JPS6045848B2 - ヒト成長ホルモンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎｇｒｏｗｔｈ
ｈｏｒｍｏｎｅ９ｈｕｍａｎＳ０ｍａｔ（）ｔｒ０Ｐｉ
ｎ）の製造方法に関する。

ヒト成長ホルモンを製造する方法としては、化学的合成
法、イソヒドロでの組織培養法および遺伝子組換による
微生物培養法などが知られているが、いずれの方法も収
率が低く、製造費がきわめて高い。

本発明者は、ヒト成長ホルモンを安価に大量に供給する
ために、鋭意研究を続けたところ、意外にもヒト成長ホ
ルモン産生能を有するヒト由来細胞は、イソヒドロでの
組織培養法により得られた細胞よりも、ヒト以外の温血
動物を利用して増殖した細胞の方が、ヒト成長ホルモン
産生量が著しく高く、細胞当り約２〜５賠にも達するこ
とを見いだし本発明を完成した。

すなわち、本発明はヒト成長ホルモン産生能を有するヒ
ト由来の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、また
はその温血動物の体液の供給を受けながら増殖し得られ
る細胞に成長ホルモン誘導剤を作用させてヒト成長ホル
モンを産生せしめることを特徴とするヒト成長ホルモン
に関するものである。

本発明の方法は、イソヒドロで培養させる場合とは違つ
て、誘導生成されるヒト成長ホルモンの量が大であるだ
けでなく、高価な血清などを含む栄養培地が不要、また
は大幅に節約でき、更に細胞増殖中の維持管理もきわめ
て容易てある。

すなわち、ヒト成長ホルモン産生能を有するヒト由来細
胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、”またはその動
物の体液の供給を受けることのできるチャンバーに収容
し、通常の飼育をすれば、温血動物体から供給される栄
養物を含有する体液を利用してその細胞が容易に増殖し
うるのである。更に、イソヒドロで培養させる場合と比
較して、この細胞の増殖が安定していること、その増殖
速度の大きいこと、得られる細胞量が大きいこと、更に
は細胞当りのヒト成長ホルモン産生量の大きいことが特
徴である。本発明で使用するヒト由来の細胞は、ヒト成
長ホルモン産生能を有し、かつヒト以外の温血動物の体
内に移植して容易に増殖するものであればよい。

例えば、ヒト下垂体前案の好酸性細胞、またはこれをＥ
ＢＶｉｒｕｓ、エツクス線などで腫瘍化させるか、また
は下垂体前葉好酸性細胞腺腫の患者から得られる腫瘍性
好酸性細胞などの本来ヒト成長ホルモン産生能を有する
細胞および肺癌細胞などの異所性ヒト成長ホルモン産生
能を有する細胞、更にこれら細胞を培養株化させた細胞
などが好適である。また、これら細胞のヒト成長ホルモ
ン産生能を持つ遺伝子を例えば、ポリエチレングリコー
ルやセンダイウイルスなどを利用する細胞融合の手段や
、ＤＮＡリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡ
ポリメラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手
段などによつて、より容易に継代培養しうる培養株化さ
れたリンパ芽球様細胞に導入して使用することは、その
増殖速度が大きいだけでなく、細胞当りのヒト成長ホル
モン産生能が約２〜１皓、またはそれ以上にも高まるの
で特に好都合である。

また、培養株化された細胞リンパ芽球様細胞の利用は、
ヒト以外の温血動物に移植する時その宿主動物の細胞と
混りにくい軟腫瘤を形成しやすく、摘出後の分散も容易
なので生きたヒトリンパ芽球様細胞の採取に極めて有利
である。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血病もし
くはヒト悪性リンパ腫由来のヒト由来細胞株が適してお
り、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）細胞、ＢＡＬＬ
−１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡｌ．Ｌ−１細胞、Ｊ
ＢＬ細胞などの公知ヒト由来細胞株が特に有利に使用し
うる。

本発明のヒト成長ホルモンの製造方法に使用する温血動
物は、ヒト成長ホルモン産生能を有するヒト由来の細胞
が増殖しうるものであればよく、例えば、ニワトリ、ハ
トなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、プタ、ウシ、
ウマ、ウサギ、モルモツト、ラット、ハムスター、普通
マウス、ヌードマウスなどの咄乳類などが使用できる。

これら動物にヒト由来の細胞を移植すると、好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけおさえるために、使用する動物は、できるだけ幼若
な状態、すなわち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期
のものの方が好ましい。また、これら動物に例えば、約
２００〜６００レムのエツクス線若しくはガンマ線を照
射するか、または抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射
するなどの前処置をほどこして、免疫反応を弱めて移植
してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合に−は、成長したも
のであつても免疫反応が弱いので、これらの前処置を必
要とすることなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移
植でき、急速に増殖できるので特に好都合である。また
、ヒト由来の細胞を、例えば先ずハムスターに移植し増
殖させた後、この細胞を更にヌードマウスに移植するな
どのように、ヒト以外の温血動物間で移植して、ヒト由
来の細胞の増殖をより安定化したり、更にそれらから誘
導生成されるヒト成長ホルモン量を増加させることも自
由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと同綱間、同門間
移植であつてもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物体
内の部位は、”移植した細胞が増殖し得る部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ば
れる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約１０−７〜１０一痛を有するメンブランフイル
ター、限外濾過膜またはホローフアイバーなどを設けた
公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、
例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体
液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で公知の培養株
化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。

また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれと接続し潅流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるよ
うにすることも、また、この拡散チャンバー部分のみを
着脱交換できるようにして動物を層殺せずに寿命一杯細
胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高め
ることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常１〜２０
週である。移植する培養株化された細胞が腫瘍細胞であ
るかリンパ芽球様細胞である場合には、その増殖速度が
特に大であり、通常１〜５週の期間で目的を達成するこ
とができる。このようにして得られるヒト由来の細胞数
は、動物個体当り約１０７〜１０１２、またはそれ以上
に達することも見い出した。換言すれば、本発明で使用
するヒト成長ホルモンの製造方法により増殖させたヒト
由来の細胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約１Ｃ
Ｐ〜１０７倍、またはそれ以上にも達し、インビトロで
栄養培地に接種して増殖させる場合の約１０１〜１０３
倍、またはそれ以上にも達して、ヒト成長ホルモンの製
造のためきわめて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞にヒト成長
ホルモン誘導剤を作用させてヒト成長ホルモンを産生さ
せる方法は自由である。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の細
胞を採取し、または皮下て増殖した腫瘤を摘出し、分散
させた後採取し、この細胞を約２０〜４０℃に保つた栄
養培地に細胞濃度が約１０１〜１Ｃｆ３／ｍｌになるよ
うに浮遊させ、これに成長ホルモン誘導剤を約１〜加時
間作用させることによつてヒト成長ホルモンを誘導生成
させればよい。

成長ホルモン誘導剤は、例えば、リジン、アルギニン、
トリプトファン、ロイシン、カザミノ酸、Ｌ−ＤＯＰＡ
などのアミノ酸、セロトニンなどのアミノ酸代謝物、ペ
プタイドなどが適宜使用される。このようにして誘導生
成されたヒト成長ホルモンは、ヒト成長ホルモン標準品
と同一であり公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、
濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行なうことによ
つて容易に精製分離し、採取することができる。更に、
高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオン交換
体への吸着・脱着、ゲル濾過およびアフイニテイクロマ
トグラフイー、等電点分画、電気泳動などの公知の方法
を更に組み合せればよく、最高純度のヒト成長ホルモン
を採取することも可能である。このようにして得たヒト
成長ホルモンは、単一物質でまたはこれにその他の一種
若しくは二種以上の物質を含有せしめ、例えば注射薬、
外用薬、内服薬、診断薬などとしてヒトの成長促進のみ
ならず、ヒトの疾患の予防、治療に有利に利用できる。

ヒト成長ホルモンの産生量は、Ｓ．Ｍ．Ｇｌｉｃｋ，ｅ
ｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（ＬＯｎｄＯｎ），ＶＯｌ．ｌ
９９７８４（１９６３）に記載されているラジオイムノ
アツセイ法に準じて測定し、米国ＮＩＨ標準品の重量で
表示した。以下、２〜３の実施例を述べる。実施例１ 成長したヌードマウスの皮下に、下垂体前葉好酸性細胞
腺腫の患者から摘出、細切、分散させて得た腫瘍性好酸
性細胞を移植した後、通常の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた腫瘤約１０ｇを摘出して細切した後、トリ
プシン含有生理食塩水に懸濁して細胞を分散させた。

この細胞を、牛脂児血清１０Ｖ／ｖ％を補足し、グルコ
ース無含有にしたＥａｒｌｅ培地１９９（ＰＨ７．２）
で洗浄した後、成長ホルモン誘導剤としてＬ−アルギニ
ンを３０ｒＴ１Ｍ存在せしめた同培地に細胞濃度約１伊
／ｍｌになように浮遊させ、３７℃で６時間保つてヒト
成長ホルモンを誘導生成させた。

その後、細胞を超音波処理し、得られる上清を用いてヒ
ト成長ホルモンの量を測定したところ、浮遊液ｍｌ当り
約１００ｒ１ｇの産生量にすぎなかつた。実施例２下垂
体前葉好酸性細胞腺腫の患者から摘出、細切、分散させ
て得た腫瘍性好酸性細胞とリンパ芽球様ナマルバ細胞（
Ｎａｍａｌｖａｃｅｌｌ）とを１４０ｎ１ＭＮａｃ１，
５４ｍＭＫＣ１，１ｍＭＮａＨ２Ｐ０４，２ｒＴ］Ｍｃ
ａｃｌ２を含有する塩類溶液にそれぞれ約１０３／ｍｌ
になるように浮遊させ、これに予め紫外線で不活化した
センダイウイルスを含有する前記塩類溶液を、氷冷下で
混合し、約５分後に３７℃恒温水槽に・移して、約３紛
間攪拌しつつ細胞融合を起させ、リンパ芽球様ナマルバ
細胞にヒト成長ホルモン産生能を導入した。

このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長したヌードマウス
の腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した。

生じた腫瘤約１５ｇを摘出し、成長ホルモン誘導剤とし
てＬ−ＤＯＰＡに替えた以外は実施例１と同様に処理し
てヒト成長ホルモンを誘導生成させた。浮遊液Ｍｔ当り
の産生量は約１８００ｒ１ｇであつノ た。対照として
細胞融合を起させたリンパ芽球様ナマルバ細胞を実施例
１と同様にインビトロで培養し、ヒト成長ホルモンを誘
導生成させたところ、浮遊液ＭＬ当り約１００ｎｇの産
生量にすぎなかつた。

実施例３新生児のハムスターにウサギから公知の方法で
調製した抗血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を
弱めた後、その皮下に、実施例２の方法に準じてヒト成
長ホルモン産生能を導入したリンパ芽球様ＪＢＬ細胞を
移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。

生じた腫瘤約１０ｇを摘出し、実施例１と同様に処理し
てヒト成長ホルモンを誘導生成させた。

浮遊液ｍｌ当りの産生量は、約２０００ｒ１ｇであつた
。対照として細胞融合を起させたリンパ芽球劇ＢＬ細胞
を実施例１と同様にインビトロで培養し、ヒト成長ホル
モンを誘導生成させたところ、浮遊液ＭＬ当り約２００
ｒ１ｇの産生量にすぎなかつた。実施例４新生児ラット
の静脈内へ、実施例２の方法でヒト成長ホルモン産生能
を導入したリンパ芽球様ナマルバ細胞を移植した後、通
常の方法で４週間飼育した。

生じた腫瘤約４０ｇを摘出し、実施例１と同様に処理し
てヒト成長ホルモンを誘導生成させた。

浮遊液ｍｌ当りの産生量は約１５００ｎｇであつた。こ
れに対して、対照のインビトロで培養し、誘導生成させ
たものは、浮遊液ｍｌ当り約１００ｎｇの産生量にすぎ
なかつた。実施例５ 成長した普通マウスに、約４００レムのエツクス線を照
射してマウスの免疫反応を弱めた後、その皮下に実施例
１と同様に調製した腫瘍性好酸性細胞を移植し、その後
通常の方法で３週間飼育し．た。

皮下に生じた腫瘤約１５ｇを摘出し、実施例２と同様に
処理してヒト成長ホルモンを誘導生成させた。浮遊液ｍ
ｌ当りの産生量は約６００ｒ１ｇであつた。これに対し
て、対照のインビトロで培養し、誘導生成させたものは
、浮遊液ｍｌ当り約２００ｎｇの産生量にすぎなかつた
。

実施例６ 孔径約０．５ミクロンのメンブランフイルターを設けた
内容量約１０ｍ１のプラスチック製円筒型拡散チャンバ
ー内に、実施例３の方法でヒト成長ホルモン産生能を導
入したリンパ芽球様ＪＢＬ細胞を生理食塩水で浮遊させ
、これを成長したラットの腹ｌ腔内に埋設した。

このラットを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出した。

これにより得られたヒト由来の細胞濃度は、約５×１Ｃ
Ｐ／ｍｌであつて、インビトロでの炭酸ガスインキュベ
ーター中で培養する場合の約１０３倍以上にも達するこ
とがわかつた。本細胞を実施例１と同様に浮遊液にし処
理してヒト成長ホルモンを誘導生成させた。浮遊液ｍｌ
当りの産生量は約２２００ｒ１ｇであつた。これに対し
て、対照のインビトロで培養し、誘導生成させたものは
、浮遊液ｍｌ当り約２００ｎｇの産生量にすぎなかつた
。実施例７ ３７℃で５日間保つたニワトリの受精卵に実施例３の方
法でヒト成長ホルモン産生能を導入したリンパ芽球様Ｊ
ＢＬ細胞を移植した後、３７℃で１週間保つた。

この卵を割卵した後、増殖細胞を採取し、実施例１と同
様に処理してヒト成長ホルモンを誘導生成させた。

浮遊液ｍｌ当りの産生量は約１３００ｎｇであつた。こ
れに対して、対照のインビトロで培養し、誘導生成させ
たものは、浮遊液ｍｌ当り約２００ｎｇの産生量にすぎ
なかつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒト成長ホルモン産生能を有するヒト由来の細胞を
   ヒト以外の温血動物体内に移植し、またはその温血動物
   の体液の供給を受けながら増殖し、得られる細胞に成長
   ホルモン誘導剤を作用させてヒト成長ホルモンを産生せ
   しめることを特徴とするヒト成長ホルモンの製造方法。