SK286304B6

SK286304B6 - Imidazonaphthyridines and their use in inducing cytokine biosynthesis

Info

Publication number: SK286304B6
Application number: SK5035-2007A
Authority: SK
Inventors: Kyle J Lindstrom
Original assignee: Meda Ab
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2008-07-07
Also published as: US6638944B2; SK285872B6; DK1512686T3; NO20035718D0; JP4283438B2; US20040204436A1; EE04314B1; US20050107421A1; SI1512686T1; UA67760C2; KR20040011533A; US20040023932A1; US6514985B1; ATE277046T1; DE69826518T2; HRP20000363B1; TR200001705T2; US20040006098A1; KR100642703B1; CZ2007268A3

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka imidazonaftyridínovej zlúčeniny 2-mctyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-4-amínu alebo jej farmaceutický prijateľných soli. Vynález sa ďalej týka farmaceutických kompozícií obsahujúcich uvedenú imidazonaftyridínovú zlúčeninu alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ. V ďalšom aspekte sa tento vynález týka použitia týchto zlúčenín ako imunomodulátorov a na prípravu liečiva na indukovanie biosyntézy cytokínu u živočíchov.

Doterajší stav techniky

Prvý spoľahlivý odkaz na lJf-imidazo[4,5-c]chinolínový kruhový systém sa objavil v Backman a kol., J. Org. Chem. 15, 1278 - 1284 (1950), v ktorom sa opisuje syntéza l-(6-metoxy-8-chinolinyl)-2-metyl-177-imidazo[4,5-c]chinolínu, ktorý je možno použiť ako antimalarické agens. Takisto bola opísaná syntéza rôzne substituovaných l//-imidazo[4,5-c]chinolínov. Napríklad v Jain a kol., J. Med. Chem. 11, pp. 87 - 92 (1968) sa opisuje syntéza zlúčeniny l-[2-(4-piperidyl)etyl]-177-imidazo[4,5-c]chinolmu ako možného antikonvulzíva a kardiovaskulárneho agens. Taktiež Baranov a kol., Chem. Abs. 85, 94362 (1976) opisuje niekoľko 2-oxoimidazo[4,5 -c] chinolíno v.

Určité 17/-imidazo[4,5-c]chinolín-4-amíny a ich 1- a 2-substituované deriváty našli použitie ako antivírusové agens, bronchodilatans a imunomodulátory. Sú opísané inter alia v U.S. patentoch číslo 4,689,338; 4,698,348; 4,929,624; 5,037,986; 5,268,376; 5,346,905 a 5,389,640, všetky sú tu zahrnuté ako odkaz. Hoci pokračuje záujem o imidazochinolínový kruhový systém, ako je vidieť napríklad vo WO 98/30562, naďalej pretrváva potreba zlúčenín, ktoré by mali schopnosť modulovať imunitnú odpoveď indukciou biosyntézy cytokínu alebo inými mechanizmami.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-4-amínu alebo jeho farmaceutický prijateľných solí.

Ďalej sa vynález týka farmaceutických kompozícií obsahujúcich farmaceutický účinné množstvo uvedenej zlúčeniny alebo jej soli a farmaceutický prijateľný nosič.

V ďalšom uskutočnení sa vynález týka uvedenej zlúčeniny alebo jej soli na použitie pri indukcii biosyntézy cytokínu u živočíchov.

Ďalej sa vynález týka použitia uvedenej zlúčeniny alebo jej soli na prípravu liečiva na indukciu biosyntézy cytokínu u živočíchov.

V ešte ďalšom uskutočnení sa vynález týka uvedenej zlúčeniny alebo jej soli na použitie pri liečení vírusovej infekcie u živočíchov.

V ešte ďalšom uskutočnení vynález poskytuje použitie uvedenej zlúčeniny alebo jej soli na prípravu liečiva na liečenie vírusovej infekcie u živočíchov.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú užitočné ako modifikátory imunitnej odpovede vďaka ich schopnosti vyvolať biosyntézu cytokínu a tiež modulovať imunitnú odpoveď pri podávaní živočíchom. Táto schopnosť robí zlúčeniny použiteľnými v liečbe rôznych stavov, ako napríklad ochorení a tumorov, ktoré sú citlivé na takéto zmeny v imunitnej odpovedi.

Tento vynález opisuje zlúčeniny vzorca (I):

kde

A je =N-CR=CR-CR=; =CR-N=CR-CR=; =CR-CR=N-CR= alebo ~CR-CR~CR-N~;

R, je vybrané zo skupiny obsahujúcej:

-vodík

-(^.20 alkyl alebo C₂.₂o alkenyl, ktorý je nesubstituovaný alebo substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny obsahujúcej:

aryl, heteroaryl, heterocyklyl,

0-Ci_2oalkyl,

O-ÍCuoalkyDo-i-aryl,

O-lCuijalkylIorheteroaryl,

0-(Ci.₂₀alkyl)o.rheterocyklyl,

C i .₂₀alkoxykarbonyl,

S(0)o-2-Ci_2oalkyl,

S(O)₀.2-(C 1.₂₀alkyl)₀.1-aryl,

S(0)₀-2-(Ci.2oalkyl)o-i-heteroaryl,

S(0)₀.2-(C|.2₀alkyl)o.i-heterocyklyl,

N(R₃)2, n₃, oxo, halogén,

N0₂,

OH,

SHa

Ci_2o alkyl-NR₃-Q-X-R4 alebo C₂.₂oalkenyl-NR3-Q-X-R4, kde Q je -CO- alebo -SO₂-; X je väzba, -O- alebo NR₃- a R4 je aryl; heteroaryl, heterocyklyl alebo -Ci.₂₀alkyl, alebo C₂.₂₀alkenyl, ktorý je nesubstituovaný ale)o substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny obsahujúcej:

aryl, heteroaryl, heterocyklyl,

0-C|.₂oalkyl,

0-(C₁.₂₀alkyl)o.i-aryl,

0-(Ci_2oalkyl)o-rheteroaryl,

0-(Cv2oalkyl)o-i-heterocyklyl,

C t .₂₀alkoxykarbonyl,

SjOj^-C^oalkyl,

SjOjo-ríCuoalkyljo-i-aryl,

S(0)o.₂-(C_l.₂oalkyl)o.|-heteroaryl,

S(0)o-2-(C I -2oalkyl)_o., -heterocyklyl,

N(R₃)₂,

NR_rCO-O-Ci.₂₀alkyl,

N₃,

0X0, halogén,

N0₂,

OH a

SH alebo R4 je

(CHj)i^ N(Rj)2 kde Y je -N- alebo -CR-;

R₂ je vybratý zo skupiny obsahujúcej: vodík,

Cj.ioalkyl,

C₂.₁₀alkenyl, aryl,

C j _ 1₀alkyl-O-C μ ₁₀-alkyl,

C_l.i₀alkyl-O-C₂.|0-alkenyl a

-Cj.ioalkyl alebo C₂_io alkenyl substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny obsahujúcej:

-OH,

-halogén,

-N(R₃)₂,

-CO-N(R₃)₂,

-CO-Cj.₁₀alkyl,

-N₃,

-aryl,

-heteroaryl,

-heterocyklyl,

-CO-aryl a

-CO-heteroaryl, každé R₃ je nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík a Cj.joalkyl a každé Rje nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík, Ci_₁₀alkyl, C_t.|₀alkoxy, halogén a trifluorometyl alebo ich farmaceutický prijateľnú soľ.

Tu používané termíny „alkyl“, „alkenyl“ a predpona ,,-alk“ zahŕňajú skupiny s rozvetveným a nerozvetveným reťazcom a cyklické skupiny, ako napríklad cykloalkyl a cykloalkenyl. Tieto cyklické skupiny môžu byť monocyklické alebo polycyklické a prednostne majú kruh s 3 až 10 atómami uhlíka. Príkladné cyklické skupiny zahŕňajú cyklopropyl, cyklopentyl, cyklohexyl a adamantyl.

Termín „aryl“, ako je tu používaný, zahŕňa karbocyklické aromatické kruhy alebo kruhové systémy. Príklady arylových skupín zahŕňajú fenyl, naftyl, bifenyl, fluorenyl a indenyl. Termín „heteroaryl“ zahŕňa aromatické kruhy alebo kruhové systémy, ktoré obsahujú aspoň jeden heteroatóm začlenený do kruhu (ako napríklad O, S, N). Vhodné heteroarylové skupiny zahŕňajú furyl, tienyl, pyridyl, chinolinyl, tetrazolyl, imidazolyl atď.

„Heterocyklyl“ zahŕňa nearomatické kruhy alebo kruhové systémy, ktoré obsahujú aspoň jeden heteroatóm zahrnutý do kruhu (ako napríklad O, S, N). Príkladné heterocyklické skupiny zahŕňajú pyrolidinyl, tetrahydrofuranyl, morfolinyl, tiazolidinyl a imidazolidinyl.

Arylové, heteroarylové a heterocyklické skupiny môžu byť nesubstituované alebo substituované jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny obsahujúcej C^alkyl, hydroxy, halogén, N(R₃)₂, NO₂, Ci-jnalkoxy, C].₂oalkyltio, trihalogénmetyl, C^oacyl, arylkarbonyl, heteroarylkarbonyl, (C_l.i₀alkyl)₀.₁-aryl, (C_b|₀alkyl)o.i-heteroaryl, nitril, C_b20alkoxykarbonyl, oxo, arylalkyl, kde alkylová skupina má 1 až 10 uhlíkových atómov a heteroarylalkyl, kde alkylová skupina má 1 až 10 uhlíkových atómov.

Vynález zahŕňa 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-4-amin v akejkoľvek jeho farmaceutický prijateľnej forme, vrátane izomérov, ako sú enantioméry, soli, solváty, polymorfné látky a podobne.

Príprava zlúčenín

Zlúčeniny vzorca (I), kde A je =N-CR=CR-CR= a R, R] a R₂ sú definované, môžu byť pripravené podľa reakčnej schémy III.

Reakčná schéma III

V kroku (1) reakčnej schémy III, 3-nitro[l,5]nafryridín-4-ol vzorca (XXIX) je chlórovaný použitím vhodného chloračného činidla, ako je fosfor oxychlorid, na poskytnutie 4-chloro-3-nitro[l,5]naftyridinu vzorca (XXX). Reakcia môže byť uskutočňovaná reagovaním zlúčeniny vzorca (XXIX) s fosfor oxychloridom vo vhodnom rozpúšťadle, ako je A'.W-dimetylformamíd, pri miernom zahrievaní (-55 °C). Zlúčenina môže byť izolovaná konvenčnými metódami alebo sa môže pokračovať ďalej bez izolácie, ako je opísané v nasledujúcom kroku (2). Zlúčenina vzorca (XXIX), kde R je vodík, je známa a jej príprava je zahrnutá v Hart, Joumal of the Chemical Society str. 212 - 214, (1956).

V kroku (2) reakčnej schémy III, 4-chloro-3-mtro[l,5]naftyridín vzorca (XXX) reaguje s amínom vzorca R|NH₂, kde Ri je definované, na poskytnutie 3-nitro[l,5]naftyridín-4-amínu vzorca (XXXI). Reakcia môže byť uskutočňovaná pridaním vody, potom nadbytku aminu do výslednej reakčnej zmesi z kroku (1), potom zahrievaním v parnom kúpeli. Reakcia môže byť uskutočňovaná pridaním nadbytku aminu do roztoku zlúčeniny vzorca (XXX) vo vhodnom rozpúšťadle, ako je dichlórmetán a optimálnym zahrievaním. Zlúčenina vzorca (XXXI), kde R₁ je vodík, je známa a jej príprava je opísaná v Wozniak a kol., J.R. Neth. Chem. Soc. 102(12), str. 511 - 13(1983).

V kroku (3) reakčnej schémy III, 3-mtro[l,5]naftyridín-4-amín vzorca (XXXI) je redukovaný na poskytnutie [l,5]naftyridm-3,4-diamínu vzorca (XXXII). Prednostne, redukcia je uskutočňovaná použitím konvenčného heterogénneho hydrogenačného katalyzátora, ako je platina na uhlí alebo paládium na uhlí. Reakcia sa môže uskutočňovať konvenčné v Parrovej aparatúre vo vhodnom rozpúšťadle, ako je etylacetát.

V kroku (4) reakčnej schémy III, zlúčenina vzorca (XXXII) reaguje s karboxylovou kyselinou alebo jej ekvivalentom na poskytnutie l/f-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridmu vzorca (XXXIII). Vhodné ekvivalenty karboxylovej kyseliny zahŕňajú kyselinu halogénvodíkovú, ortoestery a 1,1-dialkoxyalkyl alkanoáty. Karboxylová kyselina alebo ekvivalent je vybraný tak, že bude poskytovať požadovaný R₂ substituent v zlúčenine vzorca (XXXIII). Napríklad, dietoxymetylacetát bude poskytovať zlúčeninu, kde R₂ je vodík, a trimetylortovalerát bude poskytovať zlúčeninu, kde R₂ je butyl. Reakcia môže bežať v prítomnosti rozpúšťadla, v karboxylovej kyseline, ako je kyselina octová alebo v inertnom rozpúšťadle v prítomnosti kyseliny. Reakcia prebieha pri dostatočnom zahrievaní na odstránenie akéhokoľvek alkoholu alebo vody tvorenej ako vedľajší produkt reakcie.

Alternatívne, krok (4) môže byť uskutočňovaný (i) reagovaním zlúčeniny vzorca (XXXII) s acylačným činidlom; a potom (ii) cyklizáciou produktu. Časť (i) zahŕňa zlúčeninu vzorca (XXXII) s acyl halogenidom vzorca R₂C(O)X, kde R₂ je definované a X je chlór alebo bróm. Reakcia môže byť uskutočňovaná pridaním acylhalogenidu v kontrolovanom režime (napr. po kvapkách) do roztoku zlúčeniny vzorca (XXXII) vo vhodnom rozpúšťadle, ako je dichlórmetán pri zníženej teplote (napr. 0 °C). Výsledný amidový medziprodukt môže byť izolovaný odstránením rozpúšťadla. Časť (ii) zahŕňa cyklizáciu produktu z časti (i) reagovaním produktu s amoniakom v metanole pri zvýšenej teplote (ako napríklad 150 °C) a tlaku.

V kroku (5) reakčnej schémy III, zlúčenina vzorca (XXXIII) je oxidovaná na poskytnutie l/ŕ-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-5iV-oxidu vzorca (XXXIV) použitím konvenčného oxidačného činidla, ktoré je vhodné na vytvorenie /V-oxidov. Preferované reakčné podmienky zahŕňajú reagovanie roztoku zlúčeniny vzorca (XXXIII) v chloroforme s 3-chloroperoxybenzoovou kyselinou pri podmienkach okolia.

V kroku (6) reakčnej schémy III, zlúčenina vzorca (XXXIV) je aminovaná na poskytnutie lH-irmdazo[4,5-c][l,5]naftyridín-4-aminu vzorca (XXXV), ktorý je podtriedou vzorca (I). Krok (6) zahŕňa (i) reagovanie zlúčeniny vzorca (XXXIV) s acylačným činidlom; a potom (ii) reagovanie produktu s aminačným činidlom. Časť (i) kroku (6) zahŕňa reagovanie N-oxidu s acylačným činidlom. Vhodné acylačné činidlá zahŕňajú alkylalebo arylsulfonyl chloridy (ako napríklad benzénsulfonyl chlorid, metánsulfonyl chlorid, p-toluénsulfonyl chlorid). Výhodné sú arylsulfonylchloridy. Výhodnejší je p-toluénsulfonyl chlorid. Časť (ii) kroku (6) zahŕňa reagovanie produktu časti (i) s nadbytkom aminačného činidla. Vhodné aminačné činidlá zahŕňajú amoniak (ako napríklad vo forme hydroxidu amónneho) a amónne soli (ako napríklad uhličitan amónny, hydrogenuhličitan amónny, fosforečnan amónny). Výhodný je hydroxid amónny. Reakcia je prednostne uskutočňovaná rozpusteným N-oxidu vzorca (XXXIV) v inertnom rozpúšťadle takom ako dichlórmetán, pridaním aminačného činidla ku roztoku, a potom pridaním acylačného činidla. Produkt alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ môže byť izolovaná použitím konvenčným metód.

Alternatívny krok (6) môže byť uskutočňovaný (i) reagovaním zlúčeniny vzorca (XXXIV) s izokyanátom; a potom (ii) hydrolyzovaním produktu. Časť (i) zahŕňa reagovanie Λ'-oxidu s izokyanátom, kde izokyanáto skupina je viazaná na karbonylovú skupinu. Vhodné izokyanáty zahŕňajú trichloroacetyl izokyanát a aroyl izokyanáty, ako je benzoyl izokyanát. Reakcia izokyanátu s A'-oxidomje realizovaná za vhodných bezvodných podmienok pridaním izokyanátu do roztoku N-oxidu v inertnom rozpúšťadle, ako je dichlórmetán. Výsledný produkt môže byť izolovaný odstránením rozpúšťadla. Časť (ii) zahŕňa hydrolýzu produktu z časti (i). Reakcia môže byť uskutočňovaná konvenčnými metódami, ako je zahrievanie v prítomnosti vody alebo nižšieho alkanolu, prípadne v prítomnosti katalyzátora, ako je hydroxid alkalického kovu alebo nižšieho alkoxidu.

Určité funkčné skupiny vymenované v spojitosti s R₁ a R₂ môžu byť nezlučiteľné s určitými činidlami reakčnej schémy III. Zlúčeniny obsahujúce takéto funkčné skupiny môžu byť pripravené odborníkmi použitím známych metód chránenia funkčnej skupiny a manipulácie. Napríklad, amínové skupiny môžu byť chránené, ak je to nevyhnutné, derivatizáciou s di-/erc-butyl dikarbonátom.

Niektoré zlúčeniny vzorca (I) obsahujúce určité funkčné skupiny môžu byť ľahko pripravené z iných zlúčenín vzorca (I). Napríklad zlúčeniny, kde R] substituent obsahuje amidovú skupinu, môžu byť konvenčné pripravené reakciou kyslého chloridu so zlúčeninou vzorca (I), kde R₁ substituent obsahuje primárny amín. Taktiež zlúčeniny, kde Rj substituent obsahuje urea skupinu, môžu byť pripravené reagovaním izokyanátu so zlúčeninou vzorca (I), kde Rj substituent obsahuje primárny amín. Ďalej zlúčeniny, kde Rj substituent obsahuje karbamátovú skupinu, môžu byť pripravené reakciou chloroformiátu so zlúčeninou vzorca (I), kde R] substituent obsahuje primárny amín.

Farmaceutické kompozície a biologická účinnosť

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu obsahujú terapeuticky účinné množstvo 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-ímidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-4-amínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom. Ako je tu uvedené, termín „terapeuticky účinné množstvo“ znamená množstvo zlúčeniny dostačujúce na vyvolanie terapeutického účinku, ako je cytokínová indukcia alebo antivírusová aktivita. Hoci presné množstvo účinnej zlúčeniny použitej vo farmaceutickej kompozícii podľa vynálezu bude rôzne podľa faktorov známych v stave techniky, ako sú fyzikálne a chemické vlastnosti zlúčeniny, ako aj vlastnosti nosiča a uvažovaná dávkovacia schéma, predpokladá sa, že kompozície vynálezu budú obsahovať vhodné účinné zložky na poskytnutie dávky od asi 100 ng/kg do asi 50 mg/kg, výhodne od asi 10 pg/kg do asi 5 mg/kg zlúčeniny subjektu. Môžu byť použité akékoľvek konvenčné dávkovacie formy, ako sú tablety, pastilky, parenterálne formulácie, sirupy, krémy, masti, aerosólové formulácie, transdermálne náplasti, transmukozálne náplasti atď.

V experimentoch vykonaných podľa testovacej uvedenej metódy sa preukázalo, že zlúčeniny podľa vynálezu indukujú produkciu určitých cytokínov. Táto schopnosť naznačuje, že zlúčeniny sú použiteľné ako modifikátory imunitnej odpovede, ktoré môžu modulovať imunitnú odpoveď rozličnými spôsobmi, čiže môžu byť užitočné v liečbe rôznych ochorení.

Cytokíny, ktoré sú indukované podávaním zlúčenín podľa vynálezu, všeobecne zahŕňajú interferon (IFN) a faktor nekrotizujúci nádor (TNF), ako aj určité interleukíny (IL). Zlúčeniny indukujú IFN-a, TNF-α, IL-1, 6, 10 a 12 a skupinu iných cytokínov. Okrem iných účinkov cytokíny inhibujú tvorbu vírusov a rast tumorových buniek, čím robia zlúčeniny použiteľné v liečbe tumorov a vírusových ochorení.

Ako dodatok ku schopnosti vyvolať tvorbu cytokínov, zlúčeniny ovplyvňujú vrodenú imunitnú odpoveď v určitých aspektoch. Napríklad, môže byť stimulovaná aktivita prirodzených usmrcovačov bunky, tento efekt môže spôsobiť cytokínovú indukciu. Zlúčeniny môžu tiež aktivovať makrofágy, čo stimuluje sekréciu oxidu dusíka a tvorbu ďalších cytokínov. Ďalej, zlúčeniny môžu spôsobovať proliferáciu a diferenciáciu B-lymfocytov.

Zlúčeniny podľa vynálezu tiež majú vplyv na získanú imunitnú odpoveď. Napríklad, hoci nie je predpokladaný nejaký priamy vplyv na T bunky alebo na priamu indukciu T bunkových cytokínov, je nepriamo indukovaná tvorba cytokínu IFN-γ T pomocného typu 1 (Thl) a je inhibovaná tvorba Th2 cytokínu IL-5 po podaní zlúčenín. Táto aktivita znamená, že zlúčeniny sú užitočné v liečbe ochorení, kde je požadovaná regulácia Thl odpovede smerom hore a/alebo regulácia Th2 odpovede smerom dole. S ohľadom na schopnosť zlúčenín podľa vynálezu inhibovať T-pomocný-typ 2 imunitnej odpovede, zlúčeniny sú vhodné na použitie v liečbe atopie, atopickej dermatitídy, astmy, alergie, alergickej rmitídy; ako očkovacie látky na získanú bunkovú imunitu a sú použiteľné na liečbu opakujúcich sa plesňových ochorení a chlamýdií.

Účinky zlúčenín modifikujúce imunitnú odpoveď predurčujú tieto zlúčeniny na použitie v liečbe širokého spektra stavov. Pretože tieto zlúčeniny majú schopnosť indukovať cytokíny, ako sú IFN-α a TNF-α, sú využiteľné najmä v liečení vírusových ochorení a tumorov. Tieto imunomodulačné aktivity umožňujú, že zlúče niny vynálezu sú použiteľné v liečbe ochorení, ako sú, ale neobmedzuje sa len na vírusové ochorenia, ako sú napríklad genitálne bradavice, bežné bradavice, plantáme bradavice, hepatitída B, hepatitída C, Herpes Simplex typu I a typu II, mäkký nádorček kože, HIV, CMV, VZV, cervikálna intraepitelová neoplazia, ľudský papilomavírus a asociovaná neoplazia, plesňové ochorenia, ako napríklad kandida, aspergillus, cryptococcal meningitis, neoplastické ochorenia, ako napríklad bazálny karcinóm, vlasová leukémia, Kaposiho sarkóm, renálny karcinóm, skvamózny karcinóm, myelogénna leukémia, myelóm, melanóm, maligny lymfom nepatriaci k Hodgkinovmu typu, kožný lymfon a iné rakovinové ochorenia, parazitické ochorenia, ako napríklad pneumocystís camii, cryptosporidióza, histoplazmóza, toxoplazmóza, trypanózomová infekcia, leishmaniazis; bakteriálne infekcie, ako napríklad tuberkulóza, mykobaktérium avium. Ďalšie ochorenia alebo stavy, ktoré môžu byť liečené použitím zlúčenín vynálezu zahŕňajú ekzém, eozinofíliu, trombocytémiu, leprózu, sklerózu multiplex, Ommenov syndróm, reumatoidnú artritídu, systematický lupus erytematosis, diskontinálny lupus, Bowenove ochorenie a Bowenoidnú papulóza.

Vynález opisuje spôsob indukcie biosyntézy cytokínu u živočíchov zahŕňajúci podanie účinného množstva uvedenej zlúčeniny živočíchovi. Množstvo zlúčeniny vyvolávajúce indukciu biosyntézy cytokínu je množstvo účinne pôsobiace na jeden alebo viac bunkových typov, ako sú monocyty, makrofágy, dendritické bunky a B-bunky na produkciu množstva jedného alebo viacerých cytokínov, ako napríklad INF-α, TNF-a, IL-1,6,10 a 12, ktoré je zvýšené nad základnú hladinu takýchto cytokínov. Presné množstvo sa bude pohybovať v súlade s faktormi známymi v stave techniky, ale je známa dávka od asi 100 ng^zkg do asi 50 mg/kg, výhodne od asi 10 pg/kg do asi 5 mg/kg. Vynález ďalej poskytuje spôsob liečby vírusovej infekcie u živočíchov zahŕňajúci podanie účinného množstva uvedenej zlúčeniny živočíchovi. Množstvo účinné na liečbu alebo inhibíciu vírusovej infekcie je množstvo, ktoré bude spôsobovať redukciu jedného alebo viacerých prejavov vírusovej infekcie, ako sú vírusové lézie, vírusové zaťaženie, rýchlosť vírusovej produkcie a mortality v porovnaní s kontrolnými neliečenými živočíchmi. Presné množstvo bude kolísať v súlade s faktormi známymi v stave techniky, ale je očakávané v dávke od 100 ng/kg do asi 50 mg/kg, výhodne od asi 10 pg/kg do asi 5 mg/kg.

Vynález je ďalej opísaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré sú uvedené len na ilustráciu a nemajú viesť k obmedzovaniu akýmkoľvek spôsobom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 (referenčný príklad) Zlúčenina vzorca (XXXI) N⁴-(2-Metylpropyl)-3-nitro[ 1,5]naftyridín-4-amín

Oxychlorid fosforitý (0,6 ml, 6,44 mmol) reagoval s JV,N-dimetylformamidom a potom sa pridal ku roztoku 3-nitro[l,5]naftyridín-4-olu (1,0 g, 5,23 mmol) v A/.V-dimetylformamide (20 ml). Reakčná zmes sa zahriala s použitím banky s plášťom s refluxujúcim acetónom ako tepelným zdrojom. Po 3 hodinách sa reakčná zmes vliala do ľadovej vody, pridal sa izobutylamín (2,0 ml, 20,1 mmol) a zmes sa zahriala na parnom kúpeli. Po niekoľkých hodinách sa reakčná zmes ochladila na teplotu okolia, filtrovala a premyla vodou. Vodná vrstva sa extrahovala dichlórmetánom. Dichlórmetánový extrakt sa premyl vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, potom sa premyl vodou, vysušil pomocou síranu horečnatého, potom sa nalial na silikagélovú vrstvu. Silikagél sa eluoval najprv dichlórmetánom na odstránenie nečistôt, potom sa eluoval 5 % metanolom v dichlórmetáne na získanie produktu. Eluent sa koncentroval do sucha na poskytnutie N⁴-(2-metylpropyI)-3-nitro[l,5]naftyridín-4-amínu ako pevnej látky, 1.1. 97 - 99 °C.

Príklad 2 (referenčný príklad) Zlúčenina vzorca XXXIII 2-Metyl-l-(2-metylpropyl)-177-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridm

Časť A:

Síran horečnatý (3 g) a katalytické množstvo 5 % platiny na uhlí sa pridali do roztoku N⁴-(2-metylpropyl)-3-nitro[l,5]nafityridín-4-amínu (4,0 g, 16,2 mmol) v etylacetáte (250 ml). Reakčná zmes sa redukovala v Parrovej aparatúre pri tlaku vodíka 50 psi (3,5 kg/cm¹) počas 4 hodín. Reakčná zmes sa filtrovala na odstránenie katalyzátora a filtrát sa koncentroval za vákua na poskytnutie N⁴-(2-metylpropyl) [l,5]naftyridín-3,4-diamínu ako surovej pevnej látky.

Časť B:

Surová pevná látka z časti A sa preniesla do kyseliny octovej, zlúčila s anhydridom kyseliny octovej a potom zahrievala cez noc pod refluxom. Reakčná zmes sa koncentrovala za vákua. Výsledný zvyšok sa zlúčil s metanolom na rozklad nadbytku anhydridu kyseliny octovej, potom sa koncentroval za vákua. Výsledný zvy7 šok sa zlúčil s cyklohexánom, potom sa koncentroval za vákua na odstránenie kyseliny octovej. Výsledný zvyšok sa rekryštalizoval z hexánov na poskytnutie 2,2 g 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridínu ako bielych ihličiek, 1.1 118- 119 °C.

Analýza: Vypočítané pre C₁₄H₁₆N₄: % C 69,97; % H 6,71; % N 23,31; nájdené: % C 69,24; % H 6,67; %N 23,23.

Príklad 3 (referenčný príklad)

Zlúčenina vzorca (XXXIV)

2-Metyl-1-(2-metylpropyl)-1 H-imidazo[4,5-c] [ 1,5]nafryridín-5A^ľ-oxid

3-Chloroperoxybenzoová kyselina (4,5 g 50 %, 13,1 mmol) sa pridala po malých častiach počas 30 minút do roztoku 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l#-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridínu (2,1 g, 8,7 mmol) v chlorofbrme pri teplote okolia. Po 3 hodinách sa reakčná zmes riedila chloroformom, premyla dvakrát 2,0 M hydroxidom sodným, jedenkrát vodou, a jedenkrát soľankou, vysušila sa pomocou síranu horečnatého a potom koncentrovala za vákua. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (silikagél eluujúci 5 % metanolom v dichlórmetáne) na poskytnutie 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-5A^ľ-oxidu ako pevnej látky, 1.1. 228 - 230 °C.

Analýza: Vypočítané pre Ci₄H₁₆N₄O: % C 65,61; % H 6,29; % N 21,86; nájdené: % C 65,73; % H 6,31; % N 21,95.

Príklad 4

Zlúčenina vzorca (I)

2-Metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-4-amin

NH₂

Hydroxid amónny (10 ml) sa pridal do roztoku 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-17/-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-5/V-oxidu (1,1 g, 4,29 mmol) v dichlórmetáne (50 ml). Reakčná zmes sa ochladila v ľadovom kúpeli, potom sa pridal toluénsulfonyl chlorid (0,82 g, 4,29 mmol) v dichlórmetáne. Reakcia bola zahrievaná na asi 30 °C za rýchleho miešania. Reakčná zmes sa cez noc miešala pri teplote okolia. Dichlórmetánová vrstva sa separovala, premyla 10 % hydroxidom sodným, vodou a soľankou, vysušila sa pomocou síranu horečnatého, potom sa koncentrovala za vákua. Zvyšok sa rekryštalizoval z etylacetátu na poskytnutie 0,8 g 2-metyl-l-(2-metylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyndín-4-amínii ako pevnej látky, 1.1. 228 - 230 °C.

Analýza: Vypočítané pre Ci₄Hi₇N₅: % C 65,86; % H 6,71; % N 27,43; nájdené: % C 65,65; % H 6,69; % N 27,59.

Testovacie metódy

Cytokínová indukcia v ľudských bunkách

Na testovanie cytokínovej indukcie zlúčeninami podľa vynálezu sa použil in vitro systém s ľudskými krvnými bunkami. Aktivita je založená na meraní interferónu a faktora (a) nekrotizujúceho nádor (IFN a TNF) vylučovaného do kultivačného média ako opisuje Testerman a kol. V „Cytokine Induction by the Immunomodulators Imiquimod a S-27609“, Joumal of Leukocyte Biology, 58, 365 - 372 (september 1995).

Príprava krvných buniek na kultiváciu

Krv sa získala od zdravých ľudských jedincov, zbierala sa pomocou odberu zo žily do EDTA skúmaviek. Jednojadrové bunky z krvného obehu (PBMCs) sa získali z celej krvi pomocou Histopaque®-1077 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), centrifugáciou. PBMCs sa suspendovali v 1,5 x 10⁶ buniek/ml v RPMI 1640 médiu obsahujúcom 10 % hovädzie sérum, 2 mM L-glutamínu a 1 % penicilín/streptomycín roztok (RPMI úplné). 1 ml časti PBMC suspenzie sa naniesli na 24 jamkovú kultivačnú platňu, pričom jamky mali ploché dno.

Príprava zlúčeniny

Zlúčeniny sú rozpustené v dimetylsulfoxide (DMSO). Koncentrácia DMSO by nemala byť vyššia ako konečná koncentrácia 1 % na pridanie do kultivačných jamiek. Zlúčeniny sú všeobecne testované v koncentračnom intervale od 0,1 do 100 pm.

Inkubácia

Roztok testovanej zlúčeniny je pridaný do jamiek obsahujúcich 1 ml PBMCs v médiu. Platne sú pokryté plastickým vrchnákom, jemne premiešané a potom inkubované počas 18 až 24 hodín pri 37 °C v 5 % atmosfére oxidu uhličitého.

Separácia

Po inkubácii sú platne centrifugované počas 5-10 minút pri 1000 rpm (-200 x g) pri 4 °C. Bunkový kultivačný supematant sa odstránil pomocou sterilnej polypropylénovej pipety a preniesol sa do 2 ml sterilnej kryoskúmavky. Vzorky sú udržiavané pri -70 °C až do analýzy.

Interferónová analýza/výpočet

Interferón bol stanovený pomocou biotestu použitím A549 ľudských pľúcnych karcinómových buniek vyvolávajúcich encephalomyocarditis. Detaily tejto testovacej metódy sú opísané G. L. Brennanom a L. H. Kronenbergom v „Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates“, Biotechniques, jún/júl, 78, 1983, zahrnuté tu ako odkaz. V krátkosti je možné opísať túto metódu nasledovne: A549 bunky sú inkubované so vzorkami a štandardnými interferónovými roztokmi pri 37 °C počas 24 hodín. Inkubované bunky sú potom infikované inokuláciou vírusom encephalomyocarditis. Infikované bunky sú inkubované počas ďalších 24 hodín pri 37 °C pred kvantifikáciou vírusového cytopatického efektu. Vírusový cytopatický efekt je kvantifikovaný pomocou farbenia, po ktorom nasleduje vizuálne pozorovanie platní. Výsledky sú interpretované ako alfa referenčné jednotky/ml založené na hodnote získanej pre NIH ľudský leukocytový IFN štandard.

Analýza faktora nekrotizujúceho nádor (TNF-a)

Koncentrácia faktora neterorizujúceho nádor TNF-α je stanovená s použitím ELISA testu od Genzyme, Cambridge, MA: Výsledky sú vyjadrené ako pg/ml.

V uvedenej tabuľke „+“ znamená, že zlúčenina indukovala cytokín pri danej koncentrácii, znamená, že zlúčenina neindukovala cytokín pri danej koncentrácii a „±“ znamená, že výsledky boli pri danej koncentrácii nejasné.

Indukcia cytokínov v ľudských bunkách
	IFN Ί	TNF
Príklad	Koncentrácia dávky (μΜ)	Koncentrácia dávky (μΜ)
	0,1	1,0	10,0	100,0	0,1	1,0	10,0	100,0
4	nebežala	+	+	+	nebežala	-	+	-

Indukcia interferónu a v ľudských bunkách

Krv z obehového systému in vitro sa použila na testovanie indukcie interferónu pomocou zlúčenín podľa vynálezu. Aktivita je založená na meraní interferónu vylučovaného do kultivačného média. Interferón je meraný pomocou biotestu.

Príprava krvných buniek na kultiváciu

Krv sa zbierala pomocou odberu zo žily do EDTA skúmaviek. Jednojadrové bunky z krvného obehu (PBM's) sa získali z celej krvi pomocou LeucoPREP® značkovej skúmavky na separáciu krvi (k dispozícii od Becton Dickinson) alebo -Ficoll-Paque® roztoku (k dispozícii od Pharmacia LKB Biotechnology Inc, Piscataway, NJ). PBM's sa suspendovali v množstve 1 x 10⁶/ml v RPMI 1640 médiu (k dispozícii od GIBCO, Grand Island, NY) obsahujúcom 25 mM HEPES (V-2-hydroxyetylpiperazín-/V’-2-etánsulfonovú kyselinu) a L-glutamín (pridaný 1 % penicilín-streptomycínový roztok) s pridaným 10 % teplom inaktivovaným (56 °C počas 30 minút) autológnym sérom 200 μΐ časti PBM suspenzie sa naniesli na 96 jamkovú kultivačnú platňu, pričom jamky mali ploché dno.

Príprava zlúčeniny

Zlúčeniny sú rozpustené v etanole, dimetylsulfoxide alebo tkanivovej kultivačnej vode, zriedenej tkanivovej kultivačnej vode, 0,01 N hydroxide sodnom alebo 0,01 N kyseline chlorovodíkovej (výber rozpúšťadla bude závisieť od chemických charakteristík zlúčeniny, ktorá je testovaná). Koncentrácia DMSO alebo etanolu by nemala byť vyššia ako konečná koncentrácia 1 % na pridanie do kultivačných jamiek. Zlúčeniny boli na začiatku testované v koncentračnom intervale od 0,1 do asi 5 pg/ml. Zlúčeniny, ktoré majú indukciu pri koncentrácii 0,5 pg/ml, boli testované v širšom koncentračnom intervale.

Inkubácia

Roztok testovanej zlúčeniny bol pridaný v objeme (menej než alebo rovnajúcom sa 50 μΐ) do jamiek obsahujúcich 200 μΐ zriedenej krvi alebo PBM's v médiu. Rozpúšťadlo a/alebo médium boli pridané do kon trolných jamiek (jamky s netestovanou zlúčeninou), a ak to bolo potrebné, objem bol vyrovnaný na 250 μΐ. Platne sú pokryté plastickým vrchnákom, jemne vortexované a potom inkubované počas 48 hodín pri 37 °C v atmosfére 5 % oxidu uhličitého.

Separácia

Po inkubácii boli platne pokryté parafilmom a potom sa centiifugovali počas 5 - 10 minút pri 1000 rpm pri 4 °C v Damon IEC Model CRU-5000 centrifúge. Médium (asi 200 μΐ) sa odstránilo zo 4 až 8 jamiek a prenieslo sa do 2 ml sterilných kryoskúmaviek. Vzorky boli udržiavané pri -70 °C až do analýzy.

Interferónová analýza/výpočet

Interferón bol stanovený pomocou biotestu použitím A549 ľudských pľúcnych karcinómových buniek vyvolávajúcich encephalomyocarditis. Detaily tejto testovacej metódy sú opísané G. L. Brennanom a L. H. Kronenbergom v „Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates“, Biotechniques, jún/júl, 78, 1983, zahrnuté tu ako odkaz. V krátkosti je možné opísať túto metódu nasledovne: interferónové roztoky a A549 bunky sú inkubované pri 37 °C počas 12 až 24 hodín. Inkubované bunky sú potom infikované inokuláciou vírusom encephalomyocarditis. Infikované bunky sú inkubované počas ďalšej periódy pri 37 °C pred kvantifikáciou vírusového cytopatického efektu. Vírusový cytopatický efekt je kvantifikovaný pomocou farbenia, po ktorom nasleduje spektrofotometrické meranie ábsoŕbancie. Výsledky sú interpretované ako alfa referenčné jednotky/ml založené na hodnote získanej pre NIH HU IF-L štandard. Interferón bol identifikovaný ako celý interferón alfa testovaním v neutralizačnom teste proti zajačiemu neľudskému intcrferónu (beta) a koziemu neľudskému interferónu (alfa) použitím A549 bunkových monovrstiev vystavených vírusu encephalomyocarditis.

V uvedenej tabuľke „+“ znamená, že zlúčenina indukovala interferón a pri danej koncentrácii a znamená, že zlúčenina neindukovala interferón oc pri danej koncentrácii a „±“ znamená, že výsledky boli nejasné pri danej koncentrácii.

Indukcia interferónu a v ľudských bunkách
Príklad	Koncentrácia dávky (pg/ml)
	0,1	0,05	0,10	0,50	1,0 1 5,0	10,0	25,0	50,0
4	-	+	+	+	+ 1 +		+	+

Predkladaný vynález bol opísaný s odkazom na niektoré uskutočnenia. Uvedený detailný opis a príklady boli uvedené len na objasnenie predmetu vynálezu a rozhodne nie na účely jeho limitovania. Odborníkom v odbore je zrejmé, že je možné urobiť rôzne zmeny bez toho, aby išli nad rámec vynálezu. Predmet vynálezu bude presne opísaný pomocou nasledujúcich patentových nárokov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 2-Metyl-l-(2-metylpropyl)-l/7-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridín-4-amín alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
2. Farmaceutická kompozícia obsahujúca farmaceutický účinné množstvo zlúčeniny alebo soli podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
3. Zlúčenina alebo soľ podľa nároku 1 na použitie pri indukcii biosyntézy cytokínu u živočíchov.
4. Použitie zlúčeniny alebo soli podľa nároku 1 na prípravu liečiva na indukciu biosyntézy cytokínu u živočíchov.
5. Zlúčenina alebo soľ podľa nároku 1 na použitie pri liečení vírusovej infekcie u živočíchov.
6. Použitie zlúčeniny alebo soli podľa nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie vírusovej infekcie u živočíchov.