JP2000350579A - ヒト筋芽細胞系統およびその使用 - Google Patents
ヒト筋芽細胞系統およびその使用Info
- Publication number
- JP2000350579A JP2000350579A JP2000127882A JP2000127882A JP2000350579A JP 2000350579 A JP2000350579 A JP 2000350579A JP 2000127882 A JP2000127882 A JP 2000127882A JP 2000127882 A JP2000127882 A JP 2000127882A JP 2000350579 A JP2000350579 A JP 2000350579A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human muscle
- cells
- cell line
- muscle cell
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 永続的な哺乳類細胞系統を提供すること。
【解決手段】 ａ）哺乳類一次細胞の培養物またはその
懸濁液を、少なくとも１種のグルココルチコイドでを用
いて処理し、 ｂ）任意の工程として工程ａ）の前処理培養物の懸濁液
を得ることを含んでなり、 ｃ）工程ａ）またはｂ）の懸濁液の前処理細胞へ、レト
ロウイルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化す
る能力のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導入
し、さらに ｄ）工程ｃ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる方法により、ヒト筋一次細胞から増殖
および作出できる、ヒト筋細胞系統が開示される。さら
に、これら細胞系統由来のヒト筋細胞、ならびにそれら
を含んでなる医薬医薬組成物および診断組成物が提供さ
れる。
懸濁液を、少なくとも１種のグルココルチコイドでを用
いて処理し、 ｂ）任意の工程として工程ａ）の前処理培養物の懸濁液
を得ることを含んでなり、 ｃ）工程ａ）またはｂ）の懸濁液の前処理細胞へ、レト
ロウイルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化す
る能力のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導入
し、さらに ｄ）工程ｃ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる方法により、ヒト筋一次細胞から増殖
および作出できる、ヒト筋細胞系統が開示される。さら
に、これら細胞系統由来のヒト筋細胞、ならびにそれら
を含んでなる医薬医薬組成物および診断組成物が提供さ
れる。
Description
【０００１】本発明は概して、新規な方法によって作出
されたヒト筋細胞系統、さらに詳しくはヒト筋芽細胞系
統、ならびに特に遺伝子治療または筋肉組織を侵す病因
につての理解およびアプローチにおけるそれらの細胞系
統の使用に関する。
されたヒト筋細胞系統、さらに詳しくはヒト筋芽細胞系
統、ならびに特に遺伝子治療または筋肉組織を侵す病因
につての理解およびアプローチにおけるそれらの細胞系
統の使用に関する。
【０００２】細胞系統はin vivoでの細胞または組織の
発達中に関与する事象を研究するためのin vitroモデル
として広く用いられている。例えば、筋肉の発達という
事象は筋細胞系統の分化の際に再現され得る。従って、
永続的な哺乳類細胞系統、特にヒト筋原細胞系統はジス
トロフィーなどの筋肉疾患に対する新薬を同定および試
験するために、また筋形成の研究のためなどに分子的お
よび生化学的細胞事象を詳細に分析する有用な手段を提
供するので相当な価値を有するであろう。
発達中に関与する事象を研究するためのin vitroモデル
として広く用いられている。例えば、筋肉の発達という
事象は筋細胞系統の分化の際に再現され得る。従って、
永続的な哺乳類細胞系統、特にヒト筋原細胞系統はジス
トロフィーなどの筋肉疾患に対する新薬を同定および試
験するために、また筋形成の研究のためなどに分子的お
よび生化学的細胞事象を詳細に分析する有用な手段を提
供するので相当な価値を有するであろう。
【０００３】in vivoにおいて、筋芽細胞は筋形成が運
命づけられている中胚葉の前駆細胞である。決定づけら
れた筋芽細胞は他の筋芽細胞を認識して自発的に融合す
ることができ、これにより分化した筋管が形成する。多
核化した筋管はそれ以上***もせずＤＮＡも合成しない
が、収縮器官の構成成分であって神経筋の伝達に不可欠
な細胞表面成分を特徴的なものとする筋タンパク質を多
量に産生する。
命づけられている中胚葉の前駆細胞である。決定づけら
れた筋芽細胞は他の筋芽細胞を認識して自発的に融合す
ることができ、これにより分化した筋管が形成する。多
核化した筋管はそれ以上***もせずＤＮＡも合成しない
が、収縮器官の構成成分であって神経筋の伝達に不可欠
な細胞表面成分を特徴的なものとする筋タンパク質を多
量に産生する。
【０００４】いくつかの自発的筋原細胞系統が、齧歯類
骨格筋の酵素的解離によって得られた筋一次培養物から
単離されている(Mulle et al., 1988, P.N.A.S., 米国
特許第855728号ないし855732号)。しかしながら、ヒト
筋肉から得られた筋原一次クローンはこのような細胞系
統にはならず、ドナーの加齢に応じて減衰する有限の寿
命を示す。さらに、デュシェーヌ筋ジストロフィー（Ｄ
ＭＤ）患者由来の筋芽細胞の増殖能はin vitroでは特に
限定されたものとなり(Webster et Blau, 1990, Som. C
ell. Mol. Gnet., 16, 557-565)、満足のできるこの疾
病の試験または研究モデルが得られない。
骨格筋の酵素的解離によって得られた筋一次培養物から
単離されている(Mulle et al., 1988, P.N.A.S., 米国
特許第855728号ないし855732号)。しかしながら、ヒト
筋肉から得られた筋原一次クローンはこのような細胞系
統にはならず、ドナーの加齢に応じて減衰する有限の寿
命を示す。さらに、デュシェーヌ筋ジストロフィー（Ｄ
ＭＤ）患者由来の筋芽細胞の増殖能はin vitroでは特に
限定されたものとなり(Webster et Blau, 1990, Som. C
ell. Mol. Gnet., 16, 557-565)、満足のできるこの疾
病の試験または研究モデルが得られない。
【０００５】さらに、安定した細胞系統として作出され
た筋芽細胞が治療目的に使用され得る開発途上には本質
的な興味が存在する。例えば、筋芽細胞は、遺伝的欠陥
または非遺伝的欠陥が関与する種々の疾病の治療のた
め、標的組織または投与部位として筋肉組織を含む予防
接種のプロトコールのための細胞治療ベクターとして働
き得る。筋芽細胞が遺伝子治療の担体として用いられる
ような特定の場合では、筋肉または非筋肉遺伝子の中か
ら選択され、かつ、筋肉または非筋肉性疾患の治療に有
用な、あるいは新規な、もしくは向上した遺伝子の能
力、または新規な予防接種手段に有用なポリペプチドを
コードする１以上の遺伝子がかかる筋芽細胞に導入され
る。
た筋芽細胞が治療目的に使用され得る開発途上には本質
的な興味が存在する。例えば、筋芽細胞は、遺伝的欠陥
または非遺伝的欠陥が関与する種々の疾病の治療のた
め、標的組織または投与部位として筋肉組織を含む予防
接種のプロトコールのための細胞治療ベクターとして働
き得る。筋芽細胞が遺伝子治療の担体として用いられる
ような特定の場合では、筋肉または非筋肉遺伝子の中か
ら選択され、かつ、筋肉または非筋肉性疾患の治療に有
用な、あるいは新規な、もしくは向上した遺伝子の能
力、または新規な予防接種手段に有用なポリペプチドを
コードする１以上の遺伝子がかかる筋芽細胞に導入され
る。
【０００６】さらにこれまでに、in vivoで筋芽細胞が
離れた部位へ、好ましくは損傷部位へ移動することがで
き、かつ、融合して既存の繊維になり得ることがわかっ
ている。細胞の遺伝子治療の展望において、この筋芽細
胞の基底板を通過する移動は、遺伝子の担体として働く
筋芽細胞を少量投与するだけで比較的広い領域を治療す
ることを可能にする。筋芽細胞は、損傷部位または隣接
する組織へ直接注射することにより投与してもよいし、
あるいは血流、特に損傷部位を流れる血管中でかかる部
位の上流へ導入してもよい。
離れた部位へ、好ましくは損傷部位へ移動することがで
き、かつ、融合して既存の繊維になり得ることがわかっ
ている。細胞の遺伝子治療の展望において、この筋芽細
胞の基底板を通過する移動は、遺伝子の担体として働く
筋芽細胞を少量投与するだけで比較的広い領域を治療す
ることを可能にする。筋芽細胞は、損傷部位または隣接
する組織へ直接注射することにより投与してもよいし、
あるいは血流、特に損傷部位を流れる血管中でかかる部
位の上流へ導入してもよい。
【０００７】さらに広い治療用途においては、筋芽細胞
は非改変細胞、または注目される化合物を発現するよ
う、遺伝的欠損を修正する、膜表面タンパク質を供給す
る、あるいは投与部位から離れた部位に位置してもよい
部位において免疫ペプチドのような生成物を分泌され得
る膜表面分子、ＭＨＣ抗原などの発現もしくは利用能を
増強もしくは低減するよう改変されたものとして使用し
てもよい。
は非改変細胞、または注目される化合物を発現するよ
う、遺伝的欠損を修正する、膜表面タンパク質を供給す
る、あるいは投与部位から離れた部位に位置してもよい
部位において免疫ペプチドのような生成物を分泌され得
る膜表面分子、ＭＨＣ抗原などの発現もしくは利用能を
増強もしくは低減するよう改変されたものとして使用し
てもよい。
【０００８】しかしながらやはり、前記の適用には第一
に、増殖、分化およびそれらが誘導された組織における
細胞に特徴的な特性を発現することができる培養細胞系
統を確立する必要がある。ある細胞系統をい確立する能
力は総てではないが多くの細胞種について広く記載され
ている。多くのものが継代培養を続けるとれらの分化し
た表現型を失うものの、元の特徴を維持しているものも
ある。最後に、いくつかの細胞系統が存在するラットお
よびマウスとは異なり、応用に利用できる確立されたヒ
ト筋細胞系統はほとんど、あるいはまったくない。
に、増殖、分化およびそれらが誘導された組織における
細胞に特徴的な特性を発現することができる培養細胞系
統を確立する必要がある。ある細胞系統をい確立する能
力は総てではないが多くの細胞種について広く記載され
ている。多くのものが継代培養を続けるとれらの分化し
た表現型を失うものの、元の特徴を維持しているものも
ある。最後に、いくつかの細胞系統が存在するラットお
よびマウスとは異なり、応用に利用できる確立されたヒ
ト筋細胞系統はほとんど、あるいはまったくない。
【０００９】Fogel et Defendi, 1967, Proc. Natl. Ac
ad. Sci., 58, 967-973では、ヒト筋芽細胞は野生型Ｓ
Ｖ４０の感染に感受性があり、感染に続いて永久細胞系
統が作出できる。しかしながら、これらの細胞系統は急
速に分化能を失うということが実証されている。いくつ
かの不死化筋原細胞系統が齧歯類骨格筋の一次筋培養か
ら単離されている(Yaffe, D. "Retention of different
iation potentialities during prolonged cultivation
of myogenic cells" Proc Nato Acad Sci USA(1968) 6
1: 477-483およびYaffe, D. and Saxel, O. "Serial pa
ssaging and differentiation of myogenic cells isol
ated from dystrophic mouse muscle"Nature (1977) 27
0: 725-727)。しかしながら、ヒト一次培養物から得ら
れたクローンは自発的細胞系統とはならず、有限の寿命
を有する。
ad. Sci., 58, 967-973では、ヒト筋芽細胞は野生型Ｓ
Ｖ４０の感染に感受性があり、感染に続いて永久細胞系
統が作出できる。しかしながら、これらの細胞系統は急
速に分化能を失うということが実証されている。いくつ
かの不死化筋原細胞系統が齧歯類骨格筋の一次筋培養か
ら単離されている(Yaffe, D. "Retention of different
iation potentialities during prolonged cultivation
of myogenic cells" Proc Nato Acad Sci USA(1968) 6
1: 477-483およびYaffe, D. and Saxel, O. "Serial pa
ssaging and differentiation of myogenic cells isol
ated from dystrophic mouse muscle"Nature (1977) 27
0: 725-727)。しかしながら、ヒト一次培養物から得ら
れたクローンは自発的細胞系統とはならず、有限の寿命
を有する。
【００１０】より最近では、Simon et al, 1996, Exp.
Cell Res., 224, 264-271は、外植培養物にＳＶ４０ラ
ージＴ癌遺伝子の変異した温度感受型を含む組換えレト
ロウイルスを感染させることにより、初めてＤＭＤ筋肉
に由来する長期筋原細胞培養物を得た。しかしながらや
はり、レトロウイルスの使用は、ウイルスが組み込まれ
ていて、その組み込みが生命維持に必要な遺伝子の発現
を妨げるか、または処置された患者におけるＣＴＲ応答
をもたらすウイルスタンパク質が発現することになるの
で、安全性の点で満足できるものではない。
Cell Res., 224, 264-271は、外植培養物にＳＶ４０ラ
ージＴ癌遺伝子の変異した温度感受型を含む組換えレト
ロウイルスを感染させることにより、初めてＤＭＤ筋肉
に由来する長期筋原細胞培養物を得た。しかしながらや
はり、レトロウイルスの使用は、ウイルスが組み込まれ
ていて、その組み込みが生命維持に必要な遺伝子の発現
を妨げるか、または処置された患者におけるＣＴＲ応答
をもたらすウイルスタンパク質が発現することになるの
で、安全性の点で満足できるものではない。
【００１１】従って、先行技術は特にデュシェーヌ筋ジ
ストロフィー（ＤＭＤ）患者由来の、ならびに正常なジ
ストロフィン陽性の個人由来の筋肉生検に起源する、増
殖および分化可能な満足できるヒト筋細胞を得るには不
十分である。本発明は当技術分野におけるこの長年の必
要および要求を満たすものである。
ストロフィー（ＤＭＤ）患者由来の、ならびに正常なジ
ストロフィン陽性の個人由来の筋肉生検に起源する、増
殖および分化可能な満足できるヒト筋細胞を得るには不
十分である。本発明は当技術分野におけるこの長年の必
要および要求を満たすものである。
【００１２】本発明は長期哺乳類細胞系統を確立する改
良法に従って得られたヒト筋細胞系統を提供する。この
ようなヒト筋細胞系統は高い増殖能を示し、分化可能で
あり、かつ、細胞および筋肉の代謝、新薬のスクリーニ
ングまたは細胞毒性もしくは細胞障害に関して評価す
る、および疾病、特にＤＭＤのような遺伝性疾患の分子
病因を修正することを目的とした研究のための選択され
る細胞モデルを提供する方法に関するin vitro研究に価
値があることがわかるであろう。
良法に従って得られたヒト筋細胞系統を提供する。この
ようなヒト筋細胞系統は高い増殖能を示し、分化可能で
あり、かつ、細胞および筋肉の代謝、新薬のスクリーニ
ングまたは細胞毒性もしくは細胞障害に関して評価す
る、および疾病、特にＤＭＤのような遺伝性疾患の分子
病因を修正することを目的とした研究のための選択され
る細胞モデルを提供する方法に関するin vitro研究に価
値があることがわかるであろう。
【００１３】従って、本発明は、第１に、 ａ）哺乳類一次細胞の培養物またはその懸濁液を、少な
くとも１種のグルココルチコイドを用いて前処理し、 ｂ）任意の工程として工程ａ）の前処理培養物の懸濁液
を得ることを含んでなり、 ｃ）工程ａ）またはｂ）の懸濁液の前処理した細胞へ、
レトロウイルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死
化する能力のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導
入し、さらに ｄ）工程ｃ）の導入細胞を培養する工程を含んでなる方
法によってヒト筋一次細胞から作出されたヒト筋細胞系
統に関する。
くとも１種のグルココルチコイドを用いて前処理し、 ｂ）任意の工程として工程ａ）の前処理培養物の懸濁液
を得ることを含んでなり、 ｃ）工程ａ）またはｂ）の懸濁液の前処理した細胞へ、
レトロウイルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死
化する能力のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導
入し、さらに ｄ）工程ｃ）の導入細胞を培養する工程を含んでなる方
法によってヒト筋一次細胞から作出されたヒト筋細胞系
統に関する。
【００１４】本発明によれば、フレオマイシン選択遺伝
子をさらに含むＳＶ４０ラージ抗原（ＴＡｇ）プラスミ
ドによるリン酸カルシウムトランスフェクションを用い
て、骨格筋生検由来の不死化ヒト筋原細胞系統が確立さ
れた。トランスフェクションおよび選択の後にクローン
が得られた。それらはＴＡｇと筋芽細胞天然マーカーデ
スミンを発現する。適当な培養条件において、これらの
細胞系統の細胞は整列・融合して多核化した筋管を形成
し、このことはそれらがなお増殖、分化および筋細胞に
特徴的な特性を発現することを示すものである。このよ
うに、本発明歯初めて、健常者およびデュシェーヌ筋ジ
ストロフィー（ＤＭＤ）患者から単離された一次細胞の
プラスミドによる形質転換に基づく筋原細胞を作出し
た。このような細胞系統は例えば、デュシェーヌ筋芽細
胞のジストロフィン様活性を回復することができる薬剤
（すなわち、ウトロピン）の薬理学的スクリーニング
に、あいは被包された細胞の移植のような適用に有用で
ある。本発明のこの知見の関わりは以下に詳細に説明さ
れる。
子をさらに含むＳＶ４０ラージ抗原（ＴＡｇ）プラスミ
ドによるリン酸カルシウムトランスフェクションを用い
て、骨格筋生検由来の不死化ヒト筋原細胞系統が確立さ
れた。トランスフェクションおよび選択の後にクローン
が得られた。それらはＴＡｇと筋芽細胞天然マーカーデ
スミンを発現する。適当な培養条件において、これらの
細胞系統の細胞は整列・融合して多核化した筋管を形成
し、このことはそれらがなお増殖、分化および筋細胞に
特徴的な特性を発現することを示すものである。このよ
うに、本発明歯初めて、健常者およびデュシェーヌ筋ジ
ストロフィー（ＤＭＤ）患者から単離された一次細胞の
プラスミドによる形質転換に基づく筋原細胞を作出し
た。このような細胞系統は例えば、デュシェーヌ筋芽細
胞のジストロフィン様活性を回復することができる薬剤
（すなわち、ウトロピン）の薬理学的スクリーニング
に、あいは被包された細胞の移植のような適用に有用で
ある。本発明のこの知見の関わりは以下に詳細に説明さ
れる。
【００１５】本発明の第１の態様によれば、前記方法
は： ａ）哺乳類一次細胞の培養物を得、 ｂ）工程ａ）の培養物を、少なくとも１種のグルココル
チコイドを用いて前処理し、 ｃ）工程ｂ）の前処理培養物の懸濁液を得、 ｄ）工程ｃ）の懸濁液の前処理した細胞へ、レトロウイ
ルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化する能力
のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導入し、さら
に ｅ）工程ｄ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる。
は： ａ）哺乳類一次細胞の培養物を得、 ｂ）工程ａ）の培養物を、少なくとも１種のグルココル
チコイドを用いて前処理し、 ｃ）工程ｂ）の前処理培養物の懸濁液を得、 ｄ）工程ｃ）の懸濁液の前処理した細胞へ、レトロウイ
ルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化する能力
のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導入し、さら
に ｅ）工程ｄ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる。
【００１６】第２の態様によれば、前記方法は： ａ）ヒト筋肉一次細胞の培養物を得、 ｂ）工程ａ）の培養ヒト筋一次細胞の懸濁液を得、 ｃ）工程ｂ）の懸濁液を、少なくとも１種のグルココル
チコイドを用いて前処理し、 ｄ）工程ｃ）の懸濁液の前処理細胞へ、レトロウイルス
起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化する能力のあ
る、少なくとも１個の核酸ベクターを導入し、さらに ｅ）工程ｄ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる。
チコイドを用いて前処理し、 ｄ）工程ｃ）の懸濁液の前処理細胞へ、レトロウイルス
起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化する能力のあ
る、少なくとも１個の核酸ベクターを導入し、さらに ｅ）工程ｄ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる。
【００１７】本発明に従って作出された細胞は好ましく
は、それらの増殖能、分化能および筋細胞に特徴的な特
性を発現する能力に関して特異な特性を有する。これら
の特性は細胞系統作出分野で十分に実証されている。本
発明の特異的細胞は少なくとも４０日間増殖可能であ
り、分化可能であり、しかも筋細胞に特徴的な特性を発
現することができる。
は、それらの増殖能、分化能および筋細胞に特徴的な特
性を発現する能力に関して特異な特性を有する。これら
の特性は細胞系統作出分野で十分に実証されている。本
発明の特異的細胞は少なくとも４０日間増殖可能であ
り、分化可能であり、しかも筋細胞に特徴的な特性を発
現することができる。
【００１８】本発明によれば、好ましくは導入工程は細
胞懸濁液で行われるべきである。従って、工程ａ）のヒ
ト筋一次細胞が懸濁液の形態でない特別な場合では、こ
の方法は培養哺乳類一次細胞またはその前処理培養物の
懸濁液を得ることからなる特定の工程を含んでなるべき
である。
胞懸濁液で行われるべきである。従って、工程ａ）のヒ
ト筋一次細胞が懸濁液の形態でない特別な場合では、こ
の方法は培養哺乳類一次細胞またはその前処理培養物の
懸濁液を得ることからなる特定の工程を含んでなるべき
である。
【００１９】好ましい態様によれば、細胞懸濁液は導入
工程前に即時調製する。
工程前に即時調製する。
【００２０】「細胞の懸濁液」とは、細胞が固相支持体
に接着していないということを意味する。
に接着していないということを意味する。
【００２１】細胞の懸濁液を調製する方法は文献に開示
されており、機械的な手段（掻き取り、粉砕など）によ
る、またはＥＤＴＡとともに、細胞組織を解離すること
ができる少なくとも１種の化合物、例えば、パンクレア
チン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシン、ヒアル
ロニダーゼ、およびそれらの同等物からなる群から選択
される酵素を用いた化学的処理による、または温度変化
（例えば４℃処理）によるヒト筋一次細胞培養物もしく
はヒト組織の処理を含んでなってもよい。このような化
合物または同等物としては、総ての天然型、またはなお
細胞組織を解離して容易に懸濁させ得る単離細胞を作出
することができる、改変型の化合物もしくは酵素または
その一部が挙げられる。これらの機械的または化学的処
理は広く使用されており、文献（Tissue dissociation
Guide, Worthington BiochemicalCorporation)に報告さ
れており、当業者ならば容易に入手でき、また適用でき
る。
されており、機械的な手段（掻き取り、粉砕など）によ
る、またはＥＤＴＡとともに、細胞組織を解離すること
ができる少なくとも１種の化合物、例えば、パンクレア
チン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシン、ヒアル
ロニダーゼ、およびそれらの同等物からなる群から選択
される酵素を用いた化学的処理による、または温度変化
（例えば４℃処理）によるヒト筋一次細胞培養物もしく
はヒト組織の処理を含んでなってもよい。このような化
合物または同等物としては、総ての天然型、またはなお
細胞組織を解離して容易に懸濁させ得る単離細胞を作出
することができる、改変型の化合物もしくは酵素または
その一部が挙げられる。これらの機械的または化学的処
理は広く使用されており、文献（Tissue dissociation
Guide, Worthington BiochemicalCorporation)に報告さ
れており、当業者ならば容易に入手でき、また適用でき
る。
【００２２】例えば、筋細胞をトリプシン、例えばトリ
プシン処理フラスコ中で一定の攪拌をしながら、０．０
５％トリプシン・ＥＤＴＡ３７℃で一連の処理を行うこ
とにより分離してもよい。各トリプシン処理後に上清中
に回収された細胞をプールし、氷上で４℃まで冷却す
る。ウシ血清を加えて最終濃度１０容量％とし、それ以
上のプロテアーゼ活性をとめる。次いで、分離された細
胞を遠心分離し、細胞ペレットをコンディショニング培
地に再懸濁し、培養し、液体窒素中で凍結させるか、ま
たは本発明の方法に付す。特定の態様によれば、注目さ
れるヒト筋一次細胞は、モノクローナル抗体用いる細胞
精製または接着特性に基づく前培養法などの当業界で広
く用いられる濃縮方法を用いて純度７０％以上に、好ま
しくは９０％以上に、より好ましくは９９％以上に濃縮
され得る。
プシン処理フラスコ中で一定の攪拌をしながら、０．０
５％トリプシン・ＥＤＴＡ３７℃で一連の処理を行うこ
とにより分離してもよい。各トリプシン処理後に上清中
に回収された細胞をプールし、氷上で４℃まで冷却す
る。ウシ血清を加えて最終濃度１０容量％とし、それ以
上のプロテアーゼ活性をとめる。次いで、分離された細
胞を遠心分離し、細胞ペレットをコンディショニング培
地に再懸濁し、培養し、液体窒素中で凍結させるか、ま
たは本発明の方法に付す。特定の態様によれば、注目さ
れるヒト筋一次細胞は、モノクローナル抗体用いる細胞
精製または接着特性に基づく前培養法などの当業界で広
く用いられる濃縮方法を用いて純度７０％以上に、好ま
しくは９０％以上に、より好ましくは９９％以上に濃縮
され得る。
【００２３】本方法の工程ａ）によれば、ヒト筋一次細
胞の培養物が得られる。細胞の培養法は本発明の技術分
野において広く用いられており、当業者ならば用いられ
る最初のヒト筋一次細胞サンプルに適合する培地および
増殖条件を容易に選択できる。
胞の培養物が得られる。細胞の培養法は本発明の技術分
野において広く用いられており、当業者ならば用いられ
る最初のヒト筋一次細胞サンプルに適合する培地および
増殖条件を容易に選択できる。
【００２４】本発明は最終的に懸濁液の形態にある培養
ヒト筋一次細胞を、少なくとも１種のグルココルチコイ
ドを用いて前処理することを含んでなる特定の工程に基
づくものである。一般に本発明の方法では、いずれのグ
ルココルチコイドでも使用してよい。有用なグルココル
チコイドの代表例としてはデクサメタゾン、ベタメタゾ
ン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プ
レドニゾロン、トリアムシノロン、およびフルニゾリド
が挙げられる。グルココルチコイドは脂溶性形態、エタ
ノール溶性形態、または水溶性形態のいずれであっても
よく、またさらに、合成もしくは非合成グルココルチコ
イドのいずれであってもよい。
ヒト筋一次細胞を、少なくとも１種のグルココルチコイ
ドを用いて前処理することを含んでなる特定の工程に基
づくものである。一般に本発明の方法では、いずれのグ
ルココルチコイドでも使用してよい。有用なグルココル
チコイドの代表例としてはデクサメタゾン、ベタメタゾ
ン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プ
レドニゾロン、トリアムシノロン、およびフルニゾリド
が挙げられる。グルココルチコイドは脂溶性形態、エタ
ノール溶性形態、または水溶性形態のいずれであっても
よく、またさらに、合成もしくは非合成グルココルチコ
イドのいずれであってもよい。
【００２５】さらに詳しくは、前処理工程は培養された
ヒト筋一次細胞またはその懸濁液を少なくとも１種のグ
ルココルチコイドと接触させることからなる。このヒト
筋一次細胞の前処理は、導入工程前に少なくとも３時
間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少
なくとも４８時間適用されてよい。
ヒト筋一次細胞またはその懸濁液を少なくとも１種のグ
ルココルチコイドと接触させることからなる。このヒト
筋一次細胞の前処理は、導入工程前に少なくとも３時
間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少
なくとも４８時間適用されてよい。
【００２６】細胞前処理工程におけるグルココルチコイ
ド濃度は１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲である。グル
ココルチコイドがデクサメタゾンまたはヒドロコルチゾ
ンである特定の場合には、グルココルチコイド濃度はそ
れぞれ、好ましくはほぼ１０ −６Ｍまたは１０−５Ｍの
範囲である。
ド濃度は１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲である。グル
ココルチコイドがデクサメタゾンまたはヒドロコルチゾ
ンである特定の場合には、グルココルチコイド濃度はそ
れぞれ、好ましくはほぼ１０ −６Ｍまたは１０−５Ｍの
範囲である。
【００２７】本発明の方法は少なくとも導入工程前に細
胞のグルココルチコイド前処理を含んでなるべきである
が、特定の態様によれば、細胞懸濁液を得るまたは核酸
ベクターを導入する工程でグルココルチコイドを使用す
ることを意図することもできる。
胞のグルココルチコイド前処理を含んでなるべきである
が、特定の態様によれば、細胞懸濁液を得るまたは核酸
ベクターを導入する工程でグルココルチコイドを使用す
ることを意図することもできる。
【００２８】本発明のヒト筋細胞系統を作出する、本方
法のもう１つの必須工程は、前処理した細胞へ前処理し
た細胞を不死化する能力のある核酸ベクターを導入する
ことからなる。
法のもう１つの必須工程は、前処理した細胞へ前処理し
た細胞を不死化する能力のある核酸ベクターを導入する
ことからなる。
【００２９】「細胞を不死化する能力のある核酸配列」
とは、in vitroで３０倍加した後に老化が起きる正常な
状態に比べ、細胞を不死化する能力のある核酸配列の発
現により、細胞が少なくとも１００倍加する間増殖で
き、不死であると考えられるものを意味する。形質転換
させる発癌遺伝子としては、例えば単層のＮＩＨ３Ｔ３
細胞において形質転換細胞の遺伝子座を作り出すものが
ある。
とは、in vitroで３０倍加した後に老化が起きる正常な
状態に比べ、細胞を不死化する能力のある核酸配列の発
現により、細胞が少なくとも１００倍加する間増殖で
き、不死であると考えられるものを意味する。形質転換
させる発癌遺伝子としては、例えば単層のＮＩＨ３Ｔ３
細胞において形質転換細胞の遺伝子座を作り出すものが
ある。
【００３０】文献には細胞を不死化する能力があるかか
る核酸配列の多数の例が提供されている(Katakura et a
l., 1998, Methods Cell Biol., 57, 69-91)。好ましい
具体例によれば、この核酸ベクターは、ｍｙｃ、ＳＶ４
０ Ｔ抗原、ＳＶ４０ ｔ抗原、パピローマウイルスＥ
６およびＥ７、ポリオーマラージＴ遺伝子、ＥＢＶ、ｒ
ａｓ、アデノウイルスＥ１、ｐ５３のような発癌性ポリ
ペプチド、またはそのいずれか１つの発癌性部分をコー
ドする少なくとも１個の核酸配列を含んでなる。
る核酸配列の多数の例が提供されている(Katakura et a
l., 1998, Methods Cell Biol., 57, 69-91)。好ましい
具体例によれば、この核酸ベクターは、ｍｙｃ、ＳＶ４
０ Ｔ抗原、ＳＶ４０ ｔ抗原、パピローマウイルスＥ
６およびＥ７、ポリオーマラージＴ遺伝子、ＥＢＶ、ｒ
ａｓ、アデノウイルスＥ１、ｐ５３のような発癌性ポリ
ペプチド、またはそのいずれか１つの発癌性部分をコー
ドする少なくとも１個の核酸配列を含んでなる。
【００３１】不死化核酸配列の、標的細胞への導入およ
び発現を可能にするためには、これをその細胞中での核
酸配列の発現に必要な遺伝子要素を含んでなる核酸ベク
ターに組み込む。
び発現を可能にするためには、これをその細胞中での核
酸配列の発現に必要な遺伝子要素を含んでなる核酸ベク
ターに組み込む。
【００３２】本発明によれば、「核酸ベクター」とはＤ
ＮＡおよび／またはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、直鎖
または環状、天然のまたは合成、改変されているものま
たは改変されていないもの（改変例としては、米国特許
第５，５２５，７１１号；同第４，７１１，９５５号；
同第５，７９２，６０８またはＥＰ−Ａ−３０２，１７
５を参照）のいずれであってもよい、大きさ制限のない
核酸の断片または部分と定義される核酸構築物を意味す
る。特に、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチ
センス、リボザイム、またはかかるＲＮＡをコードする
ＤＮＡであってもよい。「核酸ベクター」は直鎖状核酸
構築物の形態、好ましくはプラスミドの形態であってよ
い。本発明によれば、「核酸ベクター」は好ましくは裸
の核酸構築物として（Wolff et al., Science 247 (199
0), 1465-1468)、または細胞への核酸構築物の取り込み
に関与し得る、ポリペプチド、好ましくはウイルスのポ
リペプチドまたは陽イオン脂質または陽イオンポリマー
などの少なくとも１種の化合物を伴って処方される核酸
構築物（概論としては、Ledley,Human Gene Therapy 6
(1995), 1129-1144を参照）として理解されるべきであ
る。本発明によれば「核酸ベクター」は、本発明の方法
に従って前処理された細胞を不死化する能力のある、少
なくとも１個の核酸配列を含むべきである。この特定の
配列は細胞の不死化に関与する少なくとも１個のポリペ
プチドをコードするので、「核酸ベクター」は核酸配列
の発現に必要なエレメントをさらに含むべきである。種
々の脊椎動物系において使用するのに好適な転写プロモ
ーターは十分に知られている。例えば、好適なプロモー
ターとしてはＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまた
は７．５ｋ、ワクシニアプロモーター、誘導性プロモー
ター、メタロチオネインプロモーターなどのウイルスの
プロモーターが挙げられる。好ましい具体例によれば、
核酸配列の発現に必要なエレメントはグルココルチコイ
ドによって活性化される(Geley et al., 1996, Review
of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, 128,
1-97)。「核酸ベクター」はイントロン配列、標的配
列、輸送配列、複製もしくは組み込みに関与する配列、
または例えば抗生物質耐性（アンピシリン、フレオマイ
シン、クロラムフェニコールなど）をコードする選択配
列をさらに含んでもよい。かかる配列の例は文献に報告
されており、当業者ならば容易に入手できる。また、
「核酸ベクター」は安定化させるために、スペルミンな
どの特定の成分で改変されてもよい。
ＮＡおよび／またはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、直鎖
または環状、天然のまたは合成、改変されているものま
たは改変されていないもの（改変例としては、米国特許
第５，５２５，７１１号；同第４，７１１，９５５号；
同第５，７９２，６０８またはＥＰ−Ａ−３０２，１７
５を参照）のいずれであってもよい、大きさ制限のない
核酸の断片または部分と定義される核酸構築物を意味す
る。特に、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチ
センス、リボザイム、またはかかるＲＮＡをコードする
ＤＮＡであってもよい。「核酸ベクター」は直鎖状核酸
構築物の形態、好ましくはプラスミドの形態であってよ
い。本発明によれば、「核酸ベクター」は好ましくは裸
の核酸構築物として（Wolff et al., Science 247 (199
0), 1465-1468)、または細胞への核酸構築物の取り込み
に関与し得る、ポリペプチド、好ましくはウイルスのポ
リペプチドまたは陽イオン脂質または陽イオンポリマー
などの少なくとも１種の化合物を伴って処方される核酸
構築物（概論としては、Ledley,Human Gene Therapy 6
(1995), 1129-1144を参照）として理解されるべきであ
る。本発明によれば「核酸ベクター」は、本発明の方法
に従って前処理された細胞を不死化する能力のある、少
なくとも１個の核酸配列を含むべきである。この特定の
配列は細胞の不死化に関与する少なくとも１個のポリペ
プチドをコードするので、「核酸ベクター」は核酸配列
の発現に必要なエレメントをさらに含むべきである。種
々の脊椎動物系において使用するのに好適な転写プロモ
ーターは十分に知られている。例えば、好適なプロモー
ターとしてはＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまた
は７．５ｋ、ワクシニアプロモーター、誘導性プロモー
ター、メタロチオネインプロモーターなどのウイルスの
プロモーターが挙げられる。好ましい具体例によれば、
核酸配列の発現に必要なエレメントはグルココルチコイ
ドによって活性化される(Geley et al., 1996, Review
of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, 128,
1-97)。「核酸ベクター」はイントロン配列、標的配
列、輸送配列、複製もしくは組み込みに関与する配列、
または例えば抗生物質耐性（アンピシリン、フレオマイ
シン、クロラムフェニコールなど）をコードする選択配
列をさらに含んでもよい。かかる配列の例は文献に報告
されており、当業者ならば容易に入手できる。また、
「核酸ベクター」は安定化させるために、スペルミンな
どの特定の成分で改変されてもよい。
【００３３】特定の態様では、核酸ベクターは治療上ま
たは予防上のポリペプチドの総てまたは一部をコードす
る少なくとも１種の第２の核酸配列をさらに含んでな
る。かかるポリペプチドの例としては、酵素、ホルモ
ン、サイトカイン、膜受容体、標的ポリペプチド、構造
ポリペプチド、輸送ポリペプチド、腫瘍、ウイルスまた
は感染性抗原、粘着性物質、アルブミン、リガンド、転
写因子、輸送因子、複製因子、安定化因子、抗体、ＨＰ
Ｖ由来のＥ６またはＥ７、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、イン
ターフェロン、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−
４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ
（顆粒球マクロファージコロニー刺激性因子）、１型単
純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）由来のｔｋ遺伝子ま
たはＶＥＧＦが挙げられる。好ましい具体例によれば、
核酸配列はジストロフィンの総てまたは一部をコードす
る。さらにかかるＤＮＡは、免疫を授与するポリペプチ
ドであり、細胞内ウイルスをはじめとする感染性の病原
体に対して、およびまた腫瘍細胞に対して体液性または
細胞性応答あるいは双方を引き起こす内生的免疫原とし
て機能するポリペプチドの総てまたは一部をコードして
もよい。「免疫を授与するポリペプチド」とはポリペプ
チドが発現されると、それが処置された患者における免
疫応答に関与し得るということを意味する。また、ポリ
ヌクレオチドは抗体をコードすることもできる。これに
関しては、抗体はいずれのクラスの全免疫グロブリン、
キメラ抗体、および２個のまたは多数の抗原またはエピ
トープ特異性を有する雑種抗体および雑種断片をはじめ
とするＦ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの断片な
らびに抗遺伝子型（米国特許第４，６９９，８８０号）
を包含する。
たは予防上のポリペプチドの総てまたは一部をコードす
る少なくとも１種の第２の核酸配列をさらに含んでな
る。かかるポリペプチドの例としては、酵素、ホルモ
ン、サイトカイン、膜受容体、標的ポリペプチド、構造
ポリペプチド、輸送ポリペプチド、腫瘍、ウイルスまた
は感染性抗原、粘着性物質、アルブミン、リガンド、転
写因子、輸送因子、複製因子、安定化因子、抗体、ＨＰ
Ｖ由来のＥ６またはＥ７、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、イン
ターフェロン、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−
４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ
（顆粒球マクロファージコロニー刺激性因子）、１型単
純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）由来のｔｋ遺伝子ま
たはＶＥＧＦが挙げられる。好ましい具体例によれば、
核酸配列はジストロフィンの総てまたは一部をコードす
る。さらにかかるＤＮＡは、免疫を授与するポリペプチ
ドであり、細胞内ウイルスをはじめとする感染性の病原
体に対して、およびまた腫瘍細胞に対して体液性または
細胞性応答あるいは双方を引き起こす内生的免疫原とし
て機能するポリペプチドの総てまたは一部をコードして
もよい。「免疫を授与するポリペプチド」とはポリペプ
チドが発現されると、それが処置された患者における免
疫応答に関与し得るということを意味する。また、ポリ
ヌクレオチドは抗体をコードすることもできる。これに
関しては、抗体はいずれのクラスの全免疫グロブリン、
キメラ抗体、および２個のまたは多数の抗原またはエピ
トープ特異性を有する雑種抗体および雑種断片をはじめ
とするＦ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの断片な
らびに抗遺伝子型（米国特許第４，６９９，８８０号）
を包含する。
【００３４】導入工程によれば、この核酸配列、または
より広くはその配列を含んでなる核酸ベクターは、アデ
ノウイルス感染、リポプレックス（陽イオン脂質／核酸
複合体）もしくはポリプレックス（陽イオンポリマー／
核酸複合体）などのような核酸被覆粒子によるトランス
フェクション、プラスミドのリン酸カルシウムトランス
フェクション、裸の核酸のトランスフェクション、エレ
クトロポレーション法からなる群から選択される方法、
またはそのいずれかの組合せを含む多様な方法のいずれ
かにより、懸濁液中の前処理細胞に導入される。しかし
ながら、外来の核酸配列を導入する特定の方法は本発明
にとっては重要ではない。
より広くはその配列を含んでなる核酸ベクターは、アデ
ノウイルス感染、リポプレックス（陽イオン脂質／核酸
複合体）もしくはポリプレックス（陽イオンポリマー／
核酸複合体）などのような核酸被覆粒子によるトランス
フェクション、プラスミドのリン酸カルシウムトランス
フェクション、裸の核酸のトランスフェクション、エレ
クトロポレーション法からなる群から選択される方法、
またはそのいずれかの組合せを含む多様な方法のいずれ
かにより、懸濁液中の前処理細胞に導入される。しかし
ながら、外来の核酸配列を導入する特定の方法は本発明
にとっては重要ではない。
【００３５】特定の態様では、本方法の導入工程は少な
くとも１種のグルココルチコイドの存在下で行われる。
この導入工程で使用されるグルココルチコイドは細胞の
前処理工程で使用されるものと同一であっても、異なっ
ていてもよい。
くとも１種のグルココルチコイドの存在下で行われる。
この導入工程で使用されるグルココルチコイドは細胞の
前処理工程で使用されるものと同一であっても、異なっ
ていてもよい。
【００３６】通常、導入工程における核酸濃度は０．１
〜１００μｇ／１０６細胞の範囲で選択される。
〜１００μｇ／１０６細胞の範囲で選択される。
【００３７】前記の方法に従って処理されるヒト筋一次
細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞または心筋細胞であり
得る。さらに明示すれば、このヒト筋一次細胞は筋芽細
胞または衛星細胞である。好ましい態様によれば、工程
ａ）で培養されるヒト筋一次細胞懸濁液は、少なくとも
筋細胞、および好ましくは筋細胞を含んでなるが、ヒト
筋細胞系統はまた非筋細胞（すなわち、繊維芽細胞な
ど）を含んだ一次細胞懸濁液を処理することによっても
得られる。このような特定の場合では、さらに選抜すれ
ばヒト細胞系統の選抜が容易にできる。
細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞または心筋細胞であり
得る。さらに明示すれば、このヒト筋一次細胞は筋芽細
胞または衛星細胞である。好ましい態様によれば、工程
ａ）で培養されるヒト筋一次細胞懸濁液は、少なくとも
筋細胞、および好ましくは筋細胞を含んでなるが、ヒト
筋細胞系統はまた非筋細胞（すなわち、繊維芽細胞な
ど）を含んだ一次細胞懸濁液を処理することによっても
得られる。このような特定の場合では、さらに選抜すれ
ばヒト細胞系統の選抜が容易にできる。
【００３８】本発明はまた、デュシェーヌ筋ジストロフ
ィー患者から、または非デュシェーヌ筋ジストロフィー
患者から単離されたヒト筋一次細胞の特殊な処理によっ
て前記のように作出されたヒト筋細胞系統に関する。
ィー患者から、または非デュシェーヌ筋ジストロフィー
患者から単離されたヒト筋一次細胞の特殊な処理によっ
て前記のように作出されたヒト筋細胞系統に関する。
【００３９】さらに好ましい態様では、ヒト筋一次細胞
懸濁液は筋芽細胞を含み、作出された細胞系統はヒト繊
維芽細胞系統である。
懸濁液は筋芽細胞を含み、作出された細胞系統はヒト繊
維芽細胞系統である。
【００４０】方法は胎児まおよび成人組織由来の筋芽細
胞の作出のために開発され、他の細胞を実質的に含ま
ず、しかも、本発明に従って処理できる成人組織由来の
繊維芽細胞を大量に作出できる。同様に、筋芽細胞およ
び使用方法は当技術分野で記載されている（例えば、細
胞を培養で増殖させ、クローニングにより、あるいは本
方法に従って処理できるフローサイトメター（ＦＡＣ）
により未精製細胞培養物から精製することができる、Ｗ
Ｏ９３／０３７６８を参照）。本発明に従って作出され
た細胞系統から単離された筋芽細胞は多様な方法で使用
できる可能性を持つ。第１にこの筋芽細胞は、筋肉組織
に関する遺伝的または非遺伝的欠損を伴う種々の疾病の
治療のための野生型細胞または遺伝的に改変された細胞
のいずれかとして、細胞治療に役立ち得る。また、不死
化筋芽細胞は遺伝子治療のビヒクルとして使用されても
よく、ここでは注目される産物を提供するために１以上
の遺伝子を筋芽細胞に導入してもよい。これらの遺伝子
は、筋肉または非筋肉性疾患の治療のための、あるいは
新規なまたは進んだ遺伝的能力を提供するための筋細胞
または非筋細胞であってよい。
胞の作出のために開発され、他の細胞を実質的に含ま
ず、しかも、本発明に従って処理できる成人組織由来の
繊維芽細胞を大量に作出できる。同様に、筋芽細胞およ
び使用方法は当技術分野で記載されている（例えば、細
胞を培養で増殖させ、クローニングにより、あるいは本
方法に従って処理できるフローサイトメター（ＦＡＣ）
により未精製細胞培養物から精製することができる、Ｗ
Ｏ９３／０３７６８を参照）。本発明に従って作出され
た細胞系統から単離された筋芽細胞は多様な方法で使用
できる可能性を持つ。第１にこの筋芽細胞は、筋肉組織
に関する遺伝的または非遺伝的欠損を伴う種々の疾病の
治療のための野生型細胞または遺伝的に改変された細胞
のいずれかとして、細胞治療に役立ち得る。また、不死
化筋芽細胞は遺伝子治療のビヒクルとして使用されても
よく、ここでは注目される産物を提供するために１以上
の遺伝子を筋芽細胞に導入してもよい。これらの遺伝子
は、筋肉または非筋肉性疾患の治療のための、あるいは
新規なまたは進んだ遺伝的能力を提供するための筋細胞
または非筋細胞であってよい。
【００４１】特定の態様によれば、筋肉組織から単離さ
れた筋芽細胞は、筋遺伝子を発現し筋肉の細胞構造を有
する筋芽細胞へと変換され得る。このことは、ＭｙｏＤ
またはミオゲニン、あるいは構成的発現のためのこの遺
伝子ファミリーの他のメンバーをコードする遺伝子の発
現によって達成される。遺伝的に操作されたかかる「繊
維芽細胞」は、本発明で記載されたあらゆる操作または
方法において繊維芽細胞の代わりに機能し得る。本発明
によれば、「繊維芽細胞」はまた遺伝的に操作された
「繊維芽細胞」も包含する。
れた筋芽細胞は、筋遺伝子を発現し筋肉の細胞構造を有
する筋芽細胞へと変換され得る。このことは、ＭｙｏＤ
またはミオゲニン、あるいは構成的発現のためのこの遺
伝子ファミリーの他のメンバーをコードする遺伝子の発
現によって達成される。遺伝的に操作されたかかる「繊
維芽細胞」は、本発明で記載されたあらゆる操作または
方法において繊維芽細胞の代わりに機能し得る。本発明
によれば、「繊維芽細胞」はまた遺伝的に操作された
「繊維芽細胞」も包含する。
【００４２】本発明はさらに具体的には、デュシェーヌ
筋ジストロフィー患者から単離され、Ｍｙｏｈ ＴＧ２
４ ＣＮＣＭ ＮｏＩ−２１２７で示される筋一次細胞
から作出されるヒト繊維芽細胞系統、および非デュシェ
ーヌ筋ジストロフィー患者から単離され、Ｍｙｏｈ Ｔ
Ｇ１ ＣＮＣＭ ＮｏＩ−２１２８で示される筋一次細
胞から作出されるヒト繊維芽細胞系統に向けられる。
筋ジストロフィー患者から単離され、Ｍｙｏｈ ＴＧ２
４ ＣＮＣＭ ＮｏＩ−２１２７で示される筋一次細胞
から作出されるヒト繊維芽細胞系統、および非デュシェ
ーヌ筋ジストロフィー患者から単離され、Ｍｙｏｈ Ｔ
Ｇ１ ＣＮＣＭ ＮｏＩ−２１２８で示される筋一次細
胞から作出されるヒト繊維芽細胞系統に向けられる。
【００４３】本発明はさらに、治療上または予防上のポ
リペプチドの総てまたは一部をコードする第２の核酸配
列を導入することによりさらに改変された前述のような
ヒト筋細胞系統に関する。この第２の核酸配列はこれま
でに定義されたようなものであり、好ましくはジストロ
フィンまたは免疫を授与するポリペプチドの総てまたは
一部をコードするものである。
リペプチドの総てまたは一部をコードする第２の核酸配
列を導入することによりさらに改変された前述のような
ヒト筋細胞系統に関する。この第２の核酸配列はこれま
でに定義されたようなものであり、好ましくはジストロ
フィンまたは免疫を授与するポリペプチドの総てまたは
一部をコードするものである。
【００４４】本発明はまた、本発明のヒト筋細胞系統か
ら選択されるヒト筋細胞を提供する。
ら選択されるヒト筋細胞を提供する。
【００４５】本発明はさらに、本発明のヒト筋細胞系統
から選択されるヒト筋細胞の少なくとも１種を含んでな
る医薬組成物に関する。好ましい具体例によれば、かか
る医薬組成物に含まれるヒト筋細胞は被包されている。
細胞被包法はこれまでに記載されており、パーキンソン
病(Tresco et al., 1992, ASAIO J., 38, 17-23)または
筋萎縮性側索硬化症(Aebischer et al., 1996, Hum. Ge
ne Ther., 7, 851-860)の治療において被包細胞の移植
が可能とする。この特殊な具体例によれば、細胞は微孔
質膜を形成する化合物により被包され、この被包細胞を
さらにin vivoに移植することができる。注目される細
胞を包含する例えば長さ約１ｃｍのカプセルは、ポリエ
ーテルスルホン（ＰＥＳ）(Akzo Nobel Faser AG, Wupp
ertal, Germany; Deglon et al., 1996, Hum. Gene The
r., 7, 2135-2146)製の中空の微孔質膜を用いて製造し
てもよい。この膜は分子量排除限界が１００万Ｄａより
大きく、これにより移植細胞が宿主細胞と接触しないよ
うにしつつ、カプセルの内外でタンパク質や栄養素は自
由に通過できる。封入された細胞は、皮内、皮下、静脈
内、筋肉内、鼻腔内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、
膀胱内、胸膜腔内、冠状動脈内または腫瘍内経由で移植
すればよい。
から選択されるヒト筋細胞の少なくとも１種を含んでな
る医薬組成物に関する。好ましい具体例によれば、かか
る医薬組成物に含まれるヒト筋細胞は被包されている。
細胞被包法はこれまでに記載されており、パーキンソン
病(Tresco et al., 1992, ASAIO J., 38, 17-23)または
筋萎縮性側索硬化症(Aebischer et al., 1996, Hum. Ge
ne Ther., 7, 851-860)の治療において被包細胞の移植
が可能とする。この特殊な具体例によれば、細胞は微孔
質膜を形成する化合物により被包され、この被包細胞を
さらにin vivoに移植することができる。注目される細
胞を包含する例えば長さ約１ｃｍのカプセルは、ポリエ
ーテルスルホン（ＰＥＳ）(Akzo Nobel Faser AG, Wupp
ertal, Germany; Deglon et al., 1996, Hum. Gene The
r., 7, 2135-2146)製の中空の微孔質膜を用いて製造し
てもよい。この膜は分子量排除限界が１００万Ｄａより
大きく、これにより移植細胞が宿主細胞と接触しないよ
うにしつつ、カプセルの内外でタンパク質や栄養素は自
由に通過できる。封入された細胞は、皮内、皮下、静脈
内、筋肉内、鼻腔内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、
膀胱内、胸膜腔内、冠状動脈内または腫瘍内経由で移植
すればよい。
【００４６】さらなる態様では、本発明は、ヒト組織に
投与する組成物の製造のための、前記のように作出さ
れ、最終的には改変されたヒト筋細胞の少なくとも１種
の使用に関する。好ましい具体例では、本発明で請求さ
れる使用に従って製造された組成物は脊椎動物組織に投
与するための形態にある。これらの組織としては、シリ
ンジまたは他の装置を用い、筋肉、皮膚、鼻、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵
臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神
経系、眼、腺、結合組織、血液、腫瘍などが挙げられ
る。投与は皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、脳
内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠状
動脈内または腫瘍内注射によって行ってよい。さらに筋
芽細胞は最初の投与部位から他の部位、特に損傷部位、
例えば変性病巣へ移動することがわかっている。この移
動現象により、必要な患者、特に組織、循環中または離
れた部位への注射も可能であるが、通常は損傷部位に近
い筋肉組織に筋芽細胞を注射することにより損傷組織の
治療が可能となる。遺伝子操作された筋芽細胞を使用す
ることにより、注目される製剤の適用を損傷領域へ向け
るられるようになる。通常、細胞の注入量は、治療され
る筋肉組織ｃｍ３当たり約１０４〜１０７細胞（改変型
または非改変型）である。このような特定の場合では、
本発明の組成物はまた医薬上許容される注射用担体を含
んでなってもよい。かかる担体は等張、高張、またはや
や定張であり、スクロース溶液により得られるようにイ
オン強度が比較的小さいことが好ましい。かかるものと
しては、非発熱性の滅菌水、分散媒質、被覆剤および／
または同等物含んでなる溶媒、水性または部分的に水性
である液体担体のいずれもが含まれる。医薬製剤のｐＨ
は適宜調整し、緩衝させる。
投与する組成物の製造のための、前記のように作出さ
れ、最終的には改変されたヒト筋細胞の少なくとも１種
の使用に関する。好ましい具体例では、本発明で請求さ
れる使用に従って製造された組成物は脊椎動物組織に投
与するための形態にある。これらの組織としては、シリ
ンジまたは他の装置を用い、筋肉、皮膚、鼻、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵
臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神
経系、眼、腺、結合組織、血液、腫瘍などが挙げられ
る。投与は皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、脳
内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠状
動脈内または腫瘍内注射によって行ってよい。さらに筋
芽細胞は最初の投与部位から他の部位、特に損傷部位、
例えば変性病巣へ移動することがわかっている。この移
動現象により、必要な患者、特に組織、循環中または離
れた部位への注射も可能であるが、通常は損傷部位に近
い筋肉組織に筋芽細胞を注射することにより損傷組織の
治療が可能となる。遺伝子操作された筋芽細胞を使用す
ることにより、注目される製剤の適用を損傷領域へ向け
るられるようになる。通常、細胞の注入量は、治療され
る筋肉組織ｃｍ３当たり約１０４〜１０７細胞（改変型
または非改変型）である。このような特定の場合では、
本発明の組成物はまた医薬上許容される注射用担体を含
んでなってもよい。かかる担体は等張、高張、またはや
や定張であり、スクロース溶液により得られるようにイ
オン強度が比較的小さいことが好ましい。かかるものと
しては、非発熱性の滅菌水、分散媒質、被覆剤および／
または同等物含んでなる溶媒、水性または部分的に水性
である液体担体のいずれもが含まれる。医薬製剤のｐＨ
は適宜調整し、緩衝させる。
【００４７】さらなる態様では、本発明は、候補とな
る、もしくは市販の医薬分子の筋細胞毒性または障害性
のin vitro評価（臨床前検定）または新薬のin vitroス
クリーニングに有用な、本発明に従って作出された哺乳
類細胞の少なくとも１種を含んでなる診断キットに関す
る。この応用の過程では、デュシェーヌ筋ジストロフィ
ー患者から作出された細胞系統が好ましいであろう。こ
れらの細胞系統はまた、筋肉性疾患の生理病理学を分析
する手段としても役立ち得る。好ましい態様および特定
の実施例によって本発明を説明したが、当業者ならば前
述の明細書を読めば、本方法に対し種々の変更、同等物
との置換およびその他の変更を行い、本明細書に示され
た細胞を作出できよう。従ってここに請求される保護は
添付の請求の範囲およびそれと同等物に含まれる定義に
よってのみ制限されると考えられる。
る、もしくは市販の医薬分子の筋細胞毒性または障害性
のin vitro評価（臨床前検定）または新薬のin vitroス
クリーニングに有用な、本発明に従って作出された哺乳
類細胞の少なくとも１種を含んでなる診断キットに関す
る。この応用の過程では、デュシェーヌ筋ジストロフィ
ー患者から作出された細胞系統が好ましいであろう。こ
れらの細胞系統はまた、筋肉性疾患の生理病理学を分析
する手段としても役立ち得る。好ましい態様および特定
の実施例によって本発明を説明したが、当業者ならば前
述の明細書を読めば、本方法に対し種々の変更、同等物
との置換およびその他の変更を行い、本明細書に示され
た細胞を作出できよう。従ってここに請求される保護は
添付の請求の範囲およびそれと同等物に含まれる定義に
よってのみ制限されると考えられる。
【００４８】
【実施例】本発明の方法による（ｉ）健常供与者および
（ｉｉ）デュシェーヌ筋ジストロフィー患者由来ヒト筋
原細胞系統の確立 １．材料 導入工程で使用されるプラスミドＤＮＡ（ｐＰＨＭＴ−
図１）は、マウスメタロチオネインＩＩプロモーターの
制御下に置かれたＳＶ４０由来のＴおよびｔ抗原コード
領域を含む。選択遺伝子はＲＳＶ由来のＬＴＲプロモー
ターによって制御される原核細胞フレオマイシン耐性遺
伝子である。
（ｉｉ）デュシェーヌ筋ジストロフィー患者由来ヒト筋
原細胞系統の確立 １．材料 導入工程で使用されるプラスミドＤＮＡ（ｐＰＨＭＴ−
図１）は、マウスメタロチオネインＩＩプロモーターの
制御下に置かれたＳＶ４０由来のＴおよびｔ抗原コード
領域を含む。選択遺伝子はＲＳＶ由来のＬＴＲプロモー
ターによって制御される原核細胞フレオマイシン耐性遺
伝子である。
【００４９】２．本発明の方法 ａ）ヒト筋肉一次細胞の培養 筋芽細胞は成形手術後の代謝的には健常な患者またはＤ
ＭＤ患者の筋肉生検から得た。外植培養物から細胞を採
取し、１０％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、１０
ｎｇ／ｍｌの塩基性インスリン、１０ｎｇ／ｍｌの上皮
成長因子（両者ともＳｉｇｍａから）、１０ｎｇ／ｍｌ
の塩基性繊維芽細胞増殖因子(Pepro Tech, Rocky Hill,
NJ)、２ｍＭのグルタミン(bioMerieux, Marcy I'Etoil
e, France)および４０ｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Scher
ing Plough, Kenilworth, NJ)を添加したハムのＦ１４
培地(Life Technologies)で増殖させた。本方法は最大
１２回の継代後に得られ、０．１％ゼラチン被覆ディッ
シュ（直径１００ｍｍ）に播種した（３０００細胞／ｃ
ｍ５）繊維芽細胞に対して行う。筋細胞はデスミン、ジ
ストロフィン（ＮＣＬ抗ヒトジストロフィンモノクロー
ナル抗体，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）に対する免疫組織化
学、ならびに融合して筋管を形成するそれらの能力によ
り特徴づけられる。本方法の次の工程に用いられる培養
物中の筋芽細胞の割合は７０〜９０％の間である。
ＭＤ患者の筋肉生検から得た。外植培養物から細胞を採
取し、１０％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、１０
ｎｇ／ｍｌの塩基性インスリン、１０ｎｇ／ｍｌの上皮
成長因子（両者ともＳｉｇｍａから）、１０ｎｇ／ｍｌ
の塩基性繊維芽細胞増殖因子(Pepro Tech, Rocky Hill,
NJ)、２ｍＭのグルタミン(bioMerieux, Marcy I'Etoil
e, France)および４０ｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Scher
ing Plough, Kenilworth, NJ)を添加したハムのＦ１４
培地(Life Technologies)で増殖させた。本方法は最大
１２回の継代後に得られ、０．１％ゼラチン被覆ディッ
シュ（直径１００ｍｍ）に播種した（３０００細胞／ｃ
ｍ５）繊維芽細胞に対して行う。筋細胞はデスミン、ジ
ストロフィン（ＮＣＬ抗ヒトジストロフィンモノクロー
ナル抗体，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）に対する免疫組織化
学、ならびに融合して筋管を形成するそれらの能力によ
り特徴づけられる。本方法の次の工程に用いられる培養
物中の筋芽細胞の割合は７０〜９０％の間である。
【００５０】ｂ）デキサメタゾンによる培養物の前処理 トランスフェクション工程の２日前に、５．１０Ｅ５細
胞を直径１００ｍｍの培養ディッシュのエタノールに希
釈した１０−６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を添加
した培地中に播種する。
胞を直径１００ｍｍの培養ディッシュのエタノールに希
釈した１０−６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を添加
した培地中に播種する。
【００５１】ｃ）前処理培養物の懸濁液調製 前処理細胞培養物を０．２５％トリプシン製剤を用いる
トリプシン処理工程に付す。培地を除き、単層細胞を５
ｍｌのトリプシン製剤（Ｇｉｂｃｏ）で速やかにすす
ぐ。予め加温した（３７℃）０．５ｍｌのトリプシン製
剤を加える。トリプシン処理工程は３７℃にて約５分間
行い、単層細胞の倒立顕微鏡観察によりモニターする。
遠心分離により総てのディッシュから細胞を回収し、２
０ｍｌのデキサメタゾン含有培地に再懸濁させ、機械的
に粉砕してトリプシン処理を完了させ、２本の滅菌試験
管に分注する。
トリプシン処理工程に付す。培地を除き、単層細胞を５
ｍｌのトリプシン製剤（Ｇｉｂｃｏ）で速やかにすす
ぐ。予め加温した（３７℃）０．５ｍｌのトリプシン製
剤を加える。トリプシン処理工程は３７℃にて約５分間
行い、単層細胞の倒立顕微鏡観察によりモニターする。
遠心分離により総てのディッシュから細胞を回収し、２
０ｍｌのデキサメタゾン含有培地に再懸濁させ、機械的
に粉砕してトリプシン処理を完了させ、２本の滅菌試験
管に分注する。
【００５２】ｄ）リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン工程 各試験管に１ｍｌのリン酸カルシウム沈殿（２０μｇＤ
ＮＡ／ｍｌ）を加え、５％ＣＯ２下、３７℃にて約２４
時間、１００ｍｍの培養ディッシュに１１ｍｌのトラン
スフェクション混合物（細胞＋プラスミドＤＮＡ沈殿）
を播種する。
ン工程 各試験管に１ｍｌのリン酸カルシウム沈殿（２０μｇＤ
ＮＡ／ｍｌ）を加え、５％ＣＯ２下、３７℃にて約２４
時間、１００ｍｍの培養ディッシュに１１ｍｌのトラン
スフェクション混合物（細胞＋プラスミドＤＮＡ沈殿）
を播種する。
【００５３】次に、トランスフェクション細胞（transf
ected cell）を慣用の培養法にしたがって培養培地中に
おいて培養する。２４時間後にフレオマイシンを５０ｍ
ｇ／ｍｌの量で加えることによりトランスフェクション
クローンを選択する。また、クローンが選択されるまで
デキサメタゾンも培地に対して各変量で加える。クロー
ンの選択は免疫蛍光染色により行う。
ected cell）を慣用の培養法にしたがって培養培地中に
おいて培養する。２４時間後にフレオマイシンを５０ｍ
ｇ／ｍｌの量で加えることによりトランスフェクション
クローンを選択する。また、クローンが選択されるまで
デキサメタゾンも培地に対して各変量で加える。クロー
ンの選択は免疫蛍光染色により行う。
【００５４】この選択法によれば、トランスフェクショ
ン細胞をＬａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド(Nunc, Nap
erville, IL, USA)中で２日間培養し、−２０℃にて１
０分間メタノール−アセトン（１：１）で固定する。次
いでスライドを室温で１時間、抗ＳＶ４０Ｔ抗原マウス
モノクローナル抗体（ＰＡＢ−４１９；Ｃｈｅｍｉｃｏ
ｎｅ）とともにインキュベートし、ＰＢＳバッファーで
すすぎ、次ぎにウサギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ結合抗
体(ICN ImmunoBiologicaks, Lisle, IL, USA)を室温で
１時間適用する。スライドにＭｏｗｉｏｌ溶液をマウン
トし、エピフルオレッセンス顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で
調べる。
ン細胞をＬａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド(Nunc, Nap
erville, IL, USA)中で２日間培養し、−２０℃にて１
０分間メタノール−アセトン（１：１）で固定する。次
いでスライドを室温で１時間、抗ＳＶ４０Ｔ抗原マウス
モノクローナル抗体（ＰＡＢ−４１９；Ｃｈｅｍｉｃｏ
ｎｅ）とともにインキュベートし、ＰＢＳバッファーで
すすぎ、次ぎにウサギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ結合抗
体(ICN ImmunoBiologicaks, Lisle, IL, USA)を室温で
１時間適用する。スライドにＭｏｗｉｏｌ溶液をマウン
トし、エピフルオレッセンス顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で
調べる。
【００５５】３．結果 ヒト筋芽細胞に関する主要な問題は、これらの細胞（健
常ならびにＤＭＤ）のトランスフェクションのしにくさ
にある。従来のトランスフェクション技術を用いる場
合、トランスフェクション効率は極めて低い（約１０
−７）。ここで本発明によれば、標的細胞のグルココル
チコイド前処理と懸濁細胞に対して行うトランスフェク
ションとの併用により不死化クローンの作出が可能とな
ることが実証できた（効率１０−５）。ヒトＤＭＤ筋芽
細胞に関しては、１５を超えるクローンが得られ、その
うち３クローンがそれらの筋管形成能に関して選択され
た。さらに、良好な増殖率を保つためには、クローンは
好ましくは約３０％密度で置床すべきである。単離され
たクローンは、ＤＭＥＭ基本培地、２０％ＳＶＦ、イン
スリン、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、デキサメタゾンおよび硫酸
亜鉛中で培養するのが好ましい。
常ならびにＤＭＤ）のトランスフェクションのしにくさ
にある。従来のトランスフェクション技術を用いる場
合、トランスフェクション効率は極めて低い（約１０
−７）。ここで本発明によれば、標的細胞のグルココル
チコイド前処理と懸濁細胞に対して行うトランスフェク
ションとの併用により不死化クローンの作出が可能とな
ることが実証できた（効率１０−５）。ヒトＤＭＤ筋芽
細胞に関しては、１５を超えるクローンが得られ、その
うち３クローンがそれらの筋管形成能に関して選択され
た。さらに、良好な増殖率を保つためには、クローンは
好ましくは約３０％密度で置床すべきである。単離され
たクローンは、ＤＭＥＭ基本培地、２０％ＳＶＦ、イン
スリン、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、デキサメタゾンおよび硫酸
亜鉛中で培養するのが好ましい。
【００５６】クローンの免疫蛍光研究では、総ての細胞
においてＳＶ４０ ＴＡｇの発現が証明された。また、
筋芽細胞天然マーカー「デスミン」も存在し、融合可能
なクローンもあった。
においてＳＶ４０ ＴＡｇの発現が証明された。また、
筋芽細胞天然マーカー「デスミン」も存在し、融合可能
なクローンもあった。
【表１】
【００５７】また、単離された細胞系統のトランスフェ
クト力も、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−Ｇａｌ）
を発現するプラスミドを用いてリン酸カルシウムトラン
スフェクションにより試験した。
クト力も、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−Ｇａｌ）
を発現するプラスミドを用いてリン酸カルシウムトラン
スフェクションにより試験した。
【００５８】確認されたクローンのうち、クローンＭｙ
ｏｈ ＴＧ１（健常）（ＣＮＣＭＮｏ．Ｉ−２１２８）
およびＭｙｏｈ ＴＧＤ２４（デュシェーヌ）（ＣＮＣ
ＭＮｏ．Ｉ−２１２７）の２つは効率的にトランスフェ
クトされ、一時的トランスフェクション後に１〜１０％
のβ−Ｇａｌ発現細胞を示した。
ｏｈ ＴＧ１（健常）（ＣＮＣＭＮｏ．Ｉ−２１２８）
およびＭｙｏｈ ＴＧＤ２４（デュシェーヌ）（ＣＮＣ
ＭＮｏ．Ｉ−２１２７）の２つは効率的にトランスフェ
クトされ、一時的トランスフェクション後に１〜１０％
のβ−Ｇａｌ発現細胞を示した。
【００５９】これら２つのクローンは増殖、分化および
筋細胞に特徴的な特性を発現可能であり、さらに注目さ
れる遺伝子の発現に有用な核酸ベクターで細胞へ効率的
にトランスフェクトできる。
筋細胞に特徴的な特性を発現可能であり、さらに注目さ
れる遺伝子の発現に有用な核酸ベクターで細胞へ効率的
にトランスフェクトできる。
【００６０】クローンＭｙｏｈ ＴＧ１およびＭｙｏｈ
ＴＧＤ２４は１９９９年２月１６日にCollection Nat
ionale de Cultures de Microorganimes (CNCM), Insti
tutPasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris
Cedex 15に寄託され、それぞれＣＮＣＭ受託番号Ｉ−
２１２８およびＩ−２１２７とされた。
ＴＧＤ２４は１９９９年２月１６日にCollection Nat
ionale de Cultures de Microorganimes (CNCM), Insti
tutPasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris
Cedex 15に寄託され、それぞれＣＮＣＭ受託番号Ｉ−
２１２８およびＩ−２１２７とされた。
【図１】プラスミドＤＮＡ（ｐＰｈＭＴ）を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/04 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 500196939 アソシアシオン、フランセーズ、コント ル、レ、ミオパチー ＡＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ ＦＲＡＮＣＡＩ ＳＥ ＣＯＮＴＲＥ ＬＥＳ ＭＹＯＰＡ ＴＨＩＥＳ フランス国パリ、プラース、ド、ランジ、 13 (72)発明者 セルジュ、ブラウン フランス国ドルリスシャイム、フォーブー ル、デ、ボスジュ、28 (72)発明者 フレデリク、ペロー フランス国グデルトタイム、リュ、デ、プ リムベール、３
Claims (36)
- 【請求項１】増殖可能なヒト筋細胞系統であって、ヒト
筋肉一次細胞から、 ａ）ヒト筋肉一次細胞の培養物またはその懸濁液を、少
なくとも１種のグルココルチコイドを用いて前処理し、 ｂ）任意の工程として工程ａ）の前処理培養物の懸濁液
を得ることを含んでなり、 ｃ）工程ａ）またはｂ）の懸濁液の前処理細胞へ、レト
ロウイルス起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化す
る能力のある、少なくとも１個の核酸ベクターを導入
し、さらに ｄ）工程ｃ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる方法により作出される、ヒト筋細胞系
統。 - 【請求項２】前記方法が、 ａ）ヒト筋肉一次細胞の培養物を得、 ｂ）工程ａ）の培養物を、少なくとも１種のグルココル
チコイドを用いて前処理し、 ｃ）工程ｂ）の前処理培養物の懸濁液を得、 ｄ）工程ｃ）の懸濁液の前処理細胞へ、レトロウイルス
起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化する能力のあ
る、少なくとも１個の核酸ベクターを導入し、さらに ｅ）工程ｄ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる、請求項１記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項３】前記方法が、 ａ）ヒト筋肉一次細胞の培養物を得、 ｂ）工程ａ）のヒト筋肉培養一次細胞の懸濁液を得、 ｃ）工程ｂ）の懸濁液を、少なくとも１種のグルココル
チコイドを用いて前処理し、 ｄ）工程ｃ）の懸濁液の前処理細胞へ、レトロウイルス
起源ではなく、かつ、前処理細胞を不死化する能力のあ
る、少なくとも１個の核酸ベクターを導入し、さらに ｅ）工程ｄ）の導入細胞を培養する 工程を含んでなる、請求項１記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項４】懸濁液が、ヒト筋肉培養一次細胞または前
処理培養物を、細胞組織を解離することができる少なく
とも１種の化合物で処理することにより得られる、請求
項１〜３のいずれか１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項５】化合物がパンクレアチン、コラゲナーゼ、
ジスパーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼおよびその
いずれかの同等物からなる群から選択される酵素であ
る、請求項４記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項６】グルココルチコイドが、デキサメタゾン、
ベタメタゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレド
ニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロンまたはフル
ニソリドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
ヒト筋細胞系統。 - 【請求項７】グルココルチコイドが、脂溶性形態、エタ
ノール溶性形態または水溶性形態である、請求項１〜６
のいずれか１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項８】グルココルチコイドが合成または非合成グ
ルココルチコイドである、請求項１〜７のいずれか１項
に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項９】前処理が、ヒト筋肉一次細胞の培養物また
はその懸濁液と少なくとも１種のグルココルチコイドを
接触させることからなる、請求項１〜８のいずれか１項
に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１０】前処理が、導入工程前に、少なくとも３
時間、好ましくは少なくとも２４時間、有利には少なく
とも４８時間適用される、請求項９記載のヒト筋細胞系
統。 - 【請求項１１】前処理工程におけるグルココルチコイド
濃度が１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲である、請求項
９または１０記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１２】細胞を不死化する能力のある核酸ベクタ
ーが、ｍｙｃ、ＳＶ４０ Ｔ抗原、ＳＶ４０ ｔ抗原、
パピローマウイルスＥ６およびＥ７、ポリオーマラージ
Ｔ遺伝子、ＥＢＶ、ｒａｓ、アデノウイルスＥ１、ｐ５
３からなる群から選択される発癌性ポリペプチドおよび
そのいずれかの発癌性部分をコードする少なくとも１つ
の核酸配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１
項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１３】核酸ベクターがその核酸配列の発現に必
要なエレメントをさらに含んでなる、請求項１２記載の
ヒト筋細胞系統。 - 【請求項１４】核酸配列の発現に必要なエレメントがグ
ルココルチコイドにより活性化される、請求項１３記載
のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１５】核酸ベクターがプラスミドである、請求
項１３または１４記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１６】核酸ベクターが治療上または予防上のポ
リペプチドの総てまたは一部をコードする第２の核酸配
列をさらに含んでなる、請求項１３〜１５のいずれか１
項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１７】細胞を不死化する能力のある核酸配列
が、ウイルス感染、陽イオン脂質または陽イオンポリマ
ートランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフ
ェクション、エレクトロポレーションからなる群から選
択される方法またはそのいずれかの組合せにより懸濁液
の前処理細胞に導入される、請求項１〜１６のいずれか
１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１８】導入工程が少なくとも１種のグルココル
チコイドの存在下で行われる、請求項１〜１７のいずれ
か１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項１９】導入工程における核酸濃度が０．１〜１
００μｇ／１０６細胞である、請求項１〜１８のいずれ
か１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２０】ヒト筋肉一次細胞が骨格筋細胞、平滑筋
細胞、または心筋細胞である、請求項１〜１９のいずれ
か１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２１】ヒト筋肉一次細胞が筋芽細胞または衛星
細胞である、請求項２０記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２２】ヒト筋肉一次細胞がデュシェーヌ筋ジス
トロフィー患者から単離されたヒト筋細胞である、請求
項１〜２１のいずれか１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２３】ヒト筋肉一次細胞が非デュシェーヌ筋ジ
ストロフィー患者から単離されたヒト筋細胞である、請
求項１〜２１のいずれか１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２４】ヒト筋肉一次細胞が筋芽細胞である、請
求項２２記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２５】Ｍｙｏｈ ＴＧＤ２４ ＣＮＣＭ Ｎ０
１−２１２７で示される、請求項２４記載のヒト筋細胞
系統。 - 【請求項２６】ヒト筋肉一次細胞が筋芽細胞である、請
求項２３記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２７】Ｍｙｏｈ ＴＧ１ ＣＮＣＭ Ｎ０１−
２１２８で示される、請求項２６記載のヒト筋細胞系
統。 - 【請求項２８】治療上または予防上のポリペプチドの総
てまたは一部をコードする第２の核酸配列を導入するこ
とによりさらに改変された、請求項１〜２７のいずれか
１項に記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項２９】第２の核酸配列がジストロフィンまたは
免疫を授与するポリペプチドの総てまたは一部をコード
する、請求項２８記載のヒト筋細胞系統。 - 【請求項３０】請求項１〜２９のいずれか１項に記載の
ヒト筋細胞系統に由来する、単離されたヒト筋細胞。 - 【請求項３１】請求項３０のヒト筋細胞の少なくとも１
種を含んでなる、医薬組成物。 - 【請求項３２】ヒト筋細胞が被包されている、請求項３
１記載の医薬組成物。 - 【請求項３３】ヒト組織へ投与する組成物の製造のため
の、請求項３０記載の少なくとも１種のヒト筋細胞の使
用。 - 【請求項３４】皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、
脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠
状動脈内または腫瘍内注射により投与がなされる、請求
項３３記載の使用。 - 【請求項３５】in vitroでの候補分子の筋細胞毒性また
は障害性の評価に有用な、請求項３０記載のヒト筋細胞
の少なくとも１種を含んでなる、診断キット。 - 【請求項３６】in vitroでの新薬のスクリーニングに有
用な、請求項３０記載のヒト筋細胞の少なくとも１種を
含んでなる診断キット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US186761 | 1998-11-05 | ||
| EP99401031A EP1048724A1 (en) | 1999-04-27 | 1999-04-27 | Human myoblast cell lines and their uses |
| US18676100P | 2000-03-03 | 2000-03-03 | |
| US99401031.2 | 2000-03-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000350579A true JP2000350579A (ja) | 2000-12-19 |
Family
ID=26153655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000127882A Pending JP2000350579A (ja) | 1999-04-27 | 2000-04-27 | ヒト筋芽細胞系統およびその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6514756B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000350579A (ja) |
| AU (1) | AU3012300A (ja) |
| CA (1) | CA2307104A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1900810A1 (fr) * | 2006-09-15 | 2008-03-19 | Celogos | Methode d'extraction et de selection de cellules |
| US7782202B2 (en) * | 2006-10-31 | 2010-08-24 | Corning Cable Systems, Llc | Radio frequency identification of component connections |
| US8735116B2 (en) | 2010-09-13 | 2014-05-27 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | High-density spot seeding for tissue model formation |
| US20140140969A1 (en) * | 2012-11-20 | 2014-05-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for muscular dystrophies |
| CN110862958A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-03-06 | 安徽农业大学 | 一种肉鸡肌细胞热应激模型的构建方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6713247B1 (en) * | 1996-09-03 | 2004-03-30 | Signal Pharmaceuticials, Inc. | Human CNS cell lines and methods of use therefor |
-
2000
- 2000-04-26 AU AU30123/00A patent/AU3012300A/en not_active Abandoned
- 2000-04-26 CA CA002307104A patent/CA2307104A1/en not_active Abandoned
- 2000-04-27 US US09/559,781 patent/US6514756B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-27 JP JP2000127882A patent/JP2000350579A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6514756B1 (en) | 2003-02-04 |
| CA2307104A1 (en) | 2000-10-27 |
| AU3012300A (en) | 2000-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4526186B2 (ja) | 造血幹細胞を試験管内で維持する方法と組成物 | |
| US6432711B1 (en) | Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines | |
| US5538722A (en) | Isolation, growth, differentiation and genetic engineering of human muscle cells | |
| JP3953399B2 (ja) | 不死化骨髄間葉系幹細胞 | |
| US20140322181A1 (en) | Use of human cord blood-derived pluripotent cells for the treatment of disease | |
| WO2006078034A1 (ja) | 心筋細胞への分化能を有する細胞 | |
| US6555377B1 (en) | Process for production of mammalian cell lines | |
| JP2000350579A (ja) | ヒト筋芽細胞系統およびその使用 | |
| EP1048724A1 (en) | Human myoblast cell lines and their uses | |
| WO2022130161A1 (en) | Method for producing modified mesenchymal stromal stem cells with improved properties, modified cells obtained by this method, composition including such cells | |
| US7629168B2 (en) | Insulin expressing human pancreatic islet cell line capable of reversibly proliferating and use thereof | |
| JP2010540639A (ja) | 筋肉誘導前駆体組成物を利用した骨格筋の強化およびその処置 | |
| WO2021060467A1 (ja) | 巨核球前駆細胞および巨核球細胞の製造方法並びに得られた巨核球前駆細胞および巨核球細胞 | |
| Krueger et al. | Transient transfection of oligodendrocyte progenitors by electroporation | |
| EP1084232A1 (en) | Genetically-modified fibroblasts and the use thereof |