ES2641290T3 - Modulación de la expresión de CD40 - Google Patents
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Abstract
Un compuesto antisentido para uso en el tratamiento o prevencion de una afeccion inflamatoria o inmunologica asociada en la que el compuesto antisentido comprende un oligonucleotido modificado de 12 a 30 nucleobases de longitud y que tiene una secuencia de nucleobasas que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porcion de longitud igual de una region de intron del gen CD40, en las posiciones 11250- 12685 de SEQ ID NO: 4, correspondiente al intron 6, en el que el oligonucleotido comprende: un segmento de separacion que consiste en desoxinucleosidos enlazados; un segmento de ala 5' que consiste en nucleosidos unidos; un segmento de ala 3' que consiste en nucleosidos unidos; en el que el segmento de separacion esta situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleosido de cada segmento de ala comprende un azucar modificado, en el que la secuencia de la nucleobase del compuesto es al menos 98% complementaria a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4, y en el que el compuesto antisentido es capaz de reducir el ARNm de CD40.
Description
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Modulacion de la expresion de CD40
Descripcion
Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere a metodos y composiciones para bajar niveles de CD40 en un animal. Tales metodos y composiciones son utiles como compuestos antiinflamatorios y compuestos antitumorales.
Antecedentes de la invencion
[0002] El sistema inmune tiene un papel vital en la proteccion del cuerpo frente a agentes infecciosos. Esta bien establecido, sin embargo, que una serie de estados de enfermedad y/o trastornos son el resultado de una activacion anormal o indeseable de respuestas inmunes. Los ejemplos comunes incluyen la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD) y rechazo de injerto, y enfermedades autoinmunes ligadas tales como esclerosis multiple (MS), lupus eritematoso sistemico (LES) y ciertas formas de artritis.
[0003] En general, una respuesta inmunitaria se activa como resultado de cualquiera de lesion tisular o infeccion. Ambos casos implican el reclutamiento y la activacion de un numero de celulas efectoras del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos B y T, macrofagos, eosinofilos, neutrofilos) en un proceso coordinado a traves de una serie de complejas interacciones celula-celula. Un escenario tfpico por el que una respuesta inmune se monta contra una protema extrana es como sigue: protemas extranas capturadas por celulas presentadoras de antfgeno (APC) tales como macrofagos o celulas dendnticas se procesan y se muestran en la superficie celular de la APC. Las celulas T auxiliares circulantes que expresan una inmunoglobulina que reconoce (es decir, se une a) el antfgeno mostrado sufren activacion por la APC. Estas celulas T auxiliares activan a su vez clones de celulas B apropiados para proliferar y diferenciarse en celulas plasmaticas que producen y segregan anticuerpos humorales dirigidos contra el antfgeno extrano. Los anticuerpos humorales secretados estan libres para circular y unirse a cualquier celula que exprese la protema extrana en su superficie celular, marcando en efecto la celula para su destruccion por otras celulas efectoras inmunes. En cada una de las etapas descritas anteriormente, se requiere el contacto directo celula- celula entre los tipos de celulas implicados para que se produzca la activacion. (Gruss et al, Leuk Lymphoma 1989, 24: 393). En los ultimos anos, se ha identificado una serie de receptores de superficie celular que median estos eventos de activacion dependiente de contacto celula-celula. Entre estos receptores de la superficie celular esta el CD40 y su ligando fisiologico, el ligando CD40 (CD40L) que tambien se conoce como CD154.
[0004] CD40 se caracterizo por primera vez como un receptor expresado en los linfocitos B. Mas tarde se encontro que el compromiso de CD40 de celulas B con CD40L expresado en celulas T activadas es esencial para la activacion de celulas B dependientes de celulas T (es decir, proliferacion, secrecion de inmunoglobulina y cambio de clase). Posteriormente se revelo que CD40 funcional se expresa en una variedad de tipos de celulas distintas de las celulas B, incluyendo macrofagos, celulas dendnticas, celulas epiteliales timicas, celulas de Langerhans y celulas endoteliales. Estos estudios han llevado a la creencia actual de que CD40 desempena un papel amplio en la regulacion inmune mediando las interacciones de las celulas T con las celulas B, asf como otros tipos de celulas. En apoyo de esta nocion, se ha demostrado que la estimulacion de CD40 en los macrofagos y los resultados dendnticos se requiere para la activacion de las celulas T durante la presentacion del antfgeno. (Gruss et al., Leuk. Lymphoma, 1997, 24: 393). La evidencia reciente apunta a un papel para CD40 en la inflamacion de tejido tambien. Se ha demostrado que la produccion de los mediadores inflamatorios IL-12 y oxido mtrico por los macrofagos depende del CD40. (Buhlmann y Noelle, J. Clin. Immuhol., 1996, 16:83). En las celulas endoteliales se ha encontrado que la estimulacion de CD40 por CD40L induce la expresion superficial de E-selectina, ICAM-1 y VCAM- 1, promoviendo la adhesion de leucocitos a sitios de inflamacion (Buhlmann y Noelle, J. Clin. Immuhol., 1996, 16:83); Gruss et al., Leuk. Lymphoma, 1997, 24: 393). Por ultimo, varios informes han documentado la sobreexpresion de CD40 en tumores epiteliales y hematopoyeticos, asf como en celulas endoteliales infiltrantes de tumores, lo que indica que CD40 puede desempenar tambien un papel en el crecimiento tumoral y/o angiogenesis (Gruss et al., Leuk. 1997, 24: 393, Kluth et al., Cancer Res., 1997, 57: 891).
[0005] Debido al papel fundamental que CD40 juega en la inmunidad humoral, existe el potencial de que las estrategias terapeuticas dirigidas a la regulacion negativa de CD40 o interferencia con la senalizacion de CD40 pueden proporcionar una nueva clase de agentes utiles en el tratamiento de una serie de trastornos del sistema inmune asociado, incluyendo pero no limitados a la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD), rechazo de injerto y enfermedades autoinmunes tales como esclerosis multiple (EM), lupus eritematoso sistemico (LES) y ciertas formas de artritis. Los inhibidores de CD40 tambien pueden ser utiles como compuestos antiinflamatorios y por lo tanto podnan ser utiles como tratamiento para una variedad de afecciones inflamatorias y alergicas tales como asma, artritis reumatoide, rechazos de aloinjertos, enfermedad inflamatoria del intestino, encefalomielitis autoinmune, tiroiditis, diversas condiciones dermatologicas, y psoriasis. Recientemente, se ha demostrado que tanto CD40 como CD 154 se expresan en celulas endoteliales vasculares, celulas de musculo liso vascular y macrofagos presentes en placas ateroscleroticas, lo que sugiere que la inflamacion y la inmunidad contribuyen al proceso aterogenico. El hecho de que este proceso involucre la senalizacion de cD40 es sugerido por varios estudios en modelos de raton en los que la interrupcion del CD 154 (por nocaut o por anticuerpo monoclonal) redujo la
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progresion o el tamano de las lesiones ateroscleroticas. (Mach et al., Nature, 1998, 394: 200 - 3, Lutgens et al., 1999, Nat Med. 5: 1313-6).
[0006] Por ultimo, al aprenderse mas de la asociacion entre sobreexpresion CD40 y el crecimiento tumoral, los inhibidores de CD40 pueden resultar utiles como agentes anti-tumorales e inhibidores de otras condiciones hiperproliferativas tambien.
[0007] En la actualidad, no existen agentes terapeuticos conocidos que inhiben eficazmente la smtesis de CD40. Hasta la fecha, las estrategias dirigidas a inhibir la funcion de CD40 han implicado el uso de una variedad de agentes que alteran la union de CD40/CD40L. Estos incluyen anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD40 o CD40L, formas solubles de CD40 y peptidos sinteticos derivados de una segunda protema de union a CD40, A20. El uso de anticuerpos neutralizantes contra CD40 y/o CD40L en modelos animales ha proporcionado evidencia de que la inhibicion de la senalizacion de CD40 tendna un beneficio terapeutico para GVHD, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide, SLE, MS y linfoma de celulas B. (Buhlmann y Noelle, J. Clin. Immunol, 1996, 16:83). Las investigaciones clmicas se iniciaron utilizando anticuerpos monoclonales anti-CD154 en pacientes con nefritis lupica. Sin embargo, los estudios se terminaron debido al desarrollo de eventos tromboticos. (Boumpas et al., 2003, Arthritis Rheum., 2003, 48: 719 -27).
[0008] Debido a los problemas asociados con el uso de protemas grandes como agentes terapeuticos, existe una necesidad largamente sentida de agentes adicionales capaces de inhibir eficazmente la funcion de CD40. Los oligonucleotidos antisentido evitan muchas de las trampas de los agentes actuales usados para bloquear las interacciones de CD40/CD40L y pueden por lo tanto demostrar ser de utilidad unica en una serie de aplicaciones terapeuticas, diagnosticas y de investigacion. La patente de EE.UU. 6.197.584 (Bennett y Cowsert) describe compuestos antisentido dirigidos a CD40. US 2004-0186071 A1, WO 99/57320 y Siwkowski et al. Nucleic Acids Res., 2004, 32 (9): 2695-2706, tambien describen compuestos antisentido dirigidos a acidos nucleicos que codifican CD40.
Resumen de la invencion
[0009] La invencion proporciona un compuesto antisentido para su uso en el tratamiento o la prevencion de una condicion asociada inflamatoria o inmune en el que el compuesto antisentido comprende un oligonucleotido modificado de 12 a 30 nucleobases de longitud y tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una region igual de intron del gen CD40, en las posiciones 11250-12685 de SEQ ID NO: 4, correspondiendo al intron 6, en el que el oligonucleotido comprende:
un segmento de separacion que consiste en desoxinucleosidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en nucleosidos unidos; un segmento de ala 3’ que consiste en nucleosidos unidos;
en el que el segmento de separacion esta situado entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleosido de cada segmento de ala comprende un azucar modificado, en el que la secuencia de nucleobase del compuesto es al menos 98% complementaria a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4, y en el que el compuesto antisentido es capaz de reducir el ARNm de CD40.
[0010] La invencion tambien proporciona una sal farmaceuticamente aceptable de un compuesto antisentido, para uso en el tratamiento o prevencion de una condicion asociada inflamatoria o inmune, en el que el compuesto antisentido es un compuesto antisentido como se ha expuesto en las reivindicaciones.
[0011] La invencion tambien proporciona una composicion para uso en el tratamiento o prevencion de una condicion asociada inflamatoria o inmune, donde la composicion comprende un compuesto antisentido como el expuesto en las reivindicaciones o una sal del mismo y un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
[0012] Otros aspectos de la invencion se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
Resumen de la Divulgacion
[0013] Se da a conocer en el presente documento compuestos antisentido, composiciones y metodos para el tratamiento y prevencion de afecciones inflamatorias y el cancer.
[0014] Compuestos antisentido descritos en este documento pueden ser de 12 a 30 nucleobases de longitud dirigidas a un acido nucleico CD40. El acido nucleico CD40 puede ser cualquiera de las secuencias como se expone en el N° de Acceso GENBANK® X60592.1, incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 1; N° de acceso GENBANK® H50598.1, incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2; N° de acceso GENBANK® AA203290.1, incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 3; y los nucleotidos 9797000 al nucleotido 9813000 del N° de Acceso GENBANK NT_011362.9, incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 4, o al N° de Acceso GENBANK® BC064518.1, incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 237.
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[0015] El compuesto antisentido puede ser de 12 a 30 nucleobases de longitud y puede tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementaria a una porcion de longitud igual de una region del intron del gen CD40, seleccionado de las siguientes regiones de SEQ ID NO: 4:
(a) posiciones 11250-12685, correspondientes a intron 6;
(b) posiciones 2943-6367, correspondientes a intron 1,
(c) posiciones 6447-6780, correspondientes a intron 2,
(d) posiciones 6907-7157, correspondientes a intron 3,
(e) posiciones 7305-7673, correspondientes a intron 4,
(f) posiciones 7768-11187, correspondientes a intron 5,
(g) posiciones 12773-12877, correspondientes a intron 7, o
(h) posiciones 12907 - 133429, correspondientes a intron 8,
en el que la parte o partes restantes del compuesto antisentido son al menos 70% complementarias de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, las partes restantes del compuesto antisentido son al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o, lo mas preferiblemente, 100% complementarias a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4.
[0016] Preferiblemente, el compuesto antisentido puede comprender al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porcion de igual longitud de las posiciones 12527-12685 de la SEQ ID NO: 4, que es una region que puede ser parte del intron 6, o puede ser parte de una version alternativa del exon 7 cuando se selecciona un sitio aceptor de empalme diferente. Preferiblemente, el compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 208, en donde la secuencia de nucleobases del compuesto es al menos 70% complementaria a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, el compuesto antisentido es al menos un 75%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95%, un 98%, un 99% o, lo mas preferiblemente, un 100% complementario de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4. Mas preferiblemente, el compuesto antisentido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 208. Incluso mas preferiblemente, el compuesto antisentido tiene 20 nucleobases de longitud y consiste en la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 208. Lo mas preferiblemente, el compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido 20 nucleotidos de longitud que tienen la secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 208, en donde cada citosina es una 5- metilcitosina, cada enlace internucleosido es un enlace fosforotioato, los nucleotidos 1-5 y 16-20 son 2’-O-metoxietilo nucleotidos y nucleotidos 6-15 son 2’-desoxinucleotidos; mas preferiblemente el compuesto antisentido es ISIS 396236.
[0017] Un compuesto antisentido segun la invencion puede ser de 12 a 30 nucleobases de longitud y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementaria a una porcion de longitud igual de una region del gen CD40, correspondiente a las posiciones 13662-16001 de la SEQ ID NO: 4 que forma parte del exon 9 o una region 3’ con respecto al exon 9, donde las partes restantes del compuesto antisentido son al menos 70% complementarias de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, la region diana del gen CD40 que corresponde a las posiciones 13877 - 14084, aun mas preferiblemente a las posiciones 13937 - 13996, de SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, las partes restantes del compuesto antisentido son al menos 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 98%, 99%, o, lo mas preferiblemente, 100% complementarios a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4.
[0018] Otro compuesto antisentido descrito en la presente es de 12 a 30 nucleobases de longitud y tiene una secuencia de nucleobases complementaria a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, empezando en la posicion 69 o 70 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobase es al menos un 95% complementario a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia de la nucleobase es esencialmente complementaria a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1. Mas preferiblemente, la secuencia de la nucleobase se selecciona de las secuencias de SEQ ID Nos: 90 y 163. Incluso mas preferiblemente, el compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 90. Incluso mas preferiblemente, el compuesto antisentido tiene 18 o 20 nucleobases de longitud y consiste en la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 163. El compuesto antisentido puede ser ISIS26163, ISIS396201 o ISIS396278. Preferiblemente, el compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido de 18 nucleotidos de longitud que tiene la secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 90, donde cada citosina es una 5-metilcitosina, cada enlace internucleosido es un enlace fosforotioato, nucleotidos 1-4 y 15-18 son nucleotidos 2’-O-metoxietilo, y los nucleotidos 5 a 14 son 2’- desoxinucleotidos. Mas preferiblemente, el compuesto antisentido es ISIS26163.
[0019] Un compuesto antisentido segun la invencion puede comprender un oligonucleotido modificado que consta de 12 a 30 nucleosidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 bases nucleotfdicas contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobases indicadas en SEQ ID NOs: 5 a 236. Preferiblemente, el compuesto consiste en un oligonucleotido modificado monocatenario. Preferiblemente, la secuencia de la nucleobase del oligonucleotido modificado es 100% complementaria a una secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 237 .
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[0020] El compuesto antisentido puede comprender nucleosidos enlazados. Preferiblemente, el compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido.
[0021] El compuesto antisentido puede ser de una sola hebra o de doble hebra de oligonucleotidos. Preferiblemente, el compuesto anti-sentido es un oligonucleotido monocatenario.
[0022] El oligonucleotido antisentido puede ser modificado, en donde al menos un enlace internucleosfdico es un enlace internucleosfdico modificado. El enlace internucleosido puede ser un enlace internucleosido de fosforotioato.
[0023] El oligonucleotido antisentido puede ser modificado, en el que al menos un nucleosido comprende un azucar modificado. El azucar modificado puede ser un azucar bidclico. Preferiblemente, al menos un azucar bidclico comprende un puente 4’-CH(CH3)-O-2 ’. El azucar modificado puede comprender un 2’-O-metoxietilo. El compuesto antisentido puede comprender al menos un nucleosido modificado con tetrahidropirano, en el que un anillo de tetrahidropirano reemplaza al anillo de furanosa. Preferiblemente, cada uno de al menos un nucleosido modificado con tetrahidropirano tiene la estructura
en la que Bx es un resto de base heterodclica opcionalmente protegido.
[0024] El compuesto antisentido puede comprender una nucleobase modificada. La nucleobase modificada puede ser una 5-metilcitosina. Preferiblemente, cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0025] El compuesto antisentido puede ser un gapmero, por ejemplo que comprende un oligonucleotido:
un segmento de separacion que consiste en desoxinucleosidos enlazados; un segmento de ala 5' que consiste en nucleosidos unidos; un segmento de ala 3’ que consiste en nucleosidos unidos;
en el que el segmento de separacion esta situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleosido de cada segmento de ala comprende un azucar modificado. Preferiblemente, cada nucleosido de cada segmento de ala comprende un azucar 2’-O-metoxietilo; y preferiblemente cada enlace internucleosido es un enlace fosforotioato.
[0026] El oligonucleotido antisentido puede ser un gapmero MOE 5-10-5 o un gapmero MOE 2-15-3. El oligonucleotido antisentido puede consistir en 20 nucleosidos unidos.
[0027] El oligonucleotido antisentido puede ser un gapmero MOE 4-10-4. El oligonucleotido antisentido puede consistir en 18 nucleosidos unidos.
[0028] Las composiciones descritas en este documento pueden comprender un oligonucleotido que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, dirigidos a un acido nucleico de CD40 o una sal del mismo y un vedculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
[0029] La composicion puede comprender un oligonucleotido monocatenario o bicatenario.
[0030] Tambien se describe aqrn una composicion farmaceutica que comprende un compuesto antisentido como se ha descrito anteriormente y un liposoma o un sistema de suministro basado en Kpidos. Preferiblemente, dicho liposoma es un liposoma anfotero. Preferiblemente, dicho liposoma anfotero se forma a partir de una fase lipfdica que comprende un lfpido anfotero o una mezcla de componentes lipfdicos con propiedades anfoteras. Dicho liposoma anfotero puede comprender ademas uno o mas lfpidos neutros o zwitterionicos. Mas preferiblemente, dicho liposoma anfotero se forma a partir de una fase lipfdica que comprende
(a) aproximadamente 15% en moles de POPC, aproximadamente 45% en moles de DOPE, aproximadamente 20% en moles de MoChol, aproximadamente 20% en moles de Chems
(b) aproximadamente 60% en moles de POPC, aproximadamente 10% en moles de DOTAP, aproximadamente 30% en moles de Chems
(c) aproximadamente 30% en moles de POPC, aproximadamente 10% en moles de DOTAP, aproximadamente
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20% en moles de Chems, aproximadamente 40% en moles de Chol
(d) aproximadamente 60% en moles de POPC, aproximadamente 20% en moles de HistChol, aproximadamente 20% en moles de Chol.
[0031] Tambien se describe aqm un compuesto antisentido o composicion como se describe anteriormente para uso medico. Tambien se describe aqrn un compuesto antisentido o una composicion como se ha descrito anteriormente para el tratamiento de cancer o una afeccion inflamatoria o inmunologica asociada. El tratamiento puede comprender ademas administrar un segundo farmaco, que puede administrarse por separado o concomitantemente con el compuesto antisentido de la invencion.
[0032] Los metodos descritos en el presente documento pueden comprender administrar a un animal un compuesto antisentido como se describe anteriormente, preferiblemente un compuesto antisentido que comprende un oligonucleotido que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlaces dirigidos a un acido nucleico CD40, o una composicion que comprende dicho compuesto antisentido. Preferiblemente, el animal es un ser humano.
[0033] La administracion del compuesto antisentido y/o el segundo farmaco puede ser por administracion parenteral, administracion topica, administracion oral o administracion en aerosol. La administracion parenteral puede ser cualquiera de la administracion subcutanea o intravenosa.
Descripcion detallada
[0034] Ha de entenderse que tanto la descripcion general anterior como la siguiente descripcion detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invencion, segun se reivindica. En este caso, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique espedficamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Ademas, el uso del termino "incluyendo", asf como otras formas, tales como "incluye" y "incluido", no es limitante. Ademas, terminos tales como "elemento" o "componente" abarcan elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden mas de una subunidad, a menos que se indique espedficamente lo contrario.
[0035] Los encabezados de seccion usados en este documento son solo para fines de organizacion y no deben interpretarse como limitantes del objeto descrito.
Definiciones
[0036] A menos que se proporcionen definiciones espedficas, la nomenclatura utilizada en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de qmmica analftica, qmmica organica sintetica y qmmica medica y farmaceutica descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la tecnica. Las tecnicas estandar se pueden utilizar para la smtesis qmmica, y el analisis qmmico.
[0037] A menos que se indique lo contrario, los siguientes terminos tienen los siguientes significados:
"2’-O-metoxietilo" (tambien 2’-MOE y 2’-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificacion O-metoxietilo de la posicion 2’ de un anillo de furosilo. Un azucar modificado con 2’-O-metoxietilo es un azucar modificado.
[0038] "Nucleotido 2’-O-metoxietilo" significa un nucleotido que comprende un resto de azucar modificado 2’-O- metoxietilo.
[0039] "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posicion 5'. Una 5- metilcitosina es una nucleobase modificada.
[0040] "Perfil de seguridad aceptable" significa un patron de efectos secundarios que esta dentro de lfmites clfnicamente aceptables.
[0041] "Ingrediente farmaceutico activo": la sustancia o sustancias de una composicion farmaceutica que proporciona un efecto deseado.
[0042] "Region diana activa" significa una region diana a la que uno o mas compuestos activos antisentido esta dirigido. "Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles de acido nucleico diana.
[0043] "Administrado concomitantemente" se refiere a la co-administracion de dos agentes en cualquier manera en la que los efectos farmacologicos de ambos se manifiestan en el paciente al mismo tiempo. La administracion concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una composicion farmaceutica unica, en la misma forma de dosificacion, o por la misma via de administracion.
[0044] "Administracion" significa proporcionar un agente farmaceutico a un individuo, e incluye, pero no esta limitado
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a la administracion por un profesional medico y la auto-administracion.
[0045] "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomerico que es capaz de experimentar la hibridacion con un acido nucleico diana a traves de puentes de hidrogeno.
[0046] "Inhibicion antisentido" significa reduccion de los niveles de acido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementary a un acido nucleico diana en comparacion con los niveles objetivo de acido nucleico en la ausencia del compuesto antisentido.
[0047] "Oligonucleotido antisentido" significa un oligonucleotido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridacion con una region correspondiente o segmento de un acido nucleico diana.
[0048] "Azucar bidclico" significa un anillo de furosilo modificado por el puente de dos atomos del anillo no geminales. Un azucar bidclico es un azucar modificado.
[0049] "Acido nucleico bidclico" o "BNA" o "nucleosido bidclico" o "nucleotido bidclico" se refiere a un nucleosido o nucleotido en el que la porcion de furanosa del nucleosido incluye un puente que conecta dos atomos de carbono en el anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bidclico. Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, el termino "metilenoxi BNA" solo se refiere a 13-D-metilenoxi BNA.
[0050] "Estructura de tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones qmmicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
[0051] "Compuestos antisentido quimericos" significa compuestos antisentido que tienen al menos 2 regiones qmmicamente distintas, cada una posicion que tiene una pluralidad de subunidades. Un "gapmero" significa un compuesto antisentido en el que una posicion interna que tiene una pluralidad de nucleotidos que soporta la escision de RNasaH se posiciona entre regiones externas que tienen uno o mas nucleotidos que son qmmicamente distintos de los nucleosidos de la region interna. Un "segmento de separacion" significa la pluralidad de nucleotidos que constituyen la region interna de un gapmero. Un "segmento de ala" significa la region externa de un gapmero.
[0052] "Co-administracion" significa la administracion de dos o mas agentes farmaceuticos a un individuo. Los dos o mas agentes farmaceuticos pueden estar en una sola composicion farmaceutica, o pueden estar en composiciones farmaceuticas separadas. Cada uno de los dos o mas agentes farmaceuticos puede administrarse por la misma o diferentes vfas de administracion. La coadministracion abarca la administracion en paralelo o secuencialmente.
[0053] "Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico.
[0054] "Cumplir" significa la adherencia con una terapia recomendada por un individuo.
[0055] "Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sL
[0056] "Diluyente" significa un ingrediente en una composicion que carece de actividad farmacologica, pero es farmaceuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los farmacos que se inyectan, el diluyente puede ser un lfquido, por ejemplo solucion salina.
[0057] "Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmaceutico proporcionada en una unica administracion, o en un penodo de tiempo especificado. Se puede administrar una dosis en dos o mas bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, cuando se desea la administracion subcutanea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda facilmente mediante una sola inyeccion. En tales casos, se pueden usar dos o mas inyecciones para lograr la dosis deseada. Se puede administrar una dosis en dos o mas inyecciones para minimizar la reaccion en el sitio de inyeccion en un individuo. En otros casos, el agente farmaceutico se administra por infusion durante un periodo de tiempo prolongado o continuamente. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmaceutico por hora, dfa, semana o mes.
[0058] "Dosificacion unitaria" significa una forma en la que se proporciona un agente farmaceutico, por ejemplo pfldora, comprimido, u otra unidad de dosificacion conocida en la tecnica. En ciertos casos, una unidad de dosificacion es un vial que contiene oligonucleotido antisentido liofilizado. En ciertos casos, una unidad de dosificacion es un vial que contiene oligonucleotido antisentido reconstituido.
[0059] "Duracion" significa el penodo de tiempo durante el cual continua una actividad o acontecimiento. En ciertos casos, la duracion del tratamiento es el periodo de tiempo durante el cual se administran las dosis de un agente farmaceutico.
[0060] "Eficacia" significa la capacidad de producir el efecto deseado.
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[0061] "Acido nucleico CD40" significa cualquier acido nucleico que codifique CD40. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un acido nucleico de CD40 incluye, sin limitacion, una secuencia de ADN que codifica CD40, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica CD40, y una secuencia de ARNm que codifica CD40. "ARNm CD40" significa un ARNm que codifica una protema CD40.
[0062] "Totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un primer acido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo acido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer acido nucleico es un compuesto antisentido y un acido nucleico diana es un segundo acido nucleico. En ciertas realizaciones de este tipo, un oligonucleotido antisentido es un primer acido nucleico y un acido nucleico diana es un segundo acido nucleico.
[0063] "Ensanchado por hueco" significa que un compuesto antisentido tiene un segmento de hueco de 12 o mas 2’- desoxirribonucleotidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5’ y 3’ que tienen de uno a seis nucleotidos que tienen restos de azucar modificado. "Inmediatamente adyacente" significa que no hay nucleotidos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
[0064] "Hibridacion" significa la hibridacion de moleculas de acido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moleculas de acido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y una diana de acido nucleico. En ciertas realizaciones de este tipo, las moleculas de acido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleotido antisentido y una diana de acido nucleico
[0065] "Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
[0066] "Cumplimiento individual" significa adherencia a una terapia recomendada o prescrita por un individuo.
[0067] "Reaccion en el sitio de inyeccion" significa inflamacion o enrojecimiento anormal de la piel en un sitio de inyeccion en un individuo.
[0068] "Enlace internucleosido" se refiere al enlace qmmico entre nucleosidos.
[0069] Nucleosidos enlazados significan nucleosidos adyacentes que estan unidos entre sL
[0070] La expresion "enlace internucleosido modificado" se refiere a una sustitucion y/o cualquier cambio de un enlace internucleosido (es decir, un enlace internucleosido fosfodiester).
[0071] "Oligonucleotido modificado" significa un oligonucleotido que comprende un enlace internucleosido modificado, un azucar modificado, y/o una nucleobase modificada.
[0072] "Azucar modificado" se refiere a una sustitucion y/o cualquier cambio de un azucar natural.
[0073] "Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase que no sea adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases purmicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidmicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
[0074] "Nucleotido modificado" significa un nucleotido que tiene, independientemente, un resto de azucar modificado, enlace internucleosido modificado, o nucleobase modificada. Un nucleosido modificado significa un nucleotido que tiene, independientemente, un resto de azucar modificado o una nucleobase modificada.
[0075] "Resto de azucar modificado" significa un resto de azucar que tiene cualquier sustitucion y/o cambio de un resto de azucar natural.
[0076] "Motivo" significa el patron de nucleosidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
[0077] "Enlace internucleosido natural" significa un enlace fosfodiester de 3 ’a 5’.
[0078] "Resto de azucar natural" significa un resto de azucar encontrado en el ADN (2’-H) o ARN (2’-OH).
[0079] "Nucleobase no complementaria" o "incompatibilidad" significa una nucleobase de un primer acido nucleico que no es capaz de emparejamiento con la correspondiente nucleobase de un segundo o acido nucleico diana.
[0080] "Nucleosido" significa una nucleobase unida a un azucar.
[0081] Como se usa en la presente memoria, el termino "nucleosido mimetico" pretende incluir aquellas estructuras usadas para reemplazar el azucar o el azucar y la base y no necesariamente el enlace en una o mas posiciones de un compuesto oligomerico tal como, por ejemplo, mimeticos de nucleosidos que tienen morfolina, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, mimeticos de azucar bidclicos o tridclicos, por ejemplo unidades de azucar no de furanosa.
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[0082] Nucleobase significa un resto de heterodclico capaz de emparejarse con una base de otro acido nucleico.
[0083] "Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azucar, enlace, y/o modificacion de la nucleobase.
[0084] "Nucleotido" significa un nucleosido que tiene un grupo de fosfato unido covalentemente a la porcion de azucar del nucleosido.
[0085] El termino "mimetico de nucleotidos" se pretende que incluya aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleosido y el enlace en una o mas posiciones de un compuesto oligomerico tal como por ejemplo acidos nucleicos peptfdicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiester).
[0086] "Compuesto oligomerico" se refiere a un polfmero u oligomero de subunidades monomericas con enlaces que es capaz de hibridacion a por lo menos una region de una molecula de acido nucleico.
[0087] "Oligonucleosido" significa un oligonucleotido en el que los enlaces internucleosido no contienen un atomo de fosforo.
[0088] "Oligonucleotido" se refiere a un polfmero u oligomero de nucleosidos ligados cada uno de los cuales se pueden modificaro no modificar, independientes uno de otro.
[0089] "Administracion parenteral", significa la administracion a traves de inyeccion o infusion. La administracion parenteral incluye, pero no se limita a, administracion subcutanea, administracion intravenosa o administracion intramuscular.
[0090] "Agente farmaceutico" se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapeutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleotido de antisentido dirigido a CD40 es un agente farmaceutico.
[0091] "Sales farmaceuticamente aceptables" se refieren a sales fisiologicas y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del oligonucleotido madre y no imparten efectos toxicologicos no deseados al mismo.
[0092] "Composicion farmaceutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administracion a un individuo. Por ejemplo, una composicion farmaceutica puede comprender uno o mas oligonucleotidos de antisentido o una combinacion de oligonucleotidos de antisentido y agentes activos no antisentido y una solucion acuosa esteril o aditivo otro farmaceuticamente aceptable.
[0093] "Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleosidos donde el enlace fosfodiester se modifica mediante la sustitucion de uno de los atomos de oxfgeno no puente con un atomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace de internucleosido modificado.
[0094] "Porcion" significa un numero definido de nucleobases contiguas (es decir, enlaces) de un acido nucleico. En ciertas realizaciones, una parte es un numero definido de nucleobases contiguas de un acido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una parte es un numero definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
[0095] "Profarmaco" significa un agente terapeutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un farmaco) dentro del cuerpo o las celulas del mismo por la accion de enzimas endogenas u otros productos qmmicos y/o condiciones.
[0096] "Terapia recomendada" significa un regimen terapeutico recomendado por un profesional de la medicina para el tratamiento, mejora o prevencion de una enfermedad.
[0097] "Efectos secundarios" se refiere a respuestas fisiologicas atribuibles a un tratamiento aparte de los efectos deseados. Los efectos secundarios incluyen, sin limitacion, reacciones en el sitio de la inyeccion, anomalfas en las pruebas de funcion hepatica, anomalfas en la funcion renal, toxicidad hepatica, toxicidad renal, anomalfas del sistema nervioso central, y miopatfas. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepatica o anomalfas de la funcion hepatica. Por ejemplo, aumento de la bilirrubina pueden indicar toxicidad hepatica o anomalfas de la funcion hepatica.
[0098] "Oligonucleotido de cadena sencilla modificado" significa un oligonucleotido modificado que no se hibrida a una cadena complementaria.
[0099] "Hibridar espedficamente" significa un compuesto antisentido que se hibrida con un acido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhiben un mmimo o ningun efecto sobre los acidos nucleicos no diana.
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[0100] El termino "sustituto de azucar" se superpone con el termino ligeramente mas amplio "mimetico de nucleosido", pero pretende indicar la sustitucion de la unidad de azucar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en este documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azucar en el que el grupo de azucar de furanosa ha sido sustituido por un sistema de anillo de tetrahidropiranilo.
[0101] "Condiciones de hibridacion rigurosas" significan condiciones en las que una molecula de acido nucleico, tal como un compuesto antisentido, se hibridaran a una secuencia de acido nucleico diana, sino a un numero mmimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y pueden variar en diferentes circunstancias. En el contexto de esta invencion, "condiciones rigurosas" en las que los compuestos oligomericos se hibridan con una secuencia diana vienen determinadas por la naturaleza y la composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en que estan siendo investigados.
[0102] "Administracion subcutanea" se refiere a la administracion justo debajo de la piel. "La administracion intravenosa" significa administracion en una vena.
[0103] "Selectivos" o "dirigidos a" significa que tiene una secuencia de nucleobases que permitira la hibridacion espedfica de un compuesto antisentido a un acido nucleico diana para inducir un efecto deseado. Un efecto deseado es la reduccion de un acido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un efecto deseado es la reduccion de un ARNm CD40.
[0104] "Orientacion" significa el proceso de diseno y seleccion de un compuesto antisentido que se hibride espedficamente con un acido nucleico diana e inducir un efecto deseado.
[0105] "Acido nucleico diana", "ARN diana", "transcripcion de ARN diana " y "acido nucleico diana" significan un acido nucleico capaz de ser diana de compuestos antisentido. Acidos nucleicos diana pueden incluir, pero no se limitan a, ADN, ARN (incluyendo, pero no limitado a pre-ARNm y ARNm o porciones de los mismos) transcrito a partir de ADN que codifica una diana, y tambien miARN.
[0106] "Region diana" se refiere a una porcion de un acido nucleico diana a la que uno o mas compuestos antisentido esta dirigido.
[0107] "Segmento diana" significa la secuencia de nucleotidos de un acido nucleico diana a la que un compuesto antisentido esta dirigido. "Sitio diana 5’" se refiere al nucleotido extremo 5' mas de un segmento diana. "Sitio diana 3’" se refiere al extremo 3’ mas nucleotidos de un segmento diana.
[0108] "Cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmaceutico que proporciona un beneficio terapeutico a un individuo.
[0109] "Nucleotido no modificado" significa un nucleotido compuesto de nucleobases de origen natural, restos de azucares y enlaces de internucleosido. En ciertas realizaciones, un nucleotido no modificado es un nucleotido de ARN (es decir, U-D-ribonucleosidos) o un nucleotido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleosido).
Compuestos antisentido
[0110] Los compuestos antisentido incluyen, pero no se limitan a, oligonucleotidos, oligonucleosidos, analogos de oligonucleotidos, mimeticos de oligonucleotidos, oligonucleotidos antisentido, y siARN. Un compuesto oligomerico puede ser "antisentido" frente a un acido nucleico diana, es decir que es capaz de experimentar hibridacion con un acido nucleico diana a traves de enlaces de hidrogeno.
[0111] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la direccion 5’ a 3’, comprende el complemento inverso del segmento diana de un acido nucleico diana al que esta dirigido. En ciertas realizaciones de este tipo, un oligonucleotido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando esta escrita en la direccion 5' a 3’, comprende el complemento inverso del segmento diana de un acido nucleico diana al que esta dirigido.
[0112] En la invencion reivindicada, un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico CD40 es de 12 a 30 subunidades de longitud. En otras palabras, los compuestos antisentido reivindicados son de 12 a 30 subunidades enlazadas. En otros casos, el compuesto antisentido es 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20 subunidades enlazadas. En ciertos casos, los compuestos antisentido son 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades enlazadas en longitud, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. El compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido, y las subunidades unidas son nucleotidos.
[0113] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un acido nucleico CD40 tiene una unica subunidad suprimido del extremo 5’ (truncado 5’), o alternativamente desde el extremo 3’ (truncado
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3’). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un acido nucleico CD40 puede tener dos subunidades suprimidas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades suprimidas del extremo 3', del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleosidos eliminados pueden dispersarse a traves del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleosido suprimido del extremo 5' y un nucleosido suprimido del extremo 3’.
[0114] Cuando una sola subunidad adicional esta presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar situada en el extremo 5’ o 3’ del compuesto antisentido. Cuando dos o mas subunidades adicionales estan presentes, las subunidades anadidas pueden ser adyacentes entre sf, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades anadidas al extremo 5' (adicion 5’) o, alternativamente, al extremo 3 ’(3’), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades anadidas pueden dispersarse a traves del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad anadida al extremo 5' y una subunidad anadida al extremo 3’.
[0115] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleotido antisentido, y/o introducir bases de desajuste sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992), se ensayo una serie de oligonucleotidos de antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escision de un ARN diana en un modelo de inyeccion de oocitos. Los oligonucleotidos de antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 o 11 bases desajustadas cerca de los extremos de los oligonucleotidos de antisentido fueron capaces de dirigir la escision espedfica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleotidos de antisentido que no conteman desajustes. De forma similar, se consiguio la division espedfica del objetivo usando 13 oligonucleotidos de antisentido de nucleobase, incluyendo aquellos con 1 o 3 desajustes.
[0116] Gautschi et al (J. Natl Cancer Inst 93: 463-471, marzo de 2001) demostro la capacidad de un oligonucleotido que tiene 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes a bcl-xL ARNm para reducir la expresion tanto de Bcl-2 y Bcl-xL in vitro e in vivo. Ademas, este oligonucleotido demostro actividad antitumoral potente in vivo.
[0117] Maher y Dolnick (Nuc Acid Res 16: 3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleotidos antisentido de nucleobase tandem 14, y oligonucleotidos de antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleotidos de antisentido tandem, respectivamente, por su capacidad para detener la traduccion de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleotidos de antisentido de nucleobase solo fue capaz de inhibir la traduccion, aunque a un nivel mas modesto que los oligonucleotidos de antisentido de 28 o 42 nucleobases.
[0118] Bhanot et al. (PCT/US2007/068401) proporcionaron compuestos de antisentido cortos, incluyendo compuestos que comprenden monomeros de alta afinidad modificados qmmicamente de 8 a 16 monomeros de longitud. Se demostro que estos compuestos de antisentido cortos eran utiles para reducir acidos nucleicos diana y/o protemas en celulas, tejidos y animales con potencia incrementada e mdice terapeutico mejorado. Los compuestos de antisentido cortos eran eficaces a dosis mas bajas que los compuestos anti-sentido descritos previamente, lo que permite una reduccion en la toxicidad y el coste del tratamiento. Ademas, los compuestos de antisentido cortos descritos tienen mayor potencial para la dosificacion oral.
Motivos de compuesto de antisentido
[0119] En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 han modificado qmmicamente subunidades dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos de antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, aumento de la afinidad de union para un acido nucleico diana, o resistencia a la degradacion por nucleasas in vivo.
[0120] Compuestos de antisentido quimericos contienen tfpicamente al menos una region modificada de modo que confieren una mayor resistencia a la degradacion por nucleasas, aumento de la captacion celular, aumento de la afinidad de union para el acido nucleico diana, y/o aumento de la actividad inhibidora. Una segunda region de un compuesto antisentido quimerico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un duplex ARN:ADN.
[0121] Los compuestos de antisentido que tienen un motivo de gapmero se consideran compuestos de antisentido quimericos. En un gapmero, una region interna que tiene una pluralidad de nucleotidos que soporta la escision de RNasaH se posiciona entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleotidos que son qmmicamente distintos de los nucleosidos de la region interna. En el caso de un oligonucleotido antisentido que tiene un motivo de gapmero, el segmento de hueco sirve generalmente como el sustrato para la escision de endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleosidos modificados. En una realizacion preferida, las regiones de un gapmero se diferencian por los tipos de restos de azucar que comprende cada region distinta. Los tipos de restos de azucar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gapmero puede, en algunas formas de realizacion incluir p- D-ribonucleosidos, p-D-desoxirribonucleosidos, nucleosidos 2’-modificados (tales nucleosidos 2’-modificados pueden
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incluir 2’-MOE, y nucleosidos modificados en el azucar bidclico (tales nucleosidos bidclicos modificados en el azucar pueden incluir los que tienen un puente 4’-(CH2)n-O-2’, donde n = 1 o n = 2). Preferiblemente, cada region distinta comprende restos de azucares uniformes. El motivo ala-ala-hueco se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la region de ala 5', "Y" representa la longitud de la region de hueco, y "Z" representa la longitud de la region de ala 3’. Cualquiera de los compuestos de antisentido descritos en este documento puede tener un motivo gapmero. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. Y puede estar entre 8 y 15 nucleotidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o mas nucleotidos. Por lo tanto, los gapmeros de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-10-4, 2-15-3, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-16-2, 1-18-1, 3-103, 2-10-2, 1-10-1 o 2-8-2.
[0122] En algunos casos, el compuesto antisentido como un motivo "wingmer", que tiene un ala-hueco o configuracion de brecha de ala, es decir, una configuracion X-Y o Y-Z como se describio anteriormente para la configuracion de gapmero. Por lo tanto, las configuraciones de alas de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10 o 8-2.
[0123] En una realizacion, los compuestos de antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 poseen un motivo gapmero 5-10-5.
[0124] En algunas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico CD40 tiene un motivo ensanchado con brechas. En otras realizaciones, un oligonucleotido antisentido dirigido a un acido nucleico CD40 tiene un motivo ensanchado con huecos.
[0125] En una realizacion, un oligonucleotido antisentido de hueco ensanchado dirigido a un acido nucleico CD40 tiene un segmento de hueco de catorce 2’-desoxirribonucleotidos posicionados entre los segmentos de ala de tres lados nucleosidos modificados qmmicamente. En una realizacion, la modificacion qmmica comprende una modificacion de azucar 2'. En otra realizacion, la modificacion qmmica comprende una modificacion de azucar 2'- MOE.
Acidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleotidos
[0126] Las secuencias de nucleotidos que codifican CD40 incluyen, sin limitacion, los siguientes: GENBANK N° de Acceso X60592.1, depositado primero con GENBANK® el 21 de abril, 1993 e incorporado en este documento como SEQ ID NO: 1; GeNbANK® N° de acceso H50598.1, depositado por primera vez con GENBANK® el 19 de septiembre de 1995, e incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 2; GENBANK N° de acceso AA203290.1, depositado por primera vez con GENBANK® el 25 de enero de 1997, e incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3; y los nucleotidos 9797000 a 9813000 del N° de acceso de GENBANK NT_011362.9, depositados por primera vez con GENBANK® el 29 de noviembre de 2000 e incorporados en la presente memoria como SEQ iD nO: 4, y el N° de acceso de GENBANK® BC064518.1, incorporado en la presente como SEQ ID NO: 237.
[0127] Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID N° en los ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificacion de un resto azucar, un enlace internucleosfdico o una base nucleotidica. Como tal, los compuestos de antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o mas modificaciones a un resto de azucar, un enlace internucleosido o una nucleobase. Los compuestos de antisentido descritos por Numero Isis (Isis No) indican una combinacion de secuencia de nucleobase y motivo.
[0128] Una region diana es una region estructuralmente definida del acido nucleico. Por ejemplo, una region diana puede abarcar una UTR 3’, una UTR 5’, un exon, un intron, una region codificadora, una region de iniciacion de la traduccion, region de terminacion de la traduccion u otra region de acido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para CD40 pueden obtenerse por numero de acceso a partir de bases de datos de secuencias tales como NCBI. Una region diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la region diana a un sitio diana 3’ de otro segmento diana dentro de la region diana.
[0129] La orientacion incluye la determinacion de al menos un segmento diana a la que un compuesto antisentido se hibrida, de manera que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reduccion en los niveles de acido nucleico diana de ARNm. En otras realizaciones, el efecto deseado es la reduccion de niveles de protema codificada por el acido nucleico diana o un cambio fenotfpico asociado con el acido nucleico diana.
[0130] Una region diana puede contener uno o mas segmentos objetivo. Multiples segmentos objetivo dentro de una region de destino pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden estar no superpuestos. En una realizacion, los segmentos diana dentro de una region diana estan separados por no mas de aproximadamente 300 nucleotidos. En otros procedimientos, los segmentos diana dentro de una region diana estan separados por no mas de aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleotidos sobre el acido nucleico diana. En otra realizacion, los segmentos diana dentro de una region diana estan separados por no mas de
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aproximadamente 5 nucleotidos sobre el acido nucleico diana. En realizaciones adicionales, los segmentos diana son contiguos.
[0131] Segmentos diana adecuados de la descripcion pueden ser encontrados dentro de un UTR 3’, una region codificante, una UTR 5’, un intron, o un exon. Los segmentos objetivo que contienen un codon de inicio o un codon de parada son tambien segmentos objetivo adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir espedficamente una cierta region estructuralmente definida tal como el codon de inicio o codon de parada.
[0132] La determinacion de segmentos diana adecuados pueden incluir una comparacion de la secuencia de un acido nucleico diana con otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes acidos nucleicos. Esta comparacion puede impedir la seleccion de secuencias de compuestos de antisentido que pueden hibridarse de una manera no espedfica con secuencias distintas de un acido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de diana).
[0133] Puede haber variacion en la actividad (por ejemplo, tal como se define por el porcentaje de reduccion de la meta de los niveles de acido nucleico) de los compuestos de antisentido dentro de una region diana activo. En una realizacion, las reducciones en los niveles de ARNm de CD40 son indicativas de la inhibicion de la expresion de CD40. Las reducciones en los niveles de una protema CD40 son tambien indicativas de la inhibicion de la expresion de ARNm diana. Ademas, los cambios fenotfpicos son indicativos de la inhibicion de la expresion de CD40. Por ejemplo, los cambios en la morfologfa celular en el tiempo o en la dosis de tratamiento, asf como los cambios en los niveles de componentes celulares tales como protemas, lfpidos, acidos nucleicos, hormonas, sacaridos o metales, son indicativos de la inhibicion de la expresion de CD40. La reduccion de los eosinofilos es indicativa de la inhibicion de la expresion de CD40. Las mediciones del estado celular que incluyen el pH, la etapa del ciclo celular, la ingesta o la excrecion de indicadores biologicos por la celula son tambien puntos finales de interes.
[0134] Analisis del genotipo de la celula (la medicion de la expresion de uno o mas de los genes de la celula) despues del tratamiento tambien se utiliza como un indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de CD40. Los genes Hallmark, o aquellos genes que se sospecha que estan asociados con un estado patologico espedfico, condicion o fenotipo, se miden tanto en celulas tratadas como no tratadas.
Estructura genomica, exones e intrones
[0135] Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como "intrones", que se escindio de una transcripcion antes de que se traduce. Las regiones restantes (y por lo tanto traducidas) se conocen como "exones" y se unen entre sf para formar una secuencia continua de ARNm. Los sitios de empalme dirigidos, es decir, las uniones intron-exon o las uniones exon-intron, tambien pueden ser particularmente utiles en situaciones en las que el empalme aberrante esta implicado en la enfermedad o cuando una sobreproduccion de un producto de empalme particular esta implicada en la enfermedad. Las uniones de fusion aberrantes debido a reordenamientos o deleciones son tambien sitios diana preferidos. Transcripciones de ARNm producidas a traves del proceso de empalme de dos (o mas) ARNms de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcripciones de fusion". Tambien se sabe que los intrones pueden dirigirse eficazmente usando compuestos de antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.
[0136] Tambien se conoce en la tecnica que los transcritos de ARN alternativos se pueden producir de la misma region genomica de ADN. Estas transcripciones alternativas se conocen generalmente como "variantes". Mas espedficamente, las "variantes pre-ARNm" son transcriptas producidas a partir del mismo ADN genomico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion de inicio o de parada y contienen secuencia intronica y exonica.
[0137] Tras la escision de una o mas regiones de exon o intronicas, o porciones de las mismas durante el empalme, variantes pre-ARNm producen mas pequenas "variantes de ARNm'". Consecuentemente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm unica debe producir siempre una variante unica de ARNm como resultado del empalme. Estas variantes de ARNm se conocen tambien como "variantes alternativas de empalme". Si no se produce el empalme de la variante pre-ARNm entonces la variante pre-ARNm es identica a la variante de ARNm.
Hibridacion
[0138] La hibridacion puede ocurrir entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un acido nucleico CD40. El mecanismo mas comun de hibridacion implica el enlace de hidrogeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido enlace de hidrogeno) entre nucleobases complementarias de las moleculas de acido nucleico.
[0139] La hibridacion puede producirse bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y estan determinadas por la naturaleza y composicion de las moleculas de acido nucleico a hibridar.
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[0140] Los metodos para determinar si una secuencia es espedficamente hibridable con un acido nucleico diana son bien conocidos en la tecnica. Los compuestos de antisentido descritos en el presente documento son espedficamente hibridables con un acido nucleico CD40.
Complementariedad
[0141] Un compuesto antisentido y un acido nucleico diana son complementarios entre sf cuando un numero suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden formar enlaces de hidrogeno con las nucleobases correspondientes del acido nucleico diana, de manera que se producira un efecto deseado (por ejemplo, antisentido inhibicion de un acido nucleico diana, tal como un acido nucleico CD40). [0142] nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un acido nucleico CD40 pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido sigue siendo capaz de hibridarse espedficamente a un acido nucleico diana. Ademas, un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o mas segmentos de un acido nucleico CD40 de tal manera que los segmentos intervinientes o adyacentes no estan implicados en el evento de hibridacion (por ejemplo, estructura de bucle, falta de coincidencia o estructura en horquilla).
[0143] En algunos casos, los compuestos de antisentido descritos en este documento son al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% complementarios a un acido nucleico CD40. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un acido nucleico diana se puede determinar usando metodos rutinarios. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una region diana, y por lo tanto se hibridarian especificamente, representarian una complementariedad del 90 por ciento. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sf o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que estan flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el acido nucleico diana, tendna un 77,8% de complejidad global con el acido nucleico diana y por lo tanto caena dentro del alcance de la presente invencion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas basicas de busqueda de alineacion local) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410, Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homologfa, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, Parque de Investigacion de la Universidad, Madison Wis. utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482, 489).
[0144] En otras realizaciones, los compuestos de antisentido proporcionados en este documento son totalmente complementarias (es decir, 100% complementarias) a un acido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un acido nucleico CD40, o una region diana, o un segmento diana o secuencia diana de la misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un acido nucleico diana.
[0145] La ubicacion de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo o 3’ de la 5 final del compuesto antisentido. Alternativamente, la o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posicion interna del compuesto antisentido. Cuando dos o mas nucleobases no complementarias estan presentes, pueden ser contiguas (es decir, enlazadas) o no contiguas. En una realizacion, una nucleobase no complementaria esta localizada en el segmento de ala de un oligonucleotido antisentido gapmero.
[0146] En una realizacion, compuestos de antisentido de hasta 20 nucleobases de longitud comprenden no mas de 4, no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 nucleobase no complementario (s) con respecto a un acido nucleico diana, tal como un acido nucleico CD40.
[0147] En otra realizacion, compuestos de antisentido de hasta 30 nucleobases de longitud comprenden no mas de 6, no mas de 5, no mas de 4, no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 nucleobase no complementaria ( s) con respecto a un acido nucleico diana, tal como un acido nucleico CD40.
[0148] Los compuestos de antisentido proporcionados en este documento tambien incluyen los que son complementarios a una porcion de un acido nucleico diana. Como se usa en la presente memoria, "porcion" se refiere a un numero definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una region o segmento de un acido nucleico diana. Una "porcion" tambien puede referirse a un numero definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En una realizacion, los compuestos de antisentido son complementarios de al menos una porcion de 8 nucleobases de un segmento diana. En otra realizacion, los compuestos de antisentido son complementarios de al menos una porcion de 12 nucleobases de un segmento diana. En otra realizacion mas, los compuestos de antisentido son complementarios a por lo menos una porcion de 15 nucleobases de un segmento diana. Tambien se contemplan compuestos de antisentido que son complementarios de al menos una porcion de nucleobase de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o mas de un segmento diana, o un intervalo definido por
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[0149] Los compuestos de antisentido proporcionados en este documento tambien pueden tener un porcentaje de identidad se define a una secuencia particular de nucleotidos, SEQ ID NO, o compuesto representado por un numero espedfico Isis. Como se usa aqm, un compuesto antisentido es identico a la secuencia descrita en este documento si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobasas. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de aDn descrita se considerana identico a la secuencia de ADN puesto que tanto el uracilo como la timidina se unen con adenina. Tambien se contemplan las versiones acortadas y alargadas de los compuestos de antisentido descritos en la presente memoria, asi como los compuestos que tienen bases no identicas con respecto a los compuestos de antisentido proporcionados aqui. Las bases no identicas pueden ser adyacentes entre sf o dispersadas a lo largo del compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el numero de bases que tienen pares de bases identicos con relacion a la secuencia a la que se compara.
[0150] Los compuestos de antisentido descritos en este documento son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identica a una o mas de la compuestos de antisentido o SEQ ID NOs, o una porcion de los mismos, descritos aqm.
Modificaciones
[0151] Un nucleosido es una combinacion de base-azucar. La porcion nucleobase (tambien conocida como base) del nucleosido es normalmente un resto base heterodclico. Los nucleotidos son nucleosidos que incluyen ademas un grupo fosfato unido covalentemente a la porcion de azucar del nucleosido. Para aquellos nucleosidos que incluyen un azucar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3’ o 5' del azucar. Los oligonucleotidos se forman a traves del enlace covalente de nucleosidos adyacentes entre sf, para formar un oligonucleotido polimerico lineal. Dentro de la estructura oligonucleotidica, los grupos fosfato se denominan comunmente por formar los enlaces internucleosidos del oligonucleotido.
[0152] Las modificaciones de los compuestos de antisentido comprenden sustituciones o cambios a enlaces internucleosfdicos, restos de azucar, o nucleobases. Los compuestos de antisentido modificados se prefieren a menudo a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular mejorada, afinidad mejorada para la diana de acido nucleico, estabilidad incrementada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora incrementada.
[0153] Nucleosidos qmmicamente modificados tambien se pueden emplear para aumentar la afinidad de union de un oligonucleotido antisentido acortado o truncado por su acido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos de antisentido mas cortos que tienen tales nucleosidos modificados qmmicamente.
Enlaces internucleosidos modificados
[0154] El enlace internucleosfdico de origen natural de ARN y ADN es un enlace 3’ a 5’ fosfodiester. Los compuestos de antisentido que tienen uno o mas enlaces internucleosidos modificados, es decir, no naturales, se seleccionan a menudo sobre compuestos de antisentido que tienen enlaces internucleosidos naturales, debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular mejorada, afinidad mejorada para acidos nucleicos diana y estabilidad incrementada en presencia de nucleasas.
[0155] Los oligonucleotidos que tienen enlaces internucleosidos modificados incluyen enlaces internucleosidos que retienen un atomo de fosforo, asf como enlaces internucleosidos que no tienen un atomo de fosforo. Los enlaces internucleosidos que contienen fosforo representativo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiesteres, fosfotriesteres, metilfosfonatos, fosfonoacetatos, fosforamidatos y fosforotioatos o fosforoditioatos. Los enlaces internucleosidos que no tienen un atomo de fosforo incluyen, entre otros, enlaces de metileno (metilimino) o MMI, enlaces de morfolino o enlaces de amida. En los acidos nucleicos peptfdicos (PNA), el esqueleto de azucar se reemplaza por una cadena principal que contiene amida.
Metodos de preparacion de enlaces que contienen fosforo y que no contienen fosforo son bien conocidos.
[0156] Ratentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de uniones que contienen fosforo
incluyen, pero no se limitan a, la patente de los Estados Unidos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243;
5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496;
5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361;
5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5,721,218; 5.672.697; 5.625.050 y US 6.693.187.
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[0157] Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de enlaces que no contienen fosforo incluyen, pero no se limitan a la patente de los Estados Unidos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439.
[0158] En una realizacion, los compuestos de antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 comprenden uno o mas enlaces internucleosidos modificados. En algunas realizaciones, los enlaces internucleosidos modificados son enlaces de fosforotioato. En otras realizaciones, cada enlace internucleosido de un compuesto antisentido es un enlace internucleosido fosforotioato.
Motivos de azucar modificados
[0159] Los compuestos de antisentido descritos en este documento pueden contener opcionalmente uno o mas nucleosidos en el que el grupo azucar se ha modificado. Tales nucleosidos modificados con azucar pueden impartir mayor estabilidad a las nucleasas, mayor afinidad de union o alguna otra propiedad biologica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleosidos se modifican por modificacion del anillo de ribofuranosa. Tales modificaciones incluyen, sin limitacion, la adicion de grupos sustituyentes, el puente de atomos de anillo no geminales para formar un acido nucleico biciclico (BNA), como en acidos nucleicos bloqueados (LNA), la sustitucion del atomo de oxfgeno de anillo de ribosilo por S, N(R), o C(R1) (R)2 (R = H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azucares modificados qmmicamente incluyen nucleosido sustituido con 2’-F-5’-metilo (vease la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21 de agosto de 2008 para otros nuclosidos 5', 2’-bis sustituidos) o reemplazo del atomo de oxfgeno del anillo de ribosilo con S con sustitucion adicional en la posicion 2' (vease la Solicitud de Patente de EE.UU. publicada US2005 - 0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitucion en 5’ de un BNA (vease la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 Publicada el 22 de noviembre de 2007 en la que LNA esta sustituida con, por ejemplo, un grupo 5’-metilo o 5’-vinilo).
[0160] Ejemplos de nucleosidos que tienen restos de azucares modificados incluyen, sin limitacion nucleosidos que comprenden grupos sustituyentes 5’-vinilo, 5’-metilo (R o S), 4’-S, 2’-F, 2'-OCH3 (conocido como 2'-OMe) y 2'O- (CH2)2OCH3 (conocidos como 2’MOE). El sustituyente en la posicion 2’ tambien puede ser seleccionado de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, O-CH2CH2CH2NH2, O(CH2)2SCH3, o (CH2)2-ON (Rm) (Rn), tales como 2'dimetilaminooxietoxi (2’-O-(CH2)2ON(CH3)2 o 2'-DMAOE), o (CH2)2-O-(CH2)2-N (Rm) (Rn), tales como 2'- dimetilaminoetoxietoxi (2’-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N (CH3 )2o 2'-DMAEOE y o-CH2-C(=O)-N (Rm) (Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
[0161] Los ejemplos de acidos nucleicos bidclicos (BNA) incluyen, sin limitacion de nucleosidos que comprenden un puente entre los atomos de anillo ribosilo 4’ y 2’, por ejemplo un puente 4’-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido proporcionados en este documento incluyen uno o mas nucleosidos BNA en el que el puente comprende una de las formulas: 4'-(CH2)-O-2’ (LNA); 4'-(CH2)-S-2’; 4'-(CH2)-O- 2’ (LNA); 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-C(CHa)2-O-2' (vease PCT/US2008/068922); 4'-CH(CHa)-O-2’ y 4’ CH (CH2OCH3)- O-2’ (vease la patente uS 7.399.845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-CH2-N(OCH3)-2’ (vease PCT/LTS2008/064.591); 4'-CH2-ON(CHa)-2’ (vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre del 2004); 4'-cH2-N(R)-O-2’ (vease Patente de Estados Unidos 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(CHa)-2’ y 4'-CH2-C(=CH2)-2’ (vease PCT/US2008/066154); y en donde R es, independientemente, H, alquilo C1-C12, o un grupo protector. Cada uno de los anteriores BNAs incluyen varias configuraciones de azucar estereoqmmicas incluyendo, por ejemplo a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (vease el documento WO99/14226).
[0162] En ciertas realizaciones, los nucleosidos se modifican por sustitucion del anillo de ribosilo con un sustituto de azucar. Tal modificacion incluye, sin limitacion, la sustitucion del anillo de ribosilo con un sistema de anillo sustituto (a veces referido como analogos de ADN) tal como un anillo morfolino, un anillo ciclohexenilo, un anillo de ciclohexilo o un anillo de tetrahidropiranilo tales como uno que tiene uno de la formula:
en donde Bx es un resto de base heterodclica opcionalmente protegida.
[0163] Muchos otros sistemas de anillo de sustituto de azucar bidclico y tridclico tambien se conocen en la tecnica que se puede utilizar para modificar los nucleosidos para la incorporacion en compuestos de antisentido (vease por
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ejemplo Leumann, CJ, Bioorg. Med. Chem. 10, (2002), 841-854). Tales sistemas de anillo pueden someterse a diversas sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
[0164] Los metodos para las preparaciones de azucares modificados son bien conocidos para los expertos en la tecnica. Patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de azucares modificados incluyen, pero no se limitan a la patente de EE.UU. No.4,981, 957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5446, 137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
[0165] En ciertas realizaciones, un nucleosido modificado en 2' tiene un resto de azucar bidclico. En ciertas de dichas realizaciones, el resto de azucar bidclico es un azucar D en la configuracion alfa. En ciertas de dichas realizaciones, el resto de azucar bidclico es un azucar D en la configuracion beta. En ciertas de dichas realizaciones, el resto de azucar bidclico es un azucar L en la configuracion alfa. En ciertas de dichas realizaciones, el resto de azucar bidclico es un azucar L en la configuracion beta.
[0166] En ciertas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende un grupo puente entre los atomos de carbono 2’ y 4’. En ciertas de dichas realizaciones, el grupo puente comprende de 1 a 8 grupos birradicales vinculados. En ciertas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende de 1 a 4 grupos birradicales vinculados. En ciertas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende 2 o 3 grupos birradicales vinculados. En ciertas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende 2 grupos birradicales vinculados. En ciertas realizaciones, un grupo birradical ligado se selecciona de -O-, -S-, -N(R1)-, -C(R1) (R2)-, -C(R1) = C(R1) -, -C(R1) = N-, -C (= NR1)-, -Si (R1) (R2)-, -S (= O)2-, -S(=O)-, -C(=O)- y -C (= S) -; donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo sustituido C1-C12, alquenilo C2-C12 alquenilo, sustituido alquenilo C2-C12, alquinilo C2-C12, alquinilo sustituido C2-C12, cicloalquilo C5-C20 arilo, arilo sustituido C5-C20, un radical heterociclo, un heterociclo sustituido radical, heteroarilo, heteroarilo sustituido, cicloalquilo C5-C7 alidclico radical sustituido alidclico radical, halogeno, oxi sustituido, cicloalquilo C5-C7 (-O-), amino, amino, azido, carboxilo, carboxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, CN, tiol, tiol sustituido, sulfonilo (S(=O)2-H), sulfonilo sustituido, sulfoxilo (S(=O)-H) o sustituido sulfoxilo; y cada grupo sustituyente es, independientemente, halogeno, alquilo C1-C12, alquilo sustituido C1-C12, alquenilo C2-C12 alquenilo, alquenilo sustituido C2-C12, alquenilo C2-C12, alquinilo sustituido C2-C12, alquinilo, amino, amino sustituido, acilo, acilo sustituido, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 aminoalcoxi, aminoalquilo sustituido C1-C12 sustituidos aminoalcoxi C1-C12 o un grupo protector.
[0167] En algunas realizaciones, el resto de azucar bidclico se puentea entre el 2’ y 4’ atomos de carbono con un grupo birradical seleccionado de -O-(CH2) p-, -O-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(alquilo)-, -NH-(CH2) p-, -N(alquilo)-(CH2) p-, -O-CH(alquilo)-, -(CH(alquilo))-(CH2)p-, -NH-O-(CH2)p-, - N(alquilo)-O-(CH2)p-, o -ON(alquilo)-(CH2)p-, en donde p es 1,2, 3, 4 o 5 y cada grupo alquilo puede estar sustituido adicionalmente. En ciertas realizaciones, p es 1, 2 o 3.
[0168] En un aspecto, cada uno de dichos puentes es, independientemente, -[C(R1) (R2)]n-, -[C(R1) (R2)]n-O-, - C(R1R2)-N(R1)-O- o -C(R1R2)-ON(R1)-. En otro aspecto, cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, 4'-(CH2)3-2’, 4'-(CH2)2-2’, 4’-CH2-O-2', 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-ON(R1)-2’ y 4 ’CH2-N (R1)-O-2’-, en el que cada R1 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
[0169] En los nucleotidos que tienen restos modificados de azucar, los restos de nucleobases (naturales, modificados o una combinacion de los mismos) se mantienen para la hibridacion con una diana de acido nucleico apropiado.
[0170] Los compuestos de antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 descrito en este documento pueden comprender uno o mas nucleotidos que tienen restos de azucar modificados. En una realizacion preferida, el resto de azucar modificado es 2’-MOE. Los nucleotidos modificados por 2'MOE estan dispuestos en un motivo gapmero.
Nucleobases modificadas
[0171] Modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases de origen natural o no modificadas sinteticas. Tanto nucleobases naturales como modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrogeno. Tales modificaciones de nucleobases pueden impartir estabilidad nucleasa, afinidad de union o alguna otra propiedad biologica beneficiosa para compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sinteticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones 5- metilcitosina, son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union de un compuesto antisentido para un acido nucleico diana. Por ejemplo, las sustituciones 5-metilcitosina han demostrado aumentar la estabilidad del duplex de acido nucleico mediante 0,6-1,2°C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
[0172] Nucleobases no modificadas adicionales incluyen citosina de 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C = C-CH3) uracilo y
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citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidmicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8- sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-deazaadenina.
[0173] Restos de base heterodclica tambien pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union de los compuestos de antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y N-2, N-6 y 0-6 purinas sustituidas, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
[0174] Los metodos para la preparacion de nucleobases modificadas son bien conocidos para los expertos en la tecnica. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparacion de nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a las patentes de EE.UU. N° 3.687.808, asf como la Patente de los Estados Unidos. Nos 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.750.692 y 5.681.941.
[0175] En una realizacion, los compuestos de antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 comprenden una o mas nucleobases modificadas. En una realizacion adicional, los oligonucleotidos de antisentido ensanchados por hueco dirigidos a un acido nucleico CD40 comprenden una o mas nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En realizaciones adicionales, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Compuestos de antisentido conjugados
[0176] Los compuestos de antisentido pueden ser unidos covalentemente a uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad, la distribucion celular o la captacion celular de los oligonucleotidos de antisentido resultantes. Grupos conjugados tfpicos incluyen restos de colesterol y restos lipfdicos. Grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescemas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
[0177] Los compuestos de antisentido tambien se pueden modificar para tener uno o mas grupos estabilizadores que son generalmente unidos a uno o ambos extremos terminales de compuestos de antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en grupos estabilizadores son estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene acido nucleico de terminales de la degradacion de exonucleasa, y puede ayudar en la administracion y/o localizacion dentro de una celula. La tapa puede estar presente en el extremo 5' (5’-tapa), o en el extremo 3’ (3’-tapa), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Estructuras de tapa son bien conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, tapas invertidas abasicas desoxi. Ademas, grupos estabilizadores 3’ y 5’ que se pueden utilizar para limitar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa 5' de estabilizacion incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Composiciones y metodos para la formulacion de composiciones farmaceuticas
[0178] Los oligonucleotidos de antisentido se pueden mezclar con sustancias activas y/o inertes farmaceuticamente aceptables para la preparacion de composiciones farmaceuticas o formulaciones. Composiciones y metodos para la formulacion de composiciones farmaceuticas que dependen de una serie de criterios, incluyendo, pero no limitados a, via de administracion, extension de la enfermedad, o la dosis a administrar.
[0179] Compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico de CD40 puede ser utilizado en composiciones farmaceuticas mediante combinacion del compuesto antisentido con un diluyente farmaceuticamente aceptable o portador adecuado. Un diluyente farmaceuticamente aceptable incluye por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato de ejemplo (PBS). PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones para ser administrado parenteralmente. Por consiguiente, en una realizacion, empleada en los metodos descritos en este documento es una composicion farmeceutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico de CD40 y un diluyente farmaceuticamente inaceptable. En una realizacion, el diluyente farmaceuticamente aceptable es PBS. En otras realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido.
[0180] Las composiciones farmaceuticas que comprenden compuestos de antisentido abarcan cualesquiera sales farmaceuticamente aceptables, esteres, o sales de tales esteres, o cualquier otro oligonucleotido que, tras la administracion a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biologicamente activo del mismo. De acuerdo con ello, por ejemplo, la divulgacion tambien se extrae de las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos antisentido, profarmacos, sales farmaceuticamente aceptables de dichos profarmacos y otros bioequivalentes. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sales de potasio, y sodio.
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[0181] Un profarmaco puede incluir la incorporacion de nucleosidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinde por nucleasas endogenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
[0182] Tambien se describe en el presente documento composiciones farmaceuticas y formulaciones que incluyen los compuestos antisentido descritos en este documento. Las composiciones farmaceuticas para uso de acuerdo con la presente invencion se pueden administrar en un numero de maneras, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistemico y del area a ser tratada. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a las membranas mucosas incluyendo vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye la administracion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular o infusion; o intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular, administracion. Los oligonucleotidos con al menos una modificacion 2’-O-metoxietilo se cree que son particularmente utiles para administracion oral.
[0183] Las composiciones farmaceuticas y formulaciones para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, lfquidos y polvos. Vehuculos farmaceuticos convencionales, acuosos, bases en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Condones recubiertos, guantes y similares tambien pueden ser utiles.
[0184] Las formulaciones farmaceuticas para uso de acuerdo con la presente invencion, que pueden ser convenientemente presentadas en forma de dosificacion unitaria, se pueden preparar de acuerdo con tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Tales tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los ingredientes activos con el vehuculo farmaceutico (s) o excipiente (s). En general, las formulaciones se preparan poniendose uniforme e mtimamente en asociacion los ingredientes activos con vehuculos lfquidos o vehuculos solidos finamente divididos o ambos, y despues, si es necesario, dando forma al producto.
[0185] Las composiciones para uso de acuerdo con la presente invencion pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tales como, pero no limitados a, tabletas, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invencion tambien pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener ademas sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizadores.
[0186] Las composiciones farmaceuticas para uso de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones farmaceuticas y formulaciones de la presente invencion pueden comprender potenciadores de uno o mas de penetracion, vehfculos, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos.
[0187] Las emulsiones son normalmente sistemas heterogeneos de un lfquido disperso en otro en forma de gotitas por lo general superiores a 0,1 pm de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales ademas de las fases dispersadas y el farmaco activo que puede estar presente como una solucion, ya sea en la fase acuosa, la fase aceitosa o como una fase separada. Las microemulsiones se incluyen como una realizacion de la presente invencion. Emulsiones y sus usos son bien conocidos en la tecnica y se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos. No. 6.287.860.
[0188] Las formulaciones para uso de acuerdo con la presente invencion incluyen formulaciones liposomales. Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino "liposoma" significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa esferica o bicapas. Los liposomas son vesfculas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion a ser administrada. Los liposomas cationicos son liposomas que se cree que interactuan con las moleculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable con carga positiva. Los liposomas que son sensibles al pH o negativamente cargadis se cree que atrapan el ADN en lugar de complejo. Ambos liposomas cationicos y no cationicos se han utilizado para suministrar ADN a las celulas.
[0189] Los liposomas tambien incluyen liposomas "estericamente estabilizados", un termino que, como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, dan lugar a tiempos de vida de circulacion mejorada en relacion con liposomas que carecen de tales lfpidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estericamente son aquellos en los que parte de la porcion de lfpido formador de vesfculas de liposoma comprende uno o mas glicolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos. N° 6.287.860.
[0190] Se describen otros liposomas o sistemas de administracion basados en lfpidos conocidos en la tecnica, por ejemplo en el documento WO 05/105152; WO 06/069782; Morrissey et al, Nature Biotechnology, 23 (8), 1002-1007., 2005; WO 05/007196; Wheeler et al, Gene Therapy, 6 (2), 271-281., 1999; WO 02/34236; Budker et al, Nature
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Biotechnology, 14 (6), 760-764., 1996; US 5.965.434; US 5.635.487; Spagnou et al, Biochemistry, 43 (42), 13.348 a 13.356., 2004; US 6.756.054; WO 06/016097 y US 5.785.992; WO 04/035523.
[0191] En una realizacion preferida de la invencion los liposomas anfoteros se pueden usar como formulaciones que incluyen los compuestos de antisentido mencionadas en las reivindicaciones. Liposomas anfotericos son una clase de liposomas que tienen un tensioactivo anionico o carga neutra a pH 7,5 y una carga cationica a un pH de 4. Se hace referencia al documento WO 02/066012 por Panzner et al. El uso, la seleccion y la fabricacion de liposomas anfoteros para la transfeccion de las celulas se describe adicionalmente en el documento WO 05/094783 de Endert et al., WO 07/031333 de Panzner et al., WO 07/107304 de Panzner et al. y WO 08/043575 de Panzner et al. Liposomas anfoteros tienen una excelente biodistribucion y son bien tolerados en animales. Pueden encapsular moleculas de acido nucleico con alta eficiencia. WO 06/048329 de Panzner et al., describe composiciones farmaceuticas que comprenden liposomas anfoteros y oligonucleotidos que estan adaptados para dirigir acidos nucleicos que codifican CD40.
[0192] Por "anfotero" se entiende en este documento que los liposomas comprenden grupos cargados tanto de caracter anionico como cationico en que:
(i) al menos uno de los grupos cargados tiene un pKa entre 4 y 7,4,
(ii) la carga cationica prevalece a pH 4 y
(iii) la carga anionica prevalece a pH 7,4;
con lo que los liposomas tienen un punto isoelectrico de carga neta cero entre pH 4 y pH 7,4. caracter anfotero, segun esta definicion, es diferente de "caracter zwitterionico", debido a iones tnbridos no tienen un pKa en el intervalo mencionado anteriormente. En consecuencia, zwitteriones son esencialmente neutrales en un intervalo de valores de pH. Fosfatidilcolina o fosfatidiletanolaminas, por ejemplo, son lfpidos neutros, con caracter de ion tnbrido.
[0193] Liposomas anfoteros pueden estar formados de una fase lipfdica que comprende un lfpido anfotero. En algunas realizaciones dicha fase lipfdica puede comprender 5 a 30 mol.% de dicho lfpido anfotero, preferiblemente 10 a 25 mol.%.
[0194] Lfpidos anfoteros adecuados se describen en el documento WO 02/066489 y WO 03/070735 por Panzner et al. Preferentemente, dicho lfpido anfotero se selecciona del grupo que consiste en HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, acilcarnosina y HCChol. (Un glosario de tales formas abreviadas de los nombres de los lfpidos denominados en este documento se incluye a continuacion para facilitar la referencia. Un numero de tales abreviaturas son las que se usan comunmente por los expertos en la tecnica.)
[0195] Alternativamente, dichos liposomas anfoteros pueden estar formados de una fase lipfdica que comprende una mezcla de componentes de lfpidos con propiedades anfoteras. Tales liposomas anfoteros pueden formarse a partir de componentes anionicos y/o cationicos sensibles al pH, como se describe por ejemplo en WO 02/066012. Los lfpidos cationicos sensibles a pH se describen en WO 02/066489 y WO 03/070220 y en las referencias que se hacen en el mismo, en particular en Budker, et al. 1996, Nat Biotechnol. 14 (6): 760-4, y se puede utilizar en combinacion con lfpidos anionicos constitutivamente cargados o con lfpidos anionicos que son sensibles al pH.
[0196] Alternativamente, la carga cationica puede ser introducida a partir de lfpidos constitutivamente cargados que son conocidos por los expertos en la tecnica en combinacion con un pH lfpido anionico sensible. Las combinaciones de lfpidos anionicos y cationicos constitutivamente cargados, por ejemplo DOTAP y DPPG, no se prefieren. Asf, en algunas formas de realizacion actualmente preferidas de la invencion, dicha mezcla de los componentes de lfpidos puede comprender (i) un lfpido cationico estable y un lfpido anionico cargable, (ii) un lfpido cationico cargable y ifpido anionico cargable o (iii) un lfpido anionico estable y un lfpido cationico cargable.
[0197] Componentes cationicos preferidos incluyen DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC-Chol, DOTMA, DOGS, (C18)2Gly+N, N-dioctadecilamido-glicina, CTAB, CPyC, DODAP y DOEPC.
[0198] Lfpidos anionicos preferidos para uso con la invencion incluyen DOGSucc, POGSucc, DMGSucc, DPGSucc, DMPS, DPPS, DOPS, POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA, DOPA, POPA, CHEMS y CetylP.
[0199] Preferiblemente, una mezcla de este tipo anfotero de lfpidos no constituye mas de aproximadamente 70 mol.% de la fase lipfdica. En algunas realizaciones, dicha mezcla puede constituir no mas de 50% en moles de la fase lipfdica; preferiblemente dicha fase lipfdica comprende aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mol.% de tal mezcla.
[0200] En algunas realizaciones, dicha fase lipfdica puede comprender ademas un lfpido neutro, preferiblemente un fosfolfpido neutro, tal como una fosfatidilcolina. Fosfatidilcolinas preferidas actualmente incluyen POPC, haba de soja Pc natural o hidrogenado, PC de huevo natural o hidrogenado, DMPC, DPPC, dSpC y DOPC. Mas preferiblemente, dicha fosfatidilcolina comprende POPC, PC de soja no hidrogenado o PC de huevo no hidrogenado.
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[0201] La fase lipfdica puede comprender al menos 15 mol.% de dicha fosfatidilcolina, preferiblemente al menos 20 mol.%. En algunas realizaciones, dicha fase lipfdica puede comprender no menos de aproximadamente 25 mol.% de fosfatidilcolina. Alternativamente, dicha fase lipfdica puede comprender no menos de aproximadamente 40 mol.% de fosfatidilcolina.
[0202] Una formulacion actualmente preferida de acuerdo con la presente invencion comprende un liposoma que tiene de aproximadamente 60 mol.% de POPC, aproximadamente 10 mol.% de DOTAP y aproximadamente 30 mol.% de CHEMS.
[0203] En algunas realizaciones dicho lfpido neutro puede comprender una fosfatidiletanolamina o una mezcla de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. Dichas fosfatidilcolinas neutras o fosfatidiletanolaminas o mezclas de ambas pueden estar presentes en la fase lipfdica en la cantidad molar (mol.%) no constituida por los otros componentes de la fase lipfdica, pero al menos 20 mol.% (siendo el total de la fase lipfdica 100 mol.%).
[0204] Fosfatidiletanolaminas preferidas incluyen DOPE, DMPE y DPPE.
[0205] En algunas realizaciones dicho lfpido neutro puede comprender POPC y DOPE.
[0206] Ventajosamente, dicha fase lipfdica puede comprender una mezcla de lfpidos anionicos y cationicos con propiedades de anfotero, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. Liposomas anfotericos formados a partir de una fase de tales lfpidos pueden ser estables en suero y por lo tanto adecuados para la administracion sistemica. Preferiblemente, dicha fase lipfdica comprende MoChol como un lfpido cationico y CHEMS o DMG-Succ como un lfpido anionico.
[0207] Liposomas anfoteros ademas actualmente preferidos para uso como formulaciones que incluyen los compuestos de antisentido de la presente invencion pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en:
(a) aproximadamente 15% en moles de POPC, alrededor del 45% en moles de DOPE, aproximadamente el 20% en moles MoChol y aproximadamente 20 mol% CHEMS;
(b) aproximadamente 10% en moles de POPC, alrededor del 30% en moles de DOPE, aproximadamente el 30% en moles MoChol y aproximadamente 30 mol% CHEMS;
(c) aproximadamente 10% en moles de POPC, alrededor del 30% en moles de DOPE, aproximadamente el 20% en moles MoChol y aproximadamente 40 mol% CHEMS;
(d) aproximadamente 6 mol.% POPC, aproximadamente 24 mol.% DOPE, aproximadamente 47 mol.% MoChol y aproximadamente 23 mol.% CHEMS.
[0208] Alternativamente, dicha fase lipfdica puede comprender una mezcla de lfpidos anionicos y cationicos con propiedades anfoteras, una fosfatidilcolina neutral y colesterol. Tales liposomas tambien pueden ser estables en suero. En algunas realizaciones, dicha fase lipfdica puede comprender de 30 mol.% a 50 mol.% de colesterol, preferiblemente de aproximadamente 35 mol.% a aproximadamente 45 mol.%. Alternativamente, dicha fase lipfdica puede comprender fosfatidilcolina y de 10 mol.% a 25 mol.% de colesterol, preferiblemente de aproximadamente 15 mol.% a aproximadamente 25 mol.%.
[0209] Una formulacion actualmente preferida comprende 10 a 25 mol.% de lfpidos anfoteros, por ejemplo HistChol, HistDG o acilcarnosina, 15 a 25 mol.% de colesterol y siendo el resto POPC, haba de soja PC, PC de huevo, DMPC, DPPC o DOPC, preferiblemente POPC; por ejemplo de aproximadamente 60 mol.% POPC, aproximadamente 20 mol.% HistChol y aproximadamente 20 mol.% Chol.
[0210] Otra formulacion actualmente preferida de acuerdo con la presente invencion comprende un liposoma que incluye una mezcla de componentes lipfdicos con propiedades anfoteras y que tienen de aproximadamente 30 mol.% POPC, aproximadamente 10 mol.% DOTAP, alrededor de 20 mol.% CHEMS y aproximadamente 40 mol.% Chol.
[0211] Los liposomas anfoteros pueden tener un tamano en el intervalo de 50 a 500 nm, preferiblemente de 100 a 500 nm, mas preferiblemente 150 y 300 nm.
[0212] Las formulaciones de liposomas anfoteros para su uso segun la presente invencion se pueden formular para su uso como un coloide en un vehfculo farmacologicamente aceptable adecuado. Vehfculos tales como agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato y similares son bien conocidos para los expertos en la tecnica para este proposito.
[0213] En algunas realizaciones, las formulaciones de liposomas anfoteros para su uso segun la presente invencion pueden administrarse a un pH fisiologico de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8. Para este fin, la formulacion que comprende el compuesto antisentido, excipiente y vehfculo se puede formular para tener un pH en este intervalo.
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[0214] Las formulaciones de liposomas anfoteros para su uso segun la invencion pueden ser fabricadas usando metodos adecuados que son conocidos para los expertos en la tecnica. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, extrusion a traves de membranas de tamano de poro definido, la inyeccion de soluciones de lfpidos en etanol en una fase de agua que contiene la carga a ser encapsulada, o la homogeneizacion a alta presion.
[0215] Una solucion del oligonucleotido puede ponerse en contacto con dicho excipiente a un pH neutro, lo que resulta en la inclusion de volumen de un cierto porcentaje de la solucion. Altas concentraciones del excipiente, que van desde aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM, se prefiere para lograr la encapsulacion sustancial del agente activo.
[0216] Liposomas anfoteros utilizados como formulaciones de acuerdo con la presente invencion ofrecen la ventaja de oligonucleotidos de union en o por debajo de su punto isoelectrico, concentrando de ese modo dicho agente activo en la superficie del liposoma. Este proceso se describe con mas detalle en el documento WO 02/066012.
[0217] Independientemente del proceso de produccion real utilizado para hacer las formulaciones de liposomas anfoteros, en algunas realizaciones, oligonucleotido no encapsulado puede ser retirado de los liposomas despues de la etapa de produccion inicial en la que los liposomas se forman recipientes como estrechos. Una vez mas, la literatura tecnica y las referencias incluidas en este documento describen dicha metodologfa en detalle y pasos de proceso adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, cromatograffa de exclusion por tamano, sedimentacion, dialisis, ultrafiltracion y diafiltracion.
[0218] Sin embargo, no se requiere la eliminacion de cualquier oligonucleotido no encapsulado para la realizacion de la invencion, y en algunas realizaciones la composicion puede comprender farmaco libre, asf como atrapado.
[0219] En algunos aspectos de la invencion, las formulaciones de liposomas anfoteros, que incluyen los compuestos de antisentido mencionados en las reivindicaciones pueden usarse como composiciones farmaceuticas para la prevencion o tratamiento de un trastorno inflamatorio, inmunologico o autoinmune de un animal humano o no humano tal como rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huesped, esclerosis multiple, eritematoso lupus sistemico, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis o tiroiditis, enfermedad de Crohn y Colitis ulcerosa.
Glosario de nombres de lipidos abreviados comunes
[0220]
DMPC Dimiristoilfosfatidilcolina DPPC DiPalmitoflofosfatidilcolina DSPC Diestearoilfosfatidilcolina POPC Palmitono-oleoilfosfatidilcolina DOPC Dioleoilfosfatidilcolina DOPE Dioleoilfosfatidiletanolamina DMPE Dimiristoilfosfatidiletanolamina DPPE DiPalmitoflofosfatidiletanolamina DOPG Dioleilfosfatidilglicerol POPG Palmitono-oleoilfosfatidilglicerol DMPG Dimiristoilfosfatidilglicerol DPPG Dipalmitonofosfatidilglicerina DMPS Dimiristoilfosfatidilserina DPPS Dipalmitonofosfatidilserina DOPS Dioleoilfosfatidilserina POPS Palmitono-oleoilfosfatidilserina DMPA Acido dimiristoilfosfatidico DPPA Acido dipalmitoMofosfatfdico DOPA Acido dioleoilfosfatfdico POPA Acido palmitono-oleoilfosfatfdico CHEMS Colesterolhemisuccinato
DC-Chol 3-p-[N-(N',N’-dimetiletano) carbamoMo] colesterol CetylP Cetilfosfato
DODAP (1,2)-dioleoiloxipropilo)-N,N-dimetilamonio cloruro DOEPC 1,2-dioleono-sn-glicero-3-etilfosfocolina DAC-Chol 3-(3-[N-(N,N’-dimetiletano) carbamoflo] colesterol TC-Chol 3-p-[N-(N,’N',N’-trimetilaminoetano) carbamoflo] colesterol DOTMA (1,2-dioleiloxipropil)-N,N,N-trimetilammoniumchlorid) (Lipofectin®)
DOGS ((C18)2GlySper3+) N,N-dioctadecilamido-glicilo-espermina (Transfectam®)
CTAB Cetilo-trimetilamonio,
CPyC Cetilo-piridiniocloruro
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DOTAP (1,2-dioleoiloxipropilo)-N,N, sal de N-trimetilamonio DMTAP (1,2-dimiristoiloxipropilo)-N,N,N-trimetilamonio sal DPTAP (1,2-dipalmitoiloxipropilo)-N,N, sal de N-trimetilamonio DOTMA (1,2-dioleiloxipropil)-N,N,N-trimetilamonio cloruro)
DORIE (1,2-dioleiloxipropilo)-3 amoniobromuror dimetilhidroxietilo)
DDAB Bromuro de dimetildioctadecilamonio
DPIM 4-(2,3-bis-palmitefflooxi-propilo)-1-metilo-1H-imidazol
CHIM Histaminilo-Colesterolcarbamato
MoCol 4-(2-aminoetilo)-Morfolino-Colesterolhemisuccinato
HisCol Histaminilo-Colesterolhemisuccinato.
HCCol Na-Histidinilo-Colesterolcarbamato HistCol Na-Histidinilo-colesterol-hemisuccinato.
AC Acilcarnosina, estearilo- & Palmitoilcarnosina
HistDG 1,2-Dipalmitoffoglicerol-hemisuccinato-Na-Histidinilo-hemisuccinato, y diestearoffo-, dimiristoffo-, dioleoffo- o palmitoffo-oleoilderivados
IsoHistSuccDG 1,2-Dipalmiteffloglicerol-Oa-Histidinilo-Na-hemisuccinato, y diestearoffo-, dimiristoffo-, dioleoffo- o Palmitoffo-oleoilderivados
DGSucc 1,2-Dipalmitoiglicerol-3-hemisuccinato y diestearoffo-, dimiristoffo- dioleoffo- o palmitoffo-oleoilderivados
[0221] Las formulaciones y composiciones farmaceuticas para uso de acuerdo con la presente invencion tambien pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmaceuticos, formulaciones y emulsiones es bien conocido en la tecnica. Los surfactantes y sus usos se describen adicionalmente en la patente de los Estados Unidos. No. 6.287.860. En una realizacion, la presente invencion emplea varios potenciadores de penetracion para efectuar la administracion eficiente de los acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar a la difusion de farmacos no lipofflicos a traves de las membranas celulares, los potenciadores de penetracion tambien potencian la permeabilidad de farmacos lipofflicos. Potenciadores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a una de las cinco amplias categonas, es decir, agentes tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no quelantes no tensioactivos. Potenciadores de la penetracion y sus usos se describen adicionalmente en la patente de los Estados Unidos. No. 6.287.860.
[0222] Un experto en la tecnica reconocera que las formulaciones estan disenadas de forma rutinaria de acuerdo con su uso previsto, es decir, la via de administracion.
[0223] Las formulaciones preferidas para la administracion topica incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la invencion estan en mezcla con un agente de administracion topica como por ejemplo ffpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lfpidos y liposomas preferidos incluyen ffpidos neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidilo etanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilo colina DMPC, distearolifosfatidilo colina) negativo (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilo glicerol DMPG); cationicos (por ejemplo dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y DOTMA dioleoilfosfatidilo etanolamina) o ffpidos anfoteros o mezclas en las que una mezcla de ffpidos cationicos y anionicos muestra propiedades anfoteras. Para la administracion topica u otra, los oligonucleotidos de la invencion pueden ser encapsulados dentro de liposomas o pueden formar complejos de los mismos, en particular para los liposomas cationicos. Alternativamente, los oligonucleotidos pueden formar complejos con los ffpidos, en particular, a los ffpidos cationicos. Prefieren los acidos y esteres grasos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos. N° 6.287.860. Las formulaciones topicas se describen en detalle en la solicitud de patente de EE.UU. N° 09/315.298 presentada el 20 de mayo de 1999.
[0224] Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas,
nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, sobrecitos, comprimidos o minitabletas. Espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, coadyuvantes de dispersion o aglutinantes pueden ser deseables. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las que oligonucleotidos de la invencion se administran en combinacion con potenciadores de uno o mas de penetracion de agentes tensioactivos y quelantes. Los tensioactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Acidos biliares preferidos/sales y acidos grasos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos. No. 6.287.860. Tambien se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y AUDC. Otros
potenciadores de la penetracion incluyen eter de polioxietileno-9-laurilo, eter de polioxietileno-20-cetilo. Los oligonucleotidos pueden estar administrados por via oral, en forma granular que incluye parffculas secas
pulverizadas, o complejadas para formar micro o nanoparffculas. Agentes complejantes de oligonucleotidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de los Estados Unidos N° 6.287.860. Las formulaciones orales para
oligonucleotidos y su preparacion se describen en detalle en la patente de los Estados Unidos N° 6.887.906, la
solicitud de patente de Estados Unidos Nos 09/315.298 (presentada el 20 de mayo de 1999) y US 2003-0027780 A1.
[0225] Las composiciones y formulaciones para la administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados
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tales como, pero no limitados a, potenciadores de la penetracion, compuestos portadores y otros vetnculos o excipientes farmaceuticamente aceptables.
[0226] Tambien se describen en este documento composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes activos que funcionan por un mecanismo no antisentido, tal como por ejemplo, agentes quimioterapeuticos o farmacos antiinflamatorios. Ejemplos de tales agentes quimioterapeuticos incluyen, pero no se limitan a los farmacos quimioterapeuticos contra el cancer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, arabinosido de citosina, bis-cloroetilnitrosourea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas nitrogenadas, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16 ), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se utiliza con los compuestos de la invencion, tales agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleotido), o en combinacion con uno o mas otros agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, la radioterapia y oligonucleotidos).
[0227] Los farmacos anti-inflamatorios, incluyendo pero no limitados a los farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, incluyendo, pero no limitados a, ribavirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, se pueden combinar en composiciones para uso de acuerdo con la invencion. Las combinaciones de los compuestos de antisentido y otros farmacos no antisentido tambien se describen en este documento. Dos o mas compuestos combinados pueden utilizarse juntos o secuencialmente.
[0228] En otra realizacion relacionada, las composiciones para uso de acuerdo con la invencion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos de antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Alternativamente, las composiciones para uso de acuerdo con la invencion pueden contener dos o mas compuestos de antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo acido nucleico diana. Numerosos ejemplos de compuestos de antisentido se conocen en la tecnica. Dos o mas compuestos combinados pueden utilizarse juntos o secuencialmente.
Cultivo de celulas y tratamiento de compuestos antisentido
[0229] Los efectos de los compuestos de antisentido sobre el nivel, la actividad o expresion de acidos nucleicos CD40 pueden ser probados in vitro en una variedad de tipos de celulas. Los tipos celulares utilizados para tales analisis estan disponibles de proveedores commericales (p.ej. American Type Culture Collection, Manassus, VA;. Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las celulas se cultivan de acuerdo a las instrucciones del proveedor, utilizando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Tipos celulares ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, celulas HepG2, celulas Hep3B, celulas HUVEC, T24, A549, y hepatocitos primarios.
Pruebas in vitro de oligonucleotidos antisentido
[0230] Se describen aqrn procedimientos para el tratamiento de celulas con oligonucleotidos antisentido, que pueden ser modificados apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
[0231] En general, las celulas se tratan con oligonucleotidos de antisentido cuando las celulas alcanzan aproximadamente el 60-80% de confluencia en cultivo.
[0232] Un reactivo comunmente usado para introducir oligonucleotidos de antisentido en celulas cultivadas incluye el reactivo de transfeccion de lfpidos cationicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleotidos de antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentracion final deseada de oligonucleotido antisentido y una concentracion de LIPOFECTIN® que vana tfpicamente de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleotido antisentido.
[0233] Otro reactivo usado para introducir oligonucleotidos de antisentido en celulas cultivadas incluye LiPoFeCTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonucleotido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE® en OPTI-MEM® 1 medio de suero reducido (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentracion deseada de oligonucleotido antisentido y una concentracion LIPOFECTAMINE® que vana tfpicamente de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleotido antisentido.
[0234] Las celulas se tratan con oligonucleotidos de antisentido por metodos de rutina. Las celulas se recogen tfpicamente 16-24 horas despues del tratamiento oligonucleotido antisentido, en el que el ARN tiempo o los niveles de protema de acidos nucleico diana se miden por metodos conocidos en la tecnica y se describen en este
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documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en multiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos repetidos.
[0235] La concentracion de oligonucleotido antisentido utilizado vana de lmea celular a lmea celular. Los metodos para determinar la concentracion optima de oligonucleotidos de antisentido para una lmea celular particular, son bien conocidos en la tecnica. Oligonucleotidos de antisentido se usan tipicamente en concentraciones que van de 1 nM a 300 nM.
Aislamiento de ARN
[0236] El analisis de ARN puede llevarse a cabo en el ARN celular total o poli(A) + ARNm. Los metodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la tecnica. El ARN se preparo utilizando metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) segun los protocolos recomendados por el fabricante.
Analisis de la inhibicion de los niveles o expresion diana
[0237] La inhibicion de los niveles o la expresion de un acido nucleico CD40 se puede ensayar en una variedad de formas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se dirigen a los niveles de acido nucleico se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, analisis de transferencia Northern, reaccion de la polimerasa competitiva cadena (PCR), o cuantitativa en tiempo real PCR. El analisis de ARN puede llevarse a cabo en el ARN celular total o poli(A) + ARNm. Los metodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la tecnica. Analisis de transferencia Northern tambien es rutinario en la tecnica. PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 Sequence Detection System disponible comercialmente, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y que se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Analisis PCR cuantitativo en tiempo real de niveles de ARN diana
[0238] La cuantificacion de los niveles de ARN diana se puede realizar por PCR cuantitativa en tiempo real usando el ABI PRISM® 7600, 7700, o 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) segun las instrucciones del fabricante. Metodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la tecnica.
[0239] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reaccion de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que se utiliza entonces como el sustrato para la amplificacion por PCR en tiempo real. El RT y las reacciones de PCR en tiempo real se llevan a cabo secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos RT y PCR en tiempo real se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Reacciones de RT, PCR en tiempo real se llevan a cabo por metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica.
[0240] Cantidades diana de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan utilizando ya sea el nivel de expresion de un gen cuya expresion es constante, tal como GAPDH o cuantificando el ARN total usando RiboGreen® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Expresion de GAPDH se cuantifica mediante PCR en tiempo real, al ejecutarse simultaneamente con la diana, la multiplexacion, o por separado. El ARN total se cuantifico usando reactivo de cuantificacion de RNA de RiboGreen® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los metodos de cuantificacion del ARN por RiboGreen® se ensenan en Jones, LJ, et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) se utiliza para medir la fluorescencia RiboGreen®.
[0241] Las sondas y cebadores se disenan para hibridar con un acido nucleico CD40. Los metodos para disenar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la tecnica, y pueden incluir el uso de software de tipo PRIMER Express® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Analisis de niveles de prote^na
[0242] La inhibicion antisentido de los acidos nucleicos de CD40 se puede evaluar mediante la medicion de los niveles de protema CD40. Los niveles de protema de CD40 pueden ser evaluados o cuantificados en una variedad de maneras bien conocidas en la tecnica, tales como inmunoprecipitacion, analisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), ensayos de protema cuantitativos, ensayos de actividad de la protema (por ejemplo, ensayos de actividad de la caspasa), inmunohistoqmmica, inmunocitoqmmica o celulas activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden ser identificados y obtenidos a partir de una variedad de fuentes, como el catalogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar a traves de metodos de generacion de anticuerpos monoclonales o policlonales convencionales bien conocidos en la tecnica. Los anticuerpos utiles para la deteccion de CD40 de rata humana estan disponibles comercialmente.
Ensayo in vivo de los compuestos antisentido
[0243] Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, se ensayan en animales para evaluar
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su capacidad para inhibir la expresion de CD40 y producir cambios fenotfpicos, tales como cambios en la morfologfa celular en el tiempo o tratamiento de dosis, asf como cambios en los niveles de los componentes celulares tales como protemas, acidos nucleicos, hormonas, citoquinas, y eosinofilos. Las pruebas pueden llevarse a cabo en animales normales, o en modelos de enfermedad experimentales. Para la administracion a animales, los oligonucleotidos de antisentido se formulan en un diluyente farmaceuticamente aceptable, tal como solucion salina tamponada con fosfato. La administracion incluye administracion pulmonar, administracion en aerosol, administracion topica, y vfas de administracion parenterales, tales como intraperitoneal, intravenosa y subcutanea. El calculo de la dosis de oligonucleotido antisentido y la frecuencia de dosificacion esta dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica, y depende de factores tales como la via de administracion y peso del cuerpo del animal. Tras un penodo de tratamiento con oligonucleotidos antisentido, el ARN se aislo de tejido de hfgado y se miden los cambios en la expresion de acido nucleico CD40.
Ciertas indicaciones
[0244] Tambien se describen en este documento metodos de tratamiento de un individuo que comprende administrar una o mas composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento. En ciertos casos, el individuo tiene un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo. Tambien se describen en este documento metodos para reducir profilacticamente la expresion de CD40 en un individuo. Ciertos casos incluyen el tratamiento de un individuo en necesidad del mismo mediante la administracion a un individuo de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico CD40.
[0245] En un caso, la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un acido nucleico CD40 se acompana de monitoreo de eosinofilos en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administracion del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administracion del compuesto antisentido es utilizado por un medico para determinar la cantidad y la duracion de la intervencion terapeutica.
[0246] En un caso, la administracion de un compuesto antisentido dirigido a un resultado de acido nucleico CD40 en la reduccion de la expresion de CD40 en al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o de un rango definido por dos de estos valores. En algunos casos, la administracion de un compuesto CD40 antisentido aumenta la medida de al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o de un rango definido por dos de estos valores. En algunos casos, la administracion de un compuesto CD40 antisentido disminuye la medida por al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o de un rango definido por dos de estos valores.
[0247] En ciertos casos, la composicion farmaceutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a CD40 se usa para la preparacion de un medicamento para tratar un paciente que sufre o es susceptible a una afeccion inflamatoria o un trastorno hiperproliferativo.
[0248] La formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) se cree que esta dentro de la experiencia de expertos en la tecnica. La dosificacion depende de la gravedad y capacidad de respuesta del estado de enfermedad a tratar, con el curso del tratamiento que dura de varios dfas a varios meses, o hasta que una cura se efectue o se logre una disminucion del estado de enfermedad. Los programas de dosificacion optimos pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Las personas de experiencia normal pueden determinar facilmente las dosificaciones optimas, metodologfas de dosificacion y tasas de repeticion. Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden ser estimadas basadas en CE50 encontrado para ser eficaz en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosis es de 0,01 ug a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o mas veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Las personas con experiencia ordinaria en la tecnica pueden estimar facilmente las tasas de repeticion para la dosificacion en base a los tiempos y concentraciones del farmaco en fluidos o tejidos corporales de residencia medidos. Tras un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, donde el oligonucleotido se administra en dosis de mantenimiento, que van desde 0,01 ug a 100 g por kg de peso corporal, una vez o mas al dfa, a una vez cada 20 anos.
Ciertas terapias de combinacion
[0249] En ciertos casos, una o mas composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento se administran conjuntamente con uno o mas de otros agentes farmaceuticos. En ciertos casos, dichos uno o mas agentes farmaceuticos distintos estan disenados para tratar la misma enfermedad o condicion como las una o mas composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento. En ciertos casos, dichos uno o mas agentes farmaceuticos distintos estan disenados para tratar una enfermedad o afeccion diferente como las una o mas composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento. En ciertos casos, dichos uno o mas agentes farmaceuticos distintos estan disenados para tratar un efecto no deseado de una o mas composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento. En ciertos casos, una o mas composiciones farmaceuticas
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descritas en el presente documento se administran conjuntamente con otro agente farmaceutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmaceutico. En ciertos casos, una o mas composiciones farmaceuticas descritas en este documento y uno o mas agentes farmaceuticos distintos se administran al mismo tiempo. En ciertos casos, una o mas composiciones farmaceuticas descritas en este documento y uno o mas agentes farmaceuticos distintos se administran en momentos diferentes. En ciertos casos, una o mas composiciones farmaceuticas descritas en este documento y uno o mas agentes farmaceuticos se preparan juntos en una unica formulacion. En ciertos casos, una o mas composiciones farmaceuticas descritas en este documento y uno o mas agentes farmaceuticos distintos se preparan por separado.
[0250] En ciertos casos, los agentes farmaceuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composicion farmaceutica descrita en este documento incluyen esteroides y/o agentes quimioterapeuticos. En ciertas de dichas instancias, los agentes farmaceuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composicion farmaceutica descrita incluyen, pero no se limitan a la prednisona, corticoesteroides, y paclitaxel. En ciertos casos, el agente se administra antes de la administracion de una composicion farmaceutica descrita en este documento. En ciertos casos, el agente se administra despues de la administracion de una composicion farmaceutica descrita en este documento. En ciertos de dichos casos el agente se administra al mismo tiempo como una composicion farmaceutica descrita en este documento. En ciertos de dichos casos la dosis de un agente co- administrado es la misma que la dosis que se administrana si el agente se administrara solo. En ciertos de dichos casos la dosis de un agente co-administrado es menor que la dosis que se administrana si el agente se administrara solo. En ciertos de dichos casos la dosis de un agente co-administrado es mayor que la dosis que se administrana si el agente se administrara solo.
[0251] En ciertos casos, la co-administracion de un segundo compuesto potencia el efecto de un primer compuesto, de tal modo que la co-administracion de los compuestos resulta en un efecto que es mayor que el efecto de la administracion del primer compuesto solo. En otros casos, la co-administracion se traduce en efectos que son aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En otros casos, la co-administracion se traduce en efectos que son supra-aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En algunos casos, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En algunos casos, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.
EJEMPLOS
Divulgacion no limitante
[0252] Mientras que ciertos compuestos, composiciones y metodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en este documento y no estan destinados a limitar los mismos.
Ejemplo 1: Inhibicion antisentido de CD40 humano in vitro
[0253] Los oligonucleotidos de antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 se ensayaron para determinar sus efectos sobre CD40 ARNm in vitro. Cuando las celulas cultivadas, cultivadas en una placa de 96 pocillos, alcanzaron 80% de confluencia, fueron tratadas con 150 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un penodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN de las celulas y los niveles de CD40 ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en el presente documento. Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total medido mediante normalizacion a RiboGreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de CD40, respecto a las celulas de control no tratadas en la Tabla 1.
[0254] Los oligonucleotidos de antisentido se disenaron como 18-meros con cadenas principales de fosforotioato (enlaces internucleosido). "Sitio diana 5’" indica el nucleotido mas 5' al que el oligonucleotido antisentido esta dirigido SEQ ID NO: 1 (GENBANK® N° de acceso X60592.1). Los datos son los promedios de tres experimentos.
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- Inhibicion de niveles humanos de ARNm CD40 por oligodeoxinucleotidos de fosforotioato
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Region diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 18623
- 1 18 35 5'UTR CCAGGCGGCAGGACCACT 31 5
- 18624
- 1 20 37 5'UTR GACCAGGCGGCAGGACCA 28 6
- 18625
- 1 26 43 5'UTR AGGTGAGACCAGGCGGCA 22 7
- 18626
- 1 48 65 AUG CAGAGGCAGACGAACCAT 0 8
- 18627
- 1 49 66 Codificacion GCAGAGGCAGACGAACCA 0 9
- 18628
- 1 73 90 Codificacion GCAAGCAGCCCCAGAGGA 0 10
- 18629
- 1 78 95 Codificacion GGTCAGCAAGCAGCCCCA 30 11
- 18630
- 1 84 101 Codificacion GACAGCGGTCAGCAAGCA 0 12
- 18631
- 1 88 105 Codificacion GATGGACAGCGGTCAGCA 0 13
- 18632
- 1 92 109 Codificacion TCT GGAT GGACAGCGGT C 0 14
- 18633
- 1 98 115 Codificacion GGT GGTT CT GGAT GGACA 0 15
- 18634
- 1 101 118 Codificacion GT GGGT GGTT CT GGATGG 0 16
- 18635
- 1 104 121 Codificacion GCAGT GGGT GGTTCTGGA 0 17
- 18636
- 1 152 169 Codificacion CACAAAGAACAGCACTGA 0 18
- 18637
- 1 156 173 Codificacion CT GGCACAAAGAACAGCA 0 19
- 18638
- 1 162 179 Codificacion TCCTGGCT GGCACAAAGA 0 20
- 18639
- 1 165 182 Codificacion CT GTCCT GGCT GGCACAA 5 21
- 18640
- 1 176 193 Codificacion CTCACCAGTTTCTGTCCT 0 22
- 18641
- 1 179 196 Codificacion TCACTCACCAGTTTCTGT 0 23
- 18642
- 1 185 202 Codificacion GT GCAGT CACT CACCAGT 0 24
- 18643
- 1 190 207 Codificacion ACTCTGTGCAGT CACT CA 0 25
- 18644
- 1 196 213 Codificacion CAGT GAACT CTGT GCAGT 5 26
- 18645
- 1 205 222 Codificacion ATTCCGTTTCAGTGAACT 0 27
- 18646
- 1 211 228 Codificacion GAAGGCATTCCGTTT CAG 9 28
- 18647
- 1 222 239 Codificacion TT CACCGCAAGGAAGGCA 0 29
- 18648
- 1 250 267 Codificacion CTCTGTTCCAGGTGTCTA 0 30
- 18649
- 1 267 284 Codificacion CTGGTGGCAGTGTGTCTC 0 31
- 18650
- 1 286 303 Codificacion T GGGGTCGCAGTATTT GT 0 32
- 18651
- 1 289 306 Codificacion GGTT GGGGTCGCAGTATT 0 33
- 18652
- 1 292 309 Codificacion CT AGGTT GGGGTCGCAGT 0 34
- 18653
- 1 318 335 Codificacion GGT GCCCTT CT GCT GGAC 20 35
- 18654
- 1 322 339 Codificacion CT GAGGT GCCCTT CT GCT 16 36
- 18655
- 1 332 349 Codificacion GTGTCTGTTTCTGAGGTG 0 37
- 18656
- 1 334 351 Codificacion TGGTGTCT GTTTCT GAGG 0 38
- 18657
- 1 345 362 Codificacion ACAGGT GCAGAT GGTGTC 0 39
- 18658
- 1 348 365 Codificacion TTCACAGGT GCAGAT GGT 0 40
- 18659
- 1 360 377 Codificacion GT GCCAGCCTT CTT CACA 6 41
- 18660
- 1 364 381 Codificacion T ACAGT GCCAGCCTT CTT 8 42
- 18661
- 1 391 408 Codificacion GGACACAGCT CT CACAGG 0 43
- 18662
- 1 395 412 Codificacion TGCAGGACACAGCTCTCA 0 44
- 18663
- 1 401 418 Codificacion GAGCGGT GCAGGACACAG 0 45
- 18664
- 1 416 433 Codificacion AAGCCGGGCGAGCAT GAG 0 46
- 18665
- 1 432 449 Codificacion AATCTGCTTGACCCCAAA 6 47
- 18666
- 1 446 463 Codificacion GAAACCCCTGTAGCAATC 0 48
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- Inhibicion de niveles humanos de ARNm CD40 por oligodeoxinucleotidos de fosforotioato
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Region diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 18667
- 1 452 469 Codificacion GTATCAGAAACCCCTGTA 0 49
- 18668
- 1 463 480 Codificacion GCTCGCAGAT GGT AT CAG 0 50
- 18669
- 1 468 485 Codificacion GCAGGGCTCGCAGAT GGT 34 51
- 18670
- 1 471 488 Codificacion T GGGCAGGGCTCGCAGAT 0 52
- 18671
- 1 474 491 Codificacion GACT GGGCAGGGCTCGCA 3 53
- 18672
- 1 490 507 Codificacion CATT GGAGAAGAAGCCGA 0 54
- 18673
- 1 497 514 Codificacion GAT GACACATT GGAGAAG 0 55
- 18674
- 1 500 517 Codificacion GCAGAT GACACATTGGAG 0 56
- 18675
- 1 506 523 Codificacion TCGAAAGCAGAT GACACA 0 57
- 18676
- 1 524 541 Codificacion GTCCAAGGGT GACATTTT 8 58
- 18677
- 1 532 549 Codificacion CACAGCTTGTCCAAGGGT 0 59
- 18678
- 1 539 556 Codificacion TTGGTCT CACAGCTT GTC 0 60
- 18679
- 1 546 563 Codificacion CAGGTCTTTGGTCTCACA 7 61
- 18680
- 1 558 575 Codificacion CTGTT GCACAACCAGGT C 19 62
- 18681
- 1 570 587 Codificacion GTTT GT GCCT GCCTGTT G 2 63
- 18682
- 1 575 592 Codificacion GTCTTGTTTGTGCCTGCC 0 64
- 18683
- 1 590 607 Codificacion C CACAGACAACAT CAGT C 0 65
- 18684
- 1 597 614 Codificacion CTGGGGACCACAGACAAC 0 66
- 18685
- 1 607 624 Codificacion TCAGCCGATCCTGGGGAC 0 67
- 18686
- 1 621 638 Codificacion CACCACCAGGGCT CT CAG 23 68
- 18687
- 1 626 643 Codificacion GGGATCACCACCAGGGCT 0 69
- 18688
- 1 657 674 Codificacion GAGGATGGCAAACAGGAT 0 70
- 18689
- 1 668 685 Codificacion ACCAGCACCAAGAGGAT G 0 71
- 18690
- 1 679 696 Codificacion TTTT GATAAAGACCAGCA 0 72
- 18691
- 1 703 720 Codificacion T ATT GGTT GGCTTCTTGG 0 73
- 18692
- 1 729 746 Codificacion GGGTTCCTGCTTGGGGTG 0 74
- 18693
- 1 750 767 Codificacion GTCGGGAAAATTGATCTC 0 75
- 18694
- 1 754 771 Codificacion GATCGTCGGGAAAATTGA 0 76
- 18695
- 1 765 782 Codificacion GGAGCCAGGAAGATCGTC 0 77
- 18696
- 1 766 783 Codificacion TGGAGCCAGGAAGATCGT 0 78
- 18697
- 1 780 797 Codificacion T GGAGCAGCAGT GTT GGA 0 79
- 18698
- 1 796 813 Codificacion GT AAAGT CTCCTGCACTG 0 80
- 18699
- 1 806 823 Codificacion T GGCATCCAT GTAAAGT C 0 81
- 18700
- 1 810 827 Codificacion C GGTT GGCAT C CAT GT AA 0 82
- 18701
- 1 834 851 Codificacion CTCTTTGCCATCCTCCTG 4 83
- 18702
- 1 861 878 Codificacion CTGTCT CTCCT GCACTGA 0 84
- 18703
- 1 873 890 Parar GGT GCAGCCT CACT GT CT 0 85
- 18704
- 1 910 927 3'UTR AACT GCCTGTTT GCCCAC 34 86
- 18705
- 1 954 971 3'UTR CTT CT GCCT GCACCCCT G 0 87
- 18706
- 1 976 993 3'UTR ACT GACT GGGCATAGCTC 0 88
Ejemplo 2: Inhibicion antisentido de CD40 humano in vitro
[0255] Se analizaron los oligonucleotidos antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 para determinar sus efectos sobre el ARNm de CD40 in vitro. Se trataron celulas T24 a una densidad de 7000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos con oligonucleotido antisentido 150 nM. Despues de un penodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de CD40 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en la presente memoria. Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de GAPDH, un gen domestico. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de CD40, en relacion con las celulas de control no tratadas en la Tabla 2.
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[0256] Los oligonucleotidos antisentido se disenaron como 4-10-4 gapmeros, donde el segmento de hueco comprende 2'-desoxinucleotidos y cada segmento de ala comprende nucleotidos 2'-MOE y sustituciones de 5- metilcitosina. Los oligonucleotidos antisentido comprenden esqueletos de fosforotioato (enlaces internucleosidos) a lo largo de todo el proceso. "Sitio diana 5'" indica el nucleotido mas 5' al que el oligonucleotido antisentido esta dirigido a la SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso GENBANK® X60592.1). Los datos son promedios de tres experimentos. "ND" indica que no se ha determinado un valor.
- Inhibicion de niveles ARNm CD40 por oligonucleotidos quimericos teniendo alas 4-10-4 y hueco de deoxi
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Region diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 19211
- 1 18 35 5'UTR CCAGGCGGCAGGACCACT 76 5
- 19212
- 1 20 37 5'UTR GACCAGGCGGCAGGACCA 77 6
- 19213
- 1 26 43 5'UTR AGGT GAGAC CAGGCGGCA 81 7
- 19214
- 1 48 65 AUG CAGAGGCAGACGAACCAT 24 8
- 19215
- 1 49 66 Codificacion GCAGAGGCAGACGAACCA 46 9
- 19216
- 1 73 90 Codificacion GCAAGCAGCCCCAGAGGA 66 10
- 19217
- 1 78 95 Codificacion GGTCAGCAAGCAGCCCCA 75 11
- 19218
- 1 84 101 Codificacion GACAGCGGT CAGCAAGCA 67 12
- 19219
- 1 88 105 Codificacion GAT GGACAGCGGT CAGCA 65 13
- 19220
- 1 92 109 Codificacion T CT GGAT GGACAGCGGT C 79 14
- 19221
- 1 98 115 Codificacion GGT GGTTCTGGAT GGACA 81 15
- 19222
- 1 101 118 Codificacion GT GGGTGGTTCT GGAT GG 58 16
- 19223
- 1 104 121 Codificacion GCAGT GGGT GGTT CT GGA 74 17
- 19224
- 1 152 169 Codificacion CACAAAGAACAGCACT GA 40 18
- 19225
- 1 156 173 Codificacion CTGGCACAAAGAACAGCA 60 19
- 19226
- 1 162 179 Codificacion TCCT GGCTGGCACAAAGA 10 20
- 19227
- 1 165 182 Codificacion CTGTCCT GGCTGGCACAA 24 21
- 19228
- 1 176 193 Codificacion CTCACCAGTTT CTGTCCT 22 22
- 19229
- 1 179 196 Codificacion T CACT CACCAGTTT CT GT 41 23
- 19230
- 1 185 202 Codificacion GT GCAGT CACTCAC CAGT 82 24
- 19231
- 1 190 207 Codificacion ACTCTGT GCAGT CACTCA 38 25
- 19232
- 1 196 213 Codificacion CAGT GAACTCTGT GCAGT 40 26
- 19233
- 1 205 222 Codificacion ATTCCGTTT CAGT GAACT 56 27
- 19234
- 1 211 228 Codificacion GAAGGCATTCCGTTT CAG 32 28
- 19235
- 1 222 239 Codificacion TT CACCGCAAGGAAGGCA 61 29
- 19236
- 1 250 267 Codificacion CTCTGTTCCAGGTGTCTA 62 30
- 19237
- 1 267 284 Codificacion CTGGT GGCAGT GT GT CT C 70 31
- 19238
- 1 286 303 Codificacion TGGGGTC GCAGT ATTT GT 0 32
- 19239
- 1 289 306 Codificacion GGTT GGGGTCGCAGT ATT 19 33
- 19240
- 1 292 309 Codificacion CTAGGTT GGGGTCGCAGT 36 34
- 19241
- 1 318 335 Codificacion GGTGCCCTTCTGCTGGAC 79 35
- 19242
- 1 322 339 Codificacion CTGAGGTGCCCTTCTGCT 70 36
- 19243
- 1 332 349 Codificacion GTGTCT GTTT CT GAGGT G 63 37
- 19244
- 1 334 351 Codificacion TGGTGTCT GTTT CT GAGG 43 38
- 19245
- 1 345 362 Codificacion ACAGGT GCAGAT GGTGTC 73 39
- 19246
- 1 348 365 Codificacion TT CACAGGT GCAGAT GGT 48 40
- 19247
- 1 360 377 Codificacion GTGCCAGCCTTCTTCACA 61 41
- 19248
- 1 364 381 Codificacion TACAGTGCCAGCCTTCTT 47 42
- 19249
- 1 391 408 Codificacion GGACACAGCT CT CACAGG 0 43
- 19250
- 1 395 412 Codificacion T GCAGGACACAGCT CTCA 52 44
- 19251
- 1 401 418 Codificacion GAGCGGT GCAGGACACAG 50 45
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65
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Region diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 19252
- 1 416 433 Codificacion AAGCCGGGCGAGCAT GAG 32 46
- 19253
- 1 432 449 Codificacion AATCTGCTTGACCCCAAA 0 47
- 19254
- 1 446 463 Codificacion GAAACCCCTGTAGCAATC 0 48
- 19255
- 1 452 469 Codificacion GTATCAGAAACCCCTGTA 36 49
- 19256
- 1 463 480 Codificacion GCTC GCAGAT GGTAT CAG 65 50
- 19257
- 1 468 485 Codificacion GCAGGGCTCGCAGATGGT 75 51
- 19258
- 1 471 488 Codificacion T GGGCAGGGCTC GCAGAT 0 52
- 19259
- 1 474 491 Codificacion GACT GGGCAGGGCTCGCA 82 53
- 19260
- 1 490 507 Codificacion CATTG GAGAAGAAGCC GA 41 54
- 19261
- 1 497 514 Codificacion GAT GACACATT GGAGAAG 14 55
- 19262
- 1 500 517 Codificacion GCAGAT GACACATT GGAG 78 56
- 19263
- 1 506 523 Codificacion TCGAAAGCAGAT GACACA 59 57
- 19264
- 1 524 541 Codificacion GTCCAAGGGTGACATTTT 71 58
- 19265
- 1 532 549 Codificacion CACAGCTT GTCCAAGGGT 0 59
- 19266
- 1 539 556 Codificacion TT GGTCTCACAGCTT GT C 46 60
- 19267
- 1 546 563 Codificacion CAGGT CTTT GGTCT CACA 64 61
- 19268
- 1 558 575 Codificacion CT GTT GCACAACCAGGT C 82 62
- 19269
- 1 570 587 Codificacion GTTT GTGCCTGCCT GTT G 70 63
- 19270
- 1 575 592 Codificacion GTCTTGTTTGTGCCTGCC 69 64
- 19271
- 1 590 607 Codificacion C CACAGACAACAT CAGTC 11 65
- 19272
- 1 597 614 Codificacion CT GGGGACCACAGACAAC 9 66
- 19273
- 1 607 624 Codificacion TCAGCCGATCCTGGGGAC 0 67
- 19274
- 1 621 638 Codificacion CACCACCAGGGCTCTCAG 23 68
- 19275
- 1 626 643 Codificacion GGGAT CACCACCAGGGCT 58 69
- 19276
- 1 657 674 Codificacion GAGGAT GGCAAACAGGAT 49 70
- 19277
- 1 668 685 Codificacion ACCAGCACCAAGAGGAT G ND 71
- 19278
- 1 679 696 Codificacion TTTT GAT AAAGACCAGCA 31 72
- 19279
- 1 703 720 Codificacion T ATT GGTT GGCTTCTTGG 49 73
- 19280
- 1 729 746 Codificacion GGGTTCCT GCTT GGGGT G 14 74
- 19281
- 1 750 767 Codificacion GT C GGGAAAATT GAT CTC 55 75
- 19282
- 1 754 771 Codificacion GATCGTCGGGAAAATTGA 0 76
- 19283
- 1 765 782 Codificacion GGAGCCAGGAAGATCGT C 69 77
- 19284
- 1 766 783 Codificacion T GGAGCCAGGAAGAT C GT 54 78
- 19285
- 1 780 797 Codificacion T GGAGCAGCAGT GTT GGA 15 79
- 19286
- 1 796 813 Codificacion GTAAAGT CTCCT GCACT G 31 80
- 19287
- 1 806 823 Codificacion T GGCATCCAT GT AAAGT C 65 81
- 19288
- 1 810 827 Codificacion CGGTT GGCATCCAT GTAA 34 82
- 19289
- 1 834 851 Codificacion CTCTTTGCCATCCTCCTG 42 83
- 19290
- 1 861 878 Codificacion CTGTCTCTCCTGCACTGA 26 84
- 19291
- 1 873 890 Parar GGTGCAGCCTCACTGTCT 76 85
- 19292
- 1 910 927 3'UTR AACTGCCT GTTT GCCCAC 63 86
- 19293
- 1 954 971 3'UTR CTTCTGCCT GCACCCCT G 0 87
- 19294
- 1 976 993 3'UTR ACT GACT GGGCAT AGCTC 12 88
Ejemplo 3: Inhibicion antisentido de CD40 humano
[0257] Se ensayaron oligonucleotidos antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 para determinar sus efectos sobre ARNm de CD40 in vitro. Las celulas T24 a una densidad de 7000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos se trataron con 100 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un penodo de tratamiento de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aproximadamente 24 horas, se aislo ARN de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de CD40 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en la presente memoria. Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de GAPDH, un gen domestico. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de CD40, en relacion con las celulas de control no tratadas en la Tabla 3.
[0258] Los oligonucleotidos antisentido se disenaron como 4-10-4 gapmeros, donde el segmento de hueco comprende 2’-desoxinucleotidos y cada segmento de ala comprende nucleotidos 2’-MOE. Los oligonucleotidos antisentido comprenden columnas de fosforotioato (enlaces internucleosidos) y sustituciones de 5-metilcitosina. "’Sitio diana 5’" indica el nucleotido 5’ mas que el oligonucleotido antisentido esta dirigido a SEQ ID NO: 1 (GENBANK N° de Acceso X60592.1), SEQ ID NO: 2 (GENBANK® N° de Acceso H50598.1) , y SEQ ID NO: 3 (GENBANK® N° de acceso AA203290.1).
Tabla 3: Inhibicion de niveles humanos ARNm CD40 por oligonucleotidos quimericos teniendo alas 4-10-4 MOE y hueco deoxi
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 26162
- 1 66 83 GCCCCAGAGGACGCACTG 0 89
- 26163
- 1 70 87 AGCAGCCCCAGAGGACGC 98 90
- 26164
- 1 74 91 AGCAAGCAGCCCCAGAGG 47 91
- 26165
- 1 80 97 GCGGT CAGCAAGCAGCCC 54 92
- 26167
- 1 95 112 GGTTCT GGAT GGACAGC G 66 93
- 26168
- 1 102 119 AGT GGGTGGTTCT GGAT G 26 94
- 26169
- 1 141 158 GCACT GACT GTTT ATTAG 43 95
- 26170
- 1 154 171 GGCACAAAGAACAGCACT 53 96
- 26171
- 1 164 181 T GTCCTGGCT GGCACAAA 29 97
- 26172
- 1 171 188 CAGTTTCTGTCCTGGCTG 48 98
- 26173
- 1 180 197 GTCACT CACCAGTTT CTG 47 99
- 26174
- 1 210 227 AAGGCATTCCGTTT CAGT 57 100
- 26175
- 1 224 241 CTTTCACCGCAAGGAAGG 34 101
- 26176
- 1 250 267 CTCTGTTCCAGGTGTCTA 78 30
- 26177
- 1 257 274 TGTGTCTCTCTGTTCCAG 57 102
- 26178
- 1 264 281 GT GGCAGT GTGTCTCTCT 0 103
- 26179
- 1 314 331 CCCTTCTGCTGGACCCGA 58 104
- 26180
- 1 321 338 T GAGGT GCCCTT CT GCT G 69 105
- 26181
- 1 329 346 T CT GTTTCTGAGGT GCCC 44 106
- 26182
- 1 336 353 GAT GGTGTCT GTTT CT GA 12 107
- 26183
- 1 364 381 T ACAGT GCCAGCCTT CTT 14 42
- 26184
- 1 445 462 AAACCCCT GT AGCAAT CT 15 108
- 26185
- 1 460 477 CGCAGAT GGT AT CAGAAA 53 109
- 26186
- 1 469 486 GGCAGGGCTCGCAGATGG 79 110
- 26202
- 1 485 502 GAGAAGAAGCCGACTGGG 0 111
- 26187
- 1 487 504 T GGAGAAGAAGCCGACT G 23 112
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Oligo
SEQ ID NO
ID___
26204
26205
26206
26207 26188
26208 26189
26209
26210 26211 26212
26213
26214
26215
26216
26217
26218
26219
26220 26221 26222
26223
26224
26225
26226
26227
26228
26229
26230
26231
26232
26233
26234
26235
26236
26237
diana
1
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
1___
2___
2___
2___
2___
2___
2
Sitio de inicio diana
Sitio de parada diana
Secuencia (5' a 3')
%
Inhibicion
489
491
493
495
496
497 503 524 545 555 570 572 574
576
577
578 580 590 592 594 622 624
658
659
660 669 671 673 676 678 375 377 380 382 385 387
506
508
510
512
513
514 520 541 562 572 587 589 591
593
594
595 597 607 609 611 639 641
675
676
677 686 688 690 693 695 392 394 397 399 402 404
ATT GGAGAAGAAGCCGAC ACATT GGAGAAGAAGCCG ACACATT GGAGAAGAAGC T GACACATT GGAGAAGAA AT GACACATT GGAGAAGA GAT GACACATT GGAGAAG AAAGCAGAT GACACATT G GTCCAAGGGT GACATTTT AGGTCTTTGGTCTCACAG TT GCACAACCAGGTCTTT GTTT GT GCCT GCCTGTT G TT GTTT GT GCCT GCCTGT T CTT GTTT GT GCCT GCCT AGT CTT GTTT GT GCCT GC CAGT CTT GTTT GT GCCTG T CAGT CTT GTTT GT GCCT CAT CAGT CTT GTTT GTGC C CACAGACAACAT CAGT C GACCACAGACAACAT CAG GGGACCACAGACAACAT C T CACCACCAGGGCT CT CA GAT CACCACCAGGGCT CT AGAGGATGGCAAACAGGA AAGAGGATGGCAAACAGG CAAGAGGATGGCAAACAG GACCAGCACCAAGAGGAT AAGACCAGCACCAAGAGG TAAAGACCAGCACCAAGA T GAT AAAGACCAGCACCA TTT GAT AAAGACCAGCAC ACT CT CTTT GCCCATCCT CGACTCTCTTTGCCCATC ATGCGACTCTCTTTGCCC AAATGCGACTCTCTTTGC CTGAAATGCGACTCTCTT AACTGAAATGCGACTCTC
0_
4_
0_
46
0_
0_
6_
53
81
48
76
50
87 83 80
88 52 16
11
40
37
82
33
0_
0_
57
35
13
0_
26
0_
31
12
36
51 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 26238
- 2 406 423 CTT CACT GT CTCTCCCTG 0 145
- 26239
- 2 407 424 CCTT CACT GTCTCTCCCT 56 146
- 26240
- 2 409 426 AACCTT CACT GT CTCTCC 0 147
- 26190
- 3 520 537 GAT CACCACAGGCT CT CA 0 148
- 26191
- 3 565 582 T GAT AAGACAGCACCAAG 9 149
- 26192
- 3 584 601 GGTAGTTCTTGCCACTTT 0 150
- 26193
- 3 593 610 GGGCCTATGGGT AGTT CT 0 151
- 26194
- 3 617 634 ATT AT CT CT GGGT CT GCT 9 152
- 26195
- 3 646 663 ACT GACACATTT GAGCAG 0 153
- 26196
- 3 654 671 GACTCCCTACTGACACAT 0 154
- 26197
- 3 689 706 CAAAGAGCGGTT CTCCAC 0 155
- 26198
- 3 696 713 AATTCTCCAAAGAGCGGT 0 156
- 26199
- 3 728 745 T CTT GACATCCTTTT CAT 0 157
- 26200
- 3 736 753 CCCACCTATCTT GACAT C 0 158
- 26201
- 3 791 808 AGGCCGAGAGTT CAAAAT 0 159
Ejemplo 4 Inhibicion antisentido del CD40 humano
[0259] Se ensayaron oligonucleotidos antisentido dirigidos a un acido nucleico CD40 para determinar sus efectos sobre ARNm de CD40 in vitro. Las celulas A549 a una densidad de 5000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos se trataron con 120 nM de oligonucleotido antisentido. Despues de un penodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de CD40 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en la presente memoria. El conjunto LTS37 de cebador de sonda CD40 se utilizo para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de CD40, en relacion con las celulas de control no tratadas en la Tabla 4.
[0260] Los oligonucleotidos antisentido se disenaron como 4-10-4 gapmeros, 5-10-5 gapmeros, o 2-15-3 gapmeros, donde el segmento de separacion comprende 2’-desoxinucleotidos y cada segmento de ala comprende nucleotidos 2’-MOE . El motivo para cada compuesto se indica mediante la columna denominada "motivo". Los oligonucleotidos antisentido comprenden columnas de fosforotioato (enlaces internucleosidos) y sustituciones de 5-metilcitosina. "Sitio diana 5’" indica el nucleotido mas 5’ al que el oligonucleotido antisentido esta dirigido a SEQ NO: 1 (GENBANK N° de acceso X60592.1) o SEQ ID NO: 4 (nucleotidos 9797000 a 9813000 de GENBANK N° de Acceso NT_011362 .9).
Tabla 4
- Inhibicion de niveles humanos de ARNm CD40 por oligonucleotidos quimericos teniendo alas 4-104 MOE y huecos deoxi, alas 5-10-5 MOE y hueco deoxi, y alas 2-15-3 MOE y hueco deoxi
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Motivo Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 26163
- 4 4-10-4 2914 2931 AGCAGCCCCAGAGGACGC 74 90
- 396243
- 4 5-10-5 2728 2747 CCAGCAATTCACCGCGCAGG 0 160
- 396320
- 4 2-15-3 2728 2747 CCAGCAATTCACCGCGCAGG 0 160
- 396199
- 4 5-10-5 2892 2911 T GCAGAGGCAGACGAACCAT 75 161
- 396276
- 4 2-15-3 2892 2911 T GCAGAGGCAGACGAACCAT 55 161
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Motivo Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 396200
- 4 5-10-5 2904 2923 CAGAGGACGCACT GCAGAGG 79 162
- 396277
- 4 2-15-3 2904 2923 CAGAGGACGCACT GCAGAGG 69 162
- 396201
- 4 5-10-5 2913 2932 AAGCAGCCCCAGAGGACGCA 76 163
- 396278
- 4 2-15-3 2913 2932 AAGCAGCCCCAGAGGACGCA 78 163
- 396202
- 4 5-10-5 2924 2943 CAGCGGTCAGCAAGCAGCCC 68 164
- 396279
- 4 2-15-3 2924 2943 CAGCGGTCAGCAAGCAGCCC 88 164
- 396244
- 4 5-10-5 2928 2947 CTCACAGCGGTCAGCAAGCA 86 165
- 396321
- 4 2-15-3 2928 2947 CTCACAGCGGTCAGCAAGCA 75 165
- 396245
- 4 5-10-5 3349 3368 GCT GGCAAGGAGAT GAT AAC 51 166
- 396322
- 4 2-15-3 3349 3368 GCT GGCAAGGAGAT GAT AAC 54 166
- 396246
- 4 5-10-5 3480 3499 AGGTT GGAACACCCAAGAT A 69 167
- 396323
- 4 2-15-3 3480 3499 AGGTT GGAACACCCAAGAT A 78 167
- 396247
- 4 5-10-5 3649 3668 GGAGAAACCCCT GGTTT CT C 45 168
- 396324
- 4 2-15-3 3649 3668 GGAGAAACCCCT GGTTT CT C 26 168
- 396248
- 4 5-10-5 3860 3879 T CATTCCT GCCCAGGCTTCA 43 169
- 396325
- 4 2-15-3 3860 3879 T CATTCCT GCCCAGGCTTCA 39 169
- 396249
- 4 5-10-5 3950 3969 T CAGGT GAAAGT GAAAGCT G 68 170
- 396326
- 4 2-15-3 3950 3969 T CAGGT GAAAGT GAAAGCT G 69 170
- 396250
- 4 5-10-5 4490 4509 T ACCAT CTT CAAACACAT GA 79 171
- 396327
- 4 2-15-3 4490 4509 T ACCAT CTT CAAACACAT GA 71 171
- 396251
- 4 5-10-5 4604 4623 TTACCCAAAATGGGAAAGGA 86 172
- 396328
- 4 2-15-3 4604 4623 TTACCCAAAATGGGAAAGGA 48 172
- 396252
- 4 5-10-5 4810 4829 GAAAGAATACAT GTATATGG 72 173
- 396329
- 4 2-15-3 4810 4829 GAAAGAATACAT GTATATGG 10 173
- 396253
- 4 5-10-5 4944 4963 AGAGT CAGACAGCTTTAGAC 78 174
- 396330
- 4 2-15-3 4944 4963 AGAGT CAGACAGCTTTAGAC 79 174
- 396254
- 4 5-10-5 5651 5670 GTACCACCCATGCTATTAAT 79 175
- 396331
- 4 2-15-3 5651 5670 GTACCACCCATGCTATTAAT 84 175
- 396255
- 4 5-10-5 5740 5759 ACAGT GACAGAGTCCAAAT G 85 176
- 396332
- 4 2-15-3 5740 5759 ACAGT GACAGAGTCCAAAT G 75 176
- 396256
- 4 5-10-5 5830 5849 AAT GT AAAGCT GGAAGGGT A 52 177
- 396333
- 4 2-15-3 5830 5849 AAT GT AAAGCT GGAAGGGT A 37 177
- 396257
- 4 5-10-5 5964 5983 GGGCTATGTTTAGCACTTGG 79 178
- 396334
- 4 2-15-3 5964 5983 GGGCTATGTTTAGCACTTGG 73 178
- 396258
- 4 5-10-5 6078 6097 GGGCTT GATGCCT GAGT CAT 73 179
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Motivo Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 396335
- 4 2-15-3 6078 6097 GGGCTT GAT GCCTGAGTCAT 40 179
- 396259
- 4 5-10-5 6251 6270 T GAAGT GCAAGT CAAAACAG 52 180
- 396336
- 4 2-15-3 6251 6270 T GAAGT GCAAGT CAAAACAG 44 180
- 396260
- 4 5-10-5 6332 6351 GCAATTT GAAGGGAT CTT GA 68 181
- 396337
- 4 2-15-3 6332 6351 GCAATTT GAAGGGAT CTT GA 42 181
- 396203
- 4 5-10-5 6374 6393 CATGCAGT GGGT GGTTCTGG 77 182
- 396280
- 4 2-15-3 6374 6393 CATGCAGT GGGT GGTTCTGG 83 182
- 396204
- 4 5-10-5 6385 6404 GTTTTT CTCT GCAT GCAGTG 78 183
- 396281
- 4 2-15-3 6385 6404 GTTTTT CTCT GCAT GCAGTG 70 183
- 396205
- 4 5-10-5 6424 6443 GCTGGCACAAAGAACAGCAC 61 184
- 396282
- 4 2-15-3 6424 6443 GCTGGCACAAAGAACAGCAC 65 184
- 396261
- 4 5-10-5 6709 6728 CACTAAC CACACAAT GAT CA 85 185
- 396338
- 4 2-15-3 6709 6728 CACTAAC CACACAAT GAT CA 62 185
- 396206
- 4 5-10-5 6787 6806 T GT GCAGT CACT CACCAGTT 83 186
- 396283
- 4 2-15-3 6787 6806 T GT GCAGT CACT CACCAGTT 72 186
- 396207
- 4 5-10-5 6838 6857 GTCTAGGAATTCGCTTTCAC 95 187
- 396284
- 4 2-15-3 6838 6857 GTCTAGGAATTCGCTTTCAC 85 187
- 396208
- 4 5-10-5 6843 6862 CAGGT GT CT AGGAATTCGCT 98 188
- 396285
- 4 2-15-3 6843 6862 CAGGT GT CT AGGAATTCGCT 90 188
- 396209
- 4 5-10-5 6883 6902 GT C GCAGT ATTT GTGCTGGT 84 189
- 396286
- 4 2-15-3 6883 6902 GT C GCAGT ATTT GTGCTGGT 86 189
- 396262
- 4 5-10-5 7154 7173 ACCCGAAGCCCTAGGTCTGA 92 190
- 396339
- 4 2-15-3 7154 7173 ACCCGAAGCCCTAGGTCTGA 84 190
- 396210
- 4 5-10-5 7158 7177 CTGGACCCGAAGCCCTAGGT 82 191
- 396287
- 4 2-15-3 7158 7177 CTGGACCCGAAGCCCTAGGT 90 191
- 396211
- 4 5-10-5 7163 7182 TTCTGCTGGACCCGAAGCCC 65 192
- 396288
- 4 2-15-3 7163 7182 TTCTGCTGGACCCGAAGCCC 80 192
- 396212
- 4 5-10-5 7204 7223 CTTCTTCACAGGTGCAGATG 79 193
- 396289
- 4 2-15-3 7204 7223 CTTCTTCACAGGTGCAGATG 72 193
- 396263
- 4 5-10-5 7590 7609 AGCCAGT GGCCAGGCAGGAC 70 194
- 396340
- 4 2-15-3 7590 7609 AGCCAGT GGCCAGGCAGGAC 56 194
- 396214
- 4 5-10-5 7704 7723 GAAGAAGCCGACTGGGCAGG 76 195
- 396291
- 4 2-15-3 7704 7723 GAAGAAGCCGACTGGGCAGG 80 195
- 396215
- 4 5-10-5 7709 7728 TTGGAGAAGAAGCCGACTGG 77 196
- 396292
- 4 2-15-3 7709 7728 TTGGAGAAGAAGCCGACTGG 80 196
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Motivo Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 396216
- 4 5-10-5 7718 7737 GAT GACACATT GGAGAAGAA 76 197
- 396293
- 4 2-15-3 7718 7737 GAT GACACATT GGAGAAGAA 65 197
- 396264
- 4 5-10-5 7953 7972 TGTCTATTACCT CAAAGAGA 89 198
- 396341
- 4 2-15-3 7953 7972 TGTCTATTACCT CAAAGAGA 72 198
- 396265
- 4 5-10-5 8492 8511 ACAGT GT GTT CAGAGGATT G 82 199
- 396342
- 4 2-15-3 8492 8511 ACAGT GT GTT CAGAGGATT G 67 199
- 396266
- 4 5-10-5 9755 9774 ACAATACACTTTACATGTTT 90 200
- 396343
- 4 2-15-3 9755 9774 ACAATACACTTTACATGTTT 63 200
- 396267
- 4 5-10-5 10414 10433 ATTGTGTCTTTAGAACCAGA 84 201
- 396344
- 4 2-15-3 10414 10433 ATTGTGTCTTTAGAACCAGA 59 201
- 396268
- 4 5-10-5 10528 10547 GGGCCCT AAAGGAT GTAAAA 34 202
- 396345
- 4 2-15-3 10528 10547 GGGCCCT AAAGGAT GTAAAA 76 202
- 396217
- 4 5-10-5 11218 11237 CAGT CTT GTTT GTGCCT GCC 70 203
- 396294
- 4 2-15-3 11218 11237 CAGT CTT GTTT GTGCCT GCC 79 203
- 396269
- 4 5-10-5 11244 11263 T GTCCAGGACT CACCACAGA 77 204
- 396346
- 4 2-15-3 11244 11263 T GTCCAGGACT CACCACAGA 83 204
- 396270
- 4 5-10-5 11801 11820 TATGGCACCTTCTTAAATAT 85 205
- 396347
- 4 2-15-3 11801 11820 TATGGCACCTTCTTAAATAT 81 205
- 396271
- 4 5-10-5 12248 12267 T GCTTTT GGTATAGAAGAGT 86 206
- 396348
- 4 2-15-3 12248 12267 T GCTTTT GGTATAGAAGAGT 76 206
- 396235
- 4 5-10-5 12526 12545 AAAT GTGGCT GGCAGAT GTC 79 207
- 396312
- 4 2-15-3 12526 12545 AAAT GTGGCT GGCAGAT GTC 82 207
- 396236
- 4 5-10-5 12572 12591 GT CAGAGCT CAT CT ACAT CA 87 208
- 396313
- 4 2-15-3 12572 12591 GT CAGAGCT CAT CT ACAT CA 82 208
- 396237
- 4 5-10-5 12754 12773 CTGATAAAGACCAGCACCAA 69 209
- 396314
- 4 2-15-3 12754 12773 CTGATAAAGACCAGCACCAA 70 209
- 396238
- 4 5-10-5 12762 12781 AGGACT CACT GAT AAAGAC C 69 210
- 396315
- 4 2-15-3 12762 12781 AGGACT CACT GAT AAAGAC C 43 210
- 396239
- 4 5-10-5 12982 13001 CAGACT CT GAAT CAGTTTT A 78 211
- 396316
- 4 2-15-3 12982 13001 CAGACT CT GAAT CAGTTTT A 70 211
- 396240
- 4 5-10-5 13021 13040 CAGTCCCCAATT CT GCT GCC 43 212
- 396317
- 4 2-15-3 13021 13040 CAGTCCCCAATT CT GCT GCC 70 212
- 396241
- 4 5-10-5 13107 13126 CCAGT GTT AGGCT CT GCCAG 76 213
- 396318
- 4 2-15-3 13107 13126 CCAGT GTT AGGCT CT GCCAG 85 213
- 396242
- 4 5-10-5 13134 13153 GAAT GCCAGGAAAGGAGT GA 69 214
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Motivo Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 396319
- 4 2-15-3 13134 13153 GAATGCCAGGAAAGGAGTGA 84 214
- 396272
- 4 5-10-5 13171 13190 CAGCCCCAAGGCCCAAAGAT 48 215
- 396349
- 4 2-15-3 13171 13190 CAGCCCCAAGGCCCAAAGAT 57 215
- 396220
- 4 5-10-5 13491 13510 CTGCACTGGAGCAGCAGTGT 81 216
- 396297
- 4 2-15-3 13491 13510 CTGCACTGGAGCAGCAGTGT 74 216
- 396221
- 4 5-10-5 13517 13536 ACCGGTTGGCATCCATGTAA 61 217
- 396298
- 4 2-15-3 13517 13536 ACCGGTTGGCATCCATGTAA 73 217
- 396222
- 4 5-10-5 13525 13544 CCT GGGT GACCGGTT GGCAT 71 218
- 396299
- 4 2-15-3 13525 13544 CCT GGGT GACCGGTT GGCAT 82 218
- 396223
- 4 5-10-5 13802 13821 CAAGTT GGGAGACT GGAT GG 65 219
- 396300
- 4 2-15-3 13802 13821 CAAGTT GGGAGACT GGAT GG 79 219
- 396224
- 4 5-10-5 13810 13829 CTTT AAT ACAAGTT GGGAGA 68 220
- 396301
- 4 2-15-3 13810 13829 CTTT AAT ACAAGTT GGGAGA 64 220
- 396225
- 4 5-10-5 13877 13896 TCGGAAGGTCTGGTGGATAT 65 221
- 396302
- 4 2-15-3 13877 13896 TCGGAAGGTCTGGTGGATAT 83 221
- 396226
- 4 5-10-5 13896 13915 T GGGCACCAAACT GCT GGAT 70 222
- 396303
- 4 2-15-3 13896 13915 T GGGCACCAAACT GCT GGAT 76 222
- 396227
- 4 5-10-5 13937 13956 TATGGCTTCCTGGGC GCAGG 59 223
- 396304
- 4 2-15-3 13937 13956 TATGGCTTCCTGGGC GCAGG 74 223
- 396228
- 4 5-10-5 13961 13980 AAT GCT GCAAT GGGCAT CT G 78 224
- 396305
- 4 2-15-3 13961 13980 AAT GCT GCAAT GGGCAT CT G 83 224
- 396229
- 4 5-10-5 13977 13996 GTT CACT AT CACAAACAAT G 84 225
- 396306
- 4 2-15-3 13977 13996 GTT CACT AT CACAAACAAT G 67 225
- 396230
- 4 5-10-5 13997 14016 CAGTTAAGCAGCTTCCAGTT 84 226
- 396307
- 4 2-15-3 13997 14016 CAGTTAAGCAGCTTCCAGTT 85 226
- 396231
- 4 5-10-5 14028 14047 AATTTTATTTAGC CAGT CTC 80 227
- 396308
- 4 2-15-3 14028 14047 AATTTTATTTAGC CAGT CTC 79 227
- 396232
- 4 5-10-5 14046 14065 GTT GT AT AAAT AT ATT CTAA 44 228
- 396309
- 4 2-15-3 14046 14065 GTT GT AT AAAT AT ATT CTAA 25 228
- 396233
- 4 5-10-5 14065 14084 ACAGT GTTTTT GAGATT CTG 83 229
- 396310
- 4 2-15-3 14065 14084 ACAGT GTTTTT GAGATT CTG 50 229
- 396273
- 4 5-10-5 14725 14744 CTCAGGACCCAGAGTGAGGA 37 230
- 396350
- 4 2-15-3 14725 14744 CTCAGGACCCAGAGTGAGGA 50 230
- 396274
- 4 5-10-5 15073 15092 TGGGTTAAACCTCACCTCGA 59 231
- 396351
- 4 2-15-3 15073 15092 TGGGTTAAACCTCACCTCGA 56 231
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- Inhibicion de niveles humanos de ARNm CD40 por oligonucleotidos quimericos teniendo alas 4-10-4 MOE y huecos deoxi, alas 5-10-5 MOE y hueco deoxi, y alas 2-15-3 MOE y hueco deoxi
- Oligo ID
- SEQ ID NO diana Motivo Sitio de inicio diana Sitio de parada diana Secuencia (5' a 3') % Inhibicion SEQ ID NO
- 396275
- 4 5-10-5 15350 15369 ATTAGGTCCCAAAGTTCCCC 23 232
- 396352
- 4 2-15-3 15350 15369 ATTAGGTCCCAAAGTTCCCC 48 232
- 396234
- 1 5-10-5 42 61 GGCAGACGAACCATGGCGAG 86 233
- 396311
- 1 2-15-3 42 61 GGCAGACGAACCATGGCGAG 82 233
- 396213
- 1 5-10-5 435 454 GTAGCAATCTGCTTGACCCC 82 234
- 396290
- 1 2-15-3 435 454 GTAGCAATCTGCTTGACCCC 79 234
- 396218
- 1 5-10-5 590 609 GACCACAGACAACAT CAGT C 89 235
- 396295
- 1 2-15-3 590 609 GACCACAGACAACAT CAGT C 85 235
- 396219
- 1 5-10-5 683 702 CCACCTTTTT GAT AAAGAC C 65 236
- 396296
- 1 2-15-3 683 702 CCACCTTTTT GAT AAAGAC C 41 236
Ejemplo 5: Inhibicion antisentido de CD40 humano en celulas HuVEC, Conjunto de sonda de cebador LTS37
[0261] Se ensayaron varios oligonucleotidos antisentido que exhibfan inhibicion in vitro de CD40 (vease el Ejemplo 4) a diversas dosis en celulas HuVEC. Las celulas se plaquearon a densidades de 5000 celulas por pocillo y se trataron con concentraciones nM de oligonucleotidos antisentido como se indica en la Tabla 5. Despues de un penodo de tratamiento de aproximadamente de 24 horas, se aislo ARN de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de CD40 mediante analisis cuantitativo en tiempo real PCR, como se describe en la presente memoria. El conjunto de sonda de cebador CD40 humano LTS37 se uso para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de CD40, en relacion con celulas de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 5, los niveles de ARNm de CD40 se redujeron de una manera dependiente de la dosis.
Tabla 5 Inhibicion antisentido de CD40 humano en celulas HuVEC, Conjunto de sonda de cebador LTS37
- ISIS N°
- 0,2344 nM 0,4688 nM 0,9375 nM 1,875 nM 3,75 nM 7,5 nM 15,0 nM 30,0 nM
- 26163
- 17 35 38 51 62 67 82 89
- 396236
- 23 49 59 77 86 92 91 89
- 396266
- 35 45 58 74 55 72 57 56
- 396307
- 21 45 43 56 80 79 82 82
- 396218
- 34 47 52 57 78 82 86 86
- 396279
- 34 54 59 49 72 82 88 87
- 396287
- 31 48 52 50 64 77 85 86
- 396264
- 39 34 49 56 71 84 88 86
Ejemplo 6: Inhibicion antisentido de CD40 humano en celulas AGS
[0262] Los oligonucleotidos antisentido que presentan inhibicion in vitro de CD40 (vease el Ejemplo 4) se ensayaron a diversas dosis en celulas AGS (celulas de adenocarcinoma humano). Los oligonucleotidos antisentido de SEQ ID N° 90 y SEQ ID N° 208 se disenaron como 4-10-4 gapmeros o 5-10-5 gapmeros, respectivamente, donde el segmento de separacion comprende 2’-desoxinucleotidos y cada segmento de ala comprende 2’-MOE o nucleotidos 2’OMe. Los oligonucleotidos antisentido comprenden esqueletos de fosforotioato (enlaces internucleosidos) y sustituciones de 5-metilcitosina.
[0263] Las celulas se sembraron en placas a densidades de 5000 celulas por pocillo y se trataron con concentraciones de nM de oligonucleotidos antisentido como se indica en la Tabla 6. Despues de un penodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN de las celulas y los niveles relativos de expresion de ARNm de CD40 se cuantificaron mediante RT-PCR en tiempo real usando el kit de RT-PCR QuantiTect SYBR® Green (Qiagen). Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de GAPDH, un gen domestico. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibicion de CD40, en relacion con celulas tratadas con un oligonucleotido de control mezclado (TCCATT-TATTAGTCTAGGAA (5-10-5 gapmero, donde el segmento de separacion comprende 2’-desoxinucleotidos y cada segmento de ala comprende nucleotidos de 2’-MOE. El
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
oligonucleotido comprende las columnas de fosforotioato (enlaces internucleosidos) y sustituciones de 5- metilcitosina.
Tabla 6: Inhibicion antisentido de CD40 humano en celulas AGS
- ISIS N°
- Motivo Segmento de ala 12,5 nM 25,0 nM 50,0 nM Seq ID
- 26163
- 4-10-4 2'MOE 80 69 90 90
- 396236
- 5-10-5 2'MOE 83 86 94 208
- --
- 4-10-4 2'OMe 51 54 66 90
- c a n c O’/"MV/I,-. on CO on ono
[0264] Como se ilustra en la Tabla 6, los niveles de ARNm de CD40 se redujeron de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleotidos antisentido que comprenden segmentos de ala de 2’MOE son mas activos que aquellos con segmentos de ala 2’OMe.
Ejemplo 7 Inhibicion antisentido de CD40 murino in vitro
[0265] Los oligonucleotidos antisentido quimericos que tienen alas 5-10-5 MOE y separacion de desoxi y alas 4-12-4 MOE y brecha de desoxi pueden disenarse para dirigirse al CD40 murino. Estos oligonucleotidos antisentido pueden evaluarse por su capacidad para reducir el ARNm de CD40 en hepatocitos de raton primario usando metodos similares a los descritos en el estudio humano in vitro.
[0266] Por ejemplo, los hepatocitos de raton primarios pueden tratarse con oligonucleotidos antisentido de 0,2344 nM, 0,4688 nM, 0,9375 nM, 1,875 nM, 3,75 nM, 7,5 nM, 15,0 nM y 30,0 nM durante un penodo de aproximadamente 24 horas. El ARN se puede aislar de las celulas y los niveles de ARNm de CD40 se pueden medir mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en el presente documento. Los conjuntos de sondas de cebador CD40 de murino se pueden usar para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CD40 pueden ajustarse entonces segun el contenido de ARN total medido por RIBOGREEN®.
Ejemplo 8 Inhibicion antisentido de CD40 murino in vivo
[0267] Los oligonucleotidos antisentido que muestran una inhibicion dependiente de la dosis estadfsticamente significativa a partir de un estudio in vitro pueden evaluarse por su capacidad para reducir el ARNm de CD40 in vivo.
Tratamiento
[0268] El oligonucleotido antisentido se puede evaluar en ratones Balb/c y se compara con un grupo de control tratado con solucion salina. El oligonucleotido o solucion salina se administrana por via subcutanea a una dosis de 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg o 50 mg/kg dos veces por semana durante tres semanas. Despues del penodo de tratamiento, se puede recoger hngado entero para analisis de ARN y analisis de protemas.
Analisis de ARN
[0269] Se puede aislar ARN de hngado para analisis de CD40 en tiempo real de PCR. Se teoriza que un oligonucleotido antisentido que muestra una inhibicion dependiente de la dosis significativa in vitro puede mostrar una inhibicion dependiente de la dosis significativa in vivo.
Analisis de Protemas
[0270] La protema CD40 de hfgado puede medirse mediante transferencia Western.
Ejemplo 9 Tolerabilidad de compuestos antisentido en roedores
[0271] Los ratones Balb/c machos de 6 semanas de edad fueron dosificados por via subcutanea 2x por semana durante 4 semanas con 25 o 50 mg/kg de oligonucleotidos antisentido Isis 26163 o Isis 396236. Los ratones se sacrificaron 2 dfas despues de la ultima administracion. Los pesos corporales de los animales fueron monitoreados durante el estudio. Despues del sacrificio, se determino el hngado, el bazo y los pesos renales y las enzimas hepaticas ALT y AST del plasma de raton.
[0272] En comparacion con un tratamiento de control de solucion salina, los pesos de los ratones no se ven afectados por oligonucleotidos antisentido Isis 26163 o Isis 396236. El peso del hngado y el peso del bazo mostraron un ligero aumento para Isis 26163 pero no para Isis 396236. Las pruebas de LFT (prueba de funcion hepatica) eran pequenas y estaban dentro del rango normal de estudios de raton de dosis alta.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 10: Inhibicion antisentido de CD40 humano in vitro en celulas T24 - Datos comparativos para ISIS 26163 e ISIS 19216
[0273] Los oligonucleotidos antisentido ISIS 26163 e ISIS 19216 dirigidos a un acido nucleico CD40 se ensayaron para determinar sus efectos sobre ARNm de CD40 in vitro. Los oligonucleotidos antisentido se disenaron como 4-104 gapmeros, donde el segmento de hueco comprende 2’-desoxinucleotidos y cada segmento de ala comprende nucleotidos 2’-MOE. Los oligonucleotidos antisentido comprenden esqueletos de fosforotioato (enlaces internucleosidos) y sustituciones de 5-metilcitosina en todo o en las alas, respectivamente.
[0274] Se trataron celulas T24 a una densidad de 7.000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos con 100 nM o 150 nM, respectivamente, de oligonucleotido antisentido. Despues de un penodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aislo ARN de las celulas y se midieron los niveles de ARNm de CD40 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en la presente memoria. Los niveles de ARNm de CD40 se ajustaron de acuerdo con el contenido de GAPDH, un gen domestico.
[0275] Los resultados se presentan en la Tabla 7 como porcentaje de inhibicion de CD40, en relacion con celulas de control no tratadas.
Tabla 7
- Oligo ID
- Sitios diana nM en celulas T24 % Inhibicion SEQ ID N°
- 26163
- 70-87 100 98 90
- 19216
- 73-90 150 66 10
[0276] La secuencia ISIS 26163 muestra una actividad superior sobre ISIS 19216, que se superpone a la secuencia por 15 nucleobasas.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0277]
<110> ISIS Pharmaceuticals Inc .; C. Frank Bennett
<120> MODULACION DE LA EXPRESION DE CD40
<130> 33841 -513
<150> US 60 / 989.421 <151 > 2007-11-20
<160> 237
<170> FastSEQ para Windows version 4.0
<210> 1 <211>1004 <212> ADN <213> H. sapiens
<400> 1
gcctcgctcg
ctctgcagtg
catgcagaga
agaaactggt
gcgaattcct
ccaacctagg
gtgaagaagg
gctcgcccgg
cctgcccagt
caagctgtga
tctgtggtcc
tgtttgccat
aggcccccca
ccaacactgc
atggcaaaga
tgtggccacg
gcaggcagaa
ggcgcccagt
cgtcctctgg
aaaacagtac
gagtgactgc
agacacctgg
gcttcgggtc
ctggcactgt
ctttggggtc
cggcttcttc
gaccaaagac
ccaggatcgg
cctcttggtg
ccccaagcag
tgctccagtg
gagtcgcatc
tgggcaaaca
gcggggagct
ggtcctgccg
ggctgcttgc
ctaataaaca
acagagttca
aacagagaga
cagcagaagg
acgagtgagg
aagcagattg
tccaatgtgt
ctggttgtgc
ctgagagccc
ctggtcttta
gaaccccagg
caggagactt
tcagtgcagg
ggcagttggc
atgcccagtc
cctggtctca cctcgccatg gttcgtctgc 60 tgaccgctgt ccatccagaa ccacccactg 120 gtcagtgctg ttctttgtgc cagccaggac 180 ctgaaacgga atgccttcct tgcggtgaaa 240 cacactgcca ccagcacaaa tactgcgacc 300 gcacctcaga aacagacacc atctgcacct 360 cctgtgagag ctgtgtcctg caccgctcat 420 ctacaggggt ttctgatacc atctgcgagc 480 catctgcttt cgaaaaatgt cacccttgga 540 aacaggcagg cacaaacaag actgatgttg 600 tggtggtgat ccccatcatc ttcgggatcc 660 tcaaaaaggt ggccaagaag ccaaccaata 720 agatcaattt tcccgacgat cttcctggct 780 tacatggatg ccaaccggtc acccaggagg 840 agagacagtg aggctgcacc cacccaggag 900 cagagagcct ggtgctgctg ctgcaggggt 960 agtgccagcc cctc 1004
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 2 <211> 427 <212> ADN <213> H. sapeins
<220>
<221> misc_feature
<222> 13, 52, 152, 193, 245, 254, 263, 298, 305, 323, 331, 344, 374
<223> n = A, T, C o G <400> 2
gataccatct
aaatgtcacc
aacaagactg
atcatcttcg
aagangccaa
gacgntcttc
ccggtcaccc
aaggttg
gcnagccctg
cttggacaag
atgttgtctg
ggntcctgtt
ccantaaggc
ctggctccaa
aggnaggatg
cccagtcggc
ctgtgagacc
tggtccccag
tgccatcctc
ccnccacccc
cantgctgct
ggcaaagaga
ttcttctcca atgtgtcatc tnctttcgaa 60 aaagacctgg ttgtgcaaca ggcaggcaca 120 gntcggctga gagccctggt ggtgatcccc 180 ttggtgctgg tctttatcaa aaaggtggcc 240 aagcaggaac cccaggagat caattttncc 300 ncagtgcagg agantttaca tggatgccaa 360 gtcgcatttc agttgcaggg agagacagtg 420
427
<210> 3 <211> 871 <212> ADN <213> H. sapiens
<400> 3
acctcgccat
tccatccaga
gttctttgtg
aatgccttcc
accagcacaa
aaacagacac
gctgtgtcct
tttctgatac
tcgaaaaatg
tcatcttcgg
ccataggccc
agtagggagt
gattgccatg
tgagctgtga
acagttaaac
ggttcgtctg cctctgcagt accacccact gcatgcagag ccagccagga cagaaactgg ttgcggtgaa agcgaattcc atactgcgac cccaacctag catctgcacc tgtgaagaag gcaccgctca tgctcgcccg catctgcgag ccctgcccag tcacccttgg acaaggtccc atctgtttgc atctcttggt ccacccagca gacccagaga catgagcaca gtcccacggt aaaaggatgt caagataggt attttgaact ctcggccttt ttgattatga ggtttgcctt
gcgtcctctg gggctgcttg ctgaccgctg 60 aaaaacagta cctaataaac agtcagtgct 120 tgagtgactg cacagagttc actgaaacgg 180 tagacacctg gaacagagag acacactgcc 240 ggcttcgggt ccagcagaag ggcacctcag 300 gctggcactg tacgagtgag gcctgtgaga 360 gctttggtgt caagcagatt gctacagggg 420 tcggcttctt ctccaatgtg tcatctgctt 480 aggatcggct gagagcctgt ggtgatccca 540 gctgtcttat caaaaagtgg caagaactac 600 taatttctga gatttctgct caaatgtgtc 660 ggagaaccgc tctttggaga attgtgccca 720 gggttttgtg gggggtaaac cttccccttt 780 aagaatgggg ggttaaccaa tttgactcca 840 t 871
<210>4 <211>16001 <212> ADN <213> H. sapiens
<400> 4
Claims (15)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Un compuesto antisentido para uso en el tratamiento o prevencion de una afeccion inflamatoria o inmunologica asociada en la que el compuesto antisentido comprende un oligonucleotido modificado de 12 a 30 nucleobases de longitud y que tiene una secuencia de nucleobasas que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porcion de longitud igual de una region de intron del gen CD40, en las posiciones 1125012685 de SEQ ID NO: 4, correspondiente al intron 6,en el que el oligonucleotido comprende:un segmento de separacion que consiste en desoxinucleosidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en nucleosidos unidos; un segmento de ala 3’ que consiste en nucleosidos unidos;en el que el segmento de separacion esta situado entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleosido de cada segmento de ala comprende un azucar modificado,en el que la secuencia de la nucleobase del compuesto es al menos 98% complementaria a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4, yen el que el compuesto antisentido es capaz de reducir el ARNm de CD40.
- 2. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la secuencia de la nucleobase del compuesto es 100% complementaria a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4.
- 3. El compuesto antisentido para uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la secuencia de nucleobase comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porcion de longitud igual de las posiciones 12527-12685 de SEQ ID NO: 4, que es una region que puede ser ya sea parte del intron 6, o de un exon 7 alternativo, dependiendo del sitio aceptor de empalme seleccionado.
- 4. El compuesto antisentido para uso segun la reivindicacion 3, que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 208, en la que la secuencia de nucleobases del compuesto es al menos 98% complementaria a la secuencia mostrada en la sEq ID NO: 4.
- 5. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que al menos un enlace internucleosido es un enlace internucleosido modificado, y en el que cada enlace internucleosido es opcionalmente un enlace fosforotioato internucleosido.
- 6. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que al menos un nucleosido comprende un azucar modificado.
- 7. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que al menos un azucar modificado es un azucar bidclico, y en el que el al menos un azucar bidclico comprende opcionalmente un puente 4’-CH(CH3)- O-2 ’.
- 8. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que al menos un azucar modificado comprende un 2’-O-metoxietilo.
- 9. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en el que al menos una de dichas nucleobases es una nucleobase modificada, y en la que la nucleobase modificada es opcionalmente una 5- metilcitosina.
- 10. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en el que el compuesto antisentido es un oligonucleotido de cadena sencilla o de doble cadena.
- 11. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en el que el oligonucleotido modificado:(i) es 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20 nucleobases de longitud; o(ii) es 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud.
- 12. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un oligonucleotido antisentido 20 nucleobases de longitud que tiene la secuencia de nucleobases como se establece en SEQ ID NO: 208, en donde cada citosina es una 5-metilcitosina, cada enlace internucleosido es un enlace fosforotioato, los nucleotidos 1-5 y 16-20 son nucleotidos 2’-O-metoxietilo, y los nucleotidos 6-15 son 2’-desoxinucleotidos.
- 13. Una sal farmaceuticamente aceptable de un compuesto antisentido, para uso en el tratamiento o prevencion de5101520253035404550556065una afeccion inflamatoria o inmune asociada, en la que el compuesto antisentido es un compuesto antisentido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y en el que la sal farmaceuticamente aceptable esta opcionalmente una sal sodica o potasica.
- 14. Una composicion para uso en el tratamiento o prevencion de una afeccion inflamatoria o inmunologica asociada, en la que la composicion comprende un compuesto antisentido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una sal del mismo como se describe en la reivindicacion 13 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable o diluente.
- 15. El compuesto antisentido, su sal o composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la afeccion inflamatoria o inmune asociada se selecciona del grupo que consiste en rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huesped, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis o tiroiditis, Morbus Crohn y Colitis ulcerosa.
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