JP5619602B2 - クラミジア・トラコマチスを検出するためのプライマー及びプローブ配列 - Google Patents
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Description
本願は、2007年4月13日提出の米国仮出願第60/911,684号(本明細書中にその全体を参照により組み込む。)に対する優先権を主張する。
本発明は、スウェーデンで被験者において最近観察された欠損変異体を含む、クラミジア・トラコマチスプラスミド(chlamydia trachomatis)の検出のための組成物及び方法に関する。
クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis又はCT)は、性病性リンパ肉芽腫、男性及び女性泌尿生殖器系の様々な炎症性疾患及び5億人が罹患し失明を導くことがある慢性疾患であるトラコーマを含む、一般的な性感染病の原因菌である。早期に診断し、適切な治療を行わないと、CTにより誘発される尿道炎及び子宮頸管炎から、例えば不妊症や子宮外妊娠を引き起こすことがある、膣炎、卵管炎及び骨盤炎などの、慢性炎症が起こり得る。さらに、感染した母親から生まれた新生児は、分娩中に肺及び/又は眼の感染に罹患し得る。
クラミジアエは、リポ多糖及びいくつかの膜タンパク質を含有する三層の外膜を含むグラム陰性細菌と形態学的及び構造学的類似性を示す原核生物である。クラミジアエは、その形態及びユニークな発育環がその他の細菌とは異なる。偏性細胞内寄生体、クラミジアエは、代謝的に不活性であるが感染性のある細胞外段階とおよび複製するが非感染性の細胞内段階とからなるユニークな二相の生活環を有する。生活環の複製段階は、感染した宿主細胞の細胞質から細菌を隔離する膜結合封入体内で起こる。
迅速かつ特異的な診断テストが、CTに対してうまく介入するのに非常に重要である。病原性細菌の選択的増殖に基づく診断が標準的であるが、細胞増殖には時間がかかる。多くの臨床分離株は、インビトロで増殖させるのが困難である。細菌感染は宿主において抗体産生を引き起こすので、生殖管感染に罹患している患者からの血清がまたCT感染を診断するために使用されてきた。しかし、血清学的マーカーに基づくアッセイは非定量的であり、解釈が困難であることが多い。例えば、抗体タイターは急性感染では検出不可能(偽陰性の結果)であり、過去に感染歴のある非感染者で持続し(偽陽性の結果)、交差反応種が存在するために偽陽性(例えば、異なるクラミジア種による呼吸器感染)となり得又は他の因子に依存して全く発現し得ない場合がある(偽陰性の結果)(Blackら、1991;Ngeow、1996)。これらの理由のために、血清学のみというのはCT感染の診断には不適切である。
PCRに基づくCT検出方法により、殆ど全てのCT株で見出される潜在プラスミドの長所が分かってきた。このプラスミドは、細菌あたり、およそ4−10コピーのプラスミドがあるため、CT感染のポリヌクレオチドに基づく診断のための標的として好ましい(Jalalら、2006;Palmer及びFalkow、1986;Pickettら、2005;Tamら、1992)。
第一の態様において、本発明は、CT及びCTSWを増幅及び/又は検出するのに有用なポリヌクレオチド試薬の組み合わせに関し、このポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、第一及び第二のポリヌクレオチドを含み、第一のポリヌクレオチドは、配列番号1、5−9、11−13又は14及びこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも70%、80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列から必ずなり、第二のポリヌクレオチドは、配列番号2、10、15、16及び26及びこれらの相補体のポリヌクレオチドと少なくとも70%、80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列から必ずなる。このポリヌクレオチド試薬の組み合わせは、配列番号3、17−25、27、42及び[配列番号44のn個(10≦n≦140)の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド]並びにこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70%、80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列からなる第三のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
第一のポリヌクレオチドが配列番号1又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号16又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号23又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号1又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号2又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号22又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号8もしくは9又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号10もしくは26又はこれらの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号17又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号5もしくは6又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号10又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号19又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号14又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号2又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号22又はこれの相補体の核酸配列から構成されない。
本発明は、ある種のアッセイ条件下で、CTSW株を検出することならびに他のCT株からCTSWを区別することの両方の問題を解決する。慎重に設計され厳格に試験されたプローブ及びプライマーを提供することにより、感染がCTによるものかCTSWによるものかのCT感染の診断は、今や単純であり確実である。
「特異的にハイブリッド形成する」とは、核酸が検出可能に及び特異的に、第二の核酸に結合する能力を指す。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸による検出可能な結合の相当量を最小限に抑えるハイブリッド形成及び洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリッド形成する。
%核酸配列同一性=W/Z・100(式中、Wは、配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのC及びDのアラインメントにより完全な一致としてスコア化されるヌクレオチド数であり、ZはDにおけるヌクレオチド総数である。)。
CT及びCTSWヌクレオチド配列の増幅及び検出
試料中のCT又はCTSWを増幅及び検出するために、プライマー/プローブセットとして、配列番号1−3及び5−25のポリヌクレオチドを使用することができる。標的配列を増幅するために、何らかの特定のプライマー/プローブセット(セットは表2で例示する。)中のプライマーを使用することができる。殆どの場合、このプローブは、プライマーの1つにより生成された標的配列のコピーとハイブリッド形成し、一般に、一連の増幅反応中に生成された標的配列の何れかのコピーの検出を促進する。適切なプライマー及びプローブが組み合わせられる場合、CT又はCTSWの何れか又はCT及びCTSWの両方を特異的かつ高感度で検出するための核酸増幅手順に従い、全てのプライマー/プローブセットを使用することができる。その他のプライマー及び/又はプローブと組み合わせて、プライマー/プローブセットの個々のプライマー及びプローブを使用することもできる。
「プローブ」として表2で列挙した配列に加えて、プローブは、配列番号44の何れかの部分、配列番号1及び2が増幅プライマーとして使用された場合に増幅される領域又はその相補体を含み得る。このプローブは、通常配列番号44のn個の連続ヌクレオチド又はその相補体であり、10≦n≦140である。配列番号44は以下のとおりである。
増幅法は通常、(a)核酸増幅試薬と、少なくとも1つの本発明のプライマー/プローブセットと及び少なくとも1つの標的配列を含有する疑いのある試験試料と、を含む反応混合液;及び(b)標的配列が存在する場合、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも1コピーを生成させるための増幅条件にその混合物を供することを含む。
1つの増幅反応で何れか又は両方の生物から標的配列を増幅するために、ナイゼリア・ゴノーホエア(Neisseria gonorrhoeae)(NG)などの疾患に対するその他のマーカーの増幅のためのプライマーと組み合わせて、CTプライマーを使用することができる。同時増幅反応と続く種−特異的ハイブリッド形成反応により、CT又はNGの何れか又は両方の生物による感染に関する、試験試料の同時評価が可能となる。プライマー/プローブセットの組み合わせ(例えば、1つがCT特異的プライマー/プローブセットから選択され、他方がNG−特異的プライマー/プローブセットから選択される;表3で例を示す。)を用いて、1つの反応混合液中で、NG及びCT又はCTSWの何れかの両方(又はCT及びCTSWの両方)を同時に増幅及び/又は検出することができる。言うまでもなく、各プローブは、その他のプローブのそれぞれから検出可能に区別される。例えば、2以上のプローブが同じ反応混合液中に存在する場合、各プローブの蛍光色素分子部分は異なる波長で蛍光を発する。
第一のポリヌクレオチドが配列番号1又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号16又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号23又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号1又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号2又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号22又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号8もしくは9又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号10もしくは26又はこれらの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号17又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号5もしくは6又はこれらの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号10又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号19又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく、
第一のポリヌクレオチドが配列番号14又はこれの相補体の核酸配列からなるとき、第二のポリヌクレオチドは配列番号2又はこれの相補体の核酸配列から構成されなく及び第三のポリヌクレオチドは配列番号22又はこれの相補体の核酸配列から構成されない。
CT及びCTSW核酸を定量するために、アッセイにおいて配列番号1−3及び5−25のポリヌクレオチドを使用することもできる。このように、試験試料中の標的核酸配列を特異的に増幅、検出及び定量するための方法において、本発明によるポリヌクレオチドを使用することができる。
定量的アッセイのための様々なタイプの標準物質が利用可能である。例えば、標準は、アッセイ条件下でのCT又はCTSW核酸分子の既知の量の増幅及び検出により収集された標準曲線から構成され得る。あるいは、反応に内部標準を含むことができる。このような内部標準は通常、対照標的核酸配列及び対照ポリヌクレオチドプローブを含む。内部標準は、場合によっては、プライマーのさらなる対をさらに含み得る。これらの対照プライマーの一次配列は本発明のポリヌクレオチドに無関係であり、対照標的核酸配列に特異的であり得る。あるいは、第一の標的配列(例えばCT)に向けられた第一のプライマー/プローブセットからのプライマーと一方の末端で結合し、第二の標的配列(例えばNG)に向けられた第二のプライマー/プローブセットに対するプライマーと他方の末端で結合し、増幅条件下でコピーが生成されるように対照標的配列が設計される場合、さらなるプライマーを使用する必要はない。
(a)特定の反応で使用されているCT又はCTSWプライマー又はプライマー対の何れかにより又は個別のCT対照プライマーにより増幅することができ;
(b)適切な条件下で対照プローブと特異的にハイブリッド形成し;及び
(c)同じ条件下でCT−又はCTSW−特異的プローブとハイブリッド形成しない、核酸配列である。
(a)適切な条件下で対照配列と特異的にハイブリッド形成し;
(b)CT又はCTSW標的配列を検出している場合、同じ条件下でCTもしくはCTSW配列、CTもしくはCTSW−特異的プローブ又はCTもしくはCTSW特異的プライマーとハイブリッドを形成せず;及び
(c)同じ反応混合液中で使用されるその他のプローブに組み込まれた標識とは異なる検出可能な標識を組み込む。
ハイスループットアッセイの場合、反応成分は通常、様々な試験試料を含む複数のアッセイ反応物を同じアッセイにおいて監視することを可能にする、マルチウェルマイクロタイタープレートなどの多容器担体又はプラットフォームに収容される。本発明はまた、スクリーニング又はアッセイ工程の効率を高めるための高度に自動化されたハイスループットアッセイももくろむ。スループット時間を大幅に高速化する、試料及び試薬のピペット分注、液体の分配、時間指定温置、マイクロアレイへの試料のフォーマット化、マイクロプレートの温度サイクリング及び適切な検出器でのマイクロプレートの読み取りなどの多くの手順に対する自動化能力のように、多くのハイスループット系が現在市販されている。
配列番号1−3及び5−25のポリヌクレオチドは、CT及びCTSW核酸の検出及び/又は定量を可能にするキットの一部として含まれ得る。このようなキットは、プライマー及び/又はプローブとして使用するための本発明の1以上のポリヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、このポリヌクレオチドは、表2で示されるように、試験試料中のCT及びCTSW核酸を特異的に増幅するプライマーとしての使用のための組合せでキット中で提供される。
以下の実施例は例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。同じように首尾よく本発明を行うことができる、当業者にとって利用可能な様々な代替的技術及び手法がある。
CTの特異的増幅及び検出について、様々な組合せで、新たに設計したプライマー/プローブを試験した。全体で、プライマー又はプローブとして27種類の配列を試験し、これには配列番号1−3、5−25、26、27及び43(表1)が含まれた。様々な組み合わせの154種類のセットを作った(表2)。配列番号43を除き、全ての候補プローブをQUASAR(登録商標)Q670(BioSearch Technologies、Inc.;Novato、CA)(CY5(登録商標)の代替品;Biosearch Technologies;Novato、CA;USA)及びBHQ−2(登録商標)(Biosearch Technologies)(消光剤として)で標識した。配列番号43を6−カルボキシ-フルオレセイン(FAM(登録商標);Applied Biosystems;Foster、CA;USA)及びBHQ−1(登録商標)(Applied Biosystems)(消光剤として)で標識した。CTゲノムDNA調製物をいくつかの異なる希釈度で希釈し、標的として使用し、プライマー/プローブの各セットに対して、CT/NG陰性希釈液を陰性対照として使用した。
この実施例において、Abbott Laboratories(Abbott Park、IL、USA)REALTIME(登録商標)CT/NG診断キットで提供される現在のCT/NGオリゴヌクレオチド試薬に対する特異性及びロバスト性について、新たに発見されたSwiss CT欠損変異体に適応するように新たに設計したプライマー/プローブセットを試験した。CT/NGオリゴヌクレオチド試薬は、6種類のプライマー及び3種類のプローブ(CT、NG及び内部対照(IC)に対するプライマー及びCT、NG及びICに対するプローブ)を含有する。6−カルボキシ−フルオレセイン(FAM(登録商標);Applied Biosystems;Foster、CA;USA)でオリジナルのCTプローブを標識した。候補プローブは、蛍光色素分子としてQUASAR(登録商標)Q670(CY5(登録商標)の代替品;BioSearch Technologies;Novato、CA;USA)を、消光剤としてBHQ−2(登録商標)(Biosearch Technologies)を使用した。
この実施例の目的は、配列番号3の配列を有するプローブと組み合わせた配列番号1及び2の配列を有するプライマー、及び配列番号3の配列を有するプローブと組み合わせた配列番号14及び15の配列を有するプライマーが、非CTSW CT及びNG検出の市販品において現在使用されているプライマー及びプローブを妨害しないことを明らかにすることである。
この実施例において、本発明のプライマー/プローブによって陰性対照が増幅されないという仮説を試験した。
この実施例において、CTゲノムDNA調製物(TE pH8.0及びサケ精巣DNA(担体として)中で希釈したDNA)の3種類の異なる希釈液を用いて、感度について配列番号1−3の配列を有するプライマー/プローブセットを試験した。相対的希釈率は、1、1:7.5及び1:50であり、患者試料からの低レベルのCTを試料が模倣するようにした。
配列番号1−3の配列を有するプライマー/プローブの組み合わせが高感度であり対照鋳型において特異的であることが示されたので、このプライマー/プローブの組み合わせが様々な血清型亜型においてCT(その細胞表面で発現される場合、タンパク質組成が異なるCT)を検出する能力について試験した。100コピー/反応で16種類の血清型亜型を試験し、陰性対照と比較した。このプライマー/プローブの組み合わせによって血清型亜型の標的領域が増幅され検出される場合、シグナルが生じ;そうでなければ、陰性対照により生じたシグナルと同等であるバックグラウンドシグナルのみが観察される。
この実施例において、配列番号1−3の配列を有するプライマー/プローブセット(実施例6中のようなMM1)の交差反応性を試験した。107種類の潜在交差反応生物を用いて、プライマーの各セットの性能を試験した。CT/NG REALTIME(登録商標)PCRアッセイ交差反応性パネルとして株を収集した。
この試験において、最適濃度を確認するために互いに対して配列番号1−3を滴定した。表13は、この試験で使用する様々なマスターミックス(MM)を示すが、この表でプライマー及びプローブの様々な濃度を示す。ICを各混合液に添加し、84コピー/反応の最終IC濃度とした。
この実施例において、m2000sp及びm2000rtでの、m2000実験適用仕様ファイルを用いて、ヒト被検者尿試料において配列番号1−3を含有するMM1マスターミックス(実施例6参照)を試験した。全体で43検体の尿試料を試験した。m2000実験適用仕様ファイルの試料調製部分は、現在市販されているm2000CT/NG適用仕様ファイル第2.00版の改訂版である。Internal Review Boardにより承認されたプロトコール下で、患者の同意を得て、Abbottのために、Abbott Multi−Collectトランスポートチューブにおいて、尿試料を回収した。m2000spにおいてPCRプレートを準備し、次に、PCR増幅及び検出のためにm2000rtに移した。サイクリング条件は実施例2に記載のとおりであった。この実験適用仕様ファイルのm2000rt検出部分は、CY5(登録商標)チャネルでの検出が追加された現在市販されているm2000CT/NG適用仕様ファイル第2.00版とは異なっていた。次に、同一の試料調製プロトコールから調製したこれらの同じ尿試料での結果とこの結果を比較し(CT/NG実験適用仕様ファイルv0.24)、現在市販されているm2000CT/NGアッセイ試薬(MM0、実施例6)で試験した。
この実施例において、配列番号3をFAM(登録商標)で標識した。この形態において、CT又はCTSWが検出されるか否かに関わらず、1つのCTの結果のみが得られる。
Claims (11)
- 第一、第二及び第三のポリヌクレオチドを含むクラミジア・トラコマチスの核酸配列の検出のためのポリヌクレオチド試薬の組み合わせであって、
第一のポリヌクレオチドは、配列番号1、13及び14からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなり、フォワードプライマーとして使用され、
第二のポリヌクレオチドは、配列番号2及び15からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなり、リバースプライマーとして使用され、及び
第三のポリヌクレオチドは、配列番号3からなるポリヌクレオチドであり、プローブとして使用される、
クラミジア・トラコマチスの核酸配列の検出のためのポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。 - 少なくとも1個のポリヌクレオチド試薬が検出可能な標識を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
- 第四のポリヌクレオチド(第四のポリヌクレオチドは、配列番号28−30及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、フォワードプライマーとして使用される。)、
第五のポリヌクレオチド(第五のポリヌクレオチドは、配列番号31及びこれの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、リバースプライマーとして使用される。)及び
第六のポリヌクレオチド(第六のポリヌクレオチドは、配列番号32−34及びこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、プローブとして使用される。)
をさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。 - 少なくとも1つのポリヌクレオチド試薬が検出可能な標識を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
- 少なくとも1つのポリヌクレオチド試薬がさらに消光剤を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
- 第三のポリヌクレオチドが標識及び消光剤を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチド試薬の組み合わせ及び増幅試薬を含む、クラミジア・トラコマチスの核酸配列の検出のためのキット。
- (a)増幅試薬、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)核酸配列を含有する疑いのある試料及び請求項1に記載の第一及び第二のポリヌクレオチドの組み合わせを含む反応混合液を形成すること、並びに
(b)前記混合液を、前記増幅試薬が請求項1に記載の第三のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列の少なくとも1個のコピーの増幅を促進するような条件に供すること
を含む、試料中のクラミジア・トラコマチス核酸配列を増幅する方法。 - 前記反応混合物が、対照標的ポリヌクレオチド及び対照ポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- (a)増幅試薬、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)核酸配列を含有する疑いのある試料及び請求項1に記載の第一及び第二のポリヌクレオチドの組み合わせを含む反応混合液を形成すること、
(b)前記混合液を、前記増幅試薬が請求項1に記載の第三のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列の少なくとも1個のコピーの増幅を促進するような条件に供すること、
(c)前記混合物を、第三のポリヌクレオチド試薬が標的配列との特異的ハイブリッド形成を促進するような条件に供すること、並びに
(d)第三のポリヌクレオチド:標的配列ハイブリッドを検出すること
を含む試料中でクラミジア・トラコマチスを検出する方法。 - 反応混合物が、対照標的ポリヌクレオチドと、対照ポリヌクレオチドプローブと、をさらに含む、請求項10に記載の方法。
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