DK153848B - Fremgangsmaade til fremstilling af interferon - Google Patents

Description

i

DK 153848 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af interferon, som kan anvendes til fremstilling af interferonholdige præparater til forebyggelse og behandling af interferonfølsomme sygdomme.

5

Som beskrevet af Shigeyasu Kobayashi ["Interferon" (1975), udgivet af Kodansha, Ltd., Tokyo], af D. A. J. Tyreli, ["Interferon and Its Clinical Potential" (1976), udgivet af William Heinemann Medical Books, Ltd., London] og i " Pro-10 tein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 21, nr. 4 (1976) , ud givet af Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo er interferon et et udtryk, der skal definere et stof, som er et protein-agtigt stof, der induceres intracellulært eller ekstra-cellulært af levende celler ved at eksponere cellerne for 15 interferoninducerende midler såsom virus, bakterier, pro tozoa, rickettsia, nucleinsyre, endotoxin eller polysaccharid, og som har en virkning med hensyn til ikke-specifikt at inhibere forskellige viras multiplikation i cellerne.

90 På grund af sin virkning har interferon været betragtet som et lovende forebyggende og terapeutisk middel for virussygdomme, siden det blev opdaget.

I de seneste år har der været store forventninger til realise- 25 ringen af interferon som et medicinsk præparat, da det er blevet erkendt, at det har anti-tumor virkning på ikke-viral eller viral tumor.

Da interferon er artsspecifik, er kun interferon afledt af 30 levende menneskeceller effektive til forebyggelse og terapi af humane sygdomme.

Der anvendes konventionelt leukocyter som levende humane celler til fremstilling af interferon. Leukocyter frem- skaffes ved separation fra frisk blod, men fremskaffelsen og opbevaringen deraf i store mængder og til lave omkostninger er yderst vanskelig.

35 2

DK 153848B

Det har været forsøgt at anvende levende celler frembragt ved at inokulere etablerede humane celler på et næringsmedium og at dyrke dem in vitro til fremstilling af interferon. In vitro-metoderne kan imidlertid ikke gennemføres i 5 stor skala og ved lave omkostninger, da de har den ulempe, at de kræver store mængder humant serum og giver en ustabil multiplikation, lav multiplikationsrate og lav cellekoncentration.

10 Af de ovenfor angivne årsager er den industrielle fremstilling af interferon, der kan bruges til forebyggelse og/eller terapi af humane sygdomme, langt fra realiseret.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af human-specifikt interferon, som omfatter, at humane celler udsættes for et interferon-fremkaldende middel, hvorefter det dannede human-specifikke interferon opsamles og renses, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes humane celler opnået ved: 20 a) transplantering af etablerede humane celler til et ikke-humant varmblodigt dyr; fodring af dyret for at tillade, at de humane celler udnytter næringslegemsvæsken hos dyret til sin formering? og 25 den resulterende tumor udtages og opdeles, eller alternativt b) etablerede humane celler suspenderes i en saltvandsopløsning i et konventionelt diffusionskammer udstyret med én _7 eller flere filtermembraner med en porestørrelse på 10 30 io 5 m; indlejring eller anbringelse af diffusionskammeret i eller på et ikke-humant varmblodigt dyr på en sådan måde, at næringslegemsvæsken fra dyret tilføres til de humane celler, i diffusionskammeret; 35 fodring af dyret for at tillade, at de humane celler udnytter næringslegemsvæsken til deres formering; og opsamling af de formerede humane celler fra diffusionskammeret .

3

DK 153848 B

I sammenligning med de konventionelle processer, som anvendes til at opformere celler in vitro, har fremgangsmåden ifølge 5 den foreliggende opfindelse den fordel, at den kræver intet eller meget mindre næringsmedium suppleret med dyrt humant serum, at opformeringen af etablerede celler lettere kan opretholdes, og at der kan opnås en højere interferonaktivi tet. Etablerede humane celler kan let opformeres i andre 10 varmblodede dyrelegemer, enten ved at transplantere cellerne eller ved at inokulere i et diffusionskammer, der indeholder cellerne, på et dyr, der fodres på den sædvanlige måde, medens dyret lades forsyne cellerne med sin nærende legemsvæske. Endvidere har fremgangsmåden ifølge den foreliggende 15 opfindelse i sammenligning med konventionelle in vitro-metoder den fordel, at etablerede humane celler formeres mere stabilt og hurtigere, og at der kan opnås en højere produktion af celler og et højere interferonudbytte pr. celle.

20 Der kan anvendes enhver art af etablerede humane celler, i det omfang de let kan opformeres, når de transplanteres til andre varmblodede dyr. F.eks. kan der i henhold til den foreliggende opfindelse anvendes naturlige etablerede humane celler såsom OUMS-20-celler (en lymphoblastoid linie afledt fra 25 patienter med Down's syndrom), OUMS-25-celler (en lymphoblastoid linie afledt fra humant perifert blod), HEF-celler (en fibro-blastoid linie afledt fra menneskehud), HUF-2-celler (en fi-broblastoid linie afledt fra humant føtalt væv) .eller WI-38-celler (en fibroblastoid linie af menneskelungeoprindelse), 30 beskrevet i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 20, nr. 6, side 616 - 643 (1975), udgivet af Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, og etablerede celler afledt af humane tumorceller såsom Namalvaceller (en lymphoblastoid linie stammende fra Burkitt-lymphoma), beskrevet i "Journal of 35 Clinical Microbiology", bind 1, side 116 - 117 (1975), BALL-l-celler (en lymphoblastoid linie af B-celle-typen 4

DK 153848 B

stammende fra akut lymphatisk leukæmi), TALL-l-celler (en lymphoblastoid linie af T-celle-typen stammende fra akut lymphatisk leukæmi), NALL-l-celler (en lymphoblastoid linie af nul-celle-typen stammende fra akut lymphatisk leukæmi), ® beskrevet af Isao Miyoshi, ["Nature", bind 267, side 843 -844 (1977)] eller JBL-celler (en lymphoblastoid linie af B-celle-typen stammende fra Burkitt-lymphoma), beskrevet af Isao Miyoshi, ["Cancer", bind 40, nr. 6, i tryk (1977)].

^ Ifølge den foreliggende opfindelse kan der anvendes et hvilket som helst varmblodet dyr, hvis etablerede humane celler let kan opformeres deri, f.eks. fjerkræ såsom kyllinger eller duer, eller pattedyr såsom hunde, katte, aber, geder, svin, kvæg, heste, kaniner, marsvin, rotter, hamstre, normale mus eller nøgne mus.

Da dyr er tilbøjelige til at udvise uønskede immunoreaktioner, når de etablerede humane celler transplanteres til dem, foretrækkes det især at anvende dyrene på det lavest mulige ud- 20 viklingstrin, nemlig æg', embryo, føtus, nyfødte og unge dyr, til udnyttelse af immunoparalyse.

Før transplantationen af cellerne kan dyrene forbehandles, enten med røntgenstråling eller gammastråling med 200 - 600 rem eller med antiserum eller et immunosuppressivt middel for at undertrykke immunoreaktionerne.

Som varmblodet dyr foretrækkes den nøgne mus, da den ikke 30 udviser nogen eller kun lav immunoreaktion, og da etablerede humane celler kan transplanteres og opformeres hurtigt deri uden forbehandlinger.

Opformeringen af etablerede humane celler kan stabiliseres yderligere, når cellerne først transplanteres i hamstre og derpå transplanteres til nøgne mus, hvor der induceres interferon med forøget aktivitet.

s , DK 155848B

I dette tilfælde kan de opformerede celler yderligere transplanteres fra ét varmblodet dyr til et andet dyr af samme art, slægt, klasse eller række bortset fra mennesker.

5 Etablerede humane celler kan transplanteres til en hvilken som helst del af et dyrelegeme, for så vidt at de opformeres let deri, f.eks. intravenøst, intraperitonalt, subcutant eller i allantoishulheden.

10 I stedet for at opformere naturlige humane celler direkte i dyrelegemer kan etablerede humane celler inokuleres og opformeres i diffusionskamre af forskellige former og størrelser forsynet med en filtermembran med porer på ca.

-7 -5 10 - 10 mi diameter, f.eks. et membranfilter, ultrafilter 15 eller hulfiber, og kammeret anbringes på dyrelegemet, f.eks. interperitonalt, medens dyret lades forsyne cellerne med sine næringslegemsvæsker.

Etablerede humane celler kan, om nødvendigt, opformeres i diffusionskammeret, medens det varmblodede dyrs legemsnæringsvæske lades cirkulere ind og ud af næringsmediet i kammeret for at forsyne cellerne med næringsvæsken. I dette tilfælde placeres kammeret på dyrelegemet, hvorhos opformeringsstadiet for cellerne kan observeres gennem kammerets 25 væg, og antallet af celler pr. dyr kan forøges yderligere, uden unødvendigt at aflive dyret, ved successivt at fjerne kammeret, inokulere cellerne i et andet kammer, der indeholder frisk næringsmedium, og anbringe det sidstnævnte kammer på samme dyr.

30

Diffusionskammermetoden har de yderligere fordele, at et hvilket som helst varmblodet dyr, bortset fra mennesket, kan anvendes til opformering af naturlige menneskelige celler, at forbehandling til undertrykkelse af immunoreaktioner

O C

ikke kræves, og at naturlige humane celler, som er opformeret i kammeret, let kan høstes uden forurening med dyreceller, da de humane celler ikke kommer i direkte kontakt med dyreceller, og der ikke risiko for uønskede reaktio- npr

DK 153848 B

Efter transplantationen af de humane celler fodres dyret på den sædvanlige måde uden speciel behandling.

5 Opformeringsperioden for naturlige humane celler er sædvan ligvis 1-20 uger. Hvis de naturlige celler, der transplanteres, er sådanne, som er afledt af normale eller tumorale leukocyter, er celleopformeringsraten så høj, at opformeringen sædvanligvis kan opnås i løbet af en periode på 1 til 10 5 uger.

Antallet af opformerede humane celles tælles og bestemmes 7 12 til ca. 10 - ca. 10 eller mere pr. dyr.

15 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er med andre ord særdeles fordelagtig til fremstilling af interferon, da det antal celler, der transplanteres eller inokuleres på 2 7 dyret, forøges omkring 10 til 10 gange eller mere ved g fremgangsmåden; det er 10 til 10 gange mere end det, der 20 opnås ved at inokulere og at opformere de samme celler i et næringsmedium in vitro.

De opformerecie humane celler kan på en hvilken som helst måde induceres til at fremstille interferon. Den del af selve 25 dyrelegemet, hvor cellerne er opformeret, kan eksponeres for et interferoninducerende middel. Interferon kan f.eks. fremstilles ved direkte at udsætte de suspenderede humane celler, som er opformeret intraperitonalt, eller humane tumorceller dannet subcutant for interferoninducerende midler til 30 inducering af interferon, og ved at opsamle og rense det inducerede interferon fra de eksponerede humane celler.

Interferonet kan også induceres ved at opsamle de opformerede humane celler fra dyrelegemerne og at udsætte cellerne 35 for et interferoninducerende middel in vitro. Humane celler, som er fremkommet ved at opsamle suspenderede humane celler, der er opformeret intraperitonalt, eller sådanne, der er opnået ved at dissociere en isoleret human massiv tumor,

7 DK 153848 B

der er dannet subcutant i dyrelegemer, kan f.eks. suspenderes i et næringsmedium, der holdes ved ca. 20 - ca. 40°C

5 8 til dannelse af en suspension på ca. 10 - ca. 10 celler pr.

5 ml. Derpå udsættes cellerne for interferoninducerende midler til induktion af interferon, og det dannede interferon opsamles og renses.

Når de humane celler opformeres i diffusionskamre, kan cello lerne eksponeres for interferoninducerende midler i kamrene eller efter udvinding af cellerne fra kamrene.

Ved induktionen af interferon kan produktionen af interferon forøges yderligere ved i og for sig kendte måder, 15 f.eks. priming under anvendelse af interferon og superinduktion under anvendelse af en metabolisk inhibitor.

Interferonproduktionen pr. dyr kan forøges yderligere ved følgende metoder: 20 a) en metode, ved hvilken antallet af levende celler pr. dyr kan forøges yderligere uden unødvendigt at aflive dyret, er ved successivt at fjerne kammeret, inokulere cellerne i et andet kammer, der indeholder frisk nærings-25 væske, og placere det sidstnævnte kammer på samme dyr, b) en metode, ved hvilken de humane celler, som opformeres i dyrelegemet, eksponeres for et interferoninducerende middel in vivo og/eller in vitro til induktion af in- 30 terferon under anvendelse af de samme celler én eller flere gange.

Der kan frit anvendes en hvilken som helst kendt interferoninducer, f.eks. virus, bakterier, protozoer, rickettsia, nu-35 cleinsyre, endotoxin eller polysaccharid.

Det dannede interferon kan let renses ved i og for sig kendte rensningsmetoder, f.eks. udsaltning, dialyse, filtrering,

DK 153848B

centrifugering, opkoncentrering og lyofilisering. Det vundne interferonpræparat kan, om nødvendigt, renses yderligere på i og for sig kendte måder såsom adsorption og desorption med ionbyttere, gelfiltrering, affinitetschromatografi, isoelek-5 trisk punkt-fraktionering og eletrophorese.

Interferonaktiviteten bestemmes med FL-celler/ som er en fibro-blastoid linie afledt af human amnion, som beskrevet i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 20, nr. 6, side 616 - 643 (1975) 10 udgivet af Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo ved konventionel plague-reduktionsmetode.

Hæmagglutinintiteren bestemmes ifølge fremgangsmåden beskrevet af J. E. Salk ["Journal of Immunology", bind 49, side 15 87 (1944)].

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved følgende eksempler: 20

Eksempel A. Fremstilling af interferon.

A-l) Til voksne nøgne mus transplanteres subcutant naturlige humant afledte BALL-l-celler, og musene fodres på den sæd-vanlige måde i 3 uger. Der isoleres ca. 10 g massiv tumor dannet subcutant pr. nøgen mus, den udskæres fint og suspenderes i en saltopløsning, der indeholder trypsin, til dissociering af tumoren i celler, og cellerne opsamles ved centrifugering. Cellerne vaskes med Eagle's minimal essen-30 tial medium ved pH-værdi 7,2 og 37°C indeholdende 5 volumenprocent humant serum og resuspenderes til en kon-centration på ca. 5 x 10 celler pr. ml. Til den vundne blanding sættes ca. 100 enheder pr. ml delvis renset humant arts- -specifikt interferon, og blandingen inkuberes i ca. 2 timer, 35 og derpå tilsættes omkring 300 hæmagglutinintitere pr. ml Sendai virus, og der inkuberes i yderligere 20 timer til induktion af interferon. Den inkuberede opløsningsblanding centrifugeres ved ca. 1000 g og ca. 4°C til fjernelse af

9 DK 153848 B

!Ε|,.ι,·ϊ’ bundfald, f.eks. celler. Den vundne supernatant dialyseres imod 0,1M pufferopløsning med pH-værdi 2,0 indeholdende saltsyre og kaliumchlorid ved 4°C i 48 timer og dialyseres herpå imod 0,01M phosphatpufret saltopløsning ved pH-værdi 5 7,2 i 12 timer og filtreres omhyggeligt ved membranfiltre ring. Filtratet inddampes og lyofiliseres til et interferonpulver med høj aktivitet. Interferonaktiviteten er ca.

20.000.000 enheder pr. nøgen mus.

i>'< A-2) Voksne nøgne mus transplanteres intraperitonalt med naturlige humant afledte OUMS-20-celler og fodres på den sædvanlige måde i 5 uger. Musene injiceres intraperitonalt med "Newcastle disease"-virus, som oprindelig har en hæmag-glutinintiter på ca. 3000, men næsten er fuldstændig præ-li r,aktiveret ved hjælp af ultraviolet stråling, og dræbes efter 24 timer, hvorpå ascitesvæsken opsamles. Væsken centrifugeres ved ca. 1000 g ved 4°C til fjernelse af bundfald, f.eks. celler. Supernatanten dialyseres mod 0,1M pufferopløsning ved pH-værdi 2,0 indeholdende saltsyre og kalium- O i chlorid ved 4°C i 48 timer og dialyseres derpå imod 0,01M phosphatpufret saltopløsning med pH 7,2 i 15 timer og filtreres omhyggeligt ved membranfiltrering. Filtratet koncentreres til dannelse af en interferonopløsning med høj ak-tivit. Interferonaktiviteten er ca. 700.000 enheder/10 25 nøgne mus.

A-3) Nyfødte hamstere, som er injiceret intraperitonealt med kendt kanin-antilymfocvtserum mod hamsterthymocyter og transplanteret subcutant med naturlige humant afledte 30 JBL-celler fodres på den sædvanlige måde i 4 uger.

Der isoleres ca. 30 g massiv subcutant dannet tumor pr. hamster, og tumoren opløses på lignende måde som i eksempel A-l). De vundne celler vaskes med RPMI-1640-medium, 35 o pH-værdi 7,4 og 37 C, indeholdende 10 volumenprocent kalveserum, og resuspenderes til dannelse af en koncentration på 2 x 10 celler pr. ml. Til den vundne blandingsopløsning sættes 200 enheder pr. ml delvis renset humant arts-specifikt

10 _ DK 153848 B

interferon, og blandingen inkuberes i ca. 1 time. Efter tilsætning af ca. 100 hæmaglutinintitere pr. ml Sendaivirus inkuberes den resulterende blanding i yderligere 16 timer 5 til induktion af interferon.

Derefter renses den vundne opløsning og opkoncentreres på lignende måde som i eksempel A-2) til dannelse af en interferonopløsning med høj aktivitet. Interferonaktiviteten 10 er ca. 15.000.000 enheder pr. hamster.

A-4) Nyfødte rotter transplanteres intravenøst med naturlige humant afledte Namalvaceller og fodres på den sædvanlige måde i 4 uger.

15

Der isoleres for hver rotte ca. 50 g massiv tumor dannet subcutant, og den opløses på lignende måde som i eksempel A-l) .

20 Derpå behandles de vundne celler på lignende måde som i eksempel A-l) til dannelse af interferon. Den vundne interferonopløsning renses og lyofiliseres på lignende måde som i eksempel A-l) til et interferonpulver med høj aktivitet. Interferonaktiviteten er ca. 30.000.000 enheder pr. rotte.

25 A-5) Voksne mus underkastes røntgenstrålebehandling med ca.

400 rem for at svække deres immunoreaktioner og transplanteres derpå subcutant med humant afledte naturlige TALL-1--celler og fodres på den sædvanlige måde i 3 uger.

30

Der isoleres ca. 10 g massiv tumor dannet subcutant pr. mus, og det opløses på lignende måde som i eksempel A-l).

De vundne celler behandles på lignende måde som i eksempel 35 A-3) til induktion af interferon. Den vundne interferon opløsning renses og koncentreres på lignende måde som i eksempel A-2) til en interferonopløsning med høj aktivitet. Interferonaktiviteten er omkring 8.000.000 enheder pr. mus.

,, DK 153848 B

A-6) Naturlige humane OUMS-25-celler transplanteres subcu-tant til hamstere på lignende måde som i eksempel A-3) i 3 uger og transplanteres derpå intraperitonealt i 10 dage 5 gamle, nøgne mus. De nøgne mus fodres på den sædvanlige måde i 5 uger, anaesthetiseres, og ascitesvæsken indsamles. Væsken centrifugeres til opsamling af opformerede celler. Cellerne vaskes og lades inducere interferon på lignende måde som i eksempel A-l). Den vundne interferonopløsning 10 renses og koncentreres på lignende måde som i eksempel A-2) til dannelse af en interferonopløsning med høj aktivitet. Interferonaktiviteten er omkring 2.000.000 enheder pr. nøgen mus.

A-7) Humant afledte naturlige JBL-celler suspenderes i saltopløsning i 10 ml's cylindriske plastdiffusionskamre forsynet med en membran med porer på ca. 0,5 ^u i diameter. Kamrene indlejres intraperitonealt i voksne rotter.

20

Rotterne fodres på den sædvanlige måde i 4 uger, og kamrene fjernes.

Koncentrationen af celler i kamrene bestemmes til ca.

9 3 5 x 10 celler pr. ml, hvilket er ca. 10 gange højere end det, der opnås in vitro på et næringsmedium i en CC^-in- kubator.

Cellerne behandles på lignende måde som i eksempel A-l) til induktion af interferon. Den vundne interferonopløsning

O A

renses, koncentreres og lyofiliseres til et interferonpulver med høj aktivitet. Interferonaktiviteten er omkring 30.000.000 enheder pr. rotte.

A-8) Til allantoisvæsken i befrugtede æg, som er in-kuberet ved 37°C i 5 dage, transplanteres humant afledte NALL-l-celler, og æggene inkuberes ved 37°C i én uge.

,, DK 153848 B

Æggene åbnes og de opformerede celler opsamles. Cellerne behandles på lignende måde som i eksempel A-l) til induktion af interferon. Den vundne interferonopløsning renses og koncentreres på lignende måde som i eksempel A-2) til 5 dannelse af en interferonopløsning med høj aktivetet. Interferonaktiviteten var ca. 400.000 enheder/10 befrugtede æg.

A-9) Det ved fremgangsmåden i eksempel A-l) fremstillede 10 interferonpulver renses yderligere ifølge fremgangsmåderne beskrevet af G. Bodo (Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon, "11th International Immunobiological Symposium", 8 & 9 Juni, 1977, Zagreb, Jugoslavien), dvs. adsorption og desorption med ionbytter, 15 molekylvægtfraktionering ved gelfiltrering, koncentrering og omhyggelig filtrering med membranfilter. Den vundne g interferonopløsning har en aktivitet på 2 x 10 enheder pr. mg protein. Interferongenfindelsen er ca. 40%.

20

Det i eksemplerne A-l) - A-9) vundne interferon kan med fordel anvendes alene eller i blandinger med ét eller flere andre stoffer som injektionspræparater og præparater til ekstern og intern anvendelse til forebyggelse og behandling af interferonfølsomme humane sygdomme. Opfindelsen belyses 25 yderligere ved følgende eksperimenter:

Eksperiment 1.

30

Behandling af virussygdomme med interferon (inhiberings-test for virusopformering in vitro).

Til monolag af humane embryoniske lungeceller dannet ved en primær kultur i Petriskåle med 6 cm i diameter sættes 35 0, 1, 10 eller 100 enheder af det interferon, der er fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel A-9) og de vundne blandinger inkuberes i en 5 volumenprocents C02-inkubator ved 37°C i 20 timer. Til cellerne sættes Varicella-zoster-

13 DK 153848 B

virus eller human cytomegalovirus i en mængde, så at der dannedes 100 plaques, når der ikke er tilsat interferon til cellerne. Blandingen inkuberes, og antallet af dannede plaques tælles.

5

Interferons inhiberingsvirkning på virusopformeringen bestemmes under anvendelse af følgende ligning:

A - B

reduktion i antallet af plaque (%) = - x 100

A

10 hvor A er antallet af plaques, når der ikke tilsættes interferon, og B er antallet af plaques, når der tilsættes interferon.

T> J Resultaterne er anført i tabel I.

Tabel I.

20 antal enheder Varicella-zoster virus human cytomegalovirus 0 0% 0% 25 1 12% 5% 10 53% 64% 100 91% 84% 30

Det fremgår tydeligt at resultaterne i tabel I, at det ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede interferon inhiberer opformeringen af sygdomsfremkaldende vira.

35 14

DK 153848B

Der bemærkes ingen abnormitet hos de dyrkede humane celler, når interferonet sættes til cellerne.

5 Eksperiment 2.

Behandling af ikke-virale sygdomme med interferon.

1) Inhiberingstest for opformeringen af tumorceller in vitro.

10

Til RPMI 1640-medium suppleret med 15 volumenprocent føtalt kalveserum sættes det ved fremgangsmåden i eksempel A-9) fremstillede interferon til dannelse af koncentrationer på henholdsvis 30, 300 og 3000 enheder pr. ml. De resulterende 15 blandinger inokuleres sammen med humane tumorceller til 5 dannelse af en koncentration på 5 x 10 celler pr. ml og inkuberes i 5 volumenprocents CC^-inkubator ved 37°C i 5 dage. Derpå tælles antallet af celler pr. ml medium. Kontroller fremstillet som ovenfor bortset fra, at interferonet 20 o præaktiveres ved opvarmning til 100 C i 30 minutter, inkuberes på lignende måde.

Interferonets inhiberende virkning på celleopformeringen bestemmes ved følgende ligning: 25 (A-5xI05) - (B-5xl05)

Inhibering af celleopformering (%) = - x 100 (A-5xl05) hvor A er antallet af celler i kontrollen, og B er antallet 30 af celler ved interferonbehandlingstesten.

15 DK 153848 B

jpsrr-i

Resultaterne er anført i tabel II.

Tabel II.

5

Interferonkoncentration Humane tumorceller ^ (enheder pr. ml) BALL-1 TALL-1 NALL-1 JBL

30 +18% +12% +21% +19% 300 +57% +61% +63% +54% 3000 +88% +82% +85% +91%

15 I

Det fremgår klart af resultaterne i tabel II, at interferonet inhiberer opformeringen af tumorceller såsom BALL-1-20 -celler, TALL-l-celler, NALL-l-celler og JBL-celler i sær deles høj grad, og at interferonet er effektivt i koncentrationer i området fra 30 til 3000 enheder pr. ml.

? Inhiberingstest for opformering af tumorceller in vivo.

25

Testen udføres på 8 nøgne mus, som er ca. 2 måneder gamle.

6

Der transplanteres 7,5 x 10 TALL-l-celler (tumorceller) subcutant i hver mus. Fra den tredje dag efter transplantationen får 4 mus intraperitonealt 20 doser 30 interferon fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel A-3), ide 1 dosis er 10.000 enheder pr. nøgen mus, og der gives 3 doser pr. uge. Efter transplantationerne fodres musene i 48 dage og aflives. Den våde vægt af de i musen dannede tumorer bestemmes. De resterende 4 mus anvendes som kontroller 35 16 —

DK 153848 B

og fodres og aflives på lignende måde bortset fra, at de ikke får interferonet. Den våde vægt af de dannede massive tumorer bestemmes.

5

Resultaterne er anført i tabel III.

Tabel III.

10 ---

Kontrol Interferonbehandlingstest 1 5,8 g 1,6 g 15 2 8,8 g 1,1 g 3 4,3 g Og 4 7,5 g Og

Gennemsnitsvægt 6,6 g 0,7 g 20___ 3) Inhiberingstest for opformering af tumorceller in vivo.

Testen udføres med 8 nøgne mus, der er ca. 2 måneder gamle.

25 7 I alle musene transplanteres 10 JBL-celler (tumorceller) pr. nøgen mus subcutant. Fra tredje uge efter transplantationen får 4 mus intraperitonealt 8 doser af interferonet fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel A-2), 1 dosis er 1000

Of) enheder pr. nøgen mus, og der gives 2 doser pr. uge. Efter transplantationen fodres musene i 42 dage og aflives. Den våde vægt af de dannede tumorer bestemmes. De resterende 4 mus, der anvendes som kontroller, fodres og aflives på lignende måde bortset fra, at de ikke får interferonet. Den O c.

våde vægt af de dannede tumorer bestemmes.

DK 153848 B

17

Resultaterne er anført i tabel IV.

Tabel IV.

5

Kontrol Interferonbehandlingstest 10 1 4,5 g 0,7 g 2 4,9 g 1,4 g 3 17,1 g 0,9 g 4 20,3 g 0,7 g 15

Gennemsnitsvægt 11,7 g 0,9 g _I__ 20 Det fremgår klart af resultaterne i tabel III og IV, at interferonet inhiberer dannelsen af human massiv tumor i mus, og at selv om der dannes tumor, er dens vægt langt mindre end hos kontrollerne. I sammenligning med kontrollerne har de interferonforbehandlede nøgne en stærkere 25 appetit og er mere fysisk aktive.

Eksperiment 3.

20 Akut toksicitetstest.

Akut toksicitettest udføres med 20 dage gamle mus ved at injicere den ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-9) fremstillede interferonopløsning. Resultaterne viser en ekstremt 25 lav toksicitet? LD^p-værdi på mere end 20.000.000 enheder pr. kg, når det injiceres intraperitonealt i mus.

18 DK 153848B

Det fremgår klart af de ovenfor beskrevne eksperimenter, at de her nævnte interferonfølsomme sygdomme er sådanne, som kan forebygges eller behandles med det her omhandlede 5 interferon, dvs. virussygdomme såsom epidemisk keratokon-junktivitis, herpetisk keratitis, influenza, rubella og serum hepatitis og ikke-virale sygdomme såsom leukæmi og osteosarcoma.

10 Medicin eller terapeutiske midler for interferonfølsomme sygdomme, der indeholder interferon, kan fremstilles i forskellige former og faser i overensstemmelse med slutanvendelsen, dvs. flydende præparater såsom collyrium, øjendrå-ber, næsedråber, gurglemidler, injektionspræparater, pas-15 tapræparater såsom salve, og faste præparater såsom pulvere, granuler eller tabletter.

Præparaterne er tilstrækkeligt effektive til at forebygge og behandle interferonfølsomme sygdomme, hvis de generelt 20 indeholder 1 - 10.000.000 enheder interferon pr. g. Præpa raterne kan, om nødvendigt, inkorporeres med ét eller flere medlemmer af gruppen bestående af therapeutiske midler, bærere, fyldstoffer og stabiliseringsmidler.

25 Da interferon let elimineres fra blodet inden for 10 minutter og udskilles af systemet, når det injiceres intravenøst, fås især ved tildrypningsadministration af interferon i infusionssukkeropløsning et middel til at forlænge administrationstiden for at få fuld og effektiv udnyttelse af 30 tilførte interferon og til yderligere forbedring af den terapeutiske og profylaktiske virkning af interferon på interferonfølsomme sygdomme.

35

19 DK 153848B

Der beskrives nogle udførelsesformer for interferonholdige præparater : 5 Eksempel B. Præparater.

B-l). Et flydende præparat.

Et flydende præparat fremstilles med saltopløsning og det 10 ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-l) fremstillede in terferon til en interferonkoncentration på 500 enheder pr. ml. Præparatet er egnet som nebula, øjendråber, næsedråber og gurglemiddel til forebyggelse og behandling af virale sygdomme, især epidemisk keratokonjunktivitis og influenza.

15 B-2). En injektionsopløsning.

En injektionsopløsning fremstilles med saltopløsning og det ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-9) fremstillede 20 interferon til dannelse af en interferonkoncentration på 100.000 enheder pr. ml.

Injektionsopløsningen er egnet til behandling af alle interferonfølsomme sygdomme såsom virale eller tumorale syg-25 domme.

B-3). En sukkerinfusionsopløsning .

Der fremstilles en sukkerinfusionsopløsning ved at blande 30 1.000.000 enheder af et interferonpræparat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-5) og 10 mg cyclophosphor-amid i 500 ml af en 10%'s w/v vandig maltoseopløsning. Sukkerinfusionsopløsningen er egnet som en opløsning til kontinuerlig intravenøs infusion til behandling og forebyggelse 35 af tumorsygdomme. *

20 DK 153848 B

B-4). En injektionsopløsning.

Der fremstilles en injektionsopløsning med 100 ml 10% w/v vandig maltoseopløsning, 500.000 enheder af det ved frem-5 gangsmåden ifølge eksempel Δ-6) fremstillede interferon og 2 mg mitomycin C. Injektionsopløsningen er især egnet til behandling af tumorsygdomme.

B-5). En salve.

10

Der fremstilles en salve på den sædvanlige måde ved blanding af det ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-4) fremstillede interferonpulver med vaseline og flydende paraffin til opnåelse af en interferonaktivitet på 10.000 enheder pr.

g. Præparatet er egnet til behandling af virushudsygdomme.

B-6). Tabletter.

Der fremstilles tabletter på den sædvanlige måde ved at 20 tablettere en blanding af det fremgangsmåden i eksempel A-7) fremstillede interferon, stivelse og maltose til opnåelse af en interferonaktivitet på 1000 enheder pr. tablet (100 mg). Tabletterne er egnede til forebyggelse og behandling af virussygdomme i fordøjelsessystemet.

25 B-7). Et flydende præparat.

Et flydende præparat til oral administration fremstilles med 10 ml af en 10%'s w/v vandig maltoseopløsning, 200.000 2° enheder af det ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-8) fremstillede interferon og 5 g methotrexat. Præparatet er især egnet til behandling af tumorsygdomme.

35

Claims (1)

1. 21 DK 153848 B Fremgangsmåde til fremstilling af human-specifikt interferon, som omfatter, at humane celler udsættes for et interferon-fremkaldende middel, hvorefter det dannede human-specifikke 5 interferon opsamles og renses, kendetegnet ved, at der anvendes humane celler opnået ved: a) transplantering af etablerede humane celler til et ikke- 2Q humant varmblodigt dyr; fodring af dyret for at tillade, at de humane celler udnytter næringslegemsvæsken hos dyret til sin formering; og den resulterende tumor udtages og opdeles, eller alternativt b) etablerede humane celler suspenderes i en saltvandsopløs-ning i et konventionelt diffusionskammer udstyret med én _7 eller flere filtermembraner med en porestørrelse på 10 - 10“5 m; indlejring eller anbringelse af diffusionskammeret i eller på et ikke-humant varmblodigt dyr på en sådan måde, at næ- m* U ringslegemsvæsken fra dyret tilføres til de humane celler i diffusionskammeret; fodring af dyret for at tillade, at de humane celler udnytter næringslegemsvæsken til deres formering; og ^ opsamling af de formerede humane celler fra diffusionskammeret. 30 35