Por fim, bibliotecas nativas podem também ser elaboradas sinteticamente por meio de clonagem de segmentos de genes V não redispostos de células haste, utilizando primers de PCR que contêm sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e realizar redisposição in vitro conforme descrito por Hoogenboom, H. R. e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: US 5.750.373, US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 e US 2009/0002360.
[0212] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos no presente.
5. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[0213] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes. Em certas realizações, anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes do mesmo antígeno. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam o antígeno. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos.
[0214] Os métodos de elaboração de anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitações, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve e pesada de imunoglobulina que possuem especificidades diferentes (vide Milstein, C. e Cuello, A. C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 e Traunecker, A. et al, EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) e engenharia de “knob-em- hole” (vide, por exemplo, US 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos podem também ser elaborados por meio da realização de efeitos de direcionamento eletrostático para elaborar moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpos (WO 2009/089004); retícula de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, US 4.676.980 e Brennan, M. et al, Science 229 (1985) 81-83); uso de fechos de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny, S. A. et al, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; uso de tecnologia de “diacorpos” para elaborar fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993) 6444-6448); uso de dímeros de Fv de fita simples (sFv) (vide, por exemplo, Gruber, M. et al, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt, A. et al, J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
[0215] São também incluídos no presente anticorpos elaborados com três ou mais locais de ligação de antígenos funcionais, incluindo “anticorpos Octopus” (vide, por exemplo, US 2006/0025576).
[0216] O anticorpo ou fragmento do presente também inclui um “Fab de Ação Dupla” ou “DAF” que compreende um local de ligação de antígenos que se liga a antígenos diferentes (vide, por exemplo, US 2008/0069820).
[0217] O anticorpo ou fragmento do presente também inclui anticorpos multiespecíficos descritos em WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 e WO 2010/145793.
6. VARIANTES DE ANTICORPOS
[0218] Em certas realizações, são contempladas variantes de sequências de aminoácidos dos anticorpos fornecidos no presente. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequências de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas por meio da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por meio da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, tais como ligação de antígenos.
A. VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E EXCLUSÃO
[0219] Em certas realizações, são fornecidas variantes de anticorpos que contêm uma ou mais substituições de aminoácidos. Locais de interesse para mutagênese de substituição incluem HVRs e FRs. Exemplos de alterações são fornecidos na Tabela 1 com o título “exemplos de substituições” e conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de cadeias laterais de aminoácidos. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título “substituições preferidas”. Substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos são selecionados para determinar uma atividade desejada, tal como ligação de antígenos retida/aprimorada, redução da imunogenicidade ou aumento de ADCC ou CDC. TABELA
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[0220] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comuns: 1. hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2. hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3. ácidos: Asp, Glu; 4. básicos: His, Lys, Arg; 5. resíduos que influenciam a orientação de cadeias: Gly, Pro; 6. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[0221] Substituições não conservadoras implicam a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0222] Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável (HVR) de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo adicional conterá(ão) modificações (tais como melhorias) em certas propriedades biológicas (tais como aumento da afinidade e redução da imunogenicidade) com relação ao anticorpo parental e/ou possuirão certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Um exemplo de variante de substituição é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, utilizando, por exemplo, métodos de amadurecimento por afinidade com base em exibição de fagos, tais como os descritos no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos HVR sofrem mutação e os anticorpos variantes são exibidos sobre fago e selecionados por uma atividade biológica específica (tal como afinidade de ligação).
[0223] Podem ser elaboradas alterações (tais como substituições) em HVRs, por exemplo, para aumentar a afinidade de anticorpo. Essas alterações podem ser feitas em “pontos quentes” de HVR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação sob alta frequência durante o processo de amadurecimento somático (vide, por exemplo, Chowdhury, P. S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196) e/ou SDRs (a-CDRs), em que a variante resultante VH ou VL é testada para determinar a afinidade de ligação. O amadurecimento por afinidade por meio da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrito, por exemplo, em Hoogenboom, H. R. et al em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. Em algumas realizações de amadurecimento por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis selecionados para amadurecimento por qualquer um dentre uma série de métodos (tais como PCR à prova de erros, alteração de cadeias ou mutagênese dirigida a oligonucleotídeos). É criada em seguida uma biblioteca secundária. A biblioteca é selecionada em seguida para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Um outro método de introdução da diversidade envolve abordagens dirigidas a HVR, em que diversos resíduos de HVR (tais como quatro a seis resíduos de cada vez) são aleatorizados. Resíduos de HVR envolvidos na ligação de antígenos podem ser especificamente identificados, utilizando, por exemplo, modelagem ou mutagênese de varrimento de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 são particularmente dirigidos com frequência.
[0224] Em certas realizações, substituições, inserções ou exclusões podem ocorrer em até um ou mais HVRs, desde que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de ligar antígeno. Alterações conservadoras, por exemplo (tais como substituições conservadoras conforme fornecido no presente), que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser elaboradas em HVRs. Essas alterações podem estar fora de “pontos quentes” de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterado ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[0225] Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que podem ser dirigidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varrimento de alanina”, conforme descrito por Cunningham, B. C. e Wells, J. A., Science 244 (1989), 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos desejados (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) é identificado e substituído por um aminoácido neutro ou com carga negativa (tal como alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativa ou adicionalmente, uma estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo identifica pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser dirigidos ou eliminados para possível substituição. Variantes podem ser selecionadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[0226] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo em soro.
B. VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[0227] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é alterado para aumentar ou reduzir a extensão de glicosilação do anticorpo. A adição ou exclusão de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por meio da alteração da sequência de aminoácidos, de tal forma que sejam criados ou removidos um ou mais locais de glicosilação.
[0228] Quando o anticorpo compreender uma região Fc, o carboidrato a ele ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem tipicamente um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright, A. e Morrison, S. L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, tais como manose, N- acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na “haste” da estrutura de oligossacarídeo biantenária. Em algumas realizações, podem ser elaboradas modificações do oligossacarídeo em um anticorpo de acordo com a presente invenção, a fim de criar variantes de anticorpos com certas propriedades aprimoradas.
[0229] Em uma realização, são fornecidas variantes de anticorpos que possuem uma estrutura de carboidrato que não contém fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. A quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser, por exemplo, de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada por meio do cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, com relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (tais como estruturas com alto teor de manose híbridas e complexas) conforme medido por meio de espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito, por exemplo, em WO 2008/077546. Asn297 designa o resíduo de asparagina localizado perto da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos de região Fc); Asn297 pode também estar localizado, entretanto, a cerca de três aminoácidos acima ou abaixo no fluxo da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores de sequências de anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem possuir função ADCC aprimorada. Vide, por exemplo, US 2003/0157108 e US 2004/0093621. Exemplos de publicações relativas a variantes de anticorpos “defucosilados” ou “com deficiência de fucose” incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al, J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614- 622. Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células de CHO Lec13 com deficiência na fucosilação de proteínas (Ripka, J. et al, Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; e WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11) e linhagens de células knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células de CHO knockout (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki, N. et al, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 ; Kanda, Y. et al, Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; e WO 2003/085107).
[0230] Variantes de anticorpos possuem adicionalmente oligossacarídeos bisseccionados, tais como em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bisseccionado por GlcNAc. Essas variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função de ADCC aprimorada. Exemplos dessas variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878, US 6.602.684 e US 2005/0123546. Também são fornecidas variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem possuir função CDC aprimorada. Essas variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087, WO 1998/58964 e WO 1999/22764.
7. VARIANTES DE REGIÃO FC
[0231] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido no presente, de forma a gerar uma variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (tal como região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano) que compreende uma modificação de aminoácidos (tal como substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[0232] Em certas realizações, a presente invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas mas não todas as funções efetoras, o que a torna candidato desejável para aplicações nas quais a meia vida do anticorpo in vivoé importante, mas certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Podem ser conduzidos testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo para confirmar a redução/esgotamento de atividades de CDC e/ou ADCC. Testes de ligação de receptores Fc (FcR), por exemplo, podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não apresente ligação de FcyR (portanto, propenso a não apresentar atividade de ADCC), mas retenha a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch, J. V. e Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Exemplos não limitadores de testes in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos em US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (1986) 7059-7063; e Hellstsrom, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 (1985) 1499-1502); US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, podem ser empregados métodos de teste não radioativos (vide, por exemplo, teste de citotoxicidade não radioativo ACTI® para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View CA; e teste de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison WI). Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modelo animal como o descrito em Clynes, R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95 (1998) 652-656. Testes de ligação de C1q podem também ser conduzidos para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar C1q e, portanto, não apresenta atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro, H. et al, J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M. S. et al, Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, M. S. e M. J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Determinações de meia vida/liberação in vivo e ligação de FcRn podem também ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, S. B. et al, Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
[0233] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (US 6.737.056). Esses mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a chamada mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (US 7.332.581).
[0234] São descritas certas variantes de anticorpos com maior ou menor ligação a FcRs (vide, por exemplo, US 6.737.056; WO 2004/056312; e Shields, R. L. et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)
[0235] Em certas realizações, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam ADCC, tais como substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).
[0236] Em algumas realizações, são realizadas alterações na região Fc que resultam em ligação de C1q e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) alterada (ou seja, aumentada ou reduzida), conforme descrito, por exemplo, em US 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie, E. E. et al, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
[0237] Anticorpos com maiores meias vidas e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer, R. L. et al, J. Immunol. 117 (1976) 587-593; e Kim, J. K. et al, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos em US 2005/0014934. Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que aumentam a ligação da região Fc a FcRn. Essas variantes de Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 252, 253, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, tais como substituição do resíduo da região Fc 434 (US 7.371.826).
[0238] Vide também Duncan, A. R. e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5.624.821; e WO 94/29351 com referência a outros exemplos de variantes de região Fc.
8. VARIANTES DE ANTICORPOS ELABORADAS COM CISTEÍNA
[0239] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados com cisteína, tais como “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Substituindo esses resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são posicionados, portanto, em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções de drogas ou porções de droga e ligante, para criar um imunoconjugado, conforme descrito adicionalmente no presente. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos resíduos a seguir podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Anticorpos elaborados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, em US 7.521.541.
9. DERIVADOS DE ANTICORPOS
[0240] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pode ser adicionalmente modificado para que contenha porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis. As porções apropriadas para derivação do anticorpo incluem, mas sem limitações, polímeros hidrossolúveis. Exemplos não limitadores de polímeros hidrossolúveis incluem, mas sem limitações, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetilcelulose, dextran, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, póli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno e anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextran ou póli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno e óxido de etileno, polióis polioxietilados (tais como glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. Propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagens de fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. A quantidade de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, caso mais de um polímero seja ligado, eles podem ser moléculas idênticas ou diferentes. Geralmente, a quantidade e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivação podem ser determinados com base em considerações que incluem, mas sem limitações, as propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será utilizado em terapia sob condições definidas etc.
[0241] Em uma outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos por meio de exposição à radiação. Em uma realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam, N. W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas sem limitações, comprimentos de onda que não prejudicam células comuns, mas que aquecem a porção não proteinácea até uma temperatura na qual células próximas da porção não proteinácea de anticorpo são mortas.
III. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RECOMBINANTES
[0242] Métodos de produção de anticorpos monoclonais foram relatados em primeiro lugar por Kohler e Milstein (Nature 256 (1975) 495-497). Foi relatada em seguida a produção de anticorpos recombinantes com células de mieloma por meio da introdução estável do ácido nucleico codificador de anticorpos (DNA) (vide Oi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 (1983) 63516355).
[0243] O ácido nucleico codificador de anticorpos (seja para o anticorpo completo ou para os domínios variáveis) pode ser isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais a partir de uma célula produtora de anticorpos. Após isolamento, o ácido nucleico codificador pode ser colocado em um ou mais vetores de expressão. Se apenas o ácido nucleico codificador do domínio variável for isolado, o vetor de expressão compreende também um ácido nucleico que codifica a região constante de cadeia leve e/ou cadeia pesada, respectivamente (vide, por exemplo, US 5.658.570). O vetor de expressão pode ser transfectado em células hospedeiras procarióticas (E. coli) ou eucarióticas (CHO, HEK, BHK e SP2/0) que, de outra forma, não secretam anticorpos.
[0244] Caso o ácido nucleico codificador seja derivado de uma biblioteca de exibição, tal como uma biblioteca de exibição de fagos, uma biblioteca de exibição de leveduras ou, de forma geral, uma biblioteca de exibição da superfície celular, ele pode ser clonado diretamente no vetor de expressão.
[0245] Anticorpos podem ser produzidos utilizando composições e métodos recombinantes, tal como conforme descrito na Patente Norte- Americana n° 4.816.567. Em uma realização, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo descrito no presente. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência VL e/ou de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo (tais como as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (tais como vetores de expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em uma dessas realizações, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo; ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é eucariótica, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (tal como célula Y0, NS0, Sp20). Em uma realização, é fornecido um método de elaboração de um anticorpo conforme relatado no presente, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições apropriadas para a expressão do anticorpo, e recuperação opcional do anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultivo de células hospedeiras).
[0246] Para produção recombinante de um anticorpo conforme relatado no presente, ácido nucleico que codifica um anticorpo, tal como conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo).
[0247] Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células eucarióticas ou procarióticas descritas no presente. Anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, em bactérias, particularmente quando não forem necessárias glicosilação e função efetora de Fc. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523 (vide também Charlton, K. A. em Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B. K. C. (ed.), Human Press, Totowa NJ (2003), págs. 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
[0248] Além de procariotes, micróbios eucarióticos tais como leveduras ou fungos filamentosos são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores codificadores de anticorpos, incluindo linhagens de fungos e leveduras cujos processos de glicosilação tenham sido “humanizados”, o que resulta na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação total ou parcialmente humano. Vide Gerngross, T. U., Nat. Biotech. 22 (2004) 14091414; e Li, H. et al, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
[0249] As células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (vertebrados e invertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos e plantas. Foram identificadas numerosas linhagens bacilovirais que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[0250] Cultivos de células vegetais podem também ser utilizados como hospedeiros. Vide, por exemplo, US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (que descrevem tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[0251] Células de vertebrados podem também ser utilizadas como hospedeiros. Podem ser úteis, por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para cultivo em suspensão. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham, F. L. et al, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74); células de rim de filhote de hamster (BHK); células sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, J. P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma da cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células do fígado de ratos búfalo (BRL 3A); células do pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongos (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J. P. et al, Annals N. Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub, G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77 (1980) 4216-4220); e linhagens de células de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para análise de certas linhagens de células de hospedeiros mamíferos apropriadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A. M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K. C. (ed.), Human Press, Totowa NJ (2004), págs. 255-268.
III. IMUNOCONJUGADOS
[0252] A presente invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo conforme relatado no presente conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores do crescimento, toxinas (tais como toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou isótopos radioativos.
[0253] Em uma realização, imunoconjugado é um conjugado de droga e anticorpo (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas, incluindo, mas sem limitações, maitansinoide (vide US 5.208.020, US 5.416.064 e EP 0.425.235 B1); uma auristatina tal como porções de drogas de monometil auristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (vide US 5.635.483, US 5.780.588 e US 7.498.298); dolastatina; caliqueamicina ou seus derivados (vide US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296; Hinman, L. M. et al, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; e Lode, H. N. et al, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorubicina (vide Kratz, F. et al, Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S. C. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M. Y. et al, Bioconjug. Chem. 16 (2005), 717-721; Nagy, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (2000) 829-834); Dubowchik, G. M. et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H. D. et al, J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; e Patente Norte-Americana n° 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; tricoteceno; e CC1065.
[0254] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou seu fragmento, incluindo, mas sem limitações, cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[0255] Em uma outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado for utilizado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como TC99m ou I123, ou marca de centrifugação para formação de imagens por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0256] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser elaborados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bisazido (tais como bis(p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazônio (tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bisativo (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito em Vitetta, E. S. et al, Science 238 (1987) 1098-1104. Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopenta-acético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante divisível” que possibilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari, R. V. et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5.208.020).
[0257] Os imunoconjugados ou ADCs contemplam expressamente no presente, mas sem limitações, os conjugados preparados com reagentes reticulantes, que incluem, mas sem limitações, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (por exemplo, por meio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos).
IV. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES DE DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO
[0258] Em certas realizações, qualquer um dos anticorpos fornecidos no presente é útil para detectar a presença do seu antígeno em amostras biológicas. O termo “detecção”, da forma utilizada no presente, engloba detecção qualitativa ou quantitativa. Em certas realizações, amostras biológicas compreendem uma célula ou tecido.
[0259] Em uma realização, é fornecido um anticorpo conforme relatado no presente para uso em um método de detecção ou diagnóstico. Em um aspecto adicional, é fornecido um método de detecção da presença de antígeno em uma amostra biológica. Em certas realizações, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo conforme descrito no presente sob condições permissivas para ligação do anticorpo ao seu antígeno e detecção se é formado um complexo entre o anticorpo e o antígeno. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo.
[0260] Em certas realizações, são fornecidos anticorpos marcados conforme relatado no presente. As marcas incluem, mas sem limitações, marcas ou porções que são detectadas diretamente (tais como marcas fluorescentes, cromofóricas, densas em elétrons, quimioluminescentes e radioativas), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de reação enzimática ou interação molecular. Exemplos de marcas incluem, mas sem limitações, os radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoroforos tais como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luciferases, tais como luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (US 4.737.456), luciferina, 2,3- di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rabanete silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeos, tais como oxidase de glicose, oxidase de galactose e desidrogenase 6-fosfato de glicose, oxidases heterocíclicas tais como oxidase de uricase e xantina, acoplados a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de tintura tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcas de centrifugação, marcas de bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.
V. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0261] Formulações farmacêuticas de um anticorpo conforme descrito no presente são preparadas por meio da mistura desse anticorpo que possui o grau desejado de pureza com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. (Ed.) (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente são atóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas sem limitações: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de proteína e Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis no presente incluem ainda agentes de dispersão de drogas intersticiais tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), como glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, como rhuPH20 (HYLENEX®, Bayer International, Inc.). Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rhuPH20, são descritos nas Patentes Norte-Americanas publicadas n° 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, um sHASEGP é combinado com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
[0262] Exemplos de formulações de anticorpos liofilizadas encontram-se descritos em US 6.267.958. Formulações de anticorpos aquosos incluem os descritos em US 6.171.586 e WO 2006/044908, em que estas últimas formulações incluem um tampão de acetato de histidina.
[0263] A formulação do presente pode também conter mais de um ingrediente ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Esses ingredientes ativos encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0264] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de métodos de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Esses métodos são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences,16a edição, Osol, A. (Ed.) (1980).
[0265] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas.
[0266] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.
VI. ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS
[0267] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas, sacos de solução intravenosa etc. Os recipientes podem ser formados com uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que, por si própria ou quando combinada com outra composição, é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é um anticorpo de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição escolhida. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo de acordo com a presente invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente citotóxico ou outro terapêutico adicional. O artigo industrializado desta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indica que as composições podem ser utilizadas para o tratamento de uma condição específica. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[0268] Compreende-se que qualquer um dos artigos industrializados acima pode incluir um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além de um anticorpo conforme relatado no presente.
[0269] Os exemplos, figuras e sequências a seguir são fornecidos para ajudar na compreensão da presente invenção, cujo escopo verdadeiro é definido nas reivindicações anexas. Compreende-se que podem ser realizadas modificações nos procedimentos descritos sem abandonar o espírito da presente invenção.
EXEMPLOS MÉTODOS ESPECTROMETRIA DE MASSA DE IONIZAÇÃO DE ELETROPULVERIZAÇÃO (ESI-MS)
[0270] Parcelas de proteína (50 μg) foram desglicosiladas por meio da adição de 0,5 μl de N-Glicanase Plus (Roche) e tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,1) para obter um volume final de amostra de 115 μl. A mistura foi incubada a 37 °C por 18 horas. Em seguida, para redução e desnaturação, foram adicionados 60 μl de 0,5 M de TCEP (Pierce) em 4 M de guanidina * HCl (Pierce) e 50 μl de 8 M de guanidina * HCl. A mistura foi incubada a 37 °C por trinta minutos. As amostras foram dessalinizadas por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (Sepharose G-25, isocrático, 40% de acetonitrila com 2% de ácido fórmico). Espectros de massa ESI (+ve) foram registrados em um instrumento Q-TOF (maXis, Bruker) equipado com uma fonte de nano ESI (TriVersa NanoMate, Advion). As definições de parâmetros MS foram as seguintes: Transferência: Funil RF, 400 Vpp; Energia ISCID, 0 eV; Multipolo RF, 400 Vpp; Quadripolo: energia de íons, 4,0 eV; massa baixa, 600 m/z; fonte: gás seco, 8 l/min; temperatura de gás seco, 160 °C; célula de colisão: energia de colisão, 10 eV; colisão RF: 2000 Vpp; resfriador de íons: Resfriador de Íons RF, 300 Vpp; tempo de transferência: 120 μs; armazenagem Pre Puls, 10 μs; faixa de varredura m/z 600 a 2000. Para avaliação de dados, utilizou-se software de desenvolvimento doméstico (Analisador de Massa).
ANÁLISE DE RESSONÂNCIA DE PLASMA DE SUPERFÍCIE FCRN (SPR)
[0271] As propriedades de ligação de anticorpo do tipo selvagem e dos mutantes para FcRn foram analisadas por meio de tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) utilizando um instrumento BIAcore T100 (BIAcore AB, Uppsala, Suécia). Este sistema é bem estabelecido para estudo de interações moleculares. Ele permite monitoramento em tempo real contínuo de ligações de ligante/analisado e, portanto, a determinação de parâmetros cinéticos em várias configurações de teste. A tecnologia de SPR é baseada na medição do índice de refração perto da superfície de um chip biossensor folheado a ouro. Alterações do índice de refração indicam mudanças de massa sobre a superfície causadas pela interação de ligante imobilizado com analisado injetado em solução. Caso moléculas se liguem a um ligante imobilizado sobre a superfície, a massa aumenta; em caso de dissociação, a massa diminui. No teste atual, o receptor de FcRn foi imobilizado sobre um chip biossensor BIAcore CM5 (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Suécia) por meio de acoplamento de amina até um nível de 400 unidades de resposta (RU). O teste foi conduzido à temperatura ambiente com PBS, 0,05% de Tween 20, pH 6,0 (GE Healthcare Bioscience) como tampão de condução e diluição. 200 nM de amostras de anticorpos oxidados ou nativos foram injetados em velocidade de fluxo de 50 μl/min à temperatura ambiente. O tempo de associação foi de 180 s e a fase de dissociação levou 360 s. A regeneração da superfície do chip foi atingida por uma injeção curta de HBS-P, pH 8. 0. A avaliação de dados de SPR foi realizada por meio de comparação da altura de sinal de reação biológica a 180 s após a injeção e a 300 s após a injeção. Os parâmetros correspondentes são o nível máximo de RU (180 s após a injeção) e a estabilidade posterior (300 s após o final da injeção).
EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE COLUNA DE AFINIDADE DE FCRN EXPRESSÃO DE FCRN EM CÉLULAS HEK293
[0272] FcRn foi expresso de forma transitória por meio de transfecção de células HEK293 com dois plasmídeos que contêm a sequência de codificação de FcRn e de beta-2-microglobulina. As células que sofreram transfecção foram cultivadas em frascos de agitação a 36,5 °C, 120 rpm (amplitude do agitador de 5 cm), 80% de umidade e 7% de CO2. As células foram diluídas a cada dois a três dias até densidade de 3 a 4*105 células/ml.
[0273] Para expressão transitória, um biorreator de aço inoxidável de 14 l iniciou com volume de cultivo de 8 l a 36,5 °C, pH 7,0 ± 0,2, pO2 a 35% (gasificação com N2 e ar, fluxo de gás total de 200 ml/min-1) e velocidade de agitador de 100 a 400 rpm. Quando a densidade celular atingiu 20*105 células/ml, 10 mg de DNA de plasmídeo (quantidades equimolares dos dois plasmídeos) foram diluídos em 400 ml de Opti-MEM (Invitrogen). 20 ml de 293fectina (Invitrogen) foram adicionados a essa mistura, que foi incubada em seguida por quinze minutos à temperatura ambiente e transferida em seguida para o fermentador. A partir do dia seguinte, as células foram abastecidas com nutrientes em modo contínuo: adicionou-se uma solução de alimentação em taxa de 500 ml por dia e glicose conforme necessário para manter o nível em mais de 2 g/l. O sobrenadante foi colhido sete dias após a transfecção utilizando uma centrífuga superior oscilante com baldes de um litro: 4000 rpm por 90 minutos. O sobrenadante (13 l) foi limpo por um filtro Sartobran P (0,45 μm + 0,2 μm, Sartorius) e o complexo de beta-2-microglobulina de FcRn foi purificado a partir dele.
BIOTINILAÇÃO DE RECEPTOR FC NEONATAL
[0274] Um domínio extracelular solúvel de FcRn com marca His-Avi que foi coexpresso com β2-microglobulina em células HEK293 foi biotinilado após purificação conforme segue: 1,2 mg a 12 mg de FcRn/β2-microglobulina em 5 ml de 20 mM de tampão citrato de sódio, pH 5,5 contendo 150 mM de KCl, 250 μl de PBS e uma pastilha de inibidor de protease completo (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram biotinilados utilizando o kit de biotinilação da Avidity de acordo com as instruções do fabricante (Bulk BIRA). Realizou-se reação de biotinilação à temperatura ambiente por uma noite. A proteína modificada foi dialisada contra 20 mM de tampão fosfato de sódio que compreende 150 mM de NaCl, pH 7,5, a 4 °C por uma noite para remover excesso de biotina.
ACOPLAMENTO A SEPHAROSE DE ESTREPTAVIDINA
[0275] Um grama de sepharose de estreptavidina (GE Healthcare) foi adicionado ao receptor biotinilado e dialisado (1,2 a 12 mg de FcRn/β2-microglobulina, para aplicação analítica padrão foram escolhidos 3 mg) e incubado por duas horas com agitação. A sepharose derivatizada de receptor foi cheia em uma coluna de 1 ml de XK (GE Healthcare).
EXEMPLO 2 CROMATOGRAFIA UTILIZANDO A COLUNA DE AFINIDADE DE FCRN
[0276] A sepharose derivatizada de receptor foi cheia em uma coluna de 1 ml de XK (GE Healthcare) e a coluna de FcRn foi equilibrada em seguida com 20 mM de tampão ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfônico (MES) contendo 150 mM de NaCl, pH 5,5. CONDIÇÕES Dimensões da coluna: 50 mm x 5 mm Altura do leito: 5 cm Carga: 50 μg de amostra Tampão de equilíbrio: 20 mM de MES com 150 mM de NaCl, ajustado até pH 5,5 Tampão de eluição: 20 mM de Tris/HCl com 150 mM de NaCl, ajustado até pH 8,8 Eluição: 7,5 CV tampão de equilíbrio em 30 CV a 100% de tampão de eluição, 10 CV tampão de eluição
[0277] Amostras de proteínas de fusão ou anticorpos que contêm 50 a 100 μg de proteína foram ajustadas a pH 5,5 e aplicadas à coluna de FcRn utilizando explorador ÃKTA 10 XT ou Dionex Summit (Dionex, Idstein, Alemanha). A coluna com altura de leito de 5 cm foi lavada em seguida com 5-10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio de 20 mM de MES, 150 mM de NaCl, pH 5,5. As proteínas que contêm Fc ligadas por afinidade foram eluídas com gradiente de pH até 20 mM de Tris/HCl, 150 mM de NaCl, pH 8,8, em 30 volumes de coluna. Para eluição completa de anticorpos modificados, o pH aumentou no gradiente até pH 8,8. Os experimentos foram conduzidos à temperatura ambiente. O perfil de eluição foi obtido por meio de medição contínua da absorbância a 280 nm. O tempo decorrido para um pico analítico, X, atingir o detector após a injeção de amostra foi denominado tempo de retenção.
EXEMPLO 3 CORRELAÇÃO ENTRE O TEMPO DE RETENÇÃO SOBRE A COLUNA FCRN E MEIA VIDA IN VIVO
[0278] A meia vida in vivo foi medida em camundongos C57BL/6J transgênicos para FcRn humano após a administração intravenosa isolada de 10 mg/kg (n = 8) e comparada com o tempo de retenção sobre a coluna de FcRn (vide tabela). Descobriu-se que os anticorpos que exibiram eluição posterior a partir da coluna de FcRn apresentaram meia vida mais longa em camundongos transgênicos para FcRn. TABELA
Figure img0010
EXEMPLO 4 PURIFICAÇÃO DE FCRN HUMANO, FCRN DE CAMUNDONGO E FCRN DE CYNOMOLGUS
[0279] Os sobrenadantes clarificados que contêm proteínas marcadas com hexa his foram carregados sobre uma resina de cromatografia de afinidade Ni-NTA (Qiagen, Hanbrechtikon, Suíça) a 4 °C. Após etapas de lavagem com 20 mM de tampão fosfato de sódio que compreende 500 mM de NaCl a pH 7,4 e contém 20 mM, respectivamente 100 mM de imidazol, proteínas foram eluídas em velocidade de fluxo de 2 ml/min utilizando eluição em bateladas com o mesmo tampão contendo 300 mM de imidazol sobre um sistema de cromatografia ÃKTA Prime (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). Frações foram reunidas e adicionalmente purificadas em tampão de fosfato de sódio contendo 500 mM de NaCl sobre cromatografia de exclusão de tamanhos (Superdex® 200, GE Healthcare, Zurique, Suíça). Proteínas purificadas foram quantificadas utilizando um espectrofotômetro Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) e analisadas por meio de SDS PAGE sobre géis Bis-Tris a 4-12% NuPAGE em tampão MES sob condições de desnaturação e redução.
EXEMPLO 5 CROMATOGRAFIAS DE COLUNA DE AFINIDADE DE FCRN DE CAMUNDONGO E CYNOMOLGUS
[0280] Na tabela a seguir, são fornecidos os tempos de retenção de exemplos de anticorpos humanos sobre colunas de afinidade que compreendem FcRn de macacos Cynomolgus. Os dados foram obtidos utilizando as condições a seguir: Tampão de eluição: 20 mM de TRIS/HCl, 150 nM de NaCl, pH 8,5. Descrição adicional: vide o Exemplo 2. A expressão mutante YTE indica o mutante triplo M252Y/S254T/T256E.
Figure img0011
[0281] Na tabela a seguir, são fornecidos os tempos de retenção de exemplos de anticorpos humanos sobre FcRn murino. Os dados foram obtidos utilizando as condições a seguir: 1,2 mg de receptor acoplados sobre 1 ml de Sepharose. Tampão de eluição: 20 mM de TRIS/HCl, 150 nM de NaCl, pH 8,5. Descrição adicional: vide o Exemplo 2. Os mutantes de YTE não são incluídos nesta tabela, pois eles não poderiam haver sido eluídos a menos que o pH do tampão de eluição houvesse sido ajustado em 9,5.
Figure img0012
[0282] A coluna de afinidade de FcRn de Cynomolgus comporta-se de forma similar a uma coluna de afinidade de FcRn humana com relação à ligação de anticorpos humanizados. Por outro lado, a ligação de anticorpos humanizados à coluna de FcRn murino é mais forte que à coluna de afinidade de FcRn humano, como se pode observar por meio de retenção posterior.
EXEMPLO 6 GERAÇÃO DE FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
[0283] O fragmento de F(ab’)2 e o fragmento de região Fc foram preparados por meio de divisão do anticorpo com comprimento total diluído a 1:1 com 100 mM de Tris, pH 8,0, adição de 1 μg de protease de cisteína IdeS por 50 μg de anticorpo e incubação por duas horas a 37 °C. Os produtos de divisão resultantes F(ab’)2 e Fc foram separados sobre uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (Superdex 200, GE Healthcare, Zurique, Suíça) utilizando um sistema de cromatografia ÃKTA Explorer (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e as frações de pico foram reunidas. Padrões de peso molecular sobre a mesma coluna serviram para identificar os dois produtos de divisão com base nos seus tempos de retenção.
[0284] Os tempos de retenção de anticorpos com comprimento total variaram notadamente. Por outro lado, os tempos de retenção das partes Fc correspondentes de todos os anticorpos testados virtualmente não diferiram entre si (<1%).
[0285] Ao utilizar-se plasmina para divisão dos anticorpos com comprimento total, foram obtidas as mesmas descobertas (dados não exibidos).
EXEMPLO 7 CORRELAÇÃO ENTRE O TEMPO DE RETENÇÃO SOBRE A COLUNA DE FCRN E O ESTADO DE OXIDAÇÃO
[0286] Foi estudada a influência da oxidação do anticorpo sobre o tempo de retenção na cromatografia de afinidade de FcRn. A oxidação de um anticorpo IgG1 (1 mg/ml) foi observada armazenando-se o anticorpo a 40 °C por dois meses. As amostras de anticorpos não modificados e oxidados foram analisadas por meio de cromatografia de afinidade de FcRn e tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) de FcRn. A oxidação do anticorpo foi caracterizada por mapeamento de peptídeos e espectrometria de massa por ionização de eletropulverização (ESI-MS).
[0287] Dados de ESI-MS revelaram que cerca de 50% de cadeias pesadas do anticorpo IgG1 foram oxidados no solvente e exibiram resíduos de Met252 e Met428 mediante armazenagem em tampão (20 mM de His/His*HCl, 240 mM de tre-halose e 0,02% de polissorbato 20) sob condições aceleradas a 40 °C por dois meses. Quando as amostras com estresse a 40 °C contendo anticorpo oxidado e amostras armazenadas a -80 °C e a 25 °C foram aplicadas a uma coluna de afinidade sobre a qual FcRn foi anteriormente imobilizado, poderão ser separados dois picos principais (Figura 8). O segundo pico da Figura 8 que consiste de duas curvas virtualmente sobrepostas com tempo de retenção mais longo correspondeu ao tempo de eluição do anticorpo não modificado em amostras armazenadas a 25 °C e a -80 °C, enquanto o pico de eluição inicial representou anticorpo oxidado por Met252 e Met428. A presença de Met252 e Met428 oxidado foi sustentada pela alteração de massa de 16 Da detectada na amostra com estresse por ESI-MS. Análise da amostra de anticorpo com estresse (40 °C) por meio de SPR no BIAcore exibiu o mesmo padrão de reação no sensograma da cromatografia de FcRn com duas espécies de anticorpos diferentes, ou seja, anticorpo do tipo selvagem e anticorpo oxidado por Met252 e Met428 (Figura 9).
EXEMPLO 8 CORRELAÇÃO DO TEMPO DE RETENÇÃO SOBRE COLUNA FCRN COM A FORMAÇÃO DE AGREGADOS
[0288] A influência da formação de agregados de anticorpos sobre a interação de FcRn na cromatografia de afinidade foi avaliada para um anticorpo anti-IL3R alfa. As frações de agregado e monômero de anticorpo foram isoladas por meio de cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) e reunião dos picos correspondentes. A interação de FcRn das frações foi analisada por meio de cromatografia de afinidade e tecnologia de SPR.
[0289] Utilizou-se cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) para isolar três frações de anticorpos anti-IL13R alfa que contêm monômeros de anticorpos anti-IL13R alfa e agregados multiméricos para cromatografia de coluna de FcRn. Com base nas áreas de pico do cromatograma, a amostra de anticorpo anti-IL13R alfa utilizado para cromatografia de afinidade de FcRn continha 57% de monômeros e 43% de agregados de anticorpo anti-IL13R alfa. Análise da amostra não fracionada na cromatografia de afinidade de FcRn revelou dois picos principais com tempos de retenção diferentes (Figura 10). O pico menor com tempo de retenção maior correspondeu ao da fração agregada enquanto a parte principal do pico de eluição mais rápido correspondeu à fração de monômero.
[0290] Na análise de ressonância de plasma de superfície (SPR), um padrão de referência de anticorpo anti-IL13R alfa foi comparado com duas frações reunidas diferentes enriquecidas para agregados (conjunto 1) e para monômeros (conjunto 2) e com o conjunto nativo. A composição exata da batelada nativa e frações reunidas é descrita na Tabela a seguir. TABELA
[0291] Composição de frações reunidas nativas e enriquecidas de um anticorpo anti-IL13R alfa.
Figure img0013
[0292] O sensograma da amostra de conjunto enriquecido por monômero 2 foi mais próximo do padrão de referência de anticorpo anti-IL13R alfa seguido pelo sensograma da amostra pobre em agregados. Por outro lado, o conjunto enriquecido por agregado 1 foi caracterizado por ligação quase duas vezes mais alta que FcRn na análise de SPR (Figura 11).
EXEMPLO 9 ESTUDO FARMACOCINÉTICO EM CAMUNDONGOS FCRN HUMANOS
[0293] Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as orientações da Associação de Determinação e Certificação de Cuidados com Animais de Laboratório (www.aaalac.org). O estudo foi autorizado pelo Conselho Regional de Oberbayern, Alemanha.
[0294] Machos e fêmeas de camundongos C57BL/6J (fundo); com deficiência de FcRn de camundongo, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano (huFcRn (276) -/tg (30, 31) foram utilizados ao longo de todo o estudo farmacocinético.
[0295] No momento da administração, os animais pesaram de 17 a 25 g. O anticorpo corespondente foi fornecido na forma de injeção de mistura intravenosa isolada por meio da veia da cauda. Devido ao volume de sangue limitado de camundongos, foi necessário que três grupos de quatro animais machos e quatro fêmeas cada cobrissem nove momentos de amostragem, ou seja, três momentos de amostragem por animal. Amostras de sangue foram tomadas no grupo 1 em cinco minutos, 24 horas e 336 horas, no grupo 2 em duas horas, 168 horas e 504 horas e no grupo 3 em oito horas, 48 horas e 672 horas após a administração. Amostras de sangue de cerca de 100 μl foram obtidas por meio de punção retrobulbar e armazenadas à temperatura ambiente por sessenta minutos para permitir a formação de coágulos. Amostras de soro de pelo menos 40 μl foram obtidas por meio de centrifugação a 9300 x g a 4 °C por três minutos e imediatamente congeladas e armazenadas a -20 °C até o teste.
[0296] Concentrações em soro dos anticorpos terapêuticos humanos em soro murino foram determinadas por meio de um teste imunossorvente ligado por enzimas capturado por antígeno (ELISA) específico para a região de ligação de antígenos (Fab) do anticorpo administrado e suas variantes. Todos o reagentes ou amostras foram incubadas à temperatura ambiente sobre um agitador a 400 rpm. Cada etapa de lavagem incluiu três ciclos. Resumidamente, placas de microtítulos revestidas com estreptavidina foram revestidas com anticorpo biotinilado diluído em tampão de teste. Após lavagem com polissorbato salino tamponado com fosfato (Tween 20), amostras de soro em várias diluições foram adicionadas e incubadas por uma hora. Após lavagem, anticorpos terapêuticos humanos ligados foram detectados por meio de incubação subsequente com fragmentos de Fab de anticorpos monoclonais específicos de FCY humanos conjugados a digoxigenina que não apresentam reação cruzada com IgG de camundongo. Após lavagem, um anticorpo antidigoxigenina conjugado a peroxidase de rabanete silvestre (HRP) foi adicionado e incubado por uma hora. Após lavagem, ABTS (sulfonato de 2,2’- azino-di[3-etilbenzo]tiazolina; Roche Diagnostics, Alemanha) foi adicionado na forma de substrato HRP para formar um produto de reação colorido. Absorbancia do produto de reação resultante foi lida a 405 nm com comprimento de onda de referência a 490 nm. Todas as amostras de soro e amostras de controle positivo ou negativo foram analisadas em duas cópias e calibradas contra padrão de referência.
[0297] Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados por meio de análise não compartimental, utilizando o programa de avaliação farmacocinética WinNonlin® (Pharsight, St. Louis MO, Estados Unidos), versão 5.2.1. Resumidamente, a área sob a curva de tempo/concentração AUC(0-672) foi calculada por meio de régua trapezoidal linear (com interpolação linear) do tempo 0 até o infinito. A meia vida terminal aparente (T1/2) foi derivada da equação: T1/2 = ln2 / Àz. Liberação (CL) total do corpo foi calculada como dose/AUC. Diferenças estatisticamente significativas dos parâmetros farmacocinéticos entre o anticorpo do tipo selvagem e suas variantes foram determinadas por meio de análise ANOVA.
[0298] O estudo farmacocinético em camundongos C57BL/6J com deficiência de FcRn de camundongo, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano (huFcRn (276) -/tg) demonstrou que a mutação YTE aumentou a farmacocinética do anticorpo (Figura 12). Em nível de significado estatístico, o mutante YTE apresentou liberação 1,74 vezes mais alta de AUC(0-672), liberação 1,95 vezes mais lenta e meia vida terminal 2,2 vezes mais longa em comparação com anticorpo do tipo selvagem (Tabela). TABELA
[0299] Parâmetros farmacocinéticos para anticorpo do tipo selvagem e seu YTE mutante triplo obtido por meio de análise não comportamental de concentrações de soro medidas por ELISA após uma única injeção de mistura intravenosa de 10 mg/kg a camundongos transgênicos de FcRn humano. Média ± desvio padrão, n = 8 por grupo, análise ANOVA de significado em comparação com anticorpo do tipo selvagem (+++, p < 0,001). AUC(0-672), área sob a curva de tempo e concentração em soro do momento 0 até 672 horas.
Figure img0014

Claims (11)

1. USO DE UM COMPLEXO NÃO COVALENTE IMOBILIZADO de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m), caracterizado por ser como ligante de cromatografia de afinidade em uma cromatografia de afinidade com gradiente de pH linear positivo, para separar anticorpos ou polipeptideos de fusão que compreendem pelo menos uma região Fc, em que o complexo não covalente imobilizado de um receptor Fc neonatal e beta-2-microglobulina é ligado a um material de cromatografia e o complexo não covalente é conjugado à fase sólida por meio de um par de ligação específico em que o gradiente de pH é de um primeiro valor de pH a um segundo valor de pH, de forma que o primeiro valor de pH é de pH 3,5 a pH 6,4 e o segundo valor de pH é de 7,4 a pH 9,5, e em que o complexo não covalente de um receptor Fc neonatal (FcRn) e beta-2-microglobulina (b2m) é mono-biotinilado e a fase sólida é derivatizada com estreptavidina.
2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo receptor Fc neonatal e a beta-2-microglobulina serem o receptor Fc neonatal do tipo selvagem humano e a beta-2-microglobulina do tipo selvagem humana cada, independentemente entre si, com 0 a 10 modificações de resíduos de aminoácidos.
3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo gradiente de pH ser de um primeiro valor de pH a um segundo valor de pH, de forma que o primeiro valor de pH é de pH 5,5 e o segundo valor de pH é de pH 8,8.
4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a determinação da meia vida in vivo de um anticorpo por meio da determinação da razão dos tempos de retenção do anticorpo e um anticorpo de referência.
5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a determinação da oxidação de metionina de um anticorpo.
6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a determinação do nível de oligomerização de um anticorpo.
7. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a seleção de uma biblioteca de anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados de um anticorpo parental ou um polipeptídeo de fusão parental, que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc para esses anticorpos modificados ou polipeptídeos de fusão modificados que possuem afinidade de ligação alterada para FcRn em comparação ao anticorpo parental ou ao polipeptídeo de fusão parental.
8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a identificação de anticorpos ou polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos uma parte de ligação de FcRn de uma região Fc que exibem ligação alterada ao receptor Fc neonatal.
9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a remoção de anticorpos pela metade (halfantibodies) de preparações de IgG.
10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a remoção de agregados de anticorpos e oligômeros de anticorpos de preparações de IgG.
11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a10, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoespecífico ou um fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou um anticorpo biespecífico ou um fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou um anticorpo triespecífico ou um fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão, ou um anticorpo tetraespecífico ou um fragmento de anticorpo de polipeptídeo de fusão.
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