JPS586475B2 - ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎｃ
ｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ，以下Ｈ
ＣＧと略称する。

）の製造方法に関する。ＨＣＧは、胎盤絨毛の合胞細胞
（ｓｙｎｃｙｔｉｏｔ−ｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ
）が産生ずるホルモンで、畢丸ノアンドロゲン、卵巣の
プロゲステンの産生分，泌の促進作用を有する。

ＨＣＧの製造方法は、Ｒａｂｓｏｎ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，Ｖ
ｏ１．５０，６６９−６７４（１９７３）の報告から組
織培養法により製造する方法が知られているけれども、
細胞の増殖が遅く、また細胞当りのＨＣＧ産生量も不充
分で、ＨＣＧを安価に大量製造することは困難である。

本発明者は、ＨＣＧの大量供給を目ざして鋭意研究を続
けたところ、意外にもＨＣＧ産生能を有するヒト由来の
リンパ芽球様細胞が増殖速度が大きく、細胞当りのＨＣ
Ｇ産生量も大でＨＣＧ産生細胞として好適であることを
見いだし本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ＨＣＧ産生能を有するヒト由来の
リンパ芽球様細胞をヒト以外の混血動物体内に移植し、
または、その混血動物の体液の供給を受けながら増殖さ
せた細胞からＨＣＧを産生せしめることを特徴とするＨ
ＣＧの製造方法に関するものである。

本発明の方法は、インビトロで培養させる場合とは違っ
て、ＨＣＧの産生量が大であるだけでなく、高価な血清
などを含む栄養培地が不要、または大幅に節約でき、更
に細胞増殖中の維持管理も適めで容易である。

すなわち、ＨＣＧ産生能を有するヒト由来のリンパ芽球
様細胞を、ヒト以外の混血動物体内に移植し、またはそ
の動物の体液の供給を受けることのできるチャンバーに
収容し、通常の飼育をすれば、混血動物体から供給され
る栄養物を含有する体液を利用してその細胞が容易に増
殖しうるのである。

更に、インビトロで培養させる場合と比較して、この細
胞の増殖が安定していること、その増殖速度の大きいこ
と、得られる細胞量の大きいこと、更には細胞当りのＨ
ＣＧ産生量の大きいことが特徴である。

本発明で使用するヒト由来のリンパ芽球様細胞は、ＨＣ
Ｇ産生能を有し、かつヒト以外の混血動物の体内に移植
して容易に増殖するものであればよい。

例えば、胎盤絨毛の合胞細胞、絨毛上皮腫細胞、下垂体
色素嫌性腺腫細胞などの本来ＨＣＧ産生能を有する細胞
及び肺癌細胞などの異所性ＨＣＧ産生能を有する細胞か
らＨＣＧ産生遺伝子を、ポリエチレングリコールやセン
ダイウイルスなどを利用する細胞融合の手段や、ＤＮＡ
リガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラ
ーゼなどの酵素を利用する遺伝子組換えの手段などによ
って導入したヒト由来のリンパ芽球様細胞または、異所
性ＨＣＧ産生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞な
どが好適である。

これらリンパ芽球様細胞の利用は、ヒト以外の温血動物
に移植する時、その宿主動物の細胞と混りにくい軟腫瘤
を形成しやすく、摘出後の分散も容易なので、生きたヒ
トリンパ芽球様細胞の採取に極めて有利である。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血病もし
くはヒト悪性リンパ腫由来の細胞株が適しており、例え
ばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）細胞、ＢＡＬＬ−１、Ｎ
ＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ細胞などの
公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しうる。

本発明におけるＨＣＧの製造方法に使用する混血動物は
、ＨＣＧ産生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞が
増殖しうるものであればよ＜、例えばニワトリ、ハトな
どの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ
、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウ
ス、ヌードマウス、などの哺乳類などが使用できる。

これら動物にヒト由来のリンパ芽球様細胞を移植すると
好ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、その反
応をできるだけおさえるために、使用する動物はできる
だけ幼若な状態、すなわち卵、胚、胎児、新生期、幼少
期のものの方が好ましい。

また、これら動物に、例えば約２００〜６００レムのエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応が弱いので、これら前処置を必要と
することなく、培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様
細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に好都合であ
る。

また、ヒト由来のリンパ芽球様細胞を、例えば先ずハム
スターに移植し、増殖させた後、この細胞を更にヌード
マウスに移植するなどのように、ヒト以外の混血動物間
で移植してヒト由来のリンパ芽球様細胞の増殖をより安
定化したり、更にそれらから産生されるＨＣＧ量を増加
させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱間、同門
間移植であってもよい。

更に、ヒト由来のリンパ芽球様細胞を移植する動物体内
の部位は移植した細胞が増殖しうる部位であればよく、
例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来のリンパ芽球様細胞を移
植することなく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の
濾過膜、例えば孔径約１０−７〜１０−５ｍを有するメ
ンプランフィルター、限外濾過膜、またはホローファイ
バーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡散チャン
バーを動物体内、例えば腹腔内に埋設して、動物体から
の栄養物を含む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー
内で培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞を増殖
させることができる。

また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれと接続し潅流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト由来のリンパ芽球様細胞の増殖状態を
透視できるようにすることも、また、この拡散チャンバ
一部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せず
に寿命一杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産
量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
リンパ芽球様細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒ
ト由来の細胞のみが容易に採取で１きるだけではなく、
好ましくない免疫反応を起す心配も少ないので、免疫反
応を抑制する前処置の必要もなく各種混血動物を自由に
利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の１飼育を
続ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは伺ら必
要としないので好都合である。

ヒト由来のリンパ芽球様細胞を増殖させるための期間は
１〜２０週、通常１〜５週で目的を達することができる
。

このようにして得られるヒト由来のリンパ芽球様細胞数
は、動物個体当り約１０７〜１０１２、またはそれ以上
に達することを見いだした。

換言すれば、本発明で使用するＨＣＧの製造方法により
増殖させたヒト由来のリンパ芽球様細胞数は、動物個体
当り移植した細胞数の約１０２〜１０７倍、またはそれ
以上に達し、生体外の栄養培地に接種して増殖させる場
合の約１０１〜１０６倍、またはそれ以上にも達して、
ＨＣＧの製造に極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来のリンパ芽球様生細
胞から、ＨＣＧを産生させる方法は自由である。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来のリ
ンパ芽球様細胞を採取し、または皮下で増殖した腫瘤を
摘出、分散させた後採取し、この細胞を約２０〜４０℃
に保った栄養培地に細胞濃度が約１０４〜１０８／ｍｌ
になるように浮遊させ、約１〜５０時間保つことによっ
てＨＣＧを産生させればよい。

この際、産生量をより高めるために、例えばロイシン、
リジン、アルギニン、システインなどのアミノ酸、塩化
ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグ
ネシウムなどの塩類、黄体形成ホルモン放出ホルモンな
どのホルモンなどの一種または二種以上の物質を共存さ
せることも好都合である。

このようにして産生されたＨＣＧは、公知の精製分離法
、例えば塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥
などを行なうことによって容易に精製分離し、採取する
ことができる。

更に高度の精製を必要とする場合には、例えばイオン交
換体への吸着・脱着、ゲル濾過、アフイニテイクロマト
グラフイー、等電点分画、電気泳動などの公知の方法を
組み合せれば最高純度のＨＣＧを採取することも可能で
ある。

このようにして得たＨＣＧは、単一物質で、またはこれ
にその他の一種若しくは二種以上の物質を含有せしめ、
例えば、注射薬、外用薬、内服薬、診断薬などとしてヒ
トの疾患の予防、治療に有利に利用できる。

ＨＣＧの産生量は、Ａ．Ｒ．Ｍｉｄｇｌｅｙ，Ｊｒ，Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７９，１０−１８
（１９６６）に報告されているラジオイムノアツセイ法
に準じて測定し国際単位（ＩＵ）で表示した。

以下、２〜３の実施例を述べる。

実施例 １ 絨毛上皮腫瘍患者から摘出、細切、分散させて得たヒト
絨毛上皮腫細胞とリンパ芽球様ナマルバ細胞（Ｎａｍａ
ｌｖａ ｃｅｌｌ）とを１４０ｍＭＮａＣｌ、５４ｍＭ
ＫＣＩ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭＣａＣｌ２を
含有する塩類溶液にそれぞれ約１０４／ｍｌになるよう
にフラスコ中に浮遊させ、これに予め紫外線で不活化し
たセンダイウイルスを含有する前記塩類溶液を氷冷下で
混合し、約５分後に３７℃恒温水槽に移して、約３０分
間攪拌しつつ細胞融合を起させ、リンパ芽球様ナマルバ
細胞にＨＣＧ産生能を導入した。

このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長したヌードマウ−
スの腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した
。

皮下に生じた腫瘤約１５ｇを摘出し、細切した後、トリ
プシン含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散させた。

この細胞を牛胎児血清１０ｖ／ｖ％を補足したＥａｒｌ
ｅ培地１９９（ｐＨ７７．２）で洗浄した後、Ｌ−アル
ギニンを３０ｍＭ存在せしめた同培地に細胞濃度約１０
６，／ｍｌになるように浮遊させ、３５℃で２０時間保
ってＨＣＧを産生させた。

その後、細胞を超音波処理し、得られる上清を用いてＨ
ＣＧの産生量を測定したとｉころ、浮遊液１ｍｌ当り、
約２３０ＩＵであった。

対照としてヒト絨毛上皮腫細胞をヌードマウスに直接移
植した後、通常の方法で５週間飼育し皮下に生じた腫瘤
約５ｇを摘出し、細切、分散させて得た細胞を用いて同
様にＨＣＧを産生させたところ浮遊液１ｍｌ当りわずか
に約２０ＩＵの産生量に過ぎなかった。

実施例 ２ 下垂体色素嫌性細胞腺腫患者から摘出、細切、分散させ
て得たヒト色素嫌性腺腫細胞とリンパ芽球様ＪＢＬ細胞
とを実施例１の方法に準じて細胞融合させ、リンパ芽球
様ＪＢＬ細胞にＨＣＧ産生能を導入した。

この細胞を、ウサギから公知の方法で調整した抗血清を
予め注射し免疫反応を弱めた新生児ハムスターの皮下に
移植し、その後通常冫の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた腫瘤約１０ｇを摘出し、細切した後、コラ
ゲナーゼ含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散させた
。

この細胞をヒト血清５ｖ／％を補足したＥａｇｌｅの最
少基本培地（ｐＨ７．２）で洗浄した後、Ｌ−リジンを
２０ｍＭ，硫酸マグネシウム１０ｍＭ存在せしめた同培
地に細胞濃度約１０５／ｍｌになるように浮遊させ、３
７℃に１５時間保つでＨＣＧを産生させた。

その産生量を測定したところ、浮遊液１ｍｌ当り約４５
０ＩＵであった。

対照としてヒト色素嫌性腺腫細胞をハムスターに移植し
た後、３週間飼育し、皮下に生じた腫瘤約３ｇを摘出し
、細切、分散させて得た細胞を用いて同様にＨＣＧを産
生させたところ、浮遊液１ｍｌ当りわずかに約１５ＩＵ
の産生量に過ぎなかった。

実施例 ３ 新生児ラット静脈内へ、実施例１の方法に準じてＨＣＧ
産生能を導入したリンパ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞を移植
した後、通常の方法で４週間飼育した。

生じた腫瘤約３０ｇを摘出し、細切し、分散させた。

この細胞を子牛血清１０ｖ／ｖ％を補足したＲＰＭＩ培
地（ｐＨ７．４）で洗浄した後、Ｌ−アルギニン３０ｍ
Ｍ存在せしめた同培地に細胞濃度約１０７／ｍｌになる
ように浮遊させ、３０℃で４０時間保ってＨＣＧを産生
させた。

その産生量を測定したところ、浮遊液１ｍｌ当り約８７
０ＩＵであった。

対照としてヒト絨毛上皮腫細胞をラットに移殖した後、
４周間飼育し、生じた腫瘤約５ｇを摘出し、細切、分散
させて得た細胞を用いて同様にＨＣＧを産生させたきこ
ろ、遊遊液１ｍｌ当り、わずかに約３０ＩＵの産生量に
過ぎなかった。

実施例 ４ 成長した普通マウスに約４００レムのエックス線を照射
してマウスの免疫反応を弱めた後、その皮下に実施例２
の方法に準じてＨＣＧ産生能を導入したリンパ芽球様Ｎ
ＡＬＬ−１細胞を移植し、通常の方法で３週間飼育した
。

皮下に生じた腫瘤約１５ｇを摘出し、分散させて得られ
た細胞を実施例２と同様に処理してＨＣＧを産生させた
。

その産生量は、浮遊液１ｍｌ当り約５２０ＩＵであった
。

対照としてヒト色素嫌性腺腫細胞をマウスに移植した後
、３週間飼育し、生じた腫瘤約５ｇを摘出し、細切、分
散させて得た細胞を用いて同様にＨＣＧを産生させたと
ころ、浮遊液１ｍｌ当りわずかに約２０ＩＵに過ぎなか
った。

実施例 ５ 孔径約０．５ミクロンのメンプランフィルターを設けた
内容量約１０ｙｄのプラスチック製円筒型拡散チャンバ
ー内に、実施例１の方法に準じてＨＣＧ産生能を導入し
たリンパ芽球様ＴＡＬＬ− １細胞を生理食塩水で浮遊
させ、これを成長したラットの腹腔内に埋設した。

このラットを通常の方法で４時間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出した。

これにより得られたＴＡＬＬ−１細胞の濃度は約７×１
０８／ｍｌであって、インビトロでの炭酸ガスインキュ
ベーター中で培養する場合の約１０２倍以上にも達する
ことがわかった。

この細胞を実施例３と同様に処理しでＨＣＧを産生させ
た。

その産生量を測定したところ、浮遊液１ｍｌ当り、約７
５０ＩＵであった。

対照としてヒト絨毛上皮腫細胞を同様に拡散チャンバー
内に収容し、ラット腹腔内に埋設して同様に４週間飼育
し、細胞濃度約１０７／ｍｌを得、この細胞を用いて同
様にＨＣＧを産生させたところ、浮遊液１ｍｌ当りわず
かに約２０ＩＵに過ぎなかった。

実施例 ６ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、実施例１の
方法に準じてヒト胎盤絨毛合胞細胞からＨＣＧ産生能を
導入したリンパ芽球様ＪＢＬ細胞を移植した後、３７℃
で１週間保った。

この卵を割卵した後、増殖細胞を採取し、実施例１と同
様に処理してＨＣＧを産生させた。

その産生量は、浮遊液１ｍｌ当り約２１０ＩＵであった
。

対照として、ヒト胎盤絨毛合胞細胞を同様にニワトリの
受精卵に移植したが増殖は見られなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン産生能を有するヒト由
   来のリンパ芽球様細胞をヒト以外の混血動物に移植し、
   またはその混血動物の体液の供給を受けながら増殖させ
   た細胞からヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを産生せしめる
   ことを特徴とするヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの製造方
   法。