DE3249946C2 - hTNF-haltiges therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren und dessen Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren, das menschliches TNF (hTNF) als Wirkstoff enthält, und dessen Verwendung.

hTNF ist in diesem Zusammenhang als ein Faktor definiert, der zytotoxisch auf eine fibroblastartige Zellinie von Mäusen, L-929, als Targetzellen bzw. Zielzellen wirkt und ihre anschließende Zytolyse bewirkt.

Wie von E. A. Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 72, Nr. 9, S. 3666 bis 3670 (1975), und E. Pick, "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines", Bd. 2, S. 235 bis 272 (1981), Academic Press, Inc., beschrieben wurde, bezeichnet der Ausdruck "TNF" eine proteinartige Substanz, die man beispielsweise in Macrophagen induzieren kann, indem man parenteral an Kaninchen einen TNF-Auslöser verabreicht, wie z. B. Bacille de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum oder Endotoxin; und diese proteinartige Substanz kann eine hämorrhagische Nekrose von Meth A-Sarkom bewirken. Es ist ferner gut belegt, daß TNF praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirkt, aber eine bemerkenswerte Zytolyse sowohl der Targetzellinie von Mäusen, L-929, als auch von menschlichen Tumorzellen bewirkt.

Die guten Aussichten von hTNF als therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren sind mit einer großen Erwartung aufgrund seiner Zytolysefunktion in Tumorzellen verbunden.

Obwohl TNF praktisch nicht artspezifisch ist, und daher die Möglichkeit der Verwendung von TNF nicht-menschlichen Ursprungs, z. B. aus Kaninchen oder Ratten, bei der Behandlung von menschlichen Krankheiten naheliegt, ist die Verwendung von TNF aus lebensfähigen menschlichen Zellen erwünscht und sehr sicher, weil es weniger antigene Eigenschaften ud andere Nebenwirkungen hervorbringt, wenn man es in einer derartigen Behandlung verwendet.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein hTNF als Wirkstoff enthaltendes Mittel als therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren zur Verfügung zu stellen.

Es wurde festgestellt, daß man eine große Menge an hTNF leicht erhalten kann, indem man menschliche Zellen, die man durch Vermehrung einer menschlichen Zellinie erhalten hat, welche TNF erzeugen kann, einen TNF-Auslöser aussetzt, eine gesteigerte TNF-Erzeugung induziert und das angesammelte bzw. erzeugte hTNF sammelt und reinigt; es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß das hTNF ein ausgezeichnetes therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren ist.

Ferner wurde festgestellt, daß das derart erhaltene hTNF praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirkt, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse sowohl von menschlichen Tumorzellen als auch der Target-Zellinie von Mäusen, L-929, bewirkt.

Die menschliche Zellinie, die man verwenden kann, kann eine Zellinie sein, die man in vitro auf übliche Weise vermehren kann. Um das erfindungsgemäße Mittel wirkungsvoll herzustellen, bevorzugt man die Verwendung von menschlichen Zellen, die man vermehrt hat, indem man die menschliche Zellinie auf ein nicht-menschliches warmblütiges Tier transplantierte oder wahlweise dazu die menschliche Zellinie sich in einer Diffusionskammer vom üblichen Typ vermehren ließ, durch welche die nährende Körperflüssigkeit eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der Zellinie zugeführt wird: Im Gegensatz zu üblichen Methoden, wobei man lebende menschliche Zellen in vitro vermehrt, liefert die Methode unter Verwendung der Arbeitsweise in vivo nicht nur ein TNF mit viel höherem Reinheitsgrad, sondern benötigt ferner kein oder viel weniger Nährmedium mit einem Gehalt an teurem Serum und macht dadurch die Erhaltung der Kultur während der Zellvermehrung viel leichter.

Obwohl in der US-PS 4 276 282 (Sugimito et al.) eine etwas verbesserte Methode zur Herstellung von humanspezifischem Interferon (nachstehend als "HuIFN" bezeichnet) beschrieben ist, das eine Hemmungswirkung auf Virusinfektionen aufweist, lehrt diese US-PS keinerlei Möglichkeit der Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres zur Herstellung von hTNF.

Insbesondere kann man bei der Methode unter Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres als Wirt gemäß der Erfindung bestimmte menschliche Zellinien leicht vermehren, während man die nährende Körperflüssigkeit ausnützt, die von den nicht-menschlichen warmblütigen Tier zugeführt wird, indem man die menschlichen Zellinien auf das nicht-menschliche warmblütige Tier transplantiert oder wahlweise dazu sie in eine übliche Diffusionskammer einsetzt, die derart ausgebildet ist, daß sie die Körperflüssigkeit aufnimmt, und die Kammer in das Tier einsetzt bzw. an dem Tier anbringt; und indem man das Tier auf übliche Weise füttert.

Ferner kann man das Verfahren von den üblichen Zellvermehrungsmethoden in vitro unter Verwendung von Gewebekulturen dadurch unterscheiden, daß man zusätzliche Merkmale erzielen kann, nämlich eine viel besser stabilisierte und raschere Zellvermehrung, eine höhere Zellproduktion und eine außerordentlich erhöhte Ausbeute an TNF pro Zelle.

Die menschlichen Zellinien, die man verwenden kann, sind solche, die man leicht transplantieren und in dem Tier vermehren kann, und die TNF erzeugen: Beispielsweise Namalva-Zellen, wie in Journal of Clinical Microbiology, Bd. 1, S. 116 bis 117 (1975) beschrieben ist; BALL-1-, TALL-1- und NALL-1-Zellen, wie von I. Miyoshi in Nature, Bd. 267, S. 843 bis 844 (1977) beschrieben ist; M-7002- und B-7101-Zellen, wie in Journal of Immunology, Bd. 113, S. 1334 bis 1345 (1974) beschrieben ist; JBL-, EBV- Sa-, EBV-Wa-, MOLT-3- und EBV-HO-Zellen, wie in The Tissue Culture, Bd. 6, Nr. 13, S.527 bis 546 (1980) beschrieben ist; CCRF-SB-Zellen (ATCC CCL 120); BALM 2-Zellen; DND-41- Zellen; und andere etablierte Zellinien, die man durch Transformieren von normalen Monozyten oder Granulozyten unter Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels oder von karzinogener Strahlung erhalten hat.

Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der beschriebenen Zellinien frei kombiniert in den Stufen bis zur TNF-Induktion verwenden, die nachstehend genauer beschrieben ist. Menschliche Leukozyten, die TNF erzeugen können und die man aus frischem menschlichen Blut gewonnen hat, kann man in Kombination mit einer oder mehreren der genannten Zellinien verwenden.

Das nicht-menschliche warmblütige Tier, das man verwenden kann, ist ein Tier, worin man die Zellinie vermehren kann: Beispielsweise Geflügel, wie z. B. Huhn oder Taube; oder Säugetier, wie z. B. Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Pferd, Kuh, Meerschweinchen, Ratte, nackte Ratte, Hamster, Maus oder nackte Maus.

Da die Transplantation einer derartigen menschlichen Zellinie auf das Tier unerwünschte Immunreaktionen bewirkt, ist es wünschenswert, zu einer möglichst starken Verminderung der Immunreaktion ein nicht-menschliches warmblütiges Tier im jüngsten möglichen Zustand zu verwenden, z. B. als Ei, Embryo oder Fetus oder als Neugeborenes oder jüngstes Tier.

Vor der Transplantation kann man ein derartiges Tier ferner mit Röntgenstrahlen oder gamma-Strahlen von etwa 200 bis 600 rem bestrahlen oder ein Antiserum oder Immunsuppressivum injizieren, um die Immunreaktion auf das niederste mögliche Niveau herabzudrücken.

Wenn man nackte Mäuse oder nackte Ratten als Wirtstier verwendet, kann man, weil das Tier weniger unerwünschte Immunreaktionen sogar in seinem erwachsenen Zustand zeigt, auf das Tier leicht beliebige der genannten Zellinien ohne eine derartige Vorbehandlung transplantieren, und die Zellinien vermehren sich darin, wobei man weniger befürchten muß, daß unerwünschte Immunreaktionen bewirkt werden.

Man kann sowohl die Stabilisierung der Zellvermehrung als auch die Steigerung der TNF-Erzeugung durch wiederholte Transplantation unter Verwendung von verschiedenen nicht- menschlichen warmblütigen Tieren erzielen: Beispielsweise kann man diese Vorteile erzielen, indem man zuerst die Zellinie auf Hamster transplantiert und darin vermehrt und danach die vermehrten menschlichen Zellen auf nackte Mäuse neu transplantiert. In diesem Fall kann man die wiederholte Transplantation unter Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der gleichen Klasse oder Ordnung sowie der gleichen Art oder der gleichen Gattung durchführen.

Was den Körperteil des Tieres betrifft, auf den man die Zellinie transplantieren kann, kann man die Zellinie auf einen beliebigen Körperteil des Tieres transplantieren, sofern sich die Zellinie darin vermehrt: Beispielsweise in die Allantoishöhle oder intravenös, intraperitoneal oder subkutan.

Statt die Zellinie auf das Tier zu transplantieren, kann man beliebige der beschriebenen Zellinien leicht vermehren indem man sie in eine übliche Diffusionskammer einbringt, deren Form und Größe verschieden sein kann, und die beispielsweise ein Membranfilter, Ultrafilter oder Hohlfaserfilter einer nominalen Porengröße von etwa 10^-7 bis 10^-5 m aufweist, das die Verunreinigung der Kammer mit tierischen Zellen verhindert, aber die Zellinie mit der nährenden Körperflüssigkeit versorgt; indem man beispielsweise intraperitoneal die Kammer in das Tier einbettet; und die Zellinie sich darin unter Verwendung der nährenden Körperflüssigkeit vermehren läßt, die vom Tier zugeführt wird.

Ferner kann man die Diffusionskammer beispielsweise auf dem Tier derart vorsehen und anordnen, daß die nährende Körperflüssigkeit und nährende Lösung in der Kammer frei durch die Kammer zirkulieren können. In diesem Fall kann man die Kultur in der Kammer während der Zellvermehrung durch ein oder mehrere transparente Seitenfenster beobachten, das bzw. die in einer oder mehreren der Kammerwände vorgesehen sind, und/oder man kann die Kammer wiederholt durch eine frische Kammer ersetzen, wodurch man sowohl die Zellvermehrung über den Lebenszeitraum hinaus fortsetzen, ohne das Tier zu töten, als auch die Zellproduktion pro Tier viel stärker steigern kann.

Da die Verwendung einer derartigen Diffusionskammer eine geringere Auslösung von unerwünschten Immunreaktionen bewirkt, weil keine direkte Berührung der menschlichen Zellen mit den tierischen Zellen stattfindet, kann man ein beliebiges nicht-menschliches warmblütiges Tier leicht als Wirt ohne Vorbehandlung verwenden, und man kann die vermehrten menschlichen Zellinien leicht daraus gewinnen.

Die Fütterung des Tieres kann man leicht auf übliche Weise durchführen, und es ist keinerlei Spezialbehandlung sogar nach der Transplantation erforderlich.

Der Zeitraum, den man benötigt, um eine maximale Zellvermehrung zu erzielen, beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wochen. Die Anzahl der derart erhaltenen menschlichen Zellen kann etwa 10⁷ bis 10¹² pro Tier oder mehr betragen. Insbesondere vermehren sich die transplantierten menschlichen Zellen auf das etwa 10²- bis 10⁷-fache oder mehr, was eine etwa 10- bis 10⁶-fache oder noch höhere Ausbeute ist im Vergleich zu jener, die man unter Verwendung der Vermehrungsmethode in vitro unter Verwendung eines Nährmediums erzielt: Demgemäß sind die vermehrten menschlichen Zellen vorzugsweise zur Herstellung von hTNF geeignet.

Man kann eine beliebige Methode, durch welche in den vermehrten menschlichen Zellen die Erzeugung von TNF induziert wird, anwenden: Die vermehrten menschlichen Zellen kann man in dem Tier, das man als Wirt für die Zellvermehrung verwendet, einem TNF-Auslöser aussetzen. Beispielsweise setzt man menschliche Zellen, die man in suspendiertem Aszites vermehrt hatte, oder Tumorzellen, die man beispielsweise subkutan gebildet hatte, direkt in vivo einem TNF-Auslöser aus, induziert die TNF- Erzeugung, gewinnt das erzeugte bzw. angesammelte TNF aus Aszites, Serum und/oder Tumor und reinigt danach das TNF.

Wahlweise dazu kann man die vermehrten menschlichen Zellen aus dem Tier gewinnen und danach in vitro einem TNF-Auslöser aussetzen: Beispielsweise suspendiert man die vermehrten menschlichen Zellen, die man durch Gewinnung aus der Aszitessuspension oder durch Extraktion und Zerteilen des massiven Tumors bzw. der massiven Tumoren erhalten hat, den bzw. die beispielsweise subkutan gebildet wurden, in einem Nährmedium, das man auf eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 40°C vorgewärmt hat, bis zu einer Zelldichte von etwa 10⁵ bis 10⁸ Zellen pro ml, setzt sie in vitro einem TNF-Auslöser aus und sammelt danach das gebildete hTNF aus der Kultur.

Wenn man die menschliche Zellinie in einer üblichen Diffusionskammer vermehrt, kann man die vermehrten menschlichen Zellen in der Kammer oder nach der Gewinnung daraus einem TNF-Auslöser aussetzen.

Die derart erhaltenen menschlichen Zellen kann man ferner in vitro weitere 1 bis 4 d kultivieren und die Fortpflanzungszeit vor der TNF-Induktion einstellen.

Die hTNF-Erzeugung pro Tier kann man ferner steigern, indem man beliebige der nachstehenden Methoden anwendet:

• (1) eine Methode, worin man die vermehrten menschlichen Zellen einem TNF-Auslöser in dem Tier aussetzt, das man als Wirt für die Zellvermehrung verwendet hat, die menschlichen Zellen danach aus einem oder mehreren bestimmten Körperteilen des Tieres oder aus seinem gesamten Körper gewinnt und danach die menschlichen Zellen einen TNF- Auslöser in vitro aussetzt;
• (2) eine Methode, worin man menschliche Zellen wiederholt in vitro und/oder in vivo einem TNF-Auslöser aussetzt; und/oder
• (3) eine Methode, worin man die Diffusionskammer, die man in das Tier eingebettet oder auf dem Tier angebracht hat, wiederholt durch eine frische Kammer ersetzt.

Der TNF-Auslöser, den man verwenden kann, kann einer oder mehrere Auslöser sein, der bzw. die die TNF-Erzeugung in den menschlichen Zellen induzieren, die man durch Vermehrung der menschlichen Zellinie unter Verwendung der nährenden Körperflüssigkeit erhalten hat, welche von dem Tier zugeführt wird: Beispielsweise sind ein üblicher α-Interferonauslöser (IFN-α-Auslöser), wie z. B. Virus, Nucleinsäure und Nucleotid; gamma-Interferonauslöser (IFN-gamma-Auslöser), wie z. B. Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Mitogen aus Kermesgewächs (Phytolacca americana), Lipopolysaccharid, Endotoxin, Polysaccharid oder Bakterien als TNF-Auslöser verwendbar: Im allgemeinen bevorzugt man einen IFN-α-Auslöser, weil man damit TNF eines viel höheren Reinheitsgrades induzieren kann.

Bestimmte Antigene wirken als TNF-Auslöser auf Zellen, die man mit dem jeweiligen Antigen sensibilisiert hat.

Es wurde festgestellt, daß die Kombination von IFN-α-Auslösern und IFN-gamma-Auslösern als TNF-Auslöser vorteilhaft eine bemerkenswerte Steigerung der induzierten TNF-Erzeugung bewirkt.

Ferner wurde festgestellt, daß diese Kombination zu einer gleichzeitigen Erzeugung von HuIFN führt.

Es ist also anzunehmen, daß man durch Verwendung eines derartigen Auslösers sowohl eine gleichzeitige und billige Massenherstellung von zwei oder mehr biologisch aktiven Substanzen ermöglicht, wie z. B. kostbares hTNF und HuIFN, als auch eine viel wirksamere Verwendung der vermehrten menschlichen Zellen ermöglicht.

Das derart erhaltene hTNF kann man leicht durch Reinigungs- und Abtrennungsmethoden unter Verwendung üblicher Maßnahmen sammeln, wie z. B. Einengen, Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren und/oder Lyophilisieren. Wenn eine stärker gereinigte hTNF-Zubereitung erwünscht ist, kann man eine Zubereitung höchst möglicher Reinheit mit den genannten Methoden in Kombination mit anderen üblichen Methoden erhalten, z. B. Adsorption und Desorption an Ionenaustauschern, Gelfiltration, Elektrophorese und/oder Fraktionierung am isoelektrischen Punkt.

Wenn man anstelle der genannten Methoden eine Affinitätschromatographie unter Verwendung entweder eines Antikörpers oder eines Mitogens als einem Liganden anwendet, z. B. Con A-Sepharose von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, kann man eine raschere und leichtere Herstellung von hochreinem hTNF erzielen.

Es wurde festgestellt, daß das derart erhaltene hTNF praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirkt, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse von menschlichen Tumorzellen und ferner der Zellinie von Mäusen, L-929 bewirkt: Demgemäß kann man hTNF vorteilhaft als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Krankheiten verwenden, die auf TNF ansprechen, wie z. B. maligne Tumore, deren Behandlung bisher als sehr schwierig angesehen wurde.

Den hTNF-Gehalt prüfte man mit der TNF-Prüfmethode, die von E. Pick, "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines", Bd. 2, S. 235 bis 272, Academic Press, Inc. (1981) berichtet wurde, wobei man die Zellinie von Mäusen, L-929, in Gegenwart von hTNF für einen bestimmten Zeitraum inkubiert und die überlebenden Zellen zählt.

Den Gehalt an HuIFN prüfte man mit der üblichen Löcherreduktionsmethode, die in Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) beschrieben ist, unter Verwendung von FL-Zellen aus menschlichem Amnion.

Den Hämagglutinierungstiter prüfte man mit der Methode, die in S. E. Salk, Journal of Immonology, Bd. 49, S. 87 (1944) berichtet wurde, mit einer leichten Modifzierung.

Die Erfindung betrifft also ein hTNF enthaltendes therapeutisches Mittel zur Behandlung von malignen Tumoren des Menschen.

Der Tumornekrosefaktor (TNF) bewirkt praktisch keinerlei Zytotoxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen, jedoch eine bemerkenswerte Zytotoxizität gegenüber verschiedenen menschlichen Tumorzellen mit ihrer anschließenden Zytolyse.

Das Verfahren zur Herstellung des hTNF erzeugt gleichzeitig eine beträchtliche Menge an humanspezifischem Interferon (HuIFN) zusätzlich zu den biologisch aktiven Substanzen einschließlich TNF.

Die menschlichen Zellinien, die man bevorzugt, sind menschliche Leukozyten und menschliche lymphoblastartige Zellinien, wie z. B. BALL-1-, TALL-1-, NALL-1-, Namalva-, MOLT-3-, Mono-1-, M-7002-, B-7101-, JBL-, EBV-Sa-, EBV-Wa-, EBV-HO-, BALM 2-, CCRF-CEM-, DND-41- und CCRF-SB-Zellen, sowie menschliche Zellinien, die man durch Transformieren von normalen menschlichen Monozyten oder Granulozyten erhalten kann. Alle diese menschlichen Zellinien kann man vermehren, indem man sie auf ein nicht-menschliches warmblütiges Tier transplantiert oder wahlweise dazu sie in einer üblichen Diffusionskammer sich vermehren läßt, durch die man die nährende Körperflüssigkeit eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres ihnen zuführt.

Im Vergleich zu beliebigen üblichen Methoden zur Herstellung von TNF liefert das oben beschriebene Verfahren eine große Menge an biologisch aktivem hTNF und ermöglicht eine billige Herstellung von hTNF im technischen Maßstab: Dadurch findet die Erfindung vielseitige Anwendung auf den pharmazeutischen Gebiet.

Die nachstehenden Herstellungsversuche erläutern die Erzeugung von hTNF.

Fähigkeit von in vitro oder in vivo vermehrten menschlichen Zellen, TNF zu erzeugen Herstellungsversuch 1: Zellvermehrung in vitro

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1- Zellen, die aus B-Zellen stammten, transplantiert man in ein RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2), das man mit 20 Volumen-% fötalem Kälberserum ergänzt hatte, und kultivierte sie in Suspension bei 37°C. Die vermehrten menschlichen Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2), suspendierte sie danach in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zelldichte von etwa 1×10⁶ Zellen/ml.

Herstellungsversuch 2: Zellvermehrung in vivo

Nachdem man neugeborenen Hamstern Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, zur Verminderung der Immunreaktionen injiziert hatte, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1-, die aus B-Zellen stammte, und fütterte danach die Hamster auf übliche Weise drei Wochen lang. Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, extrahierte man und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Danach wusch man die Zellen mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) und suspendierte sie wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁶ Zellen/ml.

Herstellungsbeispiel 1

Neugeborenen Hamstern injizierte man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, verminderte ihre Immunreaktion soweit wie möglich, transplantierte ihnen danach subkutan eine menschliche Zellinie monozytischen Ursprungs, die man unter Verwendung von SV-40-Virus transformiert hatte, und fütterte die Hamster danach eine Woche lang auf übliche Weise. Danach injizierte man den Tieren intraperitoneal lebende BCG-Zellen in einer Impflösung von 10⁷ Zellen pro Tier, und fütterte die Tiere weitere zwei Wochen lang.

Danach extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit Eagle′s Medium mit den minimalen Konzentrationen aller essentiellen Stoffe (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, welches man mit 5 Volumen-% menschlichem Serum ergänzt hatte, suspendierte man die Zellen in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 5×10⁶ Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellsuspension E. coli-Endotoxin in einer Menge von etwa 10 µg/ml, inkubierte bei 37°C 16 h und induzierte die TNF-Erzeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa 1000×980,7 cm/s² (1000 · g), entfernte den Niederschlag und dialysierte die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 21 h lang. Die erhaltene Lösung filtrierte man danach unter Verwendung eines Membranfilters, lyophilisierte das Filtrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, und erhielt ein pulverartiges Produkt.

Den HuIFN-Bestandteil in dem pulverartigen Produkt entfernte man durch Adsorption und Desorption mit einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwendung der Gelfiltration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters gemäß der Methode, die in G. Bodo, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon", 11-th International Immunological Symposium, 8 and 9 June 1977, Zagrev, Yugoslavia, reinigte das erhaltene HuIFN-freie Produkt durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Con A-Sepharose von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, und erhielt etwa 1×10⁶ Einheiten eines hochreinen TNF, das eine Zytolyse von Meth A-Sarkom bewirken konnte, und das praktisch keinerlei Zytolyse von menschlichen normalen Zellen, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse von menschlichen Tumorzellen bewirkte.

Das so erhaltene hTNF enthielt keinen TNF-Auslöser, und seine spezifische Aktivität betrug etwa 350 000 Einheiten/ mg Protein.

Herstellungsbeispiel 2

Nachdem man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, neugeborenen Hamstern injiziert hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1, und fütterte die Tiere auf übliche Weise drei Wochen lang.

Nach dem Extrahieren und Zerkleinern der erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g zerteilte man die erhaltenen Tumore durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit serumfreien RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, suspendierte man die menschlichen Zellen wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁷ Zellen/ml.

Zu der Zellsuspension gab man Sendaivirus und E. coli- Endotoxin in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 20 µg/ml und inkubierte danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die TNF-Erzeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa 1000×980,7 cm/s² (1000 · g), entfernte den Niederschlag, dialysierte die erhaltene überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH 7,2) 21 h lang und filtrierte danach die erhaltene Lösung unter Verwendung eines Membranfilters. Danach konzentrierte man das Filtrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, lyophilisierte es und erhielt ein pulverartiges Produkt.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 8,3×10⁷ Einheiten pro Hamster. Das Produkt enthielt ferner etwa 4,1×10⁷ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 3

Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intraperitoneal eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, TALL-1, und fütterte die Tiere auf übliche Weise 5 Wochen lang. Danach injizierte man den Tieren intraperitoneal ein durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus in einer Impflösung von etwa 3000 Einheiten Hämagglutinierungstiter pro Tier, tötete die Tiere 24 h nach der Injektion und gewann danach den Aszites.

Den Aszites reinigte man, engte ihn ein und trocknete ihn wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 6,2×10⁶ Einheiten pro nackte Maus. Das Produkt enthielt ferner etwa 4,5×10⁶ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 4

Nachdem man erwachsene Mäuse mit Röntgenstrahlen von etwa 400 rem bestrahlt hatte, um ihre Immunreaktionen zu vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche Zellinie, Mono-1-Zellen, und fütterte die Tiere auf übliche Weise 3 Wochen lang.

Danach extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 10 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie wie in Herstellungsbeispiel 1.

Danach suspendierte man die menschlichen Zellen wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 bis zur gleichen Zelldichte. Zu der Zellsuspension gab man Concanavalin A und Sendaivirus in einer Menge von 0,8 µg/ml bzw. etwa 500 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter zu, inkubierte danach 1 d die erhaltene Mischung bei 37°C und induzierte die TNF-Erzeugung.

Die erhaltene Kultur reinigte man danach, engte sie ein und trocknete sie wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 6,8×10⁷ Einheiten pro Maus. Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 1,3×10⁷ Einheiten von HuIFN.

Herstellungsbeispiel 5

Neugeborenen Hamstern transplantierte man wie in Herstellungsbeispiel 1 eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, Namalva, und fütterte danach die Tiere auf übliche Weise 4 Wochen lang.

Wie in Herstellungsbeispiel 2 extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 20 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie wie im gleichen Beispiel und erhielt eine Zellsuspension mit einer Zelldichte von etwa 3×10⁶ Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellsuspension Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutierungstiter, inkubierte danach bei 36°C 2 d und induzierte die TNF-Erzeugung. Danach reinigte man die Kultur und engte sie ein wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein Konzentrat, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 4,3×10⁷ Einheiten pro Hamster. Das Produkt enthielt ferner etwa 8,2×10⁶ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 6

Nachdem man eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, NALL-1-Zellen, in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert hatte, setzte man die Zellsuspension in eine zylindrische Diffusionskammer aus Kunststoff mit einem inneren Volumen von etwa 10 ml ein, welche mit einem Membranfilter einer nominalen Porengröße von etwa 0,5 µm versehen war, und bettete die Kammer intraperitoneal in eine erwachsene Ratte ein.

Das Tier fütterte man danach auf übliche Weise 4 Wochen lang und entfernte danach die Kammer.

Die Zelldichte in der Kammer, die man erzielte, betrug etwa 5×10⁸ Zellen/ml, was das etwa 10²-fache oder mehr jener war, die man mit einer Gewebekulturmethode in vitro mit einem CO₂-Inkubator unter Verwendung eines Nährmediums erzielte.

Die vermehrten menschlichen Zellen suspendierte man wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herstellungsbeispiel 1 bis zur gleichen Zelldichte, gab zu der erhaltenen Zellsuspension ein durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus und Phytohämagglutinin in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 100 µg/ml, inkubierte danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die TNF-Erzeugung.

Danach reinigte man die Kultur, konzentrierte sie und trocknete sie wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 2,6×10⁷ Einheiten pro Ratte. Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 9,4×10⁶ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 7

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, JBL-Zellen, transplantierte man in die Allantoishöhlen von Eiern mit Embryonen, die man bei 37°C 5 d lang inkubiert hatte, und inkubierte die Eier weiter bei dieser Temperatur eine zusätzliche Woche lang.

Danach suspendierte man die vermehrten menschlichen Zellen in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herstellungsbeispiel 1 bis zu einer Zelldichte von 5×10⁶ Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man danach Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter, inkubierte bei 37°C 1 d lang und induzierte die TNF-Erzeugung. Die Kultur reinigte man danach, konzentriete sie wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein Konzentrat, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 1,5×10⁶ Einheiten pro 10 Eier mit Embryonen und die verfügbaren physikalisch chemischen Eigenschaften stimmten gut mit jenen überein, die von Carswell et al. berichtet wurden. Das Konzentrat enthielt ferner etwa 4,0×10⁵ Einheiten HuIFN pro 10 Eier mit Embryonen.

Das TNF, das man in den beschriebenen Beispielen erhalten hat, ist als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Krankheiten einsetzbar, die auf TNF ansprechen, z. B. als Injektionslösung, Mittel zur internen oder externen Verabreichung, Kollyrium (Augenmittel) oder Collunarium, allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Mitteln.

Der Ausdruck "Krankheit, die auf TNF anspricht" umfaßt in diesem Zusammenhang alle menschlichen Krankheiten, die man unter Verwendung von TNF verhüten und/oder behandeln kann: Beispielsweise maligne Tumoren, wie z. B. Brustkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterkrebs, Blasenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs, Leukämie, Lymphom und Hautkrebs.

Die nachstehenden Untersuchungen und Versuche erläutern die Wirksamkeit, Toxizität, die Anwendungsvorschriften und Dosierung des hTNF als therapeutisches Mittel.

Untersuchung der Wirksamkeit und Toxizität von TNF Untersuchung 1

Nackten BALB/C-Mäusen transplantierte man subkutan in den Rückenbereich kleine Bruchstücke eines menschlichen Brustkrebsgewebes.

Nachdem die erhaltenen massiven Tumoren auf etwa 200 mm³ angewachsen waren, injizierte man gleiche Mengen der TNF- Zubereitung von Herstellungsbeispiel 1 intravenös jeden Tag in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder 1000 Einheiten/kg/d. 15 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Eine TNF-freie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Vergleich.

Tabelle I

Untersuchung 2

Gruppen von je 10 männlichen BDF₁-Mäusen pro Gruppe mit einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man subkutan in den Rückenbereich Gewebestückchen von Lewis′s- Lungenkrebs von 2 mm im Quadrat. Nach einem Zeitraum von 8 d nach der Transplantation injizierte man den Tieren jeden Tag das TNF von Herstellungsbeispiel 1 in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder 1000 Einheiten/ kg/d. 21 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Eine TNF-freie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Vergleich.

Tabelle II

Untersuchung 3

Eine Prüfung der akuten Toxizität der TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 1 unter Verwendung von 20-d-alten Mäusen bestätigte, daß die Toxizität der TNF-Zubereitung außerordentlich gering ist, d. h. einen LD₅₀-Wert von 200 000 Einheiten/kg oder mehr nach intraperitonealer Injektion aufweist.

Obwohl man das hTNF ggf. in ein Medikament auf übliche Weise nach dem Vermischen mit einem üblichen Trägerstoff, Grundstoff und/oder Arzneimittelträger einarbeiten kann, sollte der TNF-Gehalt des Medikamentes mindestens 5 Einheiten/g vom Gesichtspunkt seiner Toxizität, wirksamen Dosis und Stabilität her betragen.

Die Gestalt und Form des Medikamentes gegen malignen Tumor kann man beliebig auswählen, sofern es für den gewünschten Zweck geeignet ist: Beispielsweise kann man es zur oralen Verabreichung zu bestimmten Zubereitungen für Anwendungen durch den Darm formen, z. B. zu Kapseln, Tabletten oder Pulver; für die rektale Verabreichung zu Suppositorien; für die Injektion kann man es beispielsweise zu einer lyophilisierten Injektionslösung verarbeiten, die man vor der Anwendung zu einer Injektionslösung mit destilliertem Wasser löst; ferner kann es die Form von Collunarium, Kollyrium oder Salbe aufweisen.

Die nachstehenden Zubereitungsbeispiele erläutern die Mittel, die hTNF enthalten.

Zubereitungsbeispiel 1: Injektionslösung

Eine TNF-Lösung, die man durch Auflösen von 500 000 Einheiten einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 1 in 200 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt hatte, filtrierte man unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Membranfilters. Gleiche Teile des Filtrates von je 2 ml verteilte man in sterilisierte Glasampullen, lyophilisierte sie und verpackte sie darin und erhielt die Injektionslösung.

Die Injektionslösung ist zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Leukämie vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 2: Salbe

Zu einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 2 mischte man eine minimale Menge an flüssigem Paraffin, mischte der Mischung ferner Vaselin zu und erhielt eine Salbe mit einem TNF-Gehalt von 20 000 Einheiten/g auf übliche Weise.

Die Salbe ist zur Behandlung von Hautkrebs, Brustkrebs und Lymphom vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 3: Kollyrium

Zu einer Mischung aus 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml β-Phenylethylalkohol und 20 000 000 Einheiten einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 5 mischte man eine zusätzliche Menge von destilliertem Wasser mit Natriumchlorid und erhielt 1000 ml einer isotonischen Lösung.

Die Lösung ist als Kollyrium zur Behandlung von Retinoblastom vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 4: Überzogene Darmtablette

Eine überzogene Darmtablette stellte man auf übliche Weise her, indem man eine Mischung tablettierte, die aus Stärke, Maltose und einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 3 bestand, erzielte einen TNF-Gehalt von 200 000 Einheiten/ Tablette (100 mg), überzog die Tablette mit dem Phthalsäureester von Methylcellulose und erhielt eine überzogene Darmtablette.

Die Tablette ist zur Behandlung von Dickdarmkrebs und Leberkrebs vorteilhaft verwendbar.

Claims (2)

1. Therapeutisches Mittel zur Behandlung von malignen Tumoren des Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es menschlichen, interferonfreien, Tumor-Nekrose-Faktor (hTNF) als Wirkkomponente enthält, der zytotoxisch auf die fibroblastartige Zellinie L-929 von Mäusen wirkt und ein Molekulargewicht im Bereich von 1×10⁴ bis 1×10⁵ Dalton hat, wobei das hTNF durch die folgenden Schritte erhältlich ist:

• a) eine menschliche Zellinie, die zur Produktion von hTNF fähig ist, ausgewählt aus der aus den Zellinien BALL-1-, TALL-1-, NALL-1-, Namalva-, MOLT-3-, Mono-1-, M-7002-, JBL-, EBV-Sa-, EBV-Wa-, EBV-HO-, BALM 2-, CCRF-CEM-, DND- 41- und CCRF-SB(=ATCC CCL 120) bestehenden Gruppe und anderen menschlichen Zellinien monozytischen Ursprungs, die unter Verwendung des SV40-Virus transformiert worden sind, in ein warmblütiges Tier zu transplantieren;
• b) das Tier zu füttern, um die Vermehrung der menschlichen Zellinie zu bewirken;
• c) die so erhaltenen vermehrten menschlichen Zellen einem hTNF- Auslöser innerhalb oder außerhalb des warmblütigen Tieres auszusetzen;
• d) das von den menschlichen Zellen produzierte hTNF aufzufangen und
• e) zu reinigen, so daß die spezifische Aktivität des hTNF etwa 350 000 Einheiten/mg Protein beträgt.

2. Verwendung des therapeutischen Mittels nach Anspruch 1 für die Behandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterkrebs, Blasenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs, Leukämie, Lymphom und Hautkrebs.