JPS61263929A - 抗タイプ２インターフェロン感受性疾患剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タイプ■インターフェロン感受性疾患予防剤
および治療剤の製造方法に関する。

インターフェロンは、小林茂保著「インターフェロンＪ
　１９７５年　株式会社講談社発行、Ｄ、Ａ、Ｊ。

Ｔｙｒｒｅｌｌ著「ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ　ａｎｄ　Ｉ
ｔｓ　Ｃ１１ｎｉｃａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｊ　１９
７６年　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ　Ｍｅｄ
ｉｃａｌＢｏｏｋｓ　ｌｔｄ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）発行
、［蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ、２１　Ａ４　Ｊ　（
１９７６）などにも記載されているように、例えばウィ
ルス、細菌、原虫、リケッチャ、核酸、エンドトキシン
、多糖類などのインターフェロン誘導剤を生細胞に作用
させることによって、その細胞内外に誘導生成される蛋
白質様物質であって、その細胞内での各種ウィルスの増
殖を非特異的に抑制する機能を持つ物質に与えられた名
称である。

インターフェロンの持つこのような機能から、インター
フェロンはその発見の当初よリウィルス性疾患の予防剤
、治療剤として期待されてきた。

また近年、インターフェロンはウィルス性腫瘍のみなら
ず、非ウィルス性腫瘍に対しても抗腫瘍性が認められる
ようになって、医薬品としてのインターフェロンが鶴首
されるに至った。

インターフェロンには、生細胞がウィルスにさらされて
生成する分子量約１〜３万のタイプ１イアター７エロン
（別名古典的インターフェロン）と、リンパ球がミトー
ゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ　）によって刺激されるか、又は
抗原に応答して生成するタイプ１１イアター７エ０７（
別名　免疫インターフェロン）とがあり、Ｈ，Ｍ、Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ著「ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏ
ｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ
　Ｊ、第１５４巻、第１３８頁（１９７７年）には、タ
イプロインターフェロンがｕｌｔｒｏｇｅｌ　ｆ用いる
ゲル濾過により分子量約４〜７万を示すと報告されてい
る。

”　Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　”Ｖｏｌ、３５．１９
７７　（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ＬＪｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　’ｌｌ”ｅｘａｓ　Ｍｅｄｉｃａ
ｌ　Ｂｒａｎｃｈ、　Ｇａ１ｖｅｓｔｏｎ、　’ｌ’ｅ
ｘａｓ。

Ｕ、Ｓ、Ａ　）の第４２頁で、Ｌ、Ｂ、　Ｅｐｓｔｅｉ
ｎが述べているように、タイプロインターフェロンは、
厳しい条件（ｐＨ２以下、ｐＨ１０以上、温度５６℃以
上）の下ではタイプＩインターフェロンよりもさらに不
安定であることが知られている。

しかし彦がら、タイプロインターフェロンは、免疫反応
と密接なかかわりあいを有していることかう、タイプＩ
インターフェロンよリモインターフェロン感受性疾患に
対する予防効果、治療効果の大きいことが期待されてい
る。

インターフェロンは、種特異性が高く、ヒトの疾患を予
防または治療するためには、ヒトの生細胞から生成され
るインターフェロンでなけれハ効果がない。

従来から、タイプロインターフェロンの調製に使用され
てきたヒトの生細胞には白血球がある。

しかしながら、白血球はヒトの新鮮面から分離して調製
されるものであシ、その保存も困難であって、大量に安
価に供給することは極めて困難である。このような理由
から、ヒト疾患の予防や治療に使用し得るタイプロイン
ターフェロンの製造は、未だ工業的規模で実施されるま
でに至っていない。

本発明者等は、工業的規模で容易に実施し得るタイプロ
インターフェロンの製造方法を検討し、そのタイプロイ
ンターフェロンがタイプ■インターフェロン感受性疾患
の予防剤、治療剤として有用であるか否か全鋭意研究し
た。

その結果、培養株化されたヒト由来の細胞を生体外（ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ　）の栄養培地に接種し増殖させるので
は々く、ヒト以外の温血動物体内に移植しまたはヒト以
外の温血動物の体内もしくは体外に取付けたチャンバー
内でその動物体から栄養物を含有する体液の供給を受け
つつ増殖させ、得られるヒト由来の細胞に生体内または
生体外でタイプ１イアター７エロン誘導剤を作用させる
ことによって、ヒトに種特異性の高いタイプロインター
フェロンが高活性で誘導生成され、これを精製分取する
ことによってタイプロインターフェロンが多量容易６一 に製造し得ることを見いだし、そのタイプ■インターフ
ェロンがタイプ■インターフェロン感受性疾患の予防剤
、治療剤として優れていることを確認して本発明を完成
した。

本発明において使用されるタイプ■インターフェロンの
製造方法は、生細胞を生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で
増殖させる場合とは違って、高価な血清などを含む栄養
培地が不要丑たは大幅に節約できるばかりでなく、細胞
増殖中の維持管理も極めて容易であり、そのうえ誘導生
成されるタイプ■インターフェロン活性が高いという特
徴を有している。即ち、培養株化されたヒト由来の細胞
をヒト以外の温血動物体内に移植し或はその動物の体液
の供給を受けることのできる拡散チャンバー内に収容し
、このチャンバーを動物体内に埋設し通常の飼育をすれ
ば、温血動物体から供給される栄養物を含有する体液を
利用してその細胞が容易に増殖し得るのである。更に生
体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で増殖させる場合と比較し
て、この細胞の増殖が安定して、いること、その増殖速
度が大きいこと、得られる細胞量が大きいこと、更には
細胞当りのタイプ■インターフェロンの収量が著増する
ことも大きな特徴である。

本発明で使用するタイプ■インターフェロンの製造方法
に使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒト以外
の温血動物体内に移植して容易に増殖し得てしかもタイ
プ■インターフェロン産生能を有するものであればよく
、例えば「蛋白質核酸　酵素　Ｖｏｌ、２３　Ｎｏ、６
Ｊ第６９７〜７１１頁（１９７８）に報告されている　
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、ＭＯＬＴ３細胞、Ｐ　１２　／　
Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞、Ｐ８／５
ｅｋｉ細胞、ＪＢＬ細胞、ＨＣＬ細胞、Ｐ　１０　／　
Ｓｈｉ　ｂａｔａ細胞などや、「”Ｊｑｕｒｎａｌ　ｉ
ｏｆ、、（：１ｉｎｊｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙＶｏｌ、Ｉ　Ｊ　１１６頁〜１１７頁（１９７５）に
報告されているｌ’Ｊａｍａｌｖａ細胞や１．Ｍｉｙｏ
ｓｈｉ著［Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、２６７　Ｊ８４３〜
８４４頁（１９７７）に報告されているＢＡＬＬ−１細
胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞々どが自由に
使用され、本明細書に記載する株化細胞のみに限定され
るものではない。これらの細胞は、後に述べるタイプ■
インターフェヮン全誘導生成させるまでの過程で、単独
で又は２種以上を混合して自由に使用される。特に、培
養株化細胞が白血球なかでもリンパ球である場合におい
ては、Ｂ　ＩＪンパ球とＴ　ＩＪンパ球とを含有する混
合細胞溶液にして誘導生成されるタイプ■インターフェ
ロンの活性をさらに高めることも自由である。必要なら
ば、培養株化されたヒト由来の細胞に例えばヒトの新鮮
面から調製される白血球を併用することもできる。

本発明で使用するタイプ■インターフェロンの製造方法
に使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し得るも
のであればよく、例えばニヮ）　ＩＪ、ハトなどの鳥類
、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ
、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウス、ヌー
ドマウス彦どの哺乳類彦どが使用できる。

これら動物にヒト由来の細胞を移植すると好ましくない
免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできるだ
けおさえるために使用する動物は、できるだけ幼若な状
態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のものの
方が好捷しい。

また、これら動物に例えば、約２００〜６００レム程度
のエックス線若しくはガンマ線を照射するが、または抗
血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置を
ほどこして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応が弱いので、これらの前処置を必要
とするとと彦く、培養株化されたヒト由来の細胞が移植
でき、急速に増殖できるので特に好都合である。

また、培養株化されたヒト由来の細胞を、例えば先づハ
ムスターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌード
マウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間
で移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、
更にそれらから誘導生成されるタイプ■インターフェロ
ン量ヲ増加させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと同綱間、同門間
移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移＝１〇− 植する動物体内の部位は移植した細胞が増殖し得る部位
であればよく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自
由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約１０−７−１０−”ｍ　ｆ有するメンブランフ
ィルタ−１限外濾過膜またはホローファイバーなどを設
けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体
内、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含
む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培
養株化されたヒト由来の細胞を倒れも増殖させることが
できる。

また、必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む
溶液を動物体内の体液と接続し潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるようにすること
も、また、このチャンバ一部分のみを着脱交換できるよ
うにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させて、
動物個体当りの細胞生産量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでは々く、好捷しくない免
疫反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前
処置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できると
いう特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常約１〜１
０週の期間で目的を達成することができる。

このようにして得られるヒト由来の細胞数は動物個体当
り約１０７〜１０１２、またはそれ以上に達することも
見出した。

換言すれば、本発明で使用するタイプ用インターフェロ
ンの製造方法により増殖させたヒト由来の―胞数は、動
物個体当り移植した細胞数の約１０″〜１ｄ２倍、−！
たけそれ以上にも達し、生体外め栄養培地に接種して増
殖させる場合の約１０１〜１０６倍、捷たはそれ以上に
も達して、タイプ用インターフェロンの製造のため極め
て好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からタイプ
用インターフェロンを誘導生成させる方法は自由である
。それが増殖した動物体内の−２１で、タイプｎインタ
ーフェロン誘導剤を作用させることもできる。例えば、
腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の細胞に、ま
たは皮下に生じた腫瘍細胞に、タイプｎインターフェロ
ン誘導剤を直接作用させてタイプ用インターフェロンを
誘導生成させ、次いでその腹水または腫瘍からタイ７”
　ＩＩインターフェロンを精製分取すればよい。

また、ヒト由来の増殖細胞を動物体内から取り出し、生
体外でタイプｎインターフェロン誘導剤を作用させてタ
イプｎインターフェロン誘導生成させることもできる。

例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を分取し、ま
たは皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分
散し、得られる細胞を約２０〜４０℃に保った栄養培地
に細胞濃度が約１０５〜１０８／ｌｎｌになるように浮
遊させ、これにタイプｎインターフェロン誘導剤を作用
させることによってタイプ用インターフェロンを誘導生
成させ、これを精製分取すればよい。

更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合には、増殖させた細胞をチャンバー内のｉｔで、ま
たはチャンバーから取り出して、タイプｎインターフェ
ロン誘導剤を作用させ、タイプ用インターフェロンを誘
導生成させることもできる。

また、タイプ用インターフェロンの誘導生成に際して、
必要ならば例えばヒトに種特異性の高いインターフェロ
ンを用いてプライミング処理をしたり、代謝阻害剤を使
用するスーパーインダクション法などの公知の方法を採
用することによって生成スるタイプ■インターフェロン
量を更に高めることも自由である。

また、例えば増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体内
のままでタイプ用インターフェロンを誘導生成させた後
、次いで同一動物個体の特定の部位または全体から採取
したヒト由来の細胞に動物体外でタイプ■インターフェ
ロンを誘導生成させる方法、捷た一度タイブ■インター
フェロンの誘導生成に使用した細胞を更に２度以上タイ
プ■インターフェロンの誘導生成に使用する方法、また
は動物体内に埋設、若１．　＜は接続するチャンバーを
交換して得られる細胞数全増加させる方法などによって
、使用する動物個体当りのタイプ■インターフェロン生
成量を更に高めることも自由である。

タイプ■インターフェロン誘導剤としては、通常、例え
ばフィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ボークウ
イードミトーゲン、リポポリサツカリド、エンドトキシ
ン、多糖類、細菌などのミトーゲンが好適である。

′！、た、感作化された細胞にとっては抗原もタイプ■
インターフェロン誘導剤である。上記タイプ■インター
フェロン誘導剤を用いて誘導を行う際には、通常約０．
００１μｆ〜１０ｍｇ／ｍｅの濃度で目的を達すること
ができる。

必要ならば、例えば、ウィルス、核酸、ポリヌクレオチ
ドなどのタイプ■インターフェロン誘導剤を併用して、
タイプ■インターフェロン量ヲ更に増加させることも、
タイプＩインターフェロンとタイプ■インターフェロン
とを同時に生成させることも自由である。

このようにして誘導生成させたタイプ■インターフェロ
ンは、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、
遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易
に精製分離し、採取することができる。更に高度の精製
を必要とする場合には、例えばイオン交換体への吸着・
溶出、ゲル濾過およびアフィニティクロマトグラフィー
、高速液体クロマトグラフィー、等電点分画、電気泳動
などの公知の方法を更に組み合せればよく、最高純度の
タイプ■インターフェロンを採取することも可能である
。

ヒトに種特異性の高いタイプ■インターフェロンおよび
タイプ■インターフェロンの活性は「蛋白質　核酸　酵
素　Ｖｏｌ、２０　Ｎｏ、６　Ｊ　６１６頁〜６４３頁
（１９７５）に報告されているヒト羊膜由来のＦＬ細胞
を使用して公知のプラーク牛減法で測定した。

赤血球凝集価はＪ、Ｅ、　５ａｌｋ著ＶＴｈｅ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊ第４９巻、第
８７〜９８頁（１９４４年）の方法に準じて測定した。

次に、タイプ■インターフェロン産生に関する実験Ａを
述べる。

〔実験Ａ〕

生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）又は生体内で増殖させて得
た細胞によるインターフェロン産生能試験実験Ａ−Ｉ　
　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）での増殖ＢＡＬＬ−１
細胞を牛胎児血清ヲ２０％補足したＲＰＭＩ　　１６４
０培地（ｐＨ７，２）に接種し、３７℃で浮遊培養した
。

得られた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ　、１６４０培地
（ｐＨ７，２）Ｔ洗浄し、同培地に約１×１ｏ６／−に
なるように懸濁した。

実験Ａ−１生体内での増殖 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を弱めた
後、その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた腫瘍を摘出し細切した後、トリプシン含有
の生理食塩水に懸濁して細胞を分散分取した。

得られた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ　１６４０培地（
１）Ｈ７，２）テ洗浄し、同培地に約Ｉ　Ｘ　１０６７
ｍＡになるように懸濁した。

実ａＡ−ｍ　　インターフェロンの産生実験Ａ−１，Ａ
−Ｉｔで得たＢＡＬＬ−１細胞の懸濁液にフィトヘマグ
ルチニン若しくはセンダイウィルスを単用するか又はフ
ィトヘマグルチニンとセンダイウィルスとを併用してイ
ンターフェロンを誘導させた。

即ち、約Ｉ　Ｘ　１０６／−の細胞濃度を有する懸濁液
にフィトヘマグルチニンをｉ当り約１００μｖを添加シ
て３７℃で３日間保ってインターフェロン全誘導させた
。またセンダイウィルスの場合には、懸濁液−当り約３
００赤血球凝集価の制置で添加して３７℃で１日間保っ
てインターフェロンヲ誘導させた。マタ、フィトヘマグ
ルチニンとセンダイウィルスとを併用する場合には、懸
濁液にフィトヘマグルチニンｆ　ｍｌ当り約１００μク
ヲ添加して３７℃で２日間保った後、これにセンダイウ
ィルスｆ　ｍｅ当り約３００赤血球凝集価の割合で添加
して３７℃で更に１日間保ってインターフェロンを誘導
させた。

このようにして得たインターフェロンを含有する懸濁液
を遠心分離し、その上清を分画分子量６　、０００の限
外濾過膜で濃縮し、次いでこの濃縮液でデキストランゲ
ルなどによるゲル濾過法で分子量分画し、そうして得た
分子量約２５　、０００のタイプｌインターフェロンと
分子量約５０，０００のタイプｌインターフェロンとの
活性を測定し、インターフェロン誘導時の懸濁液１−当
りの活性を求めた。

結果は第１表に示す。

第　　　　１　　　表 （注）（）内の数値は、タイプｌインターフェロンのみ
の活性を示す。

第１表の結果から明らかなように、タイプｌインターフ
ェロンは生体外で増殖させた細胞からはほとんど生成さ
れず、生体内で増殖させた細胞によって多量生成される
。

また、センダイウィルスによって誘導されるタイプｌイ
ンターフェロンは、生体外、生体内をとわずどちらの増
殖方法で得た細胞からも生成される。しかし、生体内で
増殖させた細胞を用いる場合の方が約４倍も高い活性が
得られた。

マタ、インターフェロン誘導剤がフィトヘマグルチニン
単独又はセンダイウィルス単独の場合に誘導されるイン
ターフェロン活性とフィトヘマグルチニンとセンダイウ
ィルスとを併用する場合に誘導されるインターフェロン
活性とに着目すると、生体内で増殖させた細胞を用いた
場合にはタイプｌインターフェロン、タイプｌインター
フェロンいずれもインターフェロン誘導剤の相乗効果が
顕著に認められる。

特ニフィトヘマグルチニンとセンダイウィルスとを併用
して誘導されるタイプｌインターフェロンは、フィトヘ
マグルチニン単独で誘導されるタイプｌインターフェロ
ンの約２８倍も高い活性を得た。

しかしながら、生体外で増殖させた細胞を用いた場合に
は、相剰効来がほとんど認められない。

次に、タイプｌインターフェロンの２〜３の製造例を述
べる。

タイプｌインターフェロンのＨ造例１゜成長したヌード
マウスの皮下に、培養株化されたヒト由来のＢＡＬＬ−
１細胞を移植した後、通常の方法で３週間飼育した。皮
下に生じた約１０２の腫瘍を摘出し細切した後、トリプ
シン含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散分取した。

この細胞をヒト血清ｋ　５　Ｖ／Ｖ　％含有するｐＨ７
，２のＥａｇｌｅの最少基本培地で洗浄し３７℃に保っ
た同じ組成の培地に細胞濃度が約５　Ｘ　１．０６／ｍ
／！になるように希釈し、これに部分精製したヒトに種
特異性の高いインターフェロンを約１００単位／７！の
割合で加えてこの温度に約２時間保った。これにフィト
ヘマグルチニンを約２００μｆ　／ｍｌの割合で加え３
日間保ってタイプｌインターフェロンを誘導生成させた
。これを約４℃、約１０００１ｉ’で遠心分離し、細胞
などの沈澱物を除去し、得られた上清’１ｐＨ７，２，
０，０１Ｍ　！Ｊン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で
２４時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を濃縮し、
凍結乾燥してタイプｌインターフェロン活性を有する粉
末を得た。得られたタイプｌインターフェロンの活性は
、ヌードマウス１匹当り約１，５００，０００単位であ
った。

タイプ用インターフェロンの製造例　２゜成長したヌー
ドマウスの腹腔内に培養株化されたヒト由来のＴＡＬＬ
−１細胞とＢＡＬＬ−１細胞とを移植後通常の方法で５
週間飼育した。この腹腔内へフィトへマグルチニン１■
を注入して２４時間後に、更に、約３０００赤血球凝集
価のニューカッスル病ウィルスを紫外線によって予めほ
とんど失活させて注入し、２４時間後に屠殺して腹水全
採取した。これを４℃、約１ｏｏｏ　ｙ　で遠心分離し
、細胞々どの沈澱物を除去し、得られた上清’（ｉ−ｐ
Ｈ７，２，０，０１Ｍリン酸塩緩衝液全含有する生理食
塩水で１５時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を濃
縮してインターフェロン活性を有する溶液を得た。得ら
れたインターフェロン活性はヌードマウス１０匹当り約
ｓｏｏ　、ｏｏｏ単位であり、このうちタイプ用インタ
ーフェロン活性は約３００，０００単位であった。

タイプ用インターフェロンの製造例３゜新生児のハムス
ターにウサギから公知の方法で調製した抗血清を予め注
射し、ハムスターの免疫反応を弱めた後その皮下に培養
株化されたヒト由来のＪＢＬ細胞を移植し、その後通常
の方法で４週間飼育した。

皮下に生じた約３０７の腫瘍を摘出した後、製造例１と
同様の方法で細胞を分散させた。

この細胞を子ウシの血清１０Ｖ／Ｖ％’を含むｐＨ７，
４のＲＰＭＩ　１６４０培地で洗浄した後、３７℃に保
った同じ組成の培地に細胞濃度が約２　Ｘ　１０７／ｌ
ｎｌに々るように希釈した。これに部分精製したヒトに
種特異性の高いタイプ用インターフェロンを２００単位
／　ｍｅ、の割合で加えて約１時間保った後、コンカナ
バリンＡ　ｉ　５００μ２／−の割合で加え３日間保ち
更にセンダイウィルスを約１００赤血球凝集価／ｌｄの
割合で加えて１６時間保ってインターフェロンを誘導生
成させた。

以後、製造例２と同様に精製し濃縮してインターフェロ
ン活性を有する溶液を得た。得られたインターフェロン
活性は、ハムスター１匹当り約１７　、０００　、００
０単位であり、このうちタイプ用インターフェロン活性
は約６　、０００　、０００単位であった。

タイプ用インターフェロンの製造例　４゜新生児のラッ
トの静脈内へ、培養株化されたヒト由来のＮａｍａｌｖ
ａ細胞を移植した後通常の方法で４週間飼育した。

皮下に生じた約５０？の腫瘍全摘出した後、製造例１と
同様にして細胞を分散させた。

次いで、フィトヘマグルチニンの代りに丸山ワクチンを
１μり／ｍｌの割合で加えたことを除いては製造例１と
同様に処理してタイプ用インターフェロンを誘導生成さ
せ、更に製造例１と同様に精製し、凍結乾燥してタイプ
■イ／ターフェロンの活性を有する粉末を得た。得られ
た活性はラット１匹当り約ｓ　、　ｏｏｏ　、ｏｏｏ単
位であった。

タイプ用インターフェロンの製造例　５゜成長した普通
マウスに約４００レムのエックス線を予め照射してマウ
スの免疫反応を弱めた後、そのマウスの皮下に培養株化
されたヒト由来のＴＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通
常の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた約１０２の腫瘍を摘出した後、製造例１と
同様にして細胞全分散させた。

この細胞を製造例３と同様に処理してインターフェロン
を誘導生成させ、以後製造例２と同様に精製し濃縮して
インターフェロン活性を有する濃縮液を得た。得られた
インターフェロン活性は、普通マウス１匹当り約９，０
００，０００単位であり、このうちタイプ用インターフ
ェロンは約３．０００，０００単位であった。

タイプ用インターフェロンの製造例　６゜培養株化され
たＭＯＬ’ｒ−３細胞を、先づ）・ムスターの皮下に製
造例３の方法で移植し、３週間増殖させて得た細胞を、
次いで生後１０日のヌードマウスの腹腔内に移植した。

このヌードマウスを通常の方法で５週間飼育した後、麻
酔して腹水を採取し、遠心分離して増殖細胞を得た。・
この細胞を製造例１の方法で洗浄した後、製造例１と同
様に処理してタイプ用インターフェロンを誘導生成させ
、次いで製造例２と同様に精製し濃縮してタイプ用イン
ターフェロン活性を有する濃縮液を得た。得られたタイ
プ■インタ２６一 −フェロン活性は、ヌードマウス１匹当り約５００，０
００単位であった。

タイプ■インターフェロン製造例　７゜孔径的０．５ミ
クロンのタンブラ／フィルターを設けた内容量的１０７
！のプラスチック製円筒型拡散チャンバー内に、培養株
化されたヒト由来のＪＢＬ細胞を生理食塩水で浮遊させ
、これを成長したラットの腹腔内に埋設した。

このラットヲ通常の方法で４週間飼育した後、このチャ
ンバーを取り出した。

これにより得られたヒト由来の細胞濃度は、約５×１０
９／−であって、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキュ
ベーター中で増殖させる場合の約１０３倍以上にも達す
ることがわかった。

この細胞にインターフェロン製造例６で得たＭＯＬＴ−
３細胞ヲ２０％添加した後製造例１と同様に処理してタ
イプ■インターフェロンヲ誘導生成させ、精製濃縮し、
凍結乾燥してタイプ用インターフェロン活性を有する粉
末を得た。得られたタイプ用インターフェロン活性は、
ラット１匹当り約４　、０００　、０００単位であった
。

タイプ用インターフェロンの製造例８゜３７℃で５日間
保ったニワ）　ＩＪの受精卵に、培養株化されたヒト由
来のＮＡＬＬ−１細胞を移植した後、３７℃で１週間保
った。

この卵を割卵した後、増殖細胞全採取し、その細胞にイ
ンターフェロン製造例５で得たＴＡＬＬ−１細胞をほぼ
同濃度に々るように添加した後製造例１と同様に処理し
てタイプ用インターフェロンを誘導生成させ、次いで製
造例２と同様に精製し濃縮してタイプ用インターフェロ
ン活性を有する濃縮液を得た。得られたタイプ用インタ
ーフェロン活性は、受精卵１０個当り約３００，０００
単位であった。

タイプ用インターフェロンの製造例　９製造例１の方法
で調製したタイプ■インターフェロン粉末を、ｐＨ４〜
９の範囲で取り扱うことに注意し々がらＧ、］３ｏｄｏ
の報告（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎＰｒｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ、　５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃ
１１ｎｉｃａｌＵｓｅ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、
　１１ｔｈ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　　８＆
９　　Ｊｕｎｅ１９７７、　Ｚａｇｒｅｂ、　Ｙｕｇｏ
ｓｌａｖｉａ　）に準じてイオン交換樹脂への吸脱着、
ゲル濾過による分子量分画、濃縮および精密濾過々どの
手段により更に精製して、比活性が蛋白質１■当り２×
１０６単位の高純度インターフェロンを収率約４０％で
得た。

以上述べた製造例のようにして得た本発明のタイプ用イ
ンターフェロンは、タイプ■インターフェロン単独で若
しくはタイプＩインターフェロンとタイプ■インターフ
ェロン混合物で、またはインターフェロンに１種若しく
は２種以上の他の物質を含有せしめることにより、例え
ば注射薬、外用薬、内服薬などとして、ヒトのタイプ■
インターフェロン感受性疾患の予防、治療に対し有利に
利用できることが、次の実験Ｂにより明らかとなった。

〔実験Ｂ〕

タイプ用インターフェロンによるインターフェロン感受
性疾患の予防、治療試験 実験Ｂ−１，タイプ用インターフェロンによるウィルス
性疾患の治療（ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのウィルス増殖阻止
作用テスト） 直径６ｃｍのシャーレで単層培養したヒト胎児肺の初代
培養細胞に、タイプ用インターフェロンの製造例９の方
法で調製したタイプ用インターフェロン　０．１　、１
．０−！、たけ１０．０単位を添加し、３７℃で５％炭
酸ガスインキュベーター中に２０時間保った後、これに
タイプ■インターフェロン無添加の場合に約１００個の
プラーク生成能を有する量のバリセラーシスターウィル
ス（水痘帯状庖疹ウィルス）、またはヒトサイトメガロ
ウィルス（死産、早産原因ウィルス）を添加することに
より生成するプラーク数を計数した。

ウィルス増殖阻止作用は、タイプ用インターフェロンに
よるプラーク数減少率の大きさで判定した。

Ａ：タイプ■インターフェロン無添加でのプラーク数Ｂ
＝タイプ■インターフェロン添加でのプラーク数牛の計
数した結果を次の第２表に示す。

第　　　２　　　表 第２表の結果から明らかなように、本発明で使用するタ
イプロインターフェロンは、ウィルス性疾患を引き起す
ウィルスの増殖をよく阻止していることがわかる。

なお、ヒト培養細胞には、タイプ■インターフェロン添
加による何らの異常も認められなかった。

実験Ｂ−２タイプロインターフェロンによる非ウィルス
性疾患の治療 （１１ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞増殖阻止作用テス
ト牛胎児血清１５　ｖ／　ｖ％を含有するＲＰＭＩ　１
６４０培地に、タイプ用インターフェロン製造例９の方
法で調製したタイプロインターフェロンを最終濃度５　
、５０　、５００単位／　ｍｌになるように添加して、
さらに、これら各種腫瘍細胞全５×１０５／−の濃度に
なるように接種し、３７℃に保った５％炭酸ガスインキ
ュベーター中で５日間培養した後、培地−当りの細胞数
全測定した。対照としては、１００℃に３０分間保って
熱失活させたタイプロインターフェロンを、それぞれ等
量になるように添加して同様に培養し測定した。

細胞増殖阻止率は、次式で求めた。

Ａ：対照区細胞数 Ｂ：試験区細胞数 その測定した結果を次の第３表に示す。

第　　　３　　　表 第３表の結果から明らか々ように、本発明で使用するタ
イプロインターフェロンはＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＴ、
Ｌ−１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ細胞などの腫瘍
細胞の増殖を著しく阻害しており、その活性濃度も５〜
５００単位／７！の範囲で有効であることがわかる。

ｆ２）ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖阻止作用テスト
生後約２ケ月のヌードマウス８匹を使用して試験した。

１匹当り７．５×１０６個の腫瘍細胞ＴＡＬＬ−１を８
匹全べての皮下に移植した。この内４匹には、移植２日
後よりタイプ用インターフェロン製造例６の方法で調製
したタイプ■インターフェロン溶液２１７０００単位ず
つ腹腔内に週３回の割で計２０回注射し、移植後招日日
に層殺して生じた腫瘤の生重量を測定した。残りの４匹
は、対照としてタイプロインターフェロンを注射しなか
ったことを除いて先きの４匹と同様に飼育し、移植後４
８日日日層殺して生じた腫瘤の生重量全測定した。

その測定した結果を次の第４表に示した。

（３１ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖阻止作用テスト
生後約２ケ月のヌードマウス８匹を使用して試験した。

１匹当り１０７個の腫瘍細胞ＪＢＬｔ−８匹全べての皮
下に移植した。この内４匹には、移植２週間後よりタイ
プ用インターフェロン製造例２の方法で調製したタイプ
■不ンターフェロンとタイプ用インターフェロンとを含
有するインターフェロン溶液’（ｒ　１，０００単位ず
つ腹腔内に週２回の割で計８回注射し、移植後４２日目
に層殺して生じた腫瘤の生重量を測定した。残り４匹は
、対照ｌとしてタイプ用インターフェロンを注射しなか
ったことを除いて先きの４匹と同様に飼育し、移植後４
２日目に層殺して生じた腫瘤の生重量を測定した。

その測定した結果を次の第５表に示した。

第　　　５　　　表 第４表、及び第５表の結果から明らかなように、タイプ
用インターフェロンを注射したものは、腫瘤の発生が阻
止され、また仮りに腫瘤が発生したとしても、その重量
は対照と比較して極めて小さく、その肥大が著しく阻害
されていることがわかる。捷た、タイプ用インターフェ
ロンを注射したヌードマウスは、対照のヌードマウスに
比較し食欲旺盛で敏捷性もよかった。

実験Ｂ−３急性毒性テスト 生後２０日のマウスを使用して、タイプ用インターフェ
ロン製造例９の方法で調製したタイプ１１インターフエ
ロン溶液の急性毒性テス）ｋしたところ、本タイプ■イ
ンターフェロンの毒性は極めて低く、腹腔内に注射した
時のＬＤ５ｏは２０．０００，０００単位／Ｋｇ以上で
あることが判明した。

以上の実験から明らかなように、本発明で言うタイプ用
インターフェロン感受性疾患とは、本発明で使用すると
ころのタイプ用インターフェロンによって予防され、若
しくは治療される疾患であり、それがウィルス性疾患、
例えば流行性結膜炎、ヘルペス性角膜炎、インフルエン
ザ、風疹、血清肝炎などであっても、ｊｆ、た非ウィル
ス性疾患、例えば白血病、骨肉腫などであってもよい。

本発明のタイプ用インターフェロンを含有するタイプ用
インターフェロン感受性疾患予防剤、若しくは治療剤は
、その目的に応じてその形状を自由に選択できる。その
１例を上げれば噴霧剤、点眼剤、点鼻剤、うがい剤、注
射剤などの液剤、軟膏剤のようなペースト剤、粉剤、顆
粒剤、錠剤などの固剤などである。

これらのタイプ用インターフェロン感受性疾患予防剤、
治療剤には、タイプ用インターフェロンを通常グラム当
り１〜１０，０００，０００単位程度の活性を含有せし
めればよく、必要に応じて他の成分、例えば治療剤、補
助剤、増ｉ剤、安定剤などの１種、若しくは２種以上と
併用することも自由にできる。

特に注射剤としては、一度に静注する場合、タイプ用イ
ンターフェロンが短時間で血中から消失し体外に***さ
れやすいことから、その投与方法＝３７− を点滴法例えば、タイプ用インターフェロンを補糖液な
どに含有せしめて点滴静注する方法とし、その投与時間
を持続延長することによって、その薬効を効果的に利用
することを可能にし、投与するタイプ用インターフェロ
ンのタイプ用インターフェロン感受性疾患に対する予防
、治療の効果をさらに高めることも自由である。

以下、本発明における薬剤を製造する方法の実施例全２
〜３述べる。

実施例　１．　　液　　剤 生理食塩水に、タイプ用インターフェロン製造例１の方
法で調製したタイプ■インターフェロンｆｆ１１ｍ１当
り５００単位含有せしめて液剤を製造した。

水晶は、特に流行性結膜炎やインフルエンザなどのウィ
ルス性疾患の予防剤、治療沖］として噴霧用、点眼用、
点鼻用、うがい用に好適である。

実施例　２．　　注　射　剤 生理食塩水に、タイプ用インターフェロン製造例９の方
法で調製したタイプ■インターフェロン’１１ｍ１当り
１００　、０００単位含有せしめて注射剤を製造した。

水晶は、ウィルス性疾患や腫瘍性疾患などのタイプ■イ
ンターフェロン感受性疾患全般の予防用、治療用に好適
である。

実施例　３．　　点滴用注射剤 １０％マルトース液　５００ｍ１中に、タイプ用インタ
ーフェロン製造例５の方法で調製したタイプＩインター
フェロンとタイプ用インターフェロンとを含有するイン
ターフェロン　１．０００　、０００単位と、シクロフ
ォスフアミド　１００ｍｙとを含有せしめて注射剤を製
造した。

水晶は一インターフェロンの持続投与型注射剤として特
に腫瘍性疾患の予防用、治療用に好適である。

実施例　４　　点滴用注射剤 １０係マルトース液　１００ｍ１中に、タイプ用インタ
ーフェロン製造例２の方法で調製したタイプＩインター
フェロンとタイプ用インターフェロンとを含有するイン
ターフェロン　５００，０００　単位と、マイトマイシ
ン０２ｍｇとを含有せしめて注射剤を製造した。

水晶は、特に腫瘍性疾患の予防用、治療用に好適である
。

実施例　５．　　軟　膏　剤 タイプ用インターフェロン製造例４の方法で調製したタ
イプ■インターフェロン粉末ヲ常法ニ従い流動パラフィ
ン、ワセリンと混和して軟膏剤を製造するに際し、タイ
プ用インターフェロンを製品１グラム当り１０ρ００単
位となるよう含有せしめ７た。

水晶は、ウィルス性皮膚疾患などの治療用に好適である
。

実施例　６．　　錠　　　剤 タイプ用インターフェロン製造例７の方法で調製したタ
イプ■インターフェロン粉末を常法に従って澱粉とマル
トースとを混合使用して打錠するに際し、タイプ用イン
ターフェロンを製品１錠（１０（Ｃ＋ｐ）当り１，００
０単位になるように含有せしめて錠剤を製造した。

水晶は、消化器系のウィルス性疾患の予防用、治療用に
好適である。

実施例　７．　　液　　　剤 １０％マルトース液　１〇−中に、タイプ用インターフ
ェロン製造例８の方法で調製したタイプ用インターフェ
ロン　２００　、０００単位と、メソトレキセー）５７
ｆｆｇｉ含有せしめて内服用液剤を製造した。

水晶は、特に腫瘍性疾患の予防用、治療用に好適である
。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）タイプIIインターフェロン産生能を有する培養株
   化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体内に
   移植するか、またはヒト以外の温血動物の体内もしくは
   体外に取り付けた拡散チャンバー内で、その温血動物の
   体液の供給を受けながら増殖させ、得られるヒト由来の
   細胞に生体内または生体外でタイプIIインターフェロン
   誘導剤を作用させてタイプIIインターフェロンを生成さ
   せ、生成するタイプIIインターフェロンを精製分取し、
   そのタイプIIインターフェロンを含有せしめることを特
   徴とするタイプIIインターフェロンを含有するタイプI
   Iインターフェロン感受性疾患予防剤および治療剤の製
   造方法。
2. （２）タイプIIインターフェロンをグラム当り１〜１０
   ，０００，０００単位含有する特許請求の範囲第（１）
   項記載のタイプIIインターフェロン感受性疾患予防剤お
   よび治療剤の製造方法。
3. （３）タイプIIインターフェロン感受性疾患予防剤およ
   び治療剤が液剤、ペースト剤又は固剤である特許請求の
   範囲第（１）項または第（２）項記載のタイプIIインタ
   ーフェロン感受性疾患予防剤及び治療剤の製造方法。
4. （４）タイプIIインターフェロン感受性疾患が腫瘍性疾
   患であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項、
   第（２）項または第（３）項記載のタイプIIインターフ
   ェロン感受性疾患予防剤及び治療剤の製造方法。
5. （５）タイプIIインターフェロン以外の治療剤、補助剤
   、増量剤、安定剤の１種もしくは２種以上を含有せしめ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項、第（２
   ）項、第（３）項または第（４）項記載のタイプIIイン
   ターフェロン感受性疾患予防剤及び治療剤の製造方法。
6. （６）タイプIIインターフェロン以外の治療剤がタイプ
   I インターフェロンであることを特徴とする特許請求
   の範囲第（５）項記載のタイプIIインターフェロン感受
   性疾患予防剤及び治療剤の製造方法。