CN115109164A - 靶向epcam和cd3的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本公开为靶向EPCAM和CD3的双特异性抗体，提供了靶向人EpCam和CD3蛋白质的双特异性抗体。这些抗体在抗EpCam Fab片段和完全IgG抗CD3抗体之间具有不同长度的接头，其具有不同的T细胞结合亲和力，适用于不同的治疗情况。

Description

靶向EPCAM和CD3的双特异性抗体

技术领域

本发明属于细胞免疫学领域，涉及靶向人EpCam和CD3蛋白质的双特异性抗体及其用途。

背景技术

上皮细胞粘附分子（EpCAM）也称为CD326、EGP-2、17-1A、HEA125、MK-1、GA733-2、EGP34、KSA、TROP-1、ESA、TACSTD1和KS1/4，是一种I型跨膜糖蛋白，介导钙非依赖性同型上皮细胞-细胞粘附。EpCAM还参与细胞信号传导、迁移、增殖和分化。

EpCAM是最早发现的肿瘤相关抗原之一。EpCAM抗原的独特之处在于它不是任何主要粘附分子（如钙粘蛋白、选择素或整合素）家族的成员。它是一种由314个氨基酸组成的I型膜蛋白，其中只有26个面向细胞质。EpCAM被假定为是一种同嗜性细胞粘附分子，干扰钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触。EpCAM上调c-myc、细胞周期蛋白A和E，促进细胞周期并增强细胞增殖。

EpCAM在不同来源的人类癌中大量且均匀地表达。***癌和宫颈上皮内瘤变的免疫组织化学研究表明，EpCAM表达可随着疾病的进展和增殖而增加。这种明显的过度表达也见于浸润性乳腺癌和卵巢癌患者，并且是无病生存率和总体生存率低的强预测因子。在患有胆囊癌的患者中可以观察到EpCAM过度表达与疾病进展之间的相似的相关性。此外，EpCAM在从结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和***癌中分离出来的癌起始细胞或癌干细胞中过度表达。这些数据支持EpCAM作为治疗最常见的人类癌症的免疫治疗靶点的潜在效用。

许多EpCAM的抗体已用于免疫治疗，但值得注意的是，其中一些由于各种原因在临床试验中失败。

发明内容

在各种实施方式中，本公开提供了靶向人EpCam和CD3蛋白质的双特异性抗体。这些抗体在抗EpCam Fab片段和完全（full）IgG抗CD3抗体之间具有不同长度的接头，其具有不同的T细胞结合亲和力，适用于不同的治疗情况。

在一些实施方式中，双特异性抗体采用如图1所示的形式。抗EpCam部分可以包括两个Fab片段（VH/VL对），而抗CD3部分可以是完全Fab IgG抗体（full Fab IgG antibody）。在一些实施方式中，Fab片段的VH/VL匹配（VH与VH，VL与VL）完全抗CD3抗体的VH/VL。在一些实施方式中，Fab片段的VH/VL反向匹配（VH与VL，VL与VH）完全抗CD3抗体的VH/VL。

示例性Fab片段可取自Oportuzumab。示例性抗CD3抗体为SP34。其对应的VH/VL和CDR序列如表2所示。

在一些实施方式中，所述部分通过一个或多个肽接头连接。所述肽接头可以具有例如2至100、例如3至90、4至70或5至50个氨基酸残基的长度，但不限于此。在一些实施方式中，所述长度为5至15个残基（例如，GSGGGGS，SEQ ID NO: 15）。在一些实施方式中，所述长度为16至20个残基（例如，GS(GGGGS)₃，SEQ ID NO: 17）。在一些实施方式中，所述长度为21至35个残基（例如，GS(GGGGS)₆，SEQ ID NO: 16）。

本公开还提供了用所公开的抗体治疗疾病（例如癌症）的方法。

附图说明

图1说明了测试的双特异性抗体的形式。

图2A-C显示了测试的抗体与肿瘤细胞（A和B）或T细胞（C）上表达的人EpCam蛋白的结合。

图3显示了对LS174T细胞进行T细胞杀伤试验的结果。

图4显示了BJ192-5A/BJ196-6A对hCD3敲入小鼠的体内肿瘤抑制效果。

具体实施方式

定义

需要注意的是，术语“一种”实体是指所述实体中的一个或多个；例如，“一种抗体”被理解为代表一个或多个抗体。因此，术语“一”（或“一个”）、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。

如本文所用，术语“多肽”旨在包含单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键（也称为肽键）线性连接的单体（氨基酸）组成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指产品的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或多个氨基酸链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以用来代替、或与这些术语中的任何一个互换。术语“多肽”还意指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以来自天然生物来源或通过重组技术生产，但不一定是从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。

本文中关于细胞、核酸（例如DNA或RNA）使用的术语“分离的”指分别与大分子天然来源中存在的其他DNA或RNA分离的分子。本文使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”指的是不以片段形式天然出现且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。

如本文所用，涉及多肽或多核苷酸的术语“重组”意指不天然存在的多肽或多核苷酸形式，其非限制性示例可通过组合通常不会同时出现的多核苷酸或多肽来创建。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，为了进行比较的目的，这些位置可能会被对齐。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是序列共享的匹配或同源位置数量的函数。“不相关的”或“非同源”序列与本公开的其中一个序列具有小于40%的同一性，但优选地小于25%的同一性。

多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%）的“序列同一性”，这意味着，当对齐时，在比较两个序列时，碱基（或氨基酸）的百分比相同。这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如Ausubel et al. eds. (2007) CurrentProtocols in Molecular Biology中所描述的那些。优选地，默认参数用于对齐。一种对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别是，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传代码=标准；过滤器=无；股=两者；截止值=60；期望值=10；矩阵=62；描述=50个序列；排序方式=高分；数据库=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank-CDS-translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物等效多核苷酸是指具有上述指定百分比同源性并编码具有相同或相似生物活性的多肽的多核苷酸。

术语“等效核酸或多核苷酸”是指具有与所述核酸或其补体的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物旨在包括与其补体具有一定程度的同源性核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其补体杂交。同样，“等效多肽”指与参考多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的多肽。在一些方面，序列同一性为至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在一些方面，与参考多肽或多核苷酸相比，等效多肽或多核苷酸具有一个、两个、三个、四个或五个添加、缺失、取代及其组合。在一些方面，等效序列保留参考序列的活性（例如表位结合）或结构（例如盐桥）。

杂交反应可以在不同的“严格”条件下进行。一般来说，低严格杂交反应在约40°C下，在约10 x SSC或具有同等离子强度/温度的溶液中进行。中严格杂交通常在约50°C下在约6 x SSC中进行，而高严格杂交反应通常在约60°C下在约1 x SSC中进行。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性示例是细胞中通常存在的温度、离子强度、pH值和Mg²⁺浓度。

多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤（A）；胞嘧啶（C）；鸟嘌呤（G）；胸腺嘧啶；当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶（U）代表胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的按字母顺序排列的表示。这种按字母顺序排列的表示可以输入具有中央处理单元的计算机中的数据库，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”指的是一种以上的基因形式或其部分共存。基因的一部分中至少有两种不同形式，即两种不同的核苷酸序列，被称为“基因多态区”。多态区可以是单个核苷酸，其身份在不同的等位基因中不同。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段（例如探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在多核苷酸组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可被非核苷酸成分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步被修饰，例如通过与标记组分共轭。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本公开的任何多核苷酸实施方式均包含双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

用于多核苷酸的术语“编码”是指多核苷酸，如果在其天然状态下或当由本领域技术人员熟知的方法操作时，其可被转录和/或翻译以产生所述多肽和/或其片段的mRNA，则被称为“编码”多肽。反义链是这种核酸的补体，编码序列可以从中推导出来。

如本文所用，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别并结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是整个抗体和任何抗原结合片段或其单链。因此，术语“抗体”包括任何含有蛋白质或肽的分子，其包含具有与抗原结合的生物活性的免疫球蛋白分子的至少一部分。此类示例包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区（CDR）、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架（FR）区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。

术语“抗体片段”或“抗原结合片段”，如本文所用，是抗体的一部分，例如F(ab’)₂、F(ab)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv等。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体所识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像体和双体。术语“抗体片段”还包括通过结合特定抗原形成复合物而起到抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。

“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白重链（VH）和轻链（VL）可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10至约25个氨基酸的短接头连接。所述接头可以富含甘氨酸以提高灵活性，也可以富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可以连接VH的N-末端和VL的C-末端，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，该蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。本领域已知并描述了scFv分子（例如在US 5,892,019中）。

术语抗体包括各种可以在生物化学上区分的广泛类别的多肽。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ、ε，其中包括一些子类（例如，γ1-γ4）。正是这条链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等都有很好的特征，并且已知具有功能专一性。鉴于本公开，本领域技术人员容易识别出这些类别和同种型中的每一个的修饰版本，并且因此在本公开的范围内。所有免疫球蛋白类别显然都在本公开的范围内，以下讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两条相同的分子量约为23000道尔顿的轻链多肽和两条相同的分子量为53000-70000道尔顿的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”形结构连接，其中轻链从“Y”口开始包围重链，并继续通过可变区域。

“特异性结合”或“具有特异性”通常意味着抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且这种结合需要抗原结合结构域与表位之间的一些互补性。根据这一定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合时，它比随机的、不相关的表位更容易“特异性结合”到所述表位。本文使用术语“特异性”来限定特定抗体与特定表位结合的相对亲和力。例如，抗体“A”可被认为比抗体“B”对给定表位具有更高的特异性，或者抗体“A”可能被认为与表位“C”结合的特异性比相关表位“D”更高。

如本文所用，术语“治疗”或“疗法”是指医疗性治疗和预防或预防性措施，其中目的是预防或减缓（减轻）不期望的生理变化或紊乱，例如癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定（即不恶化）、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或减轻，以及缓解（部分或全部），无论可检测或不可检测。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有该疾病或紊乱的人，以及容易患有该疾病或紊乱的人，或者需要预防该疾病或紊乱的人。

“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何对象，尤其是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人类、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。

如本文所用，诸如“对需要治疗的患者”或“需要治疗的对象”之类的短语包括将受益于施用了用于检测、诊断程序和/或治疗的本公开的抗体或组合物的对象，例如哺乳动物对象。

双特异性抗EpCam抗CD3抗体

EpCAM是一种跨膜糖蛋白，介导上皮细胞中Ca²⁺非依赖性同型细胞-细胞粘附。EpCAM还参与细胞信号传导、迁移、增殖和分化。此外，EpCAM通过其上调c-myc、e-fabp和细胞周期蛋白A和E的能力具有致癌潜力。由于EpCAM仅在上皮细胞和上皮源性肿瘤中表达，因此EpCAM可被用作各种癌症的诊断标志物和治疗靶点。

具有对肿瘤抗原的特异性和对免疫细胞的第二特异性的双特异性抗体可诱导免疫细胞介导的细胞毒性以靶向肿瘤细胞。免疫细胞上可被靶向的蛋白质包括但不限于CD3、CD47、PD1、PD-L1、4-1BB、OX40、SIRPA、CD16、CD28、CTLA4和CD27。在一些实施方式中，免疫细胞表面蛋白为CD3。

在随附的实验性的实施例中测试了两个示例性抗EpCam/抗CD3抗体。它们都采用了如图1所示的2+2形式。抗EpCam部分可以包括两个Fab片段（VH/VL对），而抗CD3部分可以是完全Fab IgG抗体。在一些实施方式中，Fab片段的VH/VL匹配（VH与VH，VL与VL）完全抗CD3抗体的VH/VL（如图1所示）。在一些实施方式中，Fab片段的VH/VL反向匹配（VH与VL，VL与VH）完全抗CD3抗体的VH/VL（未显示）。

示例性Fab片段可取自Oportuzumab。示例性抗CD3抗体为SP34及其衍生物。其对应的VH/VL和CDR序列如表2所示。Oportuzumab具有SEQ ID NO: 1的VH和SEQ ID NO: 2的VL。其CDR为SEQ ID NO: 3的VH CDR1、SEQ ID NO: 4的VH CDR2、SEQ ID NO: 5的VH CDR3、SEQID NO: 6的VL CDR1、SEQ ID NO: 7的VL CDR2和SEQ ID NO: 8的VL CDR3。

SP34具有SEQ ID NO: 9的VH CDR1、SEQ ID NO: 10的VH CDR2、SEQ ID NO: 11的VH CDR3、SEQ ID NO: 12的VL CDR1、SEQ ID NO: 13的VL CDR2和SEQ ID NO: 14的VLCDR3。SP34的衍生物具有与SP34相同的CDR，但包括与SP34至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的框架区域。

在一些实施方式中，抗EpCam和抗CD3部分通过一个或多个肽接头连接。肽接头的长度可以是，例如，2至100。在一些实施方式中，每个肽接头的长度可以是至少2个氨基酸，或至少3、4、5、7、8、9、10、12、15、17、20、22或25个氨基酸。在一些实施方式中，所述长度不超过15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个氨基酸。在一些实施方式中，所述长度为3至90、4至70或5至50个氨基酸残基，但不限于此。

示例性接头包括多个甘氨酸（G）和丝氨酸（S）。在一些实施方式中，接头包括至少50%、60%、70%或80%甘氨酸。已在实施例1中观察到，较短的接头导致更适度的T细胞结合活性。例如，BJ192-5A/BJ196-6A包含接头1（GS(GGGGS)，SEQ ID NO:15），并且与包含连接子2（GS(GGGGS)₆, SEQ ID NO:16）的BJ194-5A/BJ198-6A相比，T细胞结合活性较弱。

如实施例2-3所示，更强的T细胞结合可能与更高的T细胞介导的细胞毒性相关，这可能导致患者的毒性反应。另一方面，某些肿瘤可能需要更高的T细胞介导的细胞毒性。在这种情况下，本公开提供了通过采用不同长度的肽接头来调整抗EpCam/抗CD3双特异性抗体的细胞毒性的方法。

在一些实施方式中，所述肽接头的长度为5至15个残基、5至14个残基、5至13个残基、5至12个残基、5至10个残基、6至15个残基、6至14个残基、6至13个残基、6至12个残基、7至12个残基、7至11个残基或7至10个残基（例如，GSGGGGS，SEQ ID NO: 15）。在一些实施方式中，所述长度为16至20个残基（例如，GS(GGGGS)₃，SEQ ID NO: 17）。在一些实施方式中，所述长度为21至35个残基（例如，GS(GGGGS)₆，SEQ ID NO: 16）。

在一些实施方式中，所述双特异性抗体进一步包括恒定结构域，例如CH1和CL，以及CH2和/或CH3。在一些实施方式中，所述恒定区来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列。在一些实施方式中，所述恒定区来自IgG1。在一些实施方式中，所述抗体或片段具有抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性。在一些实施方式中，所述抗体或片段不具有ADCC活性。

在一些实施方式中，与野生型IgG（例如IgG1）抗体相比，双特异性抗体的Fc片段具有降低的效应功能。可以通过在参与Fc受体结合的位置向Fc片段引入突变来实现效应功能的降低。示例性位置包括P329、L234和L235（Eu编号）。示例性突变包括但不限于P329G、P329A、L234A、L234G、L235A和L235G。在特定的示例中，IgG1 Fc为“PGLALA”（P329G+L234A+L235A，均根据EU编号）。

本领域的普通技术人员还将理解，本文所公开的抗体可以被修饰，以使其在氨基酸序列上与从其衍生的天然存在的结合多肽不同。例如，从指定蛋白质衍生的多肽或氨基酸序列可能是相似的，例如，与起始序列具有一定的百分比同一性，例如，它可能与起始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。

在一些实施方式中，所述取代是保守取代。“保守氨基酸取代”是指用具有类似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸），非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β支链侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，氨基酸串可被结构相似的串取代，其在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。

下表提供了保守氨基酸取代的非限制性示例，其中0或更高的相似性得分表示两种氨基酸之间的保守取代。

表A. 氨基酸相似性矩阵

表B. 保守氨基酸取代

氨基酸	取代为
		丙氨酸	D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys
精氨酸	D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn
		天冬酰胺	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gln, D-Gln
天冬氨酸	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
		半胱氨酸	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser
谷氨酰胺	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
		谷氨酸	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
甘氨酸	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala
		异亮氨酸	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
亮氨酸	Val, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile
		赖氨酸	D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn
蛋氨酸	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
		苯丙氨酸	D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp
脯氨酸	D-Pro
		丝氨酸	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys
苏氨酸	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val
		酪氨酸	D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp
缬氨酸	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

在某些实施方式中，抗体包含通常不与抗体结合的氨基酸序列或一个或多个部分。下面更详细地描述示例性修饰。例如，本公开的抗体可包含灵活的接头序列，或可被修饰以添加功能部分（例如，PEG、药物、毒素或标记）。

本公开的抗体、其变体或衍生物（包括经修饰的衍生物），即通过将任何类型的分子共价连接到抗体，从而使共价连接不会阻止抗体结合到表位。例如，但不限于，抗体可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质的连接等。可以通过已知的技术来进行许多化学修饰中的任何一种，包括但不限于特定化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可能包含一个或多个非经典氨基酸。

在一些实施方式中，抗体可与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG结合。

抗体可与治疗剂结合或融合，治疗剂可包括可检测标记，例如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂（可能是药物或毒素）、超声增强剂、非放射性标记、其与本领域已知的其他此类试剂的组合。

抗体可以通过将其与化学发光化合物偶联而被可检测地标记。然后通过检测化学反应过程中出现的发光来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的示例包括鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

抗体也可以用荧光发射金属（如¹⁵²Eu）或其他镧系元素标记。可以使用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）或乙二胺四乙酸（EDTA）等金属螯合基团将这些金属连接到抗体上。将不同部分结合到抗体上的技术是众所周知的，例如，参见Arnon et al., “MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R.Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, inControlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker,Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological AndClinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis,Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 以及Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates”, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))。

编码抗体的多核苷酸和制备抗体的方法

本公开还提供了编码本公开的抗体、其变体或衍生物的分离多核苷酸或核酸分子。本公开的多核苷酸可以在同一个多核苷酸分子或分离的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的整个重链和轻链可变区。此外，本公开的多核苷酸可以在同一个多核苷酸分子或分离的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的重链和轻链可变区的部分。

制备抗体的方法是本领域所熟知的，并在本文进行了描述。在某些实施方式中，本公开的抗原结合多肽的可变区和恒定区均为全人源的。可使用本领域所述和本文所述的技术制备全人源抗体。例如，针对特定抗原的全人源抗体可通过向转基因动物施用抗原来制备，该转基因动物已被修饰以产生此类抗体以响应抗原攻击，但其内源性位点已被无效。可用于制造此类抗体的示范性技术如U.S. 专利6,150,584; 6,458,592; 6,420,140中所述，其通过引用整体并入本文。

在某些实施方式中，制备的抗体不会在待治疗的动物（例如在人）中引发有害的免疫反应。在一种实施方式中，使用本领域公认的技术对本公开的抗原结合多肽、其变体或衍生物进行修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以是人源化的、灵长类化的、去免疫化的、或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性，但在人类中免疫原性较低。这可以通过多种方法实现，包括（a）将整个非人源可变结构域移植到人恒定区以产生嵌合抗体；（b）将一个或多个非人源互补决定区（CDR）的至少一部分移植到人源框架和恒定区中，并保留或不保留关键框架残基；或者（c）移植整个非人源可变结构域，但通过替换表面残基，用类似人源的部分“遮盖”它们。此类方法如Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855(1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991);Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994),及U.S. Pat. Nos.: 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762和 6,190,370中所述，其通过引用整体并入本文。

去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位（例如，参见国际申请公开号：WO/9852976 A1和WO/0034317 A2）。例如，分析来自起始抗体的可变重链和可变轻链序列，并创建每个V区的人源T细胞表位“图谱”，显示与互补决定区（CDR）和序列内其他关键残基相关的表位位置。分析T细胞表位图中的单个T细胞表位，以识别具有改变最终抗体活性的低风险的可选地氨基酸取代。设计了一系列可选地可变重序列和可变轻序列，包括氨基酸取代的组合，并且这些序列随后被并入一系列结合多肽中。通常，产生12到24种变异抗体，并测试其结合和/或功能。然后将包含修饰可变区和人源恒定区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并且将随后的质粒导入细胞系以产生完整抗体。然后在适当的生化和生物试验中比较抗体，并确定最佳变体。

本公开的抗原结合多肽的结合特异性可通过体外试验来确定，例如免疫沉淀、放射免疫试验（RIA）或酶联免疫吸附试验（ELISA）等。

癌症治疗

如本文所述，本公开的抗体、变体或衍生物可用于某些治疗和诊断方法。

本公开进一步涉及基于抗体的疗法，其涉及将本公开的抗体施用于患者（例如动物、哺乳动物和人类），以治疗本文所述的一种或多种疾病或病症。本公开的治疗性化合物包括但不限于本公开的抗体（包括如本文所述的其变体和衍生物）和编码本公开抗体的核酸或多核苷酸（包括如本文所述的其变体和衍生物）。

本公开的抗体也可用于治疗或抑制癌症。在一些实施方式中，EpCam在肿瘤细胞中过度表达。因此，在一些实施方式中，提供了用于在有需要的患者中治疗癌症的方法。在一种实施方式中，该方法需要向患者施用有效量的本公开的抗体。在一些实施方式中，患者的至少一种癌细胞（例如基质细胞）表达、过度表达或被诱导表达肿瘤抗原。例如，可以通过施用肿瘤疫苗或放射疗法来实现基因表达的诱导。

可适当治疗的肿瘤包括膀胱癌、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、尿道癌、结直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、默克尔细胞癌、胃肠道癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肾癌和小细胞肺癌。因此，目前的抗体可用于治疗任何一种或多种此类癌症。

可通过本公开的抗体或变体或其衍生物治疗、预防、诊断和/或预测的与细胞存活增加相关的其他疾病或病症包括但不限于恶性肿瘤和相关疾病的进展和/或转移，如白血病（包括急性白血病（例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病（包括成髓细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红细胞白血病））和慢性白血病（例如，慢性髓细胞（粒细胞）白血病和慢性淋巴细胞白血病）、真性红细胞增多症、淋巴瘤（例如，霍奇金病和非霍奇金病）、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、***癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、血管瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括使用的特定抗体、其变体或衍生物、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、以及给药时间、***率、药物组合和治疗的特定疾病的严重程度。医务人员对此类因素的判断属于本领域的普通技术。剂量还取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度和预期的效果。用量可通过本领域所熟知的药理学和药代动力学原理确定。

抗体、变体或衍生物的施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。抗原结合多肽或组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输液或快速浓注，通过上皮或粘膜皮肤内层（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，并且可与其他生物活性剂一起施用。因此，含有本公开抗原结合多肽的药物组合物可口服、经直肠、肠胃外、池内（intracistemally）、***内、腹膜内、局部（如通过粉末、软膏、滴剂或透皮贴剂）、经颊或作为口腔或鼻腔喷雾剂施用。

如本文所用，术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。

施用可以是***性的或局部性的。此外，可能需要通过任何合适的途径将本公开的抗体引入中枢神经***，包括心室内和鞘内注射；可以通过心室内导管促进心室内注射，例如连接到储液器，如Ommaya储液器。也可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或雾化器，以及使用气溶胶制剂。

可能需要将本公开的抗体多肽或组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以通过，例如但不限于，在手术期间局部输注、局部施用，例如，与手术后的伤口敷料结合，通过注射、通过导管、通过栓剂、或通过植入物的方式，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝胶材料（包括膜，例如唾液酸膜、或纤维）。优选地，当施用本公开的蛋白质（包括抗体）时，必须注意使用蛋白质不吸收的材料。

组合物

本公开还提供了药物组合物。此类组合物包括有效量的抗体和可接受的载体。

在特定的实施方式中，术语“药学上可接的受”是指经联邦或州政府监管机构批准或在美国药典或其他公认的用于动物，尤其是用于人类的药典中列出。此外，“药学上可接受的载体”通常是无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的辅助制剂。

术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物经静脉施用时，水是优选的载体。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；此外，还设想了用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。该组合物可用传统粘合剂和载体（如甘油三酯）制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的示例如E.W.Martin在Remington’s PharmaceuticalSciences中所述，其通过引用并入本文。此类组合物将包含治疗有效量的抗原结合多肽（优选纯化形式）以及适量的载体，以便为患者提供适合施用的形式。制剂应适合施用模式。亲代制剂可以装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。

在一个实施方式中，根据常规程序将该组合物配制成适合对人类静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是无菌等渗水缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包括溶解剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，这些成分以单位剂型单独提供或混合在一起，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物装在如安瓿或小袋的密封容器中，指示活性剂的数量。当通过输液施用该组合物，其可与含有无菌药物级水或生理盐水的输液瓶一起配药。当通过注射施用该组合物，可以提供一安瓿无菌注射用水或生理盐水，从而可以在施用前混合。

本发明的化合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

实施例

实施例1. 抗EpCam/抗CD3双特异性抗体的制备及亲和力测试

制备对EpCam和CD3均具有特异性的双特异性抗体，以采用图1所示的2+2形式。来自常规的完全IgG抗EpCam抗体的两个Fab片段通过肽接头融合到常规的完全IgG1抗CD3抗体的N末端。这里使用的抗EpCam抗体是oportuzumab。所述抗CD3抗体来自SP34，具有带有P329G突变+L234A/L235A（“PGLALA”，均根据EU编号）的IgG1 Fc片段。其VH/VL或CDR序列如表2所示。

制备了两种双特异性抗体，一种（BJ192-5A/BJ196-6A）带有GSGGGGS（SEQ ID NO:15；接头1）接头，另一种（BJ194-5A/BJ198-6A）带有GS(GGGGS)₆ (SEQ ID NO:16；接头2）接头。双特异性构型和每个链的结构如表1所示。

表1. 双特异性抗体及相关链的结构

抗体	重链	轻链
			BJ192-5A/BJ196-6A	BJ192-5A	BJ196-6A
BJ194-5A/BJ198-6A	BJ194-5A	BJ198-6A

链	结构
		BJ192-5A	抗Epcam oportuzumab VH接头1-抗CD3-Fc (PGLALA)
BJ194-5A	抗Epcam oportuzumab VH接头2-抗CD3-Fc (PGLALA)
		BJ196-6A	抗Epcam oportuzumab VL接头1-抗CD3-VL-CL
BJ198-6A	抗Epcam oportuzumab VL接头2-抗CD3-VL-CL

表2. 序列

合成编码这些双特异性抗体的cDNA序列，并用于制备抗体。

检测这些双特异性抗体对表达EpCam的肿瘤细胞（LS-174T和A549细胞）或T细胞的亲和力。结果如图2A-C所示。两种双特异性抗体都表现出对肿瘤细胞的强结合亲和力，并且它们之间的亲和力相似（图2A-B）。

然而，具有较长接头的BJ194-5A/BJ198-6A保留了抗CD3抗体的T细胞结合亲和力，而BJ192-5A/BJ196-6A的T细胞结合活性不太明显（图2C）。因此，这一结果表明，接头长度可以帮助调整抗CD3部分的结合亲和力。

实施例2. 双特异性抗体的T细胞活化

本实施例测试了双特异性抗体在表达EpCam的LS174T细胞存在时活化T细胞的能力。测试浓度包括60 nM作为初始浓度，连续稀释以产生11种不同浓度。

图3显示了所述双特异性抗体的T细胞活化结果。与T细胞结合结果一致，BJ192-5A/BJ196-6A（具有较短的接头）表现出比BJ194-5A/BJ198-6A更适度的T细胞活化（左图）。

实施例3. 体内肿瘤抑制测试

本实施例使用人CD3（hCD3）敲入小鼠模型来测试BJ192-5A/BJ196-6A的功效。

体重变化曲线（图4，左图）证实所述抗体是安全的。BJ192-5A/BJ196-6A在150 µg/kg和480 µg/kg时均有效抑制肿瘤的生长（图4，左图），更高的剂量获得更高的抗肿瘤效果。

本公开的范围不受所述具体实施例的限制，所述具体实施例旨在作为本公开各个方面的单一说明，且功能等效的任何组合物或方法均包含在本公开的范围内。对于本领域技术人员而言，显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在涵盖本公开的修改和变化，只要它们在所附权利要求书及其等效物的范围内。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度与每个被具体和单独指示为通过引用并入的出版物或专利申请相同。

序列表

<110> 博际生物医药科技（杭州）有限公司

<120> 靶向EPCAM和CD3的双特异性抗体

<130> 193821-22D-CNP

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VH

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VL

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VH CDR1

<400> 3

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VH CDR2

<400> 4

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VH CDR3

<400> 5

Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VL CDR1

<400> 6

Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VL CDR2

<400> 7

Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Oportuzumab VL CDR3

<400> 8

Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro Arg Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 VH CDR1

<400> 9

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 VH CDR2

<400> 10

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 VH CDR3

<400> 11

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 VL CDR1

<400> 12

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 VL CDR2

<400> 13

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 VL CDR3

<400> 14

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头 1

<400> 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 16

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头 2

<400> 16

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头 3

<400> 17

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser

Claims (14)

1.一种双特异性抗体，其包括通过四个肽接头融合到完全Fab抗CD3抗体的N端的抗EpCam抗体的两个Fab片段，其中

所述两个Fab片段中的每一个包括：重链可变区（VH），其包括包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的VH CDR3；以及轻链可变区（VL），其包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的VL CDR2和包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的VLCDR3；

所述完全Fab抗CD3抗体包括：VH，其包括包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的VL CDR2和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的VL CDR3；以及

所述肽接头每个都具有5至50个氨基酸残基的长度。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中每个Fab片段的每个VH都融合至所述完全Fab抗CD3抗体的VH，并且每个Fab片段的每个VL都融合至所述完全Fab抗CD3抗体的VL。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述完全Fab抗CD3抗体包含IgG1 Fc片段。

4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述IgG1 Fc片段与野生型人IgG1 Fc相比具有降低的效应活性。

5.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述IgG1 Fc片段包含选自均根据EU编号的P329G、L234A和L235A的一个或多个突变。

6.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述IgG1 Fc片段包含均根据EU编号的突变P329G、L234A和L235A。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肽接头每个都具有5至15个氨基酸残基的长度。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中所述肽接头每个都由SEQ ID NO: 15（GSGGGGS）的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肽接头每个都具有16至20个氨基酸残基的长度。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述肽接头每个都由SEQ ID NO: 17（GS(GGGGS)₃）的氨基酸序列组成。

11.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肽接头每个都具有21至35个氨基酸残基的长度。

12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述肽接头每个都由SEQ ID NO: 16（GS(GGGGS)₆）的氨基酸序列组成。

13.一种或多种编码权利要求1-12中任一项所述双特异性抗体的多核苷酸。

14.一种包含权利要求13所述的一种或多种多核苷酸的细胞。

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