CN109725159B - 人β2-微球蛋白的定量检测试纸卡与临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人β₂‑微球蛋白定量检测卡。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足定量检测卡需求的一组抗体组合(BM12和BM17)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人β₂‑微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。

Description

人β2-微球蛋白的定量检测试纸卡与临床应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人β₂-微球蛋白抗体及其制备方法以及上述抗体在人β₂-微球蛋白定量检测中的应用。

背景技术

β₂-微球蛋白(β₂-microglobulin，β₂-MG)是一种由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种内源性小分子球蛋白，分子量为11.8kDa；由99个氨基酸组成的单链多肽，在免疫应答中起重要作用；是细胞表面人白细胞抗原的β链部分，分子内含有二硫键，不含糖，与免疫球蛋白的结构相似。

β₂-MG广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。血清β₂-MG的合成速度和细胞膜释放的量是非常恒定的，从而使β₂-MG含量保持稳定水平。正常人β₂-MG可以从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管吸收并在肾小管上皮细胞中分解破坏，因此正常尿液中排出量很微量。在肾小球滤过功能受损或滤过负荷增加的情况下，血液中的β₂-MG含量增加；而尿液中排出的β₂-MG含量增加，则提示肾小管损害或滤过负荷增加。对于肾移植病人，β₂-MG检测则可预示机体是否发生排斥反应。尿β₂-MG还有助于鉴别上、下***。综上所述，β₂-MG是一种具有较高临床应用价值的检测指标。

测定β₂-MG的方法有酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、微粒子酶免疫分析法。酶联免疫吸附分析法重复性差，适合大批量检测。放射免疫分析法和放射比浊法由于核素有半衰期，试剂有效期短；此外核素有放射污染，而且核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员亦须经过特殊训练，不易普及，在测定时还需要昂贵的免疫测定仪；免疫透射比浊法特异性高，方法简单、快速，无放射污染，结果稳定性、重复性满足临床要求。但在抗原、抗体比例不同时，如出现前带或后带现象，对测定结果有较大的影响。此外，在高血脂存在的情况下，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使测定值假性升高，因此测定时尽量不用脂血标本。

发明内容

本发明采用胶体金法，该法快速、简便，易操作，自动化程度高，且与ELISA法、免疫比浊法等均具有很好的相关性，临床应用非常广泛，与其他方法检测试剂比较，通用性较强，而这其中首要解决的技术问题是提供一组能有效的、特异性结合人β₂-MG的抗体。更具体地说：

本发明的第一目的在于提供两种抗人β₂-MG抗体。

第一种抗人β₂-MG抗体(BM12)，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的 LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

优选的是本发明中BM12抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

第二种抗人β₂-MG抗体(BM17)，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

优选的是本发明中BM17抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体BM12的氨基酸序列如SEQID NO: 17所示；所述抗体BM17的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，所述编码单链抗体BM12 的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示、编码单链抗体BM17的核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示。

本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。

本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。

本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：

1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；

2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。

本发明的第七个目的在于提供上述抗人β₂-MG抗体在检测人β₂-MG含量中的应用。

本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人β₂-MG的抗体对组合；且检测灵敏度高，特异性好。

本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人β₂-MG抗体检测β₂-MG抗体的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体BM17，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体BM12。

上述胶体金免疫层析定量检测卡所用封闭液为1％-10％BSA、0.01M PB溶液，pH7.4。

所用金标抗体复溶液为1％-10％BSA、5％海藻糖、0.025％tween20、0.01M PB溶液，pH7.4。

所用抗体包被液为0.5％-2.5％海藻糖、0.01M PB溶液，pH7.4。

所用样本稀释液为0.1％Proclin300、0.01M PBS溶液，pH7.4，还可以含有1％BSA。

本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(BM12及BM17)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人β₂-MG的胶体金免疫层析定量检测卡。

附图说明

图1：抗体BM12及BM17特异性检测效果图(Western Blot)，

其中图1a为抗体BM12Western Blot图；图1b为抗体BM17Western Blot。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人β₂-MG。

图2：本发明胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、 4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。

图3：实施例6β2-MG检测卡(12-17)检测范围拟合曲线

图4：实施例6β2-MG检测卡(12-17)线性范围拟合曲线

图5：实施例6β2-MG检测卡(12-17)方法学比对相关性

具体实施方式

定义

“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。

“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将V_L的N端连接至V_H的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

互补决定区(complementarity-determining region,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。

实施例1.抗人β₂-微球蛋白杂交瘤细胞株的制备

1.动物免疫

以重组人β₂-MG(大肠杆菌重组表达，本公司制备)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠 (购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。

2.细胞融合

(1).脾脏细胞的制备

将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco 公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。

(2).饲养细胞的制备

取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入 20％1640HAT培养基中备用；

取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。

(3).细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约10⁸个上述脾细胞与 2×10⁷个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。

将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。

3.抗人β₂-微球蛋白特异性杂交瘤株筛选

(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人β₂-MG(大肠杆菌***表达，本公司制备) 至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。

(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30 分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株B12及B17所表达抗体均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。

实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定

对上述杂交瘤细胞株B12及B17抗体可变区序列进行测定。

a.RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株 B12及B17进行总RNA提取并立即进行反转录；

b.RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesis Kit(购自 Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；

c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收；

d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

测序得到杂交瘤细胞株B12的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQID NO：6所示的LCDR3。

测序得到杂交瘤细胞株B17的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ IDNO： 10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2 和如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

实施例3.单链抗体的重组表达及纯化

根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株B12及B17的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)₃，C端引入六个组氨酸，将其进行全基因合成，并用毕赤酵母表达***进行单链抗体的重组表达。所表达得到的抗体分别命名为抗体BM12及BM17。上述单链抗体的重组表达具体如下：

1.单链抗体基因的表达质粒构建

单链抗体BM12的基因序列如SEQ ID NO:19所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；单链抗体BM17的基因序列如SEQ ID NO:20所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。将单链BM12，BM17全基因合成的片段上游引入pPICZαA载体中XhoI序列后DNA序列，下游引入组氨酸标签序列和XbaI酶切位点，构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pUC57-BM12-scFv、pUC57-BM17-scFv。进行PCR 扩增，

其中上游引物P1为TGT AAA ACG ACG GCC AGT；

下游引物P2为:CAG GAA ACA GCT ATG AC。

常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析，显示产物大小与预期大小一致。分别将PCR获得基因产物回收纯化后，采用XhoI(#R0146S,购自New England Biolabs公司)和XbaI(#R0145V, 购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen) 质粒中，转化到DH5α感受态细胞中，在含有Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的LB 平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到抗体BM12，BM17的表达质粒，记为pPICZα-BM12-scFv、pPICZα-BM17-scFv。

2.单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达

YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelectPichia Expression Kit说明书；毕赤酵母感受态细胞：参照EasySelectPichia Expression Kit说明书；BMGY培养基配制：参照Invitrogen 公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养基配制：参照Invitrogen公司 Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。

分别将pPICZα-BM12-scFv、pPICZα-BM17-scFv质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin的YPDS 固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。

挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝2.0～6.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％ (v/v)。

将上述获得的BM12，BM17重组融合蛋白基因工程菌株接种于BMGY培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到OD₆₀₀＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。

3.单链抗体纯化

采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体BM12及BM17单链抗体，预装柱子选择为HisTrapHP，具体步骤如下：

(1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到单链抗体BM12及BM17融合蛋白发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mMNaCl，20mM NaH₂PO₄，10mM Imidazole，调pH7.5，0.45μm滤膜过滤。

(2)HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化***(AKTA avant150，购自GE healcare公司)对预处理获得的单链抗体BM12，BM17融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子为HisTrap HP(17-5248-02,购自GE healcare公司)。结合缓冲液为300mM NaCl，20mMNaH₂PO₄， 10mM Imidazole，pH7.5，洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，500mMImidazole， pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。纯化后的蛋白纯度均达到95％以上；合并符合要求的收集管，更换缓冲液为PBS溶液并超滤浓缩(1mg/mL)，过滤除菌于-20℃保存备用。

实施例4.抗体的性能评价

1、抗体BM12及BM17的Western blot鉴定

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及重组β₂- 微球蛋白蛋白(大肠杆菌***表达，本公司制备)，恒压下电泳1小时；

b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；

c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；

d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记BM12(BM12-HRP， 1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记BM17(BM17-HRP， 1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；

e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像***(购买于GE公司)拍照(图1)，留取结果。

检测结果可见，抗体BM12及BM17均具有较好的特异性，可特异性检测人β₂-微球蛋白。

2、单链抗体BM12及BM17在胶体金检测平台的评价

将实施例3中纯化的抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测β₂- 微球蛋白(β₂-MG)，检测步骤如下：

1)用抗体包被液将BM12或BM17稀释至1.5mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；

2)用金标抗体重悬液将胶体金标记的BM12或BM17稀释后喷与结合垫上；

3)按附图2所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)

4)用样本稀释液稀释β₂-MG标准品(众红自制)，至浓度为9mg/L，2.25mg/L，将这两个浓度标准品和零浓度标准品(即样本稀释液)分别添加40ul到胶体金检测卡中(BM12包被-BM17 标记或BM17包被-BM12标记)，10min后将检测卡放置在读数仪上进行读数。结果如下表所示：

由上述结果可知，可见BM12作为包被抗体，BM17作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测***可应用于胶体金检测平台，进行β₂-MG的检测。

实施例5抗人β2-微球蛋白的胶体金免疫检测卡的制备

1、溶液配制

1)0.01M PB缓冲液制备：称取Na₂HPO₄·12H₂O 3.22g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.15g，加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用ph计测定其pH7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。

2)0.01M PBS缓冲液制备：称取NaCl 8.00g，KCl 0.20g Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄0.24g，加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用ph计测定其pH7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。

3)封闭液制备：称取牛血清白蛋白5g，加0.01M PB溶液(PH7.4±0.1)50ml，转子搅拌至溶解。

4)抗体包被液制备：称取0.2g海藻糖，加入10ml 0.01M PB溶液(PH7.4±0.1)转子搅拌5-10min。

5)金标抗体复溶液制备：称取1g牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml 0.01M PB溶液 (pH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ul Tween-20，继续用转子搅拌5-10min。

6)样本稀释液制备：称取10g牛血清白蛋白加入1000ml 0.01M PBS溶液(PH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解，加入1.0ml Proclin300，继续用转子搅拌5-10min,0.45um滤膜过滤。

2、人β2-微球蛋白的胶体金免疫检测卡的制备

1)胶体金的标记

抗体BM17的胶体金标记(以1ml胶体金溶液标记为例)：用K₂CO₃调节胶体金pH值(每1ml胶体金中加入5ul 0.2M K₂CO₃)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体BM17(每1ml胶体金中加入30ug抗体BM17)，低速搅拌30分钟；加入封闭液100ul，搅拌20分钟；将胶体金溶液转入离心管中，1500rpm，2-8℃离心15min.；上清移至另一离心管中，12000rpm， 2-8℃离心30min；去上清用200ul金标抗体复溶液复溶沉淀即得胶体金标记的BM17抗体。

2)金标垫及反应膜制备

将BM17金标抗体喷涂在金标垫6上，干燥备用；

将抗体BM12用抗体稀释液稀释至1.5mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的T线5位置；将抗His标签抗体用抗体稀释液稀释至0.1mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的C线4位置，反应膜干燥备用。

3)组装大卡、切条、组装

将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次黏贴在PVC 底板上(如图2所示)，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右。

将大板切割成宽度为2.92mm的小条；将切好的条子放置在底卡的卡槽内，面板加样孔位置对应样本垫；将面板与底板对合，用力按压，使面板与底板吻合；压卡时应使卡竖向排列在压壳机传送带上依次压盖。

4)试剂盒组装

将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箔袋中，热封机封口，贴标签；

将样本稀释液按0.7ml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋，贴标签；

按照成品规格，将一定份数的内包，1个含样本稀释液的自封袋，1份说明书，1个合格标签装入包装盒内，并在包装盒外贴好标签。

3、人β₂-微球蛋白胶体金检测卡使用方法

1)打开外包装，从密封铝箔袋中取出检测卡，置于平坦台面上。

2)吸取10μl血清，加入490μl A管样本稀释液中，充分混合后，从中吸取10ul混合液加入490μl B管样本稀释液中。

3)从B管样本稀释液中吸取40μl经处理后的样本加入到检测卡加样孔中，室温下静置10min。

4)将检测卡放入免疫层析定量分析仪中，按“快速检测”键开始检测，仪器将自动对检测卡进行扫描。

5)从免疫层析定量分析仪的显示屏幕上读取/打印检测结果。

实施例6人β₂-微球蛋白胶体金检测卡检测效果评估

1)精密性：将BM12(包被)-BM17(标记)检测卡按检测卡使用方法检测2.25、9mg/L的β₂-MG 参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示检测结果变异系数分别为13.63％、7.55％。

2)检测范围：将BM12(包被)-BM17(标记)检测卡检测不同浓度的β2-MG重组蛋白1/2.25/4.5/9/18mg/L，拟合曲线及检测范围为1-18mg/L(如附图3)。

3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本，用BM12(包被)-BM17(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为1-18mg/L(如附图4)。

4)准确度：将BM12(包被)-BM17(标记)检测卡按检测卡使用方法检测2.25、9mg/L的β₂-MG 参考品各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显示两个浓度相对偏差分别是 13.38％、0.62％。

5、准确度—方法学比对

选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的重庆中元生物技术有限公司β2-微球蛋白检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到30的顺序编号，用对照产品和待评价的BM12(包被)-BM17(标记)的胶体金检测卡同时进行实验，按照 1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的检测结果相关系数R²＝0.9985，见图5，说明两种方法检测结果有较好的相关性。

实施例7配方筛选

除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面几组检测卡

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 人β2-微球蛋白的定量检测试纸卡与临床应用

<130> 人β2-微球蛋白的定量检测试纸卡与临床应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr Thr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Ser Ser Gly Gly Ser Phe Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ser Arg Glu Gly Gly Pro Tyr Tyr Gly Ser His Tyr Tyr Ala Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Asp Ile Thr Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Tyr Thr Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 124

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Glu Gly Gly Pro Tyr Tyr Gly Ser His Tyr Tyr Ala Leu Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gly Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Ala Val Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Ser Thr Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 122

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 246

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Glu Gly Gly Pro Tyr Tyr Gly Ser His Tyr Tyr Ala Leu Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140

Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Gly Val Thr Ile

145 150 155 160

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Arg Pro Asp Gly Ala Val Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg

180 185 190

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asn Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 18

<211> 243

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys

145 150 155 160

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210> 19

<211> 738

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 19

gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt agctacacca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc attagtagtg gtggtagttt cacctactat 180

ttagacagtg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca gtgccaagac caccctgtac 240

ctgcaaatgg gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attattgttc aagagaagga 300

ggtccctact acggtagtca ttactatgct ttggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctcct caggtggtgg tggatccgga ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgat 420

atccagatga cacagagtac atcctccctg tctgcctctc tgggagacgg agtcaccatc 480

agttgcaggg caagtcaaga cattaccaat tatttaaact ggtatcagca gagaccagat 540

ggagctgtta gactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 600

ttcagtggca gtgggtctgg aacaaattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 660

gatattgcca cttacttttg ccaacaggga aatacgcttc ctccgacgtt cggtgggggc 720

accaagttgg aaatcaaa 738

<210> 20

<211> 729

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 20

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120

cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180

tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcta catactactg tgctcgggtc 300

tactatggtt acgatggggg gttctttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360

tcctcaggtg gtggtggatc cggaggtggt ggttctggtg gtggtggttc tcaaattgtt 420

ctcacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac cataacctgc 480

agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac tggttccagc agaagccagg cacttctccc 540

aaactctgga tttatagcac atccaacctg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600

agtggatctg ggacctctta ctctctcaca atcagccgaa tggaggctga agatgctgcc 660

acttattact gccaccaaag gagtagttac ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg 720

gaaataaaa 729

Claims (8)

1.人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的标记抗体，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有包被抗体；

所述标记抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3；

所述包被抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

2.权利要求1所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，所述标记抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

3.权利要求1所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，所述包被抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.权利要求2所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，所述标记抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。

5.权利要求3所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，所述包被抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。

6.权利要求1-5任一项所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，其特征在于：制备检测卡所用的封闭液是1%-10%BSA、0.01M PB溶液，pH7.4。

7.权利要求1-5任一项所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，其特征在于：制备检测卡所用的金标抗体复溶液是1%-10%BSA、5%海藻糖、0.025%tween20、0.01M PB溶液，pH7.4。

8.权利要求1-5任一项所述的人β₂-微球蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，其特征在于：制备检测卡所用的抗体包被液是0.5%-2.5%海藻糖、0.01M PB溶液，pH7.4。

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