KR20130009760A - Ｃｄ２０ 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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cell
amino acid
lymphoma
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유타 데커트
링윈 루에이
피터 유. 파크
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이뮤노젠 아이엔씨
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    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis

Abstract

CD20은 B 세포의 표면 상에 발현된 테트라스패닌 그룹의 막관통 단백질이며, 말초 혈액뿐만 아니라 림프 조직 유래의 B 세포 상에서 발견되었다. CD 20 발현은 형질 세포 분화 단계까지 초기 전 B 세포 단계로부터 지속된다. 반대로, 조혈모세포, 프로 B 세포, 분화된 형질 세포 또는 비림프 조직상에서 발견되지 않는다. 정상적인 B 세포에서의 발현에 더하여, CD20은, 비호지킨 림프종(NHL) 및 B 세포 만성림프성 백혈병(CLL)과 같은 B 세포 유래 악성 종양에서 발현된다. CD20 발현 세포는 염증을 포함한 다른 질환 및 장애에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 우수한 물리적 및 기능적 특성을 가지는 항-CD20 항체, 형태 및 절편; 면역컨쥬게이트, 조성물, 진단 시약, 성장 억제 방법, 치료 방법, 개선된 항체 및 세포주; 및 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 이를 암호화하는 유전자 구조체를 포함한다.

Description

ＣＤ２０ 항체 및 이의 용도{CD20 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
CD20 및 CD20 아이소폼(isoform)("CD20")은 일반적으로 B 세포의 표면 상에 발현된 테트라스패닌(tetra-spanin) 그룹의 막관통 단백질인 것으로 인식된다(Valentine et al., J. Biol. Chem., 264(19): 11282-1 1287 (1989); Einfeld et al., EMBO J., 7(3):711-717 (1988)). CD20은 대부분의 말초 혈액 B 세포뿐만 아니라 다양한 림프 조직 유래의 B 세포에 의해 발현된다. CD20 발현은 일반적으로 발생의 형질 세포 분화 단계까지 발생의 초기 전 B 세포 단계로부터 지속된다(Tedder et al., J. Immunol., 135(2):973-979 (1985)). CD20은 일반적으로 조혈모세포, 프로 B 세포(pro-B cell), 분화된 형질 세포 또는 비림프 조직상 등에서 발견되지 않는다. 정상적인 B 세포에서의 발현에 더하여, CD20은, 비호지킨 림프종(NHL) 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)과 같은 B 세포 유래 악성 종양(Anderson et al., Blood, 63(6): 1424-1433 (1984)), 및 면역 장애, 자가면역 질환 및 염증 질환에 수반된 B 세포에서 발현된다.
CD20의 정확한 기능은 불명확하지만, CD20은 칼슘 동원에 관련되고 칼슘 채널로서 작용을 할 수 있다(Tedder et al., J. Cell Biochem., 14D:195 (1990)). CD20은 B 세포의 활성화 및 분화에 수반될 수 있다(Tedder et al., Eur. J. Immunol, 16(8):881-887 (1986)).
CD20의 발현 프로파일 및 기존의 CD20 항체에 대한 지식은 CD20을 항체 요법에 대한 관심의 표적으로 만들었다. 일반적으로 CD20에 대한 항체는 이의 기능적 특성에 기초하여 분류된 것이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, I형 항체는 키메라화될 때 CD20을 지질뗏목 구획으로 분배하는 능력을 특징으로 하며, 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)을 매개할 수 있다(Deans JP, J Biol Chem 1998; 273: 344-8; Cragg MS, Blood 2003;101 :1045-52; 및 Cragg MS Blood. 2004;103:2738-2743). I형 항체는 가교결합되지 않는다면, 전형적으로 그 자체에 대하여 효과적인 프로아포토시스 활성(proapoptotic activity)을 갖지 않는다. 가교결합을 필요로 하는 I형 항체의 예는 리툭시맙 및 2F2(Cragg et al., Blood, 101(3):1045-1052 (2003); 및 Teeling et al., Blood, 104(6): 1793-1800 (2004)). 그에 반해서, II형 항체는 CD20을 지질뗏목으로 분배할 수 없다. 키메라화되면, II형 항체는 제한된 CDC 활성을 가진다. II형 항체는 자체의 강한 프로아포토시스 활성을 특징으로 한다. Bl 및 GA101은 II형 항체의 예이다(Cragg MS, Blood 2003; 101:1045-52; Cragg MS Blood. 2004; 103:2738-2743; 및 Umana et al, Blood, 108:72a, Abstract 229 (2006)). I형 및 II형 항체는 잠재적으로 항체 의존성 세포매개 세포독성(antibody dependent cell mediated cytotoxicity: ADCC)을 매개할 수 있다.
B 세포 림프종과 같은 원치 않는 세포에 의한 CD20의 발현을 고려하면, 이러한 항원은 해로운 CD20 양성 세포(예컨대, 림프종 세포)를 표적화하는데 유용하다. 본질적으로, 이러한 표적화는 B 세포의 CD20 표면 항원에 대하여 특이적인 항체가 환자에게 투여되는 것으로 일반화된다. 이러한 항-CD20 항체는 특이적으로 정상 및 원치 않는(예컨대, 악성 및 면역반응성) B 세포 둘 다의 CD20 항원에 결합하고; CD20 표면 항원에 결합된 상기 항체는 B 세포의 파괴 및 고갈을 초래할 수 있다.
추가적으로, 종양 세포를 발현하는 CD20을 파괴하는 잠재력을 가지는 화학 작용제 또는 방사성 표지는 항-CD20 항체에 컨쥬게이트될 수 있어, 상기 제제는 신생 B 세포로 특이적으로 "전달"된다. 접근법에 관계없이, 주목적은 원치 않는 세포를 파괴하는 것이고; 구체적인 접근법은 이용되는 특정한 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있으며, 따라서 CD20 항원을 표적화하는데 이용가능한 접근법은 상당히 다양할 수 있다. 리툭시맙(RITUXAN(등록상표)) 항체는 CD20에 대한 유전자 조작된 키메라 뮤린(murine)/인간 단일클론 항체이다. 리툭시맙은 미국 특허 제5,736,137호(Anderson et al)에서 "C2B8"로 불린 항체이다. 리툭시맙은 현재 재발성 또는 난치성의 여포성 림프종의 치료에 대하여 승인되어 있다(Leget et al., Curr . Opin . Oncol., 10:548-551 (1998)). 보고서는, 주 1회 주입으로 리툭시맙이 48%의 전반적인 반응률을 초래하였음을 나타낸다. 그러나, 많은 환자들이 리툭시맙 치료에 반응하지 않으며, 리툭시맙을 복용하여 반응하는 환자들은 결국 재발하고 종종 리툭시맙 치료에 저항성이 생긴다. 예를 들어 현재 이용가능한 치료법에 대한 재발 및 저항성은 새로운 CD20 지향성 제제 및 치료법의 발견을 필요로 한다.
이용가능한 항체의 제한 때문에, 리툭시맙의 특이적인 기능적 양태를 개선시키는 것을 목표로 하는, CD20에 대한 차세대 항체 치료제가 개발 중에 있다. 예를 들어, 오파투무맙의 경우에, 특히 CD20 항원 밀도가 더 낮은 세포에서 시험관내 CDC 활성이 개선된 인간 단일클론 2F2 항체가 보고되었다(Teeling et al, J. Immunol, 177(1):362-371 (2006)). 아푸투주맙(afutuzumab) 또는 GA101은 시험관 내시험관 내시맙에 비하여 프로아포토시스 활성의 개선이 거의 없음이 보고되었지만, GA101은 CDC 활성을 입증하지 못한다(Umana P, Blood 2006; 108:72a, Abstract 229 및 WO 2005/044859). 게다가, GA101은 ADCC 활성이 개선된 글리코조작된(glycoengineered) 인간화 항체이다(Umana et al., Blood 2006; 108:72a, Abstract 229; 및 WO 2005/044859). 다양한 개발 단계에서 다른 화합물은 리툭시맙 또는 다른 알려진 항-CD20 항체의 특정한 내재적 특성을 조금만 개선시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 지금까지 당업계에 알려진 문제점을 다루는 특유의 물리적 및 기능적 특징을 가지는 이용가능한 신규 분자는 없었다.
리툭시맙은 또한 미국에서 적어도 하나의 TNF 길항제에 대하여 부적절한 반응이 있었던 중간 정도 활성 내지 심각한 활성의 RA가 있는 성인 환자에서 징후 및 증상을 감소시키는 MTX와 조합하여 승인되었다. 많은 연구가 다양한 비악성 자가면역 또는 염증성 장애, 예를 들어 RA에서 리툭시맙의 사용을 다루며, 여기에서 B 세포 및 자가항체는 질환 병태생리학에서 역할을 하는 것으로 보인다. (Edwards et al, Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)). 항-CD20 항체를 사용한 CD20의 표적화는, 예를 들어 RA(Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61 :883-888 (2002); Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002); Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al, Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), 루푸스(Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5: 157-159 (2003); Leandro et al. Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al, Lupus, 13: 312-316 (2004)), 면역성 혈소판 감소성 자반증(D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al, Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al., Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000); Zaja et al., Haematologica, 87:189-195 (2002); Ratanatharathorn et al, Ann. Int. Med., 133:275-279 (2000)), 적아구로(Auner et al., Br. J. Haematol, 116:725-728 (2002)); 자가면역성 빈혈(Zaja et al., supra (erratum appears in Haematologica 87:336 (2002)), 한랭응집소병(Layios et al., Leukemia, 15:187-8 (2001); Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J. Haematol., 115:79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol., 112:1083-1090 (2001); Zaja et al., Br. J. Haematol., 1 15:232-233 (2001)), 심각한 인슐린 저항성의 B형 증후군(Coll et al., N. Engl. J. Med., 350:310-311 (2004)), 혼합 한랭글로불린혈증(DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)), 중증 근무력증(Zaja et al., Neurology, 55:1062-1063 (2000); Wylam et al., J. Pediatr., 143:674-677 (2003)), 베게너 육아종증(Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001)), 난치성 심상성 천포창(Dupuy et al., Arch Dermatol, 140:91-96 (2004)), 피부근염(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)), 쇼그렌 증후군(Somer et al, Arthritis & Rheumatism, 49:394-398 (2003)), 활성 II형 혼합 한랭글로불린혈증(Zaja et al., Blood, 101 :3827-3834 (2003)), 심상성 천포창(Dupay et al., Arch. Dermatol., 140:91-95 (2004)), 자가면역 신경병증(Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)), 부종양성 안구간대경련-근간대경련 증후군(Pranzatelli et al. Neurology 60 (Suppl. 1) P05.128:A395 (2003)), 및 재발-이장성 다발성경화증(RRMS)(Cross et al. (abstract) "Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003))의 징후 및 증상을 잠재적으로 완화시키는 것으로 보고되었다.
CD20 항체, CD20-결합 분자, 및 자기 항원 백신에 관한 특허 및 특허 공개는 미국 특허 제5,776,456호, 제5,736,137호, 제5,843,439호, 제6,399,061호 및 제6,682,734호뿐만 아니라 US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885, US 2005/0186205, 및 WO 1994/11026(Anderson et al); 미국 특허 제6,455,043호, US 2003/0026804, US 2003/0206903, 및 WO 2000/09160(Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428(Grillo-Lopez 및 White); US 2004/0213784 및 WO 2000/27433(Grillo-Lopez 및 Leonard); WO 2000/44788(Braslawsky et al.); WO 2001/10462(Rastetter, W.); WO 2001/10461(Rastetter 및 White); WO 2001/10460(White 및 Grillo-Lopez); US 2001/0018041, US 2003/0180292, US 2002/0028178, WO 2001/34194, 및 WO 2002/22212(Hanna 및 Hariharan); US 2002/0006404 및 WO 2002/04021(Hanna 및 Hariharan); US 2002/0012665, US 2005/0180975, WO 2001/74388, 및 미국 특허 제6,896,885호 B5(Hanna, N.); US 2002/0058029(Hanna, N.); US 2003/0103971(Hariharan 및 Hanna); US 2005/0123540(Hanna et al.); US 2002/0009444 및 WO 2001/80884(Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858; US 2005/0112060, US 2002/0039557, 및 미국 특허 제6,846,476호(White, C); US 2002/0128448 및 WO 2002/34790(Reff, M.); WO 2002/060955(Braslawsky et al); WO 2002/096948(Braslawsky et al.); WO 2002/079255(Reff 및 Davies); 미국 특허 제6,171,586 및 6,991,790호, 및 WO 1998/56418(Lam et al.); US 2004/0191256 및 WO 1998/58964(Raju, S.); WO 1999/22764(Raju, S.); WO 1999/51642, 미국 특허 제6,194,551호, 미국 특허 제6,242,195호, 미국 특허 제6,528,624호 및 미국 특허 제6,538,124호(Idusogie et al.); 미국 특허 제7,122,637호, US 2005/0118174, US 2005/0233382, US 2006/0194291, US 2006/0194290, US 2006/0194957, 및 WO 2000/42072(Presta, L.); WO 2000/67796(Curd et al.); WO 2001/03734(Grillo-Lopez et al.); US 2002/0004587, US 2006/0025576, 및 WO 2001/77342(Miller 및 Presta); US 2002/0197256 및 WO 2002/078766(Grewal, I.); US 2003/0157108 및 WO 2003/035835(Presta, L.); 미국 특허 제5,648,267, 5,733,779, 6,017,733 및 6,159,730호, 및 WO 1994/11523(Reff et al.); 미국 특허 제6,565,827, 6,090,365, 6,287,537, 6,015,542, 5,843,398 및 5,595,721호(Kaminski et al.); 미국 특허 제5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 6,120,767, 6,652,852 및 6,893,625호뿐만 아니라 WO 1988/04936(Robinson et al.); 미국 특허 제6,410,391호(Zelsacher); 미국 특허 제6,224,866호 및 WO00/20864(Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945(Barbera-Guillem, E.); WO 2000/67795(Goldenberg); 미국 특허 제7,074,403호(Goldenberg 및 Hansen); 미국 특허 제7,151,164호(Hansen et al.); US 2003/0133930; WO 2000/74718 및 US 2005/0191300A1(Goldenberg 및 Hansen); US 2003/0219433 및 WO 2003/68821(Hansen et al); WO 2004/058298(Goldenberg 및 Hansen); WO 2000/76542(Golay et al); WO 2001/72333(Wolin 및 Rosenblatt); 미국 특허 제6,368,596호(Ghetie et al); 미국 특허 제6,306,393호 및 US 2002/0041847(Goldenberg, D.); US 2003/0026801(Weiner 및 Hartmann); WO 2002/102312(Engleman, E.); US 2003/0068664(Albitar et al.); WO 2003/002607(Leung, S.); WO 2003/049694, US 2002/0009427, 및 US 2003/0185796(Wolin et al.); WO 2003/061694(Sing 및 Siegall); US 2003/0219818(Bohen et al.); US 2003/0219433 및 WO 2003/068821(Hansen et al); US 2003/0219818(Bohen et al.); US 2002/0136719(Shenoy et al); WO 2004/032828 및 US 2005/0180972(Wahl et al.); 및 WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)를 포함한다. 또한 미국 특허 제5,849,898호 및 EP 330,191(Seed et al.); EP 332,865 A2(Meyer 및 Weiss); 미국 특허 제4,861,579호(Meyer et al.); US 2001/0056066(Bugelski et al.); WO 1995/03770(Bhat et al.); US 2003/0219433 Al(Hansen et al.); WO 2004/035607 및 US 2004/167319(Teeling et al); WO 2005/103081(Teeling et al.); US 2006/0034835, US 2006/0024300, 및 WO 2004/056312(Lowman et al.); US 2004/0093621(Shitara et al); WO 2004/103404(Watkins et al.); WO 2005/000901(Tedder et al.); US 2005/0025764(Watkins et al.); US 2006/0251652(Watkins et al); WO 2005/016969(Carr et al.); US 2005/0069545(Carr et al.); WO 2005/014618(Chang et al.); US 2005/0079174(Barbera-Guillem 및 Nelson); US 2005/0106108(Leung 및 Hansen); US 2005/0123546(Umana et al.); US 2004/0072290(Umana et al.); US 2003/0175884(Umana et al.); 및 WO 2005/044859(Umana et al.); WO 2005/070963(Allan et al); US 2005/0186216(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0202534(Hayden-Ledbetter 및 Ledbetter); US 2005/136049(Ledbetter et al.); US 2003/118592(Ledbetter et al.); US 2003/133939(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0202012(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); 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항-CD20 항체를 이용한 치료에 관한 일부 과학 간행물은 다음을 포함한다: Perotta 및 Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Abstract #3360 Blood, 10(l)(part 1-2):88B (1998); Perotta et al., "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94:49 (abstract) (1999); Matthews, R., "Medical Heretics" New Scientist, (7 Apr., 2001); Leandro et al., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis., supra; Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism, 44(9):S370 (2001); Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus" Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)(여기에서, 2주의 기간 동안 각각의 환자들은 CD20의 항체의 2번의 500mg 주입, 사이클로포스파마이드 및 고용량의 경구 코르티코스테로이드의 2번의 750mg 주입을 받고, 치료받은 환자 중 2명은 각각 7개월 및 8개월 째에 재발하여 상이한 프로토콜이긴 하지만 재치료받음); "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide et al., Lupus, 12:779-782 (2003)(여기에서, 환자는 항-CD20 항체로 치료받으며(375㎎/㎡×4, 주간 간격으로 반복됨), 또한 항체 적용은 5 내지 6개월마다 이루어졌고, 그 다음 유지 요법은 3개월마다 375㎎/㎡의 항체로 받았으며, 난치성 SLE가 있는 제2 환자는 항-CD20 항체 리툭시맙으로 치료받고 3개월마다 유지 요법을 계속 받음); Edwards 및 Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology, 40:205-211 (2001); Cambridge et al., "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Cambridge et al., "Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis" Arthritis Rheum., 48:2146-2154 (2003); Edwards et al, "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem Soc. Trans., supra; Edwards et al., "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis", Arthritis and Rheumatism, 46(9):S197 (2002); Edwards et al., "Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis" N Engl. J. Med., 350:2572-2582 (2004); Pavelka et al., Ann. Rheum. Dis., 63:(Sl):289-290 (2004); Emery et al., Arthritis Rheum. 50 (S9):S659 (2004); Levine 및 Pestronk, "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology, 52:1701-1704 (1999); Uchida et al., "The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 antibody immunotherapy" J. Exp. Med., 199:1659-1669 (2004); Gong et al., "Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy" J. 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(October, 2002), published as Tuscano, Arthritis Rheum. 46:3420 (2002); "Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin 및 Chan, Immunity, 20:517-527 (2004); Silverman 및 Weisman, "Rituximab therapy and autoimmune disorders, prospects for anti-B cell therapy", Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003); Kazkaz 및 Isenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Current Opinion in Pharmacology, 4:398-402 (2004); Virgolini 및 Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases" Biomedicine & Pharmacotherapy, 58: 299-309 (2004); Klemmer et al., "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with an AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab" Arthritis And Rheumatism, 48(9) (SEP):S624-S624 (2003); Kneitz et al., "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases" Immunobiology, 206:519-527 (2002); Arzoo et al, "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD 20 monoclonal antibody (rituximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61(10):922-924 (2002) Comment in Ann. Rheum. Dis. 61 :863-866 (2002); "Future strategies in immunotherapy" by Lake and Dionne, in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (John Wiley & Sons, Inc., 2003) (Chapter 2 "Antibody-Directed Immunotherapy"); Liang 및 Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target (2002); 표제가 "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens"인 Appendix 4A, Stockinger et al., eds: Coligan et al., in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 2003); Penichet 및 Morrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering" in Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies (2002).
또한, Looney, "B cells as a therapeutic target in autoimmune diseases other than rheumatoid arthritis" Rheumatology, 44 Suppl 2:iil3-iil7 (2005); Chambers 및 Isenberg, "Anti-B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Lupus, 14(3):210-214 (2005); Looney et al., "B-cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus: a phase I/II dose-escalating trial of rituximab" Arthritis Rheum., 50:2580-2589 (2004); Looney, "Treating human autoimmune disease by depleting B cells" Ann Rheum. Dis., 61 :863-866 (2002); Edelbauer et al., "Rituximab in childhood systemic lupus erythematosus refractory to conventional immunosuppression Case report" Pediatr. Nephrol., 20(6): 811-813 (2005); D'Cruz 및 Hughes, "The treatment of lupus nephritis" BMJ, 330(7488):377-378 (2005); Looney, "B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis" J. Rheumatol. Suppl., 73: 25-28-discussion 29-30 (2005); Sfikakis et al., "Remission of proliferative lupus nephritis following B cell depletion therapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory molecule CD40 ligand: an open-label trial" Arthritis Rheum., 52(2):501-513 (2005); Rastetter et al., "Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases" Annu. Rev. Med., 55:477-503 (2004); Silverman, "Anti-CD20 therapy in systemic lupus erythematosus: a step closer to the clinic" Arthritis Rheum., 52(2):371-377 (2005), Erratum in: Arthritis Rheum. 52(4):1342 (2005); Ahn et al., "Long-term remission from life-threatening hypercoagulable state associated with lupus anticoagulant (LA) following rituximab therapy" Am. J. Hematol., 78(2): 127-129 (2005); Tahir et al., "Humanized anti-CD20 monoclonal antibody in the treatment of severe resistant systemic lupus erythematosus in a patient with antibodies against rituximab" Rheumatology, 44(4):561-562 (2005), Epub 2005, Jan. 11; Looney et al., "Treatment of SLE with anti CD20 monoclonal antibody" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 193-205 (2005); Cragg et al., "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174 (2005); Gottenberg et al., "Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43 patients with systemic autoimmune diseases" Ann. Rheum. Dis., 64(6):913-920 (2005) Epub 2004 Nov. 18; Tokunaga et al., "Down-regulation of CD40 and CD80 on B cells in patients with life-threatening systemic lupus erythematosus after successful treatment with rituximab" Rheumatology 44(2): 176-182 (2005), Epub 2004 Oct. 19를 참조할 수 있다. 또한 문헌[Leandro et al., "B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl 9): SI 160 (2003)]를 참조할 수 있다.
또한, 베게너 육아종증을 치료하기 위하여 항-CD20 항체 및 고용량 글루코코르티코이드 375 ㎎/㎡의 4번의 주입의 사용을 개시한, 문헌[Specks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism, 44(12):2836-2840 (2001)]을 참조할 수 있다. cANCA가 재발할 때 상기 치료를 11개월 후에 반복하였지만, 치료는 글루코코르티코이드없이 하였다. 항-CD20 항체의 제2 코스 후 8개월 때, 환자의 질환은 완전관해 상태로 남아있었다. 다른 연구에서, 항-CD20 항체가 1㎎/㎏/일로 경구용 프레드니손과 함께 375㎎/㎡×4의 용량으로 사용될 때 심한 ANCA-연관 혈관염의 관해가 보고되었으며, 상기 항-CD20 항체는 제4주까지 40mg/일로 감소되었고,이후 16주에 걸쳐서 완전한 중지로 감소되었다. 4명의 환자는 재발/상승하는 ANCA 역가에 대하여 항-CD20 항체 단독으로 재치료되었다. 문헌[Keogh et al., Kidney Blood Press. Res., 26:293 (2003)]은 난치성 ANCA-연관 혈관염이 있는 환자는 4주간 375 ㎎/㎡ 용량의 항-CD20항체와 고용량의 글루코코르티코이드를 이용한 치료시 관해됨을 보고하였다.
난치성 ANCA-연관 혈관염이 있는 환자는 면역억제 약제, 예를 들어 정맥내 사이클로포스파마이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린 또는 레플루노마이드와 함께 항-CD20 항체를 투여받았다. Eriksson, "Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab" Kidney and Blood Pressure Research, 26:294 (2003)(여기에서 ANCA-연관 혈관염이 있는 5명의 환자는 1주일에 한번 4주 동안 항-CD20 항체 375 ㎎/㎡로 치료받음); Jayne et al., "B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26:294-295 (2003)(배경 면역억제와 프레드니솔론과 함께 375㎎/㎡로 항-CD20 항체를 사이클로포스파마이드와 함께 주입을 4주간 받은 난치성 혈관염이 있는 6명의 환자가 혈관염 활성에서 변화를 겪음). 난치성 전신 혈관염이 있는 환자에게 투여에 있어서 4회 용량에서 용량 당 375㎎/㎡에서 정맥내 사이클로포스파마이드와 함께 항-CD20 항체를 사용한 추가 보고가 문헌[Smith 및 Jayne, "A prospective, open label trial of B-cell depletion with rituximab in refractory systemic vasculitis" poster 998 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), American Society of Nephrology, J. Am. Soc. Nephrol., 14:755A (2003)]에서 제공된다. 또한, 문헌[Eriksson, J. Internal Med., 257:540-548 (2005)](항-CD20 항체 500mg의 2주 또는 4주의 용량으로 치료한 ANCA-양성 혈관염이 있는 9명의 환자에 관한 것임); 및 [Keogh et al., Arthritis and Rheumatism, 52:262-268 (2005)](난치성 ANCA-연관 혈관염이 있는 11명의 환자에서, 4주간 항-CD20 항체 375㎎/㎡ 용량을 이용한 치료 또는 재치료는 전하는 바에 따르면 B-림프구 고갈에 의해 관해를 유도하였음을 보고함)을 참조할 수 있다.
인간화 항-CD20 항체의 활성에 관해서, 예를 들어 문헌[Vugmeyster et al., "Depletion of B cells by a humanized anti-CD20 antibody PRO70769 in Macaca fascicularis," J. Immunother., 28:212-219 (2005)]을 참조할 수 있다. 인간 단일클론 항체의 논의에 있어서, 문헌[Baker et al., "Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator," Arthritis Rheum., 48:3253-3265 (2003)]을 참조할 수 있다. 항-CD20을 이용한 MINT 시험은 더 젊은 환자에서 공격성 비호지킨 림프종을 치료하는 것을 수반하여 수행되었다. (Pfreundschuh et al., Lancet Oncology, 7(5):379-391 (2006)).
또한 항체-세포독성제 컨쥬게이트(또는 "ACC")(또는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)라고도 불림)는 특화된 화학적 링커를 통하여 항체에 공유적으로 연결된 세포독성 제제로 이루어진 면역컨쥬게이트의 유형으로 알려져 있다. 세포독성제 또는 세포분열억제제, 즉 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 또는 억제하는 약물(문헌[Syrigos 및 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz 및 Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151 -172; U.S. Pat. No. 4,975,278] 참조)의 국소 전달을 위한 ACC의 사용은 종양으로 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 안에서 세포 내 축적이 되게 하며, 이러한 비컨쥬게이트된 약물 제제의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대하여 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있다(Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of 세포독성 Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 최소한의 독성을 가지는 최대한의 효능을 찾아내고자 한다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체 전부 때때로 이러한 점과 관련하여 유용한 것으로서 보고되었다(문헌[Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21 : 183-87] 참조). 이러한 점과 관련하여 사용된 것으로 알려진 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 포함한다(Rowland et al, Cancer Immunol. Immunother. 21 : 183-87 (1986)). 항체-독소 컨쥬게이트에 사용된 독소는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신(Kerr et al (1997) Bioconjugate Chem. 8(6):781-784; Mandler et al (2000) Journal of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드(EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리키아마이신(Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)과 같은 소분자독소를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포아이소머라아제 억제를 포함한 다양한 메커니즘을 통하여 세포독성 및/또는 세포분열억제 효과를 발휘할 수 있다. (Meyer, D. L. 및 Senter, P. D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" in Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Chapter 23, 229-237). 그러나 많은 세포독성 약물이 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드와 컨쥬게이트될 때 불활성화되거나 또는 활성이 작아지는 경향이 있다.
항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 세포의 표면 상에 발현된 항원을 표적화하는 단일클론 항체 및 항체에 공유적으로 연결된 메이탄신 유래 화합물(예컨대, 미세소관 중합화를 억제하는 강력한 항유사분열 약물)로 구성되어 있다. (Chari RV, Acc. Chem. Res. 2008 Jan;41(1):98-107). 적절한 링커와 함께, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트(AMC)는 생체 내에서 안정적일 수 있고, 표적 항원을 발현하지 않는 세포에 대하여 상당히 덜 독성일 수 있으며, 이에 의하여 컨쥬게이트의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 세포 표면 상의 표적 항원에 결합 시, AMC는 내재화되고, 리소좀 내에서, 아마도 프로테아제에 의해 파괴되어, 활성 메이탄시노이드 대사산물을 생성한 다음, 상기 메이탄시노이드 대사산물은 미세소관에 결합하여 억제하며, 이에 의하여 세포 주기의 휴지기 그리고 궁극적으로는 아포토시스(apoptosis)에 의해 일어날 수 있는 세포 사멸을 촉발한다. (Erickson et al, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4426-33). 메이탄시노이드 컨쥬게이션과 함께, mAb는 시험관 내 및 생체 내에서 표적화된 사멸 활성을 개선시킬 수 있다.
현재, 다수의 ACC가 임상 실험 및 전임상 개발에서 연구되고 있다. 이상적으로, 면역컨쥬게이트는 항체 요법과 유사하게, 환자에게 용이하게 투여될 수 있다. 특히 트라스투주맙-SMCC-DM1(T-DM1)이라고 불리는 한 가지 ACC는, 트라스투주맙 및 화학 요법에 실패한 반면, 또한 유리한 낮은 독성 프로파일을 나타내는 HER2-과발현 전이성 유방암 환자에서 효과적인 것으로 보고되었다. 문헌[Vogel CL, ASCO 2009 Abstract #1017]을 참조할 수 있다.
항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트, 예를 들어 비절단성 SMCC와 합성된 트라스투주맙-SMCC-DM1의 혈장 클리어런스는 항체 단독의 클리어런스와 비교하여 매우 느리다. (US2005/0169933). 이는 비교적 불안정한 이황화 결합으로 제조된 컨쥬게이트, 예를 들어 huC242-SPP-DM1의 혈장 클리어런스와 극명하게 대조적이다. 예를 들어, SMCC 컨쥬게이트의 클리어런스에 대한 반감기는 대략 320시간인 반면, SPP 컨쥬게이트에 대한 반감기는 약 40 내지 50시간의 범위이다. 그러나, 컨쥬게이트의 각각의 유형에 대한 항체 성분의 클리어런스는 동일하며, 이는 측정된 컨쥬게이트 클리어런스율에서의 상이함이 항체 컨쥬게이트로부터의(즉, SPP-DM1 컨쥬게이트의 경우에) 메이탄시노이드의 손실 때문일 수 있음을 시사한다. 비절단성 SMCC 연결은 아마도 SPP-DM1 컨쥬게이트보다 생체 내에서 훨씬 더 저항성의 메이탄시노이드-링커 절단 활성을 가진다. 또한, SPP-DM1 컨쥬게이트에 비하여 SMCC 링커 컨쥬게이트에 대한 감소된 클리어런스율은 곡선 아래의 면적(AuC)에 의해 측정된 바와 같이 동물의 전반적인 메이탄시노이드 노출에서 거의 5배 증가로 이어진다. 이러한 증가된 노출은 약물 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
비절단성 링커로 제조된 메이탄시노이드 컨쥬게이트, 예를 들어 SMCC는 절단성 이황화 링커로 제조된 컨쥬게이트에 비하여 마우스에서 예상치못한 증가된 내약성(tolerability)을 보여준다. (US2005/0169933). 예를 들어, huC242-SMCC-DM1 및 huC242-SPP-DM1 컨쥬게이트의 내약성은 CD-1 마우스에서 단일 정맥내 투여량을 이용한 급성 독성 시험에서 비교되었다. 이황화-링커 컨쥬게이트 SPP-DM1에 대한 MTD가 45~90㎎/㎏의 범위이었던 반면, SMCC-DM1 컨쥬게이트에 대한 최대 내약 용량(MTD)는 시험된 가장 높은 투여량(150㎎/㎏)보다 더 컸다. 150㎎/㎏에서, SMCC-DM1로 처치된 그룹에서 모든 마우스는 생존한 반면, 치사 독성은 96시간 후-처치에 의하여 SPP-DM1로 처치된 그룹에서 모든 마우스에 대하여 관찰되었다. 추가적으로, 비환원성 티오에테르-연결된 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트 트라스투주맙-SMCC-DM1은 절단성 이황화-연결된 트라스투주맙-SMCC-DM1보다 래트에서 2 내지 3배 더 우수한 내약성을 보여주었다. (Lewis Phillips GD, Li G, Dugger DL, et al., Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1, an antibody-cytotoxic drug conjugate, Cancer Res 2008; 68:9280-90). 그러므로, 비절단성 링커로 제조된 항체 약물 컨쥬게이트, 예를 들어 SMCC는 전임상 모델에서 유리한 독성 및 약동학 파라미터를 나타낼 수 있다.
CD20은 당업계에 알려져 있지만, 알려진 항-CD20 항체는 내재화가 잘 되지 않으므로, CD20은 항체-약물 컨쥬게이션에 대하여 유리한 표적이 아니다. (Press OW, Cancer Res. 1989; 49:4906-12 및 Vangeepuram N, Cancer 1997; 80 (Suppl.): 2425-30). CD20 항체의 컨쥬게이트는 이전에 연구되었지만, 특히 비이황화 연결 또는 산 안정적인 링커가 사용될 때 상당히 강한 효력을 나타내지 않았다.
예를 들어, 항-CD20 항체의 비절단성 SMCC-DM1 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트 항체와 동일한 효능을 가지는 반면, 동일한 항체의 절단성 SPP-DM1 컨쥬게이트만은 SCID 마우스의 Granta-519 이종이식 모델에서 미미하게 개선된 효능을 보인 것으로 보고되었다. (Polson et al., Cancer Res ., 69(6):2358-2364 (2009)). 유사하게, 산-안정성 아마이드 링커로 제조된 항-CD20 항체의 칼리키아마이신 컨쥬게이트는 누드 마우스의 Ramos 이종이식 모델에서 리툭시맙에 비하여 개선된 생체 내 효능을 보이지 않은 것은 것으로 보고되었다. 산-안정성 다이메틸 하이드라자이드 Ac-But 링커로 제조된 리툭시맙의 칼리키아마이신 컨쥬게이트만이 이 연구에서 개선된 생체 내 효능을 보였다. (DiJoseph　et　al., Cancer Immunol . Immunotherapy, 56(7):1107-1117 (2007)). 상이한 연구에서, 항-CD20 항체의 산 불안정성 아드리아마이신 컨쥬게이트는 Daudi 이종이식 모델에 대하여 단지 중간 정도로 효과적이었던 것으로 보고되었다. 동일한 항체의 산 안정성 아드리아마이신 컨쥬게이트는 완전히 효과적이지 않은 것으로 나타났다. (Braslawsky et al., Cancer Immunol Immunotherapy, 33:367-74 (1991)). 보고에 의하면 리툭시맙-vcMMAE로서 효소-절단성 펩티드 연결을 통하여 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)에 컨쥬게이트된 리툭시맙은 Ramos 림프종 세포에 대하여 시험관 내 및 생체 내 효능을 보였다. (Law et al., Clin. Cancer Res., 10(23):7842-7851 (2004); Erratum in: Clin. Cancer Res., 11(10):3969 (2005)).
B 세포 장애의 치료에서 효과적인 단일클론 항체의 능력을 개선시 다른 보고된 접근법은 항체에 방사성 표지를 컨쥬게이트하여 표지가 항원 부위에 국재화되도록 한다. CD20-표적화 방사성-면역컨쥬게이트인 벡사(Bexxar(등록상표))(131I-토시투모맙) 및 제발린(Zevalin)(90Y-이브리투모맙 티욱세탄)은 리툭시맙에 대하여 난치성인 환자를 포함하여, 재발성 또는 난치성의 비호지킨 B 세포 림프종 환자에 대하여 승인되었다. 임상적 세팅에서, 일부 리툭시맙-난치성 환자는 벡사(등록상표)에 대해 차도를 보였다. (Horning, J. Clin. Oncol. 2005; 23:712-9). 제발린 및 리툭시맙이 재발성 또는 난치성의 낮은 등급 또는 여포성 NHL에서 비교될 때, 보고에 의하면 제발린 치료는 리툭시맙 치료보다 상당히 더 양호한 전반적이면서 완전한 반응률을 보였다. (Witzig, J Clin Oncol 2002; 20:2453-2463). 이들 임상 데이터는 항-CD20 방사성-면역컨쥬게이트가 리툭시맙보다 더 효과적일 수 있음을 시사하는 반면, 항-CD20 방사성-면역컨쥬게이트는 방사성 화합물을 사용하는 것과 연관된 투여에서 추가적인 독성 및 어려움 때문에 광범위하게 사용되지 않는다. 따라서, 투여하기에 용이하면서 독성이 더 낮은 효과적인 항-CD20 항체 및 컨쥬게이트를 개발할 필요성이 있어왔다.
따라서, 공지된 치료제보다 특이성, 감소된 톡성, 안정성 및 향상된 물리적 및 기능적 특성을 나타내는 항체 또는 항체 절편을 포함하여 개선되고 우수한 CD20 표적화 치료제의 개발에 대한 필요성이 계속 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.
이제 본 발명의 특정 양태에 대하여 상세하게 언급할 것이며, 이의 예는 수반되는 구조식 및 화학식에 예시된다. 본 발명은 열거된 양태와 함께 기술될 것이지만, 이들 예가 본 발명을 이러한 양태로 한정하고자 함이 아닌 것으로 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 청구항으로 한정되는 바와 같은 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 균등물을 포함하는 것으로 의도된다. 당업자는 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이며, 이는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 항-CD20 항체 및/또는 이의 절편이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 세포융해 항-CD20 항체 및/또는 이의 절편이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항-CD20 세포융해 항체 및 절편은, CD20을 발현하는 B 세포가 질병의 진행에 영향을 미치는 질병의 치료에서 유용하다. 하나의 양태에서, 표적화된 B 세포는 원하지 않는다. 하나의 양태에서, 질병은 원치 않는 B 세포의 활성을 수반한다. 하나의 양태에서, 질병은 B 세포 질환이다. 본 발명의 다른 양태는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있다. 바람직한 양태에서, 질병은 비호지킨 림프종이다.
본 발명의 하나의 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있고, 항체 또는 절편은 뮤린, 비인간, 인간화, 키메라, 재표면화(resurfaced) 또는 인간의 것이다. 본 발명의 다른 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있고, 상기 항체 또는 절편은 단일클론 또는 단일 사슬이다.
본 발명의 하나의 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편을 포함하며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있고, 상기 항체는 CHO 또는 NS0 세포로부터 획득된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 그의 절편은 CD20의 제3 막관통 도메인과 제4 막관통 도메인 사이에 위치하는 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 서열번호 45의 아미노산, 또는 GI 21330989, GenBank Protein ID 23110989 등 중의 임의의 하나에 해당하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 다른 양태는 항체 또는 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 CD20을 발현하는 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 항체 또는 절편은 III형 항체이며, 이는 II형 항체와 유사하게 가교제의 부재 하에 아포토시스를 상당히 유도하는 능력을 가지고, I형 항체와 유사하게 CD20의 지질뗏목으로의 재분배를 야기하고 보체 의존성 세포독성(CDC)을 상당히 유도할 능력을 가진다.
본 발명의 하나의 양태는 항-CD20 항체 또는 절편을 포함하며, 상기 항체 또는 절편은 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA 또는 FACS 분석에서 CD20에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항-CD20 항체 또는 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGDCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 다이아바디(diabody), (scFv)2, 단일 도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, 또는 scFv-Fc를 포함한다. 본 발명의 다른 양태는 항체 또는 절편 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 이의 컨쥬게이트이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 IgG1 불변 도메인, IgG2 불변 도메인, IgG3 불변 도메인 및 IgG4 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 양태에서 항-CD20 항체는 CD20-6이다. 본 발명의 다른 양태에서, 항-CD20 항체는 CD20-7이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 림프종 세포의 아포토시스를 유도한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 Ramos 림프종 세포 및/또는 Raji 림프종 세포 및/또는 WSU-DLCL-2 림프종 세포 및/또는 Jeko-1 림프종 세포 및/또는 Granta-519 림프종 세포의 아포토시스를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재 하에 아넥신(Annexin)-V 염색에 의하여 측정된 바와 같이 Ramos 림프종 세포 및/또는 Raji 림프종 세포 및/또는 WSU-DLCL-2 림프종 세포 및/또는 Jeko-1 림프종 세포 및/또는 Granta-519 림프종 세포의 아포토시스를 유도한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재 하에 아넥신-V 염색에 의하여 측정된 바와 같이 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48% 및/또는 Raji 림프종 세포의 적어도 약 53% 및/또는 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34% 및/또는 Jeko-1 림프종 세포의 적어도 약 12% 및/또는 Granta-519 림프종 세포의 적어도 약 40%에서 아포토시스를 유도한다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재 하에 약 0.2nM 이하의 EC50으로 림프종 세포의 아포토시스를 유도할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재하에서 0.2nM 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포의 적어도 48%에서 아포토시스를 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20을 발현하는 세포막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20을 발현하는 림프종 세포 및/또는 CD20을 발현하는 면역-조절 세포의 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 Ramos 림프종 세포의 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 보체가 있는 약 5% 인간 혈청의 존재 하에서 CDC에 의하여 약 0.018㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포를 사멸하고/사멸하거나 약 0.25㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Daudi 림프종 세포를 사멸하고/사멸하거나 약 0.58㎍/㎖ 이하의 EC50으로 WSU-DLCL-2 림프종 세포를 사멸한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 이는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 이는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 이는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나, 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 가진다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 여기에서 CD20 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 프롤린을 가지지 않고/않거나 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 가지지 않는다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 서열번호 25~30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 서열번호 17~22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 서열번호 25~30 및 17~22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기에서 상기 항체 또는 절편은 CD20에 결합한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 포함하며, 여기에서 상기 중쇄는 서열번호 20~22 또는 28~30의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 17~19 또는 25~27의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, Ab 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 96%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 97%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 98%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36의 아미노산 서열을 가진다.
분비 신호 서열을 형성하는 서열은 성숙한 폴리펩티드에 존재하지 않는다.
본 발명은 인간 CD20에 결합하는 재표면화한 항체, 또는 이의 항원-결합 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며, 이는 생체 내에서 B 세포를 고갈시킨다. 또 다른 양태에서, B 세포는 인간 또는 사이노몰거스 원숭이에서 유래한다. 다른 양태에서, CDR은, 잔기가 공여자 항체 유래의 것도 아니고 수용자 항체 유래의 것도 아닌 아미노산 치환을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 전장 항체이며, 여기에서 VH 영역은 인간 IgG 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 바람직한 양태에서, IgG는 인간 IgG1 또는 IgG3이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 96%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 97%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 98%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열을 가진다. 하나의 양태에서, 재표면화한 항-CD20 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20-7, 또는 이의 절편이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 CD20에 특이적으로 결합하는 개선된 항체 또는 절편이며, 이는 다음에 의해 제조된다: (a) 서열번호 32~36, 46, 47, 17~22, 25~30 및 1~7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 항체 또는 그의 절편을 암호화하는 DNA를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 상기 DNA로의 삽입을 도입하여 상기 DNA에 의해 암호화된 상기 항체 또는 항체 절편의 아미노산 서열이 변화되는 단계; (c) 상기 항체 또는 항체 절편을 발현하는 단계; (d) 상기 개선에 대하여 상기 발현된 항체 또는 항체 절편을 스크리닝하여, 상기 개선된 항체 또는 항체 절편이 제조되는 단계. 본 발명의 하나의 양태에서, 개선은 CD20에 대한 친화도의 증가이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 친화도의 증가는 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 매개 위치 지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling), 및 E. coli의 돌연변이 유발 유전자-균주의 사용에 의해 이루어진 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 삽입에 기인한다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 CD20에 대한 결합활성의 증가이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 CD20을 발현하는 세포에 대한 세포독성 활성의 증가이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 발현 수준의 증가이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 유전자형 활성의 증가이다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 절편은 본 발명의 다른 항체 또는 그의 절편과 비교할 때 아미노산 잔기의 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 치환은 항체 또는 그의 절편의 중쇄 및/또는 경쇄의 골격 및/또는 CDR 및/또는 초가변 영역에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 이러한 치환은 CDR 서열에서만 일어난다. 일부 실시형태에서, 이러한 치환이 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 절편의 중쇄 및/또는 경쇄에 이러한 치환이 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 있다.
따라서, 본 발명은 CD20이 결합하는 항체 또는 이의 기능적 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트, 및 질환과 연관된 CD20을 발현하는 세포를 이용한 치료에서의 용도를 제공한다. 구체적인 양태에서, CD20에 결합하는 항체는 재표면화, 인간화 또는 키메라인 것이 보다 바람직하다. 인간화 항체는 골격 영역(FR)에서 아미노산 치환이 있는 항체 및 CDR에서 변화가 있는 성숙 항체의 친화도를 포함한다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 공여자 또는 수용자 항체에 존재하는 것으로 한정되지 않는다. 다른 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체 또는 이의 기능적 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 향상된 CDC 및또는 ADCC 기능 및 B 세포 사멸을 포함하여 개선된 효과기(effector) 기능을 초래하는 Fc 영역에서 아미노산 잔기의 변화를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 항-CD20 항체 또는 이의 기능적 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 안정성을 개선하는 특이적인 변화가 있는 것을 포함한다. 구체적인 양태에서, 인간화 CD20 항체 또는 이의 기능적 절편은 증가된 안정성을 가진다.
또한 생체 내에서 개선된 ADCC 기능을 가지는 글리코실화 변이가 있는 항체가 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 CD20에 특이적으로 결합하는 수단이며, 여기에서 상기 수단은 아포토시스, ADCC 및 CDC를 유도할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 서열번호 1~7 및 17~36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 PTA-10486에 해당하는 하이브리도마 또는 ATCC 수탁 번호 PTA-10487에 해당하는 하이브리도마에 의해 생성되는 항체 또는 그의 절편이다.
진단 적용에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 절편은 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지화될 것이다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있는 임의의 하나일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성 동위 원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S 또는 131I; 형광성 또는 화학 발광성 화합물, 예를 들어 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린; 또는 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 호스래디쉬 퍼록시다아제일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 항-CD20 세포융해 항체 및/또는 절편 컨쥬게이트이다. 본 발명의 하나의 양태에서, CD20-특이적 세포융해 항체 컨쥬게이트는 직병의 치료에서 유용하며, 여기에서 CD20을 발현하는 B 세포는 상기 질병의 진행에 영향을 미친다. 하나의 양태에서, 표적화된 B 세포는 원하지 않는다. 하나의 양태에서, 질병은 B 세포 질환이다. 하나의 양태에서, 질병은 원치 않는 B 세포의 활성을 수반한다. 본 발명의 다른 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 컨쥬게이트이며, 여기에서 상기 항체 또는 절편은 CD20을 발현하는 세포에서 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있다. 하나의 양태에서, 질병은 비호지킨 림프종이다.
본 발명의 하나의 양태는 세포독성제에 연결된 항체 또는 절편을 포함하는 항-CD20 항체 또는 절편 컨쥬게이트이다. 컨쥬게이트에 사용된 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁산, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카마이신 및 듀오카마이신 유사체, 에네딘(enediyne), 예를 들어 칼리키아마이신, 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴, 토메이마이신(tomaymycin) 유도체 및 렙토마이신 유도체일 수 있다.
보다 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁산, CC-1065 및 CC-1065 유사체이다.
메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체는 바람직한 세포독성제 중의 것이다. 적합한 메이탄시노이드의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체의 에스터를 포함한다. 적당한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제6,333,410호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,444,163호; 제6,716,821호; 제7,276,497호; 제7,473,796호 및 미국 출원 공개 제20050169933호에 개시되어 있다.
또한 탁산은 바람직한 세포독성제이다. 본 발명에서의 사용에 적당한 탁산은 예를 들어 미국 특허 제6,372,738호; 제6,340,701호; 제6,436,931호; 제6,596,757호; 제7,441,063호; 제7,495,114호 및 제7,598,290호에 개시되어 있다.
세포독성 컨쥬게이트의 제조에 대한 하나의 후보는 CC-1065의 유사체이며, 이는 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)의 배양 브로스에서 분리된 강력한 항-종양 항생제이다. CC-1065는 흔히 사용되는 항암 약물, 예를 들어 독소루비신, 메톡트렉세이트 및 빈크리스틴보다 시험관 내에서 약 100배 더 강력하다(B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)). CC-1065 유사체는 또한 본 발명에서의 사용에 대하여 바람직한 세포독성 약물이다. CC-1065 및 이의 유사체는 미국 특허 제6,756,397호; 제7,049,316호; 제7,388,026호; 제6,372,738호; 제6,340,701호; 제5,846,545호 및 제5,585,499호에 개시되어 있다.
또한 벤조다이아제핀 유사체는 본 발명에서의 사용에 적당한 세포독성 약물이다. 미국 특허 공개 제20090036431호 및 유럽 출원 제2019104호에 기술된 것과 같은 피롤벤조다이아제핀은 적당한 세포독성 약물이다. 또한 미국 가출원 제61/150,201호에 기술된 것과 같은 벤조다이아제핀 유도체가 적당하다.
세포독성 약물, 예를 들어 메톡트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈플라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 몰폴리노 독소루비신은 본 발명의 컨쥬게이트의 제조에 적당하다.
항체에 세포독성제를 연결하기 위하여, 연결기가 사용된다. 적당한 절단성 및 비절단성 연결기가 본원에 기술되어 있으며 당업계에 잘 알려져 있고 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기를 포함한다. 바람직한 연결기는 이황화 기 및 티오에테르 기, 특히 미국 특허 6,913,748, 미국 특허 공개 제20050169933, 20090274713호 및 WO2009/0134976에 기술된 것이다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 이황화물 교환 반응을 사용하여 또는 항체와 세포독성제 사이의 티오에테르 결합을 형성함으로써 구성될 수 있다. 항체를 변형시켜 이황화 연결된 컨쥬게이트를 제공하기 위한 바람직한 링커는 N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB) 또는 N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)-2-설포부타노에이트(설포-SPDB)이다.
본 발명은, 비절단성 링커를 통한 항체에의 메이탄시노이드의 컨쥬게이션은 생체 내 고용량의 달성을 허용하여 항-CD20 항체 또는 그의 절편의 고유의 기능적 활성을 보존하면서 컨쥬게이션의 효력을 향상시키는 양태를 포함한다. 항체 또는 항체 절편을 변형시켜 메이탄시노이드와의 티오에테르 결합을 만드는 바람직한 비절단성 링커는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-설포석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(설포SMCC), N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB)이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 링커가 친수성(예컨대, PEG를 혼입함)이고 약물의 활성을 증가시키는데 기여하는 양태를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 약물이 항-CD20 항체에 연결되어 링커 설계가 광범위한 종양에 걸쳐서, 특히 낮은 항원 발현 또는 약물 저항성 종양에서 활성인 컨쥬게이트를 제공하는 개선된 방식을 포함한다.
추가로, 이러한 친수성 링커의 혼입은 고수율로 그리고 응집 또는 침전없이 항체 분자 당 약물의 최대 15개 분자의 컨쥬게이션을 허용한다. 항체 분자당 연결된 약물의 최대 15개 분자를 가지는 친수성 링커를 포함하는 이러한 컨쥬게이트는 높은 친화도로 (비변형 항체의 것과 유사한) 표적 CD20 항원에 결합한다. 항체의 변형을 위한 바람직한 친수성 링커는 N-석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜] 에스터(NHS-PEG4-말레이미드)이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 링커가 다이카복실산계 모이어티로부터 유래한 링커와 같이 황 원자가 없는 양태를 포함한다(미국 출원 공개 제2005016993호 참조).
본 발명은 또한 본원에 기술된 링커가 하전되는 양태를 포함하며, 여기에서 전하는 항-CD20 항체 또는 그의 절편의 변형 후 및 생성된 약물 컨쥬게이트에서 전부 유지된다.
본 발명은 또한 약 2 내지 8개 약물 분자가 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결되는 양태를 포함한다. 바람직한 양태는 약 2 내지 8개 약물 분자가 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결되며 컨쥬게이트의 세포 사멸이 동일한 항-CD20 항체에 연결된 약물의 더 낮거나 더 높은 수의 약물 부하에 비하여 보다 효과적인 컨쥬게이트이다.
심지어 본 발명의 추가의 양태는 상기 방법을 이용한 치료에 민감한 암을 치료하는 방법이며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 화학식 II 또는 화학식 II'의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하며,
[화학식 II]
CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m
[화학식 II']
D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB
여기에서, CB는 항-CD20 항체를 나타내고;
D는 약물을 나타내며;
X는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합 또는 에테르 결합을 통하여 세포-결합제에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로고리 단위를 나타내고;
Y는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 에테르 결합, 아민 결합, 탄소-탄소 결합 및 하이드라존 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유 결합을 통하여 약물에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로고리 단위를 나타내며;
l은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이며;
m은 2 내지 15의 정수이고;
n은 1 내지 2000의 정수이다.
중요한 것으로, 본 발명에 기술된 컨쥬게이트는 다중약물 내성인(mdr) CD20을 발현하는 세포에 대하여 매우 강력하거나 또는 효과적이며, 이는 세포독성 약물을 이용한 치료에 대하여 민감도가 좋지 않다. 예를 들어, 암 치료는 상이한 화학요법제를 이용한 치료의 다수 라운드 후에 종종 접하게 되는 약물 내성의 메커니즘을 극복하는데 있어서의 난관이 된다. 암 세포에서 관찰된 하나의 이러한 메커니즘은 다중약물 내성이라고 불리며 ATP-결합 카세트(ABC) 운반체에 의해 약물의 향상된 방출에 의해 야기된다(C. Drumond, B. I. Sikic, J. Clin . Oncology, 1999, 17, 1061-1070, G, Szokacs et al., Nature Reviews, 5; 219-234, 2006). 약물 내성의 이러한 메커니즘을 극복하는 요법, 예를 들어 암 세포에 의한 약물의 이러한 유출을 방해 또는 극복하는 것은 상당한 가치를 가진다.
본 발명의 하나의 양태는 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 약학적 조성물은 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명은 항-CD20 항체 또는 절편 컨쥬게이트 및 담체(예컨대, 약학적으로 허용가능한 담체)를 포함하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD20 항체 또는 그의 절편, 컨쥬게이트 및 담체(액학적으로 허용가능한 담체)를 포함하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 포함하며, 이는 제2 치료제를 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물은 비정상적인 세포 성장을 억제 또는 포유동물(예컨대, 인간)에서 증식성 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 또한 포유동물(예컨대, 인간)에서 우울증, 불안감, 스트레스, 공포증, 패닉, 불쾌감, 정신 장애, 고통 및 염증성 질환을 치료하는데 유용한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 진단 시약은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트를 가지는 조성물을 포함하며, 여기에서 항체 또는 절편은 표지화된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트 표지는 방사능표지, 형광단, 발색단, 조영제 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 양태에서, CD20을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 방법이 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, CD20은 B 세포에 의해 발현된다. 본 발명의 하나의 양태에서, CD20을 발현하는 세포는 암 세포이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암세포에 결합한다.
본 발명의 다른 양태에서, CD20을 발현하는 세포는 원치 않는 면역 반응에 영향을 미친다. 본 발명의 다른 양태에서, CD20을 발현하는 세포는 염증에 영향을 미친다.
항-CD20 항체 또는 이의 컨쥬게이트, 및 이를 포함하는 조성물은 장애, 예를 들어 세포의 비정상적인 성장을 특징으로 하는 장애(예컨대, 암 및 면역 질환과 장애)를 치료하거나 또는 장애의 심각함을 완화시키는데 유용하다. 본 발명의 다른 적용은 이에 한정되는 것은 아니지만, 골다공증, 우울증, 불안감, 스트레스, 공포증, 패닉, 불쾌감, 정신 장애, 고통을 동시 치료하는 것, 또는 항간질약, 항균제, 이뇨제 및 혈압 강하제, 혈중지질저하약, 및 항우울제로서의 적용을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 세포를 항체 또는 항체 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트와 접촉시키는 것을 포함하는 암세포의 성장을 억제하는 방법이 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 환자에게 본원에 기술된 항체 또는 절편 및/또는 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법이 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 치료는 상기 환자에게 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 치료제는 세포독성제이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 등의 치료에서 유용한 CD20-특이적 세포융해 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트이다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 메토트렉세이트와 조합하여 류마티스 관절염의 치료에 유용한 CD20-지정 세포융해 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 TNF 길항제 요법에 불충분한 반응을 보이는 중등도 내지 중증 활성 류마티스 관절염이 있는 환자에서 메토트렉세이트와 조합하여 류마티스 관절염의 치료에 유용한 CD20-특이적 세포융해 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 암이 있는 환자에게 본원에 기술된 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 상기 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 치료가능한 암은 NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 암이 있는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법이 있으며, 상기 방법은 개체에게 진단 시약을 투여하는 단계; 및 개체 내에서 시약의 분포를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 진단 방법은 NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 장애, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 진단하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 면역 장애가 있는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법이 있으며, 상기 방법은 개체에게 진단 시약을 투여하는 단계; 및 개체 내에서 시약의 분포를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 진단 방법은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 장애를 진단하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염, 만성 국소 뇌염, 수포성 유천포창, A형 혈우병, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성 근염, 만성 두드러기, 원발 담즙성 간경변, 시신경 척수염, 그레이브스 갑상선 이상성 질환, 수포성 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선성 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스-연관 질환, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법이다. 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 경우, 항체는 선택적으로 제2 치료제와 함께 투여될 수 있으며, 상기 제2 치료제는 바람직하게 메토트렉세이트이다.
본 발명의 추가 양태는 생체 내에서 B 세포의 아포토시스를 유도하는 방법이며, 이는 본 발명의 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트와 B 세포를 접촉시켜 B 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트에 결합한 CD20을 포유동물, 예를 들어 질환을 앓고 있는 인간 환자에 투여함으로써 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 자가면역 질환 또는 CD20을 발현하는 암을 치료하는 방법 중 임의의 것에서, 하나의 양태에서 항체는 CD20-7 또는 CD20-6이다. 따라서, 하나의 양태는 CD20 양성 암을 치료하는 방법이며, 이는 암을 앓고 있는 환자에게 본 발명의 CD20 결합 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, CD20을 발현하는 암은 B 세포 림프종 또는 CD20을 발현하는 백혈병, 예를 들어 비호지킨 림프종(NHL) 또는 림프구 우세 호지킨병(LPHD), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 또는 SLL이다. B 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는 방법의 하나의 양태에서, 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트는 약 20~2000㎎/㎡의 투약량 범위로 투여된다. 추가적인 양태에서, 치료 방법은 환자에게 적어도 하나의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 비호지킨 림프종(NHL)에 대하여 화학요법제는 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이는 자가면역 또는 염증성 질환을 앓고 있는 환자에게 본원에 논의된 바와 같은 CD20 결합 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 자가면역 또는 염증성 질환은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염, 만성 국소 뇌염, 수포성 유천포창, A형 혈우병, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성 근염, 만성 두드러기, 원발 담즙성 간경변, 시신경 척수염, 그레이브스 갑상선 이상성 질환, 수포성 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선성 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스-연관 질환, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 경우, 항체는 선택적으로 제2 치료제와 함께 투여될 수 있으며, 상기 제2 치료제는 바람직하게 메토트렉세이트이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 피부근염, 베게너 육아종증, ANCA, 재생불량성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), VIII 인자 결핍증, A형 혈우병, 자가면역성 호중구 감소증, 캐슬만 증후군, 굿파스튜어 증후군, 고형 장기 이식 거부, 이식편대 숙주병(GVHD), IgM 매개, 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 하시모토 갑상선염, 자가면역성 간염, 림프모양 사이질 폐렴, 폐색성 세기관지염(비이식) 대 NSIP, 길랭-바레 증후군, 대혈관 혈관염, 거대세포 (타카야수) 동맥염, 중간혈관 혈관염, 가와사키병, 결절성 다발동맥염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 상기 질환을 앓고 있는 환자에게 CD20 결합 항체 및/또는 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이 방법의 하나의 양태에서, CD20 결합 항체는 CD20-7 또는 CD20-6이다.
출원인의 치료 방법에서, CD20 결합 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트는 단독으로 또는 제2 치료제, 예를 들어 제2 항체, 또는 화학요법제 또는 면역억제제와 함께 투여될 수 있다. 제2 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 또는 상이한 B 세포 항원, 또는 NK 또는 T 세포 항원에 결합하는 것일 수 있다. 하나의 양태에서, 제2 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 방사능표지된 항-CD20 항체이다. 다른 양태에서, CD20 결합 항체는 세포독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성 동위원소와 컨쥬게이트된다.
본 발명은 포유동물(예컨대, 인간)에서 원치 않는 B 세포 및/또는 비정상적인 세포 성장을 억제 또는 증식성 장애를 치료하는 방법을 포함하며, 이는 상기 포유동물에 항-CD20 항체 및/또는 컨쥬게이트(및/또는 이의 용매화합물 및 염) 또는 이의 조성물을 단독으로 또는 제2 치료제와 조합하여 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 약 20㎎/㎖의 항체, 약 10mM 히스티딘 설페이트 pH 5.8, 약 60㎎/㎖ 수크로스(6%) 및 약 0.2㎎/㎖ 폴리솔베이트 20(0.02%)으로 CD20 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트를 포함하는 액상 제형이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항체 중 임의의 것을 암호화하는 다양한 분리 핵산을 제공하며, 이는 항체 및/또는 항체 절편을 발현하는 발현 벡터를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태는 본원에 기술된 항체 또는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하며, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터이다. 본 발명의 다른 양태에서, 벡터는 상기 항체 또는 절편을 발현할 수 있는 발현 벡터이다.
본 발명은 서열번호 8~16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 핵산, 또는 이들 서열의 축퇴성 변이체(degenerate variant) 등을 제공한다. 하나의 양태는 서열번호 1~7 및 17~36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리 핵산이며, 이는 선택적으로 보존적 아미노산 치환을 가진다.
다른 양태는 본원에 기술된 핵산을 포함하는 벡터이며, 이는 숙주 세포에서 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다. 또한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 포함된다.
본 발명의 다른 양태는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 항체 또는 절편을 생성하는 숙주 세포를 포함한다. 항체 또는 절편을 생성하는 숙주 세포의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포 또는 NSO 세포이다.
항체 및/또는 이의 컨쥬게이트를 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항체를 생성하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 포유동물의 세포, 유기체 또는 연관 병리학적 상태의 시험관 내, 동일계 내, 및 생체 내 진단 또는 치료를 위한 항-CD20 항체 및/또는 컨쥬게이트를 합성하고 사용하는 방법을 포함한다.
본 발명의 양태는 제조 물품 또는 키트로 제공될 수 있다.
개체를 진단 또는 치료하는데 있어서의 사용을 위하여, 제조 물품은 조성물이 적절한 질환 또는 장애를 진단 또는 치료하는데 사용되는 것을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함한다.
항체, 항체 절편, 컨쥬게이트, 조성물 및 본 발명의 사용 방법 모두의 바람직한 양태에서, 재표면화한 CD20 결합 항체는 CD20-7이고, 본원에 기술된 바와 같은 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 가진다.
도 1은 비형질감염 300-19 대조 세포(왼쪽 패널) 및 CD20-발현 300-19 세포(오른쪽 패널)에 결합하는 항체의 히스토그램의 표현. 히스토그램은 10nM muCD20-6(상단), muCD20-7(중간)로 염색한 것 및 1차 항체의 부재(하단)에 대하여 표시되어 있다.
도 2는 유세포 분석기로 분석된 BJAB 세포에 muCD20-7(도 1A) 및 muCD20-6(도 1B)의 결합의 표현. 결합 곡선은 항체 결합의 EC50을 결정하는데 사용되었으며, 이는 항체의 겉보기 Kd에 해당한다.
도 3은 10nM 농도의 리툭시맙, muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6 또는 muCD20-7과 함께 배양된 Ramos 림프종 세포(도 3A), 및 10nM 농도의 리툭시맙, B1, muCD20-2, 또는 muCD20-7과 함께 배양된 Raji 림프종 세포(도 3B)를 사용한 아넥신-V 분석 결과의 표현. 대조 샘플이 비교로 포함되어 있다.
도 4는 10㎍/㎖의 농도에서 항-CD20 항체 또는 muIgG1 아이소타입 대조 항체를 이용하여 염색된 Ramos 세포를 사용한 지질뗏목 분석 결과의 표현. 트리톤-X 100의 부재 하(검정 막대) 및 존재 하(속이 빈 막대)에서 샘플로부터의 FL1에 대한 MFI는 각각의 항체 치료에 대하여 플롯팅되어 있다. 시험된 항체는 muCD20-2, muCD20-7, 리툭시맙, muIgG 대조 항체(도 4A), 및 muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6, muCD20-7, muIgG 대조 항체(도 4B)이었다.
도 5는 10nM 농도의 chCD20-2, chCD20-7, 리툭시맙 또는 (Ab가 없는) 대조와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포를 사용한 아넥신-V 분석 결과의 표현.
도 6은 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 chCD20-2, chCD20-7, 리툭시맙 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Daudi 세포(도 6A) 및 WSU-DLCL-2 세포(도 6B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 7은 CD20-7 VL(도 7A) 및 CD20-7 VH(도 7B)에 대하여 재표면화한 형태로 CD20-7 표면 잔기 및 치환의 표현.
도 8은 뮤린의 대응 서열과 비교하여 CD20-7 가변 영역에 대한 예시적인 재표면화한 서열 정렬의 표현. 도 8A는 경쇄(VL) 가변 도메인에 대한 것이고, 도 8B는 중쇄(VH) 가변 도메인에 대한 것임을 참조한다. 줄표 "-"는 뮤린 서열과 동일함을 나타낸다.
도 9는 유세포 분석기로 분석된 BJAB 세포에 muCD20-7, chCD20-7 및 huCD20-7(huIgG1 아이소타입 대조 항체는 아님)의 결합의 표현. 결합 곡선은 항체 결합의 EC50을 결정하는데 사용되었으며, 이는 각각의 항체의 겉보기 Kd에 해당한다.
도 10은 ELISA에 의한 WSU-DLCL-2 림프종 세포로부터의 막 제조물에 huCD20-7의 결합의 표현.
도 11은 10nM, 1nM 및 0.1nM 농도에서 muCD20-7, huCD20-7, 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현.
도 12는 3×10-8M 내지 1.7×10-13M 범위의 농도에서 huCD20-7, B1, 리툭시맙, GA101-F, 및 2F2와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현. 대조 샘플이 비교되어 있다. "B1"은 벡사(등록상표)(Beckman Coulter)의 비표지화 형태에 해당하는 반면; "GA101-F"는 아푸투주맙 또는 GA101(Hoffman LaRoche)의 푸코실화 형태에 해당하며; "2F2"는 오파투무맙(Genmab/GSK)에 해당한다.
도 13은 10nM 농도의 huCD20-7, B1, 또는 리툭시맙과 함께 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현. 비처리된 세포의 대조 샘플이 비교로 사용되어 있다. 실험은 Ramos 세포(도 13A), Raji 세포(도 13B), WSU-DLCL-2 세포(도 13C), Jeko-1 세포(도 13D) 및 Granta-519 림프종 세포(도 13E)를 포함하였다.
도 14는 10㎍/㎖에서 Ramos 세포 및 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2 및 GA101-F 항체를 사용한 지질뗏목 분석 결과의 표현. 트리톤-X 100의 부재 하(검정 막대) 및 존재 하(흰색 막대)에서 샘플로부터의 FL1에 대한 MFI는 각각의 항체 치료에 대하여 플롯팅되어 있다.
도 15는 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, 리툭시맙, GA101-F 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Daudi 세포(도 15A) 및 Ramos 림프종 세포(도 15B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 16은 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, 리툭시맙, 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 WSU-DLCL-2 세포(도 16A) 및 RL 림프종 세포(도 16B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 17은 효과기 세포와 같은 정제된 인간 NK 세포의 존재 하에서 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포(도 17A) 및 JVM-13 CLL 세포(도 17B)를 사용한 ADCC 분석 결과의 표현.
도 18은 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F, B1(도 18A) 및 muCD20-6 및 muCD20-7(도 18B)을 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20으로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 19는 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F, B1(도 19A) 및 muCD20-6, muCD20-7, 리툭시맙 및 2F2(도 19B)를 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20 A179S P172S로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 20은 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F(도 20A) 및 muCD20-6, muCD20-7, 리툭시맙 및 2F2(도 20B)를 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20 N163D로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 21은 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F(도 21A) 및 muCD20-6, muCD20-7, 리툭시맙 및 2F2(도 21B)를 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20 N163D N166D로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 22는 ELISA에 의한 WSU-DLCL-2 림프종 세포로부터의 막 제조물에 huCD20-7-SMCC-DM1 및 -SPP-DM1(도 22A) 또는 huCD20-7-설포mal-DM4 컨쥬게이트(도 22B)와 비교하여 huCD20-7의 결합의 표현.
도 23은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 리툭시맙, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 또는 huCD20-7-SPDB-DM4와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현. Ramos 세포는 비결합 huIgG1-SMCC-DM1 및 huIgG1-SPDB-DM4 컨쥬게이트의 동일한 농도로 처리되었다.
도 24는 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4, huCD20-7-PEG4-mal-DM4, 리툭시맙 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Daudi 세포(도 24A) 및 WSU-DLCL-2 림프종 세포(도 24B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 25는 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-설포-mal-DM4, 리툭시맙 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 WSU-DLCL-2 세포(도 25A) 및 Ramos 림프종 세포(도 25B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 26은 효과기 세포와 같은 정제된 인간 NK 세포의 존재 하에서 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙, 2F2 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Ramos 세포(도 26A) 및 Granta-519 림프종 세포(도 26B)에 대한 ADCC 분석 결과의 표현.
도 27은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙 또는 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 Ramos 세포(도 27A) 및 Daudi 세포(도 27B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 28은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙 또는 비결합 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 Granta-519 세포(도 28A) 및 SC-1 세포(도 28B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 29는 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙 또는 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 DOHH-2 B 세포 림프종 세포(도 29A) 및 Molt-4 T 세포 백혈병 세포(도 29B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현. Molt-4 세포는 CD20 음성이다.
도 30은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙, 리툭시맙-SMCC-DM1 또는 비결합 huIgG1 항체 및 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 Ramos 세포(도 30A) 및 Daudi 세포(도 30B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 31은 유세포 분석기로 분석된 SU-DHL-4에 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-[3H]DM1, 리툭시맙 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1의 결합의 표현(도 31A). 도 31B는 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-[3H]DM1, 리툭시맙 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1과 함께 배양된 항원-양성 SU-DHL-4 B 세포 림프종 세포 및 항원-음성 COLO205 결장암 세포에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 32는 SU-DHL-4 세포 당 결합된 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1의 양(도 32A) 및 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1에 대한 SU-DHL-4 세포의 노출 22시간 후 생성된 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물 양의 표현.
도 33은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-PEG4-mal-DM4 및 huCD20-7-SPDB-DM4(도 31A), 및 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-SPP-DM1, huCD20-7-설포-mal-DM4 및 huIgG1-SMCC-DM1 및 huIgG1-SPP-DM1 대조 컨쥬게이트(도 31B)와 함께 배양된 Granta-519 세포에 대한 예시적인 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 34는 SCID 마우스내 피하로 삽입된 확립된 이종이식 모델 SU-DHL-4 미만성 대형 B세포 림프종 세포를 사용한 실험 결과의 표현. 마우스는 10 또는 1㎎/㎏의 huCD20-7 또는 리툭시맙과 함께 세포 접종 후 제14일, 제21일 및 제28일(화살표)에 주 1회로 3회 처리되었다. 상이한 처리 그룹의 중간 종양 부피가 종양 세포 접종 후의 시간에 대하여 플롯팅되어 있다.
도 35는 SCID 마우스내 정맥내로 삽입된 Daudi 림프종 세포를 사용한 생체 내 이종이식 연구 결과의 표현. 마우스는 10㎎/㎏의 huCD20-7, 10㎎/㎏의 huCD20-7-SMCC-DM1 또는 5㎎/㎏의 huCD20-7-SPP-DM1(도 35A) 및 10㎎/㎏의 huCD20-7, 리툭시맙, huCD20-7-SMCC-DM1 또는 huCD20-7-BMPS-DM1(도 35B)과 함께 세포 접종 후 제7일에 1번 처리되었다. 상이한 처리 그룹에서 생존한 마우스의 수는 종양 세포 접종 후 시간에 대하여 플롯팅되어 있다.
도 36은 SCID 마우스내 피하로 삽입된 DOHH-2 여포성 림프종 세포를 사용한 예시적인 이종이식 연구 결과의 표현. 마우스는 10㎎/㎏의 huCD20-7, 10㎎/㎏의 huCD20-7-SMCC-DM1 또는 5㎎/㎏의 huCD20-7-SPP-DM1과 함께 세포 접종 후 제3일에 1번 처리되었다. 상이한 처리 그룹의 중간 종양 부피는 종양 세포 접종 후 시간에 대하여 플롯팅되어 있다.
본 발명은 CD20을 발현하는(예컨대, 양성) 세포에 대하여 3가지 세포독성 활성, 즉 아포토시스의 유도, ADCC, 및 CDC에서 높은 효력을 가지는 항-CD20 항체의 새로운 부류(즉, III형)를 제공한다. 또한, 생체내 종양 모델을 사용하여 입증된 바와 같이, SMCC-DM1과 항-CD20 항체의 컨쥬게이트는 CD20을 발현하는 세포를 예상치 않게 잘 사명시킨다.
정의
모든 양태에서, "지방족기"는 알킬, 알켄일 또는 알카인일 기로서 정의된다. 알킬 기는 직선형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기이며, 바람직하게는 사슬 또는 고리 내에 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지고, 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 보다 바람직한 알킬 기는 사슬 내에 1 내지 12개의 탄소 원자를 가진다. "분지형"은 1개 이상의 저급 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필이 선형 알킬 사슬에 부착된 것을 의미한다. 예시적인 알킬 기는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, n-펜틸, 3-펜틸, 옥틸, 노닐, 데실, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.
알켄일 기는 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, 직선형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기이며, 바람직하게는 사슬 내에 2 내지 15개의 탄소 원자를 가진다. 보다 바람직한 알켄일 기는 사슬 내에 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지며, 보다 바람직하게는 사슬 내에 약 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진다. 예시적인 알켄일 기는 에텐일, 프로펜일, n-뷰텐일, i-뷰텐일, 3-메틸뷰트-2-엔일, n-펜텐일, 헵텐일, 옥텐일, 노넨일 및 데센일을 포함한다.
알카인일 기는 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하고, 직선형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기이며, 바람직하게는 사슬 내에 2 내지 15개의 탄소 원자를 가진다. 보다 바람직한 알카인일 기는 사슬 내에 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지며, 보다 바람직하게는 사슬 내에 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진다. 예시적인 알카인일 기는 에탄인일, 프로파인일, n-뷰타인일, 2-뷰타인일, 3-메틸뷰타인일, n-펜타인일, 헵타인일, 옥타인일 및 데카인일을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "방향족 기"는 6 내지 14개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 10개의 탄소 원자의 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 고리계로 이루어지는 치환 또는 비치환 아릴 기를 의미한다. 예시적인 아릴 기는 페닐 및 나프틸을 포함한다. 치환기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 알킬 기, 할로겐, 나이트로, 아미노, 하이드록실 및 C1-C3 알콕시 기, 예를 들어 메톡시, 에톡시 및 프로폭시를 포함한다.
용어 " 헤테로사이클 ", " 헤테로사이클릴 " 및 " 헤테로사이클릭 기"는 포화, 부분적 불포화 또는 불포화, 비방향족의 안정적인 3 내지 14원, 바람직하게는 5 내지 10원의 모노-, 바이- 또는 멀티사이클릭 고리를 지칭하며, 여기에서 고리의 적어도 하나의 구성원은 헤테로 원자, 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 가지는 방향족, 바람직하게 5 내지 10원의 모노-, 바이- 또는 멀티사이클릭 고리이다. 전형적으로, 헤테로 원자는 이에 한정되는 것은 아니지만, 산소, 질소, 황, 셀레늄, 및 인 원자를 포함한다. 바람직한 헤테로 원자는 산소, 질소 및 황이다. 헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), 특히 1, 3, 4, 6, 7, 및 9장; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950부터 현재까지), 특히 13, 14, 16, 19, 28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기술되어 있다. "헤테로사이클릴"은 또한 라디칼을 포함하며, 여기에서 헤테로사이클 라디칼은 포화, 부분적 불포화 고리, 또는 방향족 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합된다.
지방족, 방향족 및 헤테로사이클릭 단위는 또한 하전된 치환기를 가진다. 하전된 치환기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 카복실레이트, 설포네이트 및 포스페이트로부터 선택된 음으로 하전된 기, 또는 3차 또는 4차 아미노 기로부터 선택된 양으로 하전된 기일 수 있다.
용어 " 헤테로아릴 "은 5원 또는 6원의 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭하며, 5~18개의 원자의 융합된 고리계(이의 적어도 하나는 방향족임)를 포함하고, 이는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리딘일(예를 들어, 2-하이드록시피리딘일을 포함함), 이미다졸일, 이미다조피리딘일, 피리미딘일(예를 들어, 4-하이드록시피리미딘일을 포함함), 피라졸일, 트라이아졸일, 피라진일, 테트라졸일, 퓨릴, 티엔일, 아이속사졸일, 티아졸일, 옥사졸일, 아이소티아졸일, 피롤일, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 인돌일, 벤즈이미다졸일, 벤조퓨란일, 신놀린일, 인다졸일, 인돌리진일, 프탈라진일, 피리다진일, 트라이아진일, 아이소인돌일, 프테리딘일, 퓨린일, 옥사다이아졸일, 트라이아졸일, 티아다이아졸일, 퓨라잔일, 벤조퓨라잔일, 벤조티오페닐, 벤조티아졸일, 벤족사졸일, 퀴나졸린일, 퀴녹사린일, 나프틸리딘일, 및 퓨로피리딘일이다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴 기는 탄소(탄소-연결) 또는 질소(질소-연결)가 있을 수 있는 곳에 부착된 탄소(탄소-연결) 또는 질소(질소-연결)일 수 있다. 한정되는 것은 아니지만 예로서, 탄소 결합 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 피리딘의 2, 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리다진의 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리미딘의 2, 4, 5, 또는 6번 위치, 피라진의 2, 3, 5, 또는 6번 위치, 퓨란, 테트라하이드로퓨란, 티오퓨란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 2, 3, 4, 또는 5번 위치, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 2, 4, 또는 5번 위치, 이속사졸, 피라졸 또는 아이소티아졸의 3, 4, 또는 5번 위치, 아지리딘의 2 또는 3번 위치, 아제티딘의 2, 3, 또는 4번 위치, 퀴놀린의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치, 또는 아이소퀴놀린의 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치에서 결합된다.
한정되는 것은 아니지만 예로서, 질소 결합 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 1번 위치, 아이소인돌 또는 아이소인돌린의 2번 위치, 몰폴린의 4번 위치, 및 카바졸 또는 O-카볼린의 9번 위치에서 결합된다.
헤테로아릴 및 헤테로사이클릴 기에 존재하는 헤테로원자는 산화 형태, 예를 들어 NO, SO 및 SO2를 포함한다. 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴의 치환기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 알킬 기, 할로겐, 나이트로, 아미노, 하이드록실 및 C1-C3 알콕시 기, 예를 들어 메톡시, 에톡시 및 프로폭시를 포함한다.
"할로겐"은 플루오린, 염소, 브롬 및 요오드 원소를 포함한다. 플루오린 및 염소 원자가 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "컨 쥬게이트 "는 세포 결합제(즉, 항-CD20 항체 또는 그의 절편)에 연결된 화합물 또는 이의 유도체를 지칭하며, 일반식 C-L-CBA(여기에서 C = 화합물, L = 링커, 및 CBA = 세포 결합제 또는 항-CD20 항체 또는 절편)로 정의된다. 일부 실시형태에서, 일반식 D-L-CBA(여기에서 D = 약물, L = 링커 및 CBA = 세포 결합제 또는 항-CD20 항체 또는 절편)는 또한 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
링커는 화합물, 통상적으로 약물, 예를 들어 메이탄시노이드를 세포-결합제, 예를 들어 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 안정적이고 공유적인 방식으로 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성 상태를 유지하는 조건 하에서, 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다아제-유도 절단, 에스테라아제-유도 절단, 및 이황화 결합 절단에 영향을 받기 쉽거나 또는 이에 상당히 저항성일 수 있다. 적당한 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성 기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기를 포함한다. 링커는 또한 본원에 기술되고 당업계에 알려진 바와 같이 하전된 링커 및 이의 친수성 형태를 포함한다.
달리 지시되지 않는다면, 본원에서 사용된 "비정상적 세포 성장"은 정상적인 조절 메커니즘과 관계없는 세포 성장(예컨대, 접촉 저지의 손실)을 지칭한다. 이는 예를 들어 다음의 비정상적인 성장을 포함한다: (1) 돌연변이된 티로신 키나아제를 발현 또는 수용체 티로신 키나아제의 과발현에 의해 증식하는 종양 세포(종양); (2) 비정상적인 티로신 키나아제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; (3) 수용체 티로신 키나아제에 의해 증식하는 임의의 종양; (4) 비정상적인 세린/트레오닌 키나아제 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양; 및 (5) 비정상적인 세린/트레오닌 키나아제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포.
본 발명은 종양 형성(tumorigenic) 질환 및 면역 질환, 예컨대 자가면역 또는 염증성 질환을 포함하는, CD20을 발현하는 세포를 수반하는 다양한 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
용어 "암" 및 " 암성 "은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 기술한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프 종양(lymphoid malignancy)을 포함한다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 "종양 형성" 질환의 예는, NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)을 포함한다.
CD20을 발현하는 B 세포가 수반되는 치료 및/또는 예방될 수 있는 "면역 장애" 및 질환의 예는 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신성 강피증 및 경화증, 염증성 장질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 다발성 경화증, 레이노드 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 면역 복합체 사구체신염, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 면역-매개 혈소판 감소증, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 낭창성 신염, 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염 (RA), 아토피 피부염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HN, 및 헤르페스 바이러스 연관 질환을 포함한다. 추가 예로는 중증 급성 호흡 곤란 증후군 및 맥락망막염이 있다. 또한 추가의 예로는 바이러스, 예를 들어 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 B 세포의 감염에 의해 야기되는 질환 및 장애가 있다.
"치료제"는 생물 작용제, 예를 들어 항체, 펩티드, 단백질, 효소 또는 화학요법제 모두를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 엘로티닙(TARCEVA(등록상표), Genentech/OSI Pharm.), 보르테조밉(VELCADE(등록상표), Millennium Pharm.), 풀베스트란트(FASLODEX(등록상표), AstraZeneca), 수텐트(SU11248, Pfizer), 레트로졸(FEMARA(등록상표), Novartis), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC(등록상표), Novartis), PTK787/ZK 222584(Novartis), 옥살리플라틴(Eloxatin(등록상표), Sanofi), 5-FU(5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE(등록상표), Wyeth), 라파티닙(TYKERB(등록상표), GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파닙(SCH 66336), 소라페닙(BAY43-9006, Bayer Labs), 및 게피티닙(IRESSA(등록상표), AstraZeneca), AG1478, AG1571(SU 5271; Sugen), 알킬화제 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN(등록상표) 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예를 들어 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜아민, 트라이에틸렌포스포아마이드, 트라이에틸렌티오포스포아마이드 및 트라이메틸로멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타신온); 캄토테신(예를 들어 합성 유사체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(예를 들어 이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(예를 들어 합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스터드 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스타인, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 메팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예를 들어 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예를 들어 에네딘 항생제(예를 들어 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마 II 및 칼리키아마이신 오메가 II(Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질(에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르루신, ADRIAMYCIN(등록상표)(독소루비신), 몰폴리노-독소루비신, 시아노몰폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체 예를 들어 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체 예를 들어 플루다라빈, 6-메캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항부신 물질 예를 들어 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄, 폴산 보충제 예를 들어 폴린산; 아세글라톤, 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조퓨란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히, T-2 독소, 베루카린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 탁솔(TAXOL)(등록상표)(파클리탁셀; Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재), 아브락산(ABRAXANE)(등록상표)(크레모포 없음), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 탁소텔(TAXOTERE)(등록상표)(독세탁셀; Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 젬자(GEMZAR)(등록상표)(젬시타빈); 6-티오구아닌; 메캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈플라스틴; 에포토사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)(등록상표)(비노렐빈); 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈(젤로다(XELODA)(등록상표)); 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라아제 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드 예를 들어 레티노산; 및 상기한 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체를 포함한다.
또한 "화학요법제"의 정의에 다음이 포함된다: (i) 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)와 같은 종양에 작용하는 호르몬을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표); 타목시펜 시트레이트를 포함함), 라록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 화레스톤(FARESTON)(등록상표)(토레미핀 시트레이트)을 포함함; (ii) 효소 아로마타아제를 억제하는 아로마타아제 억제제, 이는 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하며, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티마이드, MEGASE(등록상표)(메게스트롤 아세테이트), 아로마신(AROMASIN)(등록상표)(엑세메스탄; Pfizer), 포메스테인, 파드로졸, 리비솔(RIVISOR)(등록상표)(보로졸), 페마라(FEMARA)(등록상표)(레트로졸; Novartis), 및 아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표)(아나스트로졸; AstraZeneca); (iii) 항안드로겐, 예를 들어 플루타마이드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 루프롤라이드, 및 고세렐린; 및 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 단백질 키나아제 억제제; (v) 지질 키나아제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; (vii) 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제(예컨대, 엔지오자임(ANGIOZYME)(등록상표)) 및 HER2 발현 억제제; (viii) 백신, 예를 들어 유전자 치료 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표), 루벡틴(LEUVECTIN)(등록상표), 및 박시드(VAXID)(등록상표); 프로류킨(PROLEUKIN)(등록상표) rIL-2; 토포아이소머라아제 1 억제제, 예를 들어 루토테칸(LURTOTECAN)(등록상표); 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표) rmRH; (ix) 혈관 생성 억제제, 예를 들어 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN)(등록상표), Genentech); 및 (x) 상기한 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체. 기타 혈관 생성 억제제는 MMP-2(매트릭스 메탈로프로테이나아제 2) 억제제, MMP-9(매트릭스 메탈로프로테이나아제 9) 억제제, COX-II(사이클로옥시게나아제 II) 억제제, 및 VEGF 수용체 티로신 키나아제 억제제를 포함한다. 본 발명의 화합물/조성물과 조합하여 사용될 수 있는 이러한 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제의 예는 WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, EP 606,046, EP 931,788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675, EP 945864, 미국 특허 제5,863,949호, 미국 특허 제5,861,510호, 및 EP 780,386에 기술되어 있으며, 이들 모두 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. VEGF 억제제 티로신 키나아제의 예는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474; WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)- -퀴나졸린(AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바탈라닙(PTK787; WO 98/35985) 및 SU11248(수니티닙; WO 01/60814), 및 PCT 공개 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, 및 WO 98/13354에 개시된 바와 같은 화합물을 포함한다.
화학요법제의 다른 예는 PI3K(포스포이노시타이드-3 키나아제)의 억제제, 예를 들어 문헌[Yaguchi et al (2006) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 98(8):545-556]; 미국 특허 제7,173,029호; 미국 특허 제7,037,915호; 미국 특허 제6,608,056호; 미국 특허 제6,608,053호; 미국 특허 제6,838,457호; 미국 특허 제6,770,641호; 미국 특허 제6,653,320호; 미국 특허 제6,403,588호; WO 2006/046031; WO 2006/046035; WO 2006/046040; WO 2007/042806; WO 2007/042810; WO 2004/017950; US 2004/092561; WO 2004/007491; WO 2004/006916; WO 2003/037886; US 2003/149074; WO 2003/035618; WO 2003/034997; US 2003/158212; EP 1417976; US 2004/053946; JP 2001247477; JP 08175990; JP 08176070; 미국 특허 제6,703,414호; 및 WO 97/15658에 기록된 것을 포함하며, 이들 모두 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. 이러한 PI3K 억제제의 구체적인 예는 SF-1126(PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235(PI3K 억제제, Novartis), XL-147(PI3K 억제제, Exelixis, Inc.)를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "CD20" 또는 "CD20 항원"은 자연적으로 발현되거나 또는 CD20 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 등의 CD20의 폴리펩티드 및 임의의 변이체, 아이소폼 및 상동체 종을 지칭한다. 인간 CD20은 또한 MS4A1, 즉 막-스패닝 4-도메인, 서브패밀리 A, 구성원 1로서 알려져 있다. 당업계에서 인지되는 바와 같이, CD20에 대한 추가적인 동의어는 CD20 항원, CD20 수용체, B-림프구 표면 항원 B1, B1, Bp35, LEU-16, MGC3969, MS4A2 및 S7을 포함한다. 2가지 전사체 변이체가 인간 CD20에 대하여 기술되었다. 변이체 1은 더 긴 전사체 변이체를 나타내며, GenBank ID(GI) 68348720에 해당한다. 변이체 3은 변이체 1과 비교하여 5' UTR 부분이 없으며, GenBank ID (GI) 68348721에 해당한다. 변이체 1 및 3은 동일한 단백질을 암호화한다. 인간 CD20의 주요 형태는 GenBank Protein ID 23110989에 의해 기술되는 297개 아미노산 단백질을 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 화학적으로 활성인 표면 분자의 그룹으로 이루어지며, 통상적으로 특이적인 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적인 하전 특징을 가진다.
용어 "뗏목"은 세포의 원형질막의 외부 소엽(leaflet) 영역에 위치하는 스핑고지질- 및 콜레스테롤-풍부 막 마이크로도메인을 지칭한다. 이러한 도메인 내에서 회합하는 특정 단백질의 능력은 단백질의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및/또는 이의 절편이 결합한 후, 지질뗏목으로 CD20 분자의 전위는 원형질막 내에 고밀도의 CD20 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 고밀도의 CD20 항원-항체 복합체는 CDC 동안에 보체계의 효과적인 활성화를 가능하게 할 수 있다.
본원에서 사용된, "항체" 또는 절편 등은 면역글로불린 분자의 적어도 일부분, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 항원 또는 항원 수용체 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분(이들은 본 발명의 CD20에 대한 항체 내로 혼입될 수 있음)을 포함하는 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 항체는 선택적으로 특이적 리간드, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 이러한 항체가 시험관 내, 동일계 내, 생체 내 및 생체 외에서 적어도 하나의 항원 활성 또는 결합, 또는 항원 수용체 활성 또는 결합을 조절, 감소, 증가, 길항, 작용(agonize), 완화, 경감, 차단, 억제, 저지 및/또는 방해하는 특이적인 리간드에 추가로 영향을 미친다. 비제한적인 예로서, 다양한 CD20 특이적 항체가 개시되어 있으며, 여기에서 특화된 부분 또는 변이체는 적어도 하나의 항원 분자, 또는 이의 특화된 부분, 변이체 또는 도메인에 결합할 수 있다. 적당한 항원 특이적 항체, 이의 특화된 부분, 또는 변이체는 또한 선택적으로 적어도 하나의 활성 또는 기능, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 RNA, DNA 또는 단백질 합성, 방출, 수용체 신호전달, 막 회합(membrane association), 결합 활성, 단백질 생성 및/또는 합성에 영향을 미칠 수 있다.
항체는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 동일한 중쇄(HC)로 구성된 헤테로테트라머 당단백질이다. 전형적으로, 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의하여 중쇄에 연결되어 있으며, 한편 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄마다 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 이격된 사슬 내 이황화 다리를 가진다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)를 가지고, 그 다음에 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL)을 가지고, 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란하게 되고, 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 불변 도메인과 나란하게 된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초한 2가지 분명하게 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 5가지 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 배정될 수 있으며, 이는 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 좌우된다. IgA 및 IgG는 아이소타입 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로서 추가로 하위분류된다.
항체 절편은 면역글로불린 분자의 적어도 일부분, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 항원 또는 항원 수용체 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분(이들은 본 발명의 CD20에 대한 항체 내로 혼입될 수 있음)을 포함하는 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 임의의 부분이 항체 사이의 서열에서 광범위하게 상이하고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 것을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐서 균일하게 분포되지 않는다. 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 3가지 분절 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 초가변 영역에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분은 골격(FR)이라 불린다. 본래 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 CDR에 연결된 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에서는 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합함에 있어서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "항체"는 또한 절단 절편, 특화된 부분 및 이의 변이체를 포함하며,이는 단일 사슬 항체 및 이의 절편을 포함하여, 항체 또는 이의 특화된 절편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체 모방체 또는 항체의 부분을 포함하는 것을 포함한다. 기능적인 절편은 포유동물 항원, 예를 들어 CD20에 결합하는 항원-결합 절편을 단독으로 또는 다른 항원, 예를 들어 인간 상피세포 성장 인자 수용체(HER1), IgE, 혈관내피 성장 인자, HER 이량체화 억제제, Bcl-2 패밀리 단백질, MET, IL-13, IFN 알파, EGFL7, CD40, DR4 및 DR5, PI3 키나아제, 림프독소 알파, 베타 7 인테그린, 아밀로이드 베타, CRIg, TNF, 보체(C5), CBL, CD147, IL-8, gp120, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1, CD2, EGFR, TGF-베타, TNF-알파, E-셀렉틴, Fact VII, TNF, Her2/neu, F gp, CD11/18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, 베타2-인테그린, 알파4베타7, CD52, HLA DR, CD22, CD64 (FcR), TCR 알파 베타, CD2, CD3, Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpIIbIIIa, IgE, IL5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, CD30, HLA, VNR인테그린, CD25, IL-23 및 IL-12와 조합하여 포함한다. 예를 들어, 항원 또는 이의 부분에 결합할 수 있는 항체 절편은 이에 한정되는 것은 아니지만 Fab(예컨대, 파파인 절단에 의함), Fab'(예컨대, 파파인 절단 및 부분적 환원에 의함) 및 F(ab')2(예컨대, 펩신 절단에 의함), facb(예컨대, 플라스민 절단에 의함), pFc'(예컨대, 펩신 또는 플라스민 절단에 의함), Fd(예컨대, 펩신 절단, 부분적 환원 및 재응집에 의함), Fv 또는 scFv(예컨대, 분자 생물학 기법에 의함) 절편을 포함하며, 본 발명에 의해 포함된다(예컨대, 문헌[Colligan, Immunology] 참조).
이러한 절편은 당업계에 알려지고/알려지거나 본원에 기술된 바와 같은 효소 절단, 합성 또는 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 자연적 정지 코돈의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절두(truncated) 형태로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 암호화하는 조합 유전자는 CH1 도메인 및/또는 중쇄의 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체의 다양한 부분은 종래 기법에 의해 화학적으로 함께 연결될 수 있거나, 또는 유전 공학 기법을 사용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항" 항체는 CD20과 같은 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항 항체는 항원의 생물학적 활성을 상당히 또는 완전히 억제한다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%만큼 감소된다.
본원에서 사용된 "길항 항체"는 관심의 참조 폴리펩티드의 기능적 활성의 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"항-유전자형(항-Id) 항체"는 항체의 항원-결합 부위와 일반적으로 회합되는 특유의 결정기를 인식하는 항체이다. Id 항체는 항-Id가 제조되는 mAb와 함께 mAb의 공급원으로서 동일한 종 및 유전자 유형(예컨대, 마우스 주(strain))의 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 유전자형 결정기에 대한 항체(항-Id 항체)를 생성함으로써 면역화 항체의 유전자형 결정기를 인식하거나 이에 반응할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제4,699,880호를 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. 항-Id 항체는 또한 "면역원"으로서 사용되어 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이는 소위 항-항-Id 항체를 생성한다. 항-항-Id는 항-Id를 유도한 원래의 mAb와 에피토프가 동일할 수 있다. 따라서, mAb의 유전자형 결정기에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론을 확인하는 것이 가능하다.
"분리" 항체는 자연적인 환경에서 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질 또는 비단백질 용질을 포함한다. 바람직한 양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로리법(Lowry method)에 의해 측정된 바와 같이, 항체의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 배열 결정장치(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 획득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 환원 또는 비환원 조건 하에서 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로 분리 항체는 재조합 세포 내에 동일계 내 CD20 항체를 포함한다. 그러나 선택적으로, 분리 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "리툭시맙" 또는 "리툭산(RITUXAN)(등록상표)"은 미국 특허 제5,736,137호(Anderson et al.)에 "C2B8"로서 기술된 상업적으로 이용가능한 키메라 항-CD20 항체로서 지칭된다. 용어 "2F2" 또는 "오파투무맙"은 WO 2004/035607(Teeling et al. (2004))에 기술된 바와 같은 완전 인간 항-CD20 항체를 지칭한다. 용어 "GA101" 또는 "아푸투주맙(afutuzumab)"은 WO 2005/0448959(Umana, 미국 특허 제5,639,641호(2005))에 기술된 바와 같은 중쇄 B-HH6 및 경쇄 B-KV1로 이루어진 인간화 및 당-조작된(glyco-engineered) 항-CD20 항체를 지칭한다. 용어 "B1"은 뮤린 항-CD20 항체 토시투모맙을 지칭하며, 이는 벡사(등록상표)의 비표지화 항체 성분에 해당한다.
본원에 사용된 용어 "III형" 항체는 CD20, 이의 에피토프 및/또는 이의 아이소폼에 결합하는 온전한(intact) 항체 또는 그의 절편을 지칭하며, 이는 II형 항체와 유사하게 가교제의 부재 하에 아포토시스를 상당히 유도하는 능력을 가지고, I형 항체와 유사하게 CD20의 지질뗏목으로의 재분배를 야기하고 보체 의존성 세포독성(CDC)을 상당히 유도할 능력을 가진다.
본원에 사용된 용어 "조작된 항체" 또는 "변형된 항체"는 상당한 인간 골격과 불변 영역(CL, CH 도메인(예컨대, CH1, CH2, CH3), 및 힌지), 및 항-CD20 항체와 같은 항체 또는 그의 절편에 결합하는 항원으로부터 유래된 CDR을 가지는 항체를 포함한다. 완전 인간 골격은 인간 생식세포계열 서열뿐만 아니라 체세포 돌연변이가 있는 서열에 해당하는 골격을 포함한다. CDR은 임의의 항체 골격의 환경 내 또는 외부에서 항원과 회합 또는 항원에 결합하는 하나 이상의 CDR로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, CD20으로 지정된 본 발명의 조작된 인간 항체의 CDR은, 마우스 항체 골격의 환경 내에서 항원에 결합하고 그 다음 조작되어 인간 골격의 환경 내에서 항원에 결합하는 CDR로부터 유래될 수 있다. 종종, 조작된 인간 항체는 인간에서 실질적으로 비면역성(immunogenic)이다.
유사하게, 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류(마우스, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 햄스터 등) 및 기타 포유동물로 지정된 항체는 이러한 종, 아속, 속, 아과, 및 과 특이적 항체를 지정한다. 또한, 키메라 항체는 상기한 것의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 변화 또는 변이는 선택적으로 및 바람직하게 비변형 항체에 비하여 인간 또는 다른 종에서 면역원성을 유지 또는 감소시킨다. 조작된 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다.
조작된 항체는 기능적으로 재배열된 인간 또는 조작된 인간 면역글로불린(예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비인간 동물 또는 원핵세포 또는 진핵세포에 의해 생성될 수 있다. 또한, 조작된 항체가 단일 사슬 항체일 때, 이는 본래 인간 또는 비인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결하는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩티드는 인간 기원의 것을 가지는 것으로 고려된다.
CD20 및 비-CD20 항원과 같은 적어도 2가지 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 가지는 단일클론의, 바람직하게는 인간, 조작된 인간, 재표면화 또는 인간화 항체인 이중특이적, 이종특이적, 헤테로컨쥬게이트 또는 유사 항체가 또한 사용될 수 있다. 본 경우에서, 결합 특이성 중 하나는 적어도 하나의 항원 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 다른 항원 단백질에 대한 것이다. 이중특이적 항체를 만드는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하며, 여기에서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 가진다(Milstein 및 Cuello, Nature 305:537 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의 배열때문에, 이러한 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 약 10가지의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이 중 단지 1가지만 옳은 이중특이적 구조를 가진다. 옳은 분자의 정제는 보통 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 또는 그 외에는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 유사한 절차가 예컨대 각각 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는, WO 93/08829, 미국 특허 제6,210,668호, 제6,193,967호, 제6,132,992호, 제6,106,833호, 제6,060,285호, 제6,037,453호, 제6,010,902호, 제5,989,530호, 제5,959,084호, 제5,959,083호, 제5,932,448호, 제5,833,985호, 제5,821,333호, 제5,807,706호, 제5,643,759호, 제5,601,819호, 제5,582,996호, 제5,496,549호, 제4,676,980호, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)], [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)], 미국 특허 공개 제20090258026호, 미국 특허 공개 제20060140946호 및 미국 특허 공개 제20070298040호에 개시되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(본래의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 아이소타입에 따라 다르다. 항체 효과기 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과가 기능을 실행하는 백혈구이다. 특정 양태에서, 상기 세포는 적어도 FcyRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능(들)을 실행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵세포(PBMC), 자연 살생(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 본래의 공급원, 예컨대 혈액으로부터 분리될 수 있다.
항- CD20 항체
출원인의 발견, 그 중에서도 항-CD20 항체 및 이의 절편을 기초로 하여, 본 발명의 조성물 및 방법은 돌연변이 항체 등이 될 수 있다. 항-CD20 항체는 "조작된 항체" 또는 변형된 항체, 예를 들어 항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체일 수 있으며, 여기에서 항-CD20 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기는 변형된다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열에 대한 변형은 본원에 달리 지시되지 않거나 달리 알려져 있지 않다면, 항원에 대한 항체 또는 절편의 친화도 또는 결합활성을 개선시키는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 서열에 대한 변형, 및/또는 효과기 기능을 개선시키는 항체의 Fc 부분에 대한 변형을 포함한다. 변형은 임의의 공지된 항-CD20 항체 또는 본원에 기술된 바와 같이 확인된 항-CD20 항체에 대하여 이루어질 수 있다. 이러한 변형된 항체는 반드시 참조 항-CD20 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 20%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 또는 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 또는 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 인간 CD20 결합 능력을 유지할 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 47, 34, 35 및 36의 아미노산 서열에 대하여 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열에 대하여 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 경쇄를 포함한다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 또는 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 항-CD20 항체는 "조작된 항체" 또는 변형된 항체, 예를 들어 항-CD20의 아미노산 서열 변이체일 수 있으며, 여기에서 항-CD20 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기는 변형된다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열에 대한 변형은 본원에 달리 지시되지 않거나 달리 알려져 있지 않다면, 항원에 대한 항체 또는 절편의 친화도 또는 결합활성을 개선시키는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 서열에 대한 변형, 및/또는 효과기 기능을 개선시키는 항체의 Fc 부분에 대한 변형을 포함한다. 변형은 임의의 공지된 항-CD20 항체 또는 본원에 기술된 바와 같이 확인된 항-CD20 항체에 대하여 이루어질 수 있다. 이러한 변형된 항체는 반드시 참조 항-CD20 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 1~5, 1~3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 인간 CD20 결합 능력을 유지할 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 47, 34, 35 및 36의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 비교할 때 약 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 비교할 때 약 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함한다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다.
항-CD20 항체 CD20-7 및 CD20-6을 생성하는 하이브리도마는 ATCC 수탁번호 PTA-10487 및 PTA-10486 하에서 침착되었다.
"% 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정될 때, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 관계의 척도이다. 서열에 대한 동일성 또는 유사성은, 본원에서 필요하다면 최대 서열 동일성 백분율을 획득하기 위하여, 서열을 정렬하고 간격을 도입한 후에, 항-CD20 항체와 동일(즉, 동일한 잔기) 또는 유사(즉, 공통된 측쇄 특성을 기초로 한 동일한 기로부터의 아미노산 잔기, 하기 참조)한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 내부 확장, 결실, 또는 가변 도메인의 외부 항체 서열로 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되어야 한다. 일반적으로, 비교될 2개의 서열은 서열 사이의 최대 상관 관계를 제공하도록 정렬된다. 2개 서열의 정렬된 것이 검사되고 2개 서열 사이의 정확한 아미노산 또는 뉴클레오티드 관련성을 제공하는 위치의 수가 결정되며, 정렬된 것의 전체 길이로 나누고 100을 곱하여 동일성 형상 %를 제공한다. 이러한 동일성 형상 %는 비교될 서열의 전체 길이(이는 동일 또는 매우 유사한 길이이고 매우 상동성인 서열에 대하여 특히 적당함)에 대하여 결정될 수 있거나, 또는 보다 짧게 한정된 길이(이는 동일하지 않은 길이 또는 더 낮은 수준의 상동성을 가지는 서열에 대하여 보다 적당함)에 대하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 서열은 파일을 ".aln" 확장자로 생성하는 Unix 하에서의 소프트웨어 clustalW를 이용하여 정렬될 수 있고, 그 다음 상기 파일은 .aln 파일을 여는 Bioedit program으로 불러올 수 있다(Hall, T. A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98). Bioedit 윈도우에서, (한 번에 2개씩) 개별 서열을 선택하여 이들을 정렬할 수 있다. 이 방법은 전체 서열의 비교를 허용한다.
2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 예를 들어, 프로그램은 Wisconsin Sequence Analysis Package, 버젼 9.1(Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984, 미국 위스콘신주 매디슨 소재 Genetics Computer Group으로부터 입수가능함)로 입수가능하다. 2개 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP은 2개 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성 % 및 2개 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 %를 결정하는데 사용될 수 있다. BESTFIT는 Smith-Waterman의 "국소적 상동성" 알고리즘을 사용하고(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981), 2개 서열 사이의 유사성이 가장 좋은 단일 영역을 찾는다. BESTFIT는 실이가 같지 않은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열을 비교하는데 보다 적합화되며, 상기 프로그램은 서열이 더 짧을수록 더 긴 부분을 나타내는 것으로 가정한다. 이에 비해, GAP은 Needleman-Wunsch의 알고리즘에 따라서 "최대 유사성"을 찾는 2개의 서열을 정렬한다(J. Mol. Biol., 48:443-354, 1970). GAP은 대략 동일한 길이의 서열을 비교하는데 보다 적합화되어 있으며 정렬은 전체 길이에 대하여 예측된다. 바람직하게 각각의 프로그램에서 사용된 파라미터 "Gap Weight" 및 "Length Weight"는 각각 폴리뉴클레오티드에 대하여 50 및 3, 폴리펩티드에 대하여 12 및 4이다. 바람직하게 동일성 및 유사성 %는 비교되고 있는 2개의 서열이 최적으로 정렬되어 있을 때 측정된다.
서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 또한 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 BLAST 패밀리의 프로그램(Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, Karlin & Altschul에서와 같이 변형됨, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, available from the National Center for Biotechnology Information(NCBI)(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 입수가능하고, NCBI의 홈페이지 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 접근가능함)이 있다. 이들 프로그램은 2개 서열의 비교를 위하여 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직하면서 비제한적인 예를 예시한다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램을 이용하여 score=100, wordlength=12로 실행되어 본 발명의 임의의 항-CD20 항체의 전부 또는 일부분을 암호화하는 핵산 분자에 대한 뉴클레오티드 서열 상동성을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램을 이용하여 score=50, wordlength=3으로 실행되어 본 발명의 단백질 분자에 대한 아미노산 서열 상동성을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 간격이 있는 정렬을 얻기 위하여, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast가 분자(Id.) 사이의 뚜렷한 관계를 검출하는 반복 검색을 실행하는데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast를 이용할 때, 각각의 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조할 수 있다. 서열의 비교를 위하여 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직하면서 비제한적인 예는 문헌[Myers 및 Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 부분인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 포함되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 간격 길이 페널티 12, 및 간격 페널티 4가 사용될 수 있다.
당업계에 알려진 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 프로그램의 다른 비제한적인 예는 FASTA(Pearson W. R. 및 Lipman D. J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988, Wisconsin Sequence Analysis Package의 부분으로서 입수가능함)이다. 바람직하게 BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스(Henikoff S. 및 Henikoff J. G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992)가 뉴클레오티드 서열이 먼저 비교 전에 아미노산 서열로 번역되는 경우를 포함하여 폴리펩티드 서열 비교에 사용된다.
아미노산 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 당업계에 알려진 프로그램의 또 다른 비제한적인 예는 SeqWeb Software(a web-based interface to the GCG Wisconsin Package: Gap 프로그램에 대한 웹 기반 인터페이스)이며, 이는 디폴트 알고리즘 및 프로그램의 파라미터를 blosum62, gap weight 8, length weight 2로 설정하여 이용된다.
2개 서열 사이의 동일성 백분율은 간격을 허용하거나 또는 허용하지 않으면서, 상기 기술된 것과 유사한 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 전형적으로 정확하게 공통되는 것이 계수된다.
프로그램 BESTFIT가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 %를 측정하는데 사용될 수 있으며, 의문의 서열 및 참조 서열이 최적으로 정렬되고 프로그램의 파라미터가 디폴트 값으로 설정된다.
변형된 항체를 생성하기 위하여, 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)이 항체의 하나 이상의 초가변 영역에 도입된다. 대안적으로 또는 추가로, 골격 영역 잔기의 하나 이상의 변형(예컨대, 치환)이 항원에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화도를 개선시키는 경우, 이러한 변형이 항-CD20 항체에 도입될 수 있다. 변형하는 골격 영역 잔기의 예는 항원에 직접적으로 비공유적으로 결합하는 것(Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); CDR의 구조와 상호작용/이에 영향을 미치는 것(Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); 및/또는 VL VH 계면에 참여하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 이러한 골격 영역 잔기의 변형은 항원에 대한 항체의 결합 친화도의 향상을 가져온다. 예를 들어, 약 1개 내지 약 5개 골격 잔기(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개)가 본 발명의 이러한 양태에서 변형될 수 있다. 때때로, 심지어 초가변 영역 잔기의 어느 것도 변형되지 않은 경우에도, 이는 결합 친화도의 향상이 있는 항체를 생성하는데 충분할 수 있다. 그러나 보통 변형된 항체는 추가적인 초가변 영역 변형(들)을 포함할 것이다.
변형되는 초가변 영역 잔기는 무작위로 변화될 수 있으며, 특히 이 때 항원에 대한 항-CD20 항체의 출발 결합 친화도는 이러한 무작위로 생성된 변형된 항체가 용이하게 스크리닝될 수 있도록 한다.
이러한 변형된 항체를 생성하는 하나의 유용한 절차는 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)"(Cunningham 및 Wells, Science, 244:1081-1085 (1989))이라고 불린다. 하나 이상의 초가변 영역 잔기(들)는 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)로 대체되어 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 그 다음 치환에 대한 기능적 민감도를 나타내는 이러한 초가변 영역 잔기(들)는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적이거나 또는 다른 돌연변이를 도입함으로써 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 그 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 이러한 방법으로 생성된 Ala-돌연변이체는 본원에 기술 및/또는 당업계에 알려진 바와 같이 생물학적 활성에 대하여 스크리닝된다.
이러한 변형된 항체를 생성하는 다른 절차는 파지 디스플레이(phage display)를 사용하여 친화도 성숙을 포함한다(Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992), 및 Lowman et al., Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991)). 간략하게, 몇몇의 초가변 영역 부위(예컨대, 6~7개 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 돌연변이체는 융합물로서 사상파지 입자로부터 각각의 입자 내에 둘러싸여진 M13의 유전자 III 산물까지 1가 방식으로 표시된다. 그 다음 파지 디스플레이된 돌연변이체는 본원에 개시 및/또는 당업계에 알려진 바와 같이 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
항체 서열에서의 돌연변이는 치환, 내부 결실을 포함한 결실, 융합 단백질을 생성하는 추가를 포함한 추가, 또는 아미노산 서열 내 및/또는 이에 인접한 아미노산 잔기의 보존적 치환을 포함할 수 있지만, 이는 변화가 기능적으로 동등한 항-CD20 항체 또는 절편을 생성한다는 점에서 "침묵" 변화를 초래한다. 보존적 아미노산 치환은 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 수반된 잔기의 양극성(amphipathic) 성질을 기반으로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며; 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 추가로, 글리신 및 프롤린은 사슬 배향에 영향을 미칠 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다. 또한, 원한다면, 비고전적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 항체 서열로 치환 또는 부가로서 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산은 이에 한정되는 것은 아니지만 일반적인 아미노산의 D-이성질체, α-아미노 아이소뷰티르산, 4-아미노뷰티르산, Abu, 2-아미노 뷰티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소뷰티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테산, t-뷰틸글리신, t-뷰틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 조작된 아미노산(designer amino acid), 예를 들어 β-메틸 아미노산, C α-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 일반적으로 포함한다.
다른 양태에서, 변형을 위하여 선택된 부위는 파지 디스플레이를 사용하여 친화도가 성숙된된다(상기 참조).
당업계에 알려진 돌연변이유발에 대한 임의의 기법은, 항체 서열에서 아미노산 치환(들)의 목적을 위하여, 또는 추가적인 조작을 용이하게 하는 제한 부위를 형성/결실하기 위하여, DNA 서열에서 개별적인 뉴클레오티드를 변형하는데 사용될 수 있다. 이러한 기법은 이에 한정되는 것은 아니지만, 화학적 돌연변이유발, 시험관 내 부위-지정 돌연변이유발(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Hutchinson, C. et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)), 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발(Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463 (1985); Hill et al., Methods Enzymol., 155:558-568 (1987)), PCR-기반 중복 신장(PCR-based overlap extension)(Ho et al., Gene, 77:51-59 (1989)), PCR-기반 메가프라이머 돌연변이유발(Sarkar et al., Biotechniques, 8:404-407 (1990)) 등을 포함한다. 변형은 이중-가닥 다이데옥시 DNA 서열결정에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 분리 핵산은 적어도 하나의 CD20 특이적 항체 또는 그의 절편 또는 특화된 변이체의 생성에 사용될 수 있으며, 이는 세포, 조직, 기간 또는 동물(포유동물 및 인간을 포함함)에서 측정 또는 영향을 미치는데, 또는 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성 및/또는 신경학적 장애 또는 질환, 또는 다른 공지된 또는 특화된 항원 관련 병태 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 병태를 진단, 모니터, 조절, 치료, 완화, 이의 발생을 방지하는 것을 돕거나, 또는 이의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.
인간 단백질 또는 이의 절편, 예를 들어 CD20에 특이적인 상당히 조작된 인간 항체는, 예를 들어 다른 면역원성 항원 또는 아이소폼, 예를 들어 CD20 단백질 및/또는 이의 일부분(합성 분자, 예를 들어 합성 펩티드를 포함함) 또는 항원, 예를 들어 CD56, 인간 상피세포 성장 인자 수용체(HER1), IgE, 혈관내피 성장 인자, HER 이량체화 억제제s, Bcl-2 패밀리 단백질, MET, IL-13, IFN 알파, EGFL7, CD40, DR4 및 DR5, PI3 키나아제, 림프독소 알파, 베타 7 인테그린, 아밀로이드 베타, CRIg, TNF, 보체(C5), CBL, CD147, IL-8, gp120, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1, CD2, EGFR, TGF-베타, TNF-알파, E-셀렉틴, Fact VII, TNF, Her2/neu, F gp, CD11/18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, 베타2-인테그린, 알파4베타7, CD52, HLA DR, CD22, CD64(FcR), TCR 알파 베타, CD2, CD3, Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpIIbIIIa, IgE, IL-5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD30, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, HLA, VNR인테그린, CD25, IL-23 및 IL-12의 임의의 하나 또는 이의 조합에 대하여 조작될 수 있다.
항체 생성
본 발명의 적어도 하나의 항원 특이적 항체, 예를 들어 항-CD20 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 선택적으로 세포주, 혼합 세포주, 무한증식 세포 또는 무한증식 세포의 클론 집단에 의해 생성될 수 있다. 예컨대 [Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow 및 Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]를 참조할 수 있다.
하나의 접근법에서, 하이브리도마는 적당한 무한증식 세포주(예컨대, 골수종 세포주, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NS0, NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A 등, 또는 헤테로골수종, 이의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 당업계에 알려진 바와 같은 임의의 다른 적당한 세포주)(예컨대, www.atcc.org, www.lifetech.com. 등 참조)를, 항체를 생성하는 세포, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 분리 또는 클론화 비장, 말초 혈액, 림프, 편도, 또는 다른 면역 또는 B 세포 포함 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 골격 또는 CDR서열을 발현하는 임의의 다른 세포와, 내생 또는 비상동 핵산으로서, 또는 재조합 또는 내생의 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵생물, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말, 면양(ovine), 염소, 양, 영장류, 진핵동물, 유전체 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화 등 또는 이의 임의의 조합으로서 융합함으로써 생성된다. 예컨대, 문헌[Ausubel, supra, and Colligan, Immunology, supra, chapter 2]을 참조하며, 이는 전체가 본원에 참조로 포함된다.
항체를 생성하는 세포는 또한 관심의 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적당한 동물의 말초 혈액, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수 있다. 임의의 다른 적당한 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체, 이의 특화된 절편 또는 변이체를 암호화하는 비상동 또는 내생 핵산을 발현하는데 사용될 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적인 배양 조건 또는 다른 적당한 공지된 방법을 사용하여 분리되고, 한계 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 공지된 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 원하는 특이성을 가지는 항체를 생성하는 세포는 적당한 분석(예컨대, ELISA, 보다 구체적으로 CD20 ELISA)에 의해 선택될 수 있다.
인간 항원 특이적 항체는, 본원에 기술 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이 추가적으로 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 비인간 영장류 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 항원 특이적 항체를 생성하는 세포는 이러한 동물로부터 분리될 수 있고 적당한 방법, 예를 들어 본원에 기술된 방법을 사용하여 무한증식될 수 있다.
CD20과 같은 인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 마우스는 공지된 방법(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Lonberg et al.의 미국 특허 제5,770,428호, 제5,569,825호, 제5,545,806호, 제5,625,126호, 제5,625,825호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,789,650호; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. 미국 특허 제5,545,807호, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, 문헌[Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)], [Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)], [Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994)], [Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)], [Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992)], [Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993)], [Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995)] 및 [Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)]에 의해 생성될 수 있으며, 이들은 각각 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 일반적으로, 이들 마우스는 기능적으로 재배열되거나, 또는 기능적 재배열을 겪을 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 좌위로부터의 DNA를 포함하는 적어도 하나의 이식유전자를 포함한다. 이러한 마우스에서 내생 면역글로불린 좌위는 파괴 또는 결실되어 내생 유전자에 의해 암호화되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거할 수 있다.
유사한 단백질 또는 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 것은 통상적으로 펩티드 디스플레이 라이브러리, 파지 디스플레이 및 다른 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 펩티드 디스플레이 방법은 원하는 기능 또는 구조를 가지는 개별적인 구성원에 대한 펩티드의 대규모 집합의 스크리닝을 수반한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 당업계에 잘 알려져 있다. 표시된 펩티드 서열은 길이가 3 내지 5000개 이상의 아미노산일 수 있으며, 빈번하게는 5~100개 아미노산 길이, 종종 약 8 내지 25개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하는 직접적인 화학적 합성 방법에 더하여, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기술되었다. 한 가지 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열의 디스플레이를 수반한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특히 디스플레이된 펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 방법은 PCT 특허 공개 제91/17271, 91/18980, 91/19818, 및 93/08278호에 기술되어 있다.
펩티드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 시험관 내 화학적 합성 및 재조합 방법 둘 모두의 양태를 가진다. 이러한 시스템의 예는 예를 들어 PCT 특허 공개 제92/05258, 92/14843 및 96/19256호에 기술되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,658,754 및 5,643,768호를 참조할 수 있다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(Carlsbad, Calif.), 및 Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire, UK)와 같은 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 이러한 시스템의 예는 예를 들어 Enzon에게 양도된 미국 특허 제4,704,692호; 제4,939,666호; 제4,946,778호; 제5,260,203호; 제5,455,030호; 제5,518,889호; 제5,534,621호; 제5,656,730호; 제5,763,733호; 제5,767,260호; 제5,856,456호; Dyax에게 양도된 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,571,698호; 제5,837,500호; Affymax에게 양도된 미국 특허 제5,427,908호; 제5,580,717호; Cambridge Antibody Technologies에게 양도된 미국 특허 제5,885,793호; Genentech에게 양도된 미국 특허 제5,750,373호; Xoma, et al.에게 양도된 미국 특허 제5,618,920호; 제5,595,898호; 제5,576,195호; 제5,698,435호; 제5,693,493호; 제5,698,417호; 및 상기한 Sambrook에 기술되어 있다. 본 발명의 CD20 항체는 또한 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 항원 특이적 항체를 사용하여 제조되어, 젖에 이러한 항체를 생성하는 형질전환 동물 또는 포유동물, 예를 들어 염소, 소, 말, 양, 토끼 등을 제공할 수 있다. 이러한 동물은 공지된 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 이러한 방법의 예는 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 미국 특허 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 제5,304,489호 등에 기술되어 있다. 본원에 언급된 각각의 참조문헌은 전체가 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 항-CD20 항체는 추가적으로 식물 부분 또는 이로부터 배양된 세포에서 이러한 항체, 특화된 부분 또는 변이체를 생성하는 형질전환 식물 및 배양된 식물 세포(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 담배 및 옥수수(maize))를 제공하는 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 항원 특이적 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 담배 잎은, 예컨대 유도성 프로모터를 사용하여, 대량의 재조합 단백질을 제공하는데 성공적으로 사용된다. 예컨대, 문헌[Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다. 또한, 형질전환 옥수수는, 다른 재조합 시스템에서 생성된 단백질 또는 자연적 공급원으로부터 정제된 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가진 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현하는데 사용된다. 예컨대, 문헌[Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다. 항체(항체 절편, 예를 들어 단일 사슬 항체(ScFvs)를 포함함)는, 담배 종자 및 감자 괴경을 포함하여 형질전환 식물 종자로부터 대량으로 생산된다. 예컨대, 문헌[Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 CD20 항체는 공지된 방법을 따라서, 형질전환 식물을 사용하여 생성된다. 또한 예컨대 문헌[Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (October, 1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994)], 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다.
항체 조작, 인간화 및 재표면화
비인간 또는 인간 항체를 조작, 인간화 또는 재표면화하는 방법이 또한 사용될 수 있으며 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 인간화, 재표면화 또는 유사하게 조작된 항체는 비인간, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 또는 다른 포유동물인 공급원 유래의 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "이입(import)" 잔기로서 일컬어지며, 이는 전형적으로 공지된 인간 서열의 "이입" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 취해진다.
공지된 인간 Ig 서열은 예컨대, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
이러한 이입된 서열은 당업계에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화도, 온율(on-rate), 오프율(off-rate), 결합활성, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적당한 특성을 감소, 향상 또는 변형하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 CD20 결합에 영향을 미치는 것에 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 수반된다. 따라서, 비인간 또는 인간 CDR 서열의 부분 또는 전부는 유지되는 한편, 가변 및 불변 영역의 비인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
항체는 또한 선택적으로 항원 CD20 및 다른 유리한 생물학적 특성에 대하여 높은 친화도를 유지하는 인간화, 재표면화, 조작 또는 조작된 인간 항체일 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 인간화(또는 인간) 또는 조작된 항-CD20 항체 및 재표면화 항체는 선택적으로, 부모, 조작 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념상의 인간화 및 조작된 생성물의 분석 공정에 의해 제조될 수 있다. 3차원의 면역글로불린 모델은 상업적으로 입수가능하며 이는 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 표현하는 컴퓨터 프로그램이 입수가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 CD20과 같은 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방법으로, 골격(FR) 잔기는 콘센서스로부터 선택되고 조합되며 서열을 이입할 수 있어 원하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도를 획득할 수 있다.
본 발명의 항체의 인간화, 재표면화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 문헌[Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5,639,641호; 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 제4,816,567호; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; 및 7,342,110]에 기술된 것을 사용하여 실행될 수 있으며, 여기에서 인용된 참조문헌을 포함하여 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.
Fc 영역
특징 양태에서, 항체는 변형된(예컨대, 돌연변이된) Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, Fc 영역은 항체의 효과기 기능을 감소 또는 향상시키도록 변형된다. 일부 양태에서, Fc 영역은 IgM, IgA, IgG, IgE, 또는 다른 아이소타입으로부터 선택된 아이소타입이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 아미노산 변형을 C1q 결합 및/또는 항원 결합 분자의 Fc 영역의 보체 의존성 세포독성(CDC) 기능을 변형하는 하나 이상의 추가 아미노산 변형과 조합하는 것이 유용할 수 있다. 특정 관심의 출발 폴리펩티드는 C1q에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 기존 C1q 결합 활성이 있고, 선택적으로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 가지는 폴리펩티드는 변형될 수 있어 이들 활성의 하나 또는 둘 다 향상된다. C1q를 변형하고/변형하거나 이의 보체 의존성 세포독성 기능을 변형하는 아미노산 변형은, 예를 들어 WO0042072에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
예컨대 C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형시키고 이에 의해 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 변경된 효과기 기능을 가지는 본 발명의 항체의 Fc 영역을 설계할 수 있다. "효과기 기능"은 (예컨대, 개체에서) 생물학적 활성을 활성화 또는 감소시키는 것을 담당한다. 효과기 기능의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체(BCR))의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 Fc 영역이 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 할 수 있고, 다양한 분석(예컨대, Fc 결합 분석, ADCC 분석, CDC 분석 등)을 사용하여 평가될 수 있다.
예를 들어, 개선된 C1q 결합 및 개선된 FcγRIII 결합을 가진(예컨대, 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성을 모두 가지는) 조작된 항-CD20 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 대안적으로, 효과기 기능이 감소되거나 또는 제거되는 것이 바람직하다면, 감소된 CDC 활성 및/또는 감소된 ADCC 활성을 가지는 변이체 Fc 영역은 조작될 수 있다. 다른 양태에서, (예컨대, 개선된 ADCC 활성을 가지지만, 감소된 CDC 활성을 가지는 Fc 영역 변이체를 생성하기 위하여, 또한 이와 반대이도록) 이러한 활성 중 단지 하나만 증가될 수 있고, 선택적으로 또한 다른 활성은 감소될 수 있다. 예시적인 Fc 돌연변이체는 삼중 잔기 변화, 즉 S239D, A330L 및 I332D(EU 번호 체계)이며, 여기에서 ADCC는 향상되고 CDC 활성은 감소된다. 이러한 돌연변이체를 설계하는 비제한적인 방법은 예를 들어 문헌[Lazar et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(11): 4005-4010); 및 Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5):1239-49)]에서 찾아볼 수 있다. 또한 WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO2006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635를 참조할 수 있다.
Fc 돌연변이는 또한 조작된 항체로 도입되어 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 항체의 상호작용을 변경하며 이의 약동학 특성을 개선할 수 있다. FcRn에 대한 결합이 개선된 인간 Fc 변이체의 집합이 기술되었으며, 예를 들어 문헌[Shields et al., 2001]을 포함한다. FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1에 대한 결합 부위의 고해상도 맵핑(high resolution mapping) 및 FcγR에 대한 결합이 개선된 IgG1 변이체의 설계가 문헌[J. Biol. Chem. 276:6591-6604]에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
아미노산 치환의 다른 유형은 항체의 Fc 영역의 글리코실화 패턴을 변경하는 역할을 한다. Fc 영역의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 일반적으로 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어트의 부착을 지칭한다. 아스파라긴 측쇄 펩티드 서열에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착에 대한 인식 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이며, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이러한 펩티드 서열의 어느 것의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다. O-연결 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있지만, 일반적으로 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다.
항체 또는 그의 절편의 글리코실화 패턴은, 예를 들어 폴리펩티드에서 발견된 하나 이상의 글리코실화 부위(들)을 결실, 및/또는 상기 폴리펩티드에 존재하지 않은 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 첨가함으로써 변경될 수 있다. 항체 또는 항체 절견의 Fc 영역에서 글리코실화 부위의 제거는 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 수행될 수 있으며 이는 (N-연결 글리코실화 부위에 있어서) 상기 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 제거한다. 예시적인 글리코실화 변이체는 중쇄의 잔기 N297 내지 A297(EU 번호 체계)의 아미노산 치환을 가진다. O-연결 글리코실화 부위의 제거는 또한 세린 또는 트레오닌 이외의 임의의 아미노산으로 하나 이상의 글리코실화된 세린 또는 트레오닌 잔기의 치환에 의해 이루어질 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함할 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스는 예를 들어 미국 특허출원 US 2003/0157108(Presta, L.) 및 US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)에 기술되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 2등분하는 항체는 예를 들어 WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.) 및 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al)에서 참조되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 가지는 항체는 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al)에 기록되어 있다. 또한, Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물이 있는 항체에 관하여 WO 1998/58964 및 WO 1999/22764(Raju, S.)를 참조할 수 있다. 또한, 변형된 글리코실화가 있는 항체-결합 분자에 대하여 예를 들어 US 2005/0123546(Umana et al.)을 참조할 수 있다.
특정 양태에서, 글리코실화 변이체는 Fc 영역을 포함하며, 여기에서 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 푸코스가 없다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가진다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; 문헌[Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생성하는 세포주의 비제한적인 예는 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 US 2003/0157108 AI(Presta, L); 및 WO 2004/056312 AI(Adams et al.), 특히 실시예 11), 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004)), 및 푸코실화 경로 억제제, 예를 들어 세포 배양 배지에서 카스타노스퍼민의 사용을 통한 것(미국 특허출원 제2009/0041765호)을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III(GnT III)를 발현하는 세포에서 발현되어, GnT III 은 조작된 인간 항체 특이적 항체에 GlcNAc에 첨가된다. 이러한 방식으로 항체를 생성하는 방법은 WO/9954342, WO/03011878, 특허 공개 20030003097A1, 및 문헌[Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999]에서 제공된다.
항체 친화도
본 발명의 항체는 광범위한 친화도(KD)로, 인간 CD20에 결합한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 적어도 하나의 mAb는 선택적으로 높은 친화도로 인간 항원에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 조작된 인간 또는 인간화 또는 재표면화 mAb는, 당업자에 의해 실행되는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 또는 KinExA(등록상표) 방법에 의해 측정된 바와 같이, 약 10-7M과 동등하거나 또는 미만, 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 0.1~9.9(또는 이것 내의 임의의 범위 또는 값)×10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 이것 내의 임의의 범위 또는 값인 KD로 인간 항원에 결합할 수 있다. 항-CD20 항체는 약 10-9M 이하, 보다 구체적으로는 약 10-9 내지 10-10M의 Kd로 결합한다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합활성은 당업계에 잘 알려진 임의의 적당한 방법, 예컨대 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역측정법(RIA), 또는 동역학(예컨대, BIACORE(상표명) 분석법)을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 직접 결합 분석법뿐만 아니라 경쟁적 결합 분석 포맷이 용이하게 이용될 수 있다. 예를 들어 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 여기에 기술된 방법을 참조한다. 상이한 조건(예컨대, 염 농도, pH, 온도) 하에서 측정된다면 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 다를 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터(예컨대, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 당업계에 공지된 바와 같이 바람직하게 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예를 들어 본원에 기술된 완충액으로 이루어진다.
하나의 양태에서, 결합 분석법은 CD20 항원을 이용한 효소결합 면역흡착 분석법(예컨대, ELISA)을 사용하여 실행될 수 있다. 예를 들어, CD20-발현 B 세포주 또는 재조합 단백질로부터 제조된 미정제(crude) 세포 융해물은 본원에 기술된 바와 같이 CD20 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 CD20 항원 제조물은 50mM 탄산나트륨(pH 9.6)으로 100㎕/웰에서 대략 18 내지 24시간 도안 4℃에서 Immulon 2HB 플레이트 상으로 코팅된다. 플레이트는 세척 완충액(TBS 중 0.1% Tween-20, pH 7.4)으로 세척한다. 그 이후에, 플레이트는 TBS(pH 7.4) 중 1% 카세인으로 1시간 동안 실온에서 차단한다. 항체의 단계 희석물이 플레이트에 첨가되고 대략 3시간 동안 실온에서 항온처리한 다음, 앞서와 같이 세척한다. 검출을 위하여, HRP-컨쥬게이트된 염소-항-인간 또는 염소-항-뮤린 항체는 2차 항체로서 첨가되고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 플레이트는 앞서와 같이 세척되고 TMB1 기질(BioFX)의 100㎕/웰이 첨가되어 진행된다. 반응은 대략 20분 후에 450nm 정지 시약(BioFX) 100㎕/웰로 퀀칭한다. 450nm에서 흡광도를 판독하고 각각의 항체에 대한 항체 농도에 대하여 플롯팅한다. S자형의 투여량-반응 곡선은 결합 곡선에 대하여 일치시키고, EC50 값은 디폴트 파라미터를 이용하여 GraphPad Prism v4(GraphPad software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)와 같은 프로그램을 사용하여 계산된다. EC50 값은 각각의 항체에 대한 겉보기 해리 상수 "Kd" 또는 "KD"에 대한 척도로서 사용될 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 아미노산 서열 동일성 백분율(%)은 또한, 필요하다면 최대 서열 동일성 백분율을 획득하기 위하여 서열을 정렬하고 간격을 도입하며, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후에, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 측정하는 목적을 위한 정렬은 당업계 기술에 속하는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용함에 의한 것과 같이 본원에 논의된 것으로 획득될 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기 위하여, 비교될 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 적절할 파라미터를 결정할 수 있다. ALIGN-2가 이용가능하여 아미노산 서열 비교를 위하여 이용될 수 있는 경우의 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대하여, 이와 함께 또는 이에 반하여 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대하여, 이와 함께 또는 이에 반하여 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)가 다음과 같이 계산된다: 100 ×분수 X/Y(여기에서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬이라는 점에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 공통되는 것으로서 평가된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않을 경우에, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동등하지 않을 것이다.
바람직하게는, 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 100% 동일하다. 특별히 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 예를 들어 ALIGN-2 또는 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 얻어진다.
항체 용도
일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항원 특이적 항체의 일부 형태는 선택적으로 항원에 대하여 높은 친화도 결합을 특징으로 할 수 있으며, 선택적으로 그리고 바람직하게는, 수용체에 대한 낮은 독성 및 반대 결과를 가지는 것으로서 특징으로 할 수 있다. 특히, 가변 영역, 불변 영역 및 골격과 같은 개별적인 성분이 개별적으로 및/또는 집합적으로, 선택적으로 및 바람직하게 낮은 면역원성을 가지는 경우에 본 발명의 항체, 특화된 절편 또는 변이체는 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 선택적으로 증상의 측정가능한 완화 및 낮은/낮거나 허용가능한 독성이 있는 장기간 동안 환자를 치료하는 능력을 특징으로 한다. 낮은 또는 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도, 뿐만 아니라 다른 적당한 특성이 획득되는 치료적 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은, 치료되는 환자의 25% 미만으로, 바람직하게는 치료 기간 동안 권장 기간 동안 권장 투여량으로 치료된 환자의 10% 미만으로 일어나는, 항체로 치료된 환자에서 항원에 대하여 항체의 적정가능한 수준의 최소한의 발생으로서 본원에서 정의된다
본 발명의 분리 핵산은 적어도 하나의 CD20 특이적 항체, 이의 절편 또는 이의 특화된 변이체의 생성에 사용될 수 있으며, 이는 세포, 조직, 기간 또는 동물(포유동물 및 인간을 포함함)에서 측정 또는 영향을 미치는데, 또는 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성 및/또는 신경학적 장애 또는 질환, 또는 다른 공지된 또는 특화된 항원 관련 병태 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 병태를 진단, 모니터, 조절, 치료, 완화, 이의 발생을 방지하는 것을 돕거나, 또는 이의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.
이러한 방법은 적어도 하나의 항원 특이적 항체, 예를 들어 항-CD20 항체 또는 절편을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을, 증상, 효과 또는 메커니즘에서 이러한 조절, 치료, 완화, 방지 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 유효량은 단일(예컨대, 볼루스), 다중 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 500㎎/㎏의 양을 포함할 수 있거나, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여 당 약 0.01~5000㎍/㎖ 혈청 농도의 혈청 농도를 획득하기 위하여, 또는 공지된 방법을 사용하여 행해지고 측정된 바와 같이, 본원에 기술되거나 관련 업계에서 알려진 바와 같이 여기에서 임의의 효과적인 범위 또는 값을 획득하도록 포함할 수 있다.
예시적인 항체
본 발명의 바람직한 항원 특이적 CD20 항체는 나타낸 서열을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 항원 특이적 항체는 표 1에 나타낸 경쇄 CDR 서열(즉, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3) 중 하나 및/또는 표 1에 나타낸 중쇄 CDR 서열(즉, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 중 하나를 포함한다. 보다 구체적으로, 항-CD20-6 항체는 서열번호25의 CDRL1, 서열번호 26의 CDRL2, 서열번호 27의 CDRL3, 서열번호 28의 CDRH1, 서열번호 29의 CDRH2, 서열번호 30의 CDRH3을 가진다. 항-CD20-7 항체는 서열번호 17의 CDRL1, 서열번호 18의 CDRL2, 서열번호 19의 CDRL3, 서열번호 20의 CDRH1, 서열번호 21의 CDRH2, 서열번호 22의 CDRH3을 가진다.
본 발명의 예시적인 양태는 다음을 포함한다:
뮤린 아미노산 서열
muCD20-7LC
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC [서열번호 1];
muCD20-7LC 가변 영역
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMR [서열번호 32]
muCD20-7HC
QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [서열번호 2];
muCD20-7HC 가변 영역
QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호 34]
muCD20-6LC
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muCD20-6LC 가변 영역
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muCD20-6HC QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [서열번호 4];
muCD20-6HC 가변 영역
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호47]
인간화 아미노산 서열
huCD20-7LCv1.0 DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열번호 5];
huCD20-7LCv1.0 가변 영역
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huCD20-7HCv1.0 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호 6];
huCD20-7HCv1.0 가변 영역
ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호35]
huCD20-7HCv1.1 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호 7];
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ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호36]
뮤린 가변 영역 DNA 서열
muCD20-7LC
gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtggaagtgttgatagttttggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcggtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaagctgatgatattgcaacctatttctgtcagcaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgatgcgg [서열번호 8];
muCD20-7HC
cagctccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatagtttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccatcttatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagcaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtacgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [서열번호 9];
muCD20-6LC gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctttagggcagagggccattatatcctgcagagccagtgaaagtgttgataattttggcaatagctttatgcactggtaccagcagaagccaggacagccacccacactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccgttaatcctgtggaggctgatgatattgcaacttattactgtcaacaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg [서열번호 10];
muCD20-6HC
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataaattcacaaacgttggaatgaactgggtgaagcaggttccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccagcatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttttctttggaaacctctgccagcgctgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtatgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [서열번호 11];
인간화 및 키메라 가변 영역 DNA 서열
huCD20-7LCv1.0
gaattcgccaccatgggctggagctgtattattctgttcctggtagcaaccgctacaggtgtacactccgatattgttcttacccaaagcccagcctccctcgctgtcagtccaggccagcgagccactatctcctgccgtgcaagtggatctgtcgacagctttggaaatagcttcatgcactggtaccagcagaagcctggtcagcccccaaaactcctgatttatcgggcttccaatctggagtcaggagtgcccgcaaggttctctggcgggggcagccggacagatttcacattgactataaatcccgtggaggctaacgatatcgcaacatacttctgtcagcagtcttatgaggaccccttcacattcggccagggcacaaagctggagctcaaacgtacg [서열번호 12];
huCD20-7HCv1.0
aagcttgccaccatgggatggagttgcatcatcctgttcctcgtcgcaaccgcaacaggggtgcattccgaactgcagctggtccagtctggtggtgagttgaagaaaccaggggaaacagttcgcattagctgtgctgcaagcggctatacattcacaaattatggaatgaattgggtgaaacaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggataaatacctatactggagagcctagttacgccgctcccttcaaggggcggtttgccttctctcttgagacaagtgccagcaccgcctatttgcagatttctagtttgaaaaccgaagacacagctacatacttctgcgcccgcggcgcatattacagatatgatctggggatggactattggggccagggtacctccgtgaccgtatcatccgcctccacaaagggccc [서열번호 13];
huCD20-7HCv1.1
aagcttgccaccatgggttggtcttgcatcattctgtttctggtagcaactgcaactggagtgcacagcgagctgcaactcgtccagagcggaggtgagcttaagaagccaggagagaccgtgcgaatctcttgcgccgcatccggctactctttcacaaattacggaatgaattgggtcaagcaggcaccaggtaagggactcaaatggatgggctggatcaatacctacaccggcgagcctagttatgccgcacccttcaagggtcgatttgcattcagcctggagaccagtgcttctacagcttatttgcagatcagctctctgaagaccgaggacacagctacatacttctgcgcccgtggtgcctactaccgatacgatctgggcatggactattggggccaaggcacctcagtgactgtgtcttcagcatcaaccaagggccc [서열번호 14];
chCD20-7LC
gaattcgccaccatggggtggtcatgtatcatcctcttccttgtggcaaccgcaacaggcgtacactccgacattgtactgacccagtcacctgcctccctcgccgtatcccttgggcagagagccactattagttgcagggctagtggcagtgtcgattctttcggcaattcatttatgcactggtatcagcagaaaccagggcagccacccaagttgctcatataccgcgcctcaaaccttgagtccggggtcccagcccggttttccggaggcgggtcccgcaccgacttcaccctgacaatcaacccagtagaagcagatgatatcgctacttatttctgtcagcagagctatgaagacccttttacatttggggccggaaccaagttggagctcaagcgtacg [서열번호 15];
chCD20-7HC
aagcttgccaccatgggatggagctgcatcattttgtttcttgtcgctaccgcaactggcgtccactcacagctgcagctggtgcagagtgggcctgagcttaagaaacccggtgagactgtgaagatctcatgtaaggctagcggctattcctttacaaattatggcatgaattgggtgaagcaggcccctgggaagggtctcaagtggatgggatggattaacacctatactggagagccttcatacgccgatgatttcaaagggaggttcgccttctccttggaaacctctgcttctactgcctaccttcagatttctaacctcaagaacgaggacactgcaacctatttttgcgctcgtggcgcatactatcgatatgatctgggcatggattattggggtcaaggcacatccgtaaccgtgtcctcagctagcactaagggccc [서열번호 16];
뮤린 및 인간 CD20 -7 재표면화 CDR
경쇄
CD20-7_LC_CDR1 RASGSVDSFGNSFMH [서열번호 17];
CD20-7_LC_CDR2 RASNLES [서열번호 18];
CD20-7_LC_CDR3 QQSYEDPFT [서열번호 19];
중쇄
CD20-7_HC_CDR1 NYGMN [서열번호 20];
CD20-7_HC_CDR2 WINTYTGEPS [서열번호 21];
CD20-7_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [서열번호 22];
Kabat 한정된 뮤린 및 인간화 CD20-7 HC CDR2
뮤린 muCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYADDFKG [서열번호 23];
인간화 huCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYAAPFKG [서열번호 24];
뮤린 CD20 -6 CDR 서열
경쇄
CD20-6_LC_CDR1 RASESVDNFGNSFMH [서열번호 25];
CD20-6_LC_CDR2 RASNLES [서열번호 26];
CD20-6_LC_CDR3 QQSYEDPFT [서열번호 27];
중쇄
CD20-6_HC_CDR1 NVGMN [서열번호 28];
CD20-6_HC_CDR2 WINTYTGEPA [서열번호 29];
CD20-6_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [서열번호　30]; 및
Kabat 한정된 HC CDR2
CD20-6_HC_KabCDR2 WINTYTGEPAYADDFKG [서열번호 31].
당업자는 본 출원 내 서열이 비제한적인 예임을 이해한다.
기능적 동등물 , 항체 변이체 및 유도체
기능적 동등물은 전체 또는 온전한 항체의 것에 대한 동일한 또는 비교할 만한 결합 특성을 가지는 항체의 절편을 포함한다. 이러한 절편은 Fab 절편 또는 F(ab')2 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 상보성 결정 영역의 전부보다 적은 CDR, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 CDR을 포함하는 절편이 또한 기능적이더라도, 바람직하게 항체 절편은 전체 항체의 6개 상보성 결정 영역 모두를 포함한다. 또한, 기능적 동등물은 다음 면역글로불린 부류 중 임의의 하나의 구성원일 수 있거나 또는 상기 구성원을 조합할 수 있다: IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 및 이의 하위부류.
본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 변형되어 융합 단백질, 즉 비상동 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 융합된 항체 또는 절편을 생성할 수 있다. 특정 양태에서, 항-CD20 항체의 부분에 융합된 단백질은 ADEPT의 효소 성분이다. 항-CD20 항체와 융합 단백질로서 조작될 수 있는 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 포도상구균의 엔테로톡신-A(Staphylococcal enterotoxin-A), 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 및 슈도모나스 내독소(Pseudomonas endotoxin)와 같은 독소를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Pastan et al., Cell, 47:641 (1986)]; 및 Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994)]을 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 절편은 디프테리아 A 독소, 디프네리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 큐르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinaliss) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 비제한적인 예는 예를 들어 1993년 10월 28일자로 공개되고 전체가 본원에 참조로 포함된 WO 93/21232에 포함되어 있다.
추가적인 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링(집합적으로 "DNA 셔플링"으로 불림)의 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 항체 또는 그의 절편(예컨대, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리도를가지는 항체 또는 그의 절편)의 활성을 변경하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호, 및 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33]; [Harayama, 1998, Trends Biotechnol., 16(2):76-82]; [Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol., 287:265-76]; 및 [Lorenzo 및 Blasco, 1998, Biotechniques, 24(2):308-313]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다. 항체는 또한 본원에 참조로 전체가 포함되어 있는 미국 공개 20030118592, 미국 공개 200330133939, 및 PCT 공개 WO 02/056910(모두 Ledbetter et al.)에 기술되어 있는 바와 같은 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백직일 수 있다.
도메인 항체. 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD20 항체는, 인간 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 영역에 해당하는, 도메인 항체, 예컨대 항체의 소기능 결합 단위를 포함하는 항체일 수 있다. 도메인 항체의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, Domantis Limited(영국 케임브리지 소재) 및 Domantis Inc.(미국 매사추레츠주 케임브리지 소재)로부터 입수가능하며, 치료 표적에 특이적인 것(예를 들어, WO04/058821; WO04/003019; 미국 특허 제6,291,158호; 제6,582,915호; 6,696,245호; 및 제6,593,081호 참조)을 포함한다. 도메인 항체의 상업적으로 입수가능한 라이브러리는 항-CD20 도메인 항체를 식별하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 CD20 기능적 결합 단위 및 Fc 감마 수용체 기능적 결합 단위를 포함한다.
다이아바디. 용어 "다이아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 절편을 지칭하며, 상기 절편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개 도메인 사이에서 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 하며 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 다이아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 완전하게 기술되어 있다.
백시바디(Vaccibody). 본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 백시바디이다. 백시바디는 이량체 폴리펩티드이다. 백시바디의 각각의 단량체는 힌지 영역 및 Cg3을 통하여 제2 scFv에 연결된 APC 상의 표면 분자에 대하여 특이성을 가지는 scFv로 이루어진다. 본 발명의 다른 양태에서, 하나같이 scFv로 이루어진 백시바디는 항-CD20 항체 절편은 파괴될 B 세포 및 ADCC를 매개하는 효과기 세포를 병치하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Bogen et al.의 미국 특허출원 공개 제20040253238호를 참조할 수 있다.
선형 항체. 본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 선형 항체이다. 선형 항체는 항원-결합 영역의 쌍을 형성하는 나란한 Fd 분적의 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다. 선형 항체의 비제한적인 예는 예를 들어 문헌[Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)]에 개시되어 있다.
부모 항체. 본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 부모 항체이다. "부모 항체"는 본원에 개시된 바와 같은 변경된/돌연변이 항체와 비교하여 이의 하나 이상의 초가변 영역에서 또는 이와 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기가 없거나 또는 결핍된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 따라서, 부모 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항체 돌연변이체의 해당하는 초가변 영역보다 더 짧은 초가변 영역을 가진다. 부모 폴리펩티드는 원래의 서열(즉, 자연적으로 생성되는) 항체(자연적으로 생성되는 대립유전자 변이체를 포함함) 또는 자연적으로 생성되는 서열의 기존 아미노산 서열 변형(예를 들어 다른 삽입, 결실 및/또는 치환)을 가진 항체를 포함할 수 있다. 바람직하게 부모 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
항체 절편. "항체 절편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로는 항원 결합 또는 이의 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 특히 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편; 다이아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 절편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
전통적으로, 절편은 온전한 항체의 단백질분해성 절단을 통해 유래된다(예컨대, 문헌[Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 절편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 절편은 본원에 논의된 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편은 대장균(E. coli)으로부터 직접적으로 회수될 수 있으며 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 절편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 절편의 생성을 위한 다른 기법은 본 명세서에서 상세한 교시 내용이 주어진 숙련된 실시자에게 명백하다. 다른 양태에서, 선택된 항체는 단일-사슬 Fv 절편(scFv)이다. 예를 들어, WO 93/16185를 참조할 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 Fab 절편이 아니다.
이중특이적 항체. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대하여 결합 특이성을 가지는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 CD20의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이러한 항체는 CD20에 결합하고 제2 항원에 추가로 결합할 수 있다. 대안적으로, CD20 결합 팔(arm)은, 표적에 대한 세포 방어 메커니즘에 집중하기 위하여, 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T 세포 수용체 분자(예컨대, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 팔과 조합된다. 이중특이적 항체는 또한 표적에 세포독성제를 국재화하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 세포 마커-결합 팔 및 세포독성제(예컨대, 사포린, 항-인터페론α, 빈카알카로이드, 리신 A 사슬, 메톨라-엑세이트(methola-exate) 또는 방사성 동위언소 합텐)에 결합하는 팔을 가진다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 절편(예컨대, F(ab'): 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]; [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]; [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]; [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]; [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]; [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,81호; 제5,731,168호; 제4,676,980호; 및 제4,676,980호, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; EP 03089 및 US 2009/0048122를 참조할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 조성물 및 방법은 T 세포 수용체의 인간 CD20 및 CD3 엡실론 사슬에 대한 특이성을 가지는 이중특이적 뮤린 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트, 예를 들어 문헌[Daniel et al., Blood, 92:4750-4757 (1998)]에 기술된 이중특이적 항체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD20 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트가 이중특이적일 경우, 항-CD20 항체는 인간 또는 인간화된 것이고, T 세포 상의 인간 CD20 및 에피토프에 대하여 특이성을 가지거나 또는 인간 효과기-세포, 예를 들어 단핵구/대식세포 및/또는 세포 사멸에 영향을 미치는 자연 살생 세포에 결합할 수 있다.
항체 결합 친화도
본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 CD20 및 이의 항원 절편에 결합 친화도를 변경하도록 변형될 수 있다. 결합 특성은 당업계에 알려진 다양한 시험관 내 분석법, 예컨대 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역측정법(RIA), 또는 동역학(예컨대, BIACORE(상표명) 분석법)에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로 낮은 KD를 가지는 결합 분자가 바람직함이 이해된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 항체 절편은 CD20 및 이의 항원 절편에 10-5M 미만, 또는 10-6M 미만, 또는 10-7M 미만, 또는 10-8M 미만, 또는 10-9M 미만, 또는 10-10M 미만, 또는 10-11M 미만, 또는 10-12M 미만, 또는 10-13M 미만의 해리 상수 또는 KD 또는 Kd(koff/kon)로 특이적으로 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 절편은 CD20 및/또는 이의 항원 절편에 1×10-3s-1 미만, 또는 3×10-3s-1 미만의 Koff로 결합한다. 다른 양태에서, 항체는 CD20 및이의 항원 절편에 10-3s-1 미만, 5×10-3s-1 미만, 10-4s-1 미만, 5×10-4s-1 미만, 10-5s-1 미만, 5×10-5s-1 미만, 10-6s-1 미만, 5×10-6s-1 미만, 10-7s-1 미만, 5×10-7s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5×10-8s-1 미만, 10-9s-1 미만, 5×10-9s-1 미만, 또는 10-10s-1 미만의 Koff로 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 절편은 CD20 및/또는 이의 항원 절편에 적어도 105M-1s-1, 적어도 5×105M-1s-1, 적어도 106M-1s-1, 적어도 5×106M-1s-1, 적어도 107M-1s-1, 적어도 5×107M-1s -1, 또는 적어도 108M-1s-1, 또는 적어도 109M-1s-1의 결합도 상수 또는 비율로 결합한다.
당업자는 본 발명의 컨쥬게이트는 본원에 기술된 바와 동일한 특성을 가짐을 이해한다.
항체 pI 및 Tm
본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 등전점(pI)를 변경하도록 변형될 수 있다. 모든 폴리펩티드와 같이 항체는 pI를 가지며, 이는 일반적으로 폴리펩티드가 순전하를 가지지 않는 때의 pH로서 정의된다. 단백질 용해도는 전형적으로 용액의 pH가 단백질의 등전점(pI)와 동일할 때 가장 낮은 것으로 당업계에 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 pI 값은 우세한 전하 형태의 pI로서 정의된다. 단백질의 pI는, 이에 한정되는 것은 아니지만 등전점 전기영동 및 다양한 컴퓨터 알고리즘(예컨대, 문헌[Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis, 14:1023] 참조)을 포함한 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 항체의 Fab 도메인의 열 용융 온도(Tm)는 항체의 열 안정성의 우수한 지표일 수 있으며, 반감기의 표시를 추가로 제공할 수 있다. Tm이 낮을수록 응집이 더 많이 일어나고/안정성이 더 낮음을 나타내는 반면, Tm이 높을수록 응집이 더 적게 일어나고/안정성이 더 높음을 나타낸다. 따라서, 특정 양태에서 더 높은 Tm을 가지는 항체가 바람직하다. 단백질 도메인의 Tm(예컨대, Fab 도메인)은 당업계에 알려진 임의의 표준 방법을 사용하여 예를 들어 시차 열량 주사법(예컨대, 문헌[Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404]; [Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154] 참조)에 의해 측정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 비배타적 양태는 임의의 바람직한 생화학적 특징, 예를 들어 특정한 등전점(pI) 또는 용융 온도(Tm)를 가지는 변형된 항체를 포함한다.
보다 구체적으로, 하나의 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 5.5 내지 9.5 범위의 pI를 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 약 5.5 내지 약 6.0, 또는 약 6.0 내지 약 6.5, 또는 약 6.5 내지 약 7.0, 또는 약 7.0 내지 약 7.5, 또는 약 7.5 내지 약 8.0, 또는 약 8.0 내지 약 8.5, 또는 약 8.5 내지 약 9.0, 또는 약 9.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 가진다. 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 5.5~6.0, 또는 6.0 내지 6.5, 또는 6.5 내지 7.0, 또는 7.0~7.5, 또는 7.5~8.0, 또는 8.0~8.5, 또는 8.5~9.0, 또는 9.0~9.5 범위의 pI를 가진다. 보다 더 구체적으로, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 5.5, 또는 적어도 6.0, 또는 적어도 6.3, 또는 적어도 6.5, 또는 적어도 6.7, 또는 적어도 6.9, 또는 적어도 7.1, 또는 적어도 7.3, 또는 적어도 7.5, 또는 적어도 7.7, 또는 적어도 7.9, 또는 적어도 8.1, 또는 적어도 8.3, 또는 적어도 8.5, 또는 적어도 8.7, 또는 적어도 8.9, 또는 적어도 9.1, 또는 적어도 9.3, 또는 적어도 9.5의 pI를 가진다. 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 약 5.5, 또는 적어도 약 6.0, 또는 적어도 약 6.3, 또는 적어도 약 6.5, 또는 적어도 약 6.7, 또는 적어도 약 6.9, 또는 적어도 약 7.1, 또는 적어도 약 7.3, 또는 적어도 약 7.5, 또는 적어도 약 7.7, 또는 적어도 약 7.9, 또는 적어도 약 8.1, 또는 적어도 약 8.3, 또는 적어도 약 8.5, 또는 적어도 약 8.7, 또는 적어도 약 8.9, 또는 적어도 약 9.1, 또는 적어도 약 9.3, 또는 적어도 약 9.5의 pI를 가진다.
항체에서 이온화가능한 잔기의 수 및 위치를 변경함으로서 용해도를 최적화시켜 pI를 조정할 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드의 pI는 적절한 아미노산을 치환시킴으로써(예컨대, 알라닌과 같은 비하전된 잔기를 리신과 같은 하전된 아미노산으로 치환시킴으로써) 조작될 수 있다. 임의의 특정한 이론에 구속되는 것을 원하는 것은 아니지만, 상기 항체의 pI를 변화시키는 항체의 아미노산 치환은 항체의 용해도 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다. 당업자는 아미노산 치환이 원하는 pI를 획득하기 위하여 특정 항체에 대하여 가장 적절할 것임을 이해할 것이다. 하나의 양태에서, 치환은 본 발명의 항체에서 일어나서 pI를 변경시킨다. FcγR(상기 기술됨)에 대한 결합을 변경시키는 Fc 영역의 치환(들)은 또한 pI에서 변화를 초래할 수 있음이 구체적으로 고려된다. 다른 양태에서, Fc 영역의 치환(들)은 구체적으로 FcγR 결합에서 원하는 변경 및 pI에서 임의의 원하는 변화 둘 다에 영향을 미치도록 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 65℃ 내지 120℃ 범위의 Tm을 가진다. 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 약 75℃ 내지 약 120℃, 또는 약 75℃ 내지 약 85℃, 또는 약 85℃ 내지 약 95℃, 또는 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 105℃ 내지 약 115℃, 또는 약 115℃ 내지 약 120℃ 범위의 Tm을 가진다. 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 75℃ 내지 120℃, 또는 75℃ 내지 85℃, 또는 85℃ 내지 95℃, 또는 95℃ 내지 105℃, 또는 105℃ 내지 115℃, 또는 115℃ 내지 120℃ 범위의 Tm을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 약 65℃, 또는 적어도 약 70℃, 또는 적어도 약 75℃, 또는 적어도 약 80℃, 또는 적어도 약 85℃, 또는 적어도 약 90℃, 또는 적어도 약 95℃, 또는 적어도 약 100℃, 또는 적어도 약 105℃, 또는 적어도 약 110℃, 또는 적어도 약 115℃, 또는 적어도 약 120℃의 Tm을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 65℃, 또는 적어도 70℃, 또는 적어도 75℃, 또는 적어도 80℃, 또는 적어도 85℃, 또는 적어도 90℃, 또는 적어도 95℃, 또는 적어도 100℃, 또는 적어도 105℃, 또는 적어도 110℃, 또는 적어도 115℃, 또는 적어도 120℃의 Tm을 가진다.
조작된 효과기 기능
예를 들어 B 세포 연관 질환, 암, GVHD 또는 거부를 치료하는데 있어서 항체의 유효성을 향상시키기 위하여, 효과기 기능에 대하여 본 발명의 항-CD20 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)은 Fc 영역에 도입될 수 있고, 이에 의하여 이 영역 내 사슬 내 이황화 결합 형성을 허용한다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 살생 및/또는 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)]을 참조할 수 있다. 향상된 활성을 가지는 동종이량체 항체는 또한 문헌[Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 헤테로이작용성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 가지는 항체가 조작될 수 있으며, 이에 의하여 향상된 보체 융해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)]을 참조할 수 있다.
효과기 기능을 변경하기 위하여 항체의 Fc 영역을 조작하는 다른 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 공개 제20040185045호 및 PCT 공개 WO 2004/016750(둘 다 Koenig et al.), 이들은 FCγRIIA에 대한 결합 친화도와 비교하여 FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 향상시키기 위하여 Fc 영역을 변경하는 것을 기술함; 또한, PCT 공개 WO 99/58572(Armour et al.); WO 99/51642(Idusogie et al.); 및 미국 특허 제6,395,272호(Deo et al.); 이들의 개시 내용은 본원에 전체가 포함되어 있음). FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 감소시키기 위하여 Fc 영역을 변형하는 방법이 또한 당업계에 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 공개 20010036459 및 PCT 공개 WO 01/79299(둘 다 Ravetch et al.), 이들의 개시 내용은 본원에 전체가 포함되어 있음). 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 향상된 결합 친화도를 가지는 변이체 Fc 영역을 가지는 변형된 항체가 알려져 있다(예컨대, PCT 공개 WO 2004/063351(Stavenhagen et al.); 이의 개시 내용은 본원에 전체가 포함되어 있음).
당업계에 공지된 시험관 내 분석은 예를 들어 본 발명의 항-CD20 항체, 조성물, 컨쥬게이트 및 방법이 본원에 기술된 것과 같이 ADCC를 매개할 수 있다.
변이체 Fc 영역. 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질의 제형을 제공한다. 이는, 자연적으로 생성되지 않는 영역, 예를 들어 하나 이상의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 또한 본 발명의 변이체 Fc은 아미노산 결실, 추가 및/또는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외하고 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함함이 이해될 것이다. 따라서 Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 지칭한다. IgA 및 IgM에 대하여, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG에 대하여, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3(Cγ2 및 Cγ3) 및 Cγ1(Cγ1) 및 Cγ2(Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계선은 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 카복실-말단에 대한 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되며, 여기에서 번호 붙이기는 문헌[Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)]에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. "Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스"는 상기 Kabat et al.에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호 붙이기를 지칭한다. Fc는 별개로 이러한 영역, 또는 항체, 항체 절편, 또는 Fc 융합 단백질의 내용에서 이러한 영역을 지칭할 수 있다. Fc 변이체 단백질은 항체, Fc 융합, 또는 Fc 영역을 포함하는 임의의 단백질 또는 단백질 도메인일 수 있다. 특히 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질이 바람직하며, 상기 변이체 Fc 영역은 Fc의 자연적으로 생성되지 않는 변이체이다. 다형성은 다수의 Fc 위치에서 관찰되며, 이는 이에 한정되는 것은 아니지만 Kabat 270, 272, 312, 315, 356, 및 358을 포함하고, 따라서 제시된 서열 및 종래 기술에서의 서열들 사이에서 약간의 상이함이 존재할 수 있으며 이는 본원의 교시 내용을 기초로 하여 당업자에게 알려질 것이다.
본 발명은 비슷한 분자(예컨대, 야생형 Fc 영역을 가지는 것을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질)에 대하여 Fc 리간드(예컨대, Fc 수용체 C1q)에 대한 변경된 결합 특성을 가지는 Fc 변이체 단백질을 포함한다. 결합 특성의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만 결합 특이성, 평형 해리 상수(KD), 해리 및 결합도(Koff 및Kon), 결합 친화도 및/또는 결합활성을 포함한다. 일반적으로 낮은 KD를 가지는 결합 분자(예컨대, 항체와 같은 Fc 변이체 단백질)가 높은 KD를 가지는 결합 분자보다 바람직함이 이해된다. 그러나, 일부 경우에서, Kon 또는 Koff의 값은 KD의 값보다 더 관련이 있을 수 있다. 당업자는 어떤 동역학 파라미터가 주어진 항체 적용에 대하여 가장 중요한지를 결정할 수 있다.
리간드에 대한 Fc 도메인의 친화도 및 결합 특성은 Fc-FcγR 상호작용, 즉 FcγR에 대해 Fc 영역의 구체적인 결합을 측정하는 것에 대해 당업계에 알려진 다양한 시험관 내 분석 방법(생화학 또는 면역학에 기초한 분석법), 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 평형 방법(예컨대, 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역측정법(RIA)), 또는 동역학(예컨대, BIACORE(상표명) 분석법), 및 기타 방법 예를 들어 직접 결합 분석법, 경쟁적 억제 분석법, 형광 공명 에너지 전이(FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예컨대, 겔 여과)와 같은 다른 방법, 에 의해 측정될 수 있다.이들 및 기타 방법은 검사될 하나 이상의 성문 상의 표지를 이용할 수 있고/있거나 다양한 검출 방법, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 발색(chromogenic), 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 자세한 기술은 예를 들어 문헌[Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾아볼 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 양성 조절제(예컨대, FcγRIIIA)에 대한 Fc 결합을 향상시키는 반면, 음성 조절제 FcγRIIB에 대한 Fc 결합을 변화시키지 않거나 또는 심지어 이를 감소시키는 변형은 ADCC 활성을 향상시키는데 보다 바람직할 것이다. 대안적으로, 하나 이상의 양성 조절제에 결합을 감소시키고/감소시키거나 FcγRIIB에 대한 결합을 향상시키는 변형은 ADCC 활성을 감소시키는데 바람직할 것이다. 따라서, 결합 친화도의 비율(예컨대, 평형 해리 상수(KD))은 Fc 변이체의 ADCC 활성이 향상 또는 감소되는지를 나타낼 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIA/FcγRIIB 평형 해리 상수(KD) 비율의 감소는 개선된 ADCC 활성과 관계가 있을 것인 반면, 비율의 증가는 ADCC 활성의 감소와 관계가 있을 것이다. 추가적으로, C1q에 대한 결합을 향상시키는 변형은 CDC 활성을 향상시키는데 바람직할 것이지만, C1q에 대한 결합을 감소시키는 변형은 CDC 활성을 감소 또는 제거하는데 바람직할 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 증가된 친화도를 가지는 FcγRIIIA에 결합한다. 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 증가된 친화도를 가지는 FcγRIIIA에 결합하고, 비슷한 분자에 비하여 변하지 않은 결합 친화도를 가지는 FcγRIIB에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 증가된 친화도를 가지는 FcγRIIIA에 결합하고, 비슷한 분자에 비하여 감소된 친화도를 가지는 FcγRIIB에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 감소된 FcγRIIIA/FcγRIIB 평형 해리 상수(KD)의 비율을 가진다.
하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 향상된 결합을 가진다. 다른 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자의 Fc 리단드에 대한 친화도보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 높은 Fc 리간드에 대한 친화도를 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체에 대한 향상된 결합을 가진다. 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 향상된 결합을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체 FcRn에 대한 향상된 결합을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 C1q에 대한 향상된 결합을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 약 2배 내지 약 10배, 또는 약 5배 내지 약 50배, 또는 약 25배 내지 약 250배, 또는 약 100배 내지 약 500배, 또는 약 250배 내지 약 1000배 감소된 평형 해리 상수(KD)를 가진다. 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 2배 내지 10배, 또는 5배 내지 50배, 또는 25배 내지 250배, 또는 100배 내지 500배, 또는 250배 내지 1000배 감소된 평형 해리 상수(KD)를 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 a least 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배, 또는 적어도 400배, 또는 적어도 600배만큼 감소된 FcγRIIIA에 대한 평형 해리 상수(KD)를 가진다.
Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 혈청 반감기를 가진다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예컨대, 자연 살생(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 Ig는 이러한 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 그 뒤에 표적 세포를 세포독소로 살생할 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. 높은-친화도 IgG 항체, 예를 들어 표적 세포의 표면으로 지정되는 IgG 항체는 세포독성 세포로 "무장"하고 이러한 살해를 할 수 있다. 표적 세포의 융해는 세포외이고, 직접적인 세포-대-세포 접촉을 필요로 하며, 보체를 수반하지 않는다. 항체에 더하여, 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 가지는 Fc 영역을 포함하는 다른 단백질, 구체적으로 Fc 융합 단백질은 세포-매개 세포독성에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 단순화를 위하여 Fc 융합 단백질의 활성에 의한 세포-매개 세포독성도 또한 본원에서 ADCC 활성으로 불린다.
ADCC에 의해 표적 세포의 융해를 매개하는 임의의 특정 Fc 변이체 단백질의 능력이 분석될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위하여 관심의 Fc 변이체 단백질은 면역 효과기 세포와 조합하여 표적 세포에 첨가되고, 이는 표적 세포의 세포융해를 초래하는 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있다. 세포융해는 일반적으로 융해된 세포로부터의 표지(예컨대, 방사성 기질, 형광 염료 또는 자연적 세포 내 단백질)의 방출에 의해 검출된다. 이러한 분석법에 유용한 효과기 세포는 말초 혈책 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살생(NK) 세포를 포함한다. 세포 내 ADCC 분석법의 구체적인 예는 문헌[Wisecarver et al., 1985, 79:277-282; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med, 166:1351-1361]; [Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods, 258:183-191]; 및 [Patel et al., 1995, J Immunol Methods, 184:29-38]에 기술되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심의 Fc 변이체 단백질의 ADCC 활성은 예컨대 문헌[Clynes et al., 1998, PNAS USA, 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체 내 평가될 수 있다.
하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성을 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자의 ADCC 활성보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 높은 ADCC 활성을 가진다. 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대하여 향상된 결합을 가지고 비슷한 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성을 가진다. 다른 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성 및 향상된 혈청 반감기를 가진다.
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 융해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 제1 성분(C1q)의 분자, 예를 들어 동족 항원과 복합체화된 항체에의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예컨대 문헌[Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163]에 기술된 바와 같은 CDC 분석이 실행될 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 CDC 활성을 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자의 CDC 활성보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 높은 CDC 활성을 가진다. 다른 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 CDC 활성 및 향상된 혈청 반감기를 가진다.
하나의 양태에서, 본 발명은 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 234, 235, 236, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333 및 334로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 선택적으로, Fc 영역은 당업자에게 알려지거나(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공개 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 및 WO 05/040217) 또는 본원에 개시된 바와 같은 첨가 및/또는 대안적인 위치에서 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
구체적인 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247V, 247G, 252Y, 254T, 256E, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 269H, 269Y, 269F, 269R, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 313F, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 및 332A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 선택적으로 Fc 영역은 당업자에게 알려진(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공개 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 및 WO 05/040217 참조) 추가적 및/또는 대안적인 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 239, 330 및 332로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 적어도 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 포함한다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 252, 254 및 256로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 추가적인 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 포함하고, 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 252Y, 254T 및 256E로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 예시적인 Fc 변이체를 개시하는 문헌[Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15:637-40]; [Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564]; [Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657-2662]; [Lund et al, 1992, Mol. Immunol., 29:53-59]; [Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543]; [Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA, 92:11980-11984]; [Jefferis et al, 1995, Immunol Lett., 44:111-117]; [Lund et al., 1995, Faseb J., 9:115-119]; [Jefferis et al, 1996, Immunol Lett., 54:101-104]; [Lund et al, 1996, J. Immunol., 157:4963-4969]; [Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624]; [Idusogie et al, 2000, J. Immunol., 164:4178-4184]; [Reddy et al, 2000, J. Immunol., 164:1925-1933]; [Xu et al., 2000, Cell Immunol., 200:16-26]; [Idusogie et al, 2001, J. Immunol., 166:2571-2575]; [Shields et al., 2001, J Biol. Chem., 276:6591-6604]; [Jefferis et al, 2002, Immunol Lett., 82:57-65]; [Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans., 30:487-490]; 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; 및 WO 04/063351에 개시된 것과 같은 다른 공지된 Fc 변이체와 조합될 수 있다.
자연적으로 생성되지 않는 Fc 영역을 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 결실은 돌연변이유발 방법, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 위치-지정 돌연변이유발(예컨대, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985)), PCR 돌연변이유발(예컨대, Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), 및 카세트 돌연변이유발(예컨대, Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985))에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 위치-지정 돌연변이유발은 중복-신장 PCR 방법(예컨대, Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989))에 의해 실행된다. 대안적으로, 중복-신장 PCR의 기법(예컨대, 상기한 Higuchi)은 표적 서열(출발 DNA)로 임의의 원하는 돌연변이(들)를 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중복-신장 방법에서 PCR의 제1 라운드는 외부 프라이머(프라이머 1) 및 내부 돌연변이유발 프라이머(프라이머 3)을 이용하여, 그리고 별개로 제2 외부 프라이머(프라이머 4) 및 내부 프라이머(프라이머 2)를 이용하여 표적 서열을 증폭시켜 2개의 PCR 분절(분절 A 및 B)을 생성하는 단계를 수반한다. 내부 돌연변이유발 프라이머(프라이머 3)는 원하는 돌연변이(들)를 특화시키는 표적 서열에 대한 미스매치(mismatch)를 포함하도록 설계된다. PCR의 제2 라운드에서, PCR의 제1 라운드의 생성물(분절 A 및 B)은 2개의 외부 프라이머(프라이머 1 및 4)를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 전장 PCR 분절(분절 C)은 제한 효소를 이용하여 절단되고, 생성된 제한 절편은 적절한 벡터로 클로닝된다. 돌연변이유발의 제1 단계로서, 출발 DNA(예컨대, Fc 융합 단백질, 항체 또는 간단히 Fc 영역을 암호화함)는 돌연변이유발 벡터로 작동가능하게 클로닝된다. 프라이머는 원하는 아미노산 치환을 반영하도록 설계된다. 변이체 Fc 영역의 생성에 유용한 기타 예시적인 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375; 5,869,046; 6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351, 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있음).
일부 양태에서, Fc 변이체 단백질은 하나 이상의 조작된 글리코폼(glycoform), 즉 Fc 영역을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 탄수화물 조성무을 포함한다. 조작된 글리코폼은 다양한 목적, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 효과기 기능을 향상 또는 감소시키는 것에 유용할 수 있다. 조작된 글리코폼은 본원에 개시된 방법 및 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여, 예를 들어 조작되거나 또는 변이체 발현 종류를 사용함으로써, 글리코실화에 영향을 미치는 성장 조건 또는 배지를 사용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III(GnTI11)와 공동 발현에 의하여, 다양한 유기체 또는 다양한 유기에 유래의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현함으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 조작된 글리코폼을 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만 문헌[Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17:176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng., 74:288-294]; [Shields et al., 2002, J Biol. Chem., 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol. Chem., 278:3466-3473]; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 출원 일련번호 제10/277,370호; 미국 출원 일련 번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1에 기술된 것; Potillegent(상표명) 기술(Biowa, Inc., 미국 뉴저지주 프린스턴 소재); GlycoMAb(상표명) 글리코실화 조작 기술(GLYCART(상표명) biotechnology AG, 스위스 취리히 소재)을 포함한다. 또한 예컨대 WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; 문헌[Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]을 참조할 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 CD20에 결합할 수 있고 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 염격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 6x SSC, 0.5% SDS, 5x 덴하르트 용액, 및 100 ㎎ / ㎖ 열 변성 연어 정자 DNA에서 2시간 동안 60℃에서 예비혼성화; 18시간 동안 60℃에서 혼성화; 4x SSC, 0.5% SDS, 0.1% 파이로인산나트륨에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척하고, 2x SSC, 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척.
당업계에 공지된 방법으로 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다면, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(예컨대, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기술된 바와 같음)로부터 집합될 수 있으며, 이는 간단하게 항체를 암호화하는 서열의 일부분을 포함하는 중복되는 올리고뉴클레오티드의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 그 다음 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 수반한다.
항체를 암호화라는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 재조합 벡터의 조립 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 가변 도메인의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들 중 임의의 것의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.
재조합 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 그 다음 형질감염된 세포는 종래의 기법에 의해 배양되어 본 발명의 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 비상동 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체, 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 바람작한 양태에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 암호화하는 벡터는 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 발현하는데 이용될 수 있다, 이러한 숙주-발현 시스템은 관심의 암호화 서열이 생성되고 그 후 정제될 수 있게 하는 비히클을 나타내고, 또한 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질변환 또는 형질감염될 때 동일계 내에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 이에 한정되는 것은 아니지만 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질변환된 미생물, 예를 들어 박테리아(예컨대, 대장균 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질변환된 효모(예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 피키아(Pichia)); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질변환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구조체가 숨어있는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함한다.
특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위하여 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스 유래의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 요소(major intermediate early gene promoter element)와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포가 항체에 대하여 효과적인 발현 시스템이다(예를 들어 문헌[Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2]에 개시된 바와 같음).
재조합 단백질의 장기간 동안 고수율 생산을 위하여 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 전자 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적인 마커에 의해 제어된 DNA로 형질변환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 강화 배지에서 1~2일 동안 성장시킬 수 있으며, 그 다음 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 중 선택적인 마커는 선별에 대한 저항성을 제공하고, 세포가 플라스미드를 크로모좀으로 안정적으로 통합시킬 수 있게 하며, 성장하여 차례로 세포주로 클로닝되고 확장될 수 있는 중심을 형성한다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제에 대하여 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 뒤의 특이적인 항원에 대한 친화도에 의한 크로마토그래피, 및 분립(sizing) 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도(differential solubility), 또는 단백질의 정제에 대하여 임의의 기타 표준 기법에 의하여 정제될 수 있다. 이와 관련하여, 미국 특허 제7,538,195호는 본 개시 내용에 언급되어 있으며, 이의 교시 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
다른 양태에서, 다양한 항체 및 항체 절편뿐만 아니라 항체 모방체는 특정 세트의 CDR 옆에 위치하는 가변 및 불변 영역 서열 내에서 돌연변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 Ab의 상이한 부류가 상이한 중쇄의 치환에 의해 주어진 세트의 CDR에 대하여 가능하며, 이것에 의하여, 예를 들어 IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE 항체 유형 및 아이소타입이 생성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범주 내에 속하는 인공적인 항체는 전체적 합성 골격 내에 주어진 세트의 CDR 내에 삽입함으로써 생성될 수 있다. 용어 "가변"은 본원에서 항체 사이의 서열에서 상이한 가변 도메인의 특정 부분을 기술하는데 사용되며, 항원에 대하여 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성은 보통 항체의 가변 도메인을 통해 고르게 분포된다. 전형적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3가지 분절 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다의 초가변 영역에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분은 골격(FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 CDR에 연결된 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 골격 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에서는 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들어, 문헌[E. A. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, 1991, NIH] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합함에 있어서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
인간화 항체, 또는 다른 포유동물에 의한 비거부에 대해 적응된 항체는 몇몇 기술, 예를 들어 재표면화 및 CDR 그래프팅을 사용하여 생성될 수 있다. 재표면화 기술에서, 분자 모델링, 통계적 분석 및 돌연변이유발은 표적 숙주의 공지된 항체의 표면과 유사한 가변 영역의 비-CDR 표면을 조정하도록 결합된다. 항체의 재표면화 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내 항체의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,639,641호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. CDR 그래프팅 기술에서, 뮤린 중쇄 및 경쇄 CDR은 완전 인간 골격 서열로 그래프팅된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 항체의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물은 항체의 결합 특징과 비슷한 결합 특징을 가지며, 예를 들어 키메라, 인간화 및 단일 사슬 항체뿐만 아니라 이의 절편을 포함한다. 이러한 기능적 동등물을 생성하는 예시적인 방법은 PCT 출원 WO 93/21319, 유럽 특허 출원 제239,400호; PCT 출원 WO 89/09622; 유럽 특허 출원 338,745; 및 유럽 특허 출원 EP　332,424에 개시되어 있으며, 이들은 각각 전체가 참조로 포함되어 있다.
기능적 동등물은 본 발명의 항체의 가변 또는 초가변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 서열에 적용되는 "실질적으로 동일한"은, 문헌[Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따라서 FASTA 검색 방법에 의하여 측정된 바와 같이, 다른 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 서열 동일성을 가지는 서열로서 본원에서 정의된다.
키메라 항체는 바람직하게 인간 항체 불변 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 불변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터의 가변 영역의 서열로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 가변 영역을 가진다. 항체의 인간화 형태는, 예컨대 PCT 공개 제WO92/22653호에서와 같이, 인간 골격 도메인으로, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역을 치환함으로써 제조된다. 인간화 항체는 바람직하게 상응하는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 상보성 결정 영역(CDR) 이외에 불변 영역 및 가변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 CDR을 가진다.
또한 기능적 동등물은, 또한 단일-사슬 항체(scFv)로 알려진, 단일-사슬 항체 절편을 포함한다. 이러한 절편은, 하나 이상의 상호 연결 링커를 이용하여 또는 이용하지 않고 항체 가변 경쇄 서열(VL)의 적어도 하나의 절편에 묶인 항체 가변 중쇄 아미노산 서열(VH)의 적어도 하나의 절편을 포함한다. 일단 단일-사슬 항체 절편이 유래하는 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성을 유지하기 위하여 연결된다면, 이러한 링커는 (VL) 및 (VH) 도메인의 적절한 3차원 접힘이 일어나는 것을 확실히 하도록 선택되는 짧고 유연한 펩티드일 수 있다. 일반적으로, (VL) 또는 (VH) 서열의 카복실 말단은 상보적인 (VL) 및 (VH) 서열의 아미노산 말단에 이러한 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 단일-사슬 항체 절편은 분자 클로닝, 항체 파지 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 기법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단백질은 진핵 세포 또는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아에서 생성될 수 있다.
단일-사슬 항체 절편은 본 명세서에 기술된 온전한 항체의 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 하나를 가지는 아미노산 서열을 포함하지만, 이러한 항체의 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결핍되어 있다. 이러한 불변 도메인은 항원 결합을 위하여 필요하지 않지만, 온전한 항체의 구조의 주요 부분을 구성한다. 그러므로 단일-사슬 항체 절편은 불변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체의 사용과 연관된 문제점의 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일-사슬 항체 절편은 생물학적 분자와 중쇄 불변 영역, 또는 다른 원치 않는 생물학적 활성 사이의 원하지 않는 상호작용에서 자유로운 경향이 있다. 추가적으로, 단일-사슬 항체 절편은 온전한 또는 전체 항체보다 상당히 더 작고, 따라서 온전한 항체보다 더 높은 모세혈관 투과성을 가져서, 단일-사슬 항체 절편이 표적 항원-결합 부위에 보다 효과적으로 국재화되고 이에 결합될 수 있게 할 수 있다. 또한, 항체 절편은 원핵 세포에서 비교적 대규모로 생성될 수 있으며, 따라서 이의 생성을 용이하게 한다. 또한, 단일-사슬 항체 절편의 비교적 작은 크기는 이 절편이 온전한 항체보다 수용체에서 면역 반응을 자극할 가능성이 더 낮게 한다.
본원에 기술되어 있는 항-CD20 항체 및 이의 재표면화 또는 인간화 변이체에 대한 아미노산 및 핵산 서열의 지식은, 또한 인간 CD20에 결합하는 많은 항체를 개발하는데 사용될 수 있다. 몇몇 연구는, 1차 항체 서열의 지식을 기초로 하여, 결합 및 발현 수준과 같은 특성에 대하여 항체의 서열 중 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변화를 도입한 효과를 조사하였다(예컨대, 문헌[Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol . Biol ., 254, 392-403]; [Rader, C. et al., 1998, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 95, 8910-8915]; [Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539]).
이들 연구에서, 1차 항체의 변이체는, 올리고뉴클레오티드-매개 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR, DNA 셔플링(DNA shuffling)과 같은 방법, 또는 E. coli의 돌연변이 유발 유전자-균주를 사용하여, CDR1, CDR2, CDR3, 또는 골격 영역에서 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 생성되었다(Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in " Phage Display of Peptides and Proteins ", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). 1차 항체의 서열을 변화시키는 이러한 방법은 2차 항체의 친화도를 개선시켰다(예컨대, Gram, H. et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97, 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol . Biol ., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol . Chem ., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol . Chem ., 276, 27622-27628).
내용이 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는 특허 출원 공개 20090246195에 기술된 방법과 같은, 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시키는 유사한 지정된 전략에 의하여, 본 발명에 기술된 항체 서열은 개선된 기능을 가지는 항-CD20 항체를 개발하는데 사용될 수 있다.
면역컨쥬게이트
본 발명은 또한 약물 또는 전구약물에 연결 또는 컨쥬게이트되는, 본원에 개시된 바와 같은 항-CD20 항체, 항체 절편, 기능적 동등물, 개선된 항체 및 이들의 양태를 포함하는, 컨쥬게이트(또한 본원에서 면역컨쥬게이트로도 불림)에 관한 것이다. 적절한 약물 또는 전구약물은 당업계에 알려져 있다. 바람직한 약물 또는 전구약물은 세포독성제이다. 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에 사용되는 세포독성제는 세포의 사멸을 초래하거나, 또는 세포 사멸을 유도하거나, 또는 일부 방식에서 세포 생존력을 감소시키는 임의의 화합물일 수 있고, 예를 들어 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카마이신 및 듀오카마이신 유사체, 에네딘, 예를 들어 칼리키아마이신, 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴, 토메이마이신 유도체 및 렙토마이신 유도체, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈플라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 몰폴리노 독소루비신을 포함한다. 보다 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁산, CC-1065 및 CC-1065 유사체이다. 특히 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체가 바람직하며, 이들 중 다수는 미국 특허 공개 제20070048314호, 제20060233814호, 제 20080003652호, 제20060155110호, 제20060128970호, 제20090182038호, 제20090042837호, 제20080233618호, 제20080119558호, 제20060099235호, 제20050272727호, 제20050203174호, 제20050112726호, 제20060182750호, 제20090202536호, 제20090142361호, 제20080249085호, 제20080226659호, 제20080171865호, 제20080171856호, 제20080171040호, 제20080145374호, 제20080114153호, 제20070270585호, 제20070269447호, 제20070264266호, 제20070009541호, 제20070009540호, 제20070009539호, 제20060167245호, 제20060127407호, 제20060084141호, 제20050276812호, 제20050169933호, 제20050152913호, 제20050113571호, 제20050003513호, 제20040241174호, 제20040235840호, 제20040120949호, 제20040014980호, 제20030157694호, 제20020156318호, 제20020156274호, 제20020001587호에 기술되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
이러한 컨쥬게이트는 항체 또는 기능적 동등물에 약물 또는 전구악물을 연결하기 위하여 연결 기를 사용함으로써 제조될 수 있다. 적당한 연결 기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기를 포함한다.
약물 또는 전구약물은, 예를 들어 이황화 결합을 통하여 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결될 수 있다. 링커 분자 또는 가교제는 항-CD20 항체 또는 그의 절편과 반응할 수 있는 반응성 화학적 기를 포함한다. 세포-결합제와의 반응을 위한 바람직한 반응성 화학적 기는 N-석신이미딜 에스터 및 N-설포석신이미딜 에스터이다. 추가적으로, 링커 분자는 반응성 화학적 기, 바람직하게는 약물과 반응하여 이황화 결합을 형성할 수 있는 다이티오피리딜 기를 포함한다. 특히 바람직한 링커 분자는, 공지된 방법을 사용하는, 예를 들어 N-석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP)(예컨대, 문헌[Carlsson et al., Biochem . J., 173: 723-737 (1978)] 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트(SPDB)(예컨대, 미국 특허 제4,563,304호 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)2-설포뷰타노에이트(설포-SPDB)(미국 공개 제20090274713호 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오) 펜타노에이트(SPP)(예컨대, CAS 등록 번호 341498-08-6 참조), 2-이미노티올란, 또는 아세틸석시닉 무수물 및 다른 반응성 가교제, 예를 들어 미국 특허 제6,913,748호(이는 본원에 전체가 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,563,304호; 문헌[Carlsson et al, Biochem. J., 173:723-737 (1978)]; [Blattler et al, Biochem., 24:1517-1524 (1985)]; [Lambert et al, Biochem., 22:3913-3920 (1983)]; [Klotz et al, Arch. Biochem. Biophys., 96:605 (1962)]; 및 [Liu et al, Biochem., 18:690 (1979)], [Blakey 및 Thorpe, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1:1-16 (1988)]; [Worrell et al, Anti-Cancer Drug Design, 1:179-184 (1986)]을 참조하며, 이의 개시 내용은 참조로 본원에 전체가 포함되어 있다. 예를 들어, 항체 또는 세포 결합제는 가교 시약을 이용하여 변형될 수 있으며, 그 다음 이렇게 유래한 유리 또는 보호된 티올 기를 포함하는 항체 또는 세포 결합제는 이황화- 또는 티올-포함 메이탄시노이드와 반응하여 컨쥬게이트를 생성한다. 컨쥬게이트는 크로마토그래피, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 HPLC, 크기-배제, 흡착, 이온 교환 및 친화도 포획, 투석 또는 접선 흐름 여과에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 항-CD20 항체는 면역컨쥬게이트의 효력, 용해도 또는 효능을 향상시키는데 있어서 이황화 결합 및 폴리에틸렌 글리콜 스페이서를 통하여 세포독성 약물에 연결된다. 이러한 절단성 친수성 링커는 WO2009/0134976에 기술되어 있다. 이러한 링커 설계의 추가적인 이익은 항체-약물 컨쥬게이트의 원하는 높은 단량체 비율 및 최소한의 응집이다. 구체적으로 이러한 양태에서 세포-결합제의 컨쥬게이트가 고려되며, 암 세포에 대하여 비교적 높은 강력한 생물학적 활성을 보이고, 높은 컨쥬게이션 수율 및 최소한의 단백질 응집이 있는 높은 단량체 비율의 원하는 생화학적 특성을 가지는 2~8의 좁은 범위의 약물 부하를 가지는 폴리에틸렌 글리콜 스페이서((CH2CH2O)n=1-14)를 가지는 이황화 기(-S-S-)를 통하여 연결된 약물이 기술된다.
구체적으로 이러한 양태에서 화학식 I의 항-CD20 항체 약물 컨쥬게이트 또는 화학식 I'의 컨쥬게이트가 고려되며:
[화학식 I]
CB-[Xl-(-CH2-CH2O-)n-Y-D]m
[화학식 I']
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-Xl]m-CB
여기에서,
CB는 항-CD2- 항체 또는 절편을 나타내고;
D는 약물을 나타내며;
X는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 또는 에테르 결합을 통하여 세포-결합제에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;
Y는 이황화 결합을 통하여 약물에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내며;
l은 0 또는 1이고;
m은 2 내지 8이 정수이며;
n은 1 내지 24의 정수이다.
보다 바람직하게는, m은 2 내지 6의 정수이다.
또한, 훨씬 더 바람직하게는, m은 3 내지 5의 정수이다.
또한, 보다 바람직하게는, n은 2 내지 8의 정수이다. 대안적으로, 예를 들어 미국 특허 제6,441,163호 및 제7,368,565호에 개시된 바와 같이, 약물은 우선 변형되어 세포-결합제와 반응하기에 적당한 반응성 에스터를 도입할 수 있다. 세포-결합제와 활성화된 링커 모이어티를 포함하는 이들 약물의 반응은 세포-결합제 약물 컨쥬게이트를 생성하는 다른 방법을 제공한다. 메이탄시노이드는 또한 예를 들어 미국 특허 제6,716,821호에 제시된 바와 같은 PEG 연결 기를 사용하여 항-CD20 항체 또는 절편에 연결될 수 있다. 이러한 PEG-비절단성 연결 기는 물 및 비수성 용매 모두에서 용해하고, 세포 결합제에 하나 이상의 세포독성제를 연결하는데 사용될 수 있다. 예시적인 PEG 연결기는 한쪽 말단에서 기능적 설파이드릴 또는 이황화 기, 그리고 다른 말단에서 활성 에스터를 통하여 링커의 반대 말단에서 세포독성제 및 세포 결합제와 반응하는 헤테로이작용성 PEG 링커를 포함한다. PEG 연결 기를 사용하여 세포독성 컨쥬게이트의 합성의 일반적인 예로서, 다시 미국 특허 제6,716,821호가 언급되며, 이는 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 합성은 세포-결합제와 반응성 PEG 모이어티를 가지는 하나 이상의 세포독성제의 반응으로 시작하며, 이는 세포 결합제의 아미노산 잔기에 의해 각각의 반응성 PEG 모이어티의 말단 활성 에스터의 변위를 초래하여, PEG 연결 기를 통하여 세포 결합제에 공유 결합된 하나 이상의 세포독성제를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트를 생성한다. 대안적으로, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 반응성 이황화 모이어티(예를 들어 피리딜다이설파이드)를 도입할 수 있으며, 그 다음이는 티올-포함 메이탄시노이드로 처리되어 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 다른 방법에서, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 티올 모이어티를 도입할 수 있고, 그 다음 이는 반응성 이황화-포함 메이탄시노이드(예를 들어 피리딜다이설파이드)로 처리되어 컨쥬게이트를 생성한다.
비절단성 링커를 가지는 항체-약물 컨쥬게이트는 또한 제조될 수 있다. 이러한 가교제는 당업계에 기술되어 있고(예컨대, 문헌[ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook] 및 미국 공개 제20050169933호 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함되어 있음), 이에 한정되는 것은 아니지만 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)를 포함하며, 이는 SMCC(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), β-말레이미도프로판산 N-석신이미딜 에스터(BMPS), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소시아네이트(PMPI), N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)의 "장쇄" 유사체이다. 바람직하게는, 항체는 문헌에 기술된 바와 같이, 가교 시약, 예를 들어 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 설포-SMCC, 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), 설포-MBS 또는 석신이미딜-아이오도아세테이트로 변형되어 1~10개의 반응성 기를 도입한다(Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); 및 Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)). 그 다음 변형된 항체는 티올-포함 메이탄시노이드 유도체로 반응하여 컨쥬게이트를 생성한다. 컨쥬게이트는 Sephadex G25 칼럼을 통해 겔 여과에 의해 또는 투석에 의해 또는 접선 흐름 여과에 의해 정제될 수 있다. 변형된 항체는 티올-포함 메이탄시노이드(1 내지 2몰 당량/말레이미도 기)로 처리되고, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 Sephadex G-25 칼럼을 통해 겔 여과, 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼, 투석 또는 접선 흐름 여과 또는 이의 방법의 조합에 의해 정제된다. 전형적으로, 평균 항체 당 1~10개의 메이탄시노이드가 연결된다. 바람직한 방법은 항체를 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)로 변형시켜 말레이미도 기를 도입한 다음, 변형된 항체를 티올-포함 메이탄시노이드와 반응시켜 티오에테르-연결된 컨쥬게이트를 제공하는 것이다. 다시 항체 분자 당 1 내지 10개의 약물 분자를 가지는 컨쥬게이트가 생성된다. 항체, 항체 절편, 단백질 호르몬, 단백질 호르몬, 단백질 성장 인자 및 다른 단백질의 메이탄시노이드 컨쥬게이트가 동일한 방식으로 제조된다.
본 발명의 다른 양태에서, CD20 항체는 PEG 스페이서의 중개를 통하여 비절단성 결합을 통해 약물에 연결된다. 약물과 항-CD20 항체 또는 절편 사이의 링커를 형성하는 친수성 PEG 사슬을 포함하는 적당한 가교 시약은 또한 당업계에 잘 알려져 있거나, 또는 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, Quanta Biodesign, 미국 오하이오주 파월 소재). 적당한 PEG-포함 가교제는 또한 당업자에게 알려진 표준 합성 화학 기법을 사용하여 상업적으로 입수가능한 PEG 그 자체로부터 합성될 수 있다. 약물은, 미국 특허 공개 20090274713 및 WO2009/0134976에 상세하게 기술된 방법에 의해, 이작용성 PEG-포함 가교제와 반응하여 화학식 Z -Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D의 화합물을 제공할 수 있으며, 그 다음 이는 세포 결합제와 반응하여 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 대안적으로, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 티올-반응성 기(예를 들어 말레이미드 또는 할로아세트아마이드)를 도입할 수 있으며, 이는 그 다음 티올-포함 메이탄시노이드로 처리되어 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 다른 방법에서, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 티올 모이어티를 도입할 수 있고, 이는 그 다음 티올-반응성 메이탄시노이드(예를 들어, 말레이미드 또는 할로아세트아마이드를 가지는 메이탄시노이드)로 처리되어 컨쥬게이트를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 화학식 II 또는 화학식 II'의 항-CD20 항체 약물 컨쥬게이트이며;
[화학식 II]
CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m
[화학식 II']
[D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB
여기에서, CB는 항-CD20 항체 또는 절편을 나타내고;
D는 약물을 나타내며;
X는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 또는 에테르 결합을 통하여 세포-결합제에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;
Y는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 에테르 결합, 아민 결합, 탄소-탄소 결합 및 하이드라존 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유 결합을 통하여 약물에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내며;
l은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이며;
m은 2 내지 15의 정수이고;
n은 1 내지 2000의 정수이다.
바람직하게는, m은 2 내지 8의 정수이고;
바람직하게 n은 1 내지 24의 정수이다.
보다 바람직하게는, m은 2 내지 6의 정수이다.
또한, 훨씬 더 바람직하게는, m은 3 내지 5의 정수이다.
또한, 보다 바람직하게는, n은 2 내지 8의 정수이다. 적당한 PEG-포함 링커의 예는 항-CD20 항체 또는 그의 절편과의 반응을 위한 N-석신이미딜 에스터 또는 N-설포석신이미딜 에스터 모이어티뿐만 아니라 상기 화합물과의 반응을 위한 말레이미도계 또는 할로아세틸계 모이어티를 가지는 링커를 포함한다. PEG 스페이서는 본원에 기술된 방법에 의해 당업계에 알려진 임의의 가교제로 혼입될 수 있다. PEG 스페이서와 혼입될 수 있는 말레이미도계 모이어티를 포함하는 가교 시약은 이에 한정되는 것은 아니지만 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복시레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)를 포함하며, 이는 SMCC(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소시아네이트(PMPI)의 "장쇄" 유사체이다. 할로아세틸계 모이어티를 포함하는 가교 시약은 N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)를 포함한다.
황 원자가 없는 다른 가교 시약이 또한 사용될 수 있다. 이러한 링커는 다이카복실산계 모이어티로부터 유래할 수 있다. 적당한 다이카복실산계 모이어티는 이에 한정되는 것은 아니지만 하기에 나타낸 일반식의 α,ω-다이카복실산을 포함하며:
HOOC - A' p - E' q -( CH 2 CH 2 O ) n G' r - COOH
여기에서 A'는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 선택적인 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 또는 알카인일 기이고, E'는 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선택적인 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐 기이며, G'는 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선택적인 치환 또는 비치환 방향족 기이거나, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 기이되, 여기에서 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택되고, p, q 및 r은 각각 0 또는 1이며, p, q 및 r이 동시에 모두 0이 아니라면 n은 1 내지 2000의 정수이다.
본원에 개시된 많은 링커가 미국 특허 공개 제20050169933호 및 제20090274713호, 및 WO2009/0134976에 상세히 기술되어 있으며, 이들의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 또한 하전된 링커를 제공하며, 여기에서 항-CD20 항체 또는 그의 절편의 변형 후에 그리고 생성된 약물 컨쥬게이트에서 모두 전하가 유지된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항-CD20 항체에 약물을 연결하는 하전된 링커의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 하전된 링커는 세포-결합제를 변형하고 이를 약물에 연결하는데 사용된다. 본 발명의 다른 양태에서, 하전된 링커는 약물을 변형하고 이를 항-CD20 항체 또는 절편에 연결하는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 하전된 링커는 동시에 약물 및 세포-결합제를 연결하는데 사용된다. 모든 경우에서, 바람직한 최종 결과는 약물-하전된 링커-세포 결합제 컨쥬게이트이고, 이는 화학식 CB-(-Lc-D)q로 표현될 수 있으며, 여기에서 CB는 항-CD20 항체 또는 그의 절편인 세포-결합제이고, Lc는 하전된 링커이며, D는 약물 분자이고, q는 1 내지 20의 정수이다. 세포 결합제-약물 컨쥬게이트 중 링커에서 하전된 기(들)의 존재는 몇몇 이점, 예를 들어 i) 최종 생성물의 더 큰 수용성, ii) 수용액 중 더 높은 농도에서 작용하는 능력, iii) 세포-결합제의 분자 당 더 많은 약물 분자를 연결하여 더 높은 효력을 생성하는 능력, iv) 표적 세포 내부에 유지되어 더 높은 효력을 생성하는 하전된 컨쥬게이트 종에 대한 잠재력, 및 v) 세포로부터 하전된 약물 종을 배출할 수 없을 것인 다중약물 내성 세포의 개선된 민감도를 제공한다. 본 발명은 또한 링커를 기술하며, 이는 약물과 세포 결합제에 연결되어 세포에서 대사 작용을 할 수 있는 컨쥬게이트를 제공하여 하나 이상의 하전된 모이어티를 포함하는 약물 대사산물을 생성할 수 있다. 이러한 링커는 미리-하전된 링커로 불릴 것이다. 세포 가공 후 하전될 링커의 모이어티는 미리-하전된 모이어티로 불릴 것이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 하전된 또는 미리-하전된 가교제는 화학식 III으로 표현되며, 여기에서 Y'는 세포-결합제와 반응할 수 있고 Q는 세포독성 약물과 반응할 수 있으며:
[화학식 III]
Figure pct00001
식 중,
Y'는 항-CD20 항체 또는 그의 절편과 반응할 수 있게 하는 기능성 기를 나타내고;
Q는 이황화, 티오에테르, 티오에스터, 펩티드, 하이드라존, 에테르, 에스터, 카바메이트 또는 아마이드 결합을 통하여 세포독성 약물의 결합을 가능하게 하는 기능성 기를 나타내며;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일 또는 상이하고, H, 1~6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 2 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 도는 고리형 알케닐 또는 알카인일, 음이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 SO3 -, X-SO3 -, OPO3 2 -, X-OPO3 2-, PO3 2 -, X-PO3 2 -, CO2 -, 양이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 질소 포함 헤테로사이클, N+R11R12R13 또는 X-N+R11R12R13, 또는 페닐이며, 여기에서
R11, R12 및 R13은 동일 또는 상이하고, H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬이며, X는 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬을 나타내고;
l, m 및 n은 0 또는 1 내지 4의 정수이며;
A는 페닐 또는 치환된 페닐이고, 여기에서 치환기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 또는 음이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 SO3 -, X-SO3 -, OPO3 2 -, X-OPO3 2-, PO3 2 -, X-PO3 2 -, CO2 -, 및 양이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 질소 포함 헤테로사이클, N+R11R12R13 또는 X-N+R11R12R13으로부터 선택된 하전된 치환기이며, 여기에서 X는 상기한 바와 동일한 정의를 가지고, g는 0 또는 1이며;
Z는 화학식 (OCH2CH2)p,의 선택적인 폴리에틸렌옥시 단위이고, 여기에서 p는 0 또는 2 내지 약 1000의 정수이거나, 또는 F1-E1-P-E2-F2이며, 여기에서 E1 및 E2는 동일 또는 상이하고, C=O, O 또는 NR14이며, 여기에서 R14는 H, 1~6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 2 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 괴형 알케닐 또는 알카인일이고; P는 2 내지 20개 아미노산 길이의 펩티드이며, 여기에서 E1 또는 E2는 말단 질소, 말단 탄소 또는 펩티드의 아미노산 중 하나의 측쇄를 통하여 펩티드에 연결될 수 있고; F1 및 F2는 동일 또는 상이하며, 화학식 (OCH2CH2)p의 선택적인 폴리에틸렌옥시 단위이되, 여기에서 p는 0 또는 2 내지 약 1000의 정수이고, Z가 F1-E1-P-E2-F2가 아니라면 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10의 적어도 하나는 하전된 치환기이거나 또는 g가 1일 때 A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10이 적어도 하나는 하전된 치환기이다. 이는 하전된 링커를 가지는 컨쥬게이트의 하나의 예시적인 실시형태이다. 다른 예는 2009-0274713으로서 공개된 미국 특허 출원 제12/433,604호(Ravi, et al.)에 기술되어 있으며, 이의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 적당한 하전된 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 공개 제20090274713호에 기술된 것을 포함하고, 이의 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 약 2 내지 약 8개의 약물 분자("약물 부하"), 예를 들어 메이탄시노이드는 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결되는 양태를 포함하며, 컨쥬게이트의 항종양 효과는 동일한 세포 결합제에 연결된 약물의 더 낮은 또는 더 높은 약물 부하와 비교하여 훨씬 더 효과적이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "약물 부하"는 세포 결합제(예컨대 항-CD20 항체 또는 그의 절편)에 부착될 수 있는 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)의 수를 지칭한다. 하나의 양태에서 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 8(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1)로 평균할 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 7(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1)로 평균할 수 있다. 훨씬 더 바람직한 양태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 6(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1)으로 평균할 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 5(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1)로 평균할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "평균"은 항-CD20 항체 또는 그의 절편 및 이에 연결된 약물의 흡광도의 분광광도 측정에 의해 결정된다. 다른 양태에서, 약물 항-CD20 항체 또는 그의 절편 컨쥬게이트는 화학식 (D)약 2 ~ 약 8-L-항i-CD20Ab로 표현되며, 여기에서 D는 약물(예컨대, 메이탄시노이드, 탁산 또는 CC1065 유사체)이고, L은 링커이며, 여기에서 상기 링커는 절단성 링커(예컨대, 이황화물 교환을 통해 절단가능한 링커) 또는 절단에 실질적으로 저항성인 링커(예컨대, 세포-결합제와 반응을 위한 N-석신이미딜 에스터 또는 N-설포석신이미딜 에스터 모이어티뿐만 아니라 말레이미도계 또는 할로아세틸계 모이어티를 가지는 링커)로부터 선택되고, 항-CD20Ab는 본원에 기술된 바와 같은 CD20에 결합하는 항체 또는 그의 절편이다. 바람직한 요소에서, 약물-세포 결합제 컨쥬게이트(예컨대, 면역컨쥬게이트)는 화학식 (May)약 2~약 8-L- 항-CD20Ab로 표현되며, 여기에서 May는 메이탄시노이드이고, L은 링커이되, 여기에서 상기 링커는 절단성 링커 또는 절단에 실질적으로 저항성인 링커이고; 항-CD20Ab는 본원에 기술된 바와 같은 CD20에 결합하는 항체 또는 그의 절편이다. 본 발명에서의 사용에 적당한 약물은 본원에 기술된 바와 같이 세포-결합제에 연결될 수 있는 세포독성 약물이다. 본 발명의 하나의 양태는 다음을 포함하는 변형된 방향족을 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체이다: (1) C-19-데클로로(dechloro)(미국 특허 제4,256,746호)(안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨); (2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소에 의해 제조됨); 및 (3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 제4,294,757호)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨). 다른 위치의 변형을 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다: (1) C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨); (2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호); (3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(노카르디아(Nocardia)로부터 제조됨); (4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); (5) C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호)(트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 분리됨); (6) C-18-N-탈메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 (7) 4,5-데옥시(deoxy)(미국 특허 제4,371,533호)(티타늄 트리클로라이드/메이탄시놀의 LAH 환원에 의해 제조됨). 본 발명에서 유용한 티올-포함 메이탄시노이드이 합성은 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 제7,276,497호에 완전히 개시되어 있다. C-3 위치, C-14 위치, C-15 위치 또는 C-20 위치에서 티올 모이어티를 가지는 메이탄시노이드는 전부 유용하다. C-3 위치가 바람직하며, 메이탄시놀의 C-3 위치는 특히 바람직하다. 또한 N-메틸-알라닌-포함 C-3 티올 모이어티 메이탄시노이드, 및 N-메틸-시스테인-포함 C-3 티올 모이어티 메이탄시노이드, 및 각각의 유사체가 바람직하다. 바람직한 메이탄시노이드는 미국 특허 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제6,333.410호; 제6,441,163호; 제6,716,821호; 제RE39,151호 및 제7,276,497호에 기술되어 있는 것이다. 물론, N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1) 및 N 2'-데아세틸-N2'-(4-메캅토-4-메틸-1-옥소펜틸) 메이탄신(DM4)이 바람직하다. 다른 약물은 발명의 본 양태, 예를 들어 본원에 기술된 것에서 사용될 수 있다. 다른 예는 미국 가출원 제61/049,296호 및 미국 특허 출원 제12/574,430호에 기술되어 있으며; 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
이작용성 가교제를 항-CD20 항체 또는 그의 절편은 항-CD20 항체 또는 그의 절편과 반응시킴으로써 변형될 수 있으며, 이에 의해 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 링커 분자의 공유 부착을 초래한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이작용성 가교 시약"은 약물, 예를 들어 본원에 기술된 약물에 세포-결합제를 공유적으로 연결하는 임의의 화학적 모이어티이다. 다른 방법에서, 연결 모이어티의 일부분은 약물에 의해 제공된다. 이 점에서, 약물은 약물에 세포-결합제를 연결하는데 사용되는 더 큰 링커 분자의 부분인 연결 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 메이탄시노이드 DM1를 형성하기 위하여, 메이탄신의 C-3 하이드록실 기에서 측쇄는 유리 설파이드릴 기(SH)를 가지는 것으로 변형된다. 이러한 메이탄신의 티올화 형태는 변형된 세포-결합제와 반응하여 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 그러므로, 최종 링커는 2개의 성분으로부터 집합되고, 이 중 하나는 가고 시약에 의해 제공되는 반면, 다른 하나는 DM1으로부터 측쇄에 의해 제공된다.
약물 분자는 또한 중개 담체 분자, 예를 들어 혈청 알부민을 통하여 항체 분자에 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포-결합제에 연결된" 또는 "항- CD20 항체 또는 절편에 연결된"은 적당한 연결 기, 또는 이의 전구체를 통하여 세포-결합제 항-CD20 항체 또는 절편에 결합된 적어도 하나의 약물 유도체를 포함된 컨쥬게이트 분자를 지칭한다. 바람직한 연결 기는 SMCC이다.
본 발명에서 유용한 특히 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체이다. 적당한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체의 에스터를 포함한다. 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체와 같은, 미세소관 형성을 억제하고 포유동물 세포에 대하여 매우 독성인 임의의 약물이 포함된다.
적당한 메이탄시놀 에스터의 예는 변형된 방향족 고리를 가지는 것 및 다른 위치에서 변형을 가지는 것을 포함한다. 이러한 적당한 메이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,333,410호; 제7,276,497호 및 제7,473,796호에 개시되어 있다.
변형된 방향족 고리를 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다:
(1) C-19-데클로로(미국 특허 제4,256,746호)(안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨);
(2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소에 의해 제조됨); 및
(3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 제4,294,757호)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨).
다른 위치의 변형을 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다:
(1) C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨);
(2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호);
(3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(노카르디아로부터 제조됨);
(4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨);
(5) C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호)(트레위아 누디플로라로부터 분리됨);
(6) C-18-N-탈메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및
(7) 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)(티타늄 트리클로라이드/메이탄시놀의 LAH 환원에 의해 제조됨).
바람직한 양태에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성제로서 공식적으로 N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메캅토-1-옥소프로필)-메이탄신으로 불리는 티올-포함 메이탄시노이드(DM1)를 이용한다. DM1은 다음의 구조식 IV에 의해 표현된다:
[구조식 IV]
Figure pct00002
바람직한 양태에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성제로서 티올-포함 메이탄시노이드인 N 2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-메캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(예컨대, DM4)를 이용한다. DM4는 다음의 구조식 V에 의해 표현된다:
[구조식 V]
Figure pct00003
입체적으로 방해된 티올 결합을 포함하는 측쇄를 포함하는 다른 바람직한 메이탄시노이드는 N 2'-데아세틸-N2'-(4-메캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3으로 불림)이며, 다음의 구조식 VI에 의해 표현된다:
[구조식 VI]
Figure pct00004
추가적인 메이탄시노이드는 화학식 VII-L, VII-D, 또는 VII-D,L에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:
[화학식 VII-L]
Figure pct00005
[화학식 VII-D]
Figure pct00006
[화학식 VII-D,L]
Figure pct00007
식 중,
Y는 (CR7R8)l(CR5R5)m(CR3R4)nCR1R2SZ를 나타내되,
R1 및 R2는 각각 독립적으로, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 기이거나, 또는 추가로 R1 및 R2 중 하나는 H일 수 있으며;
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이고;
l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이며, 추가로 n은 0일 수 있고;
Z는 H, SR 또는 -COR이며, 여기에서 R은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 비치환 또는 치환 아릴 또는 헤테로사이클릭 기이고;
May는 C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 데스메틸(desmethyl)에서 측쇄를 가지는 메이탄시노이드를 나타낸다.
화학식 VII-L, VII-D 및 VII-D,L의 바람직한 양태는 화학식 VII-L, VII-D 및 VII-D,L의 화합물을 포함하며, 여기에서:
R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z은 H이다.
R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 H이다.
R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는　-SCH3이다.
R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z은-SCH3이다.
추가적인 메이탄시노이드는 또한 화학식 VIII에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:
[화학식 VIII]
Figure pct00008
식 중, Y는 화학식 VII에 대해서 정의된 바와 같다.
화학식 VIII의 바람직한 양태는 화학식 VIII의 화합물을 포함하며, 여기에서:
R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이고; l 및 m은 각각 1이며; n은 0이고; Z는 H이다.
R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고; n은 0이며; Z는 H이다.
R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는 -SCH3이다.
R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 -SCH3이다.
추가적인 메이탄신은 화학식 IX-L, IX-D 또는 IX-D,L에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:
[화학식 IX-L]
Figure pct00009
[화학식 IX-D]
Figure pct00010
[화학식 IX-D,L]
Figure pct00011
식 중, Y2는 (CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2를 나타내되,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 기이며, 추가로 R1 및 R2 중 하나는 H일 수 있고;
A, B 및 D는 각각 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 단순 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이며;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 , R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 기이고;
l, m, n, o, p, q, r, s 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이며, 한 번에 l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 적어도 둘이 0이고;
Z2는 SR 또는 -COR이며, 여기에서 R은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이고
May는 메이탄시노이드이다.
화학식 IX의 화합물의 바람직한 양태는, R1이 H이고 R2가 메틸이며, R1은 메틸이고 R2는 메틸인 화합물을 포함한다.
추가로 메이탄시노이드는 화학식 X에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:
[화학식 X]
Figure pct00012
식 중, Y2'는 화학식 IX에 대해서 정의된 바와 같다.
미국 특허 제5,208,020호 및 제7,276,497호에 교시된 각각의 메이탄시노이드는 또한 본 발명의 컨쥬게이트에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 미국 특허 제5,208,020호 및 제7,276,697호의 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
메이탄시노이드 상의 많은 위치는 연결 모이어티를 화학적으로 연결하는 위치로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실 기를 가지는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시로 변형된 C-15 위치 및 하이드록시 기를 가지는 C-20 위치는 전부 유용할 것으로 예상된다. 그러나 C-3 위치가 바람직하고, 메이탄시놀의 C-3 위치가 특히 바람직하다.
바람직한 컨쥬게이트의 구조적 표현이 하기에 표시되어 있으며:
[화학식 XI]
Figure pct00013
[화학식 XII]
Figure pct00014
[화학식 XIII]
Figure pct00015
[화학식 XIV]
Figure pct00016
[화학식 XV]
Figure pct00017
[화학식 XVI]
Figure pct00018
[화학식 XVII]
Figure pct00019
[화학식 XVIII]
Figure pct00020
이러한 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 생성하는 몇몇 기술은 미국 특허 제6,333,410호, 및 미국 출원 제09/867,598호, 제10/161,651호 및 제10/024,290호에서 제공되며, 이들 각각은 본원에 전체가 포함되어 있다.
일반적으로, 수용성 완충액 중 항체의 용액은 반응성 기를 가지는 이황화 모이어티를 가지는 몰 과량의 메이탄시노이드와 함께 인큐베이션될 수 있다. 반응 혼합물은 과량 아민(예를 들어 에탄올아민, 타우린 등)의 첨가에 의해 퀀칭될 수 있다. 그 다음 메이탄시노이드-항체 컨쥬게이트는 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
항체 분자 당 결합된 메이탄시노이드 분자의 수는 252nm 및 280nm에서 흡광도의 비율을 분광광도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 평균 1~10개 메이탄시노이드 분자/항체 분자가 바람직하고, 평균 2~5개가 훨씬 더 바람직하다.
메이탄시노이드 약물과 항체의 컨쥬게이트는 다양한 원치 않는 세포주의 시험관 내 증식을 억제하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 인간 림프종 세포주 Daudi 및 인간 림프종 세포주 Ramos와 같은 세포주는 이들 화합물의 세포독성의 평가에 용이하게 사용될 수 있다. 4 내지 5일 동안 화합물에 평가될 세포를 노출시키고, 공지된 방법에 의해 직접적인 분석법으로 세포의 생존한 부분을 측정할 수 있다. 그 다음 IC50 값은 분석의 결과로부터 계산될 수 있다.
미국 가출원 제61/150,201호에 기술된 벤조다이아제핀 화합물(예컨대, 인돌리노벤조다이아제핀 또는 옥사졸리디노벤조다이아제핀), 이의 유도체, 이의 중간체는 또한 항-CD20 항체 절편 또는 컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다.
유용한 벤조다이아제핀은 화학식 XIX, XX 및 XXI의 화합물을 포함하며, 여기에서 이량체 화합물은 선택적으로 세포 결합제에 연결을 허용하는 연결 기를 가진다.
[화합물 XIX]
Figure pct00021
[화합물 XX]
Figure pct00022
[화합물 XXI]
Figure pct00023
여기에서 N과 C사이의 이중선
Figure pct00024
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 이중선이 이중 결합일 경우 X는 부재하고 Y는 H이며, 이중선이 단일 결합일 경우 X는 H 또는 화합물을 전구약물로 전환시키는 아민 보호 모이어티이고;
Y는 -OR, -OCOR'에 의해 표현되는 에스터, -OCOOR'에 의해 표현되는 카보네이트, -OCONR'R''에 의해 표현되는 카바메이트, NR'R''에 의해 표현되는 아민 또는 하이드록실 아민, -NRCOR'에 의해 표현되는 아마이드, NRCOP에 의해 표현되는 펩티드로부터 선택되되, 여기에서 P는 아미노산 또는 2 내지 20개의 아미노산 단위를 포함하는 폴리펩티드, SR'에 의해 표현되는 티오에테르, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, 할로겐, 시아노, 아지도, 또는 티올이며, 여기에서 R, R' 및 R''는 동일 또는 상이하고, H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 치환 또는 비치환된 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리(여기에서 치환기는 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로부터 선택됨)로부터 선택되며, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12의 정의는 상기 주어진 바와 같고, 선택적으로 R''는 OH이며;
W는 C=O, C=S, CH2, BH, SO 또는 SO2이고;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 치환 또는 비치환된 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 또는 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로부터 선택되는 치환기이되, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리으로부터 선택되며, 선택적으로 R10은 SR13 또는 COR13이되, 여기에서 R13은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리로부터 선택되고, 선택적으로 R11은 OR14이되, 여기에서 R14는 R과 동일한 정의를 가지며, 선택적으로 R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 또는 R4' 중 임의의 하나는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기이거나 또는 선택적으로 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기를 가지는 폴리피롤로, 폴리-인돌일, 폴리-이미다졸일, 폴리피롤로-이미다졸일, 폴리-피롤로-인돌일 또는 폴리이미다졸로-인돌일 단위로부터 선택되고;
Z는 (CH2)n(여기에서 n은 1, 2 또는 3임), CR15R16, NR17, O 또는 S로부터 선택되되, 여기에서 R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)이며;
R6은 OR, SR 또는 NRR'이되, 여기에서 R 및 R'는 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지고;
X'는 CH2, NR, CO, BH, SO 또는 SO2로부터 선택되되, 여기에서 R은 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지며;
Y'는 O, CH2, NR 또는 S이되, 여기에서 R은 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지고;
X', Y' 및 Z'가 동시에 모두 CH2가 아니라면, Z'는 CH2 또는 (CH2)n(여기에서 n은 2, 3 또는 4임)이며,
A 및 A'는 동일 또는 상이하고, O, -CRR'O, S, -CRR'S, -NR15 또는 CRR'NHR15로부터 선택되되, 여기에서 R 및 R는 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지며 R15는 상기 R에 대하여 주어진 바와 동일한 정의를 가지고;
D 및 D'는 동일 또는 상이하며, 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일(선택적으로 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로 치환되되, 여기에서 R7, R8, R9, R10, R11 및 R12의 정의는 상기 주어진 바와 같음), 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)로부터 선택되고;
L은 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 선택적으로 치환되는 선택적인 페닐 기 또는 헤테로사이클 고리(여기에서 치환기는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기임)이거나, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일(선택적으로 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로 치환되되, 여기에서 R7, R8, R9, R10, R11 및 R12의 정의는 상기 주어진 바와 같음), 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)로부터 선택되고; 선택적으로, 화합물이 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 단지 하나의 연결 기를 가진다면, L 자체는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기; 또는 이러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 용매화합물, 염, 수화물 또는 수화된 염, 이의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체 또는 다형성 결정질 구조이다.
하나의 바람직한 양태에서, N과 C사이의 이중선
Figure pct00025
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 이중선이 이중 결합일 경우 X는 부재하고 Y는 H이며, 이중선이 단일 결합일 경우 X는 H 또는 화합물을 전구약물로 전환시키는 아민 보호 기이고;
Y는 -OR, NR'R", 설파이트 -SO3, 또는 바이설파이트 -OSO3으로부터 선택되며, 여기에서, R은 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리로부터 선택되고;
W는 C=O, CH2 또는 SO2이며;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 H, NO2 또는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기로부터 선택되고;
R6은 OR18이며, 여기에서 R18는 R과 동일한 정의를 가지며;
Z는 (CH2)n(여기에서 n은 1, 2 또는 3임), CR15R16, NR17, O 또는 S로부터 선택되되, 여기에서 R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)이고;
X'는 CH2 또는 C=O로부터 선택되며;
Y'는 O, NR 또는 S이되, 여기에서 R은 상기와 같이 정의되고;
Z'는 CH2 또는 (CH2)2이며;
A 및 A'는 각각 O이고;
D 및 D'는 동일 또는 상이하며, 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일이고;
L은 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 선택적으로 치환되는 선택적인 페닐 기 또는 헤테로사이클 고리(여기에서 치환기는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기임)이거나, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일(선택적으로 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로 치환됨), 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)로부터 선택되고; 선택적으로, L 자체는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기; 또는 이러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 용매화합물, 염, 수화물 또는 수화된 염, 이의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체 또는 다형성 결정질 구조이다.
다른 바람직한 양태에서, 화합물은 화학식 XXII에 의해 표현되며:
Figure pct00026
여기에서 N과 C사이의 이중선
Figure pct00027
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 이중선이 이중 결합일 경우 X는 부재하고 Y는 H이며, 이중선이 단일 결합일 경우 X는 H 또는 화합물을 전구약물로 전환시키는 아민 보호 기이고, Y는 OH, -OR에 의해 표현되는 에테르, 설파이트 -SO3 또는 바이설파이트 -OSO3로부터 선택되되, 여기에서 R은 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일로부터 선택되며,
R2, R3 중 하나는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기이고 다른 하나는 H이며,
L', L" 또는 L"' 중 하나는 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기인 반면, 다른 것들은 H이고; 바람직하게 L'는 연결 기이며 G는 CH 또는 N이다. 다른 예는 미국 특허출원 제61/150,201호에 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명에 따른 세포독성 컨쥬게이트에 사용되는 세포독성제는 또한 탁산 또는 이의 유도체일 수 있다. 탁산은, 암의 치료에 광범위하게 사용되는 2가지 화합물인, 세포독성 천연물인 파클리탁셀(탁솔), 및 반합성 유도체인 도세탁셀(탁소텔)을 포함하는 화합물의 패밀리이다. 탁산은 튜불린의 해중합을 억제하는 유사분열방추 독이며, 세포 사멸을 초래한다. 도세탁셀 및 파클리탁셀은 암의 치료에 있어서 유용한 제제인 반면, 이들의 항암 활성은 정상 세포에 대한 비특이적인 독성때문에 제한된다. 또한, 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 화합물 그 자체는 본 발명의 항-CD20 항체 및 이의 절편과 같은 세포 결합체의 컨쥬게이트에 사용되기에 충분히 강력하지 않다. 본 발명에서 사용되기에 적당한 탁산은 미국 특허 제6,372,738호 및　제6,340,701호에 개시되어 있다. 본 발명의 탁산 및 세포 결합제의 컨쥬게이트는 현재 공지되거나 이후에 개발된 임의의 기법을 사용하여 형성될 수 있다. 수많은 컨쥬게이션 방법은 미국 특허 제5,416,064호 및 미국 특허 제5,475,092호에 교시되어 있다. 탁산은 또한 미국 특허 제7,598,290호, 미국 특허 공개 제20090099336호, 제20070031402호, 제20060233814호, 제20060233811호, 제20050123549호, 제20050085513호 및 제20040039176호에 교시되어 있으며, 이들 전부 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
CC-1065 및 이의 유사체는 또한 본 발명에서 사용하기에 바람직한 세포독성 약물이다. CC-1065 및 이의 유사체는 미국 특허 제6,372,738호; 제6,340,701호; 제5,846,545호; 및 제5,585,499호에 개시되어 있다. CC-1065는 스트렙토마이세스 젤렌시스의 배양 브로스에서 분리된 강력한 항-종양 항생제이다. CC-1065는 흔히 사용되는 항암 약물, 예를 들어 독소루비신, 메톡트렉세이트 및 빈크리스틴보다 시험관 내에서 약 100배 더 강력하다(B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)).
듀오카마이신은 본 발명에서의 사용에 매우 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 일련번호 제6,281,354호; 제6,066,742호; 제5,703,080호; 제4,994,578호; 제4,923,990호에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
에네딘, 예를 들어 칼리키아마이신은 본 발명에서의 사용에 매우 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제5,436,361호; 제5,053,394호; 및 미국 특허 공개 제20090105461호에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
돌라스틴(dolastin) 및 돌라스틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴은 본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제7,084,110호; 제6,737,409호; 제6,686,445호; 제6,632,795호; 제6,458,765호; 제6,323,315호; 제6,248,865호; 제6,239,104호; 제6,143,721호; 제6,103,698호; 제6,034,065; 5,985,837호; 제5,965,537; 5,886,147호; 제5,554,725호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 및 4,879,278호에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
토메이마이신 유도체는 본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제4,427,588호, 문헌[Arima et al., "J. Antibiotics", vol. 25, No. 8, pp. 437-444, (1972)]; [Kariyone et al., "Chem. Pharm. Bull.", vol. 19, No. 11, pp. 2289-2293, (1971)]; 및 [Leimgruber et al., "J. Am. Chem. Soc.", vol. 90, pp. 5641-5643, (1968)]에 개시되어있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
렙토마이신 유도체는 본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제7,446,196호, 문헌[Kudo et al. Experimental Cell Research, 1998, 242(2), 54-546]; [Kuhnt et al., Applied Environmental Microbiology, 1998, 64(2), 714-720]; 미국 출원 제10/856,703호; 문헌[Carl et al., J. Med. Chem. 1981, 24 (3), 479-480, "A Novel Connector Linkage Applicable in Prodrug Design"]; [Chemical Abstracts No. 105:102629 (일본 특허 61-109717 A2 (1986)의 요약)]; [Doherty et al., J. Nat. Cancer Inst. 2003, 95(24), 1859-1868, "Cell Cycle Checkpoint Function in Bladder Cancer"]; [Fukuda et al., Nature 1997, 390, 308-311, "CRM1 is responsible for intracellular transport mediated by the nuclear export signal"]; [Hamamoto et al., J. Antibiotics 1983, 36 (6), 639-645, "Leptomycins A and B, New Antifungal Antibiotics I. Taxonomy of the Producing Strain and Their Fermentation, Purification and Characterization"]; [Hayakawa et al., J. Antibiotics 1987, 40 (9), 1349-1352, "New Antitumor Antibiotics, Anguinomycins A and B"]; [Inoue et al., J. Biol. Chem. 2002, 277 (17), 15053-15060, "Nuclear Import and Export Signals in Control of the p53-related Protein p73"]; [Kobayashi et al., Ensho, Saisei 2004, 24(5), 578-583, "Role of matrix metalloproteinase-9 expression on cutaneous inflammation: possible treatment by leptomycin B application" (abstract)]; [Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 220-223, "Structural Study of a New Antitumor Antibiotic, Kazusamycin"]; [Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 224-229, "Antitumor Activity of a New Antibiotic, Kazusamycin"]; [Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (3), 427-429, "Antitumor activity of leptomycin B"]; [Kudo et al., Exp. Cell Res. 1998, 242, 540-547, "Lepto-mycin B Inhibition of Signal Mediated Nuclear Export by Direct Binding to CRM1"]; [Kudo et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 1999, 96 (3), 9112-9117, "Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region"]; [Kuhnt et al., Applied Environ. Microbiol. 1998, 64 (2), 714-720, "Microbial Conversion Products of Leptomycin B"; Lane et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 2000, 97, 8501-8506, "Activation of p53 in cervical carcinoma cells by small molecules"]; [Marabese et al., Nucleic Acids Res. 2003 31 (22), 6624-6632, "DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C-EBPa repression on E2F1"]; [Meissner et al., FEBS Letters 2004, 576(1-2), 27-30, "Ratjadone and leptomycin B block CRM1-dependent nuclear export by identical mechanisms" (abstract)]; [Nishi et al., J. Biol. Chem. 1994, 269 (9), 6320-6324, "Leptomycin B Targets a Regulatory Cascade of crm1, a Fission Yeast Nuclear Protein, Involved in Control of Higher Order Chromosome Structure and Gene Expression"]; [Peehl et al., Prostate 2003, 54, 258-267, "Leptomycin B Stabilizes and Activates p53 in Primary Prostatic Epithelial Cells and Induces Apoptosis in the LNCaP Cell Line"]; 및 [University of Dundee, Dept. Surgery & Molecular Oncology, Lain Group Website, http://www.dundee.ac.uk/surgery/Non-Genotoxic.htm, accessed Dec. 6, 2004, "Non-genotoxic activation of the p53 tumor suppressor function"]에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.
본 발명의 다른 양태에서, siRNA 분자는 약물 대신에 본 발명의 항체에 연결될 수 있다. siRNA는 올리고뉴클레오티드의 변형에 흔히 사용되는 방법에 의해 본 발명의 항체에 연결될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제20050107325호 및 제20070213292호 참조). 따라서, 3' 또는 5' 포스포르아미다이트 형태에서 siRNA는 하이드록실 기능성을 가지는 가교제의 한쪽 말단과 반응하여 siRNA와 가교제 사이의 에스터 결합을 제공할 수 있다. 유사하게 말단 아미노 기를 가지는 가교제와 siRNA 포스포르아미다이트의 반응은 아민을 통하여 siRNA에 가교제의 연결을 초래한다. 대안적으로, siRNA는 표준 화학 방법에 의해 유도체화되어 티올 기를 도입할 수 있다. 이러한 티올-포함 siRNA는 활성 이황화 또는 말레이미드 모이어티를 도입하도록 변형된 항체와 반응되어, 절단성 또는 비절단성 컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 1 내지 20개 siRNA 분자는 이러한 방법에 의해 항체에 연결될 수 있다.
진단 및 연구 적용
본원에 논의된 항체의 치료적 용도에 더하여, 본 발명의 항체 및/또는 절편은 많은 공지된 진단 및 연구 적용에서 이용될 수 있다. 본 발명의 항체 및/또는 절편은 예를 들어 정제, 검출 및 CD20의 표적화에 사용될 수 있으며, 시험관 내 및 생체 내 진단 방법 모두에 포함된다. 예를 들어, 항체 및/또는 절편은 생물학적 샘플 내 세포에 의해 발현되는 CD20의 수준을 정성적으로 및 정량적으로 측정하기 위하여 면역분석법에 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조하며, 이는 참조로 본원에 전체가 포함되어 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침강 분석법에 사용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
예를 들어, 본 발명은 또한 CD20-매개 병태를 가지고 있는 것으로 알려지거나 또는 가지고 있는 것으로 의심되는 환자에서 CD20을 검출하는 진단 방법에서의 사용을 위하여, 하기 기술된 바와 같이, 검출가능하게 표지화된 상기 항-CD20 펩티드 및 항체를 제공한다. 본 발명의 항-CD20 펩티드 및/또는 항체는 샘플 내 CD20 또는 항-CD20 항체를 검출 또는 정량화하는 면역분석법에 유용하다. CD20에 대한 면역분석법은 전형적으로 CD20에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출가능하게 표지화된 높은 친화도의 항-CD20 펩티드 및/또는 항체의 존재 하에서 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계, 샘플 내에 결합된 표지화된 펩티드 또는 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 임상적 분석 절차는 당업계에, 예컨대 문헌[Immunoassays for the 80's, A. Voller et al., eds., University Park, 1981]에 기술된 바와 같이 잘 알려져 있다. 따라서, 항-CD20 펩티드 또는 항체 또는 그의 절편은 나이트로셀룰로오스, 또는 세포, 세포 입자 또는 용해성 단백질을 고정화시킬 수 있는 다른 고체 지지체에 첨가될 수 있다. 그 다음 지지체는 적당한 완충액으로 세척한 다음, 검출가능하게 표지화된 CD20-특이적 펩티드 또는 항체 또는 그의 절편으로 처리될 수 있다. 그 다음 고체상 지지체는 완충액으로 2번 세척하여 결합되지 않은 펩티드 또는 항체 또는 그의 절편을 제거할 수 있다. 그 다음 고체 지지체에 결합된 표지의 양은 공지된 방법의 단계에 의해 검출될 수 있다.
"고체상 지지체" 또는 "담체"는 펩티드, 항원 또는 항체 또는 그의 절편을 결합할 수 있는 임의의 지지체로 의도된다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 아가로오스, 및 자철석을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위하여 어느 정도까지 용해성 또는 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 결합된 분자가 CD20 또는 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 결합할 수 있는 한 사실상 임의의 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드에서와 같은 구형, 또는 시험관의 내부 표면, 또는 막대기의 외부 표면에서와 같은 원통형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 시트, 배양 접시, 테스트 스트립 등과 같이 평면일 수 있다. 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 당업자는 항체 또는 그의 절편, 펩티드 또는 항원을 결합하기 위한 많은 다른 적당한 담체를 알 것이거나, 또는 통상적인 실험에 의해 그것을 확인할 수 있다.
잘 알려진 방법의 단계는 주어진 다수의 항-CD20 펩티드 및/또는 항체 또는 그의 절편의 결합 활성을 측정할 수 있다. 당업자는 통상적인 실험에 의해 유효한 최적의 분석법을 결정할 수 있다.
CD20- 특이적 펩티드 및/또는 항체 또는 그의 절편을 검출가능하게 표지화하는 것은 효소 면역분석법(EIA), 또는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에서의 사용을 위한 효소에 연결시킴으로써 수행될 수 있다. 연결된 효소는 노출된 기질과 반응하여, 예를 들어 분광광도, 형광 측정에 의해 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 본 발명의 CD20-특이적 항체 또는 그의 절편을 검출가능하게 표지화하는데 사용될 수 있는 효소는 이에 한정되는 것은 아니지만 말레이트 데하이드로게나아제, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 아이소머라아제, 효모 알코올 데하이드로게나아제, 알파-글리세로인산 데하이드로게나아제, 3탄당인산 아이소머라아제, 호스래디쉬 퍼록시다아제, 알칼리 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제를 포함한다.
CD20-특이적 항체 및/또는 이의 절편을 방사성으로 표지화함으로써, 방사면역측정법(RIA)의 사용을 통하여 CD20을 검출하는 것이 가능하다(예를 들어, 문헌[Work, et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978)] 참조). 방사성 동위원소는 감마 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 수단에 의해, 또는 자기방사법에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S, 14C이고, 바람직하게는 125I이다.
또한 형광 화합물을 이용하여 CD20-특이적 항체 및 이의 절편을 표지화하는 것이 가능하다. 형광 표지화된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출될 경우, 그러면 상기 항체의 존재는 형광으로 인해 검출될 수 있다. 가장 흔히 사용되는 형광 표지화 화합물 중에는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레사민이 있다.
CD20-특이적 항체 또는 그의 절편은 또한 형광-발광성 금속, 예를 들어 25Eu, 또는 란탄 계열의 다른 것들을 사용하여 검출가능하게 표지화될 수 있다. 이러한 금속은 다이에틸렌트라이아민펜나아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트화 그룹을 사용하여 CD20-특이적 항체 또는 그의 절편에 부착될 수 있다.
CD20-특이적 항체 또는 그의 절편은 또한 화학 발광성 화합물에 결합시킴으로써 검출가능하게 표지화될 수 있다. 그러면 화학 발광성 표지화된 항체의 존재는 화학적 반응의 진행 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학 발광성 표지화 화합물의 예로는 루미놀, 아이소루미놀, 쎄로마틱 아크리디늄 에스터(theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터가 있다. 유사하게, 생물 발광성 화합물이 본 발명의 CD20-특이적 항체, 이의 절편 또는 유도체를 표지화하는데 사용될 수있다. 생물 발광은, 촉매 단백질이 화학 발광성 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학 발광의 종류이다. 생물 발광성 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정될 수 있다. 표지화의 목적을 위하여 중요한 생물 발광성 화합물은 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린이다.
CD-특이적 항체, 이의 절편 또는 유도체의 검출은 예를 들어 검출가능한 표지가 방사성 감마 방출체라면 섬광 계수기에 의해, 또는 예를 들어 표지가 형광성 물질이라면 형광광도계에 의해 수행될 수 있다. 효소 표지의 경우에서, 검출은 효소에 대한 기질을 이용하는 발색법에 의해 수행될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여 기질의 효소 반응의 정도를 시각적으로 비교함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 상기 분석법에 의해 검출된 CD20은 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. CD20을 포함하는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈청, 림프액, 소변, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출액 또는 호모제네이트 등과 같은 생물학적 유체이다. 그러나, 본 발명은 이러한 샘플만을 사용하는 분석법으로 한정되지 않으며, 당업자는 다른 샘플의 사용을 허용하는 적당한 조건을 결정할 수 있다.
동일계 내 검출은 환자로부터 조직염색 표본을 분리하고, 본 발명의 표지화된 항체의 조합을 상기 표본에 제공함으로써 수행될 수 있다. 항체 또는 그의 절편은 바람직하게 표지화된 항체 또는 그의 절편을 생물학적 샘플에 적용함으로써 또는 쒸움으로써 제공된다. 이러한 절차의 사용을 통하여, CD20의 존재뿐만 아니라 검사된 조직에서 CD20의 본포를 측정하는 것이 가능하다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 광범위하게 다양한 조직학적 방법(예를 들어 염색 절차) 중 임의의 것이이러한 동일계 내 검출을 달성하기 위하여 변형될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 절편은, "2자리" 또는 "샌드위치" 분석법으로도 알려진 면역계수측정법에서 이용을 위해 적합화될 수 있다. 전형적인 면역계수측정법에서, 다량의 비표지화 항체 또는 그의 절편은 처리될 유체에 불용성인 고체 지지체에 결합되고, 다량의 검출가능하게 표지화된 용해성 항체가 첨가되어 고체-상(solid-phase)의 항체, 항원 및 표지화된 항체 사이에 형성된 3성분 복합체의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 한다.
전형적이고 바람직한 면역계수측정법은, 고체상에 결합된 항체가 먼저 시험될 샘플과 접촉되어 2성분 고체상의 항체-CD20 복합체의 형성에 의해 샘플로부터 CD20을 추출하는 "전진" 분석법("forward" assay)을 포함한다. 적당한 인큐베이션 기간 후, 고체 지지체는 세척하여 만약에 있다면 미반응 CD20을 포함한 유체 샘플의 잔류물을 제거하고, 그 다음 공지된 양의 표지화된 항체("수용체 분자"로서 작용함)를 포함하는 용액과 접촉시킨다. 표지화된 항체가 비표지화된 항체 또는 그의 절편을 통하여 고체 지지체에 결합된 CD20과 복합체를 형성하도록 하는 제2 인큐베이션 기간 후에, 고체 지지체는 2번 세척하여 미반응 표지화된 항체 또는 그의 절편을 제거한다. 이러한 유형의 전진 샌드위치 분석법은 CD20이 존재하는지 여부를 결정하는 단순한 "네/아니오" 분석일 수 있거나 또는 표지화된 항체 도는 이의 절편의 양을 공지된 양의 CD20을 포함하는 표준 샘플에 대하여 얻은 것과 비교함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 "2자리" 또는 "샌드위치" 분석법은 Wide에 의해 기술되어 있다(Radioimmune Assay Method, Kirkham, ed., Livingstone, Edinburgh, 1970, pp. 199-206).
또한 CD20에 유용할 수 있는 다른 유형의 "샌드위치" 분석법은 소위 "동시" 및 "역" 분석법이다. 동시 분석법은 단일 인큐베이션 단계를 수반하며, 여기에서 고체 지지체에 결합된 항체 및 표지화된 항체는 둘 다 시험될 샘플에 동시에 첨가된다. 인큐베이션이 완료된 후, 고체 지지체는 세척하여 유체 샘플 및 비복합체화 표지화된 항체의 잔류물을 제거한다. 그 다음 고체 지지체와 결합된 표지화된 항체의 존재는 통상적인 "전진" 샌드위치 분석법에서와 같이 측정된다.
"역" 분석법에서, 먼저 유체 샘플에 표지화된 항체 용액의 점차적인 첨가 후 적절한 인큐베이션 기간 후에 고체 지지체에 결합된 비표지화된 항체의 첨가가 이용된다. 제2 인큐베이션 후, 고체상은 통상적인 방식으로 세척하여 시험될 샘플 및 미반응 표지화된 향체의 용액의 잔류물을 제거한다. 그 다음 고체 지지체와 결합된 표지화된 항체의 측정은 "동시" 및 "전진" 분석법에서와 같이 측정된다. 하나의 양태에서, 개별적인 에피토프에 특이적인 본 발명의 항체의 조합은 민감한 3자리 면역방사 측정법을 구성하는데 사용돌 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 절편은 또한 생체 내 이미징에 유용하며, 여기에서 검출가능한 모이어티 예를 들어 방사선-불투과성 제제 또는 방사성 동위원소로 표지화된 항체는 개체에게, 바람직하게는 혈류로 투여되고, 숙주 내 표지화된 항체의 존재 및 위치가 분석된다. 이러한 이미징 기법은 악성 종양의 병기 결정(staging) 및 치료에 유용하다. 항체 또는 그의 절편은, 핵 자기 공명, 방사선학에 의하든, 또는 당업계에 공지된 다른 검출 수단에 의하든 숙주에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지화될 수 있다.
표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 검출가능한 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 표지는 비오틴 표지, 효소 표지(예컨대, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 및 호스래디쉬 퍼록시다아제), 방사성-표지(예컨대, 3H, 14C, 32P, 35S, 및 125I), 형광단 예를 들어 형광성 또는 화학 발광성 화합물(예컨대, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민), 조영제(예컨대, Tc-m99 및 ㅇ이인듐(111In)) 및 금속 이온(예컨대, 갈륨 및 유로퓸)일 수 있다.
항체 또는 그의 절편을 표지에 컨쥬게이팅하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있으며, 이는 문헌[Hunter, et al., 1962, Nature 144:945; David et al., 1974, Biochemistry 13:1014; Pain et al., 1981, J. Immunol . Meth. 40:219; Nygren, J., 1982, Histochem . and Cytochem. 30:407]에 기술된 예시적인 방법을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 그의 절편은 또한 이들의 세포 내 CD20의 기능의 억제에 기초한 생물학적 연구에서의 시약으로서 유용하다.
본 발명의 항체 또는 그의 절편은 또한 친화 정화제(affinity purification agent)로서 유용하다. 이러한 공정에서, 항체는 예를 들어 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 적당한 지지체 상에 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 고정화된다. 따라서, CD20은 생물학적 샘플로부터 분리되고 정제될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 절편 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 CD20에 결합할 수 있고 본 발명의 항체 또는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 염격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 상기 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 6x SSC, 0.5% SDS, 5x 덴하르트 용액, 및 100㎎/㎖ 열 변성 연어 정자 DNA에서 2시간 동안 60℃에서 예비혼성화; 18시간 동안 60℃에서 혼성화; 4x SSC, 0.5% SDS, 0.1% 파이로인산나트륨에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척하고, 2x SSC, 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척.
당업계에 공지된 방법으로 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 항체 또는 그의 절편의 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(예컨대, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기술된 바와 같음)로부터 집합될 수 있으며, 이는 간단하게 항체를 암호화하는 서열의 일부분을 포함하는 중복되는 올리고뉴클레오티드의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 그 다음 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 수반한다.
항-CD20 항체 또는 절편을 암호화라는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 재조합 벡터의 조립 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 가변 도메인의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들 중 임의의 것의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.
재조합 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 그 다음 형질감염된 세포는 종래의 기법에 의해 배양되어 본 발명의 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 비상동 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체, 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 바람작한 양태에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 암호화하는 벡터는 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 항-CD20 항체 또는 절편 분자를 발현하는데 이용될 수 있다, 이러한 숙주-발현 시스템은 관심의 암호화 서열이 생성되고 그 후 정제될 수 있게 하는 비히클을 나타내고, 또한 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질변환 또는 형질감염될 때 동일계 내에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 이에 한정되는 것은 아니지만 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질변환된 미생물, 예를 들어 박테리아(예컨대, 대장균 및 바실러스 서브틸리스); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질변환된 효모(예컨대, 사카로마이세스 및 피키아); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질변환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구조체가 숨어있는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함한다.
특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위하여 바람직하게는 대장균과 같은 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스 유래의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포가 항체에 대하여 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
재조합 단백질의 장기간 동안 고수율 생산을 위하여 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전자 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적인 마커에 의해 제어된 DNA로 형질변환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 강화 배지에서 1~2일 동안 성장시킬 수 있으며, 그 다음 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 중 선택적인 마커는 선별에 대한 저항성을 제공하고, 세포가 플라스미드를 크로모좀으로 안정적으로 통합시킬 수 있게 하며, 성장하여 차례로 세포주로 클로닝되고 확장될 수 있는 중심을 형성한다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제에 대하여 당업계에 알려진 임의의 분자, 예를 들어 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 뒤의 특이적인 항원에 대한 친화도에 의한 크로마토그래피, 및 분립 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도, 또는 단백질의 정제에 대하여 임의의 기타 표준 기법에 의하여 정제될 수 있다. 이와 관련하여, 미국 특허 제7,538,195호는 본 개시 내용에 언급되어 있으며, 이의 교시 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
다른 양태에서, 다양한 항체 및 항체 절편뿐만 아니라 항체 모방체는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 바와 같은 방법을 사용하여 특정 세트의 CDR 옆에 위치하는 가변 및 불변 영역 서열 내에서 돌연변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 Ab의 상이한 부류가 상이한 중쇄의 치환에 의해 주어진 세트의 CDR에 대하여 가능하며, 이것에 의하여, 예를 들어 IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE 항체 유형 및 아이소타입이 생성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범주 내에 속하는 인공적인 항체는 전체적 합성 골격 내에 주어진 세트의 CDR 내에 삽입함으로써 생성될 수 있다. 용어 "가변"은 본원에서 항체 사이의 서열에서 상이한 가변 도메인의 특정 부분을 기술하는데 사용되며, 항원에 대하여 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성은 보통 항체의 가변 도메인을 통해 고르게 분포된다. 전형적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3가지 분절 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다의 초가변 영역에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분은 골격(FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 CDR에 연결된 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 골격 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에서는 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(E. A. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, 1991, NIH). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합함에 있어서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
인간화 항체, 또는 다른 포유동물에 의한 비거부에 대해 적응된 항체는 몇몇 기술, 예를 들어 재표면화 및 CDR 그래프팅을 사용하여 생성될 수 있다. 재표면화 기술에서, 분자 모델링, 통계적 분석 및 돌연변이유발은 표적 숙주의 공지된 항체의 표면과 유사한 가변 영역의 비-CDR 표면을 조정하도록 결합된다. 항체의 재표면화 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내 항체의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은 미국 특허 제5,639,641호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. CDR 그래프팅 기술에서, 뮤린 중쇄 및 경쇄 CDR은 완전 인간 골격 서열로 그래프팅된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 항체의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물은 항체의 결합 특징과 비슷한 결합 특징을 가지며, 예를 들어 키메라, 인간화 및 단일 사슬 항체뿐만 아니라 이의 절편을 포함한다. 이러한 기능적 동등물을 생성하는 방법은 PCT 출원 WO 93/21319, 유럽 특허 출원 제239,400호; PCT 출원 WO 89/09622; 유럽 특허 출원 338,745; 및 유럽 특허 출원 EP　332,424에 개시되어 있으며, 이들은 각각 전체가 참조로 포함되어 있다.
기능적 동등물은 본 발명의 항체의 가변 또는 초가변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 서열에 적용되는 "실질적으로 동일한"은, 문헌[Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따라서 FASTA 검색 방법에 의하여 측정된 바와 같이, 다른 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 가지는 서열로서 본원에서 정의된다.
키메라 항체는 바람직하게 인간 항체 불변 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 불변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터의 가변 영역의 서열로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 가변 영역을 가진다. 항체의 인간화 형태는 인간 골격 도메인으로, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역을 치환함으로써 제조되며, 예컨대 PCT 공개 제W092/22653호를 참조할 수 있다. 인간화 항체는 바람직하게 상응하는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 상보성 결정 영역(CDR) 이외에 불변 영역 및 가변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 CDR을 가진다.
또한 기능적 동등물은, 또한 단일-사슬 항체(scFv)로 알려진, 단일-사슬 항체 절편을 포함한다. 이러한 절편은, 하나 이상의 상호 연결 링커를 이용하여 또는 이용하지 않고 항체 가변 경쇄 서열(VL)의 적어도 하나의 절편에 묶인 항체 가변 중쇄 아미노산 서열(VH)의 적어도 하나의 절편을 포함한다. 일단 단일-사슬 항체 절편이 유래하는 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성을 유지하기 위하여 연결된다면, 이러한 링커는 (VL) 및 (VH) 도메인의 적절한 3차원 접힘이 일어나는 것을 확실히 하도록 선택되는 짧고 유연한 펩티드일 수 있다. 일반적으로, (VL) 또는 (VH) 서열의 카복실 말단은 상보적인 (VL) 및 (VH) 서열의 아미노산 말단에 이러한 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 단일-사슬 항체 절편은 분자 클로닝, 항체 파지 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 기법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단백질은 진핵 세포 또는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아에서 생성될 수 있다.
단일-사슬 항체 절편은 본 명세서에 기술된 전체 항체의 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 하나를 가지는 아미노산 서열을 포함하지만, 이러한 항체의 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결핍되어 있다. 이러한 불변 도메인은 항원 결합을 위하여 필요하지 않지만, 전체 항체의 구조의 주요 부분을 구성한다. 그러므로 단일-사슬 항체 절편은 불변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체의 사용과 연관된 문제점의 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일-사슬 항체 절편은 생물학적 분자와 중쇄 불변 영역, 또는 다른 원치 않는 생물학적 활성 사이의 원하지 않는 상호작용에서 자유로운 경향이 있다. 추가적으로, 단일-사슬 항체 절편은 전체 항체보다 상당히 더 작고, 따라서 전체 항체보다 더 높은 모세혈관 투과성을 가져서, 단일-사슬 항체 절편이 표적 항원-결합 부위에 보다 효과적으로 국재화되고 이에 결합될 수 있게 할 수 있다. 또한, 항체 절편은 원핵 세포에서 비교적 대규모로 생성될 수 있으며, 따라서 이의 생성을 용이하게 한다. 또한, 단일-사슬 항체 절편의 비교적 작은 크기는 이 절편이 전체 항체보다 수용체에서 면역 반응을 자극할 가능성이 더 낮게 한다.
본원에 기술되어 있는 항-CD20 항체 및 이의 인간화 변이체에 대한 아미노산 및 핵산 서열의 지식은, 또한 인간 CD20에 결합하는 많은 항체를 개발하는데 사용될 수 있다. 몇몇 연구는, 1차 항체 서열의 지식을 기초로 하여, 결합 및 발현 수준과 같은 특성에 대하여 항체의 서열 중 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변화를 도입한 효과를 조사하였다(Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol . Biol ., 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539).
이들 연구에서, 1차 항체의 변이체는, 올리고뉴클레오티드-매개 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR, DNA 셔플링과 같은 방법, 또는 E.coli의 돌연변이 유발 유전자-균주를 사용하여, CDR1, CDR2, CDR3, 또는 골격 영역에서 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 생성되었다(Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in "Phage Display of Peptides and Proteins ", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). 1차 항체의 서열을 변화시키는 이러한 방법은 2차 항체의 친화도를 개선시켰다(Gram, H. et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97, 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol . Biol ., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol . Chem ., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem ., 276, 27622-27628).
내용이 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는 특허 출원 공개 20090246195에 기술된 방법과 같은, 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시키는 유사한 지정된 전략에 의하여, 본 발명에 기술된 항체 서열은 개선된 기능을 가지는 항-CD20 항체를 개발하는데 사용될 수 있다.
검출가능한 모이어티에 항체를 컨쥬게이트하기 위하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 이는 문헌[Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)]; [David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)]; [Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]에 의해 기술된 것을 포함한다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침강 분석법에 이용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
본 발명의 항체는 또한 생체 내 이미징에 유용하며, 여기에서 검출가능한 모이어티 예를 들어 방사선-불투과성 제제 또는 방사성 동위원소로 표지화된 항체는 개체에게, 바람직하게는 혈류로 투여되고, 숙주 내 표지화된 항체의 존재 및 위치가 분석된다. 이러한 이미징 기법은 악성 종양의 병기 결정(staging) 및 치료에 유용하다. 항체는, 핵 자기 공명, 방사선학에 의하든, 또는 당업계에 공지된 다른 검출 수단에 의하든 숙주에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지화될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 친화 정화제로서 유용하다. 이러한 공정에서, 항체는 예를 들어 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 적당한 지지체 상에 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 고정화된다.
치료적 적용
또한 CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법이 본 발명에 포함된다. 이러한 방법은 본 발명의 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트뿐만 아니라 본 발명의 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트를 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 이용한다. 적당한 치료제는 CD20을 발현하는 세포의 성장을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "억제하다" 및 "억제하는"은 세포 사멸을 포함하여 세포 성장에 대한 임의의 억제 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 억제 효과는 일시적 효과, 지속적 효과 및 영구적 효과를 포함한다.
본 발명의 치료적 적용은 질환을 가지는 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법으로 치료되는 질환은 CD20의 발현을 특징으로 한다. 이러한 질환은 비호지킨 림프종 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병 및 B 세포 급성 림프구성 백혈병과 같은 B 세포 유래 악성 종양뿐만 아니라 비악성 자가면역 또는 염증성 장애, 예를 들어 RA를 포함하며, 여기에서 CD20 양성 B 세포는 질환 병태생리학에서 역할을 한다. 숙련된 기술자는 본 발명의 방법이 또한 CD20의 발현으로 기술되지만 이를 특징으로 하는 다른 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 치료적 적용은 또한 시험관 내 및 생체 외에서 실시될 수 있다.
시험관 내 사용의 예는 B 세포 계통의 세포와 같이 CD20-양성 세포로 오염된 세포 집단의 정제를 포함한다. 상기 방법은 세포독성 huCD20-7 컨쥬게이트의 존재 하에서 세포 집단을 배양하고, 그 다음 사멸한 CD20-양성 세포의 제거를 포함한다. 비임상적 시험관 내 사용을 위한 조건은 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Uckun et al., 1986, J Exp . Med. 163,347-368]; [Uckun et al., 1985, J. Immunol. 134, 3504-3515]; [Ramakrishnan et al., 1985, J. Immunol. 135, 3616-3622] 참조).
고체 지지체에 부착된 본 발명의 항체, 절편 및 영역, 절편 또는 유도체는 또한 유체 또는 조직 또는 세포 추출물로부터 CD20을 제거하는데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 혈액 또는 혈장 생성물로부터 CD20을 제거하는데 사용된다. 다른 바람직한 양태에서, 뮤린 및 키메라 항체, 절편 및 영역은 체외 면역흡착제 장치에서 유리하게 사용되며, 이는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Seminars in Hematology, 26 (2 Suppl. 1) (1989)] 참조). 환자 혈액 또는 다른 체액은 부착된 항체에 노출되고, 체액이 신체로 되돌려진 후에, 순환하는 CD20(유리 또는 면역 복합체 형태)의 부분적 또는 완전한 제거를 초래한다. 이러한 면역흡착은 세포 원심분리 단계를 간섭하거나 또는 간섭하지 않고 연속 흐름 배열에서 시행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Terman, et al., J. Immunol. 11 7:1971-1975 (1976)]을 참조할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 컨쥬게이트의 치료적 적용을 포함하며, 여기에서 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 개체에게 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 볼루스로서 정맥 내로 또는 일정 기간 동안 연속 주입에 의해, 근육 내, 피하, 관절 내, 활액 내(intrasynovial), 척추 강내, 경구, 국소적, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 또는 종양 내, 종양 주변부, 병변 내 또는 병변 주변부 경로에 의해 투여되어, 국부적뿐만 아니라 전신적 치료 효과를 발휘할 수 있다.
약학적 제형
치료적 적용을 위하여, 본 발명의 항체 또는 컨쥬게이트는 개체에게 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 투여된다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 볼루스로서 정맥 내로 또는 일정 기간 동안 연속 주입에 의해, 근육 내, 피하, 관절 내, 활액 내, 척추 강내, 경구, 국소적, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 또는 종양 내, 종양 주변부, 병변 내 또는 병변 주변부 경로에 의해 투여되어, 국부적뿐만 아니라 전신적 치료 효과를 발휘할 수 있다. 적당한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제는 잘 알려져 있으며, 임상적 상황 근거로서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 적당한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 다음을 포함한다: (1) 약 1㎎/㎖ 내지 25㎎/㎖ 인간 혈청 알부민을 포함하는 pH 약 7.4의 둘베코 인산 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline), (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v NaCl), (3) 5%(w/v) 덱스트로스 및 (4) 10mM 히스티딘 설페이트 pH 5.8, 6% 수크로스, 0.02% 폴리솔베이트 20.
수용성 투약 형태에 존재할 때, 동결건조된 것보다는, 항체 또는 컨쥬게이트는 약 0.1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖ 범위 밖의 광범위한 변이가 허용되지만, 전형적으로 약 0.1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖의 농도에서 제형화될 것이다. 질환의 치료를 위하여, 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트의 적절한 투약량은, 항체 또는 컨쥬게이트는 예방 또는 상기 정의된 바와 같은 치료될 질환의 유형, 치료적 목적을 위하여 투여되든 아니든 질환의 중증도 및 진행, 이전 치료의 진행, 환자의 치료에 대한 병력 및 반응, 및 주치의의 판단에 좌우될 것이다. 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트는 동시에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 적당하게 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라서, 환자 체중의 kg 당 항체 또는 컨쥬게이트 0.015 내지 25㎎은 예를 들어 하나 이상의 별개 투여에 의하여, 또는 연속 주입에 의하든 아니든 환자에게 투여를 위한 초기 후보 투약이다. 며칠 이상 동안 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라서, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투약 방법이 유용할 수 있으며 이는 배제되지 않는다.
폐 투여를 위하여, 바람직하게 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 항체 절편 또는 컨쥬게이트 조성물은 폐 또는 부비강의 더 낮은 기도에 도달하는데 효과적인 입도로 전달된다. 본 발명에 따라서, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트는 흡입에 의한 치료제의 투여를 위하여 당업계에 공지된 다양한 흡입 또는 코 장치 중 임의의 것에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포에 에어로졸화된 제형을 침적시킨 수 있는 이러한 장치는 정량 흡입기, 네뷸라이저, 건조 분말 생성기, 분무기 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 코 투여를 지시하는데 적당한 다른 장치가 또한 당업계에 알려져 있다. 이러한 장치 모두 항체를 에어로졸로 분배하기 위하여 투여에 적당한 제형을 이용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. 벤토린(Ventolin(상표명)) 정량 흡입기와 같은 정량 흡입기는 전형적으로 추진제 기체를 사용하고 흡식 동안 작동을 필요로 한다(예컨대, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). 터부헬러(Turbuhaler(상표명))(Astra), 로타헬러(Rotahaler(상표명))(Glaxo), 디스커스(Diskus(상표명))(Glaxo), 스피로스(Spiros(상표명)) 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판되는 장치, 및 스핀헬러(Spinhaler(상표명)) 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡-작동(breath-actuation)을 사용한다(미국 특허 제4,668,218호 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, 미국 특허 제5,458,135호 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 전체가 본원에 참조로 포함되어 있음). AERx(상표명)(Aradigm), 울트라벤트(Ultravent(상표명)) 네뷸라이저(Mallinckrodt) 및 아콘 II(Acorn II(상표명)) 네뷸라이저(Marquest Medical Products)와 같은 네뷸라이저(미국 특허 제5,404,871호 Aradigm, WO 97/22376, 상기 참조문헌은 전체가 본원에 참고로 포함되어 있음)는 용액으로부터 에어로졸을 생성하는 반면, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소립자 에어로졸을 생성한다. 상업적으로 입수가능한 흡입 장치의 이러한 구체적인 예는 본 발명의 실시에 적당한 구체적인 장치의 대표적인 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게 믿음직하고, 재현가능하며 정확하다. 흡입 장치는 우수한 호흡적합성을 위하여 선택적으로, 예컨대 약 10㎛ 미만, 바람직하게는 약 1~5㎛인 건조 소립자를 전달할 수 있다.
점막 표면을 통한 흡수를 위하여, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트를 투여하는 조성물 및 방법은 복수의 서브마이크론 입자, 점막 점착 고분자, 생물 활성 펩티드, 및 수성 연속상(이는 에멀젼 입자의 점막 점착을 달성함으로써 점막 표면을 통하여 흡수를 촉진함)을 포함하는 에멀젼을 포함한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀젼의 적용에 적당한 점액질 표면은 투여의 각막, 결막, 구강(buccal), 설하, 코, 질, 폐, 위, 장 및 직장 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제형, 예컨대 좌약은 부형제, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비강 내 투여용 제형은 고체일 수 있으며, 부형제로서, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 수성 또는 유성 용액의 점비액일 수 있다. 구강 투여에 있어서 부형제는 당, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 전호화분 녹말 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호).
경피 투여에 있어서, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 컨쥬게이트는 전달 장치, 예를 들어 리포좀 또는 중합체 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어(달리 언급되어 있지 않다면 집합적으로 마이크로입자로서 지칭됨)로 캡슐화된다. 폴리하이드록시산 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 이의 공중합체, 폴리오르토에스터, 폴리안하이드라이드 및 폴리포스파젠과 같은 합성 중합체, 및 천연 중합체 예를 들어 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 알기네이트 및 기타 다당류, 및 이의 조합으로 만들어지는 마이크로입자를 포함하여, 다수의 적당한 장치가 알려져 있다(미국 특허 제5,814,599호).
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허는 전체가 본원에 참조로 포함되어 있으며, 최신 기술 수준의 증거이다. 간행물은 임의의 과학적 또는 특허 공개물, 또는 모든 기록된, 전자 또는 인쇄된 형식을 포함하여 임의의 매체 형식으로 입수가능한 임의의 다른 정보를 지칭한다. 하기 참조문헌들은, 특히 본원에 기술된 바와 같은 항-CD20 항체, 절편, 컨쥬게이트, 제제, 조성물 등을 제조하는 것에 관련되는 내용에 대하여, 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow 및 Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001). 항체 및 이의 절편에 대한 다양한 언급은 또한 이의 사상 및 범주를 벗어나지 않고, 예를 들어 컨쥬게이트를 지칭하는 것으로 의미함이 당업자에게 명백하다. 이제 본 발명을 일반적으로 기술하며, 마찬가지로 특정 구체적인 실시예에 대한 언급에 의해 추가로 이해될 것이고, 실시예는 단지 예시의 목적으로 본원에 포함되어 있으며 달리 명시되어 있지 않다면 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
세포주 및 성장
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달리 지시되지 않는다면 세포주를 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내 적절한 배지, 예를 들어 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신(시약 모두 Invitrogen 제품)으로 보충한 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 1주일에 2번씩 신선한 배지로 희석함으로써 계대배양하고, 0.2 ~ 1×106 세포수/㎖로 유지하였다.
실시예 1
뮤린 CD20 항체의 생성
인간 CD20(GI 23110989)의 발현을 허용하는, XbaI 및 BamHI 제한 부위 옆에 위치하는 전체 CD20을 암호화하는 서열(CDS)를 포함하는 발현 플라스미드 pSRa-CD20을 구성하였다. Balb/c 마우스로부터 유래한 전 B 세포주인 300-19 세포를 상기 발현 플라스미드로 형질감염시켜 세포 표면 상에 높은 수준의 인간 CD20을 안정적으로 발현시키고, Balb/c VAF 마우스의 면역화에 사용하였다. 마우스는 당업자에게 공지된 표준 면역화 프로토콜, 예를 들어 ImmunoGen, Inc에서 사용된 프로토콜에 의하여 매 2~3주마다 마우스 당 대략 5×106 CD20-발현 300-19 세포를 이용하여 피하로 면역화하였다. 면역화된 마우스는 하이브리도마 생성을 위하여 희생되기 3일 전에 항원으로 부스팅시켰다. 마우스의 비장을 표준 동물 프로토콜, 예를 들어 2개의 살균한 반투명 현미경 슬라이드 사이에서 조직을 으깨서 RPMI-1640 배지 중 단일 세포 현탁액을 획득하는 것과 같은 프로토콜에 따라서 수집하였다. 비장 세포를 폴리에틸렌 글리콜-1500(Roche 783 641)을 사용하여 원심분리, 펠릿팅, 세척하고, 예를 들어 P3X63Ag8.653 세포(Kearney et al., J. Immunol., 123:1548-1550 (1979))와 같은 뮤린 골수종과 융합시켰다. 융합된 세포를 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT)(Sigma H-0262)을 포함하는 RPMI-1640 선택 배지에 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2에서 96-웰의 바닥이 평평한 배양 평판(Corning-Costar 3596, 웰 당 세포 현탁액 200㎕)에서의 성장을 위하여 선별하였다. 인큐베이션 5일 후, 배양 상청액 100㎕를 각각의 웰에서 제거하고, 하이포잔틴-티미딘(HT) 보충물(Sigma H-0137)을 포함하는 RPMI-1640 배지 100㎕로 대체하였다. 하이브리도마 클론이 항체 스크리닝을 위한 준비가 될 때까지 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션을 계속하였다. 면역화 및 하이브리도마 생성의 다른 기법, 예를 들어 문헌[Langone et al., Eds., "Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology, Academic Press, volume　121, Florida], 및 [Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988)]에 기술된 기법이 또한 사용될 수 있다.
하이브리도마 스크리닝 및 선별
하이브리도마로부터의 배양 상청액은 CD20 발현 세포, 예를 들어 CD20-발현 300-19 세포에는 결합하지만 형질감염되지 않은 300-19 세포에는 결합하지 않는 마우스 단일클론 항체의 분비에 대하여 유세포 분석기로 스크리닝하였다. 하이브리도마 상청액 100μl를 3시간 동안 CD20-발현 300-19 세포 또는 형질감염되지 않은 300-19 세포(샘플 당 1×105 세포수)와 함께 100㎕ FACS 완충액(2% 정상 염소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 원심분리, 펠릿팅, 세척하고, PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG-항체(예를 들어 Jackson Laboratory에서 획득가능한 것, FACS 완충액 중 6㎍/㎖) 100㎕와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 원심분리, 펠릿팅하고, FACS 완충액으로 세척하며, 1% 폼알데하이드를 포함한 PBS 200㎕에 재현탁시켰다. 세포를 HTS 다중웰(multiwell) 샘플러를 가지는 FACSCalibur 유세포 분석기 또는 FACS 배열 유세포 분석기를 사용하여 획득하고, CellQuest Pro(모두 BD Biosciences(미국 샌디에이고 소재) 제품임)를 사용하여 분석하였다.
양성 하이브리도마 클론을 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 유세포 분석기에 의하여 부모 세포와 CD20에 대하여 동일한 반응성을 보이는 각각의 하이브리도마로부터의 하나의 서브클론을 이후의 분석을 위하여 선택하였다. 안정적인 서브클론을 배양하고, 각각의 분비된 항-CD20 항체의 아이소타입을 상업적인 아이소타이핑 시약(Roche 1493027)을 사용하여 동정하였다.
항체 정제
항체는 표준 방법, 예를 들어 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(HiTrap Protein A 또는 G HP, 1㎖, Amersham Biosciences)를 사용하여 하이브리도마 서브클론 상청액으로부터 정제하였다. 간략하게, 상청액은 1M Tris/HCl 완충액(pH 8.0) 1/10 부피를 첨가함으로써 크로마토그래피용으로 준비하였다. pH-조절한 상청액을 0.22㎛ 여과막을 통하여 여과하고 결합 완충액(PBS, pH 7.3)으로 평형화시킨 칼럼 상에 로딩하였다. 280nm에서 흡광도가 없는 안정적인 기준선을 얻을 때까지 칼럼을 결합 완충액으로 세척하였다. 항체는 0.5㎖/분의 유속을 사용하여 0.15M NaCl을 포함하는 0.1M 아세트산 완충액(pH 2.8)으로 용출시켰다. 대략 0.25mL의 분획을 수집하고, 1M Tris/HCl(pH 8.0) 1/10 부피를 첨가함으로써 중화시켰다. 피크 분획(들)을 1×PBS에 대하여 2번 밤새 투석하고, 0.2㎛ 여과막을 통하여 여과시킴으로써 살균하였다. 정제된 항체는 A280에서 흡광도에 의해 정량화하였다.
단백질 A 정제된 분획은 뮤린 항체에 대한 4차 암모늄(Q) 크로마토그래피와 함께 이온 교환 크로마토그래피(IEX)를 사용하여 추가로 폴리싱(polishing)하였다. 간략하게, 단백질 A 정제로부터의 샘플은 결합 완충액(10mM Tris, 10mM 염화나트륨, pH 8.0)으로 버퍼를 교환하고, 0.22㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 그 다음 준비한 샘플을 120㎝/hr의 유속에서 결합 완충액으로 평형화시킨 Q 빠른 흐름 수지(Q fast flow resin, GE Lifesciences) 상에 로딩하였다. 칼럼 크기는 샘플 중의 모든 MAb에 결합하기에 충분한 능력을 가지도록 선택하였다. 그 다음 280nm에서 흡광도가 없는 안정적인 기준선을 얻을 때까지 칼럼을 결합 완충액으로 세척하였다. 항체는 20 칼럼 부피(CV)에서 구배를 10mM 내지 500mM 염화나트륨으로 개시함으로써 용출시켰다. 피크 분획은 280nm에서(A280) 흡광도 측정에 기초하여 수집하였다. 단량체의 백분율은, Agilent HPLC 1100 시스템(Agilent, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)을 사용하여 SWXL 가드 칼럼(guard column), 6.0 × 40 mm(Tosoh Bioscience, 미국 펜실베니아주 몽고베리빌 소재)가 있는 TSK 겔 G3000SWXL, 7.8 ×300mm 상에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 평가하였다. 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획을 모으고, TFF 시스템을 사용하여 완충액을 PBS(pH 7.4)로 교환하였으며, 0.2㎛ 여과막을 통하여 여과시킴으로써 살균하였다. 정제된 항체의 IgG 농도는 흡광 계수 1.47을 사용하여 A280에 의해 결정하였다. 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT)와 같은 대안적인 방법이 또한 우수한 선택성을 가지는 항체를 폴리싱하는데 사용되었다. 입도가 40㎛인 II형 CHT 수지(Bio-Rad Laboratories)가 IEX 크로마토그래피에 대하여 기술된 바와 동일한 프로토콜을 가지고 사용되었다. CHT에 대한 결합 완충액은 20mM 인산나트륨(pH 7.0)에 해당하고, 항체는 20CV에 대하여 20~160mM 인산나트륨의 구배로 용출시켰다.
실시예 2
유세포 분석기에 의한 결합 특징화
결합 특이성은 정제된 항체를 사용하여 유세포 분석기에 의해 시험하였다. CD20-발현 300-19 세포에 대한 muCD20-7 및 muCD20-6의 결합을 나타내는 FACS 히스토그램 및 부모 300-19 세포에의 결합 부재는 도 1에 나타내어져 있다. muCD20-7 또는 muCD20-6은 3시간 동안 CD20-발현 300-19 세포 또는 형질감염되지 않은 300-19 세포(샘플 당 1×105 세포수)와 함께 100㎕ FACS 완충액(2% 정상 염소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 펠릿팅, 세척하고, FITC-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG-항체(예를 들어 Jackson Laboratory에서 획득가능한 것, FACS 완충액 중 6㎍/㎖) 100㎕와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 펠릿팅하고, FACS 완충액으로 세척하며, 1% 폼알데하이드를 포함한 PBS 200㎕에 재현탁시켰다. 샘플을 HTS 다중웰(multiwell) 샘플러를 가지는 FACSCalibur 유세포 분석기 또는 FACS 배열 유세포 분석기를 사용하여 획득하고, CellQuest Pro(모두 BD Biosciences(미국 샌디에이고 소재) 제품임)를 사용하여 분석하였다.
muCD20-7 또는 muCD20-6과 함께 인큐베이션한 CD20-발현 300-19 세포의 FACS 히스토그램은 형광 편이(shift)를 나타낸 반면, 부모 300-19 세포는 그렇지 않았다(도 1). 또한, 어떤 세포주도 오직 FITC-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG-항체만과 인큐베이션하였을 때 유의한 형광 편이가 검출되지 않았다(도 1 하단).
형광 편이는 또한 BJAB 림프종 세포를 muCD20-7 또는 muCD20-6과 함께 인큐베이션하였을 때 관찰되었다(도 2). BJAB 세포는 다양한 농도의 muCD20-7 또는 muCD20-6항체와 함께 인큐베이션하였고, 유세포 분석법에 대하여 상기 기술한 바와 같이 처리하였다. 데이터 분석은 CellQuest Pro(BD Biosciences, 미국 샌디에이고 소재)를 사용하여 실행하였으며, 각각의 샘플에 대하여 FL1(MFI)에 대한 평균 형광 강도를 내보내어 반-대수(semi-log) 플롯으로 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. 투여량-반응 곡선은 비선형 회귀에 의해 생성되었고, BJAB 세포에의 결합에 대한 muCD20-7 또는 muCD20-6의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 GraphPad Prism v4(GraphPad software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 계산하였으며, 이는 각각 0.3nM 또는 0.4nM에 해당한다.
실시예 3
뮤린 항- CD20 항체의 프로아포토시스 활성
항-CD20 항체 muCD20-2, muCD20-6 및 muCD20-7은 림프종 세포주의 아포토시스를 유도하였다. 아포토시스의 정도는 아넥신-V(Invitrogen)의 FITC 컨쥬게이트 및 TO-PRO(등록상표)-3(Invitrogen)으로 염색한 후 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 건강하고 정상인 세포에서, 포스파티딜세린은 막 이중층의 내부에 있고, 원형질막의 내부에서 외부 소엽으로 포스파티딜세린의 전위는 가장 일찍 검출가능한 아포토시스의 신호 중 하나이다. 아넥신 V는 온전한 세포의 세포막 이중층의 외부의 포스파티딜세린에 결합하지만 내부의 포스파티딜세린에는 결합하지 않는다. 그러므로 아넥신 V의 결합 정도는 아포토시스 유도의 지표이다. TO-PRO(등록상표)-3은 막 완결성(membrane integrity)이 아포토시스의 후기 단계에 일어나는 것과 같이 파괴되어 단지 원형질막을 관통할 수 있는 단량체 시아닌 핵산 염료이다. 세포의 3가지 집단이 2색 유세포 분석법으로 구별될 수 있다: 아포토시스가 아닌 세포(아넥신-V 음성 및 TO-PRO(등록상표)-3 음성), 초기 아포토시스 세포(아넥신-V 양성 및 TO-PRO(등록상표)-3 음성) 및 괴사 세포 또는 후기 아포토시스 세포(아넥신-V 양성 및 TO-PRO(등록상표)-3 양성).
기하급수적으로 성장한 세포는 24-웰 플레이트에서 10% 소태아 혈청(FBS), 2mM L 글루타민, 및 50㎍/㎖ 겐타마이신으로 보충한 RMPI-1640 배지(하기 완전한 RMPI-1640 배지로서 나타냄)에 약 2×105 세포수/㎖로 도말(plating)하였다. 달리 언급되지 않는다면, 세포는 일반적으로 완전한 RMPI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 20~24시간 동안 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 항-CD20 항체 10nM과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 펠릿팅하고, 500㎕ PBS로 2번 세척하였으며, 100㎕ 결합 완충액(10mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2)에 재현탁시키고, 아넥신 V-FITC 5㎕로 얼음 상에서 15분 동안 염색하였다. 그 다음, 결합 완충액 400㎕ 및 TO-PRO(등록상표)-3 1μM을 혼합물에 첨가하고, FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3의 세포-결합 형광을 유세포 분석기로 즉시 측정하였다. 5000가지 경우를 각각의 샘플에 대하여 수집하였다. TO-PRO(등록상표)-3(FL4-H; y-축)의 형광 및 아넥신 V-FITC(FL1-H; x-축)에 대한 도트 플롯을 BD CellQuest 소프트웨어를 사용하여 생성하였다.
아넥신-V 양성 세포(TO-PRO(등록상표)-3 양성 및 음성 세포 둘 다 포함함)의 백분율을 이들 플롯으로부터 각각의 샘플에 대하여 결정하였으며 이는 도 3에 나타내어져 있다. 본 발명자들의 항체 스크린으로부터 분리된 몇몇 항체는 프로아포토시스 활성에 대하여 리툭시맙과 비교하여 시험하였다. 미처리 세포의 약 5%만이 아넥신-V 양성인 것과 비교하여, muCD20-6, muCD20-7 또는 muCD20-2에 노출된 Ramos 세포의 70% 초과는 아넥신-V 양성이었다. 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 단지 13%만을 아넥신-V 양성 세포로 만들었다. 유사하게, 항체 muCD20-5를 이용한 처리는 12%를 아넥신-V 양성 세포로 만들었다.
마찬가지로, 미처리 세포의 5%가 아넥신-V 양성인 것과 비교하여, muCD20-7 또는 muCD20-2를 이용하여 처리된 Raji 세포의 60% 초과가 아넥신-V 양성 세포였다. 이러한 예상치 못한 활성은 이전에 분리된 II형 항체이며, 42%를 아넥신-V 양성 세포로 만드는 B1의 활성보다 훨씬 더 강하다. 리툭시맙과 함께 인큐베이션하면 14%가 아넥신-V 양성 세포로 되었다. muCD20-5 항체는 미처리 세포와 비교하여 보다 높은 백분율의 아넥신-V 양성 세포를 유도하지 않았다.
실시예 4
지질뗏목
항체 결합 후 지질뗏목으로 CD20의 재조직화는 효과적으로 보체 인자를 모집하고 CDC 활성을 유도하는 항체의 능력과 관련이 있었다. 지질뗏목으로 항체 유도된 CD20 재분배의 측정으로서, 본 발명자들은 상기한 문헌[Cragg et al. (2003)]으로부터 변형된 유세포 분석에 기초한 방법을 이용하였다. 본 분석법의 원리는 저온에서 지질뗏목 구획의 TritonX-100 불용성을 기초로 한다.
세포는 원심분리에 의해 수확하며, 1%　BSA가 있는 RPMI-1640에서 세척하고 재현탁시켰다. 2.5×106 세포수로 세포 0.2㎖를 이중으로 각각의 분석에 대하여 사용하였다. 항-CD20 항체를 10㎍/㎖로 첨가하고 샘플을 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 원심분리하고, 2번 세척하며 FACS 완충액(1×PBS, 1% BSA, 20mM Na-아자이드) 0.2㎖에 재현탁시켰다. 샘플을 얼음 상에서 차게 하고, 이때부터 차갑게 유지하였다. 항체 처리에 응하여 지질뗏목과 결합된 항원의 분획물을 검출하기 위하여, 샘플을 0.5% 트리톤X-100과 함께 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체의 전체 양을 검출하기 위하여, 샘플을 얼음 상에 15분 동안 그대로 두었다. 샘플을 FACS 완충액으로 2번 세척하였고, 1:200으로 희석된 FITC-결합된 염소 항-마우스-Ab를 이용하여 1시간 동안 얼음 상에서 염색하였다. 샘플을 원심분리하고, FACS 완충액으로 2번 세척하였으며, 고정을 위해 200㎕ PBS, 1% 폼알데하이드 중에 세포를 재현탁시켰다. 샘플을 유세포 분석기에 의해 획득하여 FL-1의 평균으로서 항-CD20 항체 결합을 결정하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 트리톤X-100 인큐베이션의 부재 하(미처리) 또는 존재 하(트리톤 처리)에서 각각의 샘플에 대하여 도 4에 플롯팅되어 있다.
본 발명자들은, 대조군으로서 트리톤X-100 불용성 지질뗏목으로 CD20을 효율적으로 전위시키는 것으로 이미 밝혀진 I형 항체의 예인 리툭시맙을 사용하였다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 처리된 세포는 트리톤X-100 처리가 있는 경우와 트리톤X-100 처리가 없는 경우에 동일한 수준의 형광을 나타낸다. 반대로, muCD20-2로 염색된 세포의 MFI는 트리톤X-100 처리가 없는 경우보다 트리톤X-100 처리가 있는 경우에 훨씬 더 낮다. 이는, 앞서 기술된 II형 CD20 항체의 특징적인 특성인 지질뗏목으로 CD20을 재분배하는 muCD20-2의 무능력과 일관된다. 현저하게, muCD20-7로 염색된 세포의 MFI는 트리톤X-100 처리가 있는 경우 또는 없는 경우와 유사하다. 추가로, 본 발명자들은 또한 지질뗏목 활성의 muCD20-5 및 muCD20-6 항체를 시험하였다. muCD20-7에 대하여 보여지는 바와 같이, muCD20-5 또는 muCD20-6으로 염색한 세포의 MFI는 트리톤X-100 처리가 있는 경우 또는 없는 경우와 유사하다. 이러한 데이터는, 리툭시맙과 같이 muCD20-5, muCD20-6 및 muCD20-7이 림프종 세포막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있음을 나타낸다. 아넥신-V 분석법으로부터의 결과와 함께 취하면, 이는 muCD20-2가 II형 항체의 특징을 가짐을 입증한다. 이는 아포토시스를 강하게 유도할 수 있지만, 지질뗏목으로 CD20을 재분배를 시킬 수 없다. 반대로, muCD20-5는 I형 항체의 특징을 가진다. 이는 지질뗏목으로 CD20을 재분배시킬 수 있지만, 프로아포토시스 활성을 가지지 않는다.
이러한 놀라운 결과는 muCD20-6 및 muCD20-7이 기능적인 특성의 특유하고 예상치 못한 조합을 가짐을 입증한다: 이것들은 I형 항체의 지질뗏목 활성 및 II형 항체에 대하여 전형적으로 나타나는 강한 프로아포토시스 활성을 모두 가진다.
실시예 5
CD20 -7 및 CD20 -6 항체의 VL 및 VH 영역의 클로닝 및 서열결정
전체 세포 RNA는 RNeasy 키트(QIAgen)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 CD20-7 및 CD20-6 하이브리도마의 5×106 세포로부터 제조하였다. 이후에 cDNA를 SuperScript II cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 전체 RNA로부터 합성하였다.
하이브리도마 세포로부터 유래한 cDNA 상의 제1 라운드 축퇴성 PCR 반응 동안의 절차는 문헌[Wang et al., (2000) J Immunol Methods. Jan 13;233(1-2):167-77] 및 [Co et al., (1992) J Immunol. Feb 15;148(4):1149-54)]에 기술된 방법을 기초로 하였다. VH 서열은 다음의 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다: EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(서열번호 37), EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(서열번호 48) 및 BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (서열번호 38). VL 서열은 다음의 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(서열번호 39) 및 HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(서열번호 40). (혼합된 염기는 다음과 같이 정의된다: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T).
그 다음 PCR 반응 혼합은 1% 저융점 아가로스 겔 상에서 실행되며, 300 내지 400bp의 밴드를 잘라내고, Zymo DNA 미니 칼럼을 사용하여 정제하며, 서열결정을 위하여 Agencourt Biosciences로 보냈다. 각각의 5' 및 3' PCR 프라이머를 서열결정 프라이머로서 사용하여 양 방향으로부터 가변 영역 cDNA를 생성하였다. VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 DNA 서열결정 결과로부터 추론하였다.
예비 cDNA 서열은, 항체 서열이 유래한 뮤린 생식세포계열 서열에 대한 NCBI IgBlast 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 검색하는데 사용하였다. 그 다음 PCR 프라이머는, 새로운 PCR 반응이 PCR 프라이머에 의해 변경되지 않는 완전한 가변 영역 cDNA 서열을 생성하도록 뮤린 항체의 생식세포계열이 연결된 리더 서열에 어닐링하도록 설계하였다. 추가로, RACE PCR 방법은 상기한 Co et al.의 문헌에 기술된 바와 같이 실행하여 CD20-7 중쇄의 완전 가변 영역 서열을 서열결정하였다. PCR 반응, 밴드 정제, 및 서열결정은 상기 기술된 바와 같이 실행하였다.
서열 확인을 위한 질량 결정
가변 영역에 대한 cDNA 서열 정보를 생식세포계열의 불변 영역 서열과 조합하여 전장 항체 cDNA 서열을 얻었다. 그 다음 중쇄 및 경쇄의 분자량을 계산하고, 뮤린 CD20-7 및 CD20-6 항체의 LC/MS 분석에 의하여 얻은 분자량과 비교하였다. 분자량 측정값은 CD20-7 및 CD20-6 경쇄 및 중쇄 둘 다에 대한 cDNA 서열과 일관된다.
키메라화
경쇄 가변 영역에 대한 가변 서열은 pchCD20-7LCZ 플라스미드 내 EcoRI 및 BsiWI 부위로 클로닝한다. 중쇄 가변 영역은 pchCD20-7HCN 플라스미드 내 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝한다. 동등한 플라스미드를 chCD20-2, chCD20-9에 대하여 구성하였다. 이들 플라스미드는 표준 인산칼슘 절차(BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312)를 사용하여 HEK-293T 세포에서 키메라 항체를 발현시키는데 사용하였다. 상청액을 상기 기술된 바와 같이 표준 단백질 A 크로마토그래피 절차를 사용하여 정제하였으나, 폴리싱 크로마토그래피 단계는 카복시메틸(CM) 빠른 흐름 이온 교환(IEX) 수지(GE Lifesciences) 및 10mM 인산칼륨, 10mM 염화나트륨 결합 완충액(pH 7.5), 또는 상기 기술된 대안적인 CHT 방법을 사용하여 실행하였다.
실시예 6
키메라 D20 -7의 프로아포토시스 활성
Ramos 세포 상에서 아포토시스를 유도하는 키메라 항체의 능력은 상기 실시예에서 뮤린 항체에 대하여 기술된 바와 같이 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3 염색을 사용하여 측정하였다. 각각의 키메라 항체 10nM을 Ramos 세포와 함께 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신-V 염색 및 유세포 분석법을 실시하였으며, 그 결과는 도 5에 제시되어 있다. 미처리 샘플에서 단지 11%만 아넥신-V 양성 세포이었던 것과 비교하여, chCD20-7 처리는 59%를 아넥신-V 양성 세포로 만들었다. chCD20-2 처리는 43%를 아넥신-V 양성 세포로 유도한 반면, 리툭시맙 처리는 미처리 세포와 유사한 수준의 아넥신-V 염색을 초래하였다. 그러므로, CD20-7은 키메라 후에 Ramos 세포에서 강한 아포토시스를 유래하는 현저한 능력을 유지하였다.
키메라 CD20 -7의 CDC 활성
키메라 항-CD20 항체의 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 평가하기 위하여, 세포를 기초로 한 분석을 공개된 방법(Gazzano-Santoro, J. Immunol . Methods , 202(2):163-171 (1997))에 따라서 실행하였다. 항체를 RHBP(RPMI-1640, 20mM HEPES, 0.1% BSA, 1% 페니실린-스트렙토마이신) 배지 중 전형적으로 5㎍/㎖(= 3.3×10-8M) 내지 2.3ng/㎖(= 1.5×10-11M)의 범위인 다양한 농도에서 평평한 바닥의 96-웰 조직 배양 플레이트에 50㎕/웰로 이중으로 나누어 넣었다. 표적 세포를 웰 당 RHBP 배지 100㎕ 중 5×104 세포수로 항체에 첨가하였다. 동결건조된 인간 보체(Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스 소재)를 바이알 당 1㎖ 살균 정제된 물과 함께 재구성하고, 사용 직전에 RHBP 배지를 이용하여 20% 저장액(stock)으로 5배 희석하였다.보체 용액을 50㎕/웰로 최종 농도 5%가 되도록 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 37℃, 5% CO2의 습한 인큐베이터에서 인큐베이션하여 보체 매개 융해가 일어나게 하였다. 인큐베이션 시간 후에, Alamar Blue 시약(Invitrogen)을 최종 농도가 10%가 되도록 각각의 웰에 첨가하여 남아있는 세포의 생존력을 측정하였다. EX540/EM590nm에서 형광을 측정(상대적 형광 단위(RFU)로 나타내)하기 전에 플레이트를 16 내지 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 대조군은 배지와 보체는 포함하지만 세포는 포함하지 않는 웰(배지만 있음, 생존력 0%) 및 세포와 보체는 포함하지만 항체는 포함하지 않는 웰(세포만 있음, 생존력 100%)의 3중 웰을 포함하였다. 각각의 샘플에 대한 구체적인 세포 생존력의 백분율은 다음의 식으로 결정하였다: 생존력 백분율 = (샘플 - 배지 단독)/(세포 단독 - 배지 단독).
현저하게, chCD20-7 항체는 표 6에 나타낸 바와 같이 Daudi 및 WSU-DLCL-2 림프종 세포 둘 다에 대하여 리툭시맙과 유사한 CDC 활성을 가졌다. chCD20-7은 EC50이 Daudi 세포에 대하여 1.0nM이고 WSU-DLCL-2 세포에 대하여 2.2nM인 2가지 세포주 모두에서 세포 생존력을 완전히 감소시켰다. 리툭시맙은 EC50이 Daudi 세포에 대하여 1.1nM이고 WSU-DLCL-2 세포에 대하여 2.8nM인 CDC 활성을 가졌다. 전형적인 II형 항체에 대하여 예상된 바와 같이, chCD20-2는 Daudi 또는 WSU-DLCL-2 세포 어느 것에 대하여 CDC 활성을 가지지 않았다.
실시예 7
항체 인간화
CD20-7 항체는 앞서 기술된 재표면화 방법, 예를 들어 문헌[Roguska et al., Proc . Natl. Acad . Sci ., USA, 91(3):969-973 (1994)] 및 [Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)]에 따라 인간화하였으며, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 재표면화는 일반적으로 경쇄 및 중쇄에서 가변 영역 표면 잔기의 동정 및 상기 잔기를 인간 동등물로 대체하는 것을 수반한다. 예시적인 CDR은 표 1에 나타낸 바와 같이 한정된다.
예시적인 재표면화 CD20 -7 CDR
경쇄
CDR1: R A S G S V D S F G N S F M H (서열번호 17)
CDR2: R A S N L E S (서열번호 18)
CDR3: Q Q S Y E D P F T (서열번호 19)
중쇄
CDR1: N Y G M N (서열번호 20)
CDR2: W I N T Y T G E P S (서열번호 21)
CDR3: G A Y Y R Y D L G M D Y (서열번호 22)
Kabat 한정된 CD20 -7 HC CDR2
뮤린 HC CDR2: W I N T Y T G E P S Y A D D F K G (서열번호 23)
인간 HC CDR2: W I N T Y T G E P S Y A A P F K G (서열번호 24)
재표면화에 대하여 정의된 바와 같이 CD20-7 경쇄 및 중쇄 CDR은 표 1에 예로 주어져 있다. 중쇄 CDR2에 대한 Kabat 정의는 또한 뮤린 및 인간 CD20-7 둘 다에 대하여 주어져 있다. 밑줄친 서열은 재표면화를 위한 CDR로 여겨지지 않는 Kabat 중쇄 CDR2의 부분을 표시한다.
표면 잔기 위치는 상대적인 접근가능성이 30% 이상인 임의의 위치로서 정의된다(Pedersen et al., J. Mol . Biol ., 235(3):959-973 (1994)). 표면 잔기는 가장 상동성인 인간 표면 서열을 동정하는 인간 생식세포계열 표면 서열과 함께 정렬된다. CD20-7에 대하여, 대체 서열로서 사용된 인간 생식세포계열 서열은 VL 및 VH 각각에 대하여 IGKV7-3*01 및 IGHV3-15*04이었다. 도 7의 목록으로부터 알 수 있는 바와 같이, 경쇄의 4개 표면 잔기 및 중쇄의 9개 표면 잔기 모두 인간 대응물로 대체하였다. 중쇄 잔기 S28은 CDR-H1에 아주 근접하여 있고, 인간 T28로의 치환은 결합 친화도의 감소를 초래할 수 있으므로, 뮤린 S28 잔기가 유지되는 제2 재표면화된 형태가 생성되었다. 도 8은 뮤린 대응물과 함께 경쇄 및 중쇄 모두의 CD20-7 가변 도메인에 대하여 재표면화된 서열의 정렬을 나타낸다.
huCD20 -7 항체의 재조합 발현
huCD20-7에 대한 가변 영역 서열은 Blue Heron Biotechnology에 의해 코돈-최적화되고 합성하였다. 서열은 단일 사슬 포유동물 발현 플라스미드에서 각각의 불변 서열과 함께 인프레임(in-frame) 클로닝을 위한 제한 효소 부위가 옆에 위치한다. 경쇄 가변 영역은 phCD20-7LCZ 플라스미드 내 EcoRI 및 BsiWI 부위로 클로닝한다. 중쇄 가변 영역은 phCD20-7HCN 플라스미드 내 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝한다. 이들 플라스미드는 포유동물 세포에서 일시적 또는 안정적인 형질감염에서 huCD20-7을 발현하는데 사용될 수 있다. HEK-293T 세포에서 huCD20-7을 발현하는 일시적인 형질감염은 변형된 PEI 절차를 사용하여 실행하였다(Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30(2):E9 (2002)). 상청액은 키메라화된 항체에 대하여 상기 기술된 바와 같이 표준 절차를 사용하여 단백질 A 및 폴리싱 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다.
참조 항체의 발현
huCD20-7의 항체를 비교하기 위하여, 앞서 동정된 항-CD20 항체를 클로닝하고 발현하였다. 2F2 항체(오파투무맙)의 HC 및 LC 가변 영역에 대한 아미노산 서열은, HC 가변 영역에 대하여 WO 2004/035607의 서열번호 2 및 LC 가변 영역에 대하여 WO 2004/035607의 서열번호 4를 사용하여 WO 2004/035607(Teeling et al. (2004), 상기함)로부터 유래하였다. 또한, GA101 항체의 HC 및 LC 가변 영역에 대한 아미노산 서열(아푸투주맙에 대한 기초)은 WO 2005/0448959로부터 유래하였다(Umana, 미국 특허 제5,639,641호(2005)). 기술된 B-HH6 구조체에 해당하는 WO 2005/0448959의 서열번호 40은 HC 가변 영역에 대하여 사용하였고, 기술된 B-KV1 구조체에 해당하는 WO 2005/0448959의 서열번호 76은 LC 가변 영역에 사용하였다.
항체 모두에 대한 가변 영역 서열은 Blue Heron Biotechnology에 의해 코돈-최적화되고 합성하였다. 서열은 단일 사슬 포유동물 발현 플라스미드에서 각각의 불변 서열과 함께 인프레임(in-frame) 클로닝을 위한 제한 효소 부위가 옆에 위치한다. 클로닝, 발현 및 정제는 상기 huCD20-7에 대하여 기술된 바와 같이 수행하였다. 생성된 GA101-F 항체는 불변 영역에서 전형적인 푸코실화를 나타내고, 따라서 아푸투주맙에 사용된 탈푸코실화 형태가 아니다.
실시예 8
huCD20 -7의 결합 친화도
BJAB 세포 및 muCD20-7, chCD20-7 또는 huCD20-7 항체를 사용하여 유세포 분석 결합 분석법을 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하고 분석하였다. 도 9는 각각의 항체에 대하여 비선형 회귀에 의해 생성된 투여량-반응 곡선을 나타낸다. 각각의 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 GraphPad Prism v4(GraphPad software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 계산하였다. muCD20-7, chCD20-7 및 huCD20-7에 대한 Kd는 각각 0.4nM, 0.5nM 및 0.5nM에 해당하므로, 키메라화 또는 인간화는 CD20-7의 결합 친화도에 영향을 미치지 않았다.
ELISA 에 의한 결합 특징화
미정제 세포 융해물은 WSU-DLCL-2 세포(예컨대, CD20 항원의 공급원)로부터 제조하여 ELISA에 의해 결합 친화도를 측정하였다. WSU-DLCL-2 세포는 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내 롤러 병 중 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(시약 모두 Invitrogen 제품)으로 보충한 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고 세포 펠릿을 차가운 1×PBS로 2번 세척한 후, 용해 완충액(50mM Tris, pH 8, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜산나트륨, 25mM 옥틸글루코사이드)에서 융해하였다. 1㎖ 부피의 융해 완충액을 수확한 1×107 세포의 융해에 사용하였다. 세포 융해물을 22게이지 주사기 바늘을 10번 통과시킴으로써 균질화시켰고, 융해물을 45분 동안 4℃에서 회전시켰다. 상철액을 0.22마이크론 필터를 통하여 연과하고,분취하며, 액체 질소로 급속 냉동하고, -80℃에서 보관하였다. 전체 단백질 농도는 BCA 분석법(예컨대, Micro BCA Protein Assay Kit, PIERCE, US)에 의해 측정한다.
ELISA 실험을 위하여, 융해물 제조물을 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6)중의 전체 단백질 5㎍/㎖로 희석하고, 100㎕/웰로 18 내지 24시간 동안 4℃에서 Immulon 2HB 플레이트 상에 코팅하였다. 그 다음 플레이트를 세척 완충액(TBST: 0.1% Tween-20/TBS, pH 7.4)으로 200㎕/웰로 3번 세척하였다. 플레이트는 차단 완충액(1% 카세인/TBS, pH 7.4) 200㎕/웰로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하였고, 그 다음 항체의 계열 희석물을 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 그 다음 이전과 같이 세척하였다. 차단 완충액 중 염소-항-인간 HRP의 1:5,000 희석물을 2차 항체로서 100㎕/웰로 첨가하였으며, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 그 다음 TMB1 기질(BioFX) 100㎕/웰을 첨가하였다. 반응은 20분 동안 진행시킨 후, 450nm 정지 시약(BioFX) 100㎕/웰로 퀀칭하였다. 450nm에서 흡광도를 판독하고 각각의 샘플에 있어서 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. S자형의 투여량-반응 곡선은 GraphPad Prism v4(GraphPad 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 결합 곡선에 대하여 일치시켰다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 10에 나타낸 huCD20-7 에 대한 결합 곡선으로부터 계산하였으며, 0.8nM에 해당한다.
실시예 9
mu 및 huCD20 - 7의프로아포토시스 활성
huCD20-7의 프로아포토시스 활성을 muCD20-7의 활성과 비교하였다. Ramos 세포를 muCD20-7, huCD20-7 또는 huIgG 아이소타입 대조군 항체의 10nM, 1nM 또는 0.1nM 농도로 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 각각의 농도에 대하여 부모 아넥신-V 양성 세포는 도 11에 나타나 있다. huCD20-7은 muCD20-7의 강한 프로아포토시스 활성을 유지하였다. 아이소타입 대조군으로 처리된 세포의 6%가 아넥신-V 양성인 것과 비교하여, 어떤 항체 10nM로 처리한 후 Ramos 세포의 대략 60%가 아넥신-V 양성이다.
huCD20 -7의 프로아포토시스 활성
Ramos 세포에 대한 huCD20-7의프로아포토시스 활성은 다른 CD20 항체와 비교하였다. 리툭시맙 및 2F2는 앞서 기술된 한정된 프로아포토시스 활성을 가지는 I형 항체인 반면, GA101 및 B1은 공지된 강한 프로아포토시스 활성을 가지는 II형 항체이다. "B1"은 벡사(상표명)(Coulter)의 비표지화된 형태에 해당하는 반면; "GA101-F"는 아푸투주맙 또는 GA101(Roche)의 푸코실화된 형태에 해당하고; "2F2"는 오파투무맙(Genmab)에 해당한다. 상이한 양의 각각의 항체를 Ramos 세포와 20시간 인큐베이션한 후, 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율은 도 12에 반-대수 플롯으로 항체 농도에 대하여 플롯팅하였고, EC50 값은 비선형 회귀 분석을 사용하여 일치시킨 곡선으로부터 계산하였다. huCD20-7은 아넥신-V 양성 세포의 최대 백분율이 50%이고 EC50가 0.2nM인 가장 강한 프로아포토시스 효과를 가진다. EC50가 0.8nM이면서 34%를 아넥신-V 양성 세포로 만드는 B1은 훨씬 더 강력하다. GA101-F는 덜 효과적이며 EC50이 1.7nM이면서 22%를 아넥신-V 양성 세포로 만든다. 리툭시맙은 Ramos 세포의 아포토시스에 대하여 한정된 영향을 미치며, EC50가 1.7nM이면서 12%를 아넥신-V 양성 세포로 만든다. 2F2 처리된 샘플 및 미처리된 샘플 모두 2F2는 Ramos 세포의 아포토시스를 유도하지 않음을 나타내는 2%의 아넥신-V 양성 세포를 포함한다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, B1에 의해 32%, GA101-F에 의해 20% 및 리툭시맙에 의해 10%가 유도된 것과 비교하여, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 48%의 아넥신-V 양성 Ramos 세포에 해당한다.
세포주 패널에 대한 프로아포토시스 활성
GA101-F의 프로아포토시스 활성은 확장된 세포주 패널에 대하여 리툭시맙과 B1과 추가로 비교하였다. 각각의 세포주는 huCD20-7 또는 리툭시맙 10nM 또는 1.5㎍/㎖와 함께 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율은 각각의 항체 및 미처리 샘플에 대하여 플롯팅하였고, 이는 13A~13E에 제시되어 있다. huCD20-7 항체는 Ramos 및 Raji 림프종 세포주에서 리툭시맙 및 B1보다 더 활성적이었다. huCD20-7은 B1에 대하여 29%, 리툭시맙에 대하여 9%, 미처리 세포에 대하여 6%인 것과 비교하여 Ramos 림프종 세포에서 60%의 아넥신-V 양성 Ramos 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, B1에 의해 23% 및 리툭시맙에 의해 3%가 유도된 것과 비교하여, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 54%의 아넥신-V 양성 Ramos 세포에 해당한다. huCD20-7은 B1에 대하여 42%, 리툭시맙에 대하여 14%, 미처리 세포에 대하여 5%인 것과 비교하여 Raji 림프종 세포에서 58%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, B1에 의해 37% 및 리툭시맙에 의해 9%가 유도된 것과 비교하여, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 53%의 아넥신-V 양성 Raji 세포에 해당한다. 추가로, huCD20-7은 리툭시맙에 대하여 26%, 미처리 세포에 대하여 5%인 것과 비교하여 WSU-DLCL-2 DLBCL 세포에서 39%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 34%의 아넥신-V 양성 WSU-DLCL-2 세포에 해당하며, 리툭시맙에 의해서는 21%가 유도된다. huCD20-7은 리툭시맙에 대하여 9%, 미처리 세포에 대하여 8%인 것과 비교하여 Jeko-1 MCL 세포에서 20%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 12%의 아넥신-V 양성 Jeko-1 세포에 해당하며, 리툭시맙에 의해서는 단지 1%가 유도된다. 마지막으로, huCD20-7은 리툭시맙에 대하여 23%, 미처리 세포에 대하여 18%인 것과 비교하여 Granta-519 MCL 세포에서 58%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 40%의 아넥신-V 양성 Granta-519 세포에 해당하며, 리툭시맙에 의해서는 단지 5%가 유도된다.
실시예 10
인간 항체를 사용한 지질뗏목 분석
Ramos 세포에 대한 지질뗏목 분석은 다른 CD20 항체와 비교하여 상기 기술된 바와 같이 huCD20-7에 대하여 수행하였다. 리툭시맙 및 2F2는 앞서 기술된 지질뗏목 활성을 가지는 I형 항체인 반면, GA101-F 및 B1 은 지질뗏목 활성이 없고 따라서 CDC 활성이 없는 II형 항체이다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 및 2F2 처리된 세포는 트리톤X-100 처리가 있는 경우와 트리톤X-100 처리가 없는 경우에 동일한 수준의 형광을 나타낸다(도 14). 반대로, B1 또는 GA101-F로 염색된 세포의 평균 형광은 지질뗏목으로 CD20을 재분배하는 B1 및 GA101-F의 무능력과 일관되게 트리톤X-100 처리가 없는 경우보다 트리톤X-100 처리가 있는 경우에 훨씬 더 낮다. 현저하게, huCD20-7로 염색된 세포의 평균 형광은 트리톤X-100 처리가 있는 경우 또는 없는 경우와 유사하다. 따라서, 리툭시맙 및 2F2와 같이 huCD20-7은 B 세포 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다.
huCD20 -7의 CDC 활성
리툭시맙 및 GA101-F와 비교하여 huCD20-7의 CDC 활성을 실시예 6에서 키메라 항체에 대하여 기술된 바와 같이 측정하였다. 현저하게, huCD20-7 항체는 도 15A에 나타낸 바와 같이 Daudi 림프종 세포에 대하여 리툭시맙과 유사한 CDC 활성을 가졌다. 리툭시맙 또는 huCD20-7 처리는 EC50이 각각 0.23 및 0.25㎍/㎖이어서 Daudi 세포 생존력을 완전히 감소시켰다. 예상된 바와 같이, 전형적인 II형 항체인 GA101-F는 Daudi 세포에 대하여 어떠한 CDC 활성을 보이지 않았다. 유사한 결과가 도 15B에 나타낸 바와 같이 Ramos 림프종 세포에서도 보여졌다. 리툭시맙 또는 huCD20-7 처리는 EC50이 각각 0.09 및 0.014㎍/㎖이어서 Ramos 세포 생존력을 완전히 감소시켰다. 예상된 바와 같이, 전형적인 II형 항체인 GA101-F는 Ramos 세포에 대하여 최소한의 CDC 활성을 가졌다.
추가로, huCD20-7은 WSU-DLCL-2 및 RL 림프종 세포에 대하여 리툭시맙 보다 더 강력한 CDC 활성을 가졌다. 리툭시맙은 EC50이 1.9㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 WSU-DLCL-2 세포의 세포 생존력을 34%로 감소시켰다. 반대로, huCD20-7은 EC50이 0.58㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 WSU-DLCL-2 세포의 세포 생존력을 11%로 감소시켰다(도 16A). 리툭시맙은 EC50이 4.3㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 RL 세포의 세포 생존력을 56%로 중간 정도로 감소시켰다. 반대로, huCD20-7은 EC50이 훨씬 더 낮은 0.67㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 RL 세포의 세포 생존력을 11%로 보다 더 완전히 감소시켰다(도 16B).
실시예 11
huCD20 -7의 ADCC 활성
락테이트 데하이드로게나아제(LDH) 방출 분석은 효과기 세포로서 새롭게 분리된 인간 자연 살생 세포(NK) 세포를 사용하여 종양 세포주의 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC)를 측정하는데 사용하였다(예컨대, Shields, J. Biol . Chem ., 276(9):6591-6604 (2001)). NK 세포는 NK Isolation Kit II(Miltenyi Biotech, 130-091-152)에 대한 변형된 프로토콜을 사용하여 먼저 정상 공여자(Research Blood Components, Inc., Brighton, MA)로부터의 인간 혈액으로부터 분리하였다. 혈액은 1×PBS를 이용하여 2배 희석하였다. 희석된 혈액 25㎖를 50㎖ 코니칼 튜브 중 Ficoll Paque 25㎖ 상에 조심스럽게 층을 이루게 하였고, 400g에서 45분 동안 실온에서 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 계면으로부터 수집하였고, 새로운 50㎖ 코니칼 튜브로 옮기며, 1×PBS로 한번 세척하였다. PBMC를 NK-분리 완충액(1×PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA) 2㎖에 재현탁시키고, 그 다음 Biotin-Antibody Cocktail 500㎕를 세포 현탁액에 첨가하였다. Biotin-Antibody Cocktail은 NK 세포를 제외한 림프구에 결합하는 비오틴화 항체를 포함하며, 이는 NK 세포의 음성 선별을 초래한다. 혼합물은 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 그 다음 NK-분리 완충액 1.5㎖ 및 Anti-Biotin Micro Bead 1㎖를 첨가하였다. 세포-항체 혼합물은 추가 15분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 NK-분리 완충액 50㎖를 이용하여 한번 세척하고 NK-분리 완충액 3㎖에 재현탁시켰다. 그 다음, MACS LS 칼럼을 autoMACS 분리기(Miltenyi Biotech) 상에 장착하고 NK-분리 완충액 3㎖를 이용하여 예비 세척하였다. 세포 현탁액을 자동으로 칼럼 상에 적용하고, 세척하며 비표지화 NK 세포를 포함한 용출액 분획을 새로운 50㎖ 코니칼 튜브로 수집하였다. 생성된 NK 세포는 완전 RPMI 배지(5% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1mM HEPES, 1mM 파이로인산나트륨, 1% 100X MEM 비필수 아미노산 용액이 보충된 RPMI-1640)의 30㎖로 밤새 도말하였다. 이후 분석 및 모든 희석은 RHBP 배지(20mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA 및 1%　페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 수행하였다.
RHBP 배지 중 다양한 농도의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 50㎕/웰로 이중으로 나누어 넣었다. 표적 세포를 RHBP 배지 중 106 세포수/㎖로 재현탁하고 항체 희석물을 포함하는 각각의 웰에 100㎕/웰로 첨가하였다. 표적 세포 및 항체 희석물을 포함하는 플레이트는 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, NK 세포를 표적 세포를 포함하는 웰에 50㎕/웰로 첨가하였다. 전형적인 비율은 3~4개 NK 세포에 대하여 약 1개의 표적 세포였다. 적어도 다음의 대조군을 각각의 실험에 대하여 설정하였다: NK 세포 단독, 표적 세포 단독(자발적인 LDH 방출), 표적 세포와 NK 세포(항체 독립적 LDH 방출), 표적 세포와 10% 트리톤X-100(최대 LDH 방출). 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 세포 융해가 가능하게 하였다. 플레이트를 10분 동안 1200rpm에서 원심분리하였고, 상청액 100㎕를 새로운 평평한 바닥의 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮겼다. Cytotoxicity Detection Kit(Roche 1 644 793)로부터의 LDH 반응 혼합물(100㎕/웰)을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 5 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 광학밀도를 490nm에서 측정하였다(OD490). 각각 샘플의 비 융해(specific lysis) 백분율은 다음 식을 사용하여 결정하였다: 비 융해 백분율 = (샘플 값 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출) * 100.
huCD20-7와 함께 인큐베이션을 하면 인간 NK 효과기 세포의 존재 하에서 Ramos 림프종 및 JVM-13 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포에 대하여 우수한 ADCC를 야기한다. Ramos 림프종 세포에 대한 ADCC 활성은 huCD20-7, 리툭시맙, GA101-F 및　2F2에 대하여 비교하였다(도 17). huCD20-7을 이용한 처리는 대략 80%의 Ramos 세포 융해를 초래하였고, 이는 다른 CD20 항체를 이용하여 관찰된 활성과 유사하다. huCD20-7에 의한 ADCC 활성은 EC50가 1.1ng/㎖였고, 리툭시맙은 EC50가 3.5ng/㎖였으며, 2F2는 1.2ng/mL이고, GA101-F는 0.59ng/㎖였다. JVM-13 CLL 세포에 대한 huCD20-7의 ADCC 활성은 리툭시맙 및 2F2와 비교하였다. huCD20-7 처리는 리툭시맙 및 2F2와 유사한 대략 40%의 JVM-13 세포 융해를 야기하였다. huCD20-7에 의한 ADCC 활성은 EC50가 0.23ng/㎖였고, 리툭시맙은 EC50가 0.29ng/㎖였으며, 2F2는 0.17ng/㎖였다.
실시예 12
에피토프 맵핑
CD20의 세포외 도메인은 2개의 세포외 루프를 포함한다. 더 큰 루프는 제3 막관통 도메인과 제4 막관통 도메인 사이에 대략 44개의 아미노산으로 이루어져 있다. 따라서 기술된 대부분의 CD20 항체는 효과적인 결합을 위하여 더 큰 루프에서 아미노산 잔기를 필요로 한다. 돌연변이유발 분석은 항체 결합에 있어서 중요한 잔기로서 적어도 알라닌 170(A170) 및 프롤린 172(P172)를 확인하였다(Polyak, Blood, 99:3256-3262 (2002); 및 Polyak, J. Immunol ., 161:3242-3248 (1998)). 세린으로 A170 및 P172를 변화시키면, 뮤린 CD20의 이 위치에서 발견되는 아미노산이 B1과 같이 CD20 항체의 결합을 무효화하였다. 또한 뮤린의 큰 세포외 루프를 포함하는 CD20으로 A170 및 P172 잔기의 도입은 B1 및 리툭시맙을 포함한 대부분의 CD20 항체의 결합을 허용하였다. 반대로, 2F2를 포함한 항체의 특이한 세포는 CD20 A170S P172S 변이체에 결합한다고 보고된것이 기술되어 있다 (상기한 Teeling et al. (2006)). 추가로, 아스파르트산으로 아스파라긴 163(N163) 또는 아스파라긴 166(N166)을 변화시키는 것은 2F2의 결합을 감소시키는 반면, 이는 B1 또는 리툭시맙과 같은 다른 항-CD20 항체의 결합에는 영향을 미치지 않았다(Teeling et al. (2006) Blood. 177:363-371). 이러한 신규 에피토프는 강력한 CDC 활성을 수반하지만 종양 세포에 대한 직접적인 프로아토포시스 활성을 한정하는 생물학적 활성에 관련되어 있음을 시사하였다. CD20-7 및 CD20-6을 추가로 특징화하기 위하여, 본 발명자들은 CD20 변이체에 대한 CD20-7 및 CD20-6 결합을 분석하였다.
CD20 변이체 클로닝 및 발현
발현 플라스미드 pSRa-CD20은 전체 인간 CD20 cDNA 서열, Blue Heron Biotechnologies에 의해 최적화되고 합성된 코돈을 포함하며, 이는 pSRa 벡터로 클로닝을 위한 XbaI 및 BamHI 제한 부위 옆에 위치한다. CD20-A170S P172S 변이체(CD20-AP)는, 5' 프라이머 hCD20sacAP-SS(ATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACT(서열번호 41))를 3' 말단 역방향 프라이머 SRaMfe1R(AATGCAATTGTTGTTGTTAACT(서열번호 42))와 함께 사용하여 PCR 돌연변이유발에 의해 형성되어, A170S P172S 돌연변이를 포함하는 pSRa-CD20 플라스미드의 SacI 내지 Mfe1 절편을 증폭하였다. 이러한 PCR 산물은 pSRa-CD20 플라스미드의 SacI 및 Mfe1 부위로 클로닝되었다. 돌연변이유발은, 제한 효소 절단 후 DNA 서열결정에 의해 확인된 생성된 클론에 EcoRI 부위 및 CD20 서열을 도입하였다. CD20 N163D N166D 이중 돌연변이체(CD20-NNDD) 및 CD20 N163D(CD20-N163D) 단일 돌연변이체는 5' 말단 프라이머에서 특이적 코돈을 변형함으로써 동일한 SacI 내지 Mfe1 절편의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성되었다. CD20 N163D N166D 돌연변이체 절편은 hCD20sacNN-DD 5' 말단 프라이머(ATTAGAGCTCACACACCATATATCGATATATACGATTGTGAACCA(서열번호 43))를 이용하여 증폭되었고, CD20 N163D 절편은 hCD20sacN163D 5' 말단 프라이머(ATTAGAGCTCACACACCATATATTGATATCTACAACTGTGA(서열번호 44))를 이용하여 증폭되었다. SacI 내지 Mfe1 PCR 절편은 pSRa-CD20의 SacI 및 Mfe1 내로 클로닝되었고, 구조체는 도입된 Cla1 또는 EcoRV 부위에 대하여 각각 스크리닝되었다. 양성 클론이 추가로 DNA 서열결정에 의해 확인되었다.
안정적인 세포주는 공지된 전기천공법 절차를 사용하여 300-19 세포로 CD20 변이체 발현 플라스미드의 형질감염에 의해 생성되었다. 간략하게, 5×106 300-19 세포를 260V 및 960μF로 설정된 BioRad Gene Pulser를 사용하여 차가운 RPMI-1640 배지에서 전기청공하였다. 그 다음, 세포를 희석하고 96-웰 플레이트로 10% FBS 및 50μM β-메캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지 중에 도말하였다. 24시간 후 G418(예컨대, Invitrogen으로부터 입수가능한 것과 같은 것)을 최종 농도 2㎎/㎖로 첨가하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 2주 후, 단일 콜로니를 분리하고 확장하였다.
CD20 변이체에 대한 항체 결합
인간 CD20 야생형 및 변이체를 발현하는 CD20 AP에 대한 다양한 CD20 항체의 결합은 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 도 18A 및 도 18B에서 알 수 있는 바와 같이, CD20-7 및 CD20-6을 포함한 모든 항체는 야생형 CD20 발현 세포에 결합하였다. CD20AP 변이체에 대하여 얻은 데이터는 도 19에 나타내어져 있다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 및 GA101-F는 CD20AP 변이체에 결합하지 않은 반면, B1은 최소한의 결합을 나타내었다. 반대로 2F2는 앞서 보고된 바와 같이 CD20AP 변이체에 결합할 수 있다(상기한 Teeling et al. (2006)). 놀랍게도, huCD20-7는 CD20AP 변이체에 결합한다(도 19A 참조). 유사하게, muCD20-6 및 muCD20-7은 또한 CD20AP 변이체에 결합할 수 있다(도 19B). N163D 및 N166D돌연변이는 2F2의 결합을 감소시키는 것으로 나타난 반면, B1 또는 리툭시맙과 같은 다른 항-CD20의 결합에는 영항을 미치지 않았다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 및GA101-F는 CD20-N163D 변이체에 결합한 반면, 2F2는 감소된 결합을 보였다(도 20A). 반대로, huCD20-7, muCD20-7 및 muCD20-6은 CD20 N163D에 대한 결합의 손실을 보였다. 유사하게, 리툭시맙 및 GA101-F는 CD20-N163D N166D 변이체에 결합한 반면, 2F2는 최소한의 결합을 보였다(도 21). 다시, huCD20-7, muCD20-7 및 muCD20-6은 CD20 N163D N166D에 대한 결합의 손실을 보였다.
이러한 예상치 못한 결과는 huCD20-7이 기능적으로 GA101 및 B1과 같은 II형 Abs에 관련되지만, 분명하게 이러한 항체보다는 상이한 에피토프를 필요로 함을 나타낸다. 대부분의 다른 항체와 달리, huCD20-7은 CD20의 A170 및 P172 잔기에 의존적이지 않다. 그러므로, huCD20-7은 지금까지 실현되지 않은 물리적 및 기능적 특성의 조합을 가진 신규한 CD20 항체이다.
실시예 13
huCD20 -7- SPP - DM1 의 제조
N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP) 링커를 에탄올에 용해시켰다. huCD20-7 항체를 50mM NaCl, 2mM EDTA, 및 5% 에탄올을 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5) 중에서 8㎎/㎖로 7배 몰 과량의 SPP 링커와 함께 대략 100분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 앞서 언급한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후의 단계에 사용하였다.
예시적인 메이탄시노이드 DM1은 다이메틸아세트아마이드(DMA, 최종 농도는 3%임)에 용해시키고, 링커에 비하여 1.7배 몰 과량을 SPP 변형된 항체에 적가하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 컨쥬게이트된 항체를 pH 6.5에서 인산 완충 식염수(PBS)로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그 다음 huCD20-7-SPP-DM1 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM1 분자의 수는 항체 및 DM1에 대하여 앞서 보고된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). 컨쥬게이션 반응 후 존재하는 유리 메이탄시노이드의 백분율은 100mM 암모늄 아세테이트 완충액(pH 7.0) 중 25% 아세토나이트릴로 평형화된 HiSep(상표명) 칼럼 상에 20~50㎍ 컨쥬게이트를 주입하고, 아세토니트릴로 용출시킴으로서 결정하였다. 전체 유리 메이탄시노이드 종(구배로 용출되고 공지된 표준물질의 용출 시간과 비교하여 확인함)의 피크 면적은 파장이 252nm로 설정된 흡광도 검출기를 사용하여 측정하고 결합된 메이탄시노이드(칼럼 관류(flow-through) 분획에서 컨쥬게이트 피크로 용출됨)와 관련된 피크 면적과 비교하여 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율을 계산하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM1 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.
huCD20 -7- SMCC - DM1 의 제조
(석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) 링커를 DMA 중에 용해하였다. SMCC가 7.5 내지 10 몰 과량인 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA 중(pH 6.5)에서 항체를 인큐베이션함으로써 huCD20-7 항체를 SMCC로 변형하여 말레이미드를 항체로 도입하였다. 아르곤 하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 동일한 인산캄륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX™ G25 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후의 단계에 사용하였다.
SMCC-변형된 항체를 말레이미드 링커에 비하여 1.7몰 과량으로 10mM DM1 용액과 반응시켰다. 반응을 4 내지 약 16시간 동안 아르곤 하 주위 온도에서 교반하였다. 컨쥬게이션 반응 혼합물을 pH 6.5에서 1×PBS로 평형화된 SEPHADEX™ G25 겔 여과 칼럼을 통하여 여과하였다. 그 다음 huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM1 분자의 수 및 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM1 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.
huCD20 -7- SPDB - DM4 의 제조
예시적인 N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트 (SPDB)를 에탄올 중에 용해하였다. huCD20-7 항체를 50mM NaCl, 2mM EDTA, 및 3% 에탄올을 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5) 중에서 8㎎/㎖로 5배 몰 과량의 SPDB 링커와 함께 대략 100분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 앞서 언급한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후의 단계에 사용하였다.
메이탄시노이드 DM4는 다이메틸아세트아마이드(DMA, 최종 농도는 3%임)에 용해시키고, 링커에 비하여 1.7배 몰 과량을 SPDB 변형된 항체에 적가하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 컨쥬게이트된 항체를 pH 6.5에서 인산 완충 식염수(PBS)(pH 6.5)로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그 다음 huCD20-7-SPDB-DM4 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수는 항체 및 메이탄시노이드에 대하여 앞서 보고된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다(Widdison, WC, et al.J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술도니 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM4 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.
huCD20 -7- PEG4 - mal - DM4 의 제조
DM4-mal-PEG4-NHS 시약을 DMA 중에 용해하여 12mM 저장 용액을 만들었다. huCD20-7 항체는 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7.5 및 10부피% DMA 중 항체 농도 4㎎/㎖로 15 당량의 DM4-mal-PEG4-NHS로 변형하였다. 아르곤 하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 동일한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 칼럼을 사용하여 정제하였다.
그 다음 huCD20-7-PEG4-mal-DM4 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수는 항체 및 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM4 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.
huCD20 -7- 설포 - mal - DM4 의 제조
DM4-mal-3-설포-NHS는 생체 내에서 60% DMA / 40% 200mM 석시네이트 완충액(pH 5) 중 3-설포-mal-NHS를 1.6 당량의 L-DM4-SH와 2시간 동안 주위 온도에서 반응시킴으로써 생성하였다. 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7.5 및 10부피% DMA 중 huCD20-7 항체마다(5㎎/㎖) 반응 혼합물(4mM 링커 농도)의 8 당량을 첨가하였다. 아르곤 하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 동일한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25 칼럼을 사용하여 정제하였다.
그 다음 huCD20-7-설포-mal-DM4 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수는 항체 및 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM4 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.
실시예 14
컨쥬게이트의 결합 친화도
SMCC-DM1 또는 SPP-DM1에 대한 컨쥬게이션 후 huCD20-7의 결합 친화도를 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 22에 나타낸 결합 곡선으로부터 계산하였고, 이는 huCD20-7에 대하여 0.7nM, SMCC-DM1에 대하여 0.9nM, SPP-DM1 컨쥬게이트에 대하여 1.1nM에 해당한다. 이러한 결과는, 예를 들어 SMCC-DM1 또는 SPP-DM1 컨쥬게이션이 항체(예컨대, CD20-7)의 친화도를 현저하게 변경시키지 않음을 입증한다.
추가로, 예를 들어 설포-mal-DM4에 대한 컨쥬게이션 후 huCD20-7의 결합 친화도는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 22B에 나타낸 결합 곡선으로부터 계산하였고, 이는 huCD20-7에 대하여 0.8nM, 설포-mal-DM4 컨쥬게이트에 대하여 1.3nM에 해당한다. 이러한 결과는, 설포-mal-DM4 컨쥬게이션이 항체(예컨대, huCD20-7)의 친화도를 현저하게 변경시키지 않음을 입증한다.
컨쥬게이트의 프로아포토시스 활성
SMCC-DM1 또는 SPDB-DM4에 대한 컨쥬게이션 후 huCD20-7의 프로아포토시스 활성을 Ramos 세포 상에서, 예를 들어 상기 기술된 바와 같이 아넥신-V 분석법에 의해 분석하였다. Ramos 세포는 다양한 농도의 huCD20-7 항체 또는 컨쥬게이트와 함께 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율은 도 23에 반-대수 플롯으로 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. huCD20-7로의 처리는 미처리 세포에 대하여 3%인 것과 비교하여 최대 51%를 아넥신-V 양성 세포로 만든다. 리툭시맙 처리는 단지 10%를 아넥신-V 양성 세포로 유도하였다. huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트로의 처리는 아넥신-V 양성 세포를 73%로 증가시킨 한편, huCD20-7-SPDB-DM4 처리는 82%로 더 증가시켰다. 반대로, 비결합 아이소타입 대조군 항체의 SMCC-DM1 또는 SPDB-DM4 컨쥬게이트는 각각 4% 또는 8%를 아넥신-V 양성 세포로 만들었다. 예를 들어, Ramos 세포에 대한 huCD20-7의 프로아포토시스 활성은 메이탄시노이드 컨쥬게이션에 의해 향상된다.
컨쥬게이트의 CDC 활성
컨쥬게이션 후, 예를 들어 huCD20-7의 CDC 활성 상기 기술된 바와 같이 인간 보체의 존재하 림프종 세포에 대하여 분석하였다. Daudi 림프종 세포에 대하여 도 24A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7의 예시적인 SPDB-DM4 및 PEG4-mal-DM4 컨쥬게이트는 EC50이 대략 0.4㎍/㎖인 비컨쥬게이트된 항체와 유사한 CDC 활성을 가졌다. WSU-DLCL-2 미만성 거대 B 세포 림프종 세포에 대하여(도 24B), huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4 및 huCD20-7-PEG4-mal-DM4는 EC50이 대략 0.5㎍/㎖인 유사한 CDC 활성을 가졌다. WSU-DLCL-2 세포에 대하여 도 25A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, -SPP-DM1 및 설포-mal-DM4는 EC50이 대략 0.5㎍/㎖인 유사한 CDC 활성을 가졌다. Ramos 림프종 세포에 대하여(도 25B), huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, -SPP-DM1 및 설포-mal-DM4는 EC50이 대략 0.02㎍/㎖인 유사한 CDC 활성을 가졌다. 그러므로, 예를 들어 huCD20-7의 CDC 활성은 메이탄시노이드 컨쥬게이션 후에 유지된다.
컨쥬게이트의 ADCC 활성
SMCC-DM1에 대한 컨쥬게이션 후, 예를 들어 huCD20-7의 ADCC 활성을 상기 기술된 바와 같이 LDH 방출 분석에 의한 인간 NK 효과기 세포의 존재 하 Ramos 및 Granta-519 세포 상에서, 평가하였다. 도 26에서 알 수 있는 바와 같이, huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 Ramos 세포 상에서 비컨쥬게이트된 huCD20-7 항체와 유사한 ADCC 활성을 가지며, 각각 최대 세포 융해가 40%이고 EC50이 각각 1.8ng/㎖ 및 1.4ng/㎖이다. 유사한 결과는 표적 세포로서 다른 세포(예컨대, Granta-519 MCL 세포)를 사용하여 얻었다. huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 Granta-519 세포 상에서 비컨쥬게이트된 huCD20-7 항체와 비슷한 ADCC 활성을 가지며, 각각 최대 세포 융해가 대략 25%이고 EC50이 각각 0.22ng/㎖ 및 0.14ng/㎖이다. CDC에 대하여 나타낸 바와 같이, huCD20-7의 ADCC 활성은 메이탄시노이드 컨쥬게이션 후에 유지된다.
실시예 15
시험관 내 세포독성 분석
세포 성장을 억제하는 예시적인 huCD20-7 컨쥬게이트의 능력을 시험관 내 세포독성 분석을 사용하여 측정하였다. 일반적으로, 표적 세포는 완전 RPMI 배지(RPMI-1640, 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 시약 모두 Invitrogen 제품임) 중 100㎕로 웰 당 5,000 세포로 도말하였다. 항체 및 컨쥬게이트는 3배 계열 희석을 사용하여 완전 RPMI 배지로 희석하였고, 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 최종 농도는 전형적으로 3×10-8M 내지 4.6×10-12M의 범위이었다. 세포를 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 4 내지 5일 동안 인큐베이션하였다. 남아있는 세포의 생존력은 비색 WST-8 분석법(Dojindo Molecular Technologies, Inc., 미국 메릴랜드주 록빌시에 소재)에 의해 측정하였다. WST-8은 살아있는 세포의 데하이드로게나아제에 의해 조직 배양 배지에 용해성인 오렌지색 포마잔 생성물로 환원된다. 생성된 포마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 정비례한다. WST-8을 최종 부피의 10%로 첨가하고 플레이트는 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 추가 2~4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트는 다중웰 플레이트 판독기에서 450nm(A450)에서의 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 배지 및 WST-8만을 포함하는 웰의 배경 A450 흡광도를 모든 값에서 차감하였다. 생존력 백분율은 각각의 시험된 샘플 값을 미처리 세포가 있는 웰의 평균 값으로 나눔으로써 계산하였다. 생존력 백분율 = 100* (A450 처리 샘플 - A450 배경)/ (A450 미처리 샘플　-　A450 배경).
생존력 백분율 값은 각각의 처리에 대하여 반-대수 플롯에서 항체 또는 컨쥬게이트 농도에 대하여 플롯팅하였다.
Ramos 세포 상 huCD20 -7 및 huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성
Ramos세포에 대한 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트와 비교하였다. 도 27A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 60%까지 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 80% 까지 생존력을 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는, EC50이 0.68nM이어서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 20nM이어서, huCD20-7-SMCC-DM1에 대하여 예상치 못하게 상당한 29배의 특이성 윈도우를 초래하였다.
Daudi 세포 상에서 huCD20 -7 및 huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성
Daudi 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 27B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 65%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 80%로 생존력을 보다 적당히 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.77nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 12nM이어서, Daudi 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 16배의 특이성 윈도우를 초래하였다.
Granta -519 세포 상에서 huCD20 -7 및 huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성
Granta-519 MCL 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 28A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 45%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 60%로 생존력을 보다 적당히 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.03nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 13nM이어서, Granta-519 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 419배의 특이성 윈도우를 초래하였다.
SC -1 세포 상에서 huCD20 -7 및 huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성
SC-1 FL 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 28B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 35%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 75%로 생존력을 보다 적당히 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.39nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 31nM이어서, SC-1 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 79배의 특이성 윈도우를 초래하였다.
DOHH -2 세포 상에서 huCD20 -7 및 huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성
DOHH-2 FL 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 29A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 20%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 25%로 생존력을 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.12nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 35nM이어서, DOHH-2 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 292배의 특이성 윈도우를 초래하였다.
항원 음성 Molt -4 세포 상에서 huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성
huCD20-7-SMCC-DM1 세포독성의 특이성을 추가로 확인하기 위하여, huCD20-7-SMCC-DM1의 활성을 비-CD20 발현 Molt-4 T 세포 급성 림프구성 백혈병 세포주에 대하여 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트와 비교하였다. 증가된 농도의 2가지 컨쥬게이트를 본 실험에 사용하여 상대적으로 나쁜 비특이적 세포독성을 나타내었다. 도 29B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7-SMCC-DM1 및 비특이적 컨쥬게이트는 EC50이 33nM이어서 동일한 세포독성을 나타내었다.
huCD20 -7- SMCC - DM1 의 시험관 내 세포독성의 요약
예를 들어, huCD20-7은 Ramos, Daudi, Grant-519, SC-1 및 DOHH-2 세포에 대하여 리툭시맙보다 놀랍게도 더 활성적이다. 표적 세포 생존력에서의 감소는 리툭시맙 처리에 있어서 나타난 것보다 huCD20-7과 함께 인큐베이션한 후에 더 크다. 추가로, 예를 들어 huCD20-7의 SMCC-DM1 컨쥬게이션은 항체에 강력한 세포독성 활성을 추가한다. 종양 세포의 생존력은 단독으로 항체 처리한 것과 비교하여 컨쥬게이트 처리에 응하여 보다 완전하게 감소하였다. 비표적화된 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 효능에 비하여 huCD20-7-SMCC-DM1 효능을 비교할 경우, 상당한 특이성 윈도우가 각각의 CD20-발현 세포주에 대하여 관찰되며, 이는 세포독성이 표적 세포에 결합하는 huCD20-7 항체의 결과임을 나타낸다. 추가로, 예를 들어 huCD20-7-SMCC-DM1 및 비특이적 컨쥬게이트는 항원-음성 Molt-4 세포에 대하여 동일한 나쁜 세포독성을 보였다. 따라서, huCD20-7-SMCC-DM1에 대하여 관찰된 세포독성은 CD20 발현에 의존적이다.
SMCC-DM1 컨쥬게이트에 대한 EC50
Figure pct00029
실시예 16
huCD20 -7- SMCC - DM1 은 Ramos 세포에 대하여 리툭시맙 - SMCC - DM1 보다 더 활성적이다
예를 들어 Ramos 림프종 세포에 대하여, huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙, 리툭시맙-SMCC-DM1 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 30A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 55%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 생존력을 유의하게 감소시키지 못하였다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.72nM이어서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 22nM이었다. 리툭시맙-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 3.3nM인 세포독성을 초래하였다. 따라서, huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 리툭시맙-SMCC-DM1보다 시험관 내에서 더 강력한 세포독성 활성을 가진다.
huCD20 -7- SMCC - DM1 은 Daudi 세포에 대하여 리툭시맙 - SMCC - DM1 보다 더 활성적이다
예를 들어 Daudi 림프종 세포에 대하여, huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙, 리툭시맙-SMCC-DM1 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 30B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 50%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 생존력을 65%로 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 1.0nM이어서 생존력을 없앤 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 15nM이었다. 리툭시맙-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 2.6nM인 세포독성을 초래하였다. 따라서, huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 리툭시맙-SMCC-DM1보다 더 강력한 세포독성 활성을 가진다.
실시예 17
방사능-표지화된 컨쥬게이트의 제조
huCD20-7 및 리툭시맙의 방사능표지된 컨쥬게이트는 삼중수소로 표지화된 DM1([3H]DM1)을 사용한 것을 제외하고 비표지화된 컨쥬게이트에 대하여 Widdison et al.(Widdison et al. J Med Chem 2006;49:4392-408)에 의해 기술된 것과 본질적으로 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. 이 방법은 또한 Erickson et al.(Erickson et al. Bioconjug Chem 2010; 21:84-92)에 상세히 기술되어 있다.
간략하게, 항체를 먼저 N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트(SMCC)를 이용하여 항체의 리신 잔기에서 변형시키고, 겔 여과에 의해 정제한 후, 삼중수소를 가지는 DM1과의 컨쥬게이션을 C-20-메톡시 기에서 안정적으로 통합시켰다. 삼중수소로 표지화된 DM1은 안사미토신(Ansamitocin) P-3으로부터 제조하였다. 안사미토신 P-3의 C20 메톡시 기는 박테리아 균주인 스트렙토마이세스 플란텐시스(Streptomyces platensis)와 함께 인큐베이션에 의해 제거되어 안사미토신 PDM-3을 제공하였다(Asai et al, 미국 특허 제4,307,016호). 그 다음 안사미토신 PDM-3의 C-20-OH 모이어티는 Sawada(Sawada et al. Bioconj Chem 1993;4:284-289)에 의해 기술된 방법에 의해 삼중수소로 표지화된 요오드화 메틸을 사용하여 메틸화하였다. 항체 분자 당 연결된 메이탄시노이드 분자의 비율(D/A) 및 비 방사능은 다음과 같았다: 리툭수맙(rituxumab)-SMCC-[3H]DM1(3.5 D/A, 1.9 Ci/mmol) 및 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1(3.4 D/A, 1.8 Ci/mmol).
리툭시맙 - SMCC -[ 3 H] DM1 및 huCD20 -7- SMCC -[ 3 H] DM1 의 활성
2가지의 컨쥬게이트 및 해당하는 비변형된 항체는 모두 CD20 양성 SU-DHL-4 세포에 대하여 유사한 결합 친화도를 가지는 것으로 밝혀졌다(도 31A). CD20-양성 SU-DHL-4 세포 및 CD20-음성 COLO205 세포에 대한 2가지 컨쥬게이트의 세포독성 효력은 실시예 15에 기술된 바와 같은 세포-기반 생존력 분석법을 사용하여 평가하였다. 2가지 컨쥬게이트 모두 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 및 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1 컨쥬게이트 각각에 대하여 IC50 값이 대략 0.1nM 및 0.24nM이어서 강력한 것으로 밝혀졌다(도 31B). 예상된 바와 같이, 2가지 컨쥬게이트 모두 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 및 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1 컨쥬게이트 각각에 대하여 EC50 값이 34nM 및 11nM이어서 항원-음성 COLO205 결장암 세포주에 대하여 나쁜 효력을 가졌다. 이는 이들 2가지 컨쥬게이트에 의한 세포 살생이 CD20-의존적임을 나타낸다. Ramos 및 Daudi 세포에 대하여 실시예 16에 나타낸 바와 같이, huCD20-7-SMCC-[3H]DM 컨쥬게이트는 SU-DHL-4 세포에 대하여 리툭시맙-SMCC-DM1보다 더 강력한 세포독성 활성을 가진다.
리툭시맙 - SMCC -[ 3 H] DM1 및 huCD20 -7- SMCC -[ 3 H] DM1 의 표적 세포 대사산물
방사능-표지화된 컨쥬게이트에 표적 세포의 노출 후에 형성된 대사산물의 양 및 유형을 평가하기 위하여, 10% FBS기 보충된 RPMI-1640 배지의 21㎖ 중 SU-DHL-4 세포(17×106)의 배양물을 3H-컨쥬게이트 40nM에 30분 동안 37℃, 6% CO2에서 노출시켰다. 세포를 RPMI-1640 배지에서 3번 세척하여 임의의 결합지 않은 컨쥬게이트를 제거하였고, 신선한 배양 배지에 재현탁시켰으며(8×105 세포수/㎖), 37℃, 6% CO2에서 22시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고 0.3㎖ Tris-완충 식염수(pH 7.5)에 현탁시켰다. 아세톤(4:3 v/v)을 첨가하고 샘플을 혼합하며, -80℃에서 1시간 동안 냉동시켜 단백질을 침전시켰다. 샘플을 해동하고 2,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 상청액과 펠릿을 분리하였다. 단백질이 없는 메이탄시노이드 대사산물을 포함하는 진공 원심분리기를 사용하여 상청액을 증발시켜 건조시켰다. 추출물을 0.025% 트라이플루오로아세트산을 포함하는 20% 수성 아세토니트릴 0.12㎖ 중에 용해하고, 메이탄시노이드 대사산물을 분석적 C-18 칼럼(Vydac, 0.46×25㎝) 상에서 분리하였다(Erickson et al. Cancer Res 2006;66:4426-33). 용출액을 1㎖ 분획으로 수집하고, 각각의 분획에 결합된 방사능을 각각의 바이알을 4㎖ Ultima Gold 액체 섬광 칵테일과 혼합한 후 Tri-Carb 2900T 액체 섬광 계수기에서 5분 동안 계수함으로써 측정하였다.
아세톤 펠렛을 0.3㎖ 물에 재현탁하고, 1㎖ 분해가능 시약(Solvable reagent, Perkin Elmer)의 첨가에 의해 용해하였다. 그 다음 샘플을 밤새 50℃ 수욕에서 인큐베이션하였다. 샘플을 인큐베이션에서 제거하고, 0.1M EDTA 0.1㎖ 및 30% 과산화수소 0.3㎖를 각각의 샘플에 첨가한 후 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음 샘플을 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 1N HCl 0.2㎖를 각각의 샘플에 첨가한 후 15㎖ Ultima Gold 섬광 유체를 첨가하였다. 샘플을 격렬하게 교반하고 어둠 속에 밤새 둔 다음 LSC로 계수하였다.
SU-DHL-4 세포의 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 및 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1 둘 다에 대한 단기간 노출은 세포 당 결합된 컨쥬게이트의 유사하게 높은 수준을 초래하였다(도 32A). 세포 당 결합된 각각의 컨쥬게이트의 양은 컨쥬게이트에의 초기 노출 및 세척 단계 후 세포와 결합된 전체 방사능으로부터 결정하였다. 메이탄시노이드 대사산물은 아세톤 추출에 의한 노출 및 방사능-검출을 이용한 HPLC 분리 후 22시간 동안 정량화하였다. 2가지 컨쥬게이트에 노출하고 22시간 후에 세포 내에서 관찰된 유일한 대사산물은 리신-SMCC-[3H]DM1인 것으로 밝혀졌다. 어떠한 다른 대사산물도 관찰되지 않았다. 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물은 huC242-SMCC-[3H]DM1의 유일한 표적-세포 대사산물로서 이미 확인되었다(Erickson et al. Cancer Res 2006;66:4426-33). 세포가 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 컨쥬게이트에 노출하고 22시간 후 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물의 수준은 대략 0.6pmol/106 세포수인 것으로 밝혀졌다. 반대로, 리툭시맙-[3H]DM1 컨쥬게이트에 세포가 노출하고 22시간 후 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물의 수준은 대략 0.3pmol/106 세포수인 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 대사산물의 2배 더 높은 수준은 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1에 대한 노출 후 보다 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1에 대한 세포의 노출 후에 형성된다(도 32B). huCD20-7 컨쥬게이트에 의해 형성된 대사산물의 증가된 수준은 huCD20-7 컨쥬게이트의 더 높은 시험관 내 활성을 야기할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 huCD20-7은 시험관 내 비절단성 컨쥬게이트로서 보다 효과적이도록 할 수 있는 특유의 물리적 및 기능적 특성을 가진 항체이다.
실시예 18
상이한 링커를 가지는 huCD20 -7 컨쥬게이트의 시험관 내 세포독성
huCD20-7-SMCC-DM1의 세포독성은 상이한 링커로 제조된 컨쥬게이트의 세포독성과 비교하였다. 도 33A에서 알 수 있는 바와 같이, 예를 들어 huCD20-7의 SPDB-DM4 및 PEG4-mal-DM4 컨쥬게이트는 Granta-519 세포에 대하여 SMCC-DM1 컨쥬게이트로서 유사한 세포독성 활성을 가진다. 상기 2가지 컨쥬게이트는 EC50이 0.06nM인 세포 생존력의 완전한 감소를 야기한다. 도 33B에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 huCD20-7의 SPP-DM1 및 설포-mal-DM4 컨쥬게이트는 또한 Granta-519 세포에 대하여 SMCC-DM1 컨쥬게이트로서 유사한 세포독성 활성을 가진다. 모든 컨쥬게이트는 EC50이 0.1nM인 세포 생존력의 완전한 감소를 야기한다.
실시예 19
SU - DHL -4 이종이식 모델에서 huCD20 -7 항체의 생체 내 효능
예시적인 huCD20-7 항체는 SCID 마우스에 피하로 이식된 SU-DHL-4 미만성 거대 B 세포 림프종 세포의 확립된 이종이식 모델을 사용하여 시험하였다. 마우스는 체중에 의하여 치료군으로 임의 추출하였고, huCD20-7 또는 리툭시맙 10 또는 1㎎/㎏으로 세포 접종 후 14, 21 및 28일에 1주일에 한번씩 3회 처치하였다. 상이한 치료 군의 중앙 종양 부피는 도 34에 플롯팅되어 있다. 리툭시맙 치료는 2가지 투여량 ahe에서 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피에서 감소를 초래하였으며, 1㎎/㎏ 투여량은 1㎎/㎏ 투여량보다 더 강력하였다. 1㎎/㎏에서 huCD20-7로의 처치는 동일 투여량에서 PBS와 비교하여 리툭시맙보다 중앙 종양 부피에서 보다 현저한 감소를 초래하였다. 10㎎/㎏에서 huCD20-7로의 처치는 리툭시맙과 비교하여 보다 극적인 종양 성장 감소를 초래하였다. 연구 66일째에, huCD20-7 처치 결과 10마리 중 7마리가 무종양 생존자(TFS)인 반면, 리툭시맙 처치 결과는 10마리 중 1마리만이 TFS이었다. 어떠한 TFS도 PBS 대조군과 2가지 1㎎/㎏ 처치 군에서 관찰되지 않았다.
실시예 20
Daudi 이종이식 모델에서 huCD20 -7 항체, - SPP - DM1 , SMCC - DM1 및 BMPS - DM1 의 생체 내 효능
huCD20-7 항체 및 이의 컨쥬게이트는 SCID 마우스에 정맥내로 이식된 Daudi 림프종 세포를 사용하여 이종이식 모델에서의 생체 내 효능에 대하여 시험하였다. 마우스는 체중에 의하여 치료군으로 임의 추출하였고, huCD20-7 10㎎/㎏, huCD20-7-SMCC-DM1 10㎎/㎏ 또는 huCD20-7-SPP-DM1 5㎎/㎏으로 세포 접종 후 7일째에 한번 처치하였다. 상이한 처치군에서 생존한 마우스의 수는 도 35A에 플롯팅되어 있다. 마우스의 PBS 처치군에 대한 중앙 생존은 27일이었다. huCD20-7 처치는 45일까지 중앙 생존에서 증가를 초래하였다. 2가지 컨쥬게이션에서 모두 항체와 비교하여 중앙 생존에서의 추가적 증가를 초래하였다. huCD20-7-SMCC-DM1 및 huCD20-7-SPP-DM1은 각각 64일 및 58일의 중앙 생존을 초래하였다.
SCID 마우스에 정맥내로 이식된 Daudi 림프종 세포를 사용하는 유사한 이종이식 모델에서, 마우스는 huCD20-7, 리툭시맙, huCH20-7-SMCC-DM1 또는 huCH20-7-BMPS-DM1 10㎎/㎏으로 세포 접종 후 7일에 처치하였다. 상이한 처치군에서 생존한 마우스의 수는 도 35B에 플롯팅되어 있다. 마우스의 PBS 처치군에 대한 중앙 생존은 31일이었다. huCH20-7 처치는 49일까지 중앙 생존에서 증가를 초래하였다. 반대로, 리툭시맙 처치는 중앙 생존을 단지 40일까지의 증가를 초래하였다. 2가지 huCD20-7-기초 컨쥬게이트는 항체와 비교하여 생존에서 추가적 증가를 초래하였고, huCH20-7-SMCC-DM1 및 huCH20-7-BMPS-DM1은 각각 5일째 90% 및 100% 생존을 초래하였다.
huCD20 -7 항체 및 - SPP - DM1 및 SMCC - DM1 의 생체 내 효능
예시적인 huCD20-7 항체 및 이의 컨쥬게이트는 DOHH-2 마우스에 피하로 이식된 DOHH-2 여포성 림프종 세포를 사용하여 미리 감지가능한 이종이식 모델에서 테스트하였다. 마우스는 체중에 의하여 치료군으로 임의 추출하였고, huCD20-7 10㎎/㎏, huCD20-7-SMCC-DM1 10㎎/㎏ 또는 huCD20-7-SPP-DM1 5㎎/㎏으로 세포 접종 후 3일째에 한번 처치하였다. 상이한 처치군에서 중앙 종양 부피는 도 36에 플롯팅되어 있다. huCD20-7 항체 처치는 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피에서 감소를 초래하였다. 향상된 효능은 비컨쥬게이트된 항체와 비교하여 huCD20-7 컨쥬게이트에 대하여 보여졌다. 연구의 마지막 90일째에 huCD20-7 처치 결과 10마리 중 2마리가 무종양 생존자(TFS)인 반면, huCD20-7-SMCC-DM1 처치 결과는 10마리 중 6마리가 TFS이었고, huCD20-7-SPP-DM1 처치 결과는 10마리 중 10마리가 TFS이었다. 어떠한 TFS도 PBS 대조군에서 관찰되지 않았다.
huCD20 -7-기초 컨쥬게이트의 생체 내 효능의 요약
CD20 항체의 컨쥬게이트는 이미 기술되어 있다. 하나의 경우에서, 항-CD20 항체의 비절단성 SMCC-DM1 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 항체와 동일한 효능을 나타낸 반면, 동일한 항체의 절단성 SPP-DM1 컨쥬게이트는 SCID 마우스의 Granta-519 이종이식 모델에서 개선된 효능을 나타내었다(전술한 Polson et al.). 유사하게, 산-안정성 아마이드 링커를 이용하여 만든 리툭시맙의 칼리키아마이신 컨쥬게이트는 누드 마우스인 Ramos 이종이식 모델에서 개선된 생체 내 효능을 보이지 않았다. 단지 산-안정성 다이메틸 하이드라자이드 Ac-But 링커를 이용하여 만든 리툭시맙의 칼리키아마이신 컨쥬게이트만이 이 연구에서 개선된 생체 내 호능을 보였다(전술한 DiJoseph et al.).
놀랍게도, 예를 들어 SMCC-DM1 또는 BMPS-DM1 컨쥬게이트와 같은 huCD20-7의 비절단성 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트 항체와 비교하여 2가지 상이한 이종이식 모델에서 극적으로 개선된 생체 내 효능을 나타낸다. 추가로, 예를 들어 SPP-DM1 컨쥬게이트와 같은 huCD20-7의 절단성 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 항체와 비교하여 동등한 개선된 생체 내 효능을 나타낸다. 예를 들어 huCD20-7은 생체 내에서 비절단성 컨쥬게이트로서 보다 효과적이도록 할 수 있는 물리적 및 기능적 특성의 가지는 항체이다.
본 발명은 구체적인 양태와 관련하여 상세하게 기술되어 있지만, 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 사상 및 범주를 벗어남 없이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백하다.

Claims (93)

  1. CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편으로서, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스(apoptosis), 항체 의존성 세포매개 세포독성(antibody dependent cell mediated cytotoxicity: ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)을 유도할 수 있는 것인 항체 또는 그의 절편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 뮤린(murine), 비인간, 인간화, 키메라, 재표면화 또는 인간의 것인 항체 또는 그의 절편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 단일클론 또는 단일-사슬의 것인 항체 또는 그의 절편.
  4. 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 PTA-10486) 또는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 PTA-10487)에 의해 생성되는 항체 또는 그의 절편.
  5. 제1항에 있어서, 포유동물, 효모, 곤충, 식물 또는 박테리아 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 진핵 또는 원핵 숙주 세포로부터 얻어지는 것인, 항체 또는 그의 절편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO, NS0, SP2/0, PER.C6 또는 HEK-293 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.
  7. 제5항에 있어서, 상기 효모 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.
  8. 제5항에 있어서, 상기 곤충 세포는 Sf-9 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.
  9. 제5항에 있어서, 상기 식물 세포는 렘나(Lemna) 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.
  10. 제5항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 대장균(E. coli) 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20의 제3 막관통 도메인과 제4 막관통 도메인 사이에 위치하는 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  12. 세포독성제에 연결된 제1항의 항체 또는 절편을 포함하는 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포독성제는 메이탄시노이드, 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065, CC-1065 유사체, 듀오카마이신, 듀오카마이신 유사체, 칼리키아마이신, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 아우리스타틴, 토메이마이신 유도체 및 렙토마이신 유도체 또는 컨쥬게이트의 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  14. 제1항에 기재된 항체 또는 절편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제12항의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제12항에 기재된 컨쥬게이트를 포함하는 진단 시약으로서, 상기 항체 또는 절편은 표지화되어 있는 것인 진단 시약.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표지는 군으로부터 선택된 방사능표지, 형광단, 발색단, 조영제 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 진단 시약.
  18. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 서열번호 45의 아미노산, 또는 GI 21330989, GenBank Protein ID 23110989를 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  19. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20을 발현하는 세포의 사멸을 유도할 수 있는 것인 항체 또는 그의 절편.
  20. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 절편은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 상당히 유도하는 능력을 가지고, CD20의 지질뗏목으로의 재분배를 야기하며 보체 의존성 세포독성(CDC)을 상당히 유도하는 능력을 가지는, III형 항체인 것인 항체 또는 그의 절편.
  21. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 절편은 웨스턴 블럿(Western blot)에서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  22. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 절편은 ELISA에서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  23. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 절편은 유세포 분석법에서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  24. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGDCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 다이아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  25. 제1항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 IgG1 불변 도메인, IgG2 불변 도메인, IgG3 불변 도메인 및 IgG4 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 절편.
  27. 제19항에 있어서, 상기 세포는 B 세포로부터 유래된 것인 항체.
  28. 제19항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인 것인 항체.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암 세포는 B 세포 림프종, NHL, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종 및 비장 유형 변연부 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  30. 제19항에 있어서, 상기 세포는 원치 않는 면역 반응에 영향을 미치는 것인 항체 또는 그의 절편.
  31. 제19항에 있어서, 상기 세포는 염증에 영향을 미치는 것인 항체 또는 그의 절편.
  32. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  33. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하고; 상기 항체는 약 0.018㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 CDC를 포함하는 것인 항체.
  34. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하고; 상기 항체 또는 절편은 약 0.018㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 CDC를 포함하고; 상기 항체 또는 절편은 상기 세포의 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 전위시킬 수 있는 것인 항체.
  35. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Raji 림프종 세포의 적어도 약 53%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  36. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  37. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하고; 상기 항체 또는 상기 절편은 약 0.58㎍/㎖ 이하의 EC50으로 WSU-DLCL-2 림프종 세포를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 CDC를 포함하는 것인 항체.
  38. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Jeko-1 림프종 세포의 적어도 약 12%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  39. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Granta-519 림프종 세포의 적어도 약 40%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  40. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하는 것인 항체.
  41. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  42. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하는 CD20 에피토프를 포함하거나 필요로 하고/하거나; 상기 항체 또는 절편은 Raji 림프종 세포의 적어도 약 53%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  43. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  44. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 Jeko-1 림프종 세포의 적어도 약 12%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  45. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 Granta-519 림프종 세포의 적어도 약 40%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.
  46. 서열번호 25 내지 30 및 17 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 그의 절편.
  47. 제46항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 절편은 CD20에 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  48. 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 절편으로서, 상기 중쇄는 서열번호 20 내지 22 또는 28 내지 30의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 17 내지 19 또는 25 내지 27의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 그의 절편.
  49. 제48항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.
  50. 제48항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.
  51. 제48항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 절편.
  52. 제48항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.
  53. 제48항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.
  54. 제48항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 절편.
  55. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  56. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  57. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  58. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 2개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  59. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  60. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  61. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  62. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  63. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 2개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  64. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
  65. CD20에 특이적으로 결합하는 개선된 항체 또는 절편으로서,
    (a) 서열번호 32 내지 36, 46, 47, 17 내지 22, 25 내지 30 및 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 항체 또는 그의 절편을 암호화하는 DNA를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 상기 DNA로의 삽입을 도입하여 상기 DNA에 의해 암호화된 상기 항체 또는 항체 절편의 아미노산 서열이 변화되는 단계;
    (c) 상기 항체 또는 항체 절편을 발현하는 단계; 및
    (d) 상기 개선에 대하여 상기 발현된 항체 또는 항체 절편을 스크리닝하여, 상기 개선된 항체 또는 항체 절편이 제조되는 단계;
    에 의해 제조된 항체 또는 그의 절편.
  66. 제65항에 있어서, 상기 개선은 CD20에 대하여 친화도의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.
  67. 제65항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 삽입은 올리고뉴클레오티드-매개 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR, DNA 셔플링, 및 대장균의 돌연변이 유발 유전자-균주의 사용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 이루어지는 것인 항체 또는 그의 절편.
  68. 서열번호 1 내지 7 및 17 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 절편.
  69. 제65항에 있어서, 상기 개선은 효과기 기능의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.
  70. 제65항에 있어서, 상기 개선은 CDC 활성의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.
  71. 제65항에 있어서, 상기 개선은 ADCC 활성의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.
  72. 제65항에 있어서, 상기 개선은 ADCC 활성의 증가, CDC 활성의 증가 및 효과기 기능의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.
  73. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 형질전환 발현 숙주로부터 얻은 것이며, 상기 숙주는 형질전환 염소, 닭, 소, 또는 계란으로 이루어진 것인 항체 또는 그의 절편.
  74. 암 세포를 제1항에 기재된 항체 또는 절편과 접촉시키는 것을 포함하는 암 세포의 성장을 억제하는 방법.
  75. CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편 또는 컨쥬게이트의 유효량을 암이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 환자에게 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제인 것인 방법.
  78. 제19항의 컨쥬게이트의 유효량을 암이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법.
  79. 제75항에 있어서, 상기 암은 B 세포 림프종, NHL, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종 및 비장 유형 변연부 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  80. 암이 있는 것으로 의심도는 개체를 진단하는 방법으로서, 상기 방법은
    제16항의 진단 시약을 상기 개체에게 투여하는 단계; 및
    상기 개체 내에서 상기 시약의 분포를 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 암은 B 세포 림프종, NHL, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종 및 비장 유형 변연부 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 진단 방법.
  82. CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편 또는 컨쥬게이트의 유효량을 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있는 것인 치료 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염, 만성 국소 뇌염, 수포성 유천포창, A형 혈우병, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성 근염, 만성 두드러기, 원발 담즙성 간경변, 시신경 척수염, 그레이브스 갑상선 이상성 질환, 수포성 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선성 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스-연관 질환, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염, 피부근염, ANCA, 재생불량성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), VIII 인자 결핍증, A형 혈우병, 자가면역성 호중구 감소증, 캐슬만 증후군, 굿파스튜어 증후군, 고형 장기 이식 거부, 이식편대 숙주병(GVHD), 자가면역성 간염, 림프모양 사이질 폐렴(HIV), 폐색성 세기관지염(비이식), 길랭-바레 증후군, 대혈관 혈관염, 거대세포 (타카야수) 동맥염, 중간혈관 혈관염, 가와사키병 및 결절성 다발동맥염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  84. 제1항, 제4항, 제18항 및 제48항 중 어느 한 항의 항체 또는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  85. 제1항, 제4항, 제18항 및 제48항 중 어느 한 항의 항체 또는 절편의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  86. 제85항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  87. 제86항에 있어서, 상기 벡터는 상기 항체 또는 항체 절편을 발현할 수 있는 발편 벡터인 것인 벡터.
  88. 제87항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  89. CD20에 특이적으로 결합하는 수단으로서, 상기 수단은 아포토시스, ADCC 및 CDC를 유도할 수 있는 것인 수단.
  90. 제1항에 기재된 항체 또는 절편을 유효량을 암이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 항체 도는 절편은 방사능표지된 화합물에 연결된 것인 방법.
  91. 제12항에 있어서, 상기 세포독성제에 항체 또는 절편의 상기 연결은 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 통하는 것인 컨쥬게이트.
  92. 제91항에 있어서, 상기 링커는 N-석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)2-설포부타노에이트(설포-SPDB), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), 2-이미노티올란 및 아세틸석시닉 안하이드라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  93. 제91항에 있어서, 상기 링커는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), β-말레이미도프로판산 N-석신이미딜 에스터(BMPS), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소시아네이트(PMPI), N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
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