SE436969B - Sett att framstella humanspecifikt interferon - Google Patents

Description

790049:-3 10 15 20 25 30 35 2 Sättet enligt föreliggande uppfinning, som har de i patentkraven angivna särdragen, utmärks av att man i stället för att inokulera eller odla etablerade humana celler i ett odlingsmedium in vitro transplanterar etablerade humana celler till andra varmblodiga djur eller inokulerar cellerna i en diffusionskamma- re, i vilken cellerna förökas, medan djuren får förse cellerna med sina närande kroppsvätskor, och in vívo eller in vitro utsätter de erhållna cellerna för inverkan av ett interferoninducerande medel, varigenom en stor mängd interferon lätt framställs. Föreliggande uppfinning bygger också på upptäckten att det genom det här angivna sättet framställda interferonet är ett effektivt och utmärkt preparat för förebyggande och behandling av interferonkänsliga sjukdomar.

I jämförelse med konventionella förfaranden, som används för förökning av celler in vitro, har sättet enligt föreliggande uppfinning fördelen att det kräver inget eller mycket mindre näringsmedium kompletterat med dyrt humant serum, att förökningen av etablerade celler lättare kan upprätthâllas, och att man kan uppnå en högre interferonaktivitet. Etablerade humana celler kan lätt förökas i andra varmblodiga djurkroppar, antingen genom transplantation av cellerna till dessa eller genom inokulering av en diffusionskammare, som innehåller cellerna, på ett djur, som utfodras på sedvanligt sätt, medan djuret får förse cellerna med sin närande kroppsvätska. Vidare har sättet enligt föreliggan- de uppfinning i jämförelse med konventionella in vitro-metoder fördelen att etablerade humana celler förökas stabilare och snabbare, och att man kan uppnå en högre cellproduktion och ett högre interferonutbyte per cell.

Man kan använda varje slag av etablerade humana celler, såtillvida som de lätt kan förökas, när de transplanteras till andra varmblodiga djur.

Exempelvis kan man i enlighet med föreliggande uppfinning använda normala etablerade humana celler såsom OUMS-ZO-celler, OUMS-ZS-celler, HBF-cel- ler, HUF-Z-celler eller WI-Bß-celler, beskrivna i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme" volym 20, nr 6, sid. 616-603 (1975), utgiven av Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, och etablerade celler härrörande från humana tumörceller såsom Namalva-celler, beskrivna i “Journal of Clinical Microbiology", volym 1, sid. 116- 117 (1975), BALL-l-celler, TALL-l-celler NALL-l-celler, beskrivna av Isao Miyoshi, ["Nature", volym 267, sid. 843-844 (1977)) eller JBL-celler, beskrivna av Isao Miyoshi, ["Cancer", volym 40, nr 6, i tryck (1977)).

Enligt föreliggande uppfinning kan man *använda vilket som helst varmblodigt djur, om etablerade humana celler lätt kan förökas däri, t.ex. fjäderfä såsom kycklingar eller duvor, eller däggdjur såsom hundar, katter, apor, getter, svin, nötboskap, hästar, kaniner, marsvin, råttor, hamstrar, normala möss eller nakna möss. l0 15 20 25 30 35 790-0493-3 3 Eftersom djur är benägna att uppvisa oönskade immunoreaktloner, när de etablerade humana cellerna transplanteras i dem, är det särskilt föredraget att använda djuren på lägsta möjliga utvecklingsstadium, nämligen ägg, embryo, fetus, nyfödda och unga djur, för utnyttjande av immunoparalys.

Före transplantationen av cellerna kan djuren förbehandlas, antingen med röntgenstrâlning eller gammastrâlning med 200-600 rem eller med antiserum eller ett immunosuppressivt medel för att undertrycka immunoreaktionerna.

.Som varmblodigt djur föredras naken mus, eftersom den inte uppvisar någon eller endast låg immunoreaktion, och eftersom etablerade humana celler kan transplanteras och förökas snabbt däri utan förbehandlingar.

I Förökningen av etablerade humana celler kan stabiliseras ytterligare, om cellerna först transplanteras till hamstrar och därpå transplanteras till nakna möss, där det induceras interferon med ökad aktivitet. l detta fall kan de förökade cellerna ytterligare transplanteras från ett varmblodigt djur till ett annat djur av samma art, släkte, klass eller division med undantag av människor. Etablerade humana celler kan transplanteras till vilken del som helst av en djurkropp, såtillvida som de lätt kan förökas däri, t.ex. intravenöst, intraperitonealt, subkutant eller i allantoishâlígheten. l stället för att föröka naturliga humana celler direkt i djurkroppar kan, som ovan nämnts, etablerade humana celler inokuleras och förökas i diffusions- kamrar av olika former och storlekar försedda med ett filtermembran med porer på ca l0'7-lO“5 m i diameter, t.ex. ett membranfilter, ultrafilter eller hàlfiber, och kammaren anbringas på djurkroppen, t.ex. intraperitonealt, varvid djuret får förse cellerna med sina näringskroppsvätskor, Etablerade humana celler kan vid behov förökas i diffusionskammaren, medan det varmblodiga djurets kroppsnäringsvätska får cirkulera in i och ut ur näringsmediet i kammaren för att förse cellerna med näringsvätskan. I detta fall placeras kammaren på djurkroppen, varvid förökningsstadiet för cellerna kan observeras genom kammarens vägg, och antalet celler per djur kan ökas ytterligare, utan att ionödan avliva djuret, genom att man successivt avlägsnar kammaren, inokulerar cellerna i en annan kammare, som innehåller färskt näringsmedium, och anbringar den sistnämnda kammaren på samma djur.

Diffusionskammarmetoden har de ytterligare fördelarna, att vilket varmblodigt djur som helst, med undantag av människan, kan användas för förökning av etablerade mänskliga celler, att förbehandling för undertryckande av immunoreaktioner inte krävs, och att etablerade humana celler, som förökats i kammaren, lätt kan uppsamlas utan förorening med djurceller, eftersom de humana cellerna inte kommer i direkt kontakt med djurceller och det inte 10 15 20 25 30 35 'fåißöflfåšešš 4 föreligger någon risk för oönskade reaktioner.

Efter transplantationen av de humana cellerna utfodras djuret på sedvanligt sätt utan speciell behandling.

F örökningsperioden för naturliga humana celler är vanligtvis 1-20 veckor.

Om de naturliga celler, som transplanteras, är sådana som härrör från normala eller tumorala leukocyter, är cellförökningshastigheten så hög, att förökníngen vanligtvis kan uppnås inom loppet av en period på l-5 veckor.

Antalet förökade humana celler har beräknats och bestämts till ca 107- 1012 eller mer per djur.

Sättet enligt föreliggande uppfinning är med andra ord särskilt fördelak- tigt för framställning av interferon, eftersom antalet celler som transplanteras eller inokuleras på djuret ökas ungefär 102-107 gånger eller mer genom sättet; det är 101-106 gånger eller mer än vad som uppnås genom inokulering och förökning av samma celler i ett näringsmedium in vitro.

De förökade levande humana cellerna kan induceras att producera interferon på något godtyckligt sätt. Själva den del av djurkroppen, där cellerna förökas, kan exponeras för ett interferoninducerande medel. Interferon kan t.ex. framställas genom att man direkt utsätter de suspenderade humana celler, som förökats intraperitonealt, eller humana tumörceller bildade subkutant för interferoninducerande medel för inducering av interferon, och uppsarnlar och renar det inducerade interferonet från de exponerade humana cellerna. lnterferon kan även induceras genom att man uppsamlar de förökade humana cellerna från djurkropparna och utsätter cellerna för ett interferon- inducerande medel in vitro. l-lumana celler, som erhållits genom uppsamling av suspenderade humana celler, som förökats intraperitonealt, eller sådana som erhållits genom dissociering av en isolerad human massiv tumör, som bildats subkutant i djurkroppar, kan tex. suspenderas i ett näringsmedium, som hålls vid 8 celler per minnnef. ca 20-l4-0°C för bildning av en suspension på ca 105-10 Därpå utsätts cellerna för interferoninducerande medel för inducering av interferon, och det bildade interferonet uppsamlas och renas.

När de humana cellerna förökas i diffusionskamrar, kan cellerna exponeras för interferoninducerande medel i kamrarna eller efter utvinning av cellerna från kamrat-na.

Vid induceringen av interferon kan produktionen av interíeron ökas ytterligare på i och för sig kända sätt, t.ex. priming med användning av interferon och superinduktion med användning av en metabolisk inhibitor.

Interferonproduktionen per djur kan ökas ytterligare genom följande metoder: 10 15 20 7900493-3 5 a) ett förfarande, vid vilket man kan öka antalet levande celler per djur ytterligare utan att i onödan avliva djuret genom att successivt avlägsna kammaren, inokulera cellerna i en annan kammare, som innehåller färsk näringsvätska, och placera den sistnämnda kammaren på samma djur; b) ett förfarande, vid vilket man exponerar de humana celler, som förökats i djurkroppen, för ett interferoninducerande medel in vivo och/eller in vitro för inducering av interferon med användning av samma celler en eller flera gånger.

Man kan fritt använda vilken känd interferoninducerare som helst, t.ex. virus, bakterier, protozoer, rickettsier, nukleinsyra, endotoxin eller polysackarid.

Det bildade interferonet kan lätt renas med i och för sig kända renlngsmetoder, t.ex. utsaltning, dialys, filtrering, centrifugering, uppkoncentre- ring och lyofilisering. Det utvunna interferonpreparatet kan, om så erfordras, renas ytterligare på i och för sig känt sätt såsom adsorption och desorption med jonbytare, geifiltrering, affinitetskromatografi, isoelektrisk punkt-fraktionering och elektrofores. I lnterferonaktiviteten bestäms med FL-celler härledda från human am- nion, såsom beskrivs i "Protein, Nucleíc Acid and Enzyme", vol. 20, nr 6, sid. 616- 643 (1975), utgiven av Kyoritsu Shuppan Co. Ltd., Tokyo, genom konventionell plaquereduktionsmetod. l-lemagglutinintitern bestäms enligt den metod som beskrivits av SLE.

Salk ["Journal of Immunology", volym 49, sid 87 (1944)).

Framställningen av interferon enligt föreliggande uppfinning belyses närmare genom följande utföringsexempel. 7900493-3 lov 15 20 25 30 35 Exempel A. Framställning av interferon.

Exempel A-l _ Till vuxna nakna möss transplanteras subl BALL-l-celler, och mössen utfordras på sedvanligt sätt i 3 veckor. Man isolerar ca IO g subkutant bildad massiv tumör per naken mus, vilken skärs fint och suspenderas i en saltlösning, som innehåller trypsin, för dissociering av tumören i celler, och cellerna uppsamlas genom centrifugering. Cellerna tvättas med "Eagle's minimal' essential medium" vid pH 7,2 och 37°C innehållande 5 volymprocent humanserum och resuspenderas till en koncentration pâ ca 5 x 106 celler per milliliter. Till den erhållna blandningen sätts ca 100 enheter per millilíter delvis renat humant artspecifikt interferon, och blandningen inkuberas i ca 2 timmar, ' varefter man tillsätter ungefär 300 hemagglutinintitrar per milliliter Sendai-virus och inkuberar i ytterligare 20 timmar för inducering av interferon. Den inkuberade lösningsblandningen centrifugeras vid ca 1000 g, och ca 4°C för eliminering av utfällningar, t.ex. celler. Den erhållna supernatanten dialyseras mot O,lM buffert- lösning med pH 2,0 innehållande saltsyra och kaliumklorid vid 4°C i 48 timmar och dialyseras därefter mot 0,0lM fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2 i l2 timmar och filtreras omsorgsfullt genom membranfiltering. Filtratet indunstas och lyofilíseras till ett interferonpulver med hög aktivitet. Interferonaktiviteten är ca 20.000.000 enheter per naken mus.

Exemæl A-2 Vuxna nakna möss transplanteras intraperitonealt med naturliga humant härledda OUMS-20-celler och utfordras på sedvanligt sätt i 5 veckor. Mössen injiceras intraperitonealt med "Newcastle disease"-virus, som från början har en hemagglutinintiter pâ ca 3000, men nästan är fullständigt förinaktiverat med hjälp av ultraviolett strålning, och avlivas efter 24 timmar, varpå ascitesvätskan uppsamlas. Vätskan centrifugeras vid ca 1000 g vid 4°C för elimínering av utfällningar, t.ex. celler. Supernatanten dialyseras mot O,lM buffertlösning vid pH 2,0 innehållande saltsyra och kaliumklorid vid LLOC i 48 timmar och dialyseras därefter mot 0,0lM fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,2 i 15 timmar och filtreras omsorgsfullt genom membranfiltering. Filtratet koncentreras till en interferonlös- ning med hög aktivitet. lnterferonaktiviteten är ca 700.000 enheter/ 10 nakna möss.

Exemæl A-3 Nyfödda hamstrar, som intraperitonealt injicerats med känt kanin- antilymfocytserum mot hamstertymocyter och" transplanterats subkutant med etablerade humant härledda JBL-celler, utfodras pâ sedvanligt sätt i 4 veckor. 10 15 20 25 30 35 7900093-3 Man isolerar ca 30g subkutant bildad massiv tumör per hamster, och tumören upplöses på liknande sätt som i exempel A-I. De erhållna cellerna tvättas med RPMl-IGIJO-medium, pH-värde 7,4 och 37°C, innehållande 10 volymprocent kalvserum, och resuspenderas, så att man får en koncentration på 12 x 107 celler per ml. Till den erhållna blandningslösningen sätts 200 enheter per ml delvis renat humant artspecifikt interferon, och blandningen inkuberas i ca ltimme. Efter tillsats av ca 100 hemagglutinintítrar per ml Sendai-virus inkuberas den resulterande blandningen i ytterligare 16 timmar för inducering av interferon.

Därefter renas den erhållna lösningen och koncentreras på liknande sätt som i exempel A-Z, så att man får en interferonlösning med hög aktivitet. lnterferonaktiviteten är ca l5.000.000 enheter per hamster.

Exempel A-ß Nyfödda råttor transplanteras intravenöst med etablerade humant härledda Namalva-celler och utfodras på sedvanligt sätt i 4 veckor. Man isolerar ca 50 g subkutant bildad tumör för varje råtta, och den upplöses på liknande sätt som i exempel A-l. Därpå behandlas de erhållna cellerna pâ liknande sätt som i exempel A-l för bildning av interferon. Den erhållna interferonlösningen renas och lyofiliseras på liknande sätt som i exempel A-l till ett interferonpulver med hög aktivitet. Interferonaktiviteten är ca 30.000.000 enheter per råtta.

Exemæl A-S Vuxna möss underkastas röntgenstrålbehandling med ca 1400 rem för att försvaga deras immunoreaktioner och transplanteras därpå subkutant med humant härledda etablerade TALL-l-celler och utfodras på sedvanligt sätt i 3 veckor. Man isolerar ca l0g subkutant bildad massiv tumör per mus, och den upplöses på liknande sätt som i exempel A-l. De erhållna cellerna behandlas pâ liknande sätt som i exempel A-3 för inducering av interferon. Den erhållna interferonlösningen renas och koncentreras på liknande sätt som i exempel A-2 till en interferonlösning med hög aktivitet. lnterferonaktiviteten är ungefär 8.000.000 enheter per mus.

Exempel A-6 Naturliga humana OUMS-25-celler transplanteras subkutant till hamstrar på liknande sätt som i exempel A-3 i 3 veckor och transplanteras därpå intraperitonealt i 10 dagar gamla, nakna möss. De nakna mössen utfodras på sedvanligt sätt i 5 veckor, anestetiseras, och ascitesvätskan uppsamlas. Vätskan centrifugeras för uppsamling av förökade celler. Cellerna tvättas och får inducera interferon på liknande sätt som i exempel A-l. Den erhållna interferonlösningen renas och 7900493-3 10 15 20 25 30 koncentreras på liknande sätt som i exempel A-2 för bildning av en interferon- lösning med hög aktivitet. Interferonaktiviteten är ungefär 2.000.000 enheter per naken mus.

Exempel A-7 Humanï härleddfi etablerade JBL-celler suspenderas i saltlösning i 10 ml cylindriska plastdiffusionskamrar försedda med ett membran med porer på ca 0,5 p i diameter. Kamrarna införlivas intraperitonealt i vuxna råttor. Råttorna utfodras på sedvanligt sätt i 4 veckor, och kamrarna avlägsnas. Koncentrationen av celler i kamrarna bestäms till ca 5 x 109 celler per milliliter, vilket är ca 103 gånger högre än det som uppnås in vitro på ett näringsmedium i en COz-inkubator. Cellerna i behandlas på liknande sätt som i exempel A-l för inducering av interferon. Den erhållna interferonlösningen renas, koncentreras och lyofiliseras till ett interferon- pulver med hög aktivitet. Interferonaktiviteten är ungefär 30.000.000 enheter per råtta.

Exempel A-8 Till allantoisvätskan i befruktade vita ägg, som inkuberats vid 37°C i 5 dagar, transplanteras humant härledda NALL-l-celler, och äggen inkuberas vid 37°C i en veckayÄggen öppnas och de förökade cellerna uppsamlas. Cellerna behandlas på liknande sätt som i exempel A-l för inducering av interferon. Den erhållna interferonlösningen renas och koncentreras på liknande sätt som i exempel A-Z för bildning av en interferonlösning med hög aktivitet. Interferonaktiviteten var ca 400.000 enheter/ 10 fertila vita ägg.

Exempel A~9 Det genom sättet i exempel A-l framställda interferonpulvret renas ytterligare enligt de metoder som beskrivits av G. Bodo (Symposium on Prepara- tion, Standardization and Clinical Use of Interferon, "llth international Immuno- biological Symposium", 8 ö: 9 juni, 1977, Zagreb, Jugoslavien), dvs. adsorptionoch desorption med jonbytare, molekylviktfraktionering genom gelfiltrering, koncentre- ring och omsorgsfull filtrering med membranfilter. Den erhållna interferonlös- ningen har en aktivitet på 2 x 106 enheter per mg protein. lnterferonutbytet är ca 40%. i Det i exemplen A-l till A-9 erhållna iinterferonet kan med fördel användas separat eller i blandningar med en eller flera andra substanser som injektionspreparat och preparat för extern och intern användning för förebyggande _10 15 20 25 30 7900493-3 ' och behandling av interferonkänsliga humana sjukdomar. Uppfinningen belyses ytterligare av följande experiment: Exæriment l Behandling av virussjukdomar med interferon (inhiberingstest för virusför- ökning in vitro).

Till monoskikt av humana embryoniska lungceller bildade genom en primär kultur i Petri-skålar med 6 cm diameter sätts 0, l, 10 eller l00 enheter av det interferon, som framställts genom sättet i exempel A-9 och de erhållna blandningarna ínkuberas i en 5 volymprocent COz-inkubator vid 37°C i 20 timmar.

Till cellerna sätts Varicella-zoster-virus eller humant cytomegalovirus i en mängd, så att det bildas ca 100 plaquer, när inget interferon sätts till cellerna. Blandningen inkuberas, och antalet bildade plaquer räknas.

Interferons inhiberingsverkan på virusförökningen bestäms med användning av följande ekvation: A - B minskning av plaque-antalet (96) = x l00 där A är antalet plaquer, när man inte tillsätter interferon, och B är antalet plaquer, när interferon tillsätts. Resultaten anges i tabell I.

Tabell I.

Antal enheter Varicella-zoster-virus Humant cytomegalovirus 0 096 096 l 1296 596 10 53% 6496 100 9196 8496 Det framgår klart av resultaten i tabell I, att interferonet enligt föreliggande uppfinning hämmar förökningen av sjukdomsframkallande virus. Ingen abnormitet observeras hos de odlade humana cellerna, när interferon sätts till cellerna. « Experiment 2 Behandling av icke-virala sjukdomar med interferon. l) Inhiberings test för förökning av tumörceller in vitro.

Till RPMl-IGQO-medium kompletterat med 15 volymprocent fetalt kalv- serum sätts det genom sättet i exempel A-9 framställda interferonet, så att man 1900493-3 '10 15 20 25 30 10 får koncentrationer på 30, 300 resp. 3000 enheter per milliliter. De erhållna blandningarna inokuleras med humana tumörceller till bildning av en koncentration på 5 x 105- celler per milliliter och inkuberas i 5 volymprocents COz-inkubator vid 37°C i 5 dagar. Därefter räknas antalet celler per milliliter medium. Kontroller framställda som ovan med undantag av att interferonet föraktiveras genom uppvärmning till IOOOC i 30 minuter inkuberas på liknande sätt. Interferonets hämmande verkan pâ cellförökníngen bestäms med följande ekvation: (A-sxioj) - (ß-fixioj) Hämning av cellíörökning (96) = x 100 (A-sxuf) där A är antalet celler i kontrollen, och ß är antalet celler vid interferonbehand- lingstestet. Resultaten är angivna i tabell II.

Tabell Il.

Interferonkoncentration Humana tumörceller (enheter per m1) ßALL-i IALL-l NALL-l JBL 30 I +l8% +l296 +2l% +l996 300 +5796 +6196 +6396 +54% 3000 +8896 +8296 +8596 +9-l96 Det framgârfsklart av resultaten i tabell li, att interferonet hämmar förökníngen av tumörceller såsom BALL-l-celler, TALL-l-celler, NALL-I-celler och JBL-celler i särskilt hög grad, och att interferonet är verksamt i koncentra- tioner i området från 30 till 3000 enheter per milliliter. 2) Inhiberingstest för förökning av tumörceller in vivo.

~Testet utförs på 8 nakna möss, som är ca 2 månader gamla. Man trans- 6 TALL-l-celler (tumörceller) subkutant i varje mus. Från den planterar 7,5 x lO tredje dagen efter transplantatlonen fâr I! möss intraperitonealt 20 doser interferon framställt genom sättet i exempel A-3, varvid en dos är 10.000 enheter per naken mus, och man ger 3 doser per vecka. Efter transplantationerna utfodras mössen i 48 dagar och avlivas. Vâtvikten för de i mössen bildade tumörerna bestäms. De återstående 4 mössen används som kontroller och utfodras och avlivas på liknande sätt med undantag av att de inte får interferonet. Vâtvikten för de bildade massiva tumörerna bestäms. 10 15 20 25 19oo49z-3 11 Resultaten är angivna i tabell III.

Tabell III.

Kontroll lnterferonbehandlingstest 1 5,8 g 1,6 g 2 8,8 g 1,1 g 3 4,3 g 0 g 4 7,5 g ' 0 g Medelvikt 6,6 g_ 0,7 g 3) I Inhiberingstest för förökning av tumörceller in vivo.

Testet utförs med 8 nakna möss, som är ca 2 månader gamla. l alla mössen transplanteras 107JBL-celler (tumörceller) per naken mus subkutant. Från tredje veckan efter transplantationen får 4 möss intraperitonealt 8 doser av interíeronet framställt genom sättet i exempel A-Z, varvid en dos är 1000 enheter per naken mus, och man ger 2 doser per vecka. Efter transplantationen utfodras mössen i 42 dagar och avlivas. Våtvikten för de bildade tumörerna bestäms. De återstående 4 mössen, som används som kontroller, utfodras och avlivas på liknande sätt med 'undantag av att de inte får interferonet. Vâtvikten för de bildade tumörerna bestäms.

Resultaten är angivna i tabell IV.

Tabell IV.

Kontroll Interferonbehandlingstest 1 4,5 g 0,7 g 2 4,9 g 1,4 g 3 17,1 g 0,9 g 4 20,3 g 0,7 g Medelvikt 11,7 g 0,9 g Det framgår klart av resultaten i tabell III och IV, att interferonet in- hiberar bildningen av human massiv tumör i mus, och att även om tumör bildas, dennas vikt är mycket mindre än hos kontrollerna. I jämförelse med kontrollerna har de interferonbehandlade nakna mössen 8D Starkare äPïíI 0Ch är mel' fySiSkt 10 15 20 25 30 35 7900493-3 12 aktiva.

ExEriment 3 Akut toxicitetstest utförs med 20 dagar gamla möss genom injicering av den vid sättet enligt exempel A-9 framställda interferonlösningen. Resultaten visar en extremt låg toxicitet; LD jo-värden på mer än 20.000.000 enheter per kg, när den injiceras intraperitonealt i möss.

Det framgår klart av de ovan beskrivna experimenten, att de här nämnda interferonkänsliga sjukdomarna är sådana, som kan förebyggas eller behandlas med det här behandlade interferonet, dvs. virussjukdomar såsom epidemisk keratokonjunktivit, herpetisk keratit, influensa, röda hund och serum- hepatit och icke-virala sjukdomar såsom leukemi och osteosarkom.

Mediciner eller terapeutiska medel för interferonkänsliga sjukdomar . som innehåller interferon kan framställas i olika former och faser i överensstäm- melse med slutanvändningen, dvs. flytande preparat såsom nebula, ögondroppar, näsdroppar, gurgelmedel, injektionspreparat, pastapreparat såsom salvor, och fasta preparat såsom pulver, granuler eller tabletter.

Preparaten är tillräckligt verksamma för att förebygga och behandla interferonkänsliga sjukdomar, om de generellt innehåller l-l0.000.000 enheter interferon per gram. Preparaten kan vid behov uppblandas med en eller flera av följande komponenter: terapeutiska medel, bärare, fyllmedel och stabiliserings- medel.

Eftersom interferon lätt elimineras från blodet inom loppet av 10 minuter och avskiljs från systemet, när det injiceras intravenöst, fås särskilt genom tilldroppningsadministrering av interferon, t.ex. genom att införliva interferon i en infusionssockerlösníng, ett medel för att förlänga administrations- tiden för att få fullt och effektivt utnyttjande av det tillförda interferonet och för ytterligare förbättring av den terapeutiska och profylaktiska verkan av interferon på interferonkänsliga sjukdomar.

Nedan beskrivs nâgra utföringsformer av interferonhaltiga preparat: Exempel B. Preparat.

Exemæl B-l Ett flytande preparat.

Ett flytande preparat framställs med saltlösning och det genom Sättet enligt exempel A-l framställda interferonet till en interferonkoncentration på 500 enheter per millimeter. Preparatet är lämpligt som nebula, ögondroppar, näsdroppar och. gurgelmedel för förebyggande "och behandling av av virala sjukdomar, särskilt epidemisk keratokonjunktivit och influensa.

Exemæl B-2 i En injektionslösning. 10 15 20 25 30 35 7900493-3 13 En injektionslösning framställs med saltlösning och det genom sättet i exempel A-9 framställda interferonet, så att man får en interferonkoncentration på 100.000 enheter per milliliter. Injektionslösningen är lämplig för behandling av alla interferonkänsliga sjukdomar, såsom virala eller tumörsjukdomar.

Exemæl B-3 En sockerinfusionslösning.

Man framställer en sockerinfusionslösning genom att blanda 1.000.000 enheter interferon framställt genom sättet enligt exempel A-S och 10 mg cyklofosfamid med 500 ml av en 1096 (vikt/vol.) vattenhaltig maltoslösning.

Sockerinfusionslösningen är lämplig som en lösning för kontinuerlig intravenös infusion för behandling och förebyggande av tumörsjukdomar.

Exemæl B-li En injektionslösning.

Man framställer en injektionslösning med 100 ml 10% (vikt/vol.) vattenhaltig maltoslösning, 500.000 enheter av det genom sättet enligt exempel A-6 framställda interferonet och 2 mg mitomycin C. Injektionslösningen är särskilt lämplig för behandling av tumörsjukdomar.

Exemæl 5-5 En salva.

Man framställer en salva på sedvanligtsätt genom blandning av det genom sättet i exempel A-l! framställda interferonpulvret med vaselin och flytande paraffin för uppnående av en interferonaktivitet på 10.000 enheter per gram. Preparatet är lämpligt för behandling av virushudsjukdomar.

Exemæl 13-6 Tabletter.

Man framställer tabletter på sedvanligt sätt genom att tablettera en blandning av det genom sättet i exempel A-7 framställda interferonet, stärkelse- och maltos, så att en interferonaktivitet på 1000 enheter per tablett (100 mg) uppnås. Tabletterna är lämpliga för förebyggande och behandling av virussjuk- domar i matsmältningssystemet. i Exemæl B-7 Ett flytande preparat.

Ett flytande preparat för oral administrering framställs med 10 ml av en 1096 (vikt/vol.) vattenhatlig maltoslösning, 200.000 enheter av det genom sättet enligt exempel A-8 framställda interferonet och 5 g metotrexat.

Preparatet är särskilt lämpligt för behandling av tumörsjukdomar.

Claims (10)

1. 0 15 20 25 30 35 79001193-3 lll- PATENTKRAV l. Sätt att framställa humanspecifikt interferon, kännetecknat avattman med hjälp av ett icke-humant varmblodigt djur förökar etablerade humana celler med förmåga att producera humanspecifikt interferon genom att man antingen (a) transplanterar nämnda etablerade humana celler till nämnda icke-humana varmblodiga djur, utfodrar djuret för att tillåta de humana cellerna att utnyttja djurets näríngskroppsvätska för sin förökning, och uttar och sönderdelar den resulterande tumör som bildats i djuret för att erhålla de förökade humana cellerna, eller (b) suspenderar nämnda etablerade humana celler i en anordning, i vilken näringskroppsvätska från nämnda icke-humana varm- blodiga djur tillförs till de humana cellerna, inbäddar eller placerar anordningen i .eller på det icke-humana varmblodiga djuret på sådant sätt att näringskropps- vätska från djuret tillförs till de humana cellerna inuti anordningen, utfodrar djuret för att tillåta de humana cellerna att utnyttja näringskroppsvätskan för sin förökning, och skördar de förökade humana cellerna från anordningen; i exponerar de genom transplantation eller i nämnda anordning förökade humana cellerna för en interferoninducerare in vivo eller in vitro för att inducera produktion av humanspecifikt ínterferon; och utvinner det resulterande humanspecifika interferonet.

2. Sätt enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda etablerade humana celler med förmåga att producera humanspecifikt interferon är av tumörursprung.

3. Sätt enligt patentkravet l, _ k ä n n e t e c k n a t av att nämnda etablerade humana celler med förmåga att producera humanspecifikt interferon är av leukocytursprung.

4. Sätt enligt något av patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att de etablerade humana cellerna med förmåga att producera humanspecifikt interferon är OUMIS-ZO-, OUMS-25~, HEF-, l-lUF-2-, WI-38-, Namalva-, BALL-1-, NALL-l-, TALL-l- eller JBL-celler.

5. Sätt enligt något av patentkraven l-lß, _ k ä n n e t e c k n a t av att nämnda anordning är en diffusionskammare försedd med ett eller flera membranfilter, ultrafilter eller hålfibrer med en porstorlek av 1o'7-1o'5m.

6. Sätt enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret utfodras i 1-20 veckor. m 15 7900493-3 15

7. Sätt enligt något av patentkraven 1-6, k ä n n e t e c k n a t av att de förökade humana cellerna exponeras för en interferoninducerare i suspension vid en celldensitet i intervallet 105-108 celler per ml medium och vid en temperatur i intervallet 20-40°C.

8. Sätt enligt något av patentkraven 1-7, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret är ett däggdjur eller ef: fjäderfä.

9. Sätt enligt patentkravet 8, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret är kyckling, duva, hund, katt, apa, get, gris, ko, häst, kanin, marsvin, råtta, hamster, mus eller naken mus.

10. l0. Sätt enligt något av patentkraven 1-9, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda exponerings- och utvinningssteg innefattar ^ att man odlar de íörökade humana cellerna på ett in vitro-kulturmedium som innehåller en effektiv mängd av en interferoninducerare under lämpliga betingel- ser för ackumulering av en betydande mängd humanspecifikt interferon och utvinner det ackumulerade humanspeciflka interferonet ur kulturen.