JP2022512798A - 抗体ＦｃＲｎ結合の改変 - Google Patents

Abstract

ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける改変された抗体の（相対）保持時間が親抗体と比較して１分間より長いが５分間より短い間だけ増加されるまでヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を変化させる１つ以上の突然変異を導入することによる抗体のＦｃ領域の改変を含む、改善されたインビボ半減期を有する改変された抗体を提供する方法が、本明細書において報告される。

Description

本発明は組換え抗体技術の分野にある。抗体ベースのＦｖおよびＦｃ領域操作の薬物動態特性の改変方法が本明細書において報告される。

発明の背景
クラスＧのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、標的抗原に対する特異性を伝える２つの抗原結合（Ｆａｂ）領域およびＦｃ受容体の相互作用の原因となる定常領域（Ｆｃ領域）を含有する（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４（１９９１）１－２２；Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｃ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４０（２００１）２５－３５を参照）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のヒトＩｇＧは２１日の平均血清半減期を有し、これは任意の他の公知の血清タンパク質のそれより長い（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ １３（１９６９）１－１１０を参照）。この長い半減期は主に、Ｆｃ領域および新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の間の相互作用により媒介される（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（２０００）７３９－７６６；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７（２００３）３１５－３２２を参照）。これは、ＩｇＧまたはＦｃ含有融合タンパク質が広範なクラスの治療法として使用される理由の１つである。

新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎは、ＩｇＧおよびアルブミンの両方のホメオスタシス、胎盤を超える母系ＩｇＧ輸送ならびに抗原－ＩｇＧ免疫複合体食作用に関与する膜結合性受容体である（例えば、Ｂｒａｍｂｅｌｌ，Ｆ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０３（１９６４）１３５２－１３５４；Ｒｏｐｅｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（２００３）３５２８－３５３３を参照）。ヒトＦｃＲｎは、グリコシル化クラスＩ主要組織適合複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）およびβ_２マイクログロブリン（β_２ｍ）サブユニットからなるヘテロ二量体である（例えば、Ｋｕｏ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（２０１０）７７７－７８９を参照）。ＦｃＲｎは、Ｆｃ領域のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３領域中の部位に結合し（例えば、Ｒｏｐｅｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２００７）７１５－７２５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７（２００１）８６７－８７７；Ｇｏｅｂｌ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １９（２００８）５４９０－５５０５；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２－５４８を参照）、２つのＦｃＲｎ分子はＦｃ領域に同時に結合することができる（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（１９９９）９４７１－９４７６；Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０（１９９３）１０７７－１０８３を参照）。ＦｃＲｎおよびＦｃ領域の間の親和性はｐＨ依存性であり、５～６のエンドソームのｐＨにおいてナノモル濃度の親和性および７．４の生理的ｐＨにおいてかなり弱い結合を示す（例えば、Ｇｏｅｂｌ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １９（２００８）５４９０－５５０５；Ｏｂｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（２００４）１１０７６－１１０８１；Ｏｂｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（２００４）２０２１－２０２９を参照）。ＩｇＧに長い半減期を伝える根底となる機序は、３つの基礎的なステップにより説明することができる。第１に、ＩｇＧは様々な細胞種による非特異的なピノサイトーシスにさらされる（例えば、Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（２００７）４５８０－４５８８；Ｍｏｎｔｏｙｏ，Ｈ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（２００９）２７８８－２７９３を参照）。第２に、ＩｇＧは５～６のｐＨの酸性エンドソーム中でＦｃＲｎに遭遇してそれに結合し、それにより、ＩｇＧをリソソーム分解から保護する（例えば、Ｒｏｐｅｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２００７）７１５－７２５；Ｒｏｄｅｗａｌｄ，Ｒ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７１（１９７６）６６６－６６９を参照）。最後に、ＩｇＧは７．４の生理的ｐＨにおいて細胞外空間に放出される（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（２０００）７３９－７６６を参照）。この厳格なｐＨ依存性の結合および放出機序はＩｇＧ再利用のために不可欠であり、異なるｐＨ値における結合的特徴の任意の逸脱はＩｇＧの循環半減期に影響を強く及ぼし得る（例えば、Ｖａｃｃａｒｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（２００５）１２８３－１２８８を参照）。

Ｈｏｅｔｚｅｌ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（ｍＡｂｓ ４（２０１２）７５３－７６０）は、ヒト治療抗体候補の大部分は臨床使用のために好適な薬物動態特性を示すが、臨床的有用性を制限し得る予想外に急速な抗体クリアランスが観察されることがあるので、急速なクリアランスを伴う抗体のリスク軽減のための戦略を開示した。治療用タンパク質の非特異的結合を評価するためのバキュロウイルス（ＢＶ）粒子への結合のＥＬＩＳＡ検出に基づくアッセイが記載される。

モノクローナル抗体の機能的特徴付けのための分析的ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーがＷＯ２０１３／１２０９２９に開示される。モノクローナル抗体の薬物動態的、薬力学的および免疫原性比較性評価戦略がＰｕｔｎａｍ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２０１０）５０９－５１６）により開示されている。

Ｓａｍｐｅｉ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（２０１３）ｅ５７４７９）は、第ＶＩＩＩ因子補因子活性の機能を模倣する非対称二重特異性ＩｇＧ抗体の同定および多次元的最適化を開示する。

ＷＯ２０１５／１４０１２６は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上で決定される保持時間に基づく抗体のインビボ半減期の予測方法を開示する。

現行の文献は、薬物動態を予測するものとしてのＦｃＲｎクロマトグラフィー（例えば、Ｓｃｈｏｃｈ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１２（２０１５）５９９７－６００２を参照）またはＦｃＲｎ親和性（例えば、Ｎｅｕｂｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ６（２０１４）９２８－９４２を参照）の使用を開示する。代替的に、例えばＥＬＩＳＡフォーマットにおける、ヘパリン結合 （例えば、Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ７（２０１５）１０８４－１０９３を参照）は、細胞表面構造との非特異的相互作用を定量化するためのサロゲートパラメーターとして開示されている。

ＷＯ２０１５／１８９２４９は、改変されたＦｃＲｎ相互作用を有する抗体を選択する方法を開示する。Ｆｃ受容体結合改変非対称抗体および使用方法がＵＳ２０１６／０１９４８９に開示されている。ＵＳ２０１７／２２７５４７においてインビボ半減期のインビトロ予測が開示されている。ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体がＷＯ２０１８／１８４９６６に開示されている。

本発明による方法を用いることでＦｖおよび／またはＦｃ領域操作により抗体の薬物動態特性を改変することができる。そのため、本発明による方法を用いることで各々の治療応用に対して所与の抗体の薬物動態特性を調整することができる。特に、クリアランスを低減し、それにより抗体のインビボ半減期を増加させること、すなわち、その薬物動態特性を向上させて、それを治療応用のためにより好適なものにすることができる。これは、本明細書において提供される開示に基づいてＦｃ領域中のＦｖおよびＦｃＲｎ結合における電荷分布を改変することにより為される。

本発明による方法は、２つの異なるクロマトグラフィー方法の組合せ、すなわち、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組合せに基づく。ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組合せは、ＦｃＲｎおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間閾値、およびそれにより、遅いクリアランス、すなわち、長い全身循環半減期を有する抗体が見出され得る二次元保持時間領域を定義することを可能とする。

Ｆｃ領域中の改変を導入することにより抗体の薬物動態特性を向上させるために１分またはより長いが約５分より短いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける保持時間の増加はインビボ半減期の向上に関して最も効率的な改変を提供することが見出された。１つの好ましい実施形態では、増加は３分より長いが４分より短い。

そのため、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける改変された抗体の（相対）保持時間が親抗体と比較して１分間より長いが５分間より短く増加されるまでヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を変化させる１つまたはより多くの突然変異を導入することによる抗体のＦｃ領域の改変を含む、改善されたインビボ半減期を有する改変された抗体を提供する方法が本明細書において報告される。

そのため、本発明の一態様は、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供する方法であって、
ａ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける（親）抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
ｃ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける改変された抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
ｄ）（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より短い場合、および約５分より長い場合にステップｂ）を繰り返すステップであって、それにより、親抗体と比較して相対保持時間の変化が１分より短い場合にはヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域のさらに増加した結合を結果としてもたらす突然変異が選択され、または相対保持時間の変化が５分より長い場合にはヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の増加がより小さい結合を結果としてもたらす突然変異が選択される、ステップと、
ｅ）（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より長くかつ約５分より短い場合に改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
を含む、方法である。

この態様は、代替的に以下のように表現され得る：本発明の一態様は、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供する方法であって、
ａ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける（親）抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
ｃ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおいて改変された抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
を含み、
（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より短いおよび約５分より長い場合にステップｂ）が繰り返され、それにより、親抗体と比較して相対保持時間の変化が１分より短い場合にはヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域のさらに増加した結合を結果としてもたらす突然変異が選択され、または相対保持時間の変化が５分より長い場合にはヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域のより小さく増加した結合を結果としてもたらす突然変異が選択され／それを特徴とし、
それにより、（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より長いかつ約５分より短い場合に改善されたインビボ半減期を有する抗体が提供される／それを特徴とする、
方法である。

一実施形態では、（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化は約２分より長いかつ約４．５分より短い。

一実施形態では、（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化は約３分より長いかつ約４分より短い。

一実施形態では、（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化は約３．３分より長いかつ約３．９分より短い。

一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーは、
－ビオチン－ストレプトアビジン非共有結合性相互作用を介してそれにコンジュゲートしたヒトＦｃＲｎ（１つの好ましい実施形態では、マトリックス１ｇ当たり１ｍｇ～５ｍｇのＦｃＲｎ、好ましくはマトリックス１ｇ当たり２．５ｍｇのＦｃＲｎ）を有する約１ｍＬのストレプトアビジンアガロースマトリックスを含むＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムが、８０体積％の緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）および２０体積％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８）を用いて０．５ｍＬ／分の流速および２５℃のカラム温度において平衡化され、
－計３０μｇの抗体が８０体積％の緩衝液Ａおよび２０体積％の緩衝液Ｂの同じ混合物中に調製さて、平衡化されたカラムに注入され、
－注入の１０分後に、７０分にわたる２０体積％から１００体積％への緩衝液Ｂの線形勾配が開始され、
－必要に応じて１００体積％の緩衝液Ｂが１０分間保持された後にカラムが８０体積％の緩衝液Ａおよび２０体積％の緩衝液Ｂを用いて再平衡化され、
それにより、検出が、２８０ｎｍに設定されたＵＶ検出器を用いて行われ、
それにより、（比較可能な異なる実施および異なる緩衝液およびカラムロットからの結果を作成するため、ならびにわずかな保持時間のドリフトを補償するために、標準試料が各シークエンスの開始および終了時および１０回目毎の実施後に測定される）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間が以下の式：

に従って算出され、これは、図１によるピーク定義（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：図１による部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体のピーク２の保持時間；ｔ_ピーク３：図１による抗Ｈｅｒ３抗体のピーク３の保持時間）に基づく。

一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間は以下の式：

（この実施形態において以前／上記に概説されるような勾配を有するＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー上で、ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体の第２のピークの保持時間；ｔ_ピーク３：部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体の第３のピークの保持時間）にしたがって算出される。一実施形態では、抗Ｈｅｒ３抗体は配列番号０３の重鎖および配列番号０４の軽鎖を有する。

一実施形態では、ＦｃＲｎはヒトベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有結合性複合体である。

一実施形態では、方法は、ステップｂ）として、
ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
および
－正に荷電したパッチのサイズを低減すること、
－正に荷電したパッチのサイズを低減し、かつ負に荷電したパッチのサイズを増加させること、
－ＦｖまたはＦａｂにおいて電荷の全体的な分布をより均一にする／全体的な電荷を均一に分布させることにより
抗体のＦｖを改変するステップと、
を含む。

一実施形態では、Ｆｖ断片中の電荷分布を、
ｉ）少なくとも１つの（永久的に）負に荷電したもしくは荷電していないアミノ酸残基を（永久的に）正に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
ｉｉ）少なくとも１つの（永久的に）正に荷電したもしくは荷電していないアミノ酸残基を（永久的に）負に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
ｉｉｉ）少なくとも１つの（永久的に）荷電したアミノ酸残基を反対の電荷を有するアミノ酸残基に変化させること、または
ｉｖ）少なくとも１つの永久的に荷電したアミノ酸残基をｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
ｖ）ｉ）～ｉｖ）の組合せ
により変化させる。

ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上およびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の保持時間が各々のカラム上の参照抗体の保持時間に基づいて正規化される場合、遅いクリアランスを有する抗体を主に含む相対保持時間領域が定義される。この領域は、１．７８未満のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として酸化された（Ｈ２Ｏ２処理された）抗Ｈｅｒ３抗体調製物が用いられる）および０．８７未満のヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として抗ｐＴａｕ抗体が用いられる）により定義される。

一実施形態では、方法は、
ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
ならびに
ｆ）改変された抗体が、
ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短い、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短い、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
を含む。

一実施形態では、方法は、
ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
ならびに
ｆ）改変された抗体が、
ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より長いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より長いヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
を含む。

一実施形態では、方法は、
ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
ならびに
ｆ）改変された抗体が、
ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短いもしくは長いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短いもしくは長いヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方（ここで、ｉ）において相対保持時間はより短く、ｉｉ）においてそれはより長い、またはその逆である）
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと
を含む。

抗体の（溶媒曝露された）表面上の荷電したパッチを決定するために異なる方法およびツールが当業者に公知である。異なるベンダーまたは学術的グループにより提供されるツールがある。例えば、本明細書においてソフトウェアスイートＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ベンダー：Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に実装されたようなソフトウェアＣＨＡＲＭＭおよびＤｅｌｐｈｉを使用したＸ線構造または相同性モデルに基づくインシリコ算出方法、続いて酸性および塩基性アミノ酸側鎖のｐＨプロトン化ならびに３Ｄ電荷分布の算出が使用された。

一実施形態では、改変された抗体は、その（溶媒曝露された）表面上に少なくとも１つの追加の負に荷電したパッチを有する。

一実施形態では、改変された抗体は、親抗体と同じ（表面）正味電荷を有する。

一実施形態では、（永久的に）負に荷電したアミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。

一実施形態では、（永久的に）正に荷電したアミノ酸残基は、アルギニンおよびリジンからなる群から選択される。

一実施形態では、ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基はヒスチジンである。

一実施形態では、永久的に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ６～ｐＨ８のｐＨ範囲内で同じ（正味）電荷を有する。

一実施形態では、ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ６において第１の（正味）電荷およびｐＨ８において反対の第２の（正味）電荷を有する。

一実施形態では、標準試料は、重鎖ＣＨ２ドメイン中の位置２５２のメチオニン残基に関して非酸化形態、一酸化形態（位置２５２の２つのメチオニンのうちの１つのみが酸化されている）および二酸化形態（位置２５２の両方のメチオニン残基が酸化されている）（Ｋａｂａｔによるナンバリング）の参照抗体を含む酸化された抗体調製物である。一実施形態では、相対保持時間は以下の式：

（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}＝抗体の相対保持時間；ｔ_ｉ＝抗体の保持時間）に基づいて算出される。一実施形態では、第１の参照抗体は、配列番号０３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号０４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗Ｈｅｒ３抗体である。

一実施形態では、ステップｆ）における第１の閾値は２である。一実施形態では、第１の閾値は１．８である。一実施形態では、第１の閾値は１．７８である。

一実施形態では、ステップｆ）における第２の参照抗体は、配列番号０１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号０２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗ｐＴａｕ抗体である。一実施形態では、第２の閾値は１である。一実施形態では、第２の閾値は０．８である。一実施形態では、第２の閾値は０．７８である。

一実施形態では、ステップｆ）は、
改変された抗体が、
ｉ）配列番号０３および０４の酸化された抗Ｈｅｒ３抗体の調製物のピーク２および３の間の保持時間差異の１．７８倍未満であるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、ならびに
ｉｉ）配列番号０１および０２の抗ｐＴａｕ抗体の保持時間の０．８７倍未満であるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップである。

全ての方法の一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間は以下の式：

に従って算出され、これは、図１によるピーク定義（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：図１による部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体のピーク２の保持時間；ｔ_ピーク３：図１による抗Ｈｅｒ３抗体のピーク３の保持時間）に基づく。

全ての方法の一実施形態では、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間は以下の式：

（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ｐＴａｕ：抗ｐＴａｕ抗体ピークの保持時間）に従って算出される。

一実施形態では、正の線形ｐＨ勾配を用いるステップ ｅ）のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおいて、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）の固定化された非共有結合性複合体がアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用され、
新生児Ｆｃ受容体およびベータ－２－マイクログロブリンの非共有結合性複合体はクロマトグラフィー材料に結合しており、かつ非共有結合性複合体は特異的結合ペアを介して固相にコンジュゲートしており、
ｐＨ勾配は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値へのものであり、それにより、第１のｐＨ値はｐＨ３．５からｐＨ６．４へのものであり、かつ第２のｐＨ値はｐＨ７．４からｐＨ９．５へのものであり、かつ
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）の非共有結合性複合体は一ビオチン化されており、かつ固相はストレプトアビジンを用いて誘導体化されている。

一実施形態では、ステップｅ）のｐＨ勾配は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値へのものであり、それにより、第１のｐＨ値はｐＨ５．５であり、かつ第２のｐＨ値はｐＨ８．８である。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎと同じ種からのものである。

一実施形態では、ＦｃＲｎは、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、ヒツジＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ブタＦｃＲｎ、ミニブタＦｃＲｎ、およびウサギＦｃＲｎから選択される。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎと同じ種からのものである。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎとは異なる種からのものである。

一般に、Ｃ末端Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ（配列番号３２）を有するＦｃＲｎの可溶性細胞外ドメイン（ヒトＦｃＲｎについて配列番号３１）を哺乳動物細胞中でβ_２－マイクログロブリン（ヒトベータ－２－マイクログロブリンについて配列番号３３）と共発現させた。非共有結合性ＦｃＲｎ－マイクログロブリン複合体をビオチン化し、ストレプトアビジン誘導体化セファロースにロードした。

一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー用の参照抗体は、配列番号０３（重鎖）および配列番号０４（軽鎖）を有する抗ＨＥＲ３抗体である。

一実施形態では、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー用の参照抗体は、配列番号０１（重鎖）および配列番号０２（軽鎖）を有する抗ｐＴａｕ抗体である。

一実施形態では、抗体は、融合ポリペプチドの単一特異性抗体もしくは抗体断片、または融合ポリペプチドの二重特異性抗体もしくは抗体断片、または融合ポリペプチドの三重特異性抗体もしくは抗体断片、または融合ポリペプチドの四重特異性抗体もしくは抗体断片である。

一実施形態では、抗体はクラスＩｇＧの抗体である。一実施形態では、抗体はサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体である。一実施形態では、抗体はサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４の抗体である。

発明の態様の詳細な説明
本発明は、インビボ薬物動態特性の向上のためにＦｃＲｎアフィニティーカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより決定されるようなＦｃＲｎ結合の定義された増加が有利であるという発見に少なくとも部分的に基づく。

ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組合せは、ＦｃＲｎおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間閾値、およびそれにより、遅いクリアランス、すなわち、長い全身循環半減期を有する抗体が見出され得る保持時間領域を定義することを可能とする。ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上およびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の保持時間が各々のカラム上の参照抗体の保持時間に基づいて正規化される場合、遅いクリアランスを有する抗体を主に含む相対保持時間領域が定義される。この領域は、１．７８未満のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として抗Ｈｅｒ３抗体が用いられる）および０．８７未満のヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として抗ｐＴａｕ抗体が用いられる）により定義される。

Ｉ．定義
本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０ページを参照されたい）は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３ページを参照されたい）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている）に使用される。

ノブ・イントゥー・ホール二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｎｕｍｂｅｒ １，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９６，ｐｐ．７３－７３（１）に記載されている。

ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において与えられる。

本発明を実行するために有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。

組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の生成誘導体を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。該修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、１つの細胞、複数のこのような細胞および当技術分野で公知のその等価物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはより多く」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。

「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を表す。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を表す。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を表す。

「決定する」という用語は、本明細書において使用される場合、測定するおよび分析するという用語も包含する。

「含む」という用語は、「からなる」という用語も含む。

本明細書における「抗体」という用語は広い意味において使用され、Ｆｃ領域を有する限り、モノクローナル全長抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

「多重特異性抗体」は、同じ抗原または２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）またはその組合せ（例えば、全長抗体＋追加のｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）として調製することができる。２つ、３つまたはより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている（例えば、ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１を参照）。

「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおける抗体の結合を表す。一実施形態では、結合は、抗体が表面に結合しており、かつ抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される結合アッセイにおいて決定される。結合することは、例えば、１０^－８Ｍまたはそれ未満、一部の実施形態では１０^－１３～１０^－８Ｍ、一部の実施形態では１０^－１３～１０^－９Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味する。「結合する」という用語はまた、「特異的に結合する」という用語を含む。

結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により調べることができる。結合の親和性は、用語ｋ_ａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合の速度定数）、ｋ_ｄ（解離定数）、およびＫ_Ｄ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）により定義される。

「緩衝物質」という用語は、溶液中にある場合に、例えば、酸性または塩基性物質の追加または放出に起因して、溶液のｐＨ値の変化を均すことができる物質を表す。

抗体の「クラス」とは、抗体の重鎖が持つ定常ドメインや定常領域の種類を指す。５つの主要なクラスの抗体、つまり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２に分かれてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「Ｆｃ融合ポリペプチド」という用語は、抗体Ｆｃ領域との結合ドメイン（例えば、単鎖抗体などの抗原結合ドメイン、または受容体のリガンドなどのポリペプチド）の融合物を表す。

「ヒト起源のＦｃ領域」という用語は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの少なくとも部分を含有するヒト起源の免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を表す。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。一実施形態では、Ｆｃ領域は配列番号０５のアミノ酸配列を有する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。Ｆｃ領域は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合的に連結した２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドから構成される。

「ＦｃＲｎ」という用語はヒト新生児Ｆｃ受容体を表す。ＦｃＲｎは、リソソーム分解経路からＩｇＧをサルベージするように機能して、低減したクリアランスおよび増加した半減期を結果としてもたらす。ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド：５０ｋＤａのクラスＩ主要組織適合複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）および１５ｋＤａのβ２－マイクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２－ＣＨ３部分に高い親和性で結合する。ＩｇＧおよびＦｃＲｎの間の相互作用は厳格にｐＨ依存性であり、１：２の化学量論において起こり、１つのＩｇＧがその２つの重鎖を介して２つのＦｃＲｎ分子に結合する（Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０（１９９３）１０７７－１０８３）。ＦｃＲｎ結合は酸性ｐＨ（ｐＨ＜６．５）のエンドソーム中で起こり、ＩｇＧが中性の細胞表面（約７．４のｐＨ）において放出される。相互作用のｐＨ感受性は、エンドソームの酸性環境内の受容体への結合による細胞内分解からの細胞中にピノサイトーシスされたＩｇＧのＦｃＲｎ媒介性保護を促す。ＦｃＲｎは次に、細胞表面へのＩｇＧの再利用、および細胞外の中性ｐＨ環境へのＦｃＲｎ－ＩｇＧ複合体の曝露の際の血流へのその後の放出を促す。

「Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合部分」という用語は、おおよそＥＵ位置２４３～ＥＵ位置２６１およびおおよそＥＵ位置２７５～ＥＵ位置２９３およびおおよそＥＵ位置３０２～ＥＵ位置３１９およびおおよそＥＵ位置３３６～ＥＵ位置３４８およびおおよそＥＵ位置３６７～ＥＵ位置３９３およびＥＵ位置４０８およびおおよそＥＵ位置４２４～ＥＵ位置４４０に伸長する抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングによる以下のアミノ酸残基のうちの１つまたはより多くが変更される：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９、およびＳ４４０（ＥＵナンバリング）。

「全長抗体」という用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を表す。全長抗体は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む２つの全長抗体軽鎖ならびに重鎖可変ドメイン、第１の定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の定常ドメインおよび第３の定常ドメインを含む２つの全長抗体重鎖を含む。全長抗体は、さらなるドメイン、例えば、全長抗体の鎖のうちの１つまたはより多くにコンジュゲートした追加のｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂなどを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、全長抗体という用語により包含される。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」および「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞、およびそのような細胞の子孫を含む細胞を指す。宿主細胞としては、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞および継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。元々形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫は、本明細書に含まれる。

「～に由来する」という用語は、アミノ酸配列が、少なくとも１つの位置において変更を導入することにより親アミノ酸配列に由来することを表す。そのように由来するアミノ酸配列は、少なくとも１つの対応する位置（抗体Ｆｃ領域についてのＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）において対応する親アミノ酸配列から異なる。一実施形態では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置における１～１５アミノ酸残基により異なる。一実施形態では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置における１～１０アミノ酸残基により異なる。一実施形態では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置における１～６アミノ酸残基により異なる。同様に、由来するアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列に対して高いアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は８０％またはより高いアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は９０％またはより高いアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は９５％またはより高いアミノ酸配列同一性を有する。

「ヒトＦｃ領域ポリペプチド」という用語は、「天然」または「野生型」ヒトＦｃ領域ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を表す。「バリアント（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸変更」のために「天然」または「野生型」ヒトＦｃ領域ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を表す。「ヒトＦｃ領域」は２つのヒトＦｃ領域ポリペプチドからなる。「バリアント（ヒト）Ｆｃ領域」は２つのＦｃ領域ポリペプチドからなり、それにより、両方がバリアント（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドであり得るか、または一方がヒトＦｃ領域ポリペプチドであり、かつ他方がバリアント（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドである。

一実施形態では、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、配列番号０５のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、または配列番号０６のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、または配列番号０７のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域ポリペプチド、または配列番号０８のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０５、または０６、または０７、または０８のＦｃ領域ポリペプチドに由来し、かつ配列番号０５、または０６、または０７、または０８のＦｃ領域ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、約１～約１０個のアミノ酸突然変異、および一実施形態では、約１～約５個のアミノ酸突然変異を含む／有する。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０５、または０６、または０７、または０８のヒトＦｃ領域ポリペプチドと少なくとも約８０％の相同性を有する。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０５、または０６、または０７、または０８のヒトＦｃ領域ポリペプチドと最低約９０％の相同性を有する。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０５、または０６、または０７、または０８のヒトＦｃ領域ポリペプチドと少なくとも約９５％の相同性を有する。

配列番号０５、または０６または０７、または０８のヒトＦｃ領域ポリペプチドに由来するＦｃ領域ポリペプチドは、含有されるアミノ酸変更によりさらに定義される。そのため、例えば、Ｐ３２９Ｇという用語は、配列番号０５、または０６、または０７、または０８のヒトＦｃ領域ポリペプチドと比べてアミノ酸位置３２９におけるプロリンのグリシンへの突然変異を有するＦｃ領域ポリペプチド由来ヒトＦｃ領域ポリペプチドを表す。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体の「ヒト化形態」とは、例えば非ヒト抗体のように、ヒト化を受けた抗体を指す。

「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。

「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が、染色体外に存在するか、または本来の染色***置とは異なる染色***置に存在する核酸分子が含まれる。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープを結合するが、例えば、天然の突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、このような変異型は概して、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、そのような方法および本明細書に記載されているモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない。

「ネイティブ抗体」とは、様々な構造を持つネイティブに存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブＩｇＧ抗体は、２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖がジスルフィド結合したものを含む、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラメリック糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端までの各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、これに３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端までの各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これに定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（カッパ）、λ（ラムダ）と呼ばれる２種類のいずれかに割り当てられてもよい。

用語「医薬製剤」とは、そこに含まれる有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、かつ、製剤が投与されるであろう被験者に許容できない毒性を有する追加成分を含まない製剤をいう。

「薬学的に許容され得る担体」とは、有効成分以外の医薬製剤中の成分であって、被験者に無毒であるものを指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるように、「プラスミド」という用語は、それが連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。用語には、自己複製核酸構造体としてのプラスミド、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたプラスミドが含まれる。ある種のプラスミドは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなプラスミドは、本明細書では「発現プラスミド」と称される。

「正の線形ｐＨ勾配」という用語は、低い（すなわち、より酸性の）ｐＨ値で開始してより高い（すなわち、より弱い酸性、中性またはアルカリ性の）ｐＨ値で終了するｐＨ勾配を表す。一実施形態では、正の線形ｐＨ勾配は約５．５のｐＨ値で開始して約８．８のｐＨ値で終了する。

「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製、発現、作製または単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化およびヒト）を表す。これは、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫもしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞からもしくはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現プラスミドを使用して発現された抗体を含む。そのような組換え抗体は、再構成された形態の可変および定常領域を有する。本明細書において報告されるような組換え抗体は、インビボ体細胞超突然変異に供することができる。そのため、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい。

「固相」は非流体物質を表し、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックなどの材料から作られた粒子（マイクロ粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどのゲル物質；ポリマー、金属、ガラス、および／またはセラミックから作られていてもよい、キャピラリー；ゼオライトおよび他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブまたは他の分光計試料容器が挙げられる。「固体支持体」は、分子と化学的に相互作用することが意図される少なくとも１つの部分をその表面上に含有するという点で、アッセイの固相成分は不活性固体表面から区別される。固相は、チップ、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートなどの静止した成分であってもよく、またはビーズおよびマイクロ粒子などの静止していない成分であってもよい。マイクロ粒子はまた、均質なアッセイフォーマット用の固体支持体として使用することができる。タンパク質および他の物質の非共有結合または共有結合の両方を可能とする様々なマイクロ粒子が使用されてもよい。そのような粒子としては、ポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリレート）などのポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドなどの金粒子；ならびにシリカ、ガラス、および金属酸化物粒子などのセラミック粒子が挙げられる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｎｅｗｓ＆Ｆｅａｔｕｒｅｓ，Ｍａｙ １（１９９８）３２２Ａ－３２７Ａ（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。一実施形態では、固体支持体はセファロースである。

「価数」との用語は、本出願で使用される場合、（抗体）分子内の特定数の結合部位の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」および「六価」との用語は、（抗体）分子中のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位および６個の結合部位の存在を示す。本明細書において報告されるような本明細書において報告されるような二重特異性抗体は、１つの好ましい実施形態では、「二価」である。

用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体のその抗原への結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、各ドメインが４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似の構造を有する（例えば、Ｋｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（２００７），ｐａｇｅ ９１を参照）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０－８８７；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４－６２８）を参照。

「バリアント」、「改変された抗体」、および「改変された融合ポリペプチド」という用語は、親分子のアミノ酸配列から異なるアミノ酸配列を有する分子を表す。典型的には、そのような分子は、１つまたはより多くの変更、挿入、または欠失を有する。一実施形態では、改変された抗体または改変された融合ポリペプチドは、天然に存在しないＦｃ領域の少なくとも部分を含むアミノ酸配列を含む。そのような分子は、親抗体または親融合ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する。一実施形態では、改変された抗体またはバリアント融合ポリペプチドは、親抗体または親融合ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％から１００％未満まで、特に約８０％から１００％未満まで、特に約８５％から１００％未満まで、特に約９０％から１００％未満まで、特に約９５％から１００％未満までのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、親抗体または親融合ポリペプチドおよび改変された抗体またはバリアント融合ポリペプチドは、１つ（単一）、２つまたは３つのアミノ酸残基により異なる。

ＩＩ．本発明の例示的な実施形態
同一のＦｃ領域を有する抗体のクリアランスは広範囲にわたる。また、各々のＦｖ領域の影響があり、すなわち、その生物物理学的特性が、急速にクリアリングされる抗体を緩徐にクリアリングされる抗体から区別する。

この理論により縛られないが、ＦｖおよびＦｃＲｎの直接的な、電荷媒介性の相互作用はｐＨ７．４におけるＦｃＲｎからの抗体の放出に不具合をもたらすという仮説が立てられる。

ピノサイトーシスおよびＦｃＲｎ結合評価の組合せを使用して抗体の薬物動態を特徴付けることができる。これはＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー（ｐＨ勾配溶出）およびヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（塩勾配溶出）の組合せにより実現することができる。

静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、プールされたヒトドナー血清（＞１０００のドナー）から単離されたＩｇＧのポリクローナルミックス）をヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上で分離したところ、広い保持時間範囲をカバーするいくつかの広いピークが生じた。同じ材料はＦｃＲｎカラム上で狭い溶出ピークを示し、その中に含有される抗体についてのＦｃＲｎに対する類似した結合親和性を示唆した（図４を参照）。

ヘパリンは、高度に負に荷電したグリコサミノグリカン（多糖）であり、内皮細胞を覆うグリコカリックス（ｇｌｙｃｏｃａｌｉｘ）の主な成分である。

最高（図４：２）および最低（図４：１）のヘパリン保持時間を有する画分をＦｃＲｎ野生型およびＦｃＲｎノックアウトマウスにおいて試験した。観察されたクリアランスを以下の表に示す：

より高いクリアランスが強いヘパリンバインダーについて見出され、両方の設定におけるより高いピノサイトーシス速度を指し示した。

内因性ｍＩｇＧと比較してｈｕＩｇＧに対する有意により高い親和性を有するマウスＦｃＲｎを発現するマウスモデルにおいて、ＦｃＲｎ再利用は薬物動態を支配する（この理論により縛られないが、患者におけるシナリオと比較して注射されたｈｕＩｇＧとの内因性ｍＩｇＧの競合の強い低減がある）。ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいてＦｃＲｎ再利用は薬物動態に寄与せず、あらゆるピノサイトーシス事象はピノサイトーシスされたＩｇＧの分解に繋がる。したがって、それにより決定されたクリアランスは、注射されたＩｇＧ試料のピノサイトーシス速度に比例して、有意により著しいクリアランスを結果としてもたらすはずである。これらのデータはヘパリンカラムの予測と良好に相関し、それにより、ピノサイトーシスを介する抗体薬物動態の予測因子としての妥当性に対して証拠を加える。

異なるフォーマットおよび異なる特異性を有する以下の３５の抗体を製造し、分析した。

野生型Ｆｃ領域を有する二価の単一特異性ＩｇＧ１抗体は、２つの抗体軽鎖（それぞれが軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む）ならびに２つの抗体重鎖（それぞれが重鎖可変ドメイン、ヒンジ領域および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む）を含む抗体であり、それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は配列番号０５のアミノ酸配列を有する。

ＫｉＨ－Ｆｃ領域を有する二価の二重特異性ＩｇＧ１抗体は、２つの抗体軽鎖（それぞれが軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む）ならびに２つの抗体重鎖（それぞれが重鎖可変ドメイン、ヒンジ領域および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む）を含む抗体であり、それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよもよく、それにより、重鎖のうちの１つはホール突然変異を含み、かつ各々の他の重鎖はノブ突然変異を含む。一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、それぞれ配列番号０９および１０のアミノ酸配列を有する。

二価の二重特異性抗体の重鎖のＦｃ領域中のＣＨ３ドメインは、例えば、ＷＯ９６／０２７０１１，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１においていくつかの例と共に詳細に記載される「ノブ－イントゥー－ホール」技術により変更され得る。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるために変更される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。

抗体重鎖のＣＨ３ドメイン中の突然変異Ｔ３６６Ｗは「ノブ突然変異」と表され、抗体重鎖のＣＨ３ドメイン中の突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは「ホール突然変異」と表される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。ＣＨ３ドメインの間の追加の鎖間ジスルフィドブリッジもまた使用することができ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）、これは例えば、「ノブ突然変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ突然変異を導入することにより、および「ホール突然変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ突然変異もしくはＳ３５４Ｃ突然変異を導入することにより、またはその逆により為される。

ＫｉＨ ＬＡＬＡＰＧ－Ｆｃ領域を有する二価の単一特異性ＩｇＧ１抗体サイトカイン融合物は、２つの抗体軽鎖（それぞれが軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む）ならびに２つの抗体重鎖（それぞれが重鎖可変ドメイン、ヒンジ領域および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む）を含む抗体であり、それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよもよく、それにより、重鎖のうちの１つはホール突然変異を含み、かつ各々の他の重鎖はノブ突然変異を含み、それにより、両方の重鎖はアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇをさらに含む。一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、それぞれ配列番号１８および１９のアミノ酸配列を有する。

ＫｉＨ－Ｆｃ領域を有する二価の二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂは、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖、ならびに、第２の軽鎖および第２の重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いにより置き換えられている、第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖、または
ｂ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖、ならびに、第２の軽鎖および第２の重鎖の定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いにより置き換えられている、第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖
を含む抗体であり、
それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよく、それにより、重鎖のうちの１つはホール突然変異を含み、かつ各々の他の重鎖はノブ突然変異を含む。一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、それぞれ配列番号０９および１０のアミノ酸配列を有する。

ＫｉＨ－ＬＡＬＡＰＧ－Ｆｃ領域を有する２：１ヘテロ二量体Ｔ細胞二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ断片、
ｂ）Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いにより置き換えられている、第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ断片、
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ断片、ならびに
ｄ）第１および第２の重鎖Ｆｃ領域から構成されるＦｃ領域
を含む抗体であり、
（ｉｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、かつｂ）の第２のＦａｂ分子およびｃ）の第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）の重鎖Ｆｃ領域のうちの１つのＮ末端にそれぞれ融合しており、
それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖Ｆｃ領域中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよく、それにより、重鎖Ｆｃ領域のうちの１つはホール突然変異を含み、かつ各々の他の重鎖Ｆｃ領域はノブ突然変異を含み、それにより、両方の重鎖Ｆｃ領域はアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇをさらに含む。一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、それぞれ配列番号１８および１９のアミノ酸配列を有する。

ＫｉＨ－ＬＡＬＡＰＧ－Ｆｃ領域を有する三価の二重特異性ＩｇＧ１－Ｆａｂ融合物は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し（かつ２つのＦａｂ断片を含む）抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の１つの追加のＦａｂ断片
を含み、追加のＦａｂ断片は、ａ）の重鎖のうちの１つのＣ末端にペプチド性リンカーを介して融合しており、
追加のＦａｂ断片においていずれかの可変ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置き換えられており、かつ／または定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置き換えられており、
それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよく、それにより、重鎖のうちの１つはホール突然変異を含み、かつ各々の他の重鎖はノブ突然変異を含み、それにより、両方の重鎖はアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇをさらに含む。一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、それぞれ配列番号１８および１９のアミノ酸配列を有する。

ＬＡＬＡＰＧ－Ｆｃ領域を有するＦｃ領域－サイトカイン融合物は、２つの抗体重鎖Ｆｃ領域断片（それぞれがヒンジ領域ならびに重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の少なくとも断片を含む）を含む抗体Ｆｃ領域融合物であり、それにより、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、それにより、Ｆｃ領域Ｃ末端アミノ酸残基ＫまたはＧＫは、２つの抗体重鎖Ｆｃ領域断片中に互いに独立して存在してもよく、または存在しなくてもよく、それにより、両方の抗体重鎖Ｆｃ領域断片はアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む。一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。

日内、個人内および実験室内ばらつきを均すためにアフィニティーカラムのそれぞれ上の参照抗体に対して保持時間を正規化する。

ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムについて、配列番号０１の重鎖および配列番号０２の軽鎖を有する抗ｐＴａｕ抗体を選択した。この抗体は、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上で相対的に長い保持時間を示し、堅牢な相対保持時間の算出を結果としてもたらす。

ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムについて、配列番号０３の重鎖および配列番号０４の軽鎖を有する抗Ｈｅｒ ３抗体の酸化されたバリアントを含む調製物を選択した。この抗体は、Ｓｔｒａｃｋｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（ｍＡｂｓ ６（２０１４）１２２９－１２４２）において使用された抗体と同等のＡＵＣ分布を有するので選択した。３５の抗体について、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の保持時間を決定した。追加的に、単回用量薬物動態をカニクイザルにおいて決定した。結果を以下の表（以前と同じ抗体配列）に提示する。

クリアランスを以下のようにランク付けする：
急速：＞１２ｍＬ／ｋｇ／日、
ボーダーライン：８～１２ｍＬ／ｋｇ／日、
許容可能：２．５≦Ｘ＜８ｍＬ／ｋｇ／日、
非常に良好：＜ ２．５ｍＬ／ｋｇ／日。

保持時間および薬物動態挙動の相関を図２に示す。２つのアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間および薬物動態挙動の間の相関が存在することが分かる。遅いクリアランスを有する抗体を主に含む領域は、１．７８未満のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として抗Ｈｅｒ３抗体が用いられる）および０．８７未満のヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として抗ｐＴａｕ抗体が用いられる）により定義されることが見出された。マークした閾値と共に各々の相関を図３に示す。

一実施形態では、参照抗体は、酸化された抗体調製物である。一実施形態では、酸化された抗体調製物は、重鎖ＣＨ２ドメイン中の位置２５２のメチオニン残基に関して非酸化形態、一酸化形態（位置２５２の２つのメチオニンのうちの１つのみが酸化されている）および二酸化形態（位置２５２の両方のメチオニン残基が酸化されている）（Ｋａｂａｔによるナンバリング）の抗体を含む調製物である。一実施形態では、相対保持時間は以下の式：

（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}＝抗体の相対保持時間；ｔ_ｉ＝抗体の保持時間）に基づいて算出される。一実施形態では、第１の参照抗体は、配列番号０３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号０４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗Ｈｅｒ３抗体である。一実施形態では、第１の閾値は２である。一実施形態では、第１の閾値は１．８である。一実施形態では、第１の閾値は１．７８である。

一実施形態では、第２の参照抗体は、配列番号０１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号０２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗ｐＴａｕ抗体である。一実施形態では、第２の閾値は１である。一実施形態では、第２の閾値は０．８である。一実施形態では、第２の閾値は０．７８である。

一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）の固定化された非共有結合性複合体が、正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおいてアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用され、
新生児Ｆｃ受容体およびベータ－２－マイクログロブリンの非共有結合性複合体はクロマトグラフィー材料に結合しており、かつ非共有結合性複合体は特異的結合ペアを介して固相にコンジュゲートしており、
ｐＨ勾配は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値へのものであり、それにより、第１のｐＨ値はｐＨ３．５からｐＨ６．４へのものであり、かつ第２のｐＨ値はｐＨ７．４からｐＨ９．５へのものであり、かつ
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）の非共有結合性複合体は一ビオチン化されており、かつ固相はストレプトアビジンを用いて誘導体化されている。

一実施形態では、ｐＨ勾配は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値へのものであり、それにより、第１のｐＨ値はｐＨ５．５であり、かつ第２のｐＨ値はｐＨ８．８である。

一実施形態では、抗体は２つの抗原に結合している。

一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーは、ＦｃＲｎベータ－２－マイクログロブリン複合体にコンジュゲートしたストレプトアビジンセファロース（３ｍｇの複合体／１ｍｌのセファロース）を含み、かつ約５０ｍｍの長さおよび約４．６ｍｍの内径を有するＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて行われる。一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーは以下のように行われる：ｉ）ｐＨ５．５に調整された１４０ｍＭのＮａＣｌを補充された２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液を用いて平衡化されたＦｃＲｎアフィニティーカラムに３０μｇの試料を適用する；ｉｉ）ｐＨ５．５に調整された１４０ｍＭのＮａＣｌを補充された（ｖ／ｖで）８０％の２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液およびｐＨ８．８に調整された１４０ｍＭのＮａＣｌを含む２０％の２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含む緩衝液を用いて０．５ｍＬ／分の流速においてカラムを１０分間洗浄する；ｉｉｉ）ステップｉｉ）の緩衝液から、ｐＨ５．５に調整された１４０ｍＭのＮａＣｌを補充された（ｖ／ｖで）３０％の２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液およびｐＨ８．８に調整された１４０ｍＭのＮａＣｌを含む７０％の２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含む緩衝液への線形勾配を用いて０．５ｍＬ／分の流速において溶出を行い、保持時間を測定する。

一実施形態では、酸化された抗Ｈｅｒ３抗体調製物は、０．０２％の過酸化水素溶液との室温で１８時間の抗Ｈｅｒ３抗体のインキュベーションにより得られる。

一実施形態では、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーは、ヒドロキシル化メタクリル酸ポリマー上の硫酸化グリコサミノグリカンにコンジュゲートしたヘパリンを含み、かつ約５０ｍｍの長さおよび約５ｍｍの内径を有するヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて行われる。一実施形態では、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーは以下のように行われる：ｉ）室温でｐＨ７．４に調整された５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液を用いて予備平衡化されたヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムに低塩緩衝液（≦２５ｍＭのイオン強度）中の２０～５０μｇのタンパク質試料を適用する；ｉｉ）１０００ｍＭのＮａＣｌを補充され、ｐＨ７．４に調整された０～１００％の５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液の線形勾配を用いて０．８ｍｇ／ｍＬの流速において３２分にわたり溶出を行う。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎと同じ種からのものである。

本明細書において使用されるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムは、マトリックスおよびマトリックス結合クロマトグラフィー官能基を含み、マトリックス結合クロマトグラフィー官能基は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリンの非共有結合性複合体を含む。

一実施形態では、本明細書においてＦｃＲｎは、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、ヒツジＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ブタＦｃＲｎ、ミニブタＦｃＲｎ、およびウサギＦｃＲｎから選択される。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎと同じ種からのものである。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎとは異なる種からのものである。

一実施形態では、抗体は、全長抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂまたはドメイン交換抗体、２：１ヘテロ二量体Ｔ細胞二重特異性抗体、抗体－サイトカイン融合ポリペプチド、Ｆｃ領域－サイトカイン融合ポリペプチド、および抗体－Ｆａｂ融合ポリペプチドからなる群から選択される。

一実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ノブ－イントゥー－ホール突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ならびにこれらの組合せからなる群から選択されるＦｃ領域を含む。

一実施形態では、抗体フォーマットは、全長抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：１ヘテロ二量体Ｔ細胞二重特異性抗体、および１、２、または３つの追加のＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ分子に直接的にまたはペプチド性リンカーを介して融合した以上のいずれかからなる群から選択される。

一実施形態では、抗体フォーマットは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ノブ－イントゥー－ホール突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ならびにこれらの組合せからなる群から選択されるＦｃ領域を含む。

一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。

一実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体はキメラ抗体である。

一般に、Ｃ末端Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ（配列番号３２）を有するＦｃＲｎの可溶性細胞外ドメイン（ヒトＦｃＲｎについて配列番号３１）を哺乳動物細胞中でβ_２－マイクログロブリン（ヒトベータ－２－マイクログロブリンについて配列番号３３）と共発現させた。非共有結合性ＦｃＲｎ－マイクログロブリン複合体をビオチン化し、ストレプトアビジン誘導体化セファロースにロードした。

電荷およびヘパリン／ＦｃＲｎ結合およびそれにより薬物動態の関係性をさらに解明するために、抗体Ｆｖにおいて通常見られる電荷および疎水性の生物物理学的空間をカバーする抗体番号５のバリアントを合成した。

正に荷電したパッチを持つバリアントは強いヘパリンおよびＦｃＲｎカラム保持（０．５およびより高いＦｃＲｎカラムの相対保持ならびに０．８またはより高いヘパリンカラム上の相対保持）を示し、これは急速なクリアランスを予測する。

負に荷電したパッチを持つバリアントは弱いヘパリンおよびＦｃＲｎカラム保持（０．２５およびより低いＦｃＲｎカラムの相対保持ならびに０．６またはより低いヘパリンカラム上の相対保持）を示し、これは遅いクリアランスを予測する。

負および正に荷電したパッチを組み合わせた場合、結果としてもたらされる抗体バリアントは、正に荷電したパッチのみを持っているかのように挙動する。

野生型抗体番号５およびその４つのバリアントについてＦｃＲｎノックアウトマウスにおいてクリアランスを決定した（図５および図６）。正に荷電したパッチを持つ３つ全ての試験されたバリアントは、ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいて野生型抗体番号５と比較して非常に高いクリアランスを示し、カラム保持と良好に相関する。負に荷電したパッチを持つバリアントは、このマウスモデルにおいて有意に低減したクリアランスを示し、これもまたカラム保持と良好に相関する。

クリアランスに対する「パッチネス」（ｐａｔｃｈｉｎｅｓｓ）の効果（すなわち、均一な電荷分布とは対照的に電荷パッチを形成する表面電荷の濃縮の効果）を決定するために抗体番号５の５つのバリアントを生成し、それにおいてＦａｂ表面上の電荷の分布を「均一」から「パッチー」（ｐａｔｃｈｙ）へと増加的に変化させながら正および負電荷の総数を不変のままとした。

正および負荷電パッチの両方を作製したが、ヘパリンカラム保持はパッチネスの増加と共に増加した。これは、上記で既に見たように負に荷電したパッチと比較して正に荷電したパッチのより大きいまたは支配的でさえある効果を指し示す。これらのバリアントの算出されたｐＩはほぼ不変であり、最もパッチーなバリアントのＦｃＲｎノックアウトマウスにおけるクリアランスは、最も均一な電荷分布を有するものよりも有意に高い（ほぼ２倍；図７）。この理論により縛られないが、正に荷電したパッチの「パッチネス」またはむしろ影響は、薬物動態のかなり広く、したがって不良な予測因子であるｐＩと比較してクリアランスを決定することをこれらのデータは示唆する。

永久的に正に荷電したアミノ酸リジンおよびアルギニンをｐＨ依存的に荷電性のヒスチジンで置き換える効果を決定するために全てのＨＣ Ｆｖの正に荷電したアミノ酸残基をヒスチジンで置き換えた抗体番号５のバリアント（計７つの変化）を生成した。これを野生型抗体番号５とヘパリンおよびＦｃＲｎカラムの相対保持時間およびインビボ薬物動態により比較した。

この理論により縛られないが、中性ｐＨの血清中でヒスチジンの電荷は大抵は中性であり、したがって、負に荷電したグリコカリックスへの結合およびその後にピノサイトーシス速度を低減すると考えられる。酸性のエンドソーム内でヒスチジンは大抵は正荷電であり、したがってＦｖ－ＦｃＲｎアビディティを介してＦｃＲｎへの結合に寄与する。再利用されると、ヒスチジン突然変異ＩｇＧは細胞表面に運ばれ、そこでＦｃＲｎからの効率的な解離が良好な薬物動態のために要求される。血清の中性ｐＨに今や曝露されたヒスチジンは脱プロトン化され、したがってＦｃＲｎとのアビディティ相互作用を弱めて、血清への放出の向上を可能とする。

ヒスチジン突然変異体はヘパリン保持の低減を示した一方、ＦｃＲｎ保持はほとんど不変のままである（図８）。この理論により縛られないが、これはｐＨ依存性を反映する。

インビボにおいて、ヒスチジン突然変異体のクリアランスは、ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいて野生型抗体と比較して有意に低減される（図９および図１０）。

一実施形態では、改変された抗体は、その（溶媒曝露された）表面上に少なくとも１つの追加の負に荷電したパッチを有する。

抗体の（溶媒曝露された）表面上の荷電したパッチを決定するために異なる方法およびツールが当業者に公知である。異なるベンダーまたは学術的グループにより提供されるツールがある。例えば、本明細書においてソフトウェアスイートＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ベンダー：Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に実装されたようなソフトウェアＣＨＡＲＭＭおよびＤｅｌｐｈｉを使用したＸ線構造または相同性モデルに基づくインシリコ算出方法、続いて酸性および塩基性アミノ酸側鎖のｐＨプロトン化ならびに３Ｄ電荷分布の算出が使用された。

一実施形態では、改変された抗体は、その（溶媒曝露された）表面上に少なくとも１つの追加の正に荷電したパッチを有する。

一実施形態では、改変された抗体は、親抗体と同じ（表面）正味電荷を有する。

一実施形態では、（永久的に）負に荷電したアミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。

一実施形態では、（永久的に）正に荷電したアミノ酸残基は、アルギニンおよびリジンからなる群から選択される。

一実施形態では、ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基はヒスチジンである。

一実施形態では、永久的に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ６～ｐＨ８のｐＨ範囲内で同じ（正味）電荷を有する。

一実施形態では、ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ６において第１の（正味）電荷およびｐＨ８において反対の第２の（正味）電荷を有する。

ＦｃＲｎ－ｋｏ（ノックアウト）およびｈＦｃＲｎ－ｔｇ（トランスジェニック）マウスの両方において、正に荷電したパッチを含有するｍＡｂは急速なクリアランスを示した。ＦｃＲｎマウスにおいて、より多くの負電荷パッチ、均一に分布した電荷またはＡｒｇもしくはＬｙｓ（中性ｐＨにおいてさえ正に荷電した残基）の代わりにＨｉｓを持つように操作されたｍＡｂは、野生型ｍＡｂと比較してより遅いクリアランスを示した（赤）。より多くの正電荷パッチを持つように操作されたｍＡｂは、野生型ｍＡｂと比較してより急速なクリアランスを示した（青）（図１１）。

クリアランスの比（ｋｏ／ｔｇマウス）を算出することによりＦｃＲｎ再利用効率についてのインビボメトリックが見出された。ＦｃＲｎ－ｋｏマウスにおけるクリアランス（電荷パッチおよびピノサイトーシス速度と相関する）に対してこの比をプロットした時に、様々なＩｇＧの間の大きい差異を同定することができる。ｈＦｃＲｎ－ｔｇマウスに対するＦｃＲｎ－ｋｏマウスにおけるクリアランスの比に対してＦｃＲｎ－ｋｏマウスにおけるクリアランスをプロットした時に、ベル型曲線が得られる（図１２）。

ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合は、２つのＩｇＧドメイン：Ｆｃドメイン上のカノニカルな特異的ＦｃＲｎ結合部位およびＦｖドメインを介する非特異的結合（それにより、アビディティを生成する）を介して起こる。この理論により縛られないが、図１２の左側の分子（低いＦｃＲｎ再利用効率および低いピノサイトーシス速度）は、ｐＨ６においてＦｖドメイン上の正電荷パッチの非存在に起因してＦｃＲｎへの結合の低減を示し、それにより、再利用エンドソームへと選別される速度の低減を有し、リソソーム中で分解されるという仮説が立てられる。対照的に図１２の右側の分子は、生理的ｐＨにおいてＦｃＲｎとの強いＦｖ電荷媒介性の相互作用に起因して再利用効率の低減を示し、したがって細胞表面におけるより低い解離速度を有する。高い再利用効率を有する抗体は、図１２に示されるように曲線のピーク中に見出され得る。

そのため、ＦｃＲｎ親和性を増加させるためのＦｃ領域突然変異の導入は、ＦｃＲｎ再利用効率を上昇させることにより抗体の薬物動態特性を向上させるはずであり（ｐＨ６．０において重要な、増加した結合）、抗体を図１２の左側からピーク領域にシフトさせるはずである。

親抗体の異なるバリアントを生成し、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（ｈＦｃＲｎ Ｔｇ３２）においてインビボで特徴付けた。

選択（Ｘ＝インビボＰＫ）

上記の表に含有されるデータを、アライメントされたプロットにおいて図１３に提示し、それにおいてｙ軸に「Ｆｃ突然変異バリアントのｈＦｃＲｎ＋／＋Ｔｇ３２マウスにおけるクリアランス」対「対応する親（＝野生型）抗体のｈＦｃＲｎ＋／＋Ｔｇ３２マウスにおけるクリアランス」の比およびＸ軸に「Ｆｃ突然変異バリアントのＦｃＲｎカラム相対保持」および「対応する親（＝野生型）抗体のＦｃＲｎカラム相対保持」の差異を描写している。

ほとんどのバリアントはクリアランスの低減（１より低いＹ軸の値）を示したことが分かる。

突然変異Ｙ４３６ＡはＦｃＲｎ結合の低減を結果としてもたらし、そのため予期されるように、クリアランスは増加する（１より高いＹ軸の値）。

突然変異Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４ＦはｐＨ７．４において劇的に増加したＦｃＲｎ結合（５またはより高いＸ軸の値、すなわち、高度に上昇したｐＨ値におけるＦｃＲｎからの解離）を結果としてもたらし、これは、予期されるように、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎからの抗体の解離に不具合がもたらされ、それにより、ＦｃＲｎ媒介性の再利用が低減されるので、クリアランスの増加（１より高いＹ軸の値）を結果としてもたらす。

相対保持時間の変化のための好ましい「ウィンドウ」を定義できることがデータから分かる。このウィンドウは、各々の親抗体と比べたＦｃＲｎ保持時間の１分より長くから５分より短くまでの変化の時間範囲（ｒｉｍｅ ｒａｎｇｅ）に及ぶ。「ウィンドウ」におけるＦｃＲｎ結合の改変は、全てのバリアントについてクリアランスの低減およびそれにより薬物動態特性の向上を結果としてもたらす。

バリアントの７５％（８つのうちの６つ）について、３分より長くから４分より短くまでのよりいっそう狭い「ウィンドウ」を定義することができる。

そのため、本発明の一態様は、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供する方法であって、
ａ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける（親）抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
ｃ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおいて改変された抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
ｄ）（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より短いおよび約５分より長い場合にステップｂ）を繰り返すステップであって、それにより、相対保持時間の変化が１分より短い場合にはヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域のさらに増加した結合を結果としてもたらす突然変異が選択され、または相対保持時間の変化が５分より長い場合にはヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域のより小さく増加した結合を結果としてもたらす突然変異が選択される、ステップと、
ｅ）（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より長いかつ約２分より短い場合に改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
を含む、方法である。

一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーは、
－ ビオチン－ストレプトアビジン非共有結合性相互作用を介してそれにコンジュゲートしたヒトＦｃＲｎ（１つの好ましい実施形態では、マトリックス１ｇ当たり１ｍｇ～５ｍｇのＦｃＲｎ、好ましくはマトリックス１ｇ当たり２．５ｍｇのＦｃＲｎ）を有する約１ｍＬのストレプトアビジンアガロースマトリックスを含むＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムが、８０体積％の緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）および２０体積％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８）を用いて０．５ｍＬ／分の流速および２５℃のカラム温度において平衡化され、
－ 計３０μｇの抗体が８０体積％の緩衝液Ａおよび２０体積％の緩衝液Ｂの同じ混合物中に調製さて、平衡化されたカラムに注入され、
－ 注入の１０分後に、７０分にわたる２０体積％から１００体積％への緩衝液Ｂの線形勾配が開始され、
－ 必要に応じて１００体積％の緩衝液Ｂが１０分間保持された後にカラムが８０体積％の緩衝液Ａおよび２０体積％の緩衝液Ｂを用いて再平衡化され、
それにより、検出が、２８０ｎｍに設定されたＵＶ検出器を用いて行われ、
それにより、（比較可能な異なる実施および異なる緩衝液およびカラムロットからの結果を作成するため、ならびにわずかな保持時間のドリフトを補償するために、標準試料が各シークエンスの開始および終了時および１０回目毎の実施後に測定される）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間が以下の式：

に従って算出され、これは、図１によるピーク定義（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：図１による部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体のピーク２の保持時間；ｔ_ピーク３：図１による抗Ｈｅｒ３抗体のピーク３の保持時間）に基づく。

一実施形態では、ＦｃＲｎはヒトベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有結合性複合体である。

一実施形態では、方法は、ステップｂ）として、
ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
ならびに
－正に荷電したパッチのサイズを低減すること、
－正に荷電したパッチのサイズを低減し、かつ負に荷電したパッチのサイズを増加させること、
－Ｆｖにおいて電荷の全体的な分布をより均一にすることにより
抗体のＦｖを改変するステップと、
を含む。

一実施形態では、Ｆｖ断片中の電荷分布を、
ｉ）少なくとも１つの（永久的に）負に荷電したもしくは荷電していないアミノ酸残基を（永久的に）正に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
ｉｉ）少なくとも１つの（永久的に）正に荷電したもしくは荷電していないアミノ酸残基を（永久的に）負に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
ｉｉｉ）少なくとも１つの（永久的に）荷電したアミノ酸残基を反対の電荷を有するアミノ酸残基に変化させること、または
ｉｖ）少なくとも１つの永久的に荷電したアミノ酸残基をｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
ｖ）ｉ）～ｉｖ）の組合せ
により変化させる。

ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上およびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の保持時間が各々のカラム上の参照抗体の保持時間に基づいて正規化される場合、遅いクリアランスを有する抗体を主に含む相対保持時間領域が定義される。この領域は、１．７８未満のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として酸化された（Ｈ２Ｏ２処理された）抗Ｈｅｒ３抗体調製物が用いられる）および０．８７未満のヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間（参照抗体として抗ｐＴａｕ抗体が用いられる）により定義される。

一実施形態では、方法は、
ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
ならびに
ｆ）改変された抗体が、
ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短い、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短い、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
を含む。

一実施形態では、方法は、
ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
ならびに
ｆ）改変された抗体が、
ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より長いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より長いヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
を含む。

一実施形態では、方法は、
ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
ならびに
ｆ）改変された抗体が、
ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短いもしくは長いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短いもしくは長いヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方（ここで、ｉ）において相対保持時間はより短く、ｉｉ）においてそれはより長い、またはその逆である）
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと
を含む。

抗体の（溶媒曝露された）表面上の荷電したパッチを決定するために異なる方法およびツールが当業者に公知である。異なるベンダーまたは学術的グループにより提供されるツールがある。例えば、本明細書においてソフトウェアスイートＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ベンダー：Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に実装されたようなソフトウェアＣＨＡＲＭＭおよびＤｅｌｐｈｉを使用したＸ線構造または相同性モデルに基づくインシリコ算出方法、続いて酸性および塩基性アミノ酸側鎖のｐＨプロトン化ならびに３Ｄ電荷分布の算出が使用された。

一実施形態では、改変された抗体は、その（溶媒曝露された）表面上に少なくとも１つの追加の負に荷電したパッチを有する。

一実施形態では、改変された抗体は、親抗体と同じ（表面）正味電荷を有する。

一実施形態では、（永久的に）負に荷電したアミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。

一実施形態では、（永久的に）正に荷電したアミノ酸残基は、アルギニンおよびリジンからなる群から選択される。

一実施形態では、ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基はヒスチジンである。

一実施形態では、永久的に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ６～ｐＨ８のｐＨ範囲内で同じ（正味）電荷を有する。

一実施形態では、ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ６において第１の（正味）電荷およびｐＨ８において反対の第２の（正味）電荷を有する。

一実施形態では、標準試料は、重鎖ＣＨ２ドメイン中の位置２５２のメチオニン残基に関して非酸化形態、一酸化形態（位置２５２の２つのメチオニンのうちの１つのみが酸化されている）および二酸化形態（位置２５２の両方のメチオニン残基が酸化されている）（Ｋａｂａｔによるナンバリング）の参照抗体を含む酸化された抗体調製物である。一実施形態では、相対保持時間は以下の式：

（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}＝抗体の相対保持時間；ｔ_ｉ＝抗体の保持時間）に基づいて算出される。一実施形態では、第１の参照抗体は、配列番号０３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号０４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗Ｈｅｒ３抗体である。

一実施形態では、ステップｆ）における第１の閾値は２である。一実施形態では、第１の閾値は１．８である。一実施形態では、第１の閾値は１．７８である。

一実施形態では、ステップｆ）における第２の参照抗体は、配列番号０１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号０２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗ｐＴａｕ抗体である。一実施形態では、第２の閾値は１である。一実施形態では、第２の閾値は０．８である。一実施形態では、第２の閾値は０．７８である。

一実施形態では、ステップｆ）は、
改変された抗体が、
ｉ）配列番号０３および０４の酸化された抗Ｈｅｒ３抗体の調製物のピーク２および３の間の保持時間差異の１．７８倍未満であるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、ならびに
ｉｉ）配列番号０１および０２の抗ｐＴａｕ抗体の保持時間の０．８７倍未満であるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間
を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップである。

全ての方法の一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間は以下の式：

に従って算出され、これは、図１によるピーク定義（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：図１による部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体のピーク２の保持時間；ｔ_ピーク３：図１による抗Ｈｅｒ３抗体のピーク３の保持時間）に基づく。

全ての方法の一実施形態では、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間は以下の式：

（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ｐＴａｕ：抗ｐＴａｕ抗体ピークの保持時間）に従って算出される。

一実施形態では、正の線形ｐＨ勾配を用いるステップｅ）のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおいて、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）の固定化された非共有結合性複合体がアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用され、
新生児Ｆｃ受容体およびベータ－２－マイクログロブリンの非共有結合性複合体はクロマトグラフィー材料に結合しており、かつ非共有結合性複合体は特異的結合ペアを介して固相にコンジュゲートしており、
ｐＨ勾配は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値へのものであり、それにより、第１のｐＨ値はｐＨ３．５からｐＨ６．４へのものであり、かつ第２のｐＨ値はｐＨ７．４からｐＨ９．５へのものであり、かつ
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびベータ－２－マイクログロブリン（ｂ２ｍ）の非共有結合性複合体は一ビオチン化されており、かつ固相はストレプトアビジンを用いて誘導体化されている。

一実施形態では、ステップｅ）のｐＨ勾配は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値へのものであり、それにより、第１のｐＨ値はｐＨ５．５であり、かつ第２のｐＨ値はｐＨ８．８である。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎと同じ種からのものである。

一実施形態では、ＦｃＲｎは、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、ヒツジＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ブタＦｃＲｎ、ミニブタＦｃＲｎ、およびウサギＦｃＲｎから選択される。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎと同じ種からのものである。

一実施形態では、ベータ－２－マイクログロブリンはＦｃＲｎとは異なる種からのものである。

一般に、Ｃ末端Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ（配列番号３２）を有するＦｃＲｎの可溶性細胞外ドメイン（ヒトＦｃＲｎについて配列番号３１）を哺乳動物細胞中でβ_２－マイクログロブリン（ヒトベータ－２－マイクログロブリンについて配列番号３３）と共発現させた。非共有結合性ＦｃＲｎ－マイクログロブリン複合体をビオチン化し、ストレプトアビジン誘導体化セファロースにロードした。

一実施形態では、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー用の参照抗体は、配列番号０３（重鎖）および配列番号０４（軽鎖）を有する抗ＨＥＲ３抗体である。

一実施形態では、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー用の参照抗体は、配列番号０１（重鎖）および配列番号０２（軽鎖）を有する抗ｐＴａｕ抗体である。

一実施形態では、抗体は、融合ポリペプチドの単一特異性抗体もしくは抗体断片、または融合ポリペプチドの二重特異性抗体もしくは抗体断片、または融合ポリペプチドの三重特異性抗体もしくは抗体断片、または融合ポリペプチドの四重特異性抗体もしくは抗体断片である。

一実施形態では、抗体はクラスＩｇＧの抗体である。一実施形態では、抗体はサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体である。一実施形態では、抗体はサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４の抗体である。

ＩＩＩ．新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、インビボでのＩｇＧクラスの抗体の代謝運命にとって重要である。ＦｃＲｎは、リソソーム分解経路から野生型ＩｇＧをサルベージするように機能して、低減したクリアランスおよび増加した半減期を結果としてもたらす。それは、２つのポリペプチド：５０ｋＤａのクラスＩ主要組織適合複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）および１５ｋＤａのβ２－マイクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、クラスＩｇＧの抗体のＦｃ領域のＣＨ２－ＣＨ３部分に高い親和性で結合する。クラスＩｇＧの抗体およびＦｃＲｎの間の相互作用はｐＨ依存性であり、１：２の化学量論で起こり、すなわち、１つのＩｇＧ抗体分子はその２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを介して２つのＦｃＲｎ分子と相互作用することができる（例えば、Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０（１９９３）１０７７－１０８３を参照）。

そのため、ＩｇＧインビトロＦｃＲｎ結合特性／特徴は、血液循環中でのそのインビボ薬物動態特性の指標となる。

ＦｃＲｎおよびＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域の間の相互作用において重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの異なるアミノ酸残基が参加している。ＦｃＲｎと相互作用するアミノ酸残基は、おおよそＥＵ位置２４３～ＥＵ位置２６１、おおよそＥＵ位置２７５～ＥＵ位置２９３、おおよそＥＵ位置３０２～ＥＵ位置３１９、おおよそＥＵ位置３３６～ＥＵ位置３４８、おおよそＥＵ位置３６７～ＥＵ位置３９３、ＥＵ位置４０８、およびおおよそＥＵ位置４２４～ＥＵ位置４４０に位置する。より具体的には、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングによる以下のアミノ酸残基はＦｃ領域およびＦｃＲｎの間の相互作用に関与する：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５ Ｐ、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９、およびＳ４４０。

部位特異的突然変異誘発研究は、ＦｃＲｎに対するＩｇＧのＦｃ領域中の不可欠な結合部位はヒスチジン３１０、ヒスチジン４３５、およびイソロイシン２５３、ならびにより小さい程度でヒスチジン４３３およびチロシン４３６であることを証明した（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９－２８２５；Ｒａｇｈａｖａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（１９９５）１４６４９－１４６５７；Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１９９７）２２１１－２２１７を参照）。

ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を増加させる方法は、様々なアミノ酸残基においてＩｇＧを突然変異させることにより行われてきた：スレオニン２５０、メチオニン２５２、セリン２５４、スレオニン２５６、スレオニン３０７、グルタミン酸３８０、メチオニン４２８、ヒスチジン４３３、およびアスパラギン４３４（Ｋｕｏ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（２０１０）７７７－７８９を参照）。

一部の場合には、血液循環中で低減した半減期を有する抗体が所望される。例えば、硝子体内適用のための薬物は、患者の目において長い半減期および血液循環中で短い半減期を有するべきである。そのような抗体はまた、例えば目における、疾患部位への曝露の増加という利点を有する。

ＦｃＲｎ結合およびそれと共に血液循環中での半減期に影響を及ぼす異なる突然変異が公知である。マウスＦｃ領域マウスＦｃＲｎ相互作用に決定的なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発により識別されている（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１－５１８０を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、およびＨ４３５（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）が、相互作用に関与する（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３－２５３６；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３－１００２；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２－５４８）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、およびＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に決定的であることが発見された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９－２８５５）。残基Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅは、タンパク質－タンパク質相互作用研究によりＦｃＲｎ結合を向上させることがＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．により記載されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４－２３５２４）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、およびＹ４３６が相互作用に決定的であることが示されている（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３－１００２；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）において、残基２４８～２５９、および３０１～３１７、および３７６～３８２、および４２４～４３７の様々な変異が報告され、調査されている。例示的な突然変異およびＦｃＲｎ結合に対するそれらの影響を以下の表に列記する。

表

ＦｃＲｎカラム上の相対保持時間の算出のためのピーク定義。 ヘパリンカラム相対保持に対してプロットされたＦｃＲｎ相対保持。バツ印：クリアランス＞１２ｍＬ／ｋｇ／日（「急速」）；黒四角：クリアランス８～１２ｍＬ／ｋｇ／日（「ボーダーライン」）；黒丸：２．５ｍＬ／ｋｇ／日より高いが８ｍＬ／ｋｇ／日より低いクリアランス；黒星：２．５ｍＬ／ｋｇ／日またはそれ未満のクリアランス。 ヘパリンカラム相対保持に対してプロットされたＦｃＲｎ相対保持。バツ印：クリアランス＞１２ｍＬ／ｋｇ／日（「急速」）；黒四角：クリアランス８～１２ｍＬ／ｋｇ／日（「ボーダーライン」）；黒丸：２．５ｍＬ／ｋｇ／日より高いが８ｍＬ／ｋｇ／日より低いクリアランス；黒星：２．５ｍＬ／ｋｇ／日またはそれ未満のクリアランス；垂直線は、治療的に好適なクリアランスのための保持時間範囲をマークする（左下の四半分、ＦｃＲｎ＜１．７８；ヘパリン：＜０．８７）。 ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）のヘパリンカラム相対保持に対してプロットされたＦｃＲｎ相対保持。２：最も高いヘパリン結合を有する画分；１：最も低いヘパリン結合を有する画分。 抗体番号５およびそのバリアントのヘパリンカラム相対保持に対してプロットされたＦｃＲｎ相対保持。１：野生型抗体；２０：負のパッチのＨＣバリアント；２７：正のパッチのＨＣバリアント；１１２：正のパッチのＬＣ バリアント；１８３：正のパッチのＨＣバリアント。 ＦｃＲｎノックアウトマウスにおける抗体番号５およびそのバリアントのクリアランス。１：野生型抗体；２０：負のパッチのＨＣバリアント；２７：正のパッチのＨＣバリアント；１１２：正のパッチのＬＣ バリアント；１８３：正のパッチのＨＣバリアント。 ＦｃＲｎノックアウトマウスにおける抗体番号５の非パッチーおよびパッチーバリアントの時間依存性血清濃度。 抗体番号５およびそのヒスチジンバリアントのヘパリンカラム相対保持に対してプロットされたＦｃＲｎ相対保持。 ＦｃＲｎノックアウトマウスにおける抗体番号５およびそのＨＣヒスチジンバリアントの時間依存性血清濃度。 ＦｃＲｎノックアウトマウスにおける抗体番号５およびそのＨＣヒスチジンバリアントのクリアランス。 図１１Ａおよび図１１ＢｈＦｃＲｎ－ｔｇ（図１１Ｂ）およびＦｃＲｎ－ｋｏ（図１１Ａ）マウスにおけるＦｃＲｎ再利用に対するＦｖ電荷パッチの影響；レジェンド中の上から下への配列記号はそれぞれ約２時間および約２４時間のサンプル点における上から下へのグラフの配列に対応する。 図１１のバリアント（青丸）、開発中の一部のｍＡｂ（赤四角）、および一部のＩＶＩＧ画分（緑三角）についてのＦｃＲｎ－ｋｏマウス対ｈＦｃＲｎ－ｔｇマウスにおけるクリアランスの比に対するＦｃＲｎ－ｋｏマウスにおけるクリアランスのプロット。 改変された抗体の「Ｆｃ突然変異バリアントのＦｃＲｎカラム相対保持」および「対応する親（＝野生型）抗体のＦｃＲｎカラム相対保持」の差異に対する「Ｆｃ突然変異バリアントのｈＦｃＲｎ＋／＋Ｔｇ３２マウスにおけるクリアランス」対「対応する親（＝野生型）抗体のｈＦｃＲｎ＋／＋Ｔｇ３２マウスにおけるクリアランス」の比のプロット。

以下の実施例、図面および配列は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。

材料および方法
抗体
実験において使用した参照抗体は、配列番号０１の重鎖アミノ酸配列および配列番号０２の軽鎖アミノ酸配列を有する抗ｐＴａｕ抗体ならびに配列番号０３の重鎖アミノ酸配列および配列番号０４の軽鎖アミノ酸配列を有する抗Ｈｅｒ ３抗体であった。

合成遺伝子はＧｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）において製造された。

本明細書において使用されるモノクローナル抗体をＨＥＫ２９３細胞中で一過的に発現させ（以下を参照）、標準的な手順を使用してプロテインＡクロマトグラフィーにより精製を行った（以下を参照）。

生化学的な特徴付けは、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＳｕｉｔｅ（商標）２５０ ７．８×３００ｍｍ、溶出液：２００ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０）およびＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用する分子量分布の分析を含んだ。

発現プラスミド
上記の抗体の発現のために、ＣＭＶ－イントロンＡプロモーターを用い、または用いずに、ｃＤＮＡ組織化、またはＣＭＶプロモーターを用いるゲノム組織化に基づく、細胞の一過性発現（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における）のための発現プラスミドのバリアントが適用された。

抗体発現カセット以外に、プラスミドは、以下のものを含んでいた。
－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてプラスミドの複製を可能にする複製起源、
－大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子、および
－真核細胞中での選択マーカーとしてのハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）からのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子。

抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成されていた。
－５’末端の固有の制限部位
－ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期遺伝子およびプロモーター、
－次に、ｃＤＮＡ組織化の場合には、イントロンＡ配列、
－ヒト抗体遺伝子の５’－未翻訳領域、
－免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ｃＤＮＡとして、または免疫グロブリンエクソン－イントロン組織化を伴うゲノム組織化としてのヒト抗体鎖、
－ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、
－３’末端の固有の制限部位。

抗体鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成によって作成され、例えば、それぞれのプラスミド中の固有の制限部位を用いて、核酸セグメントに従って接続することによって、既知の組換え方法および技術によってアセンブリされた。サブクローン化された核酸配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。一過性トランスフェクションのために、大量のプラスミドが、トランスフェクションされた大腸菌培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）からプラスミド調製によって調製された。

細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。

ＨＥＫ２９３－Ｆ系における一過性トランスフェクション
製造者の指示に従ってＨＥＫ２９３－Ｆ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各々のプラスミド（例えば、重鎖の他に、対応する軽鎖をコードする）の一過性トランスフェクションにより抗体を生成した。簡潔に述べれば、シェークフラスコまたは撹拌発酵槽のいずれかにおいて無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁状態で生育させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に各々の発現プラスミドおよび２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）またはｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のミックスをトランスフェクトした。２Ｌシェークフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を６００ｍＬ中１×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種し、１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ_２でインキュベートした。後日、約１．５×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度の細胞にＡ）それぞれ重鎖、および等モル比の対応する軽鎖をコードする計６００μｇのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにＢ）２０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋１．２ｍＬの２９３ ｆｅｃｔｉｎまたはｆｅｃｔｉｎ（２μＬ／ｍＬ）の約４２ｍＬのミックスをトランスフェクトした。グルコース消費に従って発酵の経過の間にグルコース溶液を加えた。分泌された抗体を含有する上清を５～１０日後に回収し、抗体を上清から直接的に精製したか、または上清を凍結および貯蔵した。このようにして以下の抗体を製造した。

精製
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィー、ブチル－セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーにより細胞培養上清から抗体を精製した。

簡潔に述べれば、無菌濾過された細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭのＮａＣｌおよび２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化されたＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ樹脂に捕捉させ、平衡化緩衝液を用いて洗浄し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ３．０で溶出させた。溶出した抗体画分をプールし、２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いて中和した。１．６Ｍの硫酸アンモニウム溶液を０．８Ｍの硫酸アンモニウムの最終濃度まで加え、酢酸を使用してｐＨをｐＨ５．０に調整することにより疎水性相互作用クロマトグラフィー用の抗体プールを調製した。３５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．８Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０を用いたブチル－セファロース樹脂の平衡化後に、抗体を樹脂に適用し、平衡化緩衝液を用いて洗浄し、３５ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０への線形勾配を用いて溶出させた。抗体含有画分をプールし、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。抗体含有画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ限外濾過デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して要求される濃度まで濃縮し、－８０℃で貯蔵した。

マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用してＣＥ－ＳＤＳにより各精製ステップ後に純度および抗体完全性を分析した。製造者の指示に従ってＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用してＣＥ－ＳＤＳ分析のために５μｌのタンパク質溶液を調製し、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを使用してＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステムで分析した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを分析した。

マウス
マウスＦｃＲｎα鎖遺伝子を欠損しているが、ヒトＦｃＲｎα鎖遺伝子について半接合性トランスジェニックであるＢ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔ^{ｔｍ１Ｄｃｒ}Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）２７６Ｄｃｒマウス（ｍｕＦｃＲｎ－／－ｈｕＦｃＲｎ ｔｇ＋／－、系統２７６）を薬物動態研究のために使用した。マウスの飼育は特有病原体フリーの状態下で実行した。マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から得た（雌、４～１０週齢、投薬時に体重１７～２２ｇ）。全ての動物実験はｔｈｅ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａ、Ｇｅｒｍａｎｙにより承認され（許可番号５５．２－１－５４－２５３２．２－２８－１０）、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｎｏｒｍａｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓに従ってＡＡＡＬＡＣ認定動物施設において行われた。動物を標準的なケージ中で飼育し、研究の全期間中に食餌および水を自由にとらせた。

薬物動態研究
抗体の単回用量を１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて側尾静脈を介してｉ．ｖ．で注射した。計９つの血清収集時点（投薬後０．０８、２、８、２４、４８、１６８、３３６、５０４および６７２時間）をカバーするようにマウスを各６匹のマウスの３つの群に分けた。各マウスを２回、イソフルラン（商標）（ＣＰ－Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた浅麻酔下で行った後眼窩出血に供し、３つ目の血液試料を安楽死の時点で収集した。血液を血清チューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ５００Ｚ－Ｇｅｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に収集した。２ｈのインキュベーション後に、試料を９．３００ｇで３分間遠心分離して血清を得た。遠心分離後に、血清試料を分析まで－２０℃で凍結貯蔵した。

ヒト抗体血清濃度の決定
マウス血清中のウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、ｍＡｂ８およびｍＡｂ９の濃度を特異的酵素結合イムノアッセイにより決定した。抗体に特異的なビオチン化インターロイキン１２およびジゴキシゲニン標識抗ヒト－Ｆｃマウスモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を捕捉および検出のためにそれぞれ使用した。ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、アッセイ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に希釈されたビオチン化捕捉抗体を用いて１ｈコーティングした。洗浄後に、血清試料を様々な希釈で加え、続いて１ｈのさらなるインキュベーションステップを行った。繰返しの洗浄後に、検出抗体、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体とのその後のインキュベーションにより、結合したヒト抗体を検出した。ＡＢＴＳ（２，２’アジノ－ジ［３－エチルベンゾチアゾリンスルホネート］；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＨＲＰ基質として使用して有色の反応生成物を形成させた。結果としてもたらされた反応生成物の吸光度をＴｅｃａｎ ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダー（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して４９０ｎｍの参照波長と共に４０５ｎｍで読み取った。

全ての血清試料、陽性および陰性対照試料を２連で分析し、参照標準品に対して較正した。

薬物動態（ＰＫ）分析
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）１．１．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してノンコンパートメント解析により薬物動態パラメーターを算出した。

簡潔に述べれば、抗体の非線形減少に起因する対数台形法により曲線下面積（ＡＵＣ_{０－ｉｎｆ}）値を算出し、最後の時点において観察された濃度からの外挿を用いて、見かけの終点速度定数λｚを使用して無限大に外挿した。

投薬速度（Ｄ）をＡＵＣ_{０－ｉｎｆ}で割ったものとして血漿クリアランスを算出した。見かけの消失半減期（Ｔ１／２）は式Ｔ１／２＝ｌｎ２／λｚから導出した。

実施例１
ＦｃＲｎアフィニティーカラムの調製
ＨＥＫ２９３細胞中でのＦｃＲｎの発現
ＦｃＲｎおよびベータ－２－マイクログロブリンのコーディング配列を含有する２つのプラスミドのＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションによりＦｃＲｎを一過的に発現させた。トランスフェクトされた細胞をシェーカーフラスコ中、３６．５℃、１２０ｒｐｍ（シェーカー振幅５ｃｍ）、８０％の湿度および７％のＣＯ_２で培養した。細胞を２～３日毎に３～４×１０^５細胞／ｍｌの密度に希釈した。

一過性発現のために、１４ｌステンレス鋼バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．０±０．２、ｐＯ_２ ３５％（Ｎ_２および空気でのガス処理、総気体流れ２００ｍｌ分^－１）ならびに１００～４００ｒｐｍの撹拌器速度において８リットルの培養体積と共に開始させた。細胞密度が２０×１０^５細胞／ｍｌに達した時に、１０ｍｇのプラスミドＤＮＡ（等モル量の両方のプラスミド）を４００ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈した。２０ｍｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこの混合物に加え、これを次に室温で１５分間インキュベートした後、発酵槽に移した。翌日から、細胞に連続モードで栄養分を供給した。フィード溶液を５００ｍｌ／日の速度で加え、必要に応じてグルコースを加えて２ｇ／ｌより高いレベルを保った。４０００ｒｐｍで９０分間、１ｌバケツを用いるスイングヘッド遠心分離機を使用してトランスフェクションの７日後に上清を回収した。上清（１３Ｌ）をＳａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルター（０．４５μｍ＋０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）により除去し、ＦｃＲｎベータ－２－マイクログロブリン複合体をそこから精製した。

新生児Ｆｃ受容体のビオチン化
３ｍｇのＦｃＲｎベータ－２－マイクログロブリン複合体を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５．３ｍＬの２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝液に溶解／希釈し、２５０μｌのＰＢＳおよび１タブレット完全プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）に加えた。製造者の指示（Ｂｕｌｋ ＢＩＲＡ、Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ）に従ってＡｖｉｄｉｔｙからのビオチン化キットを使用してＦｃＲｎをビオチン化した。ビオチン化反応を室温で終夜行った。

ビオチン化ＦｃＲｎを１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（緩衝液Ａ）に対して４℃で終夜透析して過剰なビオチンを除去した。

ストレプトアビジンセファロースへの連結
ストレプトアビジンセファロースへの連結のために、１ｍＬのストレプトアビジンセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）をビオチン化および透析されたＦｃＲｎベータ－２－マイクログロブリン複合体に加え、４℃で終夜インキュベートした。ＦｃＲｎベータ－２－マイクログロブリン複合体誘導体化セファロースを４．６ｍｍ×５０ｍｍのクロマトグラフィーカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）に充填した。カラムを８０％の緩衝液Ａおよび２０％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンｐＨ８．８、１４０ｍＭのＮａＣｌ）中で貯蔵した。

実施例２
ＦｃＲｎアフィニティーカラムおよびｐＨ勾配を使用するクロマトグラフィー
条件：
カラム寸法：５０ｍｍ×４．６ｍｍ
ローディング：３０μｇの試料
緩衝液Ａ：２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌを含有、ｐＨ５．５に調整
緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌを含有、ｐＨ８．８に調整
緩衝液Ａを用いて平衡化されたＦｃＲｎアフィニティーカラムに３０μｇの試料を適用した。０．５ｍＬ／分の流速での２０％の緩衝液Ｂ中の１０分の洗浄ステップ後に、７０分にわたる２０％から７０％への緩衝液Ｂの線形勾配を用いて溶出を行った。２８０ｎｍの波長におけるＵＶ光吸収を検出のために使用した。各実施後に２０％の緩衝液Ｂを使用してカラムを１０分間再生させた。

相対保持時間の算出のために、（Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ－Ｃｉａｒｌｅｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（２００９）１８７８－１８８２）に従って０．０２％の過酸化水素を用いて１８時間酸化させた標準試料（抗Ｈｅｒ３抗体（配列番号０３および０４）をシークエンスの開始時および各１０回の試料注入後に流した。

簡潔に述べれば、１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０中の抗体（９ｍｇ／ｍＬ）を０．０２％の最終濃度までＨ２Ｏ２と混合し、室温で１８ｈインキュベートした。反応をクエンチするために、予備冷却された１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に試料を徹底的に透析した。

相対保持時間は以下の式に従って算出した：

ピークの定義について図１を参照。

実施例３
ヘパリンアフィニティーカラムおよびｐＨ勾配を使用するクロマトグラフィー
条件：
カラム寸法：５０ｍｍｘ５．０ｍｍ
ローディング：２０～５０μｇの試料
緩衝液Ａ：５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ ７．４
緩衝液Ｂ：５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ ７．４、１０００ｍＭのＮａＣｌ
低塩緩衝液（≦２５ｍＭのイオン強度）中の２０～５０μｇのタンパク質試料を、室温で緩衝液Ａを用いて予備平衡化されたＴＳＫｇｅｌ Ｈｅｐａｒｉｎ－５ＰＷ Ｇｌａｓｓ ｃｏｌｕｍｎ、５．０×５０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ／Ｊａｐａｎ）に適用した。０．８ｍｇ／ｍＬの流速において３２分にわたり０～１００％の緩衝液Ｂの線形勾配を用いて溶出を行った。２８０ｎｍの波長におけるＵＶ光吸収を検出のために使用した。あらゆる注入シークエンスを保持時間標準品（抗ｐＴａｕ抗体）と共に開始し、それを使用して以下の式に従って相対保持時間を算出した：

（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ｐＴａｕ：抗ｐＴａｕ抗体ピークの保持時間）。

実施例４
カニクイザルＳＤＰＫ研究
カニクイザルにおいて０．３ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量レベルにおける単回静脈内投与後に試験化合物の薬物動態を決定した。段階血液試料を数週にわたりサルから収集し、収集された血液試料から血清／血漿を調製した。試験化合物の血清／血漿レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。線形薬物動態の場合に、薬物動態パラメーターを標準的なノンコンパートメント法により決定した。クリアランスを以下の式に従って算出した：
クリアランス＝用量／濃度時間曲線下面積

非線形薬物動態の場合に、クリアランスの線形画分を以下の代替的な方法を介して決定した：追加の非線形クリアランス経路が実質的に飽和した高い用量レベルにおけるＩＶ投与後にいずれかのクリアランス値を推定した。代替的に、線形および非線形の飽和可能なクリアランス項を含むＰＫモデルを確立した。これらの場合に、モデル決定線形クリアランス画分を相関のために使用した。

結果：

実施例５
突然変異体の調製
以下の突然変異体をＦａｂにおける１つの親抗体Ｖ１の部位特異的突然変異誘発により調製した：Ｖ２、Ｖ２０、Ｖ２７、Ｖ１０４およびＶ１０８。

これらの電荷バリアントから以下のＦｃ領域バリアントを調製した：
選択（Ｘ＝インビボＰＫ）

Ｖ２＿ｖａｒ １：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＝２－ＹＴＥ
Ｖ２０＿ｖａｒ １：Ｍ４２８Ｌ＝２０－Ｍ４２８Ｌ
Ｖ２０＿ｖａｒ ２：Ｔ３０７Ｈ／Ｎ４３４Ｈ＝２０－Ｔ３０７Ｈ／Ｎ４３４Ｈ
Ｖ２０＿ｖａｒ ３：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＝２０－ＹＴＥ
Ｖ２０＿ｖａｒ ４：Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ＝２０－Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ
Ｖ２７＿ｖａｒ １：Ｙ４３６Ａ＝２７－Ｙ４３６Ａ
Ｖ２７＿ ｖａｒ ２：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＝２７－ＹＴＥ
Ｖ１０４＿ｖａｒ １：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＝１０４－ＹＴＥ
Ｖ１０８＿ｖａｒ １：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＝１０８－ＹＴＥ

実施例６
インビボ薬物動態研究
ｍＦｃＲｎ α鎖を欠いたマウス（Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ；ＦｃＲｎ－ｋｏと略記される）およびホモ接合Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔ＼ｔｍ１Ｄｃｒ［Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪマウス（ｈＦｃＲｎ Ｔｇ３２と略記される）を使用してインビボ研究を実行した。マウスに各々の試験化合物の単回静脈内ボーラス注射を通常５ｍｇ／ｋｇの用量で与えた（ｎ＝４～５／化合物／マウス系統）。段階血液試料をｈＦｃＲｎ Ｔｇ３２およびＦｃＲｎ－ｋｏマウスにおいてそれぞれ４週間または９６時間にわたり収集した。血液試料を凝固させ、血清を調製した。各々の試験化合物の血清レベルをＥＣＬＩＡにより分析した。薬物動態評価は、標準的なノンコンパートメント薬物動態分析を使用して行った。

実施例７
血清試料の分析
投与された抗体およびそのバリアントのヒトＦａｂ部分に特異的な電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）法を使用してマウス血清試料中のヒト治療抗体の濃度を決定した。簡潔に述べれば、アッセイ緩衝液を用いて希釈された試料を捕捉および検出分子と共に３７℃で９分間インキュベートした。ビオチン化ｍＡｂ＜Ｈ－Ｆａｂ（カッパ）＞Ｍ－ＩｇＧ－Ｂｉを捕捉分子として使用し、ルテニウム（ＩＩ）ｔｒｉｓ（ビピリジル）３２＋標識ｍＡｂ＜Ｈ－Ｆａｂ（ＣＨ１）＞Ｍ－１．１９．３１－ＩｇＧ－Ｓ－Ｒｕマウスモノクローナル抗体を検出のために使用した。ストレプトアビジンコーティング磁気マイクロ粒子を加え、３７℃でさらに９分間インキュベートしてビオチン－ストレプトアビジン相互作用により複合体形成させた。複合体を電極上に磁気的に捕捉し、共反応物トリプロピルアミン（ＴＰＡ）を使用して生成された化学発光シグナルを光電子増倍管検出器により測定した。全ての血清試料および陽性または陰性対照試料を複製で分析し、投与された対応する抗体に対して較正した。

結果は以下の通りであった。

実施例８
親および改変された抗体との間の相対保持時間差異を決定するためのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法
０．５ｍＬ／分の流速および２５℃のカラム温度において８０％の緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）および２０％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８）を用いて予備平衡化された商業的に入手可能なＦｃＲｎアフィニティーカラム（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．０８１２８０５７００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析的ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを行った。試料を上記のように調製した。計３０μｇのタンパク質を注入した。注入の１０分後に、７０分にわたる２０～１００％の緩衝液Ｂの線形勾配を開始した。１００％の緩衝液Ｂを１０分間保持した後に、８０％の緩衝液Ａおよび２０％の緩衝液Ｂを用いてカラムを再平衡化した。検出を２８０ｎｍに設定されたＵＶ検出器を用いて行った。比較可能な異なる実施および異なる緩衝液およびカラムロットからの結果を作成するため、ならびにわずかな保持時間のドリフトを補償するために、標準試料を各シークエンスの開始および終了時および１０回目毎の実施後に測定した。相対保持時間（ｔ_ｒｅｌ）を式：

に従って算出し、これは、図１によるピーク定義（ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：図１による部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体のピーク２の保持時間；ｔ_ピーク３：図１による抗Ｈｅｒ３抗体のピーク３の保持時間）に基づいた。

Claims (14)

1. 改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供する方法であって、
   （ａ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける（親）抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
   （ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
   （ｃ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける改変された抗体の（相対）保持時間を決定するステップと、
   （ｄ）（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より短い場合、および約５分より長い場合に、ステップ（ｂ）を繰り返すステップであって、それにより、相対保持時間の変化が１分より短い場合には、ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域のさらに増加した結合を結果としてもたらす突然変異が選択され、または相対保持時間の変化が５分より長い場合には、ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の増加がより小さい結合を結果としてもたらす突然変異が選択される、ステップと、
   （ｅ）（親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が約１分より長くかつ約５分より短い場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと、
   を含む、方法。
2. （親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が、約２分より長く、かつ約４．５分より短い、請求項１に記載の方法。
3. （親）抗体および改変された抗体の間の相対保持時間の変化が、約３分より長く、かつ約４分より短い、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
4. ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーが、
   － ビオチン－ストレプトアビジン非共有結合性相互作用を介して、それにコンジュゲートしたヒトＦｃＲｎ（１つの好ましい実施形態では、マトリックス１ｇ当たり１ｍｇ～５ｍｇのＦｃＲｎ、好ましくはマトリックス１ｇ当たり２．５ｍｇのＦｃＲｎ）を有する約１ｍＬのストレプトアビジンアガロースマトリックスを含むＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムが、８０体積％の緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）および２０体積％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８）を用いて、０．５ｍＬ／分の流速および２５℃のカラム温度において平衡化され、
   － 計３０μｇの抗体が、８０体積％の緩衝液Ａおよび２０体積％の緩衝液Ｂの同じ混合物中に調製されて、平衡化されたカラムに注入され、
   － 注入の１０分後に、７０分にわたる２０体積％から１００体積％への緩衝液Ｂの線形勾配が開始され、
   － 任意選択的に１００体積％の緩衝液Ｂが、１０分間保持された後にカラムが８０体積％の緩衝液Ａおよび２０体積％の緩衝液Ｂを用いて再平衡化される
   ように行われ、
   それにより、検出が、２８０ｎｍに設定されたＵＶ検出器を用いて行われ、
   それにより、（比較可能な異なる実施および異なる緩衝液およびカラムロットからの結果を作成するため、ならびにわずかな保持時間のドリフトを補償するために、標準試料が、各シークエンスの開始時および終了時および１０回目毎の実施後に測定される）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間が、以下の式：
   

   

   に従って算出され、本請求項において以前に概説されるような勾配を有するＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上で、ｔ_{ｒｅｌ，ｉ}：ピークｉの相対保持時間；ｔ_ｉ：ピークｉの保持時間；ｔ_ピーク２：部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体の第２のピークの保持時間；ｔ_ピーク３：部分的に酸化された抗Ｈｅｒ３抗体の第３のピークの保持時間である、
   請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. ステップ（ｂ）として、
   （ｂ）ヒトＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を増加させる突然変異を導入することにより抗体のＦｃ領域を改変して、改変された抗体を得るステップと、
   － 正に荷電したパッチのサイズを低減すること、
   － 正に荷電したパッチのサイズを低減し、かつ負に荷電したパッチのサイズを増加させること、
   － ＦｖまたはＦａｂにおける全体的な電荷を均等に分布させること
   により抗体のＦｖを改変するステップと、
   を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. Ｆｖ断片における電荷分布を、
   （ｉ）少なくとも１つの（永久的に）負に荷電したもしくは荷電していないアミノ酸残基を（永久的に）正に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
   （ｉｉ）少なくとも１つの（永久的に）正に荷電したもしくは荷電していないアミノ酸残基を（永久的に）負に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
   （ｉｉｉ）少なくとも１つの（永久的に）荷電したアミノ酸残基を反対の電荷を有するアミノ酸残基に変化させること、または
   （ｉｖ）少なくとも１つの永久的に荷電したアミノ酸残基をｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基に変化させること、または
   により変化させる、請求項５に記載の方法。
7. （ｅ）親抗体および改変された抗体を用いて、正の線形ｐＨ勾配を用いるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび正の線形電導度／塩勾配を用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを行うステップと、
   （ｆ）改変された抗体が、
   （ｉ）（同じ）ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
   （ｉｉ）（同じ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム（同じ溶出条件下）上での親抗体の保持時間より短いヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上の相対保持時間、または
   （ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
   を有する場合に、改善されたインビボ半減期を有する抗体を提供するステップと
   をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 改変された抗体が、その（溶媒曝露された）表面上に少なくとも１つの追加の負に荷電したパッチを有する、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 改変された抗体が親抗体と同じ（表面）正味電荷を有する、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
10. （永久的に）負に荷電したアミノ酸残基が、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される、請求項５～９のいずれか１項に記載の方法。
11. （永久的に）正に荷電したアミノ酸残基が、アルギニンおよびリジンからなる群から選択される、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基がヒスチジンである、請求項５～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 永久的に荷電したアミノ酸残基が、ｐＨ６～ｐＨ８のｐＨ範囲内で同じ（正味）電荷を有する、請求項５～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ｐＨ依存的に荷電したアミノ酸残基が、ｐＨ６において第１の（正味）電荷およびｐＨ８において反対の第２の（正味）電荷を有する、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。

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