KR20130009760A - Cd20 antibodies and uses thereof - Google Patents

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KR20130009760A
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antibody
fragment
cell
amino acid
lymphoma
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KR1020127023033A
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Korean (ko)
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유타 데커트
링윈 루에이
피터 유. 파크
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이뮤노젠 아이엔씨
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    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis

Abstract

CD20은 B 세포의 표면 상에 발현된 테트라스패닌 그룹의 막관통 단백질이며, 말초 혈액뿐만 아니라 림프 조직 유래의 B 세포 상에서 발견되었다. CD 20 발현은 형질 세포 분화 단계까지 초기 전 B 세포 단계로부터 지속된다. 반대로, 조혈모세포, 프로 B 세포, 분화된 형질 세포 또는 비림프 조직상에서 발견되지 않는다. 정상적인 B 세포에서의 발현에 더하여, CD20은, 비호지킨 림프종(NHL) 및 B 세포 만성림프성 백혈병(CLL)과 같은 B 세포 유래 악성 종양에서 발현된다. CD20 발현 세포는 염증을 포함한 다른 질환 및 장애에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 우수한 물리적 및 기능적 특성을 가지는 항-CD20 항체, 형태 및 절편; 면역컨쥬게이트, 조성물, 진단 시약, 성장 억제 방법, 치료 방법, 개선된 항체 및 세포주; 및 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 이를 암호화하는 유전자 구조체를 포함한다.CD20 is a transmembrane protein of the tetraspanin group expressed on the surface of B cells and was found on B cells derived from lymphoid tissue as well as peripheral blood. CD 20 expression continues from the early pre-B cell stage until the plasma cell differentiation stage. In contrast, it is not found on hematopoietic stem cells, pro B cells, differentiated plasma cells or nonlymphoid tissues. In addition to expression in normal B cells, CD20 is expressed in B cell derived malignancies such as non-Hodgkin's lymphoma (NHL) and B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL). CD20 expressing cells are known to play a role in other diseases and disorders, including inflammation. The present invention provides anti-CD20 antibodies, forms and fragments having excellent physical and functional properties; Immunoconjugates, compositions, diagnostic reagents, growth inhibition methods, methods of treatment, improved antibodies and cell lines; And polynucleotides, vectors and genetic constructs encoding them.

Description

ＣＤ２０ 항체 및 이의 용도{CD20 ANTIBODIES AND USES THEREOF}CD20 antibody and its use {CD20 ANTIBODIES AND USES THEREOF}

CD20 및 CD20 아이소폼(isoform)("CD20")은 일반적으로 B 세포의 표면 상에 발현된 테트라스패닌(tetra-spanin) 그룹의 막관통 단백질인 것으로 인식된다(Valentine et al., J. Biol. Chem., 264(19): 11282-1 1287 (1989); Einfeld et al., EMBO J., 7(3):711-717 (1988)). CD20은 대부분의 말초 혈액 B 세포뿐만 아니라 다양한 림프 조직 유래의 B 세포에 의해 발현된다. CD20 발현은 일반적으로 발생의 형질 세포 분화 단계까지 발생의 초기 전 B 세포 단계로부터 지속된다(Tedder et al., J. Immunol., 135(2):973-979 (1985)). CD20은 일반적으로 조혈모세포, 프로 B 세포(pro-B cell), 분화된 형질 세포 또는 비림프 조직상 등에서 발견되지 않는다. 정상적인 B 세포에서의 발현에 더하여, CD20은, 비호지킨 림프종(NHL) 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)과 같은 B 세포 유래 악성 종양(Anderson et al., Blood, 63(6): 1424-1433 (1984)), 및 면역 장애, 자가면역 질환 및 염증 질환에 수반된 B 세포에서 발현된다.CD20 and CD20 isoforms (“CD20”) are generally recognized to be transmembrane proteins of the tetra-spanin group expressed on the surface of B cells (Valentine et al., J. Biol) Chem., 264 (19): 11282-1 1287 (1989); Einfeld et al., EMBO J., 7 (3): 711-717 (1988)). CD20 is expressed by most peripheral blood B cells as well as B cells from various lymphoid tissues. CD20 expression generally continues from the initial B cell stage prior to development until the plasma cell differentiation stage of development (Tedder et al., J. Immunol., 135 (2): 973-979 (1985)). CD20 is generally not found on hematopoietic stem cells, pro-B cells, differentiated plasma cells, or nonlymphoid tissues. In addition to expression in normal B cells, CD20 is a B cell-derived malignant tumor such as non-Hodgkin's lymphoma (NHL) and B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) (Anderson et al., Blood, 63 (6): 1424-). 1433 (1984)), and B cells involved in immune disorders, autoimmune diseases and inflammatory diseases.

CD20의 정확한 기능은 불명확하지만, CD20은 칼슘 동원에 관련되고 칼슘 채널로서 작용을 할 수 있다(Tedder et al., J. Cell Biochem., 14D:195 (1990)). CD20은 B 세포의 활성화 및 분화에 수반될 수 있다(Tedder et al., Eur. J. Immunol, 16(8):881-887 (1986)).The exact function of CD20 is unclear, but CD20 is involved in calcium mobilization and can act as a calcium channel (Tedder et al., J. Cell Biochem., 14D: 195 (1990)). CD20 may be involved in the activation and differentiation of B cells (Tedder et al., Eur. J. Immunol, 16 (8): 881-887 (1986)).

CD20의 발현 프로파일 및 기존의 CD20 항체에 대한 지식은 CD20을 항체 요법에 대한 관심의 표적으로 만들었다. 일반적으로 CD20에 대한 항체는 이의 기능적 특성에 기초하여 분류된 것이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, I형 항체는 키메라화될 때 CD20을 지질뗏목 구획으로 분배하는 능력을 특징으로 하며, 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)을 매개할 수 있다(Deans JP, J Biol Chem 1998; 273: 344-8; Cragg MS, Blood 2003;101 :1045-52; 및 Cragg MS Blood. 2004;103:2738-2743). I형 항체는 가교결합되지 않는다면, 전형적으로 그 자체에 대하여 효과적인 프로아포토시스 활성(proapoptotic activity)을 갖지 않는다. 가교결합을 필요로 하는 I형 항체의 예는 리툭시맙 및 2F2(Cragg et al., Blood, 101(3):1045-1052 (2003); 및 Teeling et al., Blood, 104(6): 1793-1800 (2004)). 그에 반해서, II형 항체는 CD20을 지질뗏목으로 분배할 수 없다. 키메라화되면, II형 항체는 제한된 CDC 활성을 가진다. II형 항체는 자체의 강한 프로아포토시스 활성을 특징으로 한다. Bl 및 GA101은 II형 항체의 예이다(Cragg MS, Blood 2003; 101:1045-52; Cragg MS Blood. 2004; 103:2738-2743; 및 Umana et al, Blood, 108:72a, Abstract 229 (2006)). I형 및 II형 항체는 잠재적으로 항체 의존성 세포매개 세포독성(antibody dependent cell mediated cytotoxicity: ADCC)을 매개할 수 있다.Expression profiles of CD20 and knowledge of existing CD20 antibodies have made CD20 a target of interest in antibody therapy. In general, it is known in the art that antibodies against CD20 are classified based on their functional properties. For example, type I antibodies are characterized by the ability to distribute CD20 to the lipidraft compartment when chimerized and can mediate complement dependent cytotoxicity (CDC) (Deans JP, J Biol Chem 1998). 273: 344-8; Cragg MS, Blood 2003; 101: 1045-52; and Cragg MS Blood. 2004; 103: 2738-2743). Type I antibodies typically do not have effective proapoptotic activity on their own unless they are crosslinked. Examples of type I antibodies that require crosslinking include rituximab and 2F2 (Cragg et al., Blood, 101 (3): 1045-1052 (2003); and Teeling et al., Blood, 104 (6): 1793-1800 (2004). In contrast, type II antibodies cannot distribute CD20 to lipid rafts. Once chimerized, type II antibodies have limited CDC activity. Type II antibodies are characterized by their strong proapoptotic activity. Bl and GA101 are examples of type II antibodies (Cragg MS, Blood 2003; 101: 1045-52; Cragg MS Blood. 2004; 103: 2738-2743; and Umana et al, Blood , 108: 72a, Abstract 229 (2006 )). Type I and II antibodies can potentially mediate antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC).

B 세포 림프종과 같은 원치 않는 세포에 의한 CD20의 발현을 고려하면, 이러한 항원은 해로운 CD20 양성 세포(예컨대, 림프종 세포)를 표적화하는데 유용하다. 본질적으로, 이러한 표적화는 B 세포의 CD20 표면 항원에 대하여 특이적인 항체가 환자에게 투여되는 것으로 일반화된다. 이러한 항-CD20 항체는 특이적으로 정상 및 원치 않는(예컨대, 악성 및 면역반응성) B 세포 둘 다의 CD20 항원에 결합하고; CD20 표면 항원에 결합된 상기 항체는 B 세포의 파괴 및 고갈을 초래할 수 있다.Given the expression of CD20 by unwanted cells, such as B cell lymphoma, such antigens are useful for targeting harmful CD20 positive cells (eg, lymphoma cells). In essence, this targeting is generalized to the administration of an antibody specific for a CD20 surface antigen of B cells to a patient. Such anti-CD20 antibodies specifically bind to CD20 antigens of both normal and unwanted (eg, malignant and immunoreactive) B cells; The antibody bound to the CD20 surface antigen can lead to the destruction and depletion of B cells.

추가적으로, 종양 세포를 발현하는 CD20을 파괴하는 잠재력을 가지는 화학 작용제 또는 방사성 표지는 항-CD20 항체에 컨쥬게이트될 수 있어, 상기 제제는 신생 B 세포로 특이적으로 "전달"된다. 접근법에 관계없이, 주목적은 원치 않는 세포를 파괴하는 것이고; 구체적인 접근법은 이용되는 특정한 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있으며, 따라서 CD20 항원을 표적화하는데 이용가능한 접근법은 상당히 다양할 수 있다. 리툭시맙(RITUXAN(등록상표)) 항체는 CD20에 대한 유전자 조작된 키메라 뮤린(murine)/인간 단일클론 항체이다. 리툭시맙은 미국 특허 제5,736,137호(Anderson et al)에서 "C2B8"로 불린 항체이다. 리툭시맙은 현재 재발성 또는 난치성의 여포성 림프종의 치료에 대하여 승인되어 있다(Leget et al., Curr . Opin . Oncol., 10:548-551 (1998)). 보고서는, 주 1회 주입으로 리툭시맙이 48%의 전반적인 반응률을 초래하였음을 나타낸다. 그러나, 많은 환자들이 리툭시맙 치료에 반응하지 않으며, 리툭시맙을 복용하여 반응하는 환자들은 결국 재발하고 종종 리툭시맙 치료에 저항성이 생긴다. 예를 들어 현재 이용가능한 치료법에 대한 재발 및 저항성은 새로운 CD20 지향성 제제 및 치료법의 발견을 필요로 한다.In addition, chemical agents or radiolabels with the potential to disrupt CD20 expressing tumor cells may be conjugated to anti-CD20 antibodies such that the agent is specifically "delivered" to neoplastic B cells. Regardless of the approach, the primary purpose is to destroy unwanted cells; The specific approach can be determined by the particular anti-CD20 antibody used, and therefore the approaches available for targeting CD20 antigens can vary considerably. Rituximab (RITUXAN®) antibodies are genetically engineered chimeric murine / human monoclonal antibodies against CD20. Rituximab is an antibody called "C2B8" in US Pat. No. 5,736,137 to Anderson et al. Rituximab is currently approved for the treatment of recurrent or refractory follicular lymphoma (Leget et al., Curr . Opin . Oncol. , 10: 548-551 (1998)). The report shows that once weekly infusion, Rituximab resulted in an overall response rate of 48%. However, many patients do not respond to rituximab treatment, and patients who respond by taking rituximab eventually relapse and often become resistant to rituximab treatment. For example, relapse and resistance to currently available therapies requires the discovery of new CD20 directional agents and therapies.

이용가능한 항체의 제한 때문에, 리툭시맙의 특이적인 기능적 양태를 개선시키는 것을 목표로 하는, CD20에 대한 차세대 항체 치료제가 개발 중에 있다. 예를 들어, 오파투무맙의 경우에, 특히 CD20 항원 밀도가 더 낮은 세포에서 시험관내 CDC 활성이 개선된 인간 단일클론 2F2 항체가 보고되었다(Teeling et al, J. Immunol, 177(1):362-371 (2006)). 아푸투주맙(afutuzumab) 또는 GA101은 시험관 내시험관 내시맙에 비하여 프로아포토시스 활성의 개선이 거의 없음이 보고되었지만, GA101은 CDC 활성을 입증하지 못한다(Umana P, Blood 2006; 108:72a, Abstract 229 및 WO 2005/044859). 게다가, GA101은 ADCC 활성이 개선된 글리코조작된(glycoengineered) 인간화 항체이다(Umana et al., Blood 2006; 108:72a, Abstract 229; 및 WO 2005/044859). 다양한 개발 단계에서 다른 화합물은 리툭시맙 또는 다른 알려진 항-CD20 항체의 특정한 내재적 특성을 조금만 개선시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 지금까지 당업계에 알려진 문제점을 다루는 특유의 물리적 및 기능적 특징을 가지는 이용가능한 신규 분자는 없었다.Because of the limitations of the antibodies available, next generation antibody therapeutics against CD20 are under development, aiming to improve the specific functional aspects of rituximab. For example, in the case of opatumumab, human monoclonal 2F2 antibodies with improved CDC activity in vitro have been reported, particularly in cells with lower CD20 antigen density (Teeling et al, J. Immunol , 177 (1): 362 -371 (2006)). Although afutuzumab or GA101 has been reported to show little improvement in proapoptosis activity compared to in vitro in vitro nacimab, GA101 does not demonstrate CDC activity (Umana P, Blood 2006; 108: 72a, Abstract 229 and WO 2005/044859). In addition, GA101 is a glycoengineered humanized antibody with improved ADCC activity (Umana et al., Blood 2006; 108: 72a, Abstract 229; and WO 2005/044859). At various stages of development, other compounds have been reported to slightly improve certain intrinsic properties of rituximab or other known anti-CD20 antibodies. However, so far no new molecules are available that have unique physical and functional characteristics that address the problems known in the art.

리툭시맙은 또한 미국에서 적어도 하나의 TNF 길항제에 대하여 부적절한 반응이 있었던 중간 정도 활성 내지 심각한 활성의 RA가 있는 성인 환자에서 징후 및 증상을 감소시키는 MTX와 조합하여 승인되었다. 많은 연구가 다양한 비악성 자가면역 또는 염증성 장애, 예를 들어 RA에서 리툭시맙의 사용을 다루며, 여기에서 B 세포 및 자가항체는 질환 병태생리학에서 역할을 하는 것으로 보인다. (Edwards et al, Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)). 항-CD20 항체를 사용한 CD20의 표적화는, 예를 들어 RA(Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61 :883-888 (2002); Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002); Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al, Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), 루푸스(Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5: 157-159 (2003); Leandro et al. Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al, Lupus, 13: 312-316 (2004)), 면역성 혈소판 감소성 자반증(D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al, Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al., Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000); Zaja et al., Haematologica, 87:189-195 (2002); Ratanatharathorn et al, Ann. Int. Med., 133:275-279 (2000)), 적아구로(Auner et al., Br. J. Haematol, 116:725-728 (2002)); 자가면역성 빈혈(Zaja et al., supra (erratum appears in Haematologica 87:336 (2002)), 한랭응집소병(Layios et al., Leukemia, 15:187-8 (2001); Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J. Haematol., 115:79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol., 112:1083-1090 (2001); Zaja et al., Br. J. Haematol., 1 15:232-233 (2001)), 심각한 인슐린 저항성의 B형 증후군(Coll et al., N. Engl. J. Med., 350:310-311 (2004)), 혼합 한랭글로불린혈증(DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)), 중증 근무력증(Zaja et al., Neurology, 55:1062-1063 (2000); Wylam et al., J. Pediatr., 143:674-677 (2003)), 베게너 육아종증(Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001)), 난치성 심상성 천포창(Dupuy et al., Arch Dermatol, 140:91-96 (2004)), 피부근염(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)), 쇼그렌 증후군(Somer et al, Arthritis & Rheumatism, 49:394-398 (2003)), 활성 II형 혼합 한랭글로불린혈증(Zaja et al., Blood, 101 :3827-3834 (2003)), 심상성 천포창(Dupay et al., Arch. Dermatol., 140:91-95 (2004)), 자가면역 신경병증(Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)), 부종양성 안구간대경련-근간대경련 증후군(Pranzatelli et al. Neurology 60 (Suppl. 1) P05.128:A395 (2003)), 및 재발-이장성 다발성경화증(RRMS)(Cross et al. (abstract) "Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003))의 징후 및 증상을 잠재적으로 완화시키는 것으로 보고되었다.Rituximab has also been approved in combination with MTX which reduces signs and symptoms in adult patients with moderate to severely active RA who have had an inappropriate response to at least one TNF antagonist in the United States. Many studies deal with the use of rituximab in various nonmalignant autoimmune or inflammatory disorders, such as RA, where B cells and autoantibodies appear to play a role in disease pathophysiology. Edwards et al, Biochem Soc. Trans. 30: 824-828 (2002). Targeting CD20 with an anti-CD20 antibody is described, for example, in RA (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61: 883-888 (2002); Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9). ): S46 (2002); Stahl et al., Ann.Rheum.Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al, Arthritis Rheum. 48 (9): S439 (2003)), lupus (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5: 157-159 (2003); Leandro et al. Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al, Lupus, 13: 312-316 (2004)), Immune thrombocytopenic purpura (D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44: 561-562 (2003); Stasi et al, Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al., Semin.Oncol., 27 (Supp 12): 99-103 (2000); Zaja et al., Haematologica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn et al, Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)), Red eye (Auner et al., Br. J. Haematol, 116: 725-728 (2002)); Autoimmune anemia (Zaja et al., Supra (erratum appears in Haematologica 87: 336 (2002)), cold coagulation disease (Layios et al., Leukemia, 15: 187-8 (2001); Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001); Zaja et al., Br. J. Haematol., 1 15: 232-233 (2001)), severe insulin resistance type B syndrome (Coll et al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004) )), Mixed cold globulinemia (DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9: S206 / S469 (2002)), myasthenia gravis (Zaja et al., Neurology, 55: 1062-1063 (2000); Wylam et. al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), Wegener's granulomatosis (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), refractory vulgaris (Dupuy et al., Arch Dermatol, 140: 91-96 (2004)), Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1299 (2002)), Sjogren's syndrome (Somer et al, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-) 398 (2003)), Active Type II Mixed Cold Lobulinemia (Zaja et al., Blood, 101: 3827-3834 (2003)), vulgar pulmonary swelling (Dupay et al., Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004)), autoimmune neuropathy ( Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74: 485-489 (2003)), edema-specific ocular spasms-myoclonic syndrome (Pranzatelli et al. Neurology 60 (Suppl. 1) P05.128: A395 (2003)), and relapse-extensive multiple sclerosis ( RRMS) (Cross et al. (Abstract) "Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003)). It has been reported to be potentially mitigating.

CD20 항체, CD20-결합 분자, 및 자기 항원 백신에 관한 특허 및 특허 공개는 미국 특허 제5,776,456호, 제5,736,137호, 제5,843,439호, 제6,399,061호 및 제6,682,734호뿐만 아니라 US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885, US 2005/0186205, 및 WO 1994/11026(Anderson et al); 미국 특허 제6,455,043호, US 2003/0026804, US 2003/0206903, 및 WO 2000/09160(Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428(Grillo-Lopez 및 White); US 2004/0213784 및 WO 2000/27433(Grillo-Lopez 및 Leonard); WO 2000/44788(Braslawsky et al.); WO 2001/10462(Rastetter, W.); WO 2001/10461(Rastetter 및 White); WO 2001/10460(White 및 Grillo-Lopez); US 2001/0018041, US 2003/0180292, US 2002/0028178, WO 2001/34194, 및 WO 2002/22212(Hanna 및 Hariharan); US 2002/0006404 및 WO 2002/04021(Hanna 및 Hariharan); US 2002/0012665, US 2005/0180975, WO 2001/74388, 및 미국 특허 제6,896,885호 B5(Hanna, N.); US 2002/0058029(Hanna, N.); US 2003/0103971(Hariharan 및 Hanna); US 2005/0123540(Hanna et al.); US 2002/0009444 및 WO 2001/80884(Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858; US 2005/0112060, US 2002/0039557, 및 미국 특허 제6,846,476호(White, C); US 2002/0128448 및 WO 2002/34790(Reff, M.); WO 2002/060955(Braslawsky et al); WO 2002/096948(Braslawsky et al.); WO 2002/079255(Reff 및 Davies); 미국 특허 제6,171,586 및 6,991,790호, 및 WO 1998/56418(Lam et al.); US 2004/0191256 및 WO 1998/58964(Raju, S.); WO 1999/22764(Raju, S.); WO 1999/51642, 미국 특허 제6,194,551호, 미국 특허 제6,242,195호, 미국 특허 제6,528,624호 및 미국 특허 제6,538,124호(Idusogie et al.); 미국 특허 제7,122,637호, US 2005/0118174, US 2005/0233382, US 2006/0194291, US 2006/0194290, US 2006/0194957, 및 WO 2000/42072(Presta, L.); WO 2000/67796(Curd et al.); WO 2001/03734(Grillo-Lopez et al.); US 2002/0004587, US 2006/0025576, 및 WO 2001/77342(Miller 및 Presta); US 2002/0197256 및 WO 2002/078766(Grewal, I.); US 2003/0157108 및 WO 2003/035835(Presta, L.); 미국 특허 제5,648,267, 5,733,779, 6,017,733 및 6,159,730호, 및 WO 1994/11523(Reff et al.); 미국 특허 제6,565,827, 6,090,365, 6,287,537, 6,015,542, 5,843,398 및 5,595,721호(Kaminski et al.); 미국 특허 제5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 6,120,767, 6,652,852 및 6,893,625호뿐만 아니라 WO 1988/04936(Robinson et al.); 미국 특허 제6,410,391호(Zelsacher); 미국 특허 제6,224,866호 및 WO00/20864(Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945(Barbera-Guillem, E.); WO 2000/67795(Goldenberg); 미국 특허 제7,074,403호(Goldenberg 및 Hansen); 미국 특허 제7,151,164호(Hansen et al.); US 2003/0133930; WO 2000/74718 및 US 2005/0191300A1(Goldenberg 및 Hansen); US 2003/0219433 및 WO 2003/68821(Hansen et al); WO 2004/058298(Goldenberg 및 Hansen); WO 2000/76542(Golay et al); WO 2001/72333(Wolin 및 Rosenblatt); 미국 특허 제6,368,596호(Ghetie et al); 미국 특허 제6,306,393호 및 US 2002/0041847(Goldenberg, D.); US 2003/0026801(Weiner 및 Hartmann); WO 2002/102312(Engleman, E.); US 2003/0068664(Albitar et al.); WO 2003/002607(Leung, S.); WO 2003/049694, US 2002/0009427, 및 US 2003/0185796(Wolin et al.); WO 2003/061694(Sing 및 Siegall); US 2003/0219818(Bohen et al.); US 2003/0219433 및 WO 2003/068821(Hansen et al); US 2003/0219818(Bohen et al.); US 2002/0136719(Shenoy et al); WO 2004/032828 및 US 2005/0180972(Wahl et al.); 및 WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)를 포함한다. 또한 미국 특허 제5,849,898호 및 EP 330,191(Seed et al.); EP 332,865 A2(Meyer 및 Weiss); 미국 특허 제4,861,579호(Meyer et al.); US 2001/0056066(Bugelski et al.); WO 1995/03770(Bhat et al.); US 2003/0219433 Al(Hansen et al.); WO 2004/035607 및 US 2004/167319(Teeling et al); WO 2005/103081(Teeling et al.); US 2006/0034835, US 2006/0024300, 및 WO 2004/056312(Lowman et al.); US 2004/0093621(Shitara et al); WO 2004/103404(Watkins et al.); WO 2005/000901(Tedder et al.); US 2005/0025764(Watkins et al.); US 2006/0251652(Watkins et al); WO 2005/016969(Carr et al.); US 2005/0069545(Carr et al.); WO 2005/014618(Chang et al.); US 2005/0079174(Barbera-Guillem 및 Nelson); US 2005/0106108(Leung 및 Hansen); US 2005/0123546(Umana et al.); US 2004/0072290(Umana et al.); US 2003/0175884(Umana et al.); 및 WO 2005/044859(Umana et al.); WO 2005/070963(Allan et al); US 2005/0186216(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0202534(Hayden-Ledbetter 및 Ledbetter); US 2005/136049(Ledbetter et al.); US 2003/118592(Ledbetter et al.); US 2003/133939(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0202012(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0175614(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0180970(Ledbetter 및 Hayden-Ledbetter); US 2005/0202028(Hayden-Ledbetter 및 Ledbetter); US 2005/0202023(Hayden-Ledbetter 및 Ledbetter); WO 2005/017148(Ledbetter et al.); WO 2005/037989(Ledbetter et al.); 미국 특허 제6,183,744호(Goldenberg); 미국 특허 제6,897,044호(Braslawski et al.); WO 2006/005477(Krause et al.); US 2006/0029543(Krause et al); US 2006/0018900(McLCCormick et al); US 2006/0051349(Goldenberg 및 Hansen); WO 2006/042240(Iyer 및 Dunussi-Joannopoulos); US 2006/0121032(Dahiyat et al); WO 2006/064121(Teillaud et al.); US 2006/0153838(Watkins), CN 1718587(Chen et al.); WO 2006/084264(Adams et al.); US 2006/0188495(Barron et al.); US 2004/0202658 및 WO 2004/091657(Benynes, K.); US 2005/0095243, US 2005/0163775, WO 2005/00351, 및 WO 2006/068867(Chan, A.); US 2006/0135430 및 WO 2005/005462(Chan et al); US 2005/0032130 및 WO 2005/017529(Beresini et al); US 2005/0053602 및 WO 2005/023302(Brunetta, P.); US 2006/0179501 및 WO 2004/060052(Chan et al.); WO 2004/060053(Chan et al.); US 2005/0186206 및 WO 2005/060999(Brunetta, P.); US 2005/0191297 및 WO 2005/061542(Brunetta, P.); US 2006/0002930 및 WO 2005/115453(Brunetta et al); US 2006/0099662 및 WO 2005/108989(Chuntharapai et al.); CN 1420129A(Zhongxin Guojian Pharmaceutical); US 2005/0276803 및 WO 2005/113003(Chan et al); US 2005/0271658 및 WO 2005/117972(Brunetta et al); US 2005/0255527 및 WO 2005/11428(Yang, J.); US 2006/0024295 및 WO 2005/120437(Brunetta, P.); US 2006/0051345 및 WO 2005/117978(Frohna, P.); US 2006/0062787 및 WO 2006/012508(Hitraya, E.); US 2006/0067930 및 WO 2006/31370(Lowman et al.); WO 2006/29224(Ashkenazi, A.); US 2006/0110387 및 WO 2006/41680(Brunetta, P.); US 2006/0134111 및 WO 2006/066086(Agarwal, S.); WO 2006/069403(Ernst 및 Yansura); US 2006/0188495 및 WO 2006/076651(Dummer, W.); WO 2006/084264(Lowman, H.); WO 2006/093923(Quan 및 Sewell); WO 2006/106959(Numazaki et al.); WO 2006/126069(Morawala); WO 2006/130458(Gazit-Bornstein et al.); US 2006/0275284(Hanna, G.); US 2007/0014785(Golay et al.); US 2007/0014720(Gazit-Bornstein et al.); 및 US 2007/0020259(Hansen et al); US 2007/0020265(Goldenberg 및 Hansen); US 2007/0014797(Hitraya); US 2007/0224189(Lazar et al); 및 WO 2008/003319(Parren 및 Baadsgaard)를 참조할 수 있다.Patents and patent publications relating to CD20 antibodies, CD20-binding molecules, and self antigen vaccines are described in US Pat. 0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885, US 2005/0186205, and WO 1994/11026 (Anderson et al); US Patent No. 6,455,043, US 2003/0026804, US 2003/0206903, and WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez and White); US 2004/0213784 and WO 2000/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); Braslawsky et al., WO 2000/44788; WO 2001/10462 to Rastetter, W .; WO 2001/10461 (Rastetter and White); WO 2001/10460 to White and Grillo-Lopez; US 2001/0018041, US 2003/0180292, US 2002/0028178, WO 2001/34194, and WO 2002/22212 (Hanna and Hariharan); US 2002/0006404 and WO 2002/04021 (Hanna and Hariharan); US 2002/0012665, US 2005/0180975, WO 2001/74388, and US Pat. No. 6,896,885 B5 (Hanna, N.); US 2002/0058029 to Hanna, N .; US 2003/0103971 to Hariharan and Hanna; US 2005/0123540 to Hanna et al .; US 2002/0009444 and WO 2001/80884 to Grillo-Lopez, A .; WO 2001/97858; US 2005/0112060, US 2002/0039557, and US Pat. No. 6,846,476 (White, C); US 2002/0128448 and WO 2002/34790 (Reff, M.); Braslawsky et al; WO 2002/060955; Braslawsky et al., WO 2002/096948; WO 2002/079255 to Reff and Davies; US Pat. Nos. 6,171,586 and 6,991,790, and WO 1998/56418 to Lam et al .; US 2004/0191256 and WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 to Raju, S .; WO 1999/51642, US Pat. No. 6,194,551, US Pat. No. 6,242,195, US Pat. No. 6,528,624 and US Pat. 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No. 7,151,164 to Hansen et al .; US 2003/0133930; WO 2000/74718 and US 2005 / 0191300A1 (Goldenberg and Hansen); US 2003/0219433 and WO 2003/68821 to Hansen et al; WO 2004/058298 to Goldenberg and Hansen; Golay et al; WO 2000/76542; WO 2001/72333 (Wolin and Rosenblatt); US Patent No. 6,368,596 to Ghetie et al; US Patent No. 6,306,393 and US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); US 2003/0026801 to Weiner and Hartmann; WO 2002/102312 to Engleman, E .; US 2003/0068664 to Albitar et al .; WO 2003/002607 to Leung, S .; WO 2003/049694, US 2002/0009427, and US 2003/0185796 (Wolin et al.); WO 2003/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 to Bohen et al .; US 2003/0219433 and WO 2003/068821 to Hansen et al; US 2003/0219818 to Bohen et al .; US 2002/0136719 to Shenoy et al; WO 2004/032828 and US 2005/0180972 to Wahl et al .; And WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter). See also US Pat. Nos. 5,849,898 and EP 330,191 to Seed et al .; EP 332,865 A2 (Meyer and Weiss); US 4,861,579 to Meyer et al .; US 2001/0056066 to Bugelski et al .; Bhat et al., WO 1995/03770; US 2003/0219433 Al (Hansen et al.); WO 2004/035607 and US 2004/167319 (Teeling et al); Teeling et al., WO 2005/103081; US 2006/0034835, US 2006/0024300, and WO 2004/056312 to Lowman et al .; US 2004/0093621 to Shitara et al; WO 2004/103404 to Watkins et al .; Tedder et al., WO 2005/000901; US 2005/0025764 to Watkins et al .; US 2006/0251652 to Watkins et al; Carr et al., WO 2005/016969; US 2005/0069545 to Carr et al .; Chang et al., WO 2005/014618; US 2005/0079174 (Barbera-Guillem and Nelson); US 2005/0106108 to Leung and Hansen; US 2005/0123546 (Umana et al.); US 2004/0072290 to Umana et al .; US 2003/0175884 to Umana et al .; And WO 2005/044859 to Umana et al .; Allan et al, WO 2005/070963; US 2005/0186216 to Ledbetter and Hayden-Ledbetter; US 2005/0202534 (Hayden-Ledbetter and Ledbetter); US 2005/136049 to Ledbetter et al .; US 2003/118592 to Ledbetter et al .; US 2003/133939 to Ledbetter and Hayden-Ledbetter; US 2005/0202012 to Ledbetter and Hayden-Ledbetter; US 2005/0175614 to Ledbetter and Hayden-Ledbetter; US 2005/0180970 to Ledbetter and Hayden-Ledbetter; US 2005/0202028 (Hayden-Ledbetter and Ledbetter); US 2005/0202023 (Hayden-Ledbetter and Ledbetter); Ledbetter et al., WO 2005/017148; Ledbetter et al., WO 2005/037989; US Patent No. 6,183, 744 to Goldenberg; US Pat. No. 6,897,044 to Braslawski et al .; Krause et al., WO 2006/005477; US 2006/0029543 to Krause et al; US 2006/0018900 (McLCCormick et al); US 2006/0051349 to Goldenberg and Hansen; WO 2006/042240 to Iyer and Dunussi-Joannopoulos; US 2006/0121032 (Dahiyat et al); WO 2006/064121 to Teillaud et al .; US 2006/0153838 (Watkins), CN 1718587 (Chen et al.); Adams et al., WO 2006/084264; US 2006/0188495 to Barron et al .; US 2004/0202658 and WO 2004/091657 to Bennynes, K .; US 2005/0095243, US 2005/0163775, WO 2005/00351, and WO 2006/068867 to Chan, A .; US 2006/0135430 and WO 2005/005462 to Chan et al; US 2005/0032130 and WO 2005/017529 to Beresini et al; US 2005/0053602 and WO 2005/023302 to Brunetta, P .; US 2006/0179501 and WO 2004/060052 to Chan et al .; Chan et al., WO 2004/060053; US 2005/0186206 and WO 2005/060999 to Brunetta, P .; US 2005/0191297 and WO 2005/061542 to Brunetta, P .; US 2006/0002930 and WO 2005/115453 to Brunetta et al; US 2006/0099662 and WO 2005/108989 to Chuntharapai et al .; CN 1420129A from Zhongxin Guojian Pharmaceutical; US 2005/0276803 and WO 2005/113003 to Chan et al; US 2005/0271658 and WO 2005/117972 to Brunetta et al; US 2005/0255527 and WO 2005/11428 to Yang, J .; US 2006/0024295 and WO 2005/120437 to Brunetta, P .; US 2006/0051345 and WO 2005/117978 (Frohna, P.); US 2006/0062787 and WO 2006/012508 to Hitraya, E .; US 2006/0067930 and WO 2006/31370 to Lowman et al .; Ashkenazi, A., WO 2006/29224; US 2006/0110387 and WO 2006/41680 to Brunetta, P .; US 2006/0134111 and WO 2006/066086 to Agarwal, S .; WO 2006/069403 (Ernst and Yansura); US 2006/0188495 and WO 2006/076651 (Dummer, W.); WO 2006/084264 to Lowman, H .; WO 2006/093923 to Quan and Sewell; Numazaki et al., WO 2006/106959; WO 2006/126069 to Morawala; Gazit-Bornstein et al., WO 2006/130458; US 2006/0275284 to Hanna, G .; US 2007/0014785 to Golay et al .; US 2007/0014720 (Gazit-Bornstein et al.); And US 2007/0020259 to Hansen et al; US 2007/0020265 to Goldenberg and Hansen; US 2007/0014797 to Hitraya; US 2007/0224189 to Laza et al; And WO 2008/003319 (Parren and Baadsgaard).

항-CD20 항체를 이용한 치료에 관한 일부 과학 간행물은 다음을 포함한다: Perotta 및 Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Abstract #3360 Blood, 10(l)(part 1-2):88B (1998); Perotta et al., "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94:49 (abstract) (1999); Matthews, R., "Medical Heretics" New Scientist, (7 Apr., 2001); Leandro et al., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis., supra; Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism, 44(9):S370 (2001); Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus" Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)(여기에서, 2주의 기간 동안 각각의 환자들은 CD20의 항체의 2번의 500mg 주입, 사이클로포스파마이드 및 고용량의 경구 코르티코스테로이드의 2번의 750mg 주입을 받고, 치료받은 환자 중 2명은 각각 7개월 및 8개월 째에 재발하여 상이한 프로토콜이긴 하지만 재치료받음); "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide et al., Lupus, 12:779-782 (2003)(여기에서, 환자는 항-CD20 항체로 치료받으며(375㎎/㎡×4, 주간 간격으로 반복됨), 또한 항체 적용은 5 내지 6개월마다 이루어졌고, 그 다음 유지 요법은 3개월마다 375㎎/㎡의 항체로 받았으며, 난치성 SLE가 있는 제2 환자는 항-CD20 항체 리툭시맙으로 치료받고 3개월마다 유지 요법을 계속 받음); Edwards 및 Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology, 40:205-211 (2001); Cambridge et al., "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Cambridge et al., "Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis" Arthritis Rheum., 48:2146-2154 (2003); Edwards et al, "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem Soc. Trans., supra; Edwards et al., "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis", Arthritis and Rheumatism, 46(9):S197 (2002); Edwards et al., "Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis" N Engl. J. Med., 350:2572-2582 (2004); Pavelka et al., Ann. Rheum. Dis., 63:(Sl):289-290 (2004); Emery et al., Arthritis Rheum. 50 (S9):S659 (2004); Levine 및 Pestronk, "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology, 52:1701-1704 (1999); Uchida et al., "The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 antibody immunotherapy" J. Exp. Med., 199:1659-1669 (2004); Gong et al., "Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy" J. Immunol., 174:817-826 (2005); Hamaguchi et al., "The peritoneal cavity provides a protective niche for B1 and conventional B lymphocytes during anti-CD20 immunotherapy in mice" J. Immunol., 174:4389-4399 (2005); Cragg et al. "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy" Curr. Dir. Autoimmun., 8:140-174 (2005); Eisenberg, "Mechanisms of autoimmunity" Immunol. Res., 27:203-218 (2003); DeVita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum, 46:2029-2033 (2002); Higashida et al. "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology (Abstract #LB1 1), New Orleans, La. (October, 2002); Tuscano, "Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology, New Orleans, La. (October, 2002), published as Tuscano, Arthritis Rheum. 46:3420 (2002); "Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin 및 Chan, Immunity, 20:517-527 (2004); Silverman 및 Weisman, "Rituximab therapy and autoimmune disorders, prospects for anti-B cell therapy", Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003); Kazkaz 및 Isenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Current Opinion in Pharmacology, 4:398-402 (2004); Virgolini 및 Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases" Biomedicine & Pharmacotherapy, 58: 299-309 (2004); Klemmer et al., "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with an AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab" Arthritis And Rheumatism, 48(9) (SEP):S624-S624 (2003); Kneitz et al., "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases" Immunobiology, 206:519-527 (2002); Arzoo et al, "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD 20 monoclonal antibody (rituximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61(10):922-924 (2002) Comment in Ann. Rheum. Dis. 61 :863-866 (2002); "Future strategies in immunotherapy" by Lake and Dionne, in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (John Wiley & Sons, Inc., 2003) (Chapter 2 "Antibody-Directed Immunotherapy"); Liang 및 Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target (2002); 표제가 "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens"인 Appendix 4A, Stockinger et al., eds: Coligan et al., in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 2003); Penichet 및 Morrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering" in Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies (2002).Some scientific publications on treatment with anti-CD20 antibodies include: Perotta and Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Abstract # 3360 Blood, 10 (l) (part 1-2) : 88B (1998); Perotta et al., “Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)”, Blood, 94:49 (abstract) (1999); Matthews, R., "Medical Heretics" New Scientist, (7 Apr., 2001); Leandro et al., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis., Supra; Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism, 44 (9): S370 (2001); Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus" Arthritis and Rheumatism, 46: 2673-2677 (2002) (where, for two weeks, each patient received two 500 mg infusions of CD20 antibodies) , Two 750 mg infusions of cyclophosphamide and high doses of oral corticosteroids, and two of the treated patients relapse at 7 months and 8 months, respectively, but with different protocols but retreated); "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide et al., Lupus, 12: 779-782 (2003), where the patient is treated with an anti-CD20 antibody (375 mg / m 2 × 4 , Repeated at weekly intervals), and also antibody application every five to six months, followed by maintenance therapy with 375 mg / m2 antibody every three months, and a second patient with refractory SLE was treated with anti-CD20 antibody rituxi. Treated with Mab and continued maintenance therapy every three months); Edwards and Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology, 40: 205-211 (2001); Cambridge et al., "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Cambridge et al., "Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis" Arthritis Rheum., 48: 2146-2154 (2003); Edwards et al, "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem Soc. Trans., Supra; Edwards et al., "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis", Arthritis and Rheumatism, 46 (9): S197 (2002); Edwards et al., "Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis" N Engl. J. Med., 350: 2572-2582 (2004); Pavelka et al., Ann. Rheum. Dis., 63: (Sl): 289-290 (2004); Emery et al., Arthritis Rheum. 50 (S9): S659 (2004); Levine and Pestronk, "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology, 52: 1701-1704 (1999); Uchida et al., "The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 antibody immunotherapy" J. Exp. Med., 199: 1659-1669 (2004); Gong et al., "Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy" J. Immunol., 174: 817-826 (2005); Hamaguchi et al., "The peritoneal cavity provides a protective niche for B1 and conventional B lymphocytes during anti-CD20 immunotherapy in mice" J. Immunol., 174: 4389-4399 (2005); Cragg et al. "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174 (2005); Eisenberg, "Mechanisms of autoimmunity" Immunol. Res., 27: 203-218 (2003); DeVita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum, 46: 2029-2033 (2002); Higashida et al. "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology (Abstract # LB1 1), New Orleans, La. (October, 2002); Tuscano, "Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology, New Orleans, La. (October, 2002), published as Tuscano, Arthritis Rheum. 46: 3420 (2002); "Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin and Chan, Immunity, 20: 517-527 (2004); Silverman and Weisman, "Rituximab therapy and autoimmune disorders, prospects for anti-B cell therapy", Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003); Kazkaz and Isenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Current Opinion in Pharmacology, 4: 398-402 (2004); Virgolini and Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases" Biomedicine & Pharmacotherapy, 58: 299-309 (2004); Klemmer et al., "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with an AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab" Arthritis And Rheumatism, 48 (9) (SEP): S624-S624 (2003); Kneitz et al., "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases" Immunobiology, 206: 519-527 (2002); Arzoo et al, "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD 20 monoclonal antibody (rituximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61 (10): 922-924 (2002) Comment in Ann. Rheum. Dis. 61: 863-866 (2002); "Future strategies in immunotherapy" by Lake and Dionne, in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (John Wiley & Sons, Inc., 2003) (Chapter 2 "Antibody-Directed Immunotherapy"); Liang and Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target (2002); Appendix 4A, Stockinger et al., Eds: Coligan et al., In Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 2003), entitled "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens"; Penichet and Morrison, "CD Antibodies / molecules: Definition; Antibody Engineering" in Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies (2002).

또한, Looney, "B cells as a therapeutic target in autoimmune diseases other than rheumatoid arthritis" Rheumatology, 44 Suppl 2:iil3-iil7 (2005); Chambers 및 Isenberg, "Anti-B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Lupus, 14(3):210-214 (2005); Looney et al., "B-cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus: a phase I/II dose-escalating trial of rituximab" Arthritis Rheum., 50:2580-2589 (2004); Looney, "Treating human autoimmune disease by depleting B cells" Ann Rheum. Dis., 61 :863-866 (2002); Edelbauer et al., "Rituximab in childhood systemic lupus erythematosus refractory to conventional immunosuppression Case report" Pediatr. Nephrol., 20(6): 811-813 (2005); D'Cruz 및 Hughes, "The treatment of lupus nephritis" BMJ, 330(7488):377-378 (2005); Looney, "B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis" J. Rheumatol. Suppl., 73: 25-28-discussion 29-30 (2005); Sfikakis et al., "Remission of proliferative lupus nephritis following B cell depletion therapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory molecule CD40 ligand: an open-label trial" Arthritis Rheum., 52(2):501-513 (2005); Rastetter et al., "Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases" Annu. Rev. Med., 55:477-503 (2004); Silverman, "Anti-CD20 therapy in systemic lupus erythematosus: a step closer to the clinic" Arthritis Rheum., 52(2):371-377 (2005), Erratum in: Arthritis Rheum. 52(4):1342 (2005); Ahn et al., "Long-term remission from life-threatening hypercoagulable state associated with lupus anticoagulant (LA) following rituximab therapy" Am. J. Hematol., 78(2): 127-129 (2005); Tahir et al., "Humanized anti-CD20 monoclonal antibody in the treatment of severe resistant systemic lupus erythematosus in a patient with antibodies against rituximab" Rheumatology, 44(4):561-562 (2005), Epub 2005, Jan. 11; Looney et al., "Treatment of SLE with anti CD20 monoclonal antibody" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 193-205 (2005); Cragg et al., "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174 (2005); Gottenberg et al., "Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43 patients with systemic autoimmune diseases" Ann. Rheum. Dis., 64(6):913-920 (2005) Epub 2004 Nov. 18; Tokunaga et al., "Down-regulation of CD40 and CD80 on B cells in patients with life-threatening systemic lupus erythematosus after successful treatment with rituximab" Rheumatology 44(2): 176-182 (2005), Epub 2004 Oct. 19를 참조할 수 있다. 또한 문헌[Leandro et al., "B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl 9): SI 160 (2003)]를 참조할 수 있다.See also Looney, "B cells as a therapeutic target in autoimmune diseases other than rheumatoid arthritis" Rheumatology, 44 Suppl 2: iil3-iil7 (2005); Chambers and Isenberg, "Anti-B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Lupus, 14 (3): 210-214 (2005); Looney et al., "B-cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus: a phase I / II dose-escalating trial of rituximab" Arthritis Rheum., 50: 2580-2589 (2004); Looney, "Treating human autoimmune disease by depleting B cells" Ann Rheum. Dis., 61: 863-866 (2002); Edelbauer et al., "Rituximab in childhood systemic lupus erythematosus refractory to conventional immunosuppression Case report" Pediatr. Nephrol., 20 (6): 811-813 (2005); D'Cruz and Hughes, "The treatment of lupus nephritis" BMJ, 330 (7488): 377-378 (2005); Looney, "B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis" J. Rheumatol. Suppl., 73: 25-28-discussion 29-30 (2005); Sfikakis et al., "Remission of proliferative lupus nephritis following B cell depletion therapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory molecule CD40 ligand: an open-label trial" Arthritis Rheum., 52 (2): 501-513 ( 2005); Rastetter et al., "Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases" Annu. Rev. Med., 55: 477-503 (2004); Silverman, "Anti-CD20 therapy in systemic lupus erythematosus: a step closer to the clinic" Arthritis Rheum., 52 (2): 371-377 (2005), Erratum in: Arthritis Rheum. 52 (4): 1342 (2005); Ahn et al., "Long-term remission from life-threatening hypercoagulable state associated with lupus anticoagulant (LA) following rituximab therapy" Am. J. Hematol., 78 (2): 127-129 (2005); Tahir et al., "Humanized anti-CD20 monoclonal antibody in the treatment of severe resistant systemic lupus erythematosus in a patient with antibodies against rituximab" Rheumatology, 44 (4): 561-562 (2005), Epub 2005, Jan. 11; Looney et al., "Treatment of SLE with anti CD20 monoclonal antibody" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 193-205 (2005); Cragg et al., "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy" Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174 (2005); Gottenberg et al., "Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43 patients with systemic autoimmune diseases" Ann. Rheum. Dis., 64 (6): 913-920 (2005) Epub 2004 Nov. 18; Tokunaga et al., "Down-regulation of CD40 and CD80 on B cells in patients with life-threatening systemic lupus erythematosus after successful treatment with rituximab" Rheumatology 44 (2): 176-182 (2005), Epub 2004 Oct. See 19. See also Leandro et al., "B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl 9): SI 160 (2003).

또한, 베게너 육아종증을 치료하기 위하여 항-CD20 항체 및 고용량 글루코코르티코이드 375 ㎎/㎡의 4번의 주입의 사용을 개시한, 문헌[Specks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism, 44(12):2836-2840 (2001)]을 참조할 수 있다. cANCA가 재발할 때 상기 치료를 11개월 후에 반복하였지만, 치료는 글루코코르티코이드없이 하였다. 항-CD20 항체의 제2 코스 후 8개월 때, 환자의 질환은 완전관해 상태로 남아있었다. 다른 연구에서, 항-CD20 항체가 1㎎/㎏/일로 경구용 프레드니손과 함께 375㎎/㎡×4의 용량으로 사용될 때 심한 ANCA-연관 혈관염의 관해가 보고되었으며, 상기 항-CD20 항체는 제4주까지 40mg/일로 감소되었고,이후 16주에 걸쳐서 완전한 중지로 감소되었다. 4명의 환자는 재발/상승하는 ANCA 역가에 대하여 항-CD20 항체 단독으로 재치료되었다. 문헌[Keogh et al., Kidney Blood Press. Res., 26:293 (2003)]은 난치성 ANCA-연관 혈관염이 있는 환자는 4주간 375 ㎎/㎡ 용량의 항-CD20항체와 고용량의 글루코코르티코이드를 이용한 치료시 관해됨을 보고하였다.Also disclosed is the use of four infusions of anti-CD20 antibody and high dose glucocorticoid 375 mg / m 2 to treat Wegener's granulomatosis, Specks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism, 44 (12): 2836-2840 (2001). The treatment was repeated 11 months later when cANCA recurred, but the treatment was done without glucocorticoids. At 8 months after the second course of anti-CD20 antibody, the patient's disease remained completely relevant. In another study, remission of severe ANCA-associated vasculitis was reported when an anti-CD20 antibody was used at a dose of 375 mg / m 2 x 4 with oral prednisone at 1 mg / kg / day, the anti-CD20 antibody being a fourth It was reduced to 40 mg / day by week and then to complete stop over 16 weeks. Four patients were retreated with anti-CD20 antibody alone for recurrent / rising ANCA titers. Keog et al., Kidney Blood Press. Res., 26: 293 (2003), reported that patients with refractory ANCA-associated vasculitis were treated with 375 mg / m 2 doses of anti-CD20 antibody and high dose glucocorticoids for 4 weeks.

난치성 ANCA-연관 혈관염이 있는 환자는 면역억제 약제, 예를 들어 정맥내 사이클로포스파마이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린 또는 레플루노마이드와 함께 항-CD20 항체를 투여받았다. Eriksson, "Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab" Kidney and Blood Pressure Research, 26:294 (2003)(여기에서 ANCA-연관 혈관염이 있는 5명의 환자는 1주일에 한번 4주 동안 항-CD20 항체 375 ㎎/㎡로 치료받음); Jayne et al., "B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26:294-295 (2003)(배경 면역억제와 프레드니솔론과 함께 375㎎/㎡로 항-CD20 항체를 사이클로포스파마이드와 함께 주입을 4주간 받은 난치성 혈관염이 있는 6명의 환자가 혈관염 활성에서 변화를 겪음). 난치성 전신 혈관염이 있는 환자에게 투여에 있어서 4회 용량에서 용량 당 375㎎/㎡에서 정맥내 사이클로포스파마이드와 함께 항-CD20 항체를 사용한 추가 보고가 문헌[Smith 및 Jayne, "A prospective, open label trial of B-cell depletion with rituximab in refractory systemic vasculitis" poster 998 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), American Society of Nephrology, J. Am. Soc. Nephrol., 14:755A (2003)]에서 제공된다. 또한, 문헌[Eriksson, J. Internal Med., 257:540-548 (2005)](항-CD20 항체 500mg의 2주 또는 4주의 용량으로 치료한 ANCA-양성 혈관염이 있는 9명의 환자에 관한 것임); 및 [Keogh et al., Arthritis and Rheumatism, 52:262-268 (2005)](난치성 ANCA-연관 혈관염이 있는 11명의 환자에서, 4주간 항-CD20 항체 375㎎/㎡ 용량을 이용한 치료 또는 재치료는 전하는 바에 따르면 B-림프구 고갈에 의해 관해를 유도하였음을 보고함)을 참조할 수 있다.Patients with refractory ANCA-associated vasculitis received an anti-CD20 antibody in combination with an immunosuppressive agent, such as intravenous cyclophosphamide, mycophenolate mofetil, azathioprine or leflunomide. Eriksson, "Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab" Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003) (where five patients with ANCA-associated vasculitis once a week Treated with 375 mg / m 2 of anti-CD20 antibody for 4 weeks); Jayne et al., "B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294-295 (2003) 6 patients with refractory vasculitis who received 4 weeks of infusion with phamide experience changes in vasculitis activity). Further reports using anti-CD20 antibodies with intravenous cyclophosphamide at 4 doses at 375 mg / m2 per dose in administration to patients with refractory systemic vasculitis are described in Smith and Jayne, “A prospective, open label. trial of B-cell depletion with rituximab in refractory systemic vasculitis "poster 998 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), American Society of Nephrology, J. Am. Soc. Nephrol., 14: 755A (2003). In addition, Eriksson, J. Internal Med., 257: 540-548 (2005) (for nine patients with ANCA-positive vasculitis treated with a two or four week dose of 500 mg of anti-CD20 antibody). ; And [Keogh et al., Arthritis and Rheumatism, 52: 262-268 (2005)] (in 11 patients with refractory ANCA-associated vasculitis, treatment or retreatment with a 375 mg / m 2 dose of anti-CD20 antibody for 4 weeks Allegedly reported to have induced remission by B-lymphocyte depletion).

인간화 항-CD20 항체의 활성에 관해서, 예를 들어 문헌[Vugmeyster et al., "Depletion of B cells by a humanized anti-CD20 antibody PRO70769 in Macaca fascicularis," J. Immunother., 28:212-219 (2005)]을 참조할 수 있다. 인간 단일클론 항체의 논의에 있어서, 문헌[Baker et al., "Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator," Arthritis Rheum., 48:3253-3265 (2003)]을 참조할 수 있다. 항-CD20을 이용한 MINT 시험은 더 젊은 환자에서 공격성 비호지킨 림프종을 치료하는 것을 수반하여 수행되었다. (Pfreundschuh et al., Lancet Oncology, 7(5):379-391 (2006)).Regarding the activity of humanized anti-CD20 antibodies, see, eg, Vugmeyster et al., "Depletion of B cells by a humanized anti-CD20 antibody PRO70769 in Macaca fascicularis," J. Immunother., 28: 212-219 (2005 )]. For discussion of human monoclonal antibodies, see Baker et al., "Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator," Arthritis Rheum., 48: 3253-3265 (2003 )]. MINT trials with anti-CD20 were performed involving the treatment of aggressive non-Hodgkin's lymphoma in younger patients. (Pfreundschuh et al., Lancet Oncology, 7 (5): 379-391 (2006)).

또한 항체-세포독성제 컨쥬게이트(또는 "ACC")(또는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)라고도 불림)는 특화된 화학적 링커를 통하여 항체에 공유적으로 연결된 세포독성 제제로 이루어진 면역컨쥬게이트의 유형으로 알려져 있다. 세포독성제 또는 세포분열억제제, 즉 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 또는 억제하는 약물(문헌[Syrigos 및 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz 및 Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151 -172; U.S. Pat. No. 4,975,278] 참조)의 국소 전달을 위한 ACC의 사용은 종양으로 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 안에서 세포 내 축적이 되게 하며, 이러한 비컨쥬게이트된 약물 제제의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대하여 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있다(Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of 세포독성 Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 최소한의 독성을 가지는 최대한의 효능을 찾아내고자 한다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체 전부 때때로 이러한 점과 관련하여 유용한 것으로서 보고되었다(문헌[Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21 : 183-87] 참조). 이러한 점과 관련하여 사용된 것으로 알려진 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 포함한다(Rowland et al, Cancer Immunol. Immunother. 21 : 183-87 (1986)). 항체-독소 컨쥬게이트에 사용된 독소는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신(Kerr et al (1997) Bioconjugate Chem. 8(6):781-784; Mandler et al (2000) Journal of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드(EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리키아마이신(Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)과 같은 소분자독소를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포아이소머라아제 억제를 포함한 다양한 메커니즘을 통하여 세포독성 및/또는 세포분열억제 효과를 발휘할 수 있다. (Meyer, D. L. 및 Senter, P. D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" in Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Chapter 23, 229-237). 그러나 많은 세포독성 약물이 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드와 컨쥬게이트될 때 불활성화되거나 또는 활성이 작아지는 경향이 있다.Antibody-cytotoxic agent conjugates (or “ACCs”) (also called antibody-drug conjugates (ADCs)) are a type of immunoconjugate consisting of cytotoxic agents covalently linked to antibodies via specialized chemical linkers. Known. Cytotoxic or cytostatic agents, ie drugs that kill or inhibit tumor cells in the treatment of cancer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. The use of ACC for local delivery of Drg Del. Rev. 26: 151-172; US Pat. No. 4,975,278) results in targeted delivery of the drug moiety to the tumor, and intracellular accumulation therein, Systemic administration of unconjugated drug formulations can lead to unacceptable levels of toxicity for normal cells as well as tumor cells to be removed (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986) Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (Ed.s), pp. 603-05; 475-506). We want to find the maximum efficacy with the least toxicity. Both polyclonal and monoclonal antibodies have sometimes been reported as useful in this regard (see Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Drugs known to be used in this regard include daunomycin, doxorubicin, methotrexate and bindecine (Rowland et al, Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87 (1986)). Toxins used in antibody-toxin conjugates include bacterial toxins such as diphtheria toxins, plant toxins such as lysine, geldanamycin (Kerr et al (1997) Bioconjugate Chem. 8 (6): 781-784; Mandler et al (2000). ) Journal of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786- 791), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), and calicheamicin (Lode et al (1998) Cancer Res. 58 : 2928; small molecule toxins such as Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Toxins may exert cytotoxic and / or cytostatic effects through a variety of mechanisms including tubulin binding, DNA binding, or topoisomerase inhibition. (Meyer, D. L. and Senter, P. D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" in Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Chapter 23, 229-237). However, many cytotoxic drugs tend to be inactivated or less active when conjugated with large antibodies or protein receptor ligands.

항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 세포의 표면 상에 발현된 항원을 표적화하는 단일클론 항체 및 항체에 공유적으로 연결된 메이탄신 유래 화합물(예컨대, 미세소관 중합화를 억제하는 강력한 항유사분열 약물)로 구성되어 있다. (Chari RV, Acc. Chem. Res. 2008 Jan;41(1):98-107). 적절한 링커와 함께, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트(AMC)는 생체 내에서 안정적일 수 있고, 표적 항원을 발현하지 않는 세포에 대하여 상당히 덜 독성일 수 있으며, 이에 의하여 컨쥬게이트의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 세포 표면 상의 표적 항원에 결합 시, AMC는 내재화되고, 리소좀 내에서, 아마도 프로테아제에 의해 파괴되어, 활성 메이탄시노이드 대사산물을 생성한 다음, 상기 메이탄시노이드 대사산물은 미세소관에 결합하여 억제하며, 이에 의하여 세포 주기의 휴지기 그리고 궁극적으로는 아포토시스(apoptosis)에 의해 일어날 수 있는 세포 사멸을 촉발한다. (Erickson et al, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4426-33). 메이탄시노이드 컨쥬게이션과 함께, mAb는 시험관 내 및 생체 내에서 표적화된 사멸 활성을 개선시킬 수 있다.Antibody-maytansinoid conjugates are monoclonal antibodies that target antigens expressed on the surface of cells and maytansine-derived compounds covalently linked to the antibodies (eg, potent antimitotic drugs that inhibit microtubule polymerization). Consists of (Chari RV, Acc. Chem. Res. 2008 Jan; 41 (1): 98-107). With the appropriate linker, antibody-maytansinoid conjugates (AMC) can be stable in vivo and can be significantly less toxic to cells that do not express the target antigen, thereby increasing the therapeutic index of the conjugate. You can. Upon binding to the target antigen on the cell surface, AMC is internalized and destroyed in lysosomes, possibly by proteases, to produce active maytansinoid metabolites, which then bind to microtubules Inhibits cell death, thereby triggering cell death that can occur by the cell cycle resting period and ultimately by apoptosis. (Erickson et al, Cancer Res. 2006 Apr 15; 66 (8): 4426-33). In combination with maytansinoid conjugation, mAbs can improve targeted killing activity in vitro and in vivo.

현재, 다수의 ACC가 임상 실험 및 전임상 개발에서 연구되고 있다. 이상적으로, 면역컨쥬게이트는 항체 요법과 유사하게, 환자에게 용이하게 투여될 수 있다. 특히 트라스투주맙-SMCC-DM1(T-DM1)이라고 불리는 한 가지 ACC는, 트라스투주맙 및 화학 요법에 실패한 반면, 또한 유리한 낮은 독성 프로파일을 나타내는 HER2-과발현 전이성 유방암 환자에서 효과적인 것으로 보고되었다. 문헌[Vogel CL, ASCO 2009 Abstract #1017]을 참조할 수 있다.Currently, many ACCs are being studied in clinical trials and preclinical developments. Ideally, the immunoconjugate can be easily administered to a patient, similar to antibody therapy. One ACC, especially called trastuzumab-SMCC-DM1 (T-DM1), has been reported to be effective in patients with HER2-overexpressing metastatic breast cancer who have failed trastuzumab and chemotherapy, but also exhibit a favorable low toxicity profile. See Vogel CL, ASCO 2009 Abstract # 1017.

항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트, 예를 들어 비절단성 SMCC와 합성된 트라스투주맙-SMCC-DM1의 혈장 클리어런스는 항체 단독의 클리어런스와 비교하여 매우 느리다. (US2005/0169933). 이는 비교적 불안정한 이황화 결합으로 제조된 컨쥬게이트, 예를 들어 huC242-SPP-DM1의 혈장 클리어런스와 극명하게 대조적이다. 예를 들어, SMCC 컨쥬게이트의 클리어런스에 대한 반감기는 대략 320시간인 반면, SPP 컨쥬게이트에 대한 반감기는 약 40 내지 50시간의 범위이다. 그러나, 컨쥬게이트의 각각의 유형에 대한 항체 성분의 클리어런스는 동일하며, 이는 측정된 컨쥬게이트 클리어런스율에서의 상이함이 항체 컨쥬게이트로부터의(즉, SPP-DM1 컨쥬게이트의 경우에) 메이탄시노이드의 손실 때문일 수 있음을 시사한다. 비절단성 SMCC 연결은 아마도 SPP-DM1 컨쥬게이트보다 생체 내에서 훨씬 더 저항성의 메이탄시노이드-링커 절단 활성을 가진다. 또한, SPP-DM1 컨쥬게이트에 비하여 SMCC 링커 컨쥬게이트에 대한 감소된 클리어런스율은 곡선 아래의 면적(AuC)에 의해 측정된 바와 같이 동물의 전반적인 메이탄시노이드 노출에서 거의 5배 증가로 이어진다. 이러한 증가된 노출은 약물 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있다.Plasma clearance of trastuzumab-SMCC-DM1 synthesized with antibody-maytansinoid conjugates, such as non-cleavable SMCCs, is very slow compared to the clearance of the antibody alone. (US2005 / 0169933). This is in sharp contrast to the plasma clearance of conjugates made with relatively labile disulfide bonds, for example huC242-SPP-DM1. For example, the half-life for clearance of SMCC conjugates is approximately 320 hours, while the half-life for SPP conjugates is in the range of about 40-50 hours. However, the clearance of the antibody component for each type of conjugate is the same, which differs from the measured conjugate clearance rate from the antibody conjugate (ie in the case of the SPP-DM1 conjugate) This may be due to loss of noid. Non-cleavable SMCC linkages probably have much more resistant maytansinoid-linker cleavage activity in vivo than the SPP-DM1 conjugate. In addition, the reduced clearance rate for the SMCC linker conjugate compared to the SPP-DM1 conjugate leads to a nearly 5-fold increase in the overall maytansinoid exposure of the animal as measured by the area under the curve (AuC). Such increased exposure can have a significant impact on drug efficacy.

비절단성 링커로 제조된 메이탄시노이드 컨쥬게이트, 예를 들어 SMCC는 절단성 이황화 링커로 제조된 컨쥬게이트에 비하여 마우스에서 예상치못한 증가된 내약성(tolerability)을 보여준다. (US2005/0169933). 예를 들어, huC242-SMCC-DM1 및 huC242-SPP-DM1 컨쥬게이트의 내약성은 CD-1 마우스에서 단일 정맥내 투여량을 이용한 급성 독성 시험에서 비교되었다. 이황화-링커 컨쥬게이트 SPP-DM1에 대한 MTD가 45~90㎎/㎏의 범위이었던 반면, SMCC-DM1 컨쥬게이트에 대한 최대 내약 용량(MTD)는 시험된 가장 높은 투여량(150㎎/㎏)보다 더 컸다. 150㎎/㎏에서, SMCC-DM1로 처치된 그룹에서 모든 마우스는 생존한 반면, 치사 독성은 96시간 후-처치에 의하여 SPP-DM1로 처치된 그룹에서 모든 마우스에 대하여 관찰되었다. 추가적으로, 비환원성 티오에테르-연결된 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트 트라스투주맙-SMCC-DM1은 절단성 이황화-연결된 트라스투주맙-SMCC-DM1보다 래트에서 2 내지 3배 더 우수한 내약성을 보여주었다. (Lewis Phillips GD, Li G, Dugger DL, et al., Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1, an antibody-cytotoxic drug conjugate, Cancer Res 2008; 68:9280-90). 그러므로, 비절단성 링커로 제조된 항체 약물 컨쥬게이트, 예를 들어 SMCC는 전임상 모델에서 유리한 독성 및 약동학 파라미터를 나타낼 수 있다.Maytansinoid conjugates made with non-cleavable linkers, such as SMCC, show unexpectedly increased tolerability in mice compared to conjugates made with cleavable disulfide linkers. (US2005 / 0169933). For example, the tolerability of huC242-SMCC-DM1 and huC242-SPP-DM1 conjugates were compared in acute toxicity testing using a single intravenous dose in CD-1 mice. While the MTD for disulfide-linker conjugate SPP-DM1 ranged from 45-90 mg / kg, the maximum tolerated dose (MTD) for the SMCC-DM1 conjugate was higher than the highest dose tested (150 mg / kg). Was bigger. At 150 mg / kg all mice survived in the group treated with SMCC-DM1, whereas lethal toxicity was observed for all mice in the group treated with SPP-DM1 by 96 hours post-treatment. Additionally, the non-reducing thioether-linked antibody-maytansinoid conjugate trastuzumab-SMCC-DM1 showed two to three times better tolerability in rats than the cleavable disulfide-linked trastuzumab-SMCC-DM1. (Lewis Phillips GD, Li G, Dugger DL, et al., Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1, an antibody-cytotoxic drug conjugate, Cancer Res 2008; 68: 9280-90). Therefore, antibody drug conjugates made with non-cleavable linkers, such as SMCC, may exhibit beneficial toxicity and pharmacokinetic parameters in preclinical models.

CD20은 당업계에 알려져 있지만, 알려진 항-CD20 항체는 내재화가 잘 되지 않으므로, CD20은 항체-약물 컨쥬게이션에 대하여 유리한 표적이 아니다. (Press OW, Cancer Res. 1989; 49:4906-12 및 Vangeepuram N, Cancer 1997; 80 (Suppl.): 2425-30). CD20 항체의 컨쥬게이트는 이전에 연구되었지만, 특히 비이황화 연결 또는 산 안정적인 링커가 사용될 때 상당히 강한 효력을 나타내지 않았다.CD20 is known in the art, but since known anti-CD20 antibodies are not well internalized, CD20 is not an advantageous target for antibody-drug conjugation. (Press OW, Cancer Res. 1989; 49: 4906-12 and Vangeepuram N, Cancer 1997; 80 (Suppl.): 2425-30). Conjugates of CD20 antibodies have been studied previously, but did not show significant potency, especially when non-disulfide linkages or acid stable linkers are used.

예를 들어, 항-CD20 항체의 비절단성 SMCC-DM1 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트 항체와 동일한 효능을 가지는 반면, 동일한 항체의 절단성 SPP-DM1 컨쥬게이트만은 SCID 마우스의 Granta-519 이종이식 모델에서 미미하게 개선된 효능을 보인 것으로 보고되었다. (Polson et al., Cancer Res ., 69(6):2358-2364 (2009)). 유사하게, 산-안정성 아마이드 링커로 제조된 항-CD20 항체의 칼리키아마이신 컨쥬게이트는 누드 마우스의 Ramos 이종이식 모델에서 리툭시맙에 비하여 개선된 생체 내 효능을 보이지 않은 것은 것으로 보고되었다. 산-안정성 다이메틸 하이드라자이드 Ac-But 링커로 제조된 리툭시맙의 칼리키아마이신 컨쥬게이트만이 이 연구에서 개선된 생체 내 효능을 보였다. (DiJoseph　et　al., Cancer Immunol . Immunotherapy, 56(7):1107-1117 (2007)). 상이한 연구에서, 항-CD20 항체의 산 불안정성 아드리아마이신 컨쥬게이트는 Daudi 이종이식 모델에 대하여 단지 중간 정도로 효과적이었던 것으로 보고되었다. 동일한 항체의 산 안정성 아드리아마이신 컨쥬게이트는 완전히 효과적이지 않은 것으로 나타났다. (Braslawsky et al., Cancer Immunol Immunotherapy, 33:367-74 (1991)). 보고에 의하면 리툭시맙-vcMMAE로서 효소-절단성 펩티드 연결을 통하여 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)에 컨쥬게이트된 리툭시맙은 Ramos 림프종 세포에 대하여 시험관 내 및 생체 내 효능을 보였다. (Law et al., Clin. Cancer Res., 10(23):7842-7851 (2004); Erratum in: Clin. Cancer Res., 11(10):3969 (2005)).For example, the non-cleavable SMCC-DM1 conjugate of the anti-CD20 antibody has the same potency as the non-conjugate antibody, whereas only the cleavable SPP-DM1 conjugate of the same antibody is in the Granta-519 xenograft model of SCID mice. It has been reported to show slightly improved efficacy. (Polson et al., Cancer Res . , 69 (6): 2358-2364 (2009)). Similarly, it has been reported that the calicheamicin conjugates of anti-CD20 antibodies made with acid-stable amide linkers did not show improved in vivo efficacy over rituximab in the Ramos xenograft model of nude mice. Only the calicheamicin conjugate of rituximab made with the acid-stable dimethyl hydrazide Ac-But linker showed improved in vivo efficacy in this study. (DiJoseph et al., Cancer Immunol . Immunotherapy , 56 (7): 1107-1117 (2007)). In different studies, acid labile adriamycin conjugates of anti-CD20 antibodies were reported to be only moderately effective against the Daudi xenograft model. Acid stable adriamycin conjugates of the same antibody have been shown to be not completely effective. Braslawsky et al., Cancer Immunol Immunotherapy , 33: 367-74 (1991)). Reportedly, rituximab conjugated to monomethyl auristatin E (MMAE) via enzyme-cleavable peptide linkage as rituximab-vcMMAE has shown in vitro and in vivo efficacy against Ramos lymphoma cells. (Law et al., Clin. Cancer Res . , 10 (23): 7842-7851 (2004); Erratum in: Clin. Cancer Res., 11 (10): 3969 (2005)).

B 세포 장애의 치료에서 효과적인 단일클론 항체의 능력을 개선시 다른 보고된 접근법은 항체에 방사성 표지를 컨쥬게이트하여 표지가 항원 부위에 국재화되도록 한다. CD20-표적화 방사성-면역컨쥬게이트인 벡사(Bexxar(등록상표))(131I-토시투모맙) 및 제발린(Zevalin)(90Y-이브리투모맙 티욱세탄)은 리툭시맙에 대하여 난치성인 환자를 포함하여, 재발성 또는 난치성의 비호지킨 B 세포 림프종 환자에 대하여 승인되었다. 임상적 세팅에서, 일부 리툭시맙-난치성 환자는 벡사(등록상표)에 대해 차도를 보였다. (Horning, J. Clin. Oncol. 2005; 23:712-9). 제발린 및 리툭시맙이 재발성 또는 난치성의 낮은 등급 또는 여포성 NHL에서 비교될 때, 보고에 의하면 제발린 치료는 리툭시맙 치료보다 상당히 더 양호한 전반적이면서 완전한 반응률을 보였다. (Witzig, J Clin Oncol 2002; 20:2453-2463). 이들 임상 데이터는 항-CD20 방사성-면역컨쥬게이트가 리툭시맙보다 더 효과적일 수 있음을 시사하는 반면, 항-CD20 방사성-면역컨쥬게이트는 방사성 화합물을 사용하는 것과 연관된 투여에서 추가적인 독성 및 어려움 때문에 광범위하게 사용되지 않는다. 따라서, 투여하기에 용이하면서 독성이 더 낮은 효과적인 항-CD20 항체 및 컨쥬게이트를 개발할 필요성이 있어왔다.Another reported approach in improving the ability of monoclonal antibodies to be effective in the treatment of B cell disorders is to conjugate radiolabels to the antibodies so that the labels are localized at the antigenic site. Bexxar (R) (131I-Tositumomab) and Zevalin (90Y-Ibritumomab Tioxetane), CD20-targeted radio-immunoconjugates, were used to treat patients refractory to rituximab. Including, for patients with relapsed or refractory non-Hodgkin's B cell lymphoma. In clinical settings, some Rituximab-refractory patients showed a remission for Bexa. (Horning, J. Clin. Oncol. 2005; 23: 712-9). When zevalin and rituximab are compared in relapsed or refractory low grade or follicular NHL, the reported zevalin treatment showed a significantly better overall and complete response rate than rituximab treatment. (Witzig, J Clin Oncol 2002; 20: 2453-2463). These clinical data suggest that anti-CD20 radio-immunoconjugates may be more effective than rituximab, while anti-CD20 radio-immunoconjugates may be due to additional toxicity and difficulty in administration associated with the use of radioactive compounds. Not widely used Thus, there has been a need to develop effective anti-CD20 antibodies and conjugates that are easy to administer but less toxic.

따라서, 공지된 치료제보다 특이성, 감소된 톡성, 안정성 및 향상된 물리적 및 기능적 특성을 나타내는 항체 또는 항체 절편을 포함하여 개선되고 우수한 CD20 표적화 치료제의 개발에 대한 필요성이 계속 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.Accordingly, there is a continuing need for the development of improved and superior CD20 targeted therapeutics, including antibodies or antibody fragments that exhibit specificity, reduced talk, stability and improved physical and functional properties over known therapeutic agents. The present invention addresses this need.

이제 본 발명의 특정 양태에 대하여 상세하게 언급할 것이며, 이의 예는 수반되는 구조식 및 화학식에 예시된다. 본 발명은 열거된 양태와 함께 기술될 것이지만, 이들 예가 본 발명을 이러한 양태로 한정하고자 함이 아닌 것으로 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 청구항으로 한정되는 바와 같은 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 균등물을 포함하는 것으로 의도된다. 당업자는 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이며, 이는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.Reference will now be made in detail to certain embodiments of the invention, examples of which are illustrated in the accompanying structural formulas and formulas. While the invention will be described in conjunction with the enumerated embodiments, it will be understood that these examples are not intended to limit the invention to these embodiments. On the contrary, the invention is intended to cover all alternatives, modifications and equivalents as may be included within the scope of the invention as defined by the claims. Those skilled in the art will recognize many methods and materials similar or equivalent to those described herein, which can be used in the practice of the present invention.

하나의 양태에서, 본 발명은 항-CD20 항체 및/또는 이의 절편이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 세포융해 항-CD20 항체 및/또는 이의 절편이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항-CD20 세포융해 항체 및 절편은, CD20을 발현하는 B 세포가 질병의 진행에 영향을 미치는 질병의 치료에서 유용하다. 하나의 양태에서, 표적화된 B 세포는 원하지 않는다. 하나의 양태에서, 질병은 원치 않는 B 세포의 활성을 수반한다. 하나의 양태에서, 질병은 B 세포 질환이다. 본 발명의 다른 양태는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있다. 바람직한 양태에서, 질병은 비호지킨 림프종이다.In one embodiment, the invention is an anti-CD20 antibody and / or fragment thereof. In one embodiment, the invention is a cytolytic anti-CD20 antibody and / or fragments thereof. In one embodiment of the invention, the anti-CD20 fusion antibodies and fragments are useful in the treatment of diseases in which B cells expressing CD20 affect disease progression. In one embodiment, targeted B cells are not desired. In one embodiment, the disease involves the activity of unwanted B cells. In one embodiment, the disease is a B cell disease. Another aspect of the invention is an antibody or fragment thereof that specifically binds to a CD20 antigen, wherein the antibody or fragment can induce apoptosis, antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC). In a preferred embodiment, the disease is non-Hodgkin's lymphoma.

본 발명의 하나의 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있고, 항체 또는 절편은 뮤린, 비인간, 인간화, 키메라, 재표면화(resurfaced) 또는 인간의 것이다. 본 발명의 다른 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있고, 상기 항체 또는 절편은 단일클론 또는 단일 사슬이다.One aspect of the invention is an antibody or fragment thereof that specifically binds to CD20, wherein the antibody or fragment is capable of inducing apoptosis, antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC), The antibody or fragment is of murine, nonhuman, humanized, chimeric, resurfaced or human. Another aspect of the invention is an antibody or fragment thereof that specifically binds CD20, wherein the antibody or fragment is capable of inducing apoptosis, antibody dependent cytotoxic cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) Antibodies or fragments are monoclonal or single chain.

본 발명의 하나의 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편을 포함하며, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있고, 상기 항체는 CHO 또는 NS0 세포로부터 획득된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 그의 절편은 CD20의 제3 막관통 도메인과 제4 막관통 도메인 사이에 위치하는 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합한다.One aspect of the invention includes an antibody or fragment thereof that specifically binds CD20, wherein the antibody or fragment is capable of inducing apoptosis, antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC). And the antibody is obtained from CHO or NS0 cells. In another embodiment of the invention, the antibody or fragment thereof specifically binds to at least one amino acid comprising an amino acid residue located between the third transmembrane domain and the fourth transmembrane domain of CD20.

본 발명의 다른 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 서열번호 45의 아미노산, 또는 GI 21330989, GenBank Protein ID 23110989 등 중의 임의의 하나에 해당하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 다른 양태는 항체 또는 절편이며, 상기 항체 또는 절편은 CD20을 발현하는 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 항체 또는 절편은 III형 항체이며, 이는 II형 항체와 유사하게 가교제의 부재 하에 아포토시스를 상당히 유도하는 능력을 가지고, I형 항체와 유사하게 CD20의 지질뗏목으로의 재분배를 야기하고 보체 의존성 세포독성(CDC)을 상당히 유도할 능력을 가진다.In another embodiment of the invention, the antibody or fragment thereof specifically binds at least one amino acid comprising the amino acid of SEQ ID NO: 45, or a sequence corresponding to any one of GI 21330989, GenBank Protein ID 23110989 and the like. Another aspect of the invention is an antibody or fragment, which may induce the death of cells expressing CD20. In another embodiment of the invention, the antibody or fragment is a type III antibody, which has the ability to significantly induce apoptosis in the absence of crosslinking agents similar to type II antibodies, and redistributes CD20 to lipid rafts similar to type I antibodies And significantly induce complement dependent cytotoxicity (CDC).

본 발명의 하나의 양태는 항-CD20 항체 또는 절편을 포함하며, 상기 항체 또는 절편은 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA 또는 FACS 분석에서 CD20에 특이적으로 결합한다.One embodiment of the invention includes an anti-CD20 antibody or fragment, which antibody or fragment specifically binds CD20 in Western blot, ELISA or FACS analysis.

본 발명의 하나의 양태에서, 항-CD20 항체 또는 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGDCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 다이아바디(diabody), (scFv)2, 단일 도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, 또는 scFv-Fc를 포함한다. 본 발명의 다른 양태는 항체 또는 절편 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 이의 컨쥬게이트이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 IgG1 불변 도메인, IgG2 불변 도메인, IgG3 불변 도메인 및 IgG4 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 양태에서 항-CD20 항체는 CD20-6이다. 본 발명의 다른 양태에서, 항-CD20 항체는 CD20-7이다.In one embodiment of the invention, the anti-CD20 antibody or fragment is a Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fd, single chain Fv or scFv, disulfide linked Fv, V-NAR domain, IgNar, intrabody ), IgGDCH2, minibody, F (ab ') 3 , tetrabody, triabody, diabody, (scFv) 2 , single domain antibody, DVD-Ig, Fcab, mAb 2 , or scFv-Fc. Another aspect of the invention is a conjugate thereof comprising an antibody or fragment and / or an immunoglobulin heavy chain constant domain. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment, immunoglobulin heavy chain constant domain is selected from the group consisting of an IgG 1 constant domain, an IgG 2 constant domain, an IgG 3 constant domain and an IgG 4 constant domain. In one embodiment of the invention the anti-CD20 antibody is CD20-6. In another embodiment of the invention, the anti-CD20 antibody is CD20-7.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 림프종 세포의 아포토시스를 유도한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 Ramos 림프종 세포 및/또는 Raji 림프종 세포 및/또는 WSU-DLCL-2 림프종 세포 및/또는 Jeko-1 림프종 세포 및/또는 Granta-519 림프종 세포의 아포토시스를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재 하에 아넥신(Annexin)-V 염색에 의하여 측정된 바와 같이 Ramos 림프종 세포 및/또는 Raji 림프종 세포 및/또는 WSU-DLCL-2 림프종 세포 및/또는 Jeko-1 림프종 세포 및/또는 Granta-519 림프종 세포의 아포토시스를 유도한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재 하에 아넥신-V 염색에 의하여 측정된 바와 같이 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48% 및/또는 Raji 림프종 세포의 적어도 약 53% 및/또는 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34% 및/또는 Jeko-1 림프종 세포의 적어도 약 12% 및/또는 Granta-519 림프종 세포의 적어도 약 40%에서 아포토시스를 유도한다.In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof induces apoptosis of lymphoma cells. In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof is Ramos lymphoma cell and / or Raji lymphoma cell and / or WSU-DLCL-2 lymphoma cell and / or Jeko-1 lymphoma cell and / or Granta-519 lymphoma Apoptosis of cells. In another aspect of the invention, the antibodies, fragments and / or conjugates thereof of the invention are Ramos lymphoma cells and / or Raji lymphoma cells and / or as measured by Annexin-V staining in the absence of crosslinking agents. Induces apoptosis of WSU-DLCL-2 lymphoma cells and / or Jeko-1 lymphoma cells and / or Granta-519 lymphoma cells. In one embodiment of the invention, the antibody, fragment and / or conjugate thereof is at least about 48% of Ramos lymphoma cells and / or at least about Raji lymphoma cells as measured by Annexin-V staining in the absence of a crosslinking agent. Apoptosis is induced in 53% and / or at least about 34% of WSU-DLCL-2 lymphoma cells and / or at least about 12% of Jeko-1 lymphoma cells and / or at least about 40% of Granta-519 lymphoma cells.

본 발명의 다른 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재 하에 약 0.2nM 이하의 EC50으로 림프종 세포의 아포토시스를 유도할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 가교제의 부재하에서 0.2nM 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포의 적어도 48%에서 아포토시스를 유도할 수 있다.In another aspect of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof may induce apoptosis of lymphoma cells with an EC 50 of about 0.2 nM or less in the absence of a crosslinking agent. In another aspect of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof may induce apoptosis in at least 48% of Ramos lymphoma cells with an EC 50 of 0.2 nM or less in the absence of a crosslinking agent.

본 발명의 다른 양태에서, 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20을 발현하는 세포막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20을 발현하는 림프종 세포 및/또는 CD20을 발현하는 면역-조절 세포의 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 Ramos 림프종 세포의 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다.In another aspect of the invention, the antibody, fragment and / or conjugate thereof can efficiently translocate CD20 to the lipidraft compartment of the cell membrane expressing CD20. In another aspect of the invention, the antibodies, fragments and / or conjugates thereof of the invention can efficiently translocate CD20 to lipidraft compartments of membranes of lymphoma cells expressing CD20 and / or immuno-regulatory cells expressing CD20. have. In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof can efficiently translocate CD20 into the lipidraft compartment of the membrane of Ramos lymphoma cells.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 보체가 있는 약 5% 인간 혈청의 존재 하에서 CDC에 의하여 약 0.018㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포를 사멸하고/사멸하거나 약 0.25㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Daudi 림프종 세포를 사멸하고/사멸하거나 약 0.58㎍/㎖ 이하의 EC50으로 WSU-DLCL-2 림프종 세포를 사멸한다.In one embodiment of the invention, the antibody, fragment and / or conjugate thereof kills / kills Ramos lymphoma cells with an EC 50 of about 0.018 μg / ml or less by CDC in the presence of about 5% human serum with complement. Or kill Daudi lymphoma cells with an EC 50 of about 0.25 μg / ml or less and / or kill WSU-DLCL-2 lymphoma cells with an EC 50 of about 0.58 μg / ml or less.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 이는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 이는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 이는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나, 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 가진다.In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof binds to an epitope on CD20, which does not include or require amino acid residues proline at positions 170 and / or 172. In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof binds to an epitope on CD20, which comprises or has the amino acid residues asparagine at positions 163 and / or 166. In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof binds to an epitope on CD20, which does not include or require amino acid residues proline at positions 170 and / or 172, and / or positions 163 and / or 166 Contains or has the amino acid residue asparagine at

본 발명의 하나의 양태에서, 항체, 절편 또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 상의 에피토프에 결합하며, 여기에서 CD20 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 프롤린을 가지지 않고/않거나 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 가지지 않는다.In one embodiment of the invention, the antibody, fragment or conjugate thereof binds an epitope on CD20, wherein the CD20 epitope does not have proline at positions 170 and / or 172 and / or amino acid residues at positions 163 and / or 166 Do not have asparagine.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 서열번호 25~30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 서열번호 17~22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 서열번호 25~30 및 17~22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기에서 상기 항체 또는 절편은 CD20에 결합한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 포함하며, 여기에서 상기 중쇄는 서열번호 20~22 또는 28~30의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 17~19 또는 25~27의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, Ab 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 96%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 97%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 98%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36의 아미노산 서열을 가진다.In one embodiment of the invention, the antibody or fragment thereof comprises at least one complementarity determining region having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25-30. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment thereof comprises at least one complementarity determining region having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17-22. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment comprises at least one complementarity determining region having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25-30 and 17-22, wherein the antibody or fragment is present in CD20. To combine. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment comprises at least one heavy chain and at least one light chain, wherein the heavy chain comprises three sequential complementarity determinations having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20-22 or 28-30 Wherein said light chain comprises three sequential complementarity determining regions having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 17-19 or 25-27. In one embodiment of the invention, the Ab or segment heavy chain has at least 90% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment heavy chain has at least 96% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment heavy chain has at least 97% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment has at least 98% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment heavy chain has at least 99% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment heavy chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36.

분비 신호 서열을 형성하는 서열은 성숙한 폴리펩티드에 존재하지 않는다.The sequence that forms the secretory signal sequence is not present in the mature polypeptide.

본 발명은 인간 CD20에 결합하는 재표면화한 항체, 또는 이의 항원-결합 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며, 이는 생체 내에서 B 세포를 고갈시킨다. 또 다른 양태에서, B 세포는 인간 또는 사이노몰거스 원숭이에서 유래한다. 다른 양태에서, CDR은, 잔기가 공여자 항체 유래의 것도 아니고 수용자 항체 유래의 것도 아닌 아미노산 치환을 포함한다.The present invention provides resurfaced antibodies that bind to human CD20, or antigen-binding fragments thereof and / or conjugates thereof, which deplete B cells in vivo. In another embodiment, the B cells are from human or cynomolgus monkeys. In other embodiments, the CDRs comprise amino acid substitutions wherein the residues are neither from donor antibodies nor from recipient antibodies.

바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 전장 항체이며, 여기에서 VH 영역은 인간 IgG 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 바람직한 양태에서, IgG는 인간 IgG1 또는 IgG3이다.In a preferred embodiment, the antibody of the invention is a full length antibody, wherein the VH region is linked to a human IgG heavy chain constant region. In some preferred embodiments, the IgG is human IgG 1 or IgG 3 .

본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 96%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 97%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 98%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열을 가진다. 하나의 양태에서, 재표면화한 항-CD20 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20-7, 또는 이의 절편이다.In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has at least 90% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has at least 95% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has at least 96% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has at least 97% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has at least 98% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has at least 99% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment light chain thereof has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, 32 or 33. In one embodiment, the resurfaced anti-CD20 antibody and / or conjugate thereof is CD20-7, or a fragment thereof.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 CD20에 특이적으로 결합하는 개선된 항체 또는 절편이며, 이는 다음에 의해 제조된다: (a) 서열번호 32~36, 46, 47, 17~22, 25~30 및 1~7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 항체 또는 그의 절편을 암호화하는 DNA를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 상기 DNA로의 삽입을 도입하여 상기 DNA에 의해 암호화된 상기 항체 또는 항체 절편의 아미노산 서열이 변화되는 단계; (c) 상기 항체 또는 항체 절편을 발현하는 단계; (d) 상기 개선에 대하여 상기 발현된 항체 또는 항체 절편을 스크리닝하여, 상기 개선된 항체 또는 항체 절편이 제조되는 단계. 본 발명의 하나의 양태에서, 개선은 CD20에 대한 친화도의 증가이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 친화도의 증가는 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 매개 위치 지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling), 및 E. coli의 돌연변이 유발 유전자-균주의 사용에 의해 이루어진 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 삽입에 기인한다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 CD20에 대한 결합활성의 증가이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 CD20을 발현하는 세포에 대한 세포독성 활성의 증가이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 발현 수준의 증가이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개선은 유전자형 활성의 증가이다.In one embodiment of the invention, the antibody or fragment is an improved antibody or fragment that specifically binds to CD20, which is prepared by: (a) SEQ ID NOs: 32-36, 46, 47, 17-22, Providing a DNA encoding an antibody or fragment thereof comprising at least one sequence selected from the group consisting of 25-30 and 1-7; (b) introducing at least one nucleotide mutation, deletion or insertion into the DNA to change the amino acid sequence of the antibody or antibody fragment encoded by the DNA; (c) expressing said antibody or antibody fragment; (d) screening said expressed antibody or antibody fragment for said improvement, wherein said improved antibody or antibody fragment is prepared. In one embodiment of the invention, the improvement is an increase in affinity for CD20. In another embodiment of the present invention, the increase in affinity can be achieved by known methods such as oligonucleotide mediated positional mutagenesis, cassette mutagenesis, error-prone PCR, DNA shuffling, And at least one nucleotide mutation, deletion or insertion made by the use of a mutagenesis gene-strain of E. coli . In another embodiment of the invention, the improvement is an increase in binding activity to CD20. In another embodiment of the invention, the improvement is an increase in cytotoxic activity against cells expressing CD20. In another embodiment of the invention, the improvement is an increase in expression level. In another embodiment of the invention, the improvement is an increase in genotype activity.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 절편은 본 발명의 다른 항체 또는 그의 절편과 비교할 때 아미노산 잔기의 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 치환은 항체 또는 그의 절편의 중쇄 및/또는 경쇄의 골격 및/또는 CDR 및/또는 초가변 영역에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 이러한 치환은 CDR 서열에서만 일어난다. 일부 실시형태에서, 이러한 치환이 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 절편의 중쇄 및/또는 경쇄에 이러한 치환이 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 있다.In another aspect of the invention, an antibody or fragment thereof of the invention comprises one or more conservative substitutions of amino acid residues when compared to other antibodies or fragments thereof of the invention. In some embodiments, such substitutions occur in the framework and / or CDR and / or hypervariable regions of the heavy and / or light chain of the antibody or fragment thereof. In some embodiments, such substitutions occur only in the CDR sequences. In some embodiments, such substitutions are about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 There are more than 30, 35, 40, 45, 50. In another embodiment, such substitutions in the heavy and / or light chains of the antibodies or fragments thereof of the invention comprise 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1.

따라서, 본 발명은 CD20이 결합하는 항체 또는 이의 기능적 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트, 및 질환과 연관된 CD20을 발현하는 세포를 이용한 치료에서의 용도를 제공한다. 구체적인 양태에서, CD20에 결합하는 항체는 재표면화, 인간화 또는 키메라인 것이 보다 바람직하다. 인간화 항체는 골격 영역(FR)에서 아미노산 치환이 있는 항체 및 CDR에서 변화가 있는 성숙 항체의 친화도를 포함한다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 공여자 또는 수용자 항체에 존재하는 것으로 한정되지 않는다. 다른 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체 또는 이의 기능적 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 향상된 CDC 및또는 ADCC 기능 및 B 세포 사멸을 포함하여 개선된 효과기(effector) 기능을 초래하는 Fc 영역에서 아미노산 잔기의 변화를 추가로 포함한다.Accordingly, the present invention provides a use in the treatment with an antibody or functional fragment thereof and / or conjugate thereof to which CD20 binds, and cells expressing CD20 associated with a disease. In specific embodiments, the antibody that binds to CD20 is more preferably resurfaced, humanized or chimeric. Humanized antibodies include the affinity of antibodies with amino acid substitutions in the framework region (FR) and mature antibodies with changes in CDRs. Amino acids substituted in the CDRs or FRs are not limited to those present in the donor or acceptor antibody. In another embodiment, an anti-CD20 antibody or functional fragment thereof and / or conjugate thereof of the present invention is an amino acid residue in the Fc region that results in improved effector function, including enhanced CDC and / or ADCC function and B cell death. It further includes a change of.

본 발명의 다른 항-CD20 항체 또는 이의 기능적 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 안정성을 개선하는 특이적인 변화가 있는 것을 포함한다. 구체적인 양태에서, 인간화 CD20 항체 또는 이의 기능적 절편은 증가된 안정성을 가진다.Other anti-CD20 antibodies or functional fragments thereof and / or conjugates thereof of the invention include those with specific changes that improve stability. In specific embodiments, the humanized CD20 antibody or functional fragment thereof has increased stability.

또한 생체 내에서 개선된 ADCC 기능을 가지는 글리코실화 변이가 있는 항체가 제공된다.Also provided are antibodies with glycosylation mutations having improved ADCC function in vivo.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 그의 절편은 CD20에 특이적으로 결합하는 수단이며, 여기에서 상기 수단은 아포토시스, ADCC 및 CDC를 유도할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 서열번호 1~7 및 17~36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.In one embodiment of the invention, the antibody or fragment thereof is a means for specifically binding to CD20, wherein said means can induce apoptosis, ADCC and CDC. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment comprises at least one polypeptide comprising at least one member selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-7 and 17-36.

다른 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 PTA-10486에 해당하는 하이브리도마 또는 ATCC 수탁 번호 PTA-10487에 해당하는 하이브리도마에 의해 생성되는 항체 또는 그의 절편이다.In another embodiment, the invention is an antibody or fragment thereof produced by a hybridoma corresponding to ATCC Accession No. PTA-10486 or a hybridoma corresponding to ATCC Accession No. PTA-10487.

진단 적용에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 절편은 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지화될 것이다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있는 임의의 하나일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성 동위 원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S 또는 131I; 형광성 또는 화학 발광성 화합물, 예를 들어 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린; 또는 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 호스래디쉬 퍼록시다아제일 수 있다.In diagnostic applications, an antibody or fragment thereof of the invention will typically be labeled with a detectable moiety. The detectable moiety can be any one that can generate a detectable signal directly or indirectly. For example, the detectable moiety can be a radioisotope such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S or 131 I; Fluorescent or chemiluminescent compounds such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine, or luciferin; Or enzymes such as alkaline phosphatase, beta-galactosidase or horseradish peroxidase.

하나의 양태에서, 본 발명은 항-CD20 세포융해 항체 및/또는 절편 컨쥬게이트이다. 본 발명의 하나의 양태에서, CD20-특이적 세포융해 항체 컨쥬게이트는 직병의 치료에서 유용하며, 여기에서 CD20을 발현하는 B 세포는 상기 질병의 진행에 영향을 미친다. 하나의 양태에서, 표적화된 B 세포는 원하지 않는다. 하나의 양태에서, 질병은 B 세포 질환이다. 하나의 양태에서, 질병은 원치 않는 B 세포의 활성을 수반한다. 본 발명의 다른 양태는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 컨쥬게이트이며, 여기에서 상기 항체 또는 절편은 CD20을 발현하는 세포에서 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있다. 하나의 양태에서, 질병은 비호지킨 림프종이다.In one embodiment, the invention is an anti-CD20 fusion antibody and / or fragment conjugate. In one embodiment of the invention, the CD20-specific fusion antibody conjugate is useful in the treatment of direct disease, wherein B cells expressing CD20 influence the progression of the disease. In one embodiment, targeted B cells are not desired. In one embodiment, the disease is a B cell disease. In one embodiment, the disease involves the activity of unwanted B cells. Another aspect of the invention is an antibody conjugate that specifically binds to CD20, wherein the antibody or fragment is apoptosis, antibody dependent cytotoxic cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) in cells expressing CD20. Can be derived. In one embodiment, the disease is non-Hodgkin's lymphoma.

본 발명의 하나의 양태는 세포독성제에 연결된 항체 또는 절편을 포함하는 항-CD20 항체 또는 절편 컨쥬게이트이다. 컨쥬게이트에 사용된 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁산, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카마이신 및 듀오카마이신 유사체, 에네딘(enediyne), 예를 들어 칼리키아마이신, 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴, 토메이마이신(tomaymycin) 유도체 및 렙토마이신 유도체일 수 있다.One aspect of the invention is an anti-CD20 antibody or fragment conjugate comprising an antibody or fragment linked to a cytotoxic agent. Cytotoxic agents used in the conjugates maytansinoids and maytansinoid analogues, benzodiazepines, taxanes, CC-1065 and CC-1065 analogues, duocarmycin and duocarmycin analogs, enediyne, For example, calicheamicin, dolastatin and dolastatin analogs, such as auristatin, tomaymycin derivatives and leptomycin derivatives.

보다 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁산, CC-1065 및 CC-1065 유사체이다.More preferred cytotoxic agents are maytansinoids and maytansinoid analogs, benzodiazepines, taxanes, CC-1065 and CC-1065 analogs.

메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체는 바람직한 세포독성제 중의 것이다. 적합한 메이탄시노이드의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체의 에스터를 포함한다. 적당한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제6,333,410호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,444,163호; 제6,716,821호; 제7,276,497호; 제7,473,796호 및 미국 출원 공개 제20050169933호에 개시되어 있다.Maytansinoids and maytansinoid analogs are among the preferred cytotoxic agents. Examples of suitable maytansinoids are known to those skilled in the art and include esters of maytansinol and maytansinol analogs. Suitable maytansinoids are described, for example, in US Pat. No. 4,424,219; 4,256,746; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,307,016; 4,313,946; 4,313,946; 4,315,929; 4,315,929; No. 4,331,598; No. 4,361,650; 4,362,663; No. 4,364,866; No. 4,450,254; No. 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 6,333,410; 5,475,092; 5,475,092; 5,585,499; 5,585,499; No. 5,846,545; No. 6,444,163; 6,716,821; 6,716,821; No. 7,276,497; 7,473,796 and US Application Publication No. 20050169933.

또한 탁산은 바람직한 세포독성제이다. 본 발명에서의 사용에 적당한 탁산은 예를 들어 미국 특허 제6,372,738호; 제6,340,701호; 제6,436,931호; 제6,596,757호; 제7,441,063호; 제7,495,114호 및 제7,598,290호에 개시되어 있다.Taxanes are also preferred cytotoxic agents. Taxanes suitable for use in the present invention are described, for example, in US Pat. No. 6,372,738; 6,340,701; 6,340,701; No. 6,436,931; No. 6,596,757; 7,441,063; 6,076,076; 7,495,114 and 7,598,290.

세포독성 컨쥬게이트의 제조에 대한 하나의 후보는 CC-1065의 유사체이며, 이는 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)의 배양 브로스에서 분리된 강력한 항-종양 항생제이다. CC-1065는 흔히 사용되는 항암 약물, 예를 들어 독소루비신, 메톡트렉세이트 및 빈크리스틴보다 시험관 내에서 약 100배 더 강력하다(B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)). CC-1065 유사체는 또한 본 발명에서의 사용에 대하여 바람직한 세포독성 약물이다. CC-1065 및 이의 유사체는 미국 특허 제6,756,397호; 제7,049,316호; 제7,388,026호; 제6,372,738호; 제6,340,701호; 제5,846,545호 및 제5,585,499호에 개시되어 있다.One candidate for the preparation of cytotoxic conjugates is an analog of CC-1065, which is a potent anti-tumor antibiotic isolated from the culture broth of Streptomyces zelensis . CC-1065 is about 100 times more potent in vitro than commonly used anticancer drugs such as doxorubicin, methoxtrexate and vincristine (BK Bhuyan et al., Cancer Res ., 42 , 3532-3537 (1982)). CC-1065 analogs are also preferred cytotoxic drugs for use in the present invention. CC-1065 and its analogues are described in US Pat. No. 6,756,397; 7,049,316; 7,049,316; 7,388,026; 6,076,079; 6,372,738; 6,372,738; 6,340,701; 6,340,701; 5,846,545 and 5,585,499.

또한 벤조다이아제핀 유사체는 본 발명에서의 사용에 적당한 세포독성 약물이다. 미국 특허 공개 제20090036431호 및 유럽 출원 제2019104호에 기술된 것과 같은 피롤벤조다이아제핀은 적당한 세포독성 약물이다. 또한 미국 가출원 제61/150,201호에 기술된 것과 같은 벤조다이아제핀 유도체가 적당하다.Benzodiazepine analogs are also cytotoxic drugs suitable for use in the present invention. Pyrrolebenzodiazepines, such as those described in US Patent Publication No. 20090036431 and European Application No. 2019104, are suitable cytotoxic drugs. Also suitable are benzodiazepine derivatives such as those described in US Provisional Application No. 61 / 150,201.

세포독성 약물, 예를 들어 메톡트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈플라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 몰폴리노 독소루비신은 본 발명의 컨쥬게이트의 제조에 적당하다.Cytotoxic drugs such as methoxtrexate, cisplatin, carboplatin, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinplastin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil and morpholino doxorubicin are conjugates of the present invention. It is suitable for the manufacture of gates.

항체에 세포독성제를 연결하기 위하여, 연결기가 사용된다. 적당한 절단성 및 비절단성 연결기가 본원에 기술되어 있으며 당업계에 잘 알려져 있고 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기를 포함한다. 바람직한 연결기는 이황화 기 및 티오에테르 기, 특히 미국 특허 6,913,748, 미국 특허 공개 제20050169933, 20090274713호 및 WO2009/0134976에 기술된 것이다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 이황화물 교환 반응을 사용하여 또는 항체와 세포독성제 사이의 티오에테르 결합을 형성함으로써 구성될 수 있다. 항체를 변형시켜 이황화 연결된 컨쥬게이트를 제공하기 위한 바람직한 링커는 N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB) 또는 N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)-2-설포부타노에이트(설포-SPDB)이다.In order to link the cytotoxic agent to the antibody, a linker is used. Suitable cleavable and non-cleavable linking groups are described herein and are well known in the art and include disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, light labile groups, peptidase labile groups and esterase labile groups. Preferred linking groups are those described in disulfide and thioether groups, in particular US Pat. No. 6,913,748, US Patent Publication No. 20050169933, 20090274713 and WO2009 / 0134976. For example, the conjugate can be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond between the antibody and the cytotoxic agent. Preferred linkers for modifying the antibody to provide disulfide linked conjugates include N -succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate (SPP), N -succinimidyl 4- (2-pyridyldi Thio) butanoate (SPDB) or N -succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) -2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB).

본 발명은, 비절단성 링커를 통한 항체에의 메이탄시노이드의 컨쥬게이션은 생체 내 고용량의 달성을 허용하여 항-CD20 항체 또는 그의 절편의 고유의 기능적 활성을 보존하면서 컨쥬게이션의 효력을 향상시키는 양태를 포함한다. 항체 또는 항체 절편을 변형시켜 메이탄시노이드와의 티오에테르 결합을 만드는 바람직한 비절단성 링커는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-설포석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(설포SMCC), N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB)이다.The present invention provides that the conjugation of maytansinoids to antibodies through non-cleavable linkers allows the achievement of high doses in vivo to enhance the efficacy of conjugation while preserving the inherent functional activity of the anti-CD20 antibody or fragment thereof. It includes an aspect. Preferred non-cleavable linkers that modify antibodies or antibody fragments to form thioether bonds with maytansinoids include N -succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N -sulfosuccinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (sulfoSMCC), N -succinimidyl-4- (iodoacetyl) -aminobenzoate (SIAB).

본 발명은 또한 본원에 기술된 링커가 친수성(예컨대, PEG를 혼입함)이고 약물의 활성을 증가시키는데 기여하는 양태를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 약물이 항-CD20 항체에 연결되어 링커 설계가 광범위한 종양에 걸쳐서, 특히 낮은 항원 발현 또는 약물 저항성 종양에서 활성인 컨쥬게이트를 제공하는 개선된 방식을 포함한다.The invention also encompasses embodiments in which the linkers described herein are hydrophilic (eg, incorporate PEG) and contribute to increasing the activity of the drug. Thus, another aspect of the present invention includes an improved manner in which the drug is linked to an anti-CD20 antibody such that the linker design provides a conjugate that is active over a wide range of tumors, particularly in low antigen expression or drug resistant tumors.

추가로, 이러한 친수성 링커의 혼입은 고수율로 그리고 응집 또는 침전없이 항체 분자 당 약물의 최대 15개 분자의 컨쥬게이션을 허용한다. 항체 분자당 연결된 약물의 최대 15개 분자를 가지는 친수성 링커를 포함하는 이러한 컨쥬게이트는 높은 친화도로 (비변형 항체의 것과 유사한) 표적 CD20 항원에 결합한다. 항체의 변형을 위한 바람직한 친수성 링커는 N-석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜] 에스터(NHS-PEG4-말레이미드)이다.In addition, the incorporation of such hydrophilic linkers allows for conjugation of up to 15 molecules of drug per antibody molecule in high yield and without aggregation or precipitation. Such conjugates comprising a hydrophilic linker having up to 15 molecules of drug linked per antibody molecule bind to the target CD20 antigen (similar to that of an unmodified antibody) with high affinity. A preferred hydrophilic linker for modification of the antibody is N -succinimidyl-[( N -maleimidopropionamido) -tetraethyleneglycol] ester (NHS-PEG 4 -maleimide).

본 발명은 또한 본원에 기술된 링커가 다이카복실산계 모이어티로부터 유래한 링커와 같이 황 원자가 없는 양태를 포함한다(미국 출원 공개 제2005016993호 참조).The present invention also encompasses embodiments in which the linkers described herein are free of sulfur atoms, such as linkers derived from dicarboxylic acid based moieties (see US Patent Application Publication 2005016993).

본 발명은 또한 본원에 기술된 링커가 하전되는 양태를 포함하며, 여기에서 전하는 항-CD20 항체 또는 그의 절편의 변형 후 및 생성된 약물 컨쥬게이트에서 전부 유지된다.The invention also encompasses embodiments in which the linker described herein is charged, wherein the charge is retained entirely after modification of the anti-CD20 antibody or fragment thereof and in the resulting drug conjugate.

본 발명은 또한 약 2 내지 8개 약물 분자가 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결되는 양태를 포함한다. 바람직한 양태는 약 2 내지 8개 약물 분자가 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결되며 컨쥬게이트의 세포 사멸이 동일한 항-CD20 항체에 연결된 약물의 더 낮거나 더 높은 수의 약물 부하에 비하여 보다 효과적인 컨쥬게이트이다.The invention also encompasses embodiments wherein about 2 to 8 drug molecules are linked to an anti-CD20 antibody or fragment thereof. Preferred embodiments are more effective conjugates compared to lower or higher number of drug loads of drugs wherein about 2 to 8 drug molecules are linked to anti-CD20 antibodies or fragments thereof and that cell death of the conjugate is linked to the same anti-CD20 antibody. It is a gate.

심지어 본 발명의 추가의 양태는 상기 방법을 이용한 치료에 민감한 암을 치료하는 방법이며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 화학식 II 또는 화학식 II'의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하며,Even a further aspect of the invention is a method of treating cancer sensitive to treatment using the method, which method comprises administering to a patient in need thereof an effective dosage of a composition comprising a conjugate of Formula II or Formula II '. Include,

[화학식 II]≪ RTI ID = 0.0 &

CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m CB- [X l -(-CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p -D] m

[화학식 II'][Formula II ']

D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB DY p -(-CH 2 -CH 2 -O-) n -X l ] m -CB

여기에서, CB는 항-CD20 항체를 나타내고;Wherein CB represents an anti-CD20 antibody;

D는 약물을 나타내며;D represents a drug;

X는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합 또는 에테르 결합을 통하여 세포-결합제에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로고리 단위를 나타내고;X represents an aliphatic, aromatic or heterocyclic unit bound to the cell-binding agent via a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond or an ether bond;

Y는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 에테르 결합, 아민 결합, 탄소-탄소 결합 및 하이드라존 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유 결합을 통하여 약물에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로고리 단위를 나타내며;Y represents an aliphatic, aromatic or heterocyclic unit bound to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of thioether bonds, amide bonds, carbamate bonds, ether bonds, amine bonds, carbon-carbon bonds and hydrazone bonds. Represent;

l은 0 또는 1이고;l is 0 or 1;

p는 0 또는 1이며;p is 0 or 1;

m은 2 내지 15의 정수이고;m is an integer from 2 to 15;

n은 1 내지 2000의 정수이다.n is an integer from 1 to 2000.

중요한 것으로, 본 발명에 기술된 컨쥬게이트는 다중약물 내성인(mdr) CD20을 발현하는 세포에 대하여 매우 강력하거나 또는 효과적이며, 이는 세포독성 약물을 이용한 치료에 대하여 민감도가 좋지 않다. 예를 들어, 암 치료는 상이한 화학요법제를 이용한 치료의 다수 라운드 후에 종종 접하게 되는 약물 내성의 메커니즘을 극복하는데 있어서의 난관이 된다. 암 세포에서 관찰된 하나의 이러한 메커니즘은 다중약물 내성이라고 불리며 ATP-결합 카세트(ABC) 운반체에 의해 약물의 향상된 방출에 의해 야기된다(C. Drumond, B. I. Sikic, J. Clin . Oncology, 1999, 17, 1061-1070, G, Szokacs et al., Nature Reviews, 5; 219-234, 2006). 약물 내성의 이러한 메커니즘을 극복하는 요법, 예를 들어 암 세포에 의한 약물의 이러한 유출을 방해 또는 극복하는 것은 상당한 가치를 가진다.Importantly, the conjugates described herein are very potent or effective against cells expressing multidrug resistant ( mdr ) CD20, which is poorly sensitive to treatment with cytotoxic drugs. For example, cancer treatment is a challenge in overcoming the mechanism of drug resistance that is often encountered after many rounds of treatment with different chemotherapeutic agents. One such mechanism observed in cancer cells is called multidrug resistance and is caused by enhanced release of the drug by the ATP-binding cassette (ABC) carrier (C. Drumond, BI Sikic, J. Clin . Oncology , 1999, 17 , 1061-1070, G, Szokacs et al., Nature Reviews , 5; 219-234, 2006). Therapies that overcome this mechanism of drug resistance, for example, hinder or overcome this outflow of drugs by cancer cells, are of considerable value.

본 발명의 하나의 양태는 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 약학적 조성물은 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명은 항-CD20 항체 또는 절편 컨쥬게이트 및 담체(예컨대, 약학적으로 허용가능한 담체)를 포함하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 포함한다.One aspect of the invention is a composition comprising an antibody or fragment and / or conjugate thereof. Another aspect of the invention is a pharmaceutical composition comprising an antibody or fragment and / or conjugate thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment pharmaceutical composition comprises a conjugate and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention includes compositions (eg, pharmaceutical compositions) comprising an anti-CD20 antibody or fragment conjugate and a carrier (eg, a pharmaceutically acceptable carrier).

본 발명은 또한 항-CD20 항체 또는 그의 절편, 컨쥬게이트 및 담체(액학적으로 허용가능한 담체)를 포함하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 포함하며, 이는 제2 치료제를 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물은 비정상적인 세포 성장을 억제 또는 포유동물(예컨대, 인간)에서 증식성 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 또한 포유동물(예컨대, 인간)에서 우울증, 불안감, 스트레스, 공포증, 패닉, 불쾌감, 정신 장애, 고통 및 염증성 질환을 치료하는데 유용한다.The invention also includes compositions (eg, pharmaceutical compositions) comprising an anti-CD20 antibody or fragments thereof, conjugates and carriers (pharmaceutically acceptable carriers), which further comprise a second therapeutic agent. The compositions of the present invention are useful for inhibiting abnormal cell growth or for treating proliferative disorders in mammals (eg, humans). The compositions of the present invention are also useful for treating depression, anxiety, stress, phobias, panic, discomfort, mental disorders, pain and inflammatory diseases in mammals (eg, humans).

본 발명의 하나의 양태에서, 진단 시약은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트를 가지는 조성물을 포함하며, 여기에서 항체 또는 절편은 표지화된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트 표지는 방사능표지, 형광단, 발색단, 조영제 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된다.In one aspect of the invention, the diagnostic reagent comprises a composition having an antibody or fragment thereof and / or conjugate thereof as described herein, wherein the antibody or fragment is labeled. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment and / or conjugate label thereof is selected from the group consisting of radiolabels, fluorophores, chromophores, contrast agents and metal ions.

본 발명의 하나의 양태에서, CD20을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 방법이 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, CD20은 B 세포에 의해 발현된다. 본 발명의 하나의 양태에서, CD20을 발현하는 세포는 암 세포이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편은 NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암세포에 결합한다.In one embodiment of the invention there is a method of specifically binding to a cell expressing CD20. In one embodiment of the invention, CD20 is expressed by B cells. In one embodiment of the invention, the cell expressing CD20 is a cancer cell. In one embodiment of the invention, the antibody or fragment is a B cell lymphoma, including NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma, and mature B cell neoplasia, eg, B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) / slymphocytic Lymphoma (SLL), B cell prelymphocytic leukemia, lymphoplasmic lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL) (including low grade, medium grade and high grade FL), dermal follicular center Lymphoma, marginal zone B cell lymphoma (MALT type, nodular and spleen type), hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disease, Waldenstrom's macroglobulinemia And cancer cells selected from the group consisting of retrograde large cell lymphoma (ALCL).

본 발명의 다른 양태에서, CD20을 발현하는 세포는 원치 않는 면역 반응에 영향을 미친다. 본 발명의 다른 양태에서, CD20을 발현하는 세포는 염증에 영향을 미친다.In another aspect of the invention, cells expressing CD20 affect an unwanted immune response. In another embodiment of the present invention, cells expressing CD20 affect inflammation.

항-CD20 항체 또는 이의 컨쥬게이트, 및 이를 포함하는 조성물은 장애, 예를 들어 세포의 비정상적인 성장을 특징으로 하는 장애(예컨대, 암 및 면역 질환과 장애)를 치료하거나 또는 장애의 심각함을 완화시키는데 유용하다. 본 발명의 다른 적용은 이에 한정되는 것은 아니지만, 골다공증, 우울증, 불안감, 스트레스, 공포증, 패닉, 불쾌감, 정신 장애, 고통을 동시 치료하는 것, 또는 항간질약, 항균제, 이뇨제 및 혈압 강하제, 혈중지질저하약, 및 항우울제로서의 적용을 포함한다.Anti-CD20 antibodies or conjugates thereof, and compositions comprising the same, are useful for treating disorders, such as disorders characterized by abnormal growth of cells (eg, cancer and immune diseases and disorders), or alleviating the severity of the disorder. Do. Other applications of the present invention include, but are not limited to, treating osteoporosis, depression, anxiety, stress, phobias, panic, discomfort, mental disorders, pain, or antiepileptic drugs, antibacterial agents, diuretics and hypotensive agents, hypolipidemia Medicine, and application as an antidepressant.

본 발명의 하나의 양태에서, 세포를 항체 또는 항체 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트와 접촉시키는 것을 포함하는 암세포의 성장을 억제하는 방법이 있다.In one embodiment of the present invention, there is a method of inhibiting the growth of cancer cells comprising contacting the cells with an antibody or antibody fragment and / or conjugate thereof.

본 발명의 하나의 양태에서, 환자에게 본원에 기술된 항체 또는 절편 및/또는 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법이 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 치료는 상기 환자에게 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 치료제는 세포독성제이다.In one aspect of the invention, there is a method of treating a patient with cancer comprising administering to the patient an effective amount of an antibody or fragment and / or conjugate described herein. In one embodiment of the invention, said treatment further comprises administering a therapeutic agent to said patient. In one embodiment of the invention, the therapeutic agent is a cytotoxic agent.

또 다른 양태에서, 본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 등의 치료에서 유용한 CD20-특이적 세포융해 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트이다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 메토트렉세이트와 조합하여 류마티스 관절염의 치료에 유용한 CD20-지정 세포융해 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 TNF 길항제 요법에 불충분한 반응을 보이는 중등도 내지 중증 활성 류마티스 관절염이 있는 환자에서 메토트렉세이트와 조합하여 류마티스 관절염의 치료에 유용한 CD20-특이적 세포융해 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트이다.In another embodiment, the invention is a CD20-specific cytolytic antibody or fragment and / or conjugate thereof useful in the treatment of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis and the like. In a further aspect, the invention is a CD20-directed cytofusion antibody and / or conjugate thereof useful in the treatment of rheumatoid arthritis in combination with methotrexate. In one embodiment, the invention provides a CD20-specific cytolytic antibody and / or its useful for the treatment of rheumatoid arthritis in combination with methotrexate in patients with moderate to severely active rheumatoid arthritis exhibiting insufficient response to one or more TNF antagonist therapies. It is a conjugate.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 암이 있는 환자에게 본원에 기술된 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 상기 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 치료가능한 암은 NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.In one embodiment of the invention, the antibody or fragment and / or conjugate thereof is a method of treating such a patient comprising administering an effective amount of the conjugate described herein to a patient with cancer. In one embodiment of the invention, the treatable cancer is B cell lymphoma, including NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma, and mature B cell neoplasia, such as B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) / slymphocytic Lymphoma (SLL), B cell prelymphocytic leukemia, lymphoplasmic lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL) (including low grade, medium grade and high grade FL), dermal follicular center Lymphoma, marginal zone B cell lymphoma (MALT type, nodular and spleen type), hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disease, Waldenstrom's macroglobulinemia , And retrograde large cell lymphoma (ALCL).

본 발명의 하나의 양태에서, 암이 있는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법이 있으며, 상기 방법은 개체에게 진단 시약을 투여하는 단계; 및 개체 내에서 시약의 분포를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 진단 방법은 NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 장애, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 진단하는 것을 포함한다.In one aspect of the invention, there is a method of diagnosing a subject suspected of having cancer, the method comprising administering a diagnostic reagent to the subject; And detecting the distribution of reagents in the subject. In one embodiment of the invention, the diagnostic method comprises B cell lymphoma, including NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma and mature B cell neoplasia, such as B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) / slymphocytic lymphoma (SLL), B cell prelymphocytic leukemia, lymphoid cytoplasmic lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL) (including low grade, medium grade and high grade FL), dermal follicular central lymphoma , Marginal zone B cell lymphoma (MALT type, nodular and spleen type), hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disorder, Waldenstrom's macroglobulinemia, And diagnosing cancer selected from the group consisting of retrograde large cell lymphoma (ALCL).

본 발명의 다른 양태에서, 면역 장애가 있는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법이 있으며, 상기 방법은 개체에게 진단 시약을 투여하는 단계; 및 개체 내에서 시약의 분포를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 진단 방법은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 장애를 진단하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염, 만성 국소 뇌염, 수포성 유천포창, A형 혈우병, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성 근염, 만성 두드러기, 원발 담즙성 간경변, 시신경 척수염, 그레이브스 갑상선 이상성 질환, 수포성 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선성 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스-연관 질환, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법이다. 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 경우, 항체는 선택적으로 제2 치료제와 함께 투여될 수 있으며, 상기 제2 치료제는 바람직하게 메토트렉세이트이다.In another aspect of the invention, there is a method of diagnosing a subject suspected of having an immune disorder, the method comprising administering a diagnostic reagent to the subject; And detecting the distribution of reagents in the subject. In one embodiment of the invention, the diagnostic method is rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's disease, inflammatory bowel disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) ), Autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis, psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, Raynaud's syndrome, Crohn's disease, ulcerative colitis, gastritis, Hashimoto thyroiditis, ankylosing spondylitis, hepatitis C Diagnosing an immune disorder selected from the group consisting of associated cold globulin vasculitis. Preferred embodiments of the present invention include rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's disease, inflammatory bowel disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), autoimmune thrombocytopenia Reduction, multiple sclerosis, psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy, myasthenia gravis, diabetes mellitus, Raynaud's syndrome, Crohn's disease, ulcerative colitis, gastritis, Hashimoto's thyroiditis, ankylosing spondylitis, hepatitis C-associated cold globulin vasculitis, chronic Focal encephalitis, bullous swelling, type A hemophilia, membrane proliferative glomerulonephritis, adult and pediatric dermatitis, adult multiple myositis, chronic urticaria, primary biliary cirrhosis, optic nerve myelitis, Graves' thyroid abnormalities, bullous vesicular swelling, membrane Proliferative glomerulonephritis, Chug-Strauss syndrome, asthma, psoriatic arthritis, dermatitis, dyspnea syndrome, meningitis, encephalitis, Uveitis, eczema, atherosclerosis, leukocytosis, childhood diabetes, lighter disease, Behcet's disease, hemolytic anemia, atopic dermatitis, vulgaris ulcer, Wegener's granulomatosis, Omen's syndrome, chronic renal failure, acute infectious mononucleosis, HIV and herpes-associated A method of diagnosing an individual suspected of having an autoimmune or inflammatory disease selected from the group consisting of diseases, scleroderma, Sjogren's syndrome and glomerulonephritis. If the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, the antibody may optionally be administered with a second therapeutic agent, which second agent is preferably methotrexate.

본 발명의 추가 양태는 생체 내에서 B 세포의 아포토시스를 유도하는 방법이며, 이는 본 발명의 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트와 B 세포를 접촉시켜 B 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.A further aspect of the invention is a method of inducing apoptosis of B cells in vivo, which comprises contacting B cells with the antibodies and / or conjugates thereof of the invention to kill B cells.

본 발명은 또한 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트에 결합한 CD20을 포유동물, 예를 들어 질환을 앓고 있는 인간 환자에 투여함으로써 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 자가면역 질환 또는 CD20을 발현하는 암을 치료하는 방법 중 임의의 것에서, 하나의 양태에서 항체는 CD20-7 또는 CD20-6이다. 따라서, 하나의 양태는 CD20 양성 암을 치료하는 방법이며, 이는 암을 앓고 있는 환자에게 본 발명의 CD20 결합 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, CD20을 발현하는 암은 B 세포 림프종 또는 CD20을 발현하는 백혈병, 예를 들어 비호지킨 림프종(NHL) 또는 림프구 우세 호지킨병(LPHD), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 또는 SLL이다. B 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는 방법의 하나의 양태에서, 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트는 약 20~2000㎎/㎡의 투약량 범위로 투여된다. 추가적인 양태에서, 치료 방법은 환자에게 적어도 하나의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 비호지킨 림프종(NHL)에 대하여 화학요법제는 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 군으로부터 선택된다.The present invention also provides a method of treating a disease by administering the antibody or fragment thereof and / or its conjugated CD20 to a mammal, eg, a human patient suffering from the disease. In any of the methods of treating an autoimmune disease or a cancer expressing CD20, in one embodiment the antibody is CD20-7 or CD20-6. Thus, one aspect is a method of treating a CD20 positive cancer, which comprises administering a therapeutically effective amount of a CD20 binding antibody of the invention and / or a conjugate thereof to a patient suffering from cancer. In a preferred embodiment, the cancer expressing CD20 is B cell lymphoma or leukemia expressing CD20, such as non-Hodgkin's lymphoma (NHL) or lymphocyte predominant Hodgkin's disease (LPHD), chronic lymphocytic leukemia (CLL) or SLL. In one embodiment of the method of treating B cell lymphoma or leukemia, the antibody and / or conjugate thereof is administered in a dosage range of about 20-2000 mg / m 2. In a further aspect, the method of treatment further comprises administering at least one chemotherapeutic agent to the patient, wherein for non-Hodgkin's lymphoma (NHL) the chemotherapeutic agent is doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine and prednisolone. Selected from the group consisting of:

또한 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이는 자가면역 또는 염증성 질환을 앓고 있는 환자에게 본원에 논의된 바와 같은 CD20 결합 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 자가면역 또는 염증성 질환은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염, 만성 국소 뇌염, 수포성 유천포창, A형 혈우병, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성 근염, 만성 두드러기, 원발 담즙성 간경변, 시신경 척수염, 그레이브스 갑상선 이상성 질환, 수포성 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선성 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스-연관 질환, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 경우, 항체는 선택적으로 제2 치료제와 함께 투여될 수 있으며, 상기 제2 치료제는 바람직하게 메토트렉세이트이다.Also provided are methods of treating an autoimmune or inflammatory disease, comprising administering to a patient suffering from an autoimmune or inflammatory disease a therapeutically effective amount of a CD20 binding antibody or fragment and / or conjugate thereof as discussed herein. Include. Autoimmune or inflammatory diseases include rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's disease, inflammatory bowel disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), autoimmune thrombocytopenia Reduction, multiple sclerosis, psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, Raynaud's syndrome, Crohn's disease, ulcerative colitis, gastritis, Hashimoto's thyroiditis, ankylosing spondylitis, hepatitis C-associated cold globulin vasculitis , Chronic focal encephalitis, bullous swelling, type A hemophilia, membrane proliferative glomerulonephritis, adult and pediatric dermatitis, adult polymyositis, chronic urticaria, primary biliary cirrhosis, optic nerve myelitis, Graves' thyroid abnormality, bullous stool , Proliferative glomerulonephritis, Chug-Strauss syndrome, asthma, psoriatic arthritis, dermatitis, dyspnea syndrome, cerebrospinal fluid Inflammation, encephalitis, uveitis, eczema, atherosclerosis, leukocytosis, childhood diabetes, lighter disease, Behcet's disease, hemolytic anemia, atopic dermatitis, vulgaris ulcer, Wegener's granulomatosis, Omen syndrome, chronic renal failure, acute infectious mononucleosis, HIV And herpes-associated disease, scleroderma, Sjogren's syndrome and glomerulonephritis. If the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, the antibody may optionally be administered with a second therapeutic agent, which second agent is preferably methotrexate.

하나의 양태에서, 본 발명은 피부근염, 베게너 육아종증, ANCA, 재생불량성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), VIII 인자 결핍증, A형 혈우병, 자가면역성 호중구 감소증, 캐슬만 증후군, 굿파스튜어 증후군, 고형 장기 이식 거부, 이식편대 숙주병(GVHD), IgM 매개, 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 하시모토 갑상선염, 자가면역성 간염, 림프모양 사이질 폐렴, 폐색성 세기관지염(비이식) 대 NSIP, 길랭-바레 증후군, 대혈관 혈관염, 거대세포 (타카야수) 동맥염, 중간혈관 혈관염, 가와사키병, 결절성 다발동맥염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 상기 질환을 앓고 있는 환자에게 CD20 결합 항체 및/또는 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이 방법의 하나의 양태에서, CD20 결합 항체는 CD20-7 또는 CD20-6이다.In one embodiment, the invention relates to dermatitis, Wegener's granulomatosis, ANCA, aplastic anemia, autoimmune hemolytic anemia (AIHA), factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, Castleman syndrome, Goodpasture syndrome, Solid organ transplant rejection, graft-versus-host disease (GVHD), IgM-mediated, thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), Hashimoto's thyroiditis, autoimmune hepatitis, lymphoid interstitial pneumonia, obstructive bronchiolitis (non-transplant) versus NSIP, Guillain It provides a method for treating an autoimmune or inflammatory disease selected from the group consisting of Barre syndrome, macrovascular vasculitis, giant cell (Takayasu) arteritis, intermediate vessel vasculitis, Kawasaki disease, nodular polyarteritis, which suffers from the disease Administering a therapeutically effective amount of the CD20 binding antibody and / or conjugate to the patient. In one embodiment of this method, the CD20 binding antibody is CD20-7 or CD20-6.

출원인의 치료 방법에서, CD20 결합 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트는 단독으로 또는 제2 치료제, 예를 들어 제2 항체, 또는 화학요법제 또는 면역억제제와 함께 투여될 수 있다. 제2 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 CD20 또는 상이한 B 세포 항원, 또는 NK 또는 T 세포 항원에 결합하는 것일 수 있다. 하나의 양태에서, 제2 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트는 방사능표지된 항-CD20 항체이다. 다른 양태에서, CD20 결합 항체는 세포독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성 동위원소와 컨쥬게이트된다.In Applicants' method of treatment, the CD20 binding antibody and / or conjugate thereof may be administered alone or in combination with a second therapeutic agent, such as a second antibody, or a chemotherapeutic or immunosuppressive agent. The second antibody or fragment and / or conjugate thereof may be one that binds to CD20 or a different B cell antigen, or NK or T cell antigen. In one embodiment, the second antibody or fragment and / or conjugate thereof is a radiolabeled anti-CD20 antibody. In other embodiments, the CD20 binding antibody is conjugated with a cytotoxic agent such as toxin or radioisotope.

본 발명은 포유동물(예컨대, 인간)에서 원치 않는 B 세포 및/또는 비정상적인 세포 성장을 억제 또는 증식성 장애를 치료하는 방법을 포함하며, 이는 상기 포유동물에 항-CD20 항체 및/또는 컨쥬게이트(및/또는 이의 용매화합물 및 염) 또는 이의 조성물을 단독으로 또는 제2 치료제와 조합하여 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.The present invention includes methods of inhibiting unwanted B cells and / or abnormal cell growth or treating proliferative disorders in a mammal (eg, a human), which comprises anti-CD20 antibodies and / or conjugates to the mammal (eg, And / or solvates and salts thereof) or compositions thereof, alone or in combination with a second therapeutic agent.

본 발명의 하나의 양태는 약 20㎎/㎖의 항체, 약 10mM 히스티딘 설페이트 pH 5.8, 약 60㎎/㎖ 수크로스(6%) 및 약 0.2㎎/㎖ 폴리솔베이트 20(0.02%)으로 CD20 항체 및/또는 이의 컨쥬게이트를 포함하는 액상 제형이다.One embodiment of the invention is a CD20 antibody with about 20 mg / ml antibody, about 10 mM histidine sulfate pH 5.8, about 60 mg / ml sucrose (6%) and about 0.2 mg / ml polysorbate 20 (0.02%) And / or conjugates thereof.

본 발명은 또한 본원에 개시된 항체 중 임의의 것을 암호화하는 다양한 분리 핵산을 제공하며, 이는 항체 및/또는 항체 절편을 발현하는 발현 벡터를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태는 본원에 기술된 항체 또는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다.The present invention also provides various isolation nucleic acids encoding any of the antibodies disclosed herein, which include expression vectors expressing the antibody and / or antibody fragment. One aspect of the invention includes polynucleotide (s) encoding an antibody or fragment described herein.

본 발명의 하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 또는 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하며, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터이다. 본 발명의 다른 양태에서, 벡터는 상기 항체 또는 절편을 발현할 수 있는 발현 벡터이다.In one embodiment of the invention, the polynucleotide encodes the light or heavy chain of an antibody or fragment and / or conjugate thereof, and the polynucleotide is DNA or RNA. In one embodiment of the invention, the polynucleotide is a vector. In another embodiment of the invention, the vector is an expression vector capable of expressing the antibody or fragment.

본 발명은 서열번호 8~16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 핵산, 또는 이들 서열의 축퇴성 변이체(degenerate variant) 등을 제공한다. 하나의 양태는 서열번호 1~7 및 17~36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리 핵산이며, 이는 선택적으로 보존적 아미노산 치환을 가진다.The present invention provides an isolated nucleic acid comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 8-16, or degenerate variants of these sequences. One embodiment is an isolated nucleic acid comprising a sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-7 and 17-36, which optionally has conservative amino acid substitutions.

다른 양태는 본원에 기술된 핵산을 포함하는 벡터이며, 이는 숙주 세포에서 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다. 또한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 포함된다.Another aspect is a vector comprising a nucleic acid described herein, which comprises an expression vector for expression in a host cell. Also included are host cells comprising the vector.

본 발명의 다른 양태는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 항체 또는 절편을 생성하는 숙주 세포를 포함한다. 항체 또는 절편을 생성하는 숙주 세포의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포 또는 NSO 세포이다.Other aspects of the invention include host cells comprising nucleic acids, and host cells that produce antibodies or fragments. In a preferred embodiment of the host cell producing the antibody or fragment, the host cell is a CHO cell or an NSO cell.

항체 및/또는 이의 컨쥬게이트를 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항체를 생성하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.Methods of generating antibodies and / or conjugates thereof are provided, the methods comprising culturing a host cell producing the antibody and recovering the antibody from the cell culture.

본 발명은 포유동물의 세포, 유기체 또는 연관 병리학적 상태의 시험관 내, 동일계 내, 및 생체 내 진단 또는 치료를 위한 항-CD20 항체 및/또는 컨쥬게이트를 합성하고 사용하는 방법을 포함한다.The present invention includes methods of synthesizing and using anti-CD20 antibodies and / or conjugates for in vitro, in situ, and in vivo diagnosis or treatment of cells, organisms or associated pathological conditions in a mammal.

본 발명의 양태는 제조 물품 또는 키트로 제공될 수 있다.Aspects of the present invention may be provided as an article of manufacture or a kit.

개체를 진단 또는 치료하는데 있어서의 사용을 위하여, 제조 물품은 조성물이 적절한 질환 또는 장애를 진단 또는 치료하는데 사용되는 것을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함한다.For use in diagnosing or treating a subject, the article of manufacture further comprises a package insert indicating that the composition is used to diagnose or treat the appropriate disease or disorder.

항체, 항체 절편, 컨쥬게이트, 조성물 및 본 발명의 사용 방법 모두의 바람직한 양태에서, 재표면화한 CD20 결합 항체는 CD20-7이고, 본원에 기술된 바와 같은 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 가진다.In a preferred embodiment of all of the antibodies, antibody fragments, conjugates, compositions and methods of use of the invention, the resurfaced CD20 binding antibody is CD20-7 and has light and heavy chain amino acid sequences as described herein.

도 1은 비형질감염 300-19 대조 세포(왼쪽 패널) 및 CD20-발현 300-19 세포(오른쪽 패널)에 결합하는 항체의 히스토그램의 표현. 히스토그램은 10nM muCD20-6(상단), muCD20-7(중간)로 염색한 것 및 1차 항체의 부재(하단)에 대하여 표시되어 있다.
도 2는 유세포 분석기로 분석된 BJAB 세포에 muCD20-7(도 1A) 및 muCD20-6(도 1B)의 결합의 표현. 결합 곡선은 항체 결합의 EC50을 결정하는데 사용되었으며, 이는 항체의 겉보기 Kd에 해당한다.
도 3은 10nM 농도의 리툭시맙, muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6 또는 muCD20-7과 함께 배양된 Ramos 림프종 세포(도 3A), 및 10nM 농도의 리툭시맙, B1, muCD20-2, 또는 muCD20-7과 함께 배양된 Raji 림프종 세포(도 3B)를 사용한 아넥신-V 분석 결과의 표현. 대조 샘플이 비교로 포함되어 있다.
도 4는 10㎍/㎖의 농도에서 항-CD20 항체 또는 muIgG1 아이소타입 대조 항체를 이용하여 염색된 Ramos 세포를 사용한 지질뗏목 분석 결과의 표현. 트리톤-X 100의 부재 하(검정 막대) 및 존재 하(속이 빈 막대)에서 샘플로부터의 FL1에 대한 MFI는 각각의 항체 치료에 대하여 플롯팅되어 있다. 시험된 항체는 muCD20-2, muCD20-7, 리툭시맙, muIgG 대조 항체(도 4A), 및 muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6, muCD20-7, muIgG 대조 항체(도 4B)이었다.
도 5는 10nM 농도의 chCD20-2, chCD20-7, 리툭시맙 또는 (Ab가 없는) 대조와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포를 사용한 아넥신-V 분석 결과의 표현.
도 6은 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 chCD20-2, chCD20-7, 리툭시맙 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Daudi 세포(도 6A) 및 WSU-DLCL-2 세포(도 6B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 7은 CD20-7 VL(도 7A) 및 CD20-7 VH(도 7B)에 대하여 재표면화한 형태로 CD20-7 표면 잔기 및 치환의 표현.
도 8은 뮤린의 대응 서열과 비교하여 CD20-7 가변 영역에 대한 예시적인 재표면화한 서열 정렬의 표현. 도 8A는 경쇄(VL) 가변 도메인에 대한 것이고, 도 8B는 중쇄(VH) 가변 도메인에 대한 것임을 참조한다. 줄표 "-"는 뮤린 서열과 동일함을 나타낸다.
도 9는 유세포 분석기로 분석된 BJAB 세포에 muCD20-7, chCD20-7 및 huCD20-7(huIgG1 아이소타입 대조 항체는 아님)의 결합의 표현. 결합 곡선은 항체 결합의 EC50을 결정하는데 사용되었으며, 이는 각각의 항체의 겉보기 Kd에 해당한다.
도 10은 ELISA에 의한 WSU-DLCL-2 림프종 세포로부터의 막 제조물에 huCD20-7의 결합의 표현.
도 11은 10nM, 1nM 및 0.1nM 농도에서 muCD20-7, huCD20-7, 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현.
도 12는 3×10-8M 내지 1.7×10-13M 범위의 농도에서 huCD20-7, B1, 리툭시맙, GA101-F, 및 2F2와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현. 대조 샘플이 비교되어 있다. "B1"은 벡사(등록상표)(Beckman Coulter)의 비표지화 형태에 해당하는 반면; "GA101-F"는 아푸투주맙 또는 GA101(Hoffman LaRoche)의 푸코실화 형태에 해당하며; "2F2"는 오파투무맙(Genmab/GSK)에 해당한다.
도 13은 10nM 농도의 huCD20-7, B1, 또는 리툭시맙과 함께 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현. 비처리된 세포의 대조 샘플이 비교로 사용되어 있다. 실험은 Ramos 세포(도 13A), Raji 세포(도 13B), WSU-DLCL-2 세포(도 13C), Jeko-1 세포(도 13D) 및 Granta-519 림프종 세포(도 13E)를 포함하였다.
도 14는 10㎍/㎖에서 Ramos 세포 및 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2 및 GA101-F 항체를 사용한 지질뗏목 분석 결과의 표현. 트리톤-X 100의 부재 하(검정 막대) 및 존재 하(흰색 막대)에서 샘플로부터의 FL1에 대한 MFI는 각각의 항체 치료에 대하여 플롯팅되어 있다.
도 15는 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, 리툭시맙, GA101-F 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Daudi 세포(도 15A) 및 Ramos 림프종 세포(도 15B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 16은 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, 리툭시맙, 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 WSU-DLCL-2 세포(도 16A) 및 RL 림프종 세포(도 16B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 17은 효과기 세포와 같은 정제된 인간 NK 세포의 존재 하에서 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포(도 17A) 및 JVM-13 CLL 세포(도 17B)를 사용한 ADCC 분석 결과의 표현.
도 18은 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F, B1(도 18A) 및 muCD20-6 및 muCD20-7(도 18B)을 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20으로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 19는 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F, B1(도 19A) 및 muCD20-6, muCD20-7, 리툭시맙 및 2F2(도 19B)를 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20 A179S P172S로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 20은 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F(도 20A) 및 muCD20-6, muCD20-7, 리툭시맙 및 2F2(도 20B)를 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20 N163D로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 21은 huCD20-7, 리툭시맙, 2F2, GA101-F(도 21A) 및 muCD20-6, muCD20-7, 리툭시맙 및 2F2(도 21B)를 사용하여 유세포 분석기로 분석된 인간 CD20 N163D N166D로 형질감염된 세포에 CD20 항체 집단 결합의 표현.
도 22는 ELISA에 의한 WSU-DLCL-2 림프종 세포로부터의 막 제조물에 huCD20-7-SMCC-DM1 및 -SPP-DM1(도 22A) 또는 huCD20-7-설포mal-DM4 컨쥬게이트(도 22B)와 비교하여 huCD20-7의 결합의 표현.
도 23은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 리툭시맙, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 또는 huCD20-7-SPDB-DM4와 함께 배양된 Ramos 림프종 세포에 대한 아넥신-V 분석 결과의 표현. Ramos 세포는 비결합 huIgG1-SMCC-DM1 및 huIgG1-SPDB-DM4 컨쥬게이트의 동일한 농도로 처리되었다.
도 24는 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4, huCD20-7-PEG4-mal-DM4, 리툭시맙 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Daudi 세포(도 24A) 및 WSU-DLCL-2 림프종 세포(도 24B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 25는 보체가 있는 5% 인간 혈청의 존재 하에서 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-설포-mal-DM4, 리툭시맙 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 WSU-DLCL-2 세포(도 25A) 및 Ramos 림프종 세포(도 25B)에 대한 CDC 분석 결과의 표현.
도 26은 효과기 세포와 같은 정제된 인간 NK 세포의 존재 하에서 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙, 2F2 또는 huIgG1 아이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Ramos 세포(도 26A) 및 Granta-519 림프종 세포(도 26B)에 대한 ADCC 분석 결과의 표현.
도 27은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙 또는 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 Ramos 세포(도 27A) 및 Daudi 세포(도 27B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 28은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙 또는 비결합 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 Granta-519 세포(도 28A) 및 SC-1 세포(도 28B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 29는 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙 또는 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 DOHH-2 B 세포 림프종 세포(도 29A) 및 Molt-4 T 세포 백혈병 세포(도 29B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현. Molt-4 세포는 CD20 음성이다.
도 30은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, 리툭시맙, 리툭시맙-SMCC-DM1 또는 비결합 huIgG1 항체 및 huIgG1-SMCC-DM1 대조 컨쥬게이트와 함께 배양된 Ramos 세포(도 30A) 및 Daudi 세포(도 30B)에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 31은 유세포 분석기로 분석된 SU-DHL-4에 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-[3H]DM1, 리툭시맙 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1의 결합의 표현(도 31A). 도 31B는 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-[3H]DM1, 리툭시맙 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1과 함께 배양된 항원-양성 SU-DHL-4 B 세포 림프종 세포 및 항원-음성 COLO205 결장암 세포에 대한 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 32는 SU-DHL-4 세포 당 결합된 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1의 양(도 32A) 및 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 또는 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1에 대한 SU-DHL-4 세포의 노출 22시간 후 생성된 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물 양의 표현.
도 33은 3×10-8M 내지 1×10-11M 범위의 농도에서 5일 동안 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-PEG4-mal-DM4 및 huCD20-7-SPDB-DM4(도 31A), 및 huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-SPP-DM1, huCD20-7-설포-mal-DM4 및 huIgG1-SMCC-DM1 및 huIgG1-SPP-DM1 대조 컨쥬게이트(도 31B)와 함께 배양된 Granta-519 세포에 대한 예시적인 WST-8 세포독성 분석 결과의 표현.
도 34는 SCID 마우스내 피하로 삽입된 확립된 이종이식 모델 SU-DHL-4 미만성 대형 B세포 림프종 세포를 사용한 실험 결과의 표현. 마우스는 10 또는 1㎎/㎏의 huCD20-7 또는 리툭시맙과 함께 세포 접종 후 제14일, 제21일 및 제28일(화살표)에 주 1회로 3회 처리되었다. 상이한 처리 그룹의 중간 종양 부피가 종양 세포 접종 후의 시간에 대하여 플롯팅되어 있다.
도 35는 SCID 마우스내 정맥내로 삽입된 Daudi 림프종 세포를 사용한 생체 내 이종이식 연구 결과의 표현. 마우스는 10㎎/㎏의 huCD20-7, 10㎎/㎏의 huCD20-7-SMCC-DM1 또는 5㎎/㎏의 huCD20-7-SPP-DM1(도 35A) 및 10㎎/㎏의 huCD20-7, 리툭시맙, huCD20-7-SMCC-DM1 또는 huCD20-7-BMPS-DM1(도 35B)과 함께 세포 접종 후 제7일에 1번 처리되었다. 상이한 처리 그룹에서 생존한 마우스의 수는 종양 세포 접종 후 시간에 대하여 플롯팅되어 있다.
도 36은 SCID 마우스내 피하로 삽입된 DOHH-2 여포성 림프종 세포를 사용한 예시적인 이종이식 연구 결과의 표현. 마우스는 10㎎/㎏의 huCD20-7, 10㎎/㎏의 huCD20-7-SMCC-DM1 또는 5㎎/㎏의 huCD20-7-SPP-DM1과 함께 세포 접종 후 제3일에 1번 처리되었다. 상이한 처리 그룹의 중간 종양 부피는 종양 세포 접종 후 시간에 대하여 플롯팅되어 있다.1 is a representation of histograms of antibodies that bind to non-transfected 300-19 control cells (left panel) and CD20-expressing 300-19 cells (right panel). Histograms are shown for staining with 10 nM muCD20-6 (top), muCD20-7 (middle) and absence (primary) of the primary antibody.
2 is a representation of the binding of muCD20-7 (FIG. 1A) and muCD20-6 (FIG. 1B) to BJAB cells analyzed by flow cytometry. The binding curve was used to determine the EC 50 of antibody binding, which corresponds to the apparent K d of the antibody.
FIG. 3 shows Ramos lymphoma cells cultured with rituximab, muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6 or muCD20-7 at 10 nM concentration (FIG. 3A), and Rituximab, B1, muCD20-2 at 10 nM concentration , Or expression of annexin-V assay using Raji lymphoma cells (FIG. 3B) incubated with muCD20-7. Control samples are included in the comparison.
4 is a representation of lipid raft analysis results using Ramos cells stained with anti-CD20 antibody or muIgG1 isotype control antibody at a concentration of 10 μg / ml. MFIs for FL1 from samples in the absence (black bars) and presence (triangle bars) of Triton-X 100 are plotted for each antibody treatment. The antibodies tested were muCD20-2, muCD20-7, rituximab, muIgG control antibody (Figure 4A), and muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6, muCD20-7, muIgG control antibody (Figure 4B).
FIG. 5 is a representation of annexin-V assay using Ramos lymphoma cells incubated with 10 nM concentration of chCD20-2, chCD20-7, rituximab or a control (without Ab).
FIG. 6 shows Daudi cells (FIG. 6A) and WSU-DLCL-2 cells (FIG. 6A) cultured with chCD20-2, chCD20-7, rituximab or huIgG1 isotype control antibody in the presence of 5% human serum with complement (FIG. 6B). Representation of the results of the CDC analysis.
FIG. 7 is a representation of CD20-7 surface residues and substitutions in a resurfaced form for CD20-7 VL (FIG. 7A) and CD20-7 VH (FIG. 7B).
8 is a representation of an exemplary resurfaced sequence alignment for the CD20-7 variable region compared to the corresponding sequence of murine. See FIG. 8A for the light chain (VL) variable domain and FIG. 8B for the heavy chain (VH) variable domain. A dash "-" indicates that the murine sequence is the same.
9 shows expression of binding of muCD20-7, chCD20-7 and huCD20-7 (but not huIgG1 isotype control antibody) to BJAB cells analyzed by flow cytometry. Binding curves were used to determine the EC 50 of antibody binding, which corresponds to the apparent K d of each antibody.
10 Expression of binding of huCD20-7 to membrane preparations from WSU-DLCL-2 lymphoma cells by ELISA.
FIG. 11 is a representation of Annexin-V assay for Ramos lymphoma cells cultured with muCD20-7, huCD20-7, or huIgG1 isotype control antibodies at 10 nM, 1 nM and 0.1 nM concentrations.
FIG. 12 shows Annexin-V analysis of Ramos lymphoma cells incubated with huCD20-7, B1, Rituximab, GA101-F, and 2F2 at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1.7 × 10 −13 M Representation of the result. Control samples are compared. "B1" corresponds to the unlabeled form of Beckman Coulter; "GA101-F" corresponds to the fucosylated form of aputuzumab or GA101 (Hoffman LaRoche); "2F2" corresponds to opatumumab (Genmab / GSK).
FIG. 13 is a representation of Annexin-V assay for lymphoma cells with huCD20-7, B1, or Rituximab at a concentration of 10 nM. Control samples of untreated cells were used for comparison. Experiments included Ramos cells (FIG. 13A), Raji cells (FIG. 13B), WSU-DLCL-2 cells (FIG. 13C), Jeko-1 cells (FIG. 13D) and Granta-519 lymphoma cells (FIG. 13E).
FIG. 14 is a representation of lipid raft assay results using Ramos cells and huCD20-7, rituximab, 2F2 and GA101-F antibodies at 10 μg / ml. MFI for FL1 from samples in the absence (black bars) and in the presence of Triton-X 100 (white bars) is plotted for each antibody treatment.
FIG. 15 shows Daudi cells (FIG. 15A) and Ramos lymphoma cells (FIG. 15B) incubated with huCD20-7, Rituximab, GA101-F or huIgG1 isotype control antibody in the presence of 5% human serum with complement. Representation of CDC Analysis Results.
FIG. 16 shows WSU-DLCL-2 cells (FIG. 16A) and RL lymphoma cells (FIG. 16B) incubated with huCD20-7, rituximab, or huIgG1 isotype control antibody in the presence of 5% human serum with complement. Representation of CDC analysis results.
FIG. 17 shows Ramos lymphoma cells (FIG. 17A) and JVM-13 CLL cells (FIG. 17B) incubated with huCD20-7, Rituximab, 2F2 or huIgG1 isotype control antibodies in the presence of purified human NK cells such as effector cells. Representation of ADCC analysis results using).
FIG. 18 shows CD20 in cells transfected with human CD20 analyzed by flow cytometry using huCD20-7, rituximab, 2F2, GA101-F, B1 (FIG. 18A) and muCD20-6 and muCD20-7 (FIG. 18B). Expression of Antibody Population Binding.
FIG. 19 shows human CD20 analyzed by flow cytometry using huCD20-7, Rituximab, 2F2, GA101-F, B1 (FIG. 19A) and muCD20-6, muCD20-7, Rituximab and 2F2 (FIG. 19B). Expression of CD20 antibody population binding to cells transfected with A179S P172S.
20 shows human CD20 N163D analyzed by flow cytometry using huCD20-7, Rituximab, 2F2, GA101-F (FIG. 20A) and muCD20-6, muCD20-7, Rituximab and 2F2 (FIG. 20B). Expression of CD20 antibody population binding to transfected cells.
Figure 21 shows human CD20 N163D N166D analyzed by flow cytometry using huCD20-7, Rituximab, 2F2, GA101-F (Figure 21A) and muCD20-6, muCD20-7, Rituximab and 2F2 (Figure 21B). Expression of CD20 antibody population binding to cells transfected with.
FIG. 22 shows huCD20-7-SMCC-DM1 and -SPP-DM1 (FIG. 22A) or huCD20-7-sulfomal-DM4 conjugate (FIG. 22B) in membrane preparations from WSU-DLCL-2 lymphoma cells by ELISA. Expression of binding of huCD20-7 in comparison.
FIG. 23 shows Ramos lymphoma cultured with rituximab, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, or huCD20-7-SPDB-DM4 at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1 × 10 −11 M Expression of Annexin-V Assay for Cells. Ramos cells were treated with the same concentrations of unbound huIgG1-SMCC-DM1 and huIgG1-SPDB-DM4 conjugates.
Figure 24 Daudi cells cultured with huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4, huCD20-7-PEG4-mal-DM4, Rituximab or huIgG1 isotype control antibodies in the presence of 5% human serum with complement (FIG. 24A) and representation of CDC assay results for WSU-DLCL-2 lymphoma cells (FIG. 24B).
Figure 25 WSU- incubated with huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-sulfo-mal-DM4, rituximab or huIgG1 isotype control antibody in the presence of 5% human serum with complement Representation of CDC assay results for DLCL-2 cells (FIG. 25A) and Ramos lymphoma cells (FIG. 25B).
FIG. 26 shows Ramos cells (FIG. 26A) and Granta cultured with huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, Rituximab, 2F2 or huIgG1 isotype control antibody in the presence of purified human NK cells such as effector cells. Representation of ADCC Assay for -519 Lymphoma Cells (FIG. 26B).
FIG. 27 is incubated with huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, Rituximab, or huIgG1-SMCC-DM1 control conjugates for 5 days at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1 × 10 −11 M Representation of WST-8 cytotoxicity assay on Ramos cells (FIG. 27A) and Daudi cells (FIG. 27B).
28 shows huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, rituximab, or unbound huIgG1-SMCC-DM1 control conjugates for 5 days at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1 × 10 −11 M Representation of WST-8 cytotoxicity assay results for Granta-519 cells (FIG. 28A) and SC-1 cells (FIG. 28B) co-cultured.
29 shows incubation with huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, rituximab, or huIgG1-SMCC-DM1 control conjugates for 5 days at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1 × 10 −11 M Representation of WST-8 cytotoxicity assay on DOHH-2 B cell lymphoma cells (FIG. 29A) and Molt-4 T cell leukemia cells (FIG. 29B). Molt-4 cells are CD20 negative.
30 shows huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, rituximab, rituximab-SMCC-DM1 or unbound huIgG1 for 5 days at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1 × 10 −11 M Representation of WST-8 cytotoxicity assay on Ramos cells (FIG. 30A) and Daudi cells (FIG. 30B) incubated with antibody and huIgG1-SMCC-DM1 control conjugate.
31 is a representation of binding to the SU-DHL-4 analysis by flow cytometry huCD20-7, huCD20-7-SMCC- [3 H ] DM1, rituximab or rituximab when Thank Thank -SMCC- [3 H] DM1 ( Figure 31A). Figure 31B 5 days huCD20-7, huCD20-7-SMCC- [3 H ] DM1, rituximab or rituximab -SMCC- [3 H] antigen during incubation with DM1-positive SU-DHL-4 B Representation of WST-8 cytotoxicity assay on cellular lymphoma cells and antigen-negative COLO205 colon cancer cells.
Figure 32 is an SU-DHL-4 huCD20-7-SMCC- [3 H] DM1 or rituximab -SMCC- [3 H] amount of DM1 (FIG. 32A) and huCD20-7-SMCC- bonds per cell [3 H] DM1 or rituximab -SMCC- [3 H] after 22 hours of exposure of the SU-DHL-4 cells for DM1 generated lysine -SMCC- [3 H] expression of DM1 metabolites amount.
33 shows huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-PEG4-mal-DM4 and huCD20-7-SPDB for 5 days at concentrations ranging from 3 × 10 −8 M to 1 × 10 −11 M -DM4 (FIG. 31A), and huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, huCD20-7-SPP-DM1, huCD20-7-sulfo-mal-DM4 and huIgG1-SMCC-DM1 and huIgG1-SPP-DM1 controls Representation of exemplary WST-8 cytotoxicity assay results for Granta-519 cells incubated with the conjugate (FIG. 31B).
34 Representation of experimental results using established xenograft model SU-DHL-4 diffuse large B-cell lymphoma cells inserted subcutaneously in SCID mice. Mice were treated three times weekly on days 14, 21 and 28 (arrows) after cell inoculation with huCD20-7 or rituximab at 10 or 1 mg / kg. Median tumor volumes from different treatment groups are plotted against time after tumor cell inoculation.
35 Representation of the results of in vivo xenograft studies using Daudi lymphoma cells inserted intravenously in SCID mice. Mice were huCD20-7 at 10 mg / kg, huCD20-7-SMCC-DM1 at 10 mg / kg or huCD20-7-SPP-DM1 at 5 mg / kg (FIG. 35A) and huCD20-7 at 10 mg / kg, Treatment with rituximab, huCD20-7-SMCC-DM1 or huCD20-7-BMPS-DM1 (FIG. 35B) was performed once on day 7 post cell inoculation. The number of mice surviving in the different treatment groups is plotted against time after tumor cell inoculation.
36 is a representation of exemplary xenograft studies using subcutaneous DOHH-2 follicular lymphoma cells in SCID mice. Mice were treated once on day 3 post cell inoculation with 10 mg / kg huCD20-7, 10 mg / kg huCD20-7-SMCC-DM1 or 5 mg / kg huCD20-7-SPP-DM1. Median tumor volumes from different treatment groups are plotted against time after tumor cell inoculation.

본 발명은 CD20을 발현하는(예컨대, 양성) 세포에 대하여 3가지 세포독성 활성, 즉 아포토시스의 유도, ADCC, 및 CDC에서 높은 효력을 가지는 항-CD20 항체의 새로운 부류(즉, III형)를 제공한다. 또한, 생체내 종양 모델을 사용하여 입증된 바와 같이, SMCC-DM1과 항-CD20 항체의 컨쥬게이트는 CD20을 발현하는 세포를 예상치 않게 잘 사명시킨다.The present invention provides a new class of anti-CD20 antibodies (ie type III) that have three cytotoxic activities against CD20 expressing (eg, positive) cells, namely induction of apoptosis, ADCC, and high potency in CDC. do. In addition, as demonstrated using an in vivo tumor model, the conjugate of SMCC-DM1 and anti-CD20 antibody unexpectedly well commissions cells expressing CD20.

정의Justice

모든 양태에서, "지방족기"는 알킬, 알켄일 또는 알카인일 기로서 정의된다. 알킬 기는 직선형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기이며, 바람직하게는 사슬 또는 고리 내에 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지고, 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 보다 바람직한 알킬 기는 사슬 내에 1 내지 12개의 탄소 원자를 가진다. "분지형"은 1개 이상의 저급 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필이 선형 알킬 사슬에 부착된 것을 의미한다. 예시적인 알킬 기는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, n-펜틸, 3-펜틸, 옥틸, 노닐, 데실, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.In all embodiments, an " aliphatic group " is defined as an alkyl, alkenyl or alkynyl group. Alkyl groups are aliphatic hydrocarbon groups which may be straight or branched, preferably have from 1 to 20 carbon atoms in the chain or ring, preferably have from 3 to 10 carbon atoms. More preferred alkyl groups have 1 to 12 carbon atoms in the chain. "Branched" means that at least one lower alkyl group, such as methyl, ethyl or propyl, is attached to a linear alkyl chain. Exemplary alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, n-pentyl, 3-pentyl, octyl, nonyl, decyl, cyclopentyl and cyclohexyl.

알켄일 기는 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, 직선형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기이며, 바람직하게는 사슬 내에 2 내지 15개의 탄소 원자를 가진다. 보다 바람직한 알켄일 기는 사슬 내에 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지며, 보다 바람직하게는 사슬 내에 약 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진다. 예시적인 알켄일 기는 에텐일, 프로펜일, n-뷰텐일, i-뷰텐일, 3-메틸뷰트-2-엔일, n-펜텐일, 헵텐일, 옥텐일, 노넨일 및 데센일을 포함한다.Alkenyl groups are aliphatic hydrocarbon groups that contain carbon-carbon double bonds and may be straight or branched, and preferably have 2 to 15 carbon atoms in the chain. More preferred alkenyl groups have 2 to 12 carbon atoms in the chain, and more preferably have about 2 to 4 carbon atoms in the chain. Exemplary alkenyl groups include ethenyl, propenyl, n-butenyl, i-butenyl, 3-methylbut-2-enyl, n-pentenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl and desenyl.

알카인일 기는 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하고, 직선형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기이며, 바람직하게는 사슬 내에 2 내지 15개의 탄소 원자를 가진다. 보다 바람직한 알카인일 기는 사슬 내에 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지며, 보다 바람직하게는 사슬 내에 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진다. 예시적인 알카인일 기는 에탄인일, 프로파인일, n-뷰타인일, 2-뷰타인일, 3-메틸뷰타인일, n-펜타인일, 헵타인일, 옥타인일 및 데카인일을 포함한다.Alkainyl groups are aliphatic hydrocarbon groups that contain carbon-carbon triple bonds and may be straight or branched, and preferably have 2 to 15 carbon atoms in the chain. More preferred alkynyl groups have 2 to 12 carbon atoms in the chain, and more preferably have 2 to 4 carbon atoms in the chain. Exemplary alkynyl groups are ethaneynyl, propynyl, n-butynyl, 2-butynyl, 3-methylbutynyl, n-pentynyl, heptinyl, octaynyl and decainyl It includes.

본원에서 사용된, 용어 "방향족 기"는 6 내지 14개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 10개의 탄소 원자의 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 고리계로 이루어지는 치환 또는 비치환 아릴 기를 의미한다. 예시적인 아릴 기는 페닐 및 나프틸을 포함한다. 치환기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 알킬 기, 할로겐, 나이트로, 아미노, 하이드록실 및 C1-C3 알콕시 기, 예를 들어 메톡시, 에톡시 및 프로폭시를 포함한다.As used herein, the term “ aromatic group ” means a substituted or unsubstituted aryl group consisting of an aromatic monocyclic or multicyclic hydrocarbon ring system of 6 to 14 carbon atoms, preferably 6 to 10 carbon atoms. Exemplary aryl groups include phenyl and naphthyl. Substituents include, but are not limited to, alkyl groups, halogens, nitros, amino, hydroxyl and C 1 -C 3 alkoxy groups such as methoxy, ethoxy and propoxy.

용어 " 헤테로사이클 ", " 헤테로사이클릴 " 및 " 헤테로사이클릭 기"는 포화, 부분적 불포화 또는 불포화, 비방향족의 안정적인 3 내지 14원, 바람직하게는 5 내지 10원의 모노-, 바이- 또는 멀티사이클릭 고리를 지칭하며, 여기에서 고리의 적어도 하나의 구성원은 헤테로 원자, 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 가지는 방향족, 바람직하게 5 내지 10원의 모노-, 바이- 또는 멀티사이클릭 고리이다. 전형적으로, 헤테로 원자는 이에 한정되는 것은 아니지만, 산소, 질소, 황, 셀레늄, 및 인 원자를 포함한다. 바람직한 헤테로 원자는 산소, 질소 및 황이다. 헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), 특히 1, 3, 4, 6, 7, 및 9장; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950부터 현재까지), 특히 13, 14, 16, 19, 28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기술되어 있다. "헤테로사이클릴"은 또한 라디칼을 포함하며, 여기에서 헤테로사이클 라디칼은 포화, 부분적 불포화 고리, 또는 방향족 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합된다.The terms " heterocycle " , " heterocyclyl " and " heterocyclic group" are saturated, partially unsaturated or unsaturated, non-aromatic, stable 3-14 membered, preferably 5-10 membered mono-, bi- or multi Refers to a cyclic ring, wherein at least one member of the ring is a hetero atom, or an aromatic, preferably 5 to 10 membered mono-, bi- or multicyclic ring having at least one hetero atom. Typically, heteroatoms include, but are not limited to, oxygen, nitrogen, sulfur, selenium, and phosphorus atoms. Preferred hetero atoms are oxygen, nitrogen and sulfur. Heterocycles are described in Paquette, Leo A .; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (WA Benjamin, New York, 1968), in particular Chapters 1, 3, 4, 6, 7, and 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), especially volumes 13, 14, 16, 19, 28; And J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566. "Heterocyclyl" also includes radicals in which the heterocycle radicals are fused with saturated, partially unsaturated rings, or aromatic carbocyclic or heterocyclic rings.

지방족, 방향족 및 헤테로사이클릭 단위는 또한 하전된 치환기를 가진다. 하전된 치환기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 카복실레이트, 설포네이트 및 포스페이트로부터 선택된 음으로 하전된 기, 또는 3차 또는 4차 아미노 기로부터 선택된 양으로 하전된 기일 수 있다.Aliphatic, aromatic and heterocyclic units also have charged substituents. Charged substituents may be, but are not limited to, negatively charged groups selected from carboxylates, sulfonates and phosphates, or groups charged in amounts selected from tertiary or quaternary amino groups.

용어 " 헤테로아릴 "은 5원 또는 6원의 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭하며, 5~18개의 원자의 융합된 고리계(이의 적어도 하나는 방향족임)를 포함하고, 이는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리딘일(예를 들어, 2-하이드록시피리딘일을 포함함), 이미다졸일, 이미다조피리딘일, 피리미딘일(예를 들어, 4-하이드록시피리미딘일을 포함함), 피라졸일, 트라이아졸일, 피라진일, 테트라졸일, 퓨릴, 티엔일, 아이속사졸일, 티아졸일, 옥사졸일, 아이소티아졸일, 피롤일, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 인돌일, 벤즈이미다졸일, 벤조퓨란일, 신놀린일, 인다졸일, 인돌리진일, 프탈라진일, 피리다진일, 트라이아진일, 아이소인돌일, 프테리딘일, 퓨린일, 옥사다이아졸일, 트라이아졸일, 티아다이아졸일, 퓨라잔일, 벤조퓨라잔일, 벤조티오페닐, 벤조티아졸일, 벤족사졸일, 퀴나졸린일, 퀴녹사린일, 나프틸리딘일, 및 퓨로피리딘일이다.The term “ heteroaryl ” refers to a monovalent aromatic radical of a 5 or 6 membered ring and includes a fused ring system of 5-18 atoms, at least one of which is aromatic, which is nitrogen, oxygen and sulfur It includes one or more heteroatoms independently selected from. Examples of heteroaryl groups include pyridinyl (eg, including 2-hydroxypyridinyl), imidazolyl, imidazopyridinyl, pyrimidinyl (eg, 4-hydroxypyrimidinyl) Pyrazolyl, triazolyl, pyrazinyl, tetrazolyl, furyl, thienyl, isoxazolyl, thiazolyl, oxazolyl, isothiazolyl, pyrrolyl, quinolinyl, isoquinolinyl, indolyl, benz Imidazolyl, benzofuranyl, cinnolinyl, indazolyl, indolinyl, phthalazinyl, pyridazinyl, triazineyl, isoindoleyl, pterridinyl, purinyl, oxadiazolyl, triazolyl, Thiadiazolyl, furazanyl, benzofurazanyl, benzothiophenyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, naphthyridinyl, and purpyridinyl.

헤테로사이클 또는 헤테로아릴 기는 탄소(탄소-연결) 또는 질소(질소-연결)가 있을 수 있는 곳에 부착된 탄소(탄소-연결) 또는 질소(질소-연결)일 수 있다. 한정되는 것은 아니지만 예로서, 탄소 결합 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 피리딘의 2, 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리다진의 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리미딘의 2, 4, 5, 또는 6번 위치, 피라진의 2, 3, 5, 또는 6번 위치, 퓨란, 테트라하이드로퓨란, 티오퓨란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 2, 3, 4, 또는 5번 위치, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 2, 4, 또는 5번 위치, 이속사졸, 피라졸 또는 아이소티아졸의 3, 4, 또는 5번 위치, 아지리딘의 2 또는 3번 위치, 아제티딘의 2, 3, 또는 4번 위치, 퀴놀린의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치, 또는 아이소퀴놀린의 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치에서 결합된다.The heterocycle or heteroaryl group may be carbon (carbon-linked) or nitrogen (nitrogen-linked) attached where there may be carbon (carbon-linked) or nitrogen (nitrogen-linked) groups. By way of example, but not limitation, carbon-bonded heterocycles and heteroaryls are at position 2, 3, 4, 5, or 6 of pyridine, position 3, 4, 5, or 6 of pyridazine, position 2, 4 of pyrimidine. , Position 5, or 6, position 2, 3, 5, or 6 of pyrazine, position 2, 3, 4, or 5 of furan, tetrahydrofuran, thiofuran, thiophene, pyrrole or tetrahydropyrrole, 2, 4, or 5 position of oxazole, imidazole or thiazole, 3, 4, or 5 position of isoxazole, pyrazole or isothiazole, 2 or 3 position of aziridine, 2 of azetidine , 3, or 4 position, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 position of quinoline, or 1, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 position of isoquinoline .

한정되는 것은 아니지만 예로서, 질소 결합 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 1번 위치, 아이소인돌 또는 아이소인돌린의 2번 위치, 몰폴린의 4번 위치, 및 카바졸 또는 O-카볼린의 9번 위치에서 결합된다.By way of example, but not limitation, nitrogen bond heterocycles and heteroaryls are aziridine, azetidine, pyrrole, pyrrolidine, 2-pyrroline, 3-pyrroline, imidazole, imidazolidine, 2-imidazoline , 3-imidazoline, pyrazole, pyrazoline, 2-pyrazoline, 3-pyrazoline, piperidine, piperazine, indole, indolin, 1H-indazole, isoindole or isoindolin Position 2, position 4 of the morpholine, and position 9 of the carbazole or O-carboline.

헤테로아릴 및 헤테로사이클릴 기에 존재하는 헤테로원자는 산화 형태, 예를 들어 NO, SO 및 SO2를 포함한다. 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴의 치환기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 알킬 기, 할로겐, 나이트로, 아미노, 하이드록실 및 C1-C3 알콕시 기, 예를 들어 메톡시, 에톡시 및 프로폭시를 포함한다.Heteroatoms present in heteroaryl and heterocyclyl groups include oxidized forms such as NO, SO and SO 2 . Substituents of heteroaryl or heterocyclyl include, but are not limited to, alkyl groups, halogens, nitros, amino, hydroxyl and C 1 -C 3 alkoxy groups such as methoxy, ethoxy and propoxy .

"할로겐"은 플루오린, 염소, 브롬 및 요오드 원소를 포함한다. 플루오린 및 염소 원자가 바람직하다. "Halogen" includes fluorine, chlorine, bromine and iodine elements. Fluorine and chlorine atoms are preferred.

본원에서 사용된 용어 "컨 쥬게이트 "는 세포 결합제(즉, 항-CD20 항체 또는 그의 절편)에 연결된 화합물 또는 이의 유도체를 지칭하며, 일반식 C-L-CBA(여기에서 C = 화합물, L = 링커, 및 CBA = 세포 결합제 또는 항-CD20 항체 또는 절편)로 정의된다. 일부 실시형태에서, 일반식 D-L-CBA(여기에서 D = 약물, L = 링커 및 CBA = 세포 결합제 또는 항-CD20 항체 또는 절편)는 또한 동일한 방식으로 사용될 수 있다.As used herein, the term "juice containers gate" is the cell binding agent refers to the compound or derivative thereof linked to (i. E., Anti -CD20 antibody or fragment), the formula CL-CBA (here C = compound, L = linker, And CBA = cell binding agent or anti-CD20 antibody or fragment). In some embodiments, the general formula DL-CBA, wherein D = drug, L = linker and CBA = cell binder or anti-CD20 antibody or fragment, may also be used in the same manner.

링커는 화합물, 통상적으로 약물, 예를 들어 메이탄시노이드를 세포-결합제, 예를 들어 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 안정적이고 공유적인 방식으로 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성 상태를 유지하는 조건 하에서, 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다아제-유도 절단, 에스테라아제-유도 절단, 및 이황화 결합 절단에 영향을 받기 쉽거나 또는 이에 상당히 저항성일 수 있다. 적당한 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성 기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기를 포함한다. 링커는 또한 본원에 기술되고 당업계에 알려진 바와 같이 하전된 링커 및 이의 친수성 형태를 포함한다. A linker is any chemical moiety capable of linking a compound, typically a drug, for example maytansinoid, to a cell-binding agent, such as an anti-CD20 antibody or fragment thereof, in a stable and covalent manner. The linker may be susceptible to or significantly resistant to acid-induced cleavage, light-induced cleavage, peptidase-induced cleavage, esterase-induced cleavage, and disulfide bond cleavage under conditions in which the compound or antibody remains active. have. Suitable linkers are well known in the art and include, for example, disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, light labile groups, peptidase labile groups and esterase labile groups. Linkers also include charged linkers and their hydrophilic forms as described herein and known in the art.

달리 지시되지 않는다면, 본원에서 사용된 "비정상적 세포 성장"은 정상적인 조절 메커니즘과 관계없는 세포 성장(예컨대, 접촉 저지의 손실)을 지칭한다. 이는 예를 들어 다음의 비정상적인 성장을 포함한다: (1) 돌연변이된 티로신 키나아제를 발현 또는 수용체 티로신 키나아제의 과발현에 의해 증식하는 종양 세포(종양); (2) 비정상적인 티로신 키나아제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; (3) 수용체 티로신 키나아제에 의해 증식하는 임의의 종양; (4) 비정상적인 세린/트레오닌 키나아제 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양; 및 (5) 비정상적인 세린/트레오닌 키나아제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포.Unless otherwise indicated, “abnormal cell growth” as used herein refers to cell growth that is independent of normal regulatory mechanisms (eg, loss of contact arrest). This includes, for example, abnormal growth of: (1) tumor cells (tumors) that proliferate mutated tyrosine kinases by expression or overexpression of receptor tyrosine kinases; (2) benign and malignant cells of other proliferative diseases in which abnormal tyrosine kinase activation occurs; (3) any tumor that proliferates by receptor tyrosine kinase; (4) any tumor that proliferates by abnormal serine / threonine kinase activation; And (5) benign and malignant cells of other proliferative diseases in which abnormal serine / threonine kinase activation occurs.

본 발명은 종양 형성(tumorigenic) 질환 및 면역 질환, 예컨대 자가면역 또는 염증성 질환을 포함하는, CD20을 발현하는 세포를 수반하는 다양한 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.The present invention can be used to treat and / or prevent various diseases involving cells expressing CD20, including tumorigenic diseases and immune diseases such as autoimmune or inflammatory diseases.

용어 "암" 및 " 암성 "은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 기술한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프 종양(lymphoid malignancy)을 포함한다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 "종양 형성" 질환의 예는, NHL을 포함한 B 세포 림프종, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급의 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종(MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)을 포함한다.The terms “cancer” and “ cancerous ” refer to or describe physiological conditions in mammals that are typically characterized by unregulated cell growth. "Tumor" includes one or more cancerous cells. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancy. Examples of “tumor forming” diseases that can be treated and / or prevented include B cell lymphoma, including NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma, and mature B cell neoplasia, such as B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL). ) / Slim lymphocytic lymphoma (SLL), B cell prelymphocytic leukemia, lymphoid cytoplasmic lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL) (including low, medium and high grade FL) ), Follicular follicular lymphoma, marginal zone B cell lymphoma (MALT type, nodular and spleen type), hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disease, Waldenstrom's macroglobulinemia, and retrograde large cell lymphoma (ALCL).

CD20을 발현하는 B 세포가 수반되는 치료 및/또는 예방될 수 있는 "면역 장애" 및 질환의 예는 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신성 강피증 및 경화증, 염증성 장질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 다발성 경화증, 레이노드 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 면역 복합체 사구체신염, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 면역-매개 혈소판 감소증, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 낭창성 신염, 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염 (RA), 아토피 피부염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HN, 및 헤르페스 바이러스 연관 질환을 포함한다. 추가 예로는 중증 급성 호흡 곤란 증후군 및 맥락망막염이 있다. 또한 추가의 예로는 바이러스, 예를 들어 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 B 세포의 감염에 의해 야기되는 질환 및 장애가 있다.Examples of “immune disorders” and diseases that can be treated and / or prevented with B cells expressing CD20 include psoriasis, psoriatic arthritis, dermatitis, systemic scleroderma and sclerosis, inflammatory bowel disease (IBD), Crohn's disease, Ulcerative colitis, dyspnea syndrome, meningitis, encephalitis, uveitis, glomerulonephritis, eczema, asthma, atherosclerosis, leukocyte adhesion deficiency, multiple sclerosis, Raynaud's syndrome, Sjogren's syndrome, childhood diabetes, lighter disease, Behcet's disease, immune complex Glomerulonephritis, IgA nephropathy, IgM multiple neuropathy, immune-mediated thrombocytopenia, for example acute idiopathic thrombocytopenic purpura and chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, myasthenia gravis, lupus nephritis, systemic lupus erythematosus Arthritis (RA), atopic dermatitis, pemphigus, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, Wegener's granulomatosis, Omen syndrome, chronic renal failure, acute sensation Including gender mononucleosis, HN, and the herpes virus associated diseases. Further examples are severe acute respiratory distress syndrome and chorioretinitis. Further examples are diseases and disorders caused by infection of B cells with viruses such as Epstein-Barr virus (EBV).

"치료제"는 생물 작용제, 예를 들어 항체, 펩티드, 단백질, 효소 또는 화학요법제 모두를 포함한다." Therapeutic agent " includes all biological agents such as antibodies, peptides, proteins, enzymes or chemotherapeutic agents.

"화학요법제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 엘로티닙(TARCEVA(등록상표), Genentech/OSI Pharm.), 보르테조밉(VELCADE(등록상표), Millennium Pharm.), 풀베스트란트(FASLODEX(등록상표), AstraZeneca), 수텐트(SU11248, Pfizer), 레트로졸(FEMARA(등록상표), Novartis), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC(등록상표), Novartis), PTK787/ZK 222584(Novartis), 옥살리플라틴(Eloxatin(등록상표), Sanofi), 5-FU(5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE(등록상표), Wyeth), 라파티닙(TYKERB(등록상표), GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파닙(SCH 66336), 소라페닙(BAY43-9006, Bayer Labs), 및 게피티닙(IRESSA(등록상표), AstraZeneca), AG1478, AG1571(SU 5271; Sugen), 알킬화제 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN(등록상표) 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예를 들어 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜아민, 트라이에틸렌포스포아마이드, 트라이에틸렌티오포스포아마이드 및 트라이메틸로멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타신온); 캄토테신(예를 들어 합성 유사체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(예를 들어 이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(예를 들어 합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스터드 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스타인, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 메팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예를 들어 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예를 들어 에네딘 항생제(예를 들어 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마 II 및 칼리키아마이신 오메가 II(Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질(에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르루신, ADRIAMYCIN(등록상표)(독소루비신), 몰폴리노-독소루비신, 시아노몰폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체 예를 들어 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체 예를 들어 플루다라빈, 6-메캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항부신 물질 예를 들어 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄, 폴산 보충제 예를 들어 폴린산; 아세글라톤, 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조퓨란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히, T-2 독소, 베루카린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 탁솔(TAXOL)(등록상표)(파클리탁셀; Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재), 아브락산(ABRAXANE)(등록상표)(크레모포 없음), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 탁소텔(TAXOTERE)(등록상표)(독세탁셀; Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 젬자(GEMZAR)(등록상표)(젬시타빈); 6-티오구아닌; 메캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈플라스틴; 에포토사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)(등록상표)(비노렐빈); 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈(젤로다(XELODA)(등록상표)); 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라아제 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드 예를 들어 레티노산; 및 상기한 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체를 포함한다. A "chemotherapeutic agent" is a chemical compound useful in the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic agents include erlotinib (TARCEVA®, Genentech / OSI Pharm.), Bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), Fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), Letrozole (FEMARA®, Novartis), Imatinib mesylate (GLEEVEC®, Novartis), PTK787 / ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatin®, Sanofi ), 5-FU (5-Fluorouracil), Leucovorin, Rapamycin (Syrrolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), Lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), Ronaphanib ( SCH 66336), sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs), and gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), alkylating agents such as Thiotepa and CYTOXAN® ) Cyclophosphamide; Alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and pipeosulfan; Aziridines such as benzodopa, carbocuone, meturedopa, and uredopa; Ethyleneimines and methylamelamines such as altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoamide, triethylenethiophosphoamide and trimethyllomelamine; Acetogenin (particularly bulatacin and bulatacinone); Camptothecins (eg synthetic analog topotecan); Bryostatin; Calistatin; CC-1065 (eg its adozelesin, kazelesin and bizelesin synthetic analogs); Cryptopycin (particularly cryptotopin 1 and cryptotopin 8); Dolastatin; Duocarmycin (eg, synthetic analogs, KW-2189 and CB1-TM1); Eleuterobin; Pancreatistin; Sarcocticin; Spongystatin; Nitrogen mustards, for example chlorambucil, clonaphazine, chlorophosphamide, esturamusstein, ifosmamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, mephalan, normovicin, phenesterin, fred Nimustine, trophosphamide, uracil mustard; Nitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, potemustine, lomustine, nimustine, and rannimustine; Antibiotics such as enedine antibiotics (for example calicheamicins, especially calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186)); Such as dynemycin A; bisphosphonates, such as clodronate; esperamicin; and neocarcinonostatin chromophores and related pigment proteins (enedine antibiotic chromophores), aclacinomycin, actinomycin, anthracycin , Azaserine, Bleomycin, Cocktinomycin, Carabicin, Caminomycin, Casinophylline, Chromomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Detorrubicin, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine, ADRIAMYCIN® (doxorubicin), morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, 2-pyrrolino-doxorubicin and deoxydoxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomycin, Mitomycin example For example, mitomycin C, mycophenolic acid, nogalamycin, olibomycin, peplomycin, porphyromycin, puromycin, quelamycin, rhodrubicin, streptonigrin, streptozosin, tubercidine, ubenimax , Ginostatin, zorubicin; Antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); Folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, ptereptherin, trimetrexate; Purine analogs such as fludarabine, 6-mecaptopurine, thiamiprine, thioguanine; Pyrimidine analogs such as ancitabine, azacytidine, 6-azauridine, camopur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluidine, enositabine, phloxuridine; Androgens such as calussterone, dromostanolone propionate, epithiostanol, mepitiostane, testosterone; Antiadrenal substances such as aminoglutethymide, mitotans, trilostane, folic acid supplements such as folic acid; Aceglaton, aldophosphamide glycoside; Aminolevulinic acid; Enyluracil; Amsacrine; Best La Vucil; Arsenate; Edatroxate; Depopamin; Demechecine; Diajikuon; Elformitin; Elliptinium acetate; Epothilone; Etoglucide; Gallium nitrate; Hydroxyurea; Lentinan; Ronidainine; Maytansinoids such as maytansine and ansamitocin; Mitoguazone; Mitoxantrone; Fur monotherapy; Nitraerine; Pentostatin; Phenamate; Pyra rubicin; Rosantanone; Grapefinal acid; 2-ethylhydrazide; Procarbazine; PSK® polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); Lauric acid; Liqin; Shijo furan; Spirogermanium; Tenuazonic acid; Triazinone; 2,2 ', 2''-trichlorotriethylamine; Tricortesenes (particularly T-2 toxins, berucarin A, loridine A and anguidine); urethane; Bindesin; Dacarbazine; Mannomustine; Mitobronitol; Mitolactol; Fifobroman; Astaxanthin; Arabinosides ("Ara-C");Cyclophosphamide;Thiotepa; Taxoids such as TAXOL® (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE® (without cremofo), albumin-engineered nanoparticles of paclitaxel Formulations (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), And TAXOTERE® (doxtaxel; Rhone-Poulenc Rorer, Anthony, France); Chlorambucil; GEMZAR® (Gemcitabine); 6-thioguanine; Mecaptopurine; Methotrexate; Platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; Vinplastin; Eposides (VP-16); Ifosfamide; Mitoxantrone; Vincristine; Navelvin® (vinorelbine); Novantron; Teniposide; Etrexate; Daunomycin; Aminopterin; Capecitabine (XELODA®); Ibandronate; CPT-11; Topoisomerase inhibitor RFS 2000; Difluoromethylornithine (DMFO); Retinoids such as retinoic acid; And pharmaceutically acceptable salts, acids and derivatives of any of the foregoing.

또한 "화학요법제"의 정의에 다음이 포함된다: (i) 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)와 같은 종양에 작용하는 호르몬을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표); 타목시펜 시트레이트를 포함함), 라록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 화레스톤(FARESTON)(등록상표)(토레미핀 시트레이트)을 포함함; (ii) 효소 아로마타아제를 억제하는 아로마타아제 억제제, 이는 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하며, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티마이드, MEGASE(등록상표)(메게스트롤 아세테이트), 아로마신(AROMASIN)(등록상표)(엑세메스탄; Pfizer), 포메스테인, 파드로졸, 리비솔(RIVISOR)(등록상표)(보로졸), 페마라(FEMARA)(등록상표)(레트로졸; Novartis), 및 아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표)(아나스트로졸; AstraZeneca); (iii) 항안드로겐, 예를 들어 플루타마이드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 루프롤라이드, 및 고세렐린; 및 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 단백질 키나아제 억제제; (v) 지질 키나아제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; (vii) 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제(예컨대, 엔지오자임(ANGIOZYME)(등록상표)) 및 HER2 발현 억제제; (viii) 백신, 예를 들어 유전자 치료 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표), 루벡틴(LEUVECTIN)(등록상표), 및 박시드(VAXID)(등록상표); 프로류킨(PROLEUKIN)(등록상표) rIL-2; 토포아이소머라아제 1 억제제, 예를 들어 루토테칸(LURTOTECAN)(등록상표); 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표) rmRH; (ix) 혈관 생성 억제제, 예를 들어 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN)(등록상표), Genentech); 및 (x) 상기한 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체. 기타 혈관 생성 억제제는 MMP-2(매트릭스 메탈로프로테이나아제 2) 억제제, MMP-9(매트릭스 메탈로프로테이나아제 9) 억제제, COX-II(사이클로옥시게나아제 II) 억제제, 및 VEGF 수용체 티로신 키나아제 억제제를 포함한다. 본 발명의 화합물/조성물과 조합하여 사용될 수 있는 이러한 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제의 예는 WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, EP 606,046, EP 931,788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675, EP 945864, 미국 특허 제5,863,949호, 미국 특허 제5,861,510호, 및 EP 780,386에 기술되어 있으며, 이들 모두 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. VEGF 억제제 티로신 키나아제의 예는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474; WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)- -퀴나졸린(AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바탈라닙(PTK787; WO 98/35985) 및 SU11248(수니티닙; WO 01/60814), 및 PCT 공개 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, 및 WO 98/13354에 개시된 바와 같은 화합물을 포함한다.Also included in the definition of "chemotherapeutic agents" are: (i) anti-hormonal agents that act to modulate or inhibit hormones that act on tumors, such as antiestrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs), for example tamoxifen (NOLVADEX®; including tamoxifen citrate), raloxifene, droroxifene, 4-hydroxytamoxifen, trioxyphene, keoxyphene, LY117018, onafristone, and furstone ( FARESTON® (Toremipine Citrate); (ii) aromatase inhibitors that inhibit the enzyme aromatase, which regulates estrogen production in the adrenal glands, such as 4 (5) -imidazole, aminoglutetide, MEGASE® (megestrol acetate) ), AROMASIN (registered trademark) (Exemestane; Pfizer), pomesteine, padrosol, ribisol (RIVISOR) (borosol), FEMARA (registered trademark) (retro Sol, Novartis), and Arimidex® (Anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrogens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; And troxacitabine (1,3-dioxolane nucleoside cytosine analog); (iv) protein kinase inhibitors; (v) lipid kinase inhibitors; (vi) inhibiting expression of genes in antisense oligonucleotides, particularly signaling pathways involved in abnormal cell proliferation, such as PKC-alpha, Ralf and H-Ras; (vii) ribozymes such as VEGF expression inhibitors (eg, ANGIOZYME®) and HER2 expression inhibitors; (viii) vaccines, such as gene therapy vaccines, such as ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, and BAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; Topoisomerase 1 inhibitors such as LURTOTECAN®; ABARELIX rmRH; (ix) angiogenesis inhibitors such as bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); And (x) pharmaceutically acceptable salts, acids and derivatives of any of the foregoing. Other angiogenesis inhibitors include MMP-2 (matrix metalloproteinase 2) inhibitors, MMP-9 (matrix metalloproteinase 9) inhibitors, COX-II (cyclooxygenase II) inhibitors, and VEGF receptor tyrosine kinases. Inhibitors. Examples of such useful matrix metalloproteinase inhibitors that can be used in combination with the compounds / compositions of the present invention are WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, EP 606,046, EP 931,788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675 , EP 945864, US Pat. No. 5,863,949, US Pat. No. 5,861,510, and EP 780,386, all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Examples of VEGF inhibitor tyrosine kinases are 4- (4-bromo-2-fluoroanilino) -6-methoxy-7- (1-methylpiperidin-4-ylmethoxy) quinazolin (ZD6474; WO 01 / 32651 Example 2), 4- (4-Fluoro-2-methylindol-5-yloxy) -6-methoxy-7- (3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)-quina Sleepin (AZD2171; Example 240 of WO 00/47212), Batalanib (PTK787; WO 98/35985) and SU11248 (Sunitinib; WO 01/60814), and PCT Publication WO 97/22596, WO 97/30035 , WO 97/32856, and WO 98/13354.

화학요법제의 다른 예는 PI3K(포스포이노시타이드-3 키나아제)의 억제제, 예를 들어 문헌[Yaguchi et al (2006) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 98(8):545-556]; 미국 특허 제7,173,029호; 미국 특허 제7,037,915호; 미국 특허 제6,608,056호; 미국 특허 제6,608,053호; 미국 특허 제6,838,457호; 미국 특허 제6,770,641호; 미국 특허 제6,653,320호; 미국 특허 제6,403,588호; WO 2006/046031; WO 2006/046035; WO 2006/046040; WO 2007/042806; WO 2007/042810; WO 2004/017950; US 2004/092561; WO 2004/007491; WO 2004/006916; WO 2003/037886; US 2003/149074; WO 2003/035618; WO 2003/034997; US 2003/158212; EP 1417976; US 2004/053946; JP 2001247477; JP 08175990; JP 08176070; 미국 특허 제6,703,414호; 및 WO 97/15658에 기록된 것을 포함하며, 이들 모두 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. 이러한 PI3K 억제제의 구체적인 예는 SF-1126(PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235(PI3K 억제제, Novartis), XL-147(PI3K 억제제, Exelixis, Inc.)를 포함한다.Other examples of chemotherapeutic agents include inhibitors of PI3K (phosphoinositide-3 kinase), for example Yaguchi et al (2006) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 98 (8): 545-556; US Patent No. 7,173,029; US Patent No. 7,037,915; US Patent No. 6,608,056; US Patent No. 6,608,053; US Patent No. 6,838,457; US Patent No. 6,770,641; US Patent No. 6,653,320; US Patent No. 6,403,588; WO 2006/046031; WO 2006/046035; WO 2006/046040; WO 2007/042806; WO 2007/042810; WO 2004/017950; US 2004/092561; WO 2004/007491; WO 2004/006916; WO 2003/037886; US 2003/149074; WO 2003/035618; WO 2003/034997; US 2003/158212; EP 1417976; US 2004/053946; JP 2001247477; JP 08175990; JP 08176070; US Patent No. 6,703,414; And those recorded in WO 97/15658, all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Specific examples of such PI3K inhibitors include SF-1126 (PI3K inhibitors, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K inhibitors, Novartis), XL-147 (PI3K inhibitors, Exelixis, Inc.).

본원에서 사용된 용어 "CD20" 또는 "CD20 항원"은 자연적으로 발현되거나 또는 CD20 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 등의 CD20의 폴리펩티드 및 임의의 변이체, 아이소폼 및 상동체 종을 지칭한다. 인간 CD20은 또한 MS4A1, 즉 막-스패닝 4-도메인, 서브패밀리 A, 구성원 1로서 알려져 있다. 당업계에서 인지되는 바와 같이, CD20에 대한 추가적인 동의어는 CD20 항원, CD20 수용체, B-림프구 표면 항원 B1, B1, Bp35, LEU-16, MGC3969, MS4A2 및 S7을 포함한다. 2가지 전사체 변이체가 인간 CD20에 대하여 기술되었다. 변이체 1은 더 긴 전사체 변이체를 나타내며, GenBank ID(GI) 68348720에 해당한다. 변이체 3은 변이체 1과 비교하여 5' UTR 부분이 없으며, GenBank ID (GI) 68348721에 해당한다. 변이체 1 및 3은 동일한 단백질을 암호화한다. 인간 CD20의 주요 형태는 GenBank Protein ID 23110989에 의해 기술되는 297개 아미노산 단백질을 포함한다.The term "CD20" or " CD20 antigen" as used herein refers to polypeptides of CD20 and any variants, isoforms and homologous species, such as naturally expressed or expressed on cells transfected with the CD20 gene. Human CD20 is also known as MS4A1, ie, membrane-spanning 4-domain, subfamily A, member 1. As is recognized in the art, additional synonyms for CD20 include CD20 antigen, CD20 receptor, B-lymphocyte surface antigens B1, B1, Bp35, LEU-16, MGC3969, MS4A2 and S7. Two transcript variants were described for human CD20. Variant 1 represents the longer transcript variant and corresponds to GenBank ID (GI) 68348720. Variant 3 lacks the 5 ′ UTR portion compared to variant 1 and corresponds to GenBank ID (GI) 68348721. Variants 1 and 3 encode the same protein. The main form of human CD20 comprises the 297 amino acid protein described by GenBank Protein ID 23110989.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 화학적으로 활성인 표면 분자의 그룹으로 이루어지며, 통상적으로 특이적인 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적인 하전 특징을 가진다.The term “epitope” refers to a protein determinant capable of specific binding to an antibody. Epitopes typically consist of a group of chemically active surface molecules such as amino acids or sugar side chains, and typically have specific three dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics.

용어 "뗏목"은 세포의 원형질막의 외부 소엽(leaflet) 영역에 위치하는 스핑고지질- 및 콜레스테롤-풍부 막 마이크로도메인을 지칭한다. 이러한 도메인 내에서 회합하는 특정 단백질의 능력은 단백질의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및/또는 이의 절편이 결합한 후, 지질뗏목으로 CD20 분자의 전위는 원형질막 내에 고밀도의 CD20 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 고밀도의 CD20 항원-항체 복합체는 CDC 동안에 보체계의 효과적인 활성화를 가능하게 할 수 있다.The term "raft" refers to sphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains located in the outer leaflet region of the plasma membrane of a cell. The ability of certain proteins to associate within these domains can affect the function of the proteins. For example, after the antibodies and / or fragments thereof of the invention bind, the translocation of the CD20 molecules into the lipid raft forms a dense CD20 antigen-antibody complex in the plasma membrane. This high density of CD20 antigen-antibody complexes can enable effective activation of the complement system during CDC.

본원에서 사용된, "항체" 또는 절편 등은 면역글로불린 분자의 적어도 일부분, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 항원 또는 항원 수용체 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분(이들은 본 발명의 CD20에 대한 항체 내로 혼입될 수 있음)을 포함하는 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 항체는 선택적으로 특이적 리간드, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 이러한 항체가 시험관 내, 동일계 내, 생체 내 및 생체 외에서 적어도 하나의 항원 활성 또는 결합, 또는 항원 수용체 활성 또는 결합을 조절, 감소, 증가, 길항, 작용(agonize), 완화, 경감, 차단, 억제, 저지 및/또는 방해하는 특이적인 리간드에 추가로 영향을 미친다. 비제한적인 예로서, 다양한 CD20 특이적 항체가 개시되어 있으며, 여기에서 특화된 부분 또는 변이체는 적어도 하나의 항원 분자, 또는 이의 특화된 부분, 변이체 또는 도메인에 결합할 수 있다. 적당한 항원 특이적 항체, 이의 특화된 부분, 또는 변이체는 또한 선택적으로 적어도 하나의 활성 또는 기능, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 RNA, DNA 또는 단백질 합성, 방출, 수용체 신호전달, 막 회합(membrane association), 결합 활성, 단백질 생성 및/또는 합성에 영향을 미칠 수 있다.As used herein, an “antibody” or fragment and the like refer to at least a portion of an immunoglobulin molecule, such as, but not limited to, at least one complementarity determining region (CDR), heavy or light chain variable of a heavy or light chain or a ligand binding portion thereof. A molecule comprising a region, a heavy or light chain constant region, a framework region, or any portion thereof, or at least one portion of an antigen or antigen receptor or binding protein, which may be incorporated into an antibody against CD20 of the invention It includes any protein or peptide that includes. Such antibodies are optionally specific ligands, such as, but not limited to, the antibody modulates, reduces, or reduces at least one antigenic activity or binding, or antigen receptor activity or binding in vitro, in situ, in vivo and ex vivo, It further affects specific ligands that increase, antagonize, agonize, alleviate, alleviate, block, inhibit, inhibit, and / or interfere. By way of non-limiting example, various CD20 specific antibodies are disclosed wherein the specialized moiety or variant may bind to at least one antigenic molecule, or specialized moiety, variant or domain thereof. Suitable antigen specific antibodies, specialized portions thereof, or variants may also optionally comprise at least one activity or function, such as, but not limited to, RNA, DNA or protein synthesis, release, receptor signaling, membrane association. , Binding activity, protein production and / or synthesis.

항체는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 동일한 중쇄(HC)로 구성된 헤테로테트라머 당단백질이다. 전형적으로, 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의하여 중쇄에 연결되어 있으며, 한편 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄마다 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 이격된 사슬 내 이황화 다리를 가진다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)를 가지고, 그 다음에 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL)을 가지고, 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란하게 되고, 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 불변 도메인과 나란하게 된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초한 2가지 분명하게 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 5가지 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 배정될 수 있으며, 이는 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 좌우된다. IgA 및 IgG는 아이소타입 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로서 추가로 하위분류된다.An antibody is a heterotetrameric glycoprotein consisting of two identical light chains (LC) and two identical heavy chains (HC). Typically, each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide linkages varies for the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has disulfide bridges in the spaced apart chain. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain (VL) at one end and a constant domain at the other end; The constant domain of the light chain is parallel with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain constant domain is parallel with the constant domain of the heavy chain. Antibody light chains of any vertebrate species can be assigned to one of two distinctly distinct types, kappa and lambda, based on the amino acid sequences of the constant domains. Immunoglobulins can be assigned to five major classes, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, which depend on the heavy chain constant domain amino acid sequence. IgA and IgG are further subclassed as isotypes IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.

항체 절편은 면역글로불린 분자의 적어도 일부분, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 항원 또는 항원 수용체 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분(이들은 본 발명의 CD20에 대한 항체 내로 혼입될 수 있음)을 포함하는 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다.Antibody fragments comprise at least a portion of an immunoglobulin molecule, such as, but not limited to, at least one complementarity determining region (CDR), heavy or light chain variable region, heavy or light chain constant region, framework of the heavy or light chain or ligand binding portion thereof Any protein or peptide comprising a region, or any portion thereof, or a molecule comprising at least one portion of an antigen or antigen receptor or binding protein, which may be incorporated into an antibody against CD20 of the invention do.

용어 "가변"은 가변 도메인의 임의의 부분이 항체 사이의 서열에서 광범위하게 상이하고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 것을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐서 균일하게 분포되지 않는다. 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 3가지 분절 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 초가변 영역에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분은 골격(FR)이라 불린다. 본래 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 CDR에 연결된 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에서는 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합함에 있어서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.The term “variable” refers to any portion of the variable domains that differs widely in sequence between antibodies and that is used in the binding and specificity of each particular antibody to a particular antigen. However, the variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments or hypervariable regions of the light and heavy chain variable domains called complementarity determining regions (CDRs). The more conserved portions of the variable domains are called the backbone (FR). The variable domains of the original heavy and light chains each comprise four FR regions that adopt predominantly beta-sheet arrangements linked to three CDRs, which form loops connecting the beta-sheet structures, and in some cases beta-sheets Forms part of the structure. CDRs in each chain are bound in close proximity by the FR region and, together with CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth). Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). The constant domains are not directly involved in binding the antibody to the antigen, but represent the participation of the antibody in various effector functions, for example antibody-dependent cytotoxicity.

용어 "항체"는 또한 절단 절편, 특화된 부분 및 이의 변이체를 포함하며,이는 단일 사슬 항체 및 이의 절편을 포함하여, 항체 또는 이의 특화된 절편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체 모방체 또는 항체의 부분을 포함하는 것을 포함한다. 기능적인 절편은 포유동물 항원, 예를 들어 CD20에 결합하는 항원-결합 절편을 단독으로 또는 다른 항원, 예를 들어 인간 상피세포 성장 인자 수용체(HER1), IgE, 혈관내피 성장 인자, HER 이량체화 억제제, Bcl-2 패밀리 단백질, MET, IL-13, IFN 알파, EGFL7, CD40, DR4 및 DR5, PI3 키나아제, 림프독소 알파, 베타 7 인테그린, 아밀로이드 베타, CRIg, TNF, 보체(C5), CBL, CD147, IL-8, gp120, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1, CD2, EGFR, TGF-베타, TNF-알파, E-셀렉틴, Fact VII, TNF, Her2/neu, F gp, CD11/18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, 베타2-인테그린, 알파4베타7, CD52, HLA DR, CD22, CD64 (FcR), TCR 알파 베타, CD2, CD3, Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpIIbIIIa, IgE, IL5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, CD30, HLA, VNR인테그린, CD25, IL-23 및 IL-12와 조합하여 포함한다. 예를 들어, 항원 또는 이의 부분에 결합할 수 있는 항체 절편은 이에 한정되는 것은 아니지만 Fab(예컨대, 파파인 절단에 의함), Fab'(예컨대, 파파인 절단 및 부분적 환원에 의함) 및 F(ab')2(예컨대, 펩신 절단에 의함), facb(예컨대, 플라스민 절단에 의함), pFc'(예컨대, 펩신 또는 플라스민 절단에 의함), Fd(예컨대, 펩신 절단, 부분적 환원 및 재응집에 의함), Fv 또는 scFv(예컨대, 분자 생물학 기법에 의함) 절편을 포함하며, 본 발명에 의해 포함된다(예컨대, 문헌[Colligan, Immunology] 참조).The term “antibody” also includes cleavage fragments, specialized moieties, and variants thereof, including antibody mimetics or antibodies that mimic the structure and / or function of an antibody or specialized fragments or parts thereof, including single chain antibodies and fragments thereof. It includes to include part of. Functional fragments may be used alone or in combination with other antigens, such as human epidermal growth factor receptor (HER1), IgE, vascular endothelial growth factor, HER dimerization inhibitors. , Bcl-2 family protein, MET, IL-13, IFN alpha, EGFL7, CD40, DR4 and DR5, PI3 kinase, lymphotoxin alpha, beta 7 integrin, amyloid beta, CRIg, TNF, complement (C5), CBL, CD147 , IL-8, gp120, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1, CD2, EGFR, TGF-beta, TNF-alpha, E-selectin, Fact VII, TNF, Her2 / neu, F gp, CD11 / 18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, Beta2-Integrin, Alpha 4beta7, CD52, HLA DR, CD22, CD64 (FcR), TCR Alpha Beta, CD2, CD3 , Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpIIbIIIa, IgE, IL5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80 , In combination with CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, CD30, HLA, VNR integrin, CD25, IL-23 and IL-12 . For example, antibody fragments capable of binding to an antigen or portion thereof include, but are not limited to, Fab (eg, by papain cleavage), Fab '(eg, by papain cleavage and partial reduction), and F (ab'). 2 (eg by pepsin cleavage), facb (eg by plasmin cleavage), pFc ′ (eg by pepsin or plasmin cleavage), Fd (eg by pepsin cleavage, partial reduction and reaggregation) , Fv or scFv (eg, by molecular biology techniques) fragments, and are encompassed by the present invention (see, eg, Colligan, Immunology).

이러한 절편은 당업계에 알려지고/알려지거나 본원에 기술된 바와 같은 효소 절단, 합성 또는 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 자연적 정지 코돈의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절두(truncated) 형태로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 암호화하는 조합 유전자는 CH1 도메인 및/또는 중쇄의 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체의 다양한 부분은 종래 기법에 의해 화학적으로 함께 연결될 수 있거나, 또는 유전 공학 기법을 사용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다.Such fragments may be produced by enzyme cleavage, synthesis or recombination techniques known in the art and / or described herein. Antibodies can also be produced in various truncated forms using antibody genes in which one or more stop codons are introduced upstream of a natural stop codon. For example, the combination gene encoding the F (ab ') 2 heavy chain portion may be designed to include a DNA sequence encoding the CH1 domain and / or the hinge region of the heavy chain. Various portions of antibodies can be linked together chemically by conventional techniques, or can be prepared as contiguous proteins using genetic engineering techniques.

"차단" 항체 또는 "길항" 항체는 CD20과 같은 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항 항체는 항원의 생물학적 활성을 상당히 또는 완전히 억제한다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%만큼 감소된다.An " blocking " antibody or an " antagonist " antibody is one that inhibits or reduces the biological activity of an antigen to which an antibody such as CD20 binds. Preferred blocking antibodies or antagonist antibodies significantly or completely inhibit the biological activity of the antigen. Preferably, the biological activity is reduced by 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, or even 100%.

본원에서 사용된 "길항 항체"는 관심의 참조 폴리펩티드의 기능적 활성의 적어도 하나를 모방하는 항체이다.As used herein, an “ antagonist antibody ” is an antibody that mimics at least one of the functional activities of a reference polypeptide of interest.

"항-유전자형(항-Id) 항체"는 항체의 항원-결합 부위와 일반적으로 회합되는 특유의 결정기를 인식하는 항체이다. Id 항체는 항-Id가 제조되는 mAb와 함께 mAb의 공급원으로서 동일한 종 및 유전자 유형(예컨대, 마우스 주(strain))의 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 유전자형 결정기에 대한 항체(항-Id 항체)를 생성함으로써 면역화 항체의 유전자형 결정기를 인식하거나 이에 반응할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제4,699,880호를 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. 항-Id 항체는 또한 "면역원"으로서 사용되어 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이는 소위 항-항-Id 항체를 생성한다. 항-항-Id는 항-Id를 유도한 원래의 mAb와 에피토프가 동일할 수 있다. 따라서, mAb의 유전자형 결정기에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론을 확인하는 것이 가능하다.An “anti-genotype (anti-Id) antibody” is an antibody that recognizes unique determinants that are typically associated with an antigen-binding site of the antibody. Id antibodies can be prepared by immunizing animals of the same species and gene type (eg, mouse strain) as a source of mAb with the mAb from which the anti-Id is produced. Immunized animals will recognize or respond to genotype determinants of immunized antibodies by generating antibodies to the genotype determinants (anti-Id antibodies). See, for example, US Pat. No. 4,699,880, which is incorporated herein by reference in its entirety. Anti-Id antibodies can also be used as “immunogens” to induce an immune response in another animal, which produces a so-called anti-anti-Id antibody. The anti-anti-Id may have the same epitope as the original mAb from which the anti-Id was derived. Thus, by using antibodies against genotype determinants of mAb, it is possible to identify other clones expressing antibodies of the same specificity.

"분리" 항체는 자연적인 환경에서 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질 또는 비단백질 용질을 포함한다. 바람직한 양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로리법(Lowry method)에 의해 측정된 바와 같이, 항체의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 배열 결정장치(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 획득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 환원 또는 비환원 조건 하에서 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로 분리 항체는 재조합 세포 내에 동일계 내 CD20 항체를 포함한다. 그러나 선택적으로, 분리 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.An "isolated" antibody is one that is isolated and / or recovered in its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that will interfere with diagnostic or therapeutic uses for antibodies, which include enzymes, hormones, and other protein or nonprotein solutes. In a preferred embodiment, the antibody comprises (1) greater than 95% by weight of the antibody, most preferably greater than 99% by weight, as measured, for example, by the Lowry method, and (2) spinning cup array determination device. sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence by use of a spinning cup sequenator, or (3) using Coomassie blue or preferably silver staining under reducing or non-reducing conditions. It will be purified homogeneously by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Isolating antibodies include in situ CD20 antibodies in recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. However, optionally, the isolated antibody will be prepared by at least one purification step.

용어 "리툭시맙" 또는 "리툭산(RITUXAN)(등록상표)"은 미국 특허 제5,736,137호(Anderson et al.)에 "C2B8"로서 기술된 상업적으로 이용가능한 키메라 항-CD20 항체로서 지칭된다. 용어 "2F2" 또는 "오파투무맙"은 WO 2004/035607(Teeling et al. (2004))에 기술된 바와 같은 완전 인간 항-CD20 항체를 지칭한다. 용어 "GA101" 또는 "아푸투주맙(afutuzumab)"은 WO 2005/0448959(Umana, 미국 특허 제5,639,641호(2005))에 기술된 바와 같은 중쇄 B-HH6 및 경쇄 B-KV1로 이루어진 인간화 및 당-조작된(glyco-engineered) 항-CD20 항체를 지칭한다. 용어 "B1"은 뮤린 항-CD20 항체 토시투모맙을 지칭하며, 이는 벡사(등록상표)의 비표지화 항체 성분에 해당한다.The term "rituximab" or "RITUXAN®" is referred to as a commercially available chimeric anti-CD20 antibody described as "C2B8" in US Pat. No. 5,736,137 (Anderson et al.). The term “2F2” or “opatumumab” refers to fully human anti-CD20 antibodies as described in WO 2004/035607 (Teeling et al. (2004)). The term "GA101" or "afutuzumab" refers to humanized and sugar-consisting of heavy chain B-HH6 and light chain B-KV1 as described in WO 2005/0448959 (Umana, US Pat. No. 5,639,641 (2005)). Refers to a glyco-engineered anti-CD20 antibody. The term “B1” refers to the murine anti-CD20 antibody tocitumomab, which corresponds to the unlabeled antibody component of Bexsa®.

본원에 사용된 용어 "III형" 항체는 CD20, 이의 에피토프 및/또는 이의 아이소폼에 결합하는 온전한(intact) 항체 또는 그의 절편을 지칭하며, 이는 II형 항체와 유사하게 가교제의 부재 하에 아포토시스를 상당히 유도하는 능력을 가지고, I형 항체와 유사하게 CD20의 지질뗏목으로의 재분배를 야기하고 보체 의존성 세포독성(CDC)을 상당히 유도할 능력을 가진다.As used herein, the term “type III” antibody refers to an intact antibody or fragment thereof that binds to CD20, its epitope and / or isoform thereof, which similarly to type II antibody significantly reduces apoptosis in the absence of crosslinking agents. It has the ability to induce, similar to type I antibodies, to cause redistribution of CD20 to lipid rafts and to significantly induce complement dependent cytotoxicity (CDC).

본원에 사용된 용어 "조작된 항체" 또는 "변형된 항체"는 상당한 인간 골격과 불변 영역(CL, CH 도메인(예컨대, CH1, CH2, CH3), 및 힌지), 및 항-CD20 항체와 같은 항체 또는 그의 절편에 결합하는 항원으로부터 유래된 CDR을 가지는 항체를 포함한다. 완전 인간 골격은 인간 생식세포계열 서열뿐만 아니라 체세포 돌연변이가 있는 서열에 해당하는 골격을 포함한다. CDR은 임의의 항체 골격의 환경 내 또는 외부에서 항원과 회합 또는 항원에 결합하는 하나 이상의 CDR로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, CD20으로 지정된 본 발명의 조작된 인간 항체의 CDR은, 마우스 항체 골격의 환경 내에서 항원에 결합하고 그 다음 조작되어 인간 골격의 환경 내에서 항원에 결합하는 CDR로부터 유래될 수 있다. 종종, 조작된 인간 항체는 인간에서 실질적으로 비면역성(immunogenic)이다.As used herein, the term “ engineered antibody ” or “modified antibody” refers to antibodies such as significant human backbone and constant regions (CL, CH domains (eg, CH1, CH2, CH3), and hinges), and anti-CD20 antibodies. Or an antibody having a CDR derived from an antigen that binds to a fragment thereof. The fully human skeleton includes the framework corresponding to human germline sequences as well as sequences with somatic mutations. The CDRs may be derived from one or more CDRs that associate with or bind to an antigen within or outside the environment of any antibody backbone. For example, the CDRs of engineered human antibodies of the invention designated as CD20 may be derived from CDRs that bind to an antigen in the environment of the mouse antibody backbone and then engineered to bind the antigen in the environment of the human backbone. Often, engineered human antibodies are substantially immunogenic in humans.

유사하게, 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류(마우스, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 햄스터 등) 및 기타 포유동물로 지정된 항체는 이러한 종, 아속, 속, 아과, 및 과 특이적 항체를 지정한다. 또한, 키메라 항체는 상기한 것의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 변화 또는 변이는 선택적으로 및 바람직하게 비변형 항체에 비하여 인간 또는 다른 종에서 면역원성을 유지 또는 감소시킨다. 조작된 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다.Similarly, antibodies designated as primates (monkeys, baboons, chimpanzees, etc.), rodents (mouse, rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, etc.), and other mammals, include these species, subgenus, genus, subfamily, and hyperspecific antibodies. Specifies. In addition, chimeric antibodies may comprise any combination of the foregoing. Such changes or variations selectively and preferably maintain or reduce immunogenicity in humans or other species as compared to unmodified antibodies. Engineered human antibodies are distinguished from chimeric or humanized antibodies.

조작된 항체는 기능적으로 재배열된 인간 또는 조작된 인간 면역글로불린(예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비인간 동물 또는 원핵세포 또는 진핵세포에 의해 생성될 수 있다. 또한, 조작된 항체가 단일 사슬 항체일 때, 이는 본래 인간 또는 비인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결하는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩티드는 인간 기원의 것을 가지는 것으로 고려된다.Engineered antibodies can be produced by non-human animals or prokaryotic or eukaryotic cells capable of expressing functionally rearranged human or engineered human immunoglobulin (eg heavy and / or light chain) genes. In addition, when the engineered antibody is a single chain antibody, it may comprise linker peptides that are not originally found in human or non-human antibodies. For example, the Fv may comprise a linker peptide connecting the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain, for example 2 to 8 glycine or other amino acid residues. Such linker peptides are considered to have those of human origin.

CD20 및 비-CD20 항원과 같은 적어도 2가지 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 가지는 단일클론의, 바람직하게는 인간, 조작된 인간, 재표면화 또는 인간화 항체인 이중특이적, 이종특이적, 헤테로컨쥬게이트 또는 유사 항체가 또한 사용될 수 있다. 본 경우에서, 결합 특이성 중 하나는 적어도 하나의 항원 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 다른 항원 단백질에 대한 것이다. 이중특이적 항체를 만드는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하며, 여기에서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 가진다(Milstein 및 Cuello, Nature 305:537 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의 배열때문에, 이러한 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 약 10가지의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이 중 단지 1가지만 옳은 이중특이적 구조를 가진다. 옳은 분자의 정제는 보통 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 또는 그 외에는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 유사한 절차가 예컨대 각각 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는, WO 93/08829, 미국 특허 제6,210,668호, 제6,193,967호, 제6,132,992호, 제6,106,833호, 제6,060,285호, 제6,037,453호, 제6,010,902호, 제5,989,530호, 제5,959,084호, 제5,959,083호, 제5,932,448호, 제5,833,985호, 제5,821,333호, 제5,807,706호, 제5,643,759호, 제5,601,819호, 제5,582,996호, 제5,496,549호, 제4,676,980호, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)], [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)], 미국 특허 공개 제20090258026호, 미국 특허 공개 제20060140946호 및 미국 특허 공개 제20070298040호에 개시되어 있다.Bispecific, heterospecific, heteroconjugates which are monoclonal, preferably human, engineered human, resurfacing or humanized antibodies with binding specificities for at least two different antigens such as CD20 and non-CD20 antigens or Similar antibodies can also be used. In this case, one of the binding specificities is for at least one antigenic protein and the other is for another antigenic protein. Methods of making bispecific antibodies are known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs, where the two heavy chains have different specificities (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)). . Because of the random arrangement of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of about 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually carried out by affinity chromatography steps or otherwise as described herein. Similar procedures are described, for example, in WO 93/08829, US Pat. Nos. 6,210,668, 6,193,967, 6,132,992, 6,106,833, 6,060,285, 6,037,453, 6,010,902, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. 5,989,530, 5,959,084, 5,959,083, 5,932,448, 5,833,985, 5,821,333, 5,807,706, 5,643,759, 5,601,819, 5,582,996,91,549,496,549,496 WO / 00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986), US Patent Publication 20090258026, US Patent Publication No. 20060140946 and US Patent Publication No. 20070298040.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(본래의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 아이소타입에 따라 다르다. 항체 효과기 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.Antibody “effector function” refers to the biological activity attributable to the Fc region (original sequence Fc region or amino acid sequence variant Fc region) of an antibody, and depends on the antibody isotype. Examples of antibody effector functions include: C1q binding and complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); Phagocytosis; Down regulation of cell surface receptors (eg, B cell receptor); And B cell activation.

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과가 기능을 실행하는 백혈구이다. 특정 양태에서, 상기 세포는 적어도 FcyRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능(들)을 실행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵세포(PBMC), 자연 살생(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 본래의 공급원, 예컨대 혈액으로부터 분리될 수 있다. A "human effector cell" is a white blood cell that expresses one or more FcRs and the effect is functional. In certain embodiments, the cell expresses at least FcyRIII and performs ADCC effector function (s). Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic cells and neutrophils. Effector cells may be isolated from original sources, such as blood.

항-term- CD20CD20 항체 Antibody

출원인의 발견, 그 중에서도 항-CD20 항체 및 이의 절편을 기초로 하여, 본 발명의 조성물 및 방법은 돌연변이 항체 등이 될 수 있다. 항-CD20 항체는 "조작된 항체" 또는 변형된 항체, 예를 들어 항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체일 수 있으며, 여기에서 항-CD20 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기는 변형된다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열에 대한 변형은 본원에 달리 지시되지 않거나 달리 알려져 있지 않다면, 항원에 대한 항체 또는 절편의 친화도 또는 결합활성을 개선시키는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 서열에 대한 변형, 및/또는 효과기 기능을 개선시키는 항체의 Fc 부분에 대한 변형을 포함한다. 변형은 임의의 공지된 항-CD20 항체 또는 본원에 기술된 바와 같이 확인된 항-CD20 항체에 대하여 이루어질 수 있다. 이러한 변형된 항체는 반드시 참조 항-CD20 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 20%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 또는 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 또는 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 인간 CD20 결합 능력을 유지할 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 47, 34, 35 및 36의 아미노산 서열에 대하여 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열에 대하여 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 경쇄를 포함한다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 또는 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다.Based on the applicant's findings, inter alia, anti-CD20 antibodies and fragments thereof, the compositions and methods of the present invention may be mutant antibodies and the like. An anti-CD20 antibody may be an “engineered antibody” or an amino acid sequence variant of a modified antibody, eg an anti-CD20 antibody, wherein one or more amino acid residues of the anti-CD20 antibody are modified. Modifications to the amino acid sequence of an anti-CD20 antibody are modifications to the sequence of polypeptides and / or polynucleotides that improve the affinity or binding activity of the antibody or fragment to the antigen, unless otherwise indicated herein or otherwise known, and And / or modifications to the Fc portion of the antibody that improve effector function. Modifications can be made to any known anti-CD20 antibody or anti-CD20 antibody identified as described herein. Such modified antibodies necessarily have less than 100% sequence identity or similarity with the reference anti-CD20 antibody. In a preferred embodiment, the modified antibody has at least 20%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, or 75% amino acid sequence identity or similarity with the amino acid sequence of the heavy or light chain variable domain of the anti-CD20 antibody. , More preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% amino acid sequence identity or similarity. In a preferred embodiment, the modified antibody has at least 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, or 75% amino acid sequence identity or similarity with the amino acid sequence of heavy chain CDR1, CDR2, or CDR3 of the anti-CD20 antibody, It will more preferably have at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% amino acid sequence identity or similarity. In a preferred embodiment, the modified antibody will maintain human CD20 binding capacity. In certain embodiments, the anti-CD20 antibodies of the invention are about 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% relative to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 47, 34, 35, and 36 Heavy chains of 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more. In certain embodiments, the anti-CD20 antibodies of the invention are about 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, 32, or 33 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more of the same light chains. In a preferred embodiment, the modified antibody has at least 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, or 75% amino acid sequence identity or similarity with the amino acid sequence of the light chain CDR1, CDR2 or CDR3 of the anti-CD20 antibody, more Preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% amino acid sequence identity or similarity Will have an amino acid sequence.

본 발명의 일부 실시형태에서, 항-CD20 항체는 "조작된 항체" 또는 변형된 항체, 예를 들어 항-CD20의 아미노산 서열 변이체일 수 있으며, 여기에서 항-CD20 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기는 변형된다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열에 대한 변형은 본원에 달리 지시되지 않거나 달리 알려져 있지 않다면, 항원에 대한 항체 또는 절편의 친화도 또는 결합활성을 개선시키는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 서열에 대한 변형, 및/또는 효과기 기능을 개선시키는 항체의 Fc 부분에 대한 변형을 포함한다. 변형은 임의의 공지된 항-CD20 항체 또는 본원에 기술된 바와 같이 확인된 항-CD20 항체에 대하여 이루어질 수 있다. 이러한 변형된 항체는 반드시 참조 항-CD20 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 1~5, 1~3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 인간 CD20 결합 능력을 유지할 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 47, 34, 35 및 36의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 비교할 때 약 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 비교할 때 약 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함한다. 바람직한 양태에서, 변형된 항체는 항-CD20 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 1~20, 1~15, 1~10, 1~5, 1~3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 보존적 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다.In some embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody may be an “engineered antibody” or a modified antibody, eg, an amino acid sequence variant of anti-CD20, wherein one or more amino acid residues of the anti-CD20 antibody are modified do. Modifications to the amino acid sequence of an anti-CD20 antibody are modifications to the sequence of polypeptides and / or polynucleotides that improve the affinity or binding activity of the antibody or fragment to the antigen, unless otherwise indicated herein or otherwise known, and And / or modifications to the Fc portion of the antibody that improve effector function. Modifications can be made to any known anti-CD20 antibody or anti-CD20 antibody identified as described herein. Such modified antibodies necessarily have less than 100% sequence identity or similarity with the reference anti-CD20 antibody. In a preferred embodiment, the modified antibody is at least 1-5, 1-3, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 as compared to the amino acid sequence of the heavy or light chain variable domains of the anti-CD20 antibody. , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 or 50 Amino acid sequences with conservative amino acid substitutions. In a preferred embodiment, the modified antibody is at least 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 20, 19, when compared to the amino acid sequence of heavy chain CDR1, CDR2 or CDR3 of the anti-CD20 antibody. Will have an amino acid sequence with 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 conservative amino acid substitutions. In a preferred embodiment, the modified antibody will maintain human CD20 binding capacity. In certain embodiments, the anti-CD20 antibodies of the invention comprise about 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, as compared to the amino acid sequences of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 47, 34, 35, and 36 , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , Heavy chains having an amino acid sequence having 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 or 50 conservative amino acid substitutions. In certain embodiments, the anti-CD20 antibody of the invention is about 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 1 when compared to the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, 32 or 33 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , Heavy chains having an amino acid sequence having 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 or 50 conservative amino acid substitutions. In a preferred embodiment, the modified antibody is at least 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 20, 19, when compared to the amino acid sequence of the light chain CDR1, CDR2 or CDR3 of the anti-CD20 antibody. Will have an amino acid sequence with 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 conservative amino acid substitutions.

항-CD20 항체 CD20-7 및 CD20-6을 생성하는 하이브리도마는 ATCC 수탁번호 PTA-10487 및 PTA-10486 하에서 침착되었다.Hybridomas producing anti-CD20 antibodies CD20-7 and CD20-6 were deposited under ATCC accession numbers PTA-10487 and PTA-10486.

"% 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정될 때, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 관계의 척도이다. 서열에 대한 동일성 또는 유사성은, 본원에서 필요하다면 최대 서열 동일성 백분율을 획득하기 위하여, 서열을 정렬하고 간격을 도입한 후에, 항-CD20 항체와 동일(즉, 동일한 잔기) 또는 유사(즉, 공통된 측쇄 특성을 기초로 한 동일한 기로부터의 아미노산 잔기, 하기 참조)한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 내부 확장, 결실, 또는 가변 도메인의 외부 항체 서열로 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되어야 한다. 일반적으로, 비교될 2개의 서열은 서열 사이의 최대 상관 관계를 제공하도록 정렬된다. 2개 서열의 정렬된 것이 검사되고 2개 서열 사이의 정확한 아미노산 또는 뉴클레오티드 관련성을 제공하는 위치의 수가 결정되며, 정렬된 것의 전체 길이로 나누고 100을 곱하여 동일성 형상 %를 제공한다. 이러한 동일성 형상 %는 비교될 서열의 전체 길이(이는 동일 또는 매우 유사한 길이이고 매우 상동성인 서열에 대하여 특히 적당함)에 대하여 결정될 수 있거나, 또는 보다 짧게 한정된 길이(이는 동일하지 않은 길이 또는 더 낮은 수준의 상동성을 가지는 서열에 대하여 보다 적당함)에 대하여 결정될 수 있다. "% Identity" is a measure of the relationship between two polynucleotides or two polypeptides, as determined by comparing sequences. Identity or similarity to a sequence is identical (ie, identical residues) or similar (ie, common side chains) to the anti-CD20 antibody after aligning the sequences and introducing gaps, in order to obtain the maximum percentage of sequence identity, if necessary herein. Amino acid residues from the same group based on properties, see below), as a percentage of amino acid residues in a candidate sequence. Any insertion into the N-terminal, C-terminal, or internal extension, deletion, or external antibody sequence of the variable domain should be interpreted as affecting sequence identity or similarity. In general, the two sequences to be compared are aligned to provide the maximum correlation between the sequences. The alignment of the two sequences is examined and the number of positions providing the correct amino acid or nucleotide association between the two sequences is determined, divided by the total length of the alignment and multiplied by 100 to give% identity shape. This percent identity shape can be determined over the total length of the sequences to be compared (which is particularly suitable for sequences that are identical or very similar in length and very homologous), or shorter defined lengths (which are not equal or lower levels). More suitable for sequences with homology to).

예를 들어, 서열은 파일을 ".aln" 확장자로 생성하는 Unix 하에서의 소프트웨어 clustalW를 이용하여 정렬될 수 있고, 그 다음 상기 파일은 .aln 파일을 여는 Bioedit program으로 불러올 수 있다(Hall, T. A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98). Bioedit 윈도우에서, (한 번에 2개씩) 개별 서열을 선택하여 이들을 정렬할 수 있다. 이 방법은 전체 서열의 비교를 허용한다.For example, the sequence can be sorted using software clustalW under Unix, which creates a file with a ".aln" extension, which can then be loaded into the Bioedit program to open the .aln file (Hall, TA 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98 / NT.Nucl.Acids.Symp.Ser. 41: 95-98). In the Bioedit window, you can align them by selecting individual sequences (two at a time). This method allows for comparison of the entire sequence.

2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 예를 들어, 프로그램은 Wisconsin Sequence Analysis Package, 버젼 9.1(Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984, 미국 위스콘신주 매디슨 소재 Genetics Computer Group으로부터 입수가능함)로 입수가능하다. 2개 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP은 2개 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성 % 및 2개 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 %를 결정하는데 사용될 수 있다. BESTFIT는 Smith-Waterman의 "국소적 상동성" 알고리즘을 사용하고(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981), 2개 서열 사이의 유사성이 가장 좋은 단일 영역을 찾는다. BESTFIT는 실이가 같지 않은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열을 비교하는데 보다 적합화되며, 상기 프로그램은 서열이 더 짧을수록 더 긴 부분을 나타내는 것으로 가정한다. 이에 비해, GAP은 Needleman-Wunsch의 알고리즘에 따라서 "최대 유사성"을 찾는 2개의 서열을 정렬한다(J. Mol. Biol., 48:443-354, 1970). GAP은 대략 동일한 길이의 서열을 비교하는데 보다 적합화되어 있으며 정렬은 전체 길이에 대하여 예측된다. 바람직하게 각각의 프로그램에서 사용된 파라미터 "Gap Weight" 및 "Length Weight"는 각각 폴리뉴클레오티드에 대하여 50 및 3, 폴리펩티드에 대하여 12 및 4이다. 바람직하게 동일성 및 유사성 %는 비교되고 있는 2개의 서열이 최적으로 정렬되어 있을 때 측정된다.Methods of comparing the identity of two or more sequences are well known in the art. Thus, for example, the program is available in the Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12: 387-395, 1984, available from the Genetics Computer Group, Madison, WI). Do. Determination of percent identity between two sequences can be made using a mathematical algorithm. For example, the programs BESTFIT and GAP can be used to determine the percent identity between two polynucleotides and the percent identity between two polypeptide sequences. BESTFIT uses Smith-Waterman's “local homology” algorithm (Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489, 1981) and finds the single region with the best similarity between the two sequences. BESTFIT is more suited to comparing two polynucleotide or two polypeptide sequences that are not identical in size, and the program assumes that shorter sequences represent longer portions. In comparison, GAP aligns two sequences looking for "maximum similarity" according to Needleman-Wunsch's algorithm (J. Mol. Biol., 48: 443-354, 1970). GAPs are more suited to comparing sequences of approximately equal length and alignments are predicted over the entire length. Preferably the parameters "Gap Weight" and "Length Weight" used in each program are 50 and 3 for polynucleotides and 12 and 4 for polypeptides, respectively. Preferably the percent identity and similarity are determined when the two sequences being compared are optimally aligned.

서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 또한 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 BLAST 패밀리의 프로그램(Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, Karlin & Altschul에서와 같이 변형됨, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, available from the National Center for Biotechnology Information(NCBI)(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 입수가능하고, NCBI의 홈페이지 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 접근가능함)이 있다. 이들 프로그램은 2개 서열의 비교를 위하여 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직하면서 비제한적인 예를 예시한다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램을 이용하여 score=100, wordlength=12로 실행되어 본 발명의 임의의 항-CD20 항체의 전부 또는 일부분을 암호화하는 핵산 분자에 대한 뉴클레오티드 서열 상동성을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램을 이용하여 score=50, wordlength=3으로 실행되어 본 발명의 단백질 분자에 대한 아미노산 서열 상동성을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 간격이 있는 정렬을 얻기 위하여, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast가 분자(Id.) 사이의 뚜렷한 관계를 검출하는 반복 검색을 실행하는데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast를 이용할 때, 각각의 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조할 수 있다. 서열의 비교를 위하여 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직하면서 비제한적인 예는 문헌[Myers 및 Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 부분인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 포함되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 간격 길이 페널티 12, 및 간격 페널티 4가 사용될 수 있다.Other programs for determining identity and / or similarity between sequences are also known in the art, for example, programs of the BLAST family (Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268). , Modified as in Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, USA , Accessible from the NCBI's homepage at www.ncbi.nlm.nih.gov. These programs illustrate preferred and non-limiting examples of mathematical algorithms used for the comparison of two sequences. Such algorithms are described in Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410, which are included in the NBLAST and XBLAST programs. BLAST nucleotide searches can be performed using the NBLAST program with score = 100, wordlength = 12 to obtain nucleotide sequence homology to nucleic acid molecules encoding all or part of any anti-CD20 antibody of the invention. BLAST protein searches can be performed with score = 50 and wordlength = 3 using the XBLAST program to obtain amino acid sequence homology to the protein molecules of the invention. To obtain spaced alignments for comparison purposes, Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402. Alternatively, PSI-Blast can be used to perform an iterative search that detects distinct relationships between molecules (Id.). When using BLAST, Gapped BLAST and PSI-Blast, default parameters of respective programs (eg, XBLAST and NBLAST) can be used. See http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Another preferred and non-limiting example of a mathematical algorithm used for the comparison of sequences is the algorithm of Myers and Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17. This algorithm is included in the ALIGN program (version 2.0) which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, a PAM120 weight residue table, interval length penalty 12, and interval penalty 4 can be used.

당업계에 알려진 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 프로그램의 다른 비제한적인 예는 FASTA(Pearson W. R. 및 Lipman D. J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988, Wisconsin Sequence Analysis Package의 부분으로서 입수가능함)이다. 바람직하게 BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스(Henikoff S. 및 Henikoff J. G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992)가 뉴클레오티드 서열이 먼저 비교 전에 아미노산 서열로 번역되는 경우를 포함하여 폴리펩티드 서열 비교에 사용된다.Other non-limiting examples of programs for determining identity and / or similarity between sequences known in the art include FASTA (Pearson WR and Lipman DJ, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448, 1988, Available as part of the Wisconsin Sequence Analysis Package). Preferably, the BLOSUM62 amino acid substitution matrix (Henikoff S. and Henikoff JG, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992) comprises a polypeptide sequence including when the nucleotide sequence is first translated into an amino acid sequence before comparison. Used for comparison.

아미노산 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 당업계에 알려진 프로그램의 또 다른 비제한적인 예는 SeqWeb Software(a web-based interface to the GCG Wisconsin Package: Gap 프로그램에 대한 웹 기반 인터페이스)이며, 이는 디폴트 알고리즘 및 프로그램의 파라미터를 blosum62, gap weight 8, length weight 2로 설정하여 이용된다.Another non-limiting example of a program known in the art for determining identity and / or similarity between amino acid sequences is SeqWeb Software (a web-based interface to the GCG Wisconsin Package). This is used by setting the parameters of the default algorithm and program to blosum62, gap weight 8 and length weight 2.

2개 서열 사이의 동일성 백분율은 간격을 허용하거나 또는 허용하지 않으면서, 상기 기술된 것과 유사한 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 전형적으로 정확하게 공통되는 것이 계수된다.The percent identity between two sequences can be measured using techniques similar to those described above, with or without allowing gaps. In calculating percent identity, typically what is commonly shared is counted.

프로그램 BESTFIT가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 %를 측정하는데 사용될 수 있으며, 의문의 서열 및 참조 서열이 최적으로 정렬되고 프로그램의 파라미터가 디폴트 값으로 설정된다.Program BESTFIT can be used to determine the percent identity of a polynucleotide or polypeptide sequence relative to a polynucleotide or polypeptide sequence of the present invention, the sequences in question and the reference sequences are optimally aligned and the parameters of the program are set to default values.

변형된 항체를 생성하기 위하여, 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)이 항체의 하나 이상의 초가변 영역에 도입된다. 대안적으로 또는 추가로, 골격 영역 잔기의 하나 이상의 변형(예컨대, 치환)이 항원에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화도를 개선시키는 경우, 이러한 변형이 항-CD20 항체에 도입될 수 있다. 변형하는 골격 영역 잔기의 예는 항원에 직접적으로 비공유적으로 결합하는 것(Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); CDR의 구조와 상호작용/이에 영향을 미치는 것(Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); 및/또는 VL VH 계면에 참여하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 이러한 골격 영역 잔기의 변형은 항원에 대한 항체의 결합 친화도의 향상을 가져온다. 예를 들어, 약 1개 내지 약 5개 골격 잔기(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개)가 본 발명의 이러한 양태에서 변형될 수 있다. 때때로, 심지어 초가변 영역 잔기의 어느 것도 변형되지 않은 경우에도, 이는 결합 친화도의 향상이 있는 항체를 생성하는데 충분할 수 있다. 그러나 보통 변형된 항체는 추가적인 초가변 영역 변형(들)을 포함할 것이다.To produce a modified antibody, one or more amino acid modifications (eg, substitutions) are introduced into one or more hypervariable regions of the antibody. Alternatively or in addition, if one or more modifications (eg, substitutions) of the framework region residues improve the binding affinity of the antibody mutant for the antigen, such modifications may be introduced into the anti-CD20 antibody. Examples of modifying skeletal region residues include, but are not directly covalently binding to the antigen (Amit et al., Science, 233: 747-753 (1986)); Interacting with / affecting the structure of CDRs (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)); And / or participate in the VL VH interface. In certain embodiments, modification of one or more such framework region residues results in an improvement in the binding affinity of the antibody for antigen. For example, about 1 to about 5 backbone residues (eg, 1, 2, 3, 4 or 5) can be modified in this aspect of the invention. Occasionally, even if none of the hypervariable region residues are modified, this may be sufficient to produce an antibody with an improvement in binding affinity. Normally, however, modified antibodies will include additional hypervariable region modification (s).

변형되는 초가변 영역 잔기는 무작위로 변화될 수 있으며, 특히 이 때 항원에 대한 항-CD20 항체의 출발 결합 친화도는 이러한 무작위로 생성된 변형된 항체가 용이하게 스크리닝될 수 있도록 한다.The hypervariable region residues to be modified can be changed randomly, in particular the starting binding affinity of the anti-CD20 antibody for the antigen to allow such randomly generated modified antibodies to be easily screened.

이러한 변형된 항체를 생성하는 하나의 유용한 절차는 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)"(Cunningham 및 Wells, Science, 244:1081-1085 (1989))이라고 불린다. 하나 이상의 초가변 영역 잔기(들)는 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)로 대체되어 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 그 다음 치환에 대한 기능적 민감도를 나타내는 이러한 초가변 영역 잔기(들)는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적이거나 또는 다른 돌연변이를 도입함으로써 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 그 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 이러한 방법으로 생성된 Ala-돌연변이체는 본원에 기술 및/또는 당업계에 알려진 바와 같이 생물학적 활성에 대하여 스크리닝된다.One useful procedure for generating such modified antibodies is called "alanine scanning mutagenesis" (Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). One or more hypervariable region residue (s) are replaced with alanine or polyalanine residue (s) to affect the antigen's interaction with amino acids. Such hypervariable region residue (s) which then exhibit functional sensitivity to substitution are improved by introducing additional or other mutations at or about the substitution site. Thus, the site for introducing amino acid sequence variation is predetermined, while the nature of the mutation itself does not need to be predetermined. Ala-mutants generated in this manner are screened for biological activity, as known in the art and / or in the art.

이러한 변형된 항체를 생성하는 다른 절차는 파지 디스플레이(phage display)를 사용하여 친화도 성숙을 포함한다(Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992), 및 Lowman et al., Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991)). 간략하게, 몇몇의 초가변 영역 부위(예컨대, 6~7개 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 돌연변이체는 융합물로서 사상파지 입자로부터 각각의 입자 내에 둘러싸여진 M13의 유전자 III 산물까지 1가 방식으로 표시된다. 그 다음 파지 디스플레이된 돌연변이체는 본원에 개시 및/또는 당업계에 알려진 바와 같이 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.Other procedures for generating such modified antibodies include affinity maturation using phage displays (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254: 889-896 (1992), and Lowman et. al., Biochemistry, 30 (45): 10832-10837 (1991)). Briefly, some hypervariable region sites (eg 6-7 sites) are mutated to produce all possible amino acid substitutions at each site. The antibody mutants thus produced are expressed in a monovalent manner from filamentous phage particles to the gene III product of M13 enclosed within each particle as a fusion. Phage displayed mutants are then screened for biological activity (eg, binding affinity) as disclosed herein and / or known in the art.

항체 서열에서의 돌연변이는 치환, 내부 결실을 포함한 결실, 융합 단백질을 생성하는 추가를 포함한 추가, 또는 아미노산 서열 내 및/또는 이에 인접한 아미노산 잔기의 보존적 치환을 포함할 수 있지만, 이는 변화가 기능적으로 동등한 항-CD20 항체 또는 절편을 생성한다는 점에서 "침묵" 변화를 초래한다. 보존적 아미노산 치환은 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 수반된 잔기의 양극성(amphipathic) 성질을 기반으로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며; 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 추가로, 글리신 및 프롤린은 사슬 배향에 영향을 미칠 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다. 또한, 원한다면, 비고전적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 항체 서열로 치환 또는 부가로서 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산은 이에 한정되는 것은 아니지만 일반적인 아미노산의 D-이성질체, α-아미노 아이소뷰티르산, 4-아미노뷰티르산, Abu, 2-아미노 뷰티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소뷰티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테산, t-뷰틸글리신, t-뷰틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 조작된 아미노산(designer amino acid), 예를 들어 β-메틸 아미노산, C α-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 일반적으로 포함한다.Mutations in an antibody sequence may include substitutions, deletions including internal deletions, additions including additions to generate fusion proteins, or conservative substitutions of amino acid residues in and / or adjacent to an amino acid sequence, although the changes are functionally It results in a "silent" change in that it produces equivalent anti-CD20 antibodies or fragments. Conservative amino acid substitutions can be made based on polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or the amphipathic nature of the residues involved. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine; Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine; Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine; Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. In addition, glycine and proline can affect chain orientation. Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for a member of another class. Also, if desired, nonclassical amino acids or chemical amino acid analogs can be introduced as substitutions or additions to the antibody sequence. Non-classical amino acids include, but are not limited to, D-isomers of common amino acids, α-amino isobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-amino butyric acid, γ-Abu, ε-Ahx, 6-amino hexanoic acid , Aib, 2-amino isobutyric acid, 3-amino propionic acid, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline, sarcosine, citrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclo Hexylalanine, β-alanine, fluoro-amino acids, designer amino acids such as β-methyl amino acids, C α-methyl amino acids, N α-methyl amino acids, and amino acid analogs generally.

다른 양태에서, 변형을 위하여 선택된 부위는 파지 디스플레이를 사용하여 친화도가 성숙된된다(상기 참조).In another embodiment, the site selected for modification is matured with affinity using phage display (see above).

당업계에 알려진 돌연변이유발에 대한 임의의 기법은, 항체 서열에서 아미노산 치환(들)의 목적을 위하여, 또는 추가적인 조작을 용이하게 하는 제한 부위를 형성/결실하기 위하여, DNA 서열에서 개별적인 뉴클레오티드를 변형하는데 사용될 수 있다. 이러한 기법은 이에 한정되는 것은 아니지만, 화학적 돌연변이유발, 시험관 내 부위-지정 돌연변이유발(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Hutchinson, C. et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)), 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발(Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463 (1985); Hill et al., Methods Enzymol., 155:558-568 (1987)), PCR-기반 중복 신장(PCR-based overlap extension)(Ho et al., Gene, 77:51-59 (1989)), PCR-기반 메가프라이머 돌연변이유발(Sarkar et al., Biotechniques, 8:404-407 (1990)) 등을 포함한다. 변형은 이중-가닥 다이데옥시 DNA 서열결정에 의해 확인될 수 있다.Any technique for mutagenesis known in the art can be used to modify individual nucleotides in a DNA sequence for the purpose of amino acid substitution (s) in the antibody sequence, or to form / delete restriction sites that facilitate further manipulation. Can be used. Such techniques include, but are not limited to, chemical mutagenesis, in vitro site-directed mutagenesis (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488 (1985); Hutchinson, C. et al., J. Chem., 253: 6551 (1978)), oligonucleotide-directed mutagenesis (Smith, Ann. Rev. Genet., 19: 423-463 (1985); Hill et al., Methods Enzymol., 155: 558 -568 (1987)), PCR-based overlap extension (Ho et al., Gene, 77: 51-59 (1989)), PCR-based megaprimer mutagenesis (Sarkar et al., Biotechniques, 8: 404-407 (1990)). Modifications can be identified by double-stranded dideoxy DNA sequencing.

본 발명의 분리 핵산은 적어도 하나의 CD20 특이적 항체 또는 그의 절편 또는 특화된 변이체의 생성에 사용될 수 있으며, 이는 세포, 조직, 기간 또는 동물(포유동물 및 인간을 포함함)에서 측정 또는 영향을 미치는데, 또는 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성 및/또는 신경학적 장애 또는 질환, 또는 다른 공지된 또는 특화된 항원 관련 병태 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 병태를 진단, 모니터, 조절, 치료, 완화, 이의 발생을 방지하는 것을 돕거나, 또는 이의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.The isolated nucleic acid of the present invention can be used to produce at least one CD20 specific antibody or fragment or specialized variant thereof, which is measured or influenced in cells, tissues, periods or animals (including mammals and humans). Diagnosing at least one condition selected from at least one of, but not limited to, immune disorders or diseases, cardiovascular disorders or diseases, infectious, malignant and / or neurological disorders or diseases, or other known or specialized antigen related conditions. , May be used to monitor, control, treat, alleviate, help prevent its occurrence, or reduce its symptoms.

인간 단백질 또는 이의 절편, 예를 들어 CD20에 특이적인 상당히 조작된 인간 항체는, 예를 들어 다른 면역원성 항원 또는 아이소폼, 예를 들어 CD20 단백질 및/또는 이의 일부분(합성 분자, 예를 들어 합성 펩티드를 포함함) 또는 항원, 예를 들어 CD56, 인간 상피세포 성장 인자 수용체(HER1), IgE, 혈관내피 성장 인자, HER 이량체화 억제제s, Bcl-2 패밀리 단백질, MET, IL-13, IFN 알파, EGFL7, CD40, DR4 및 DR5, PI3 키나아제, 림프독소 알파, 베타 7 인테그린, 아밀로이드 베타, CRIg, TNF, 보체(C5), CBL, CD147, IL-8, gp120, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1, CD2, EGFR, TGF-베타, TNF-알파, E-셀렉틴, Fact VII, TNF, Her2/neu, F gp, CD11/18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, 베타2-인테그린, 알파4베타7, CD52, HLA DR, CD22, CD64(FcR), TCR 알파 베타, CD2, CD3, Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpIIbIIIa, IgE, IL-5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD30, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, HLA, VNR인테그린, CD25, IL-23 및 IL-12의 임의의 하나 또는 이의 조합에 대하여 조작될 수 있다.Highly engineered human antibodies specific for human proteins or fragments thereof, such as CD20, are for example other immunogenic antigens or isoforms, such as CD20 proteins and / or portions thereof (synthetic molecules, eg synthetic peptides). Or antigens such as CD56, human epidermal growth factor receptor (HER1), IgE, vascular endothelial growth factor, HER dimerization inhibitors, Bcl-2 family proteins, MET, IL-13, IFN alpha, EGFL7, CD40, DR4 and DR5, PI3 kinase, lymphotoxin alpha, beta 7 integrin, amyloid beta, CRIg, TNF, complement (C5), CBL, CD147, IL-8, gp120, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF , CD40L, Id, ICAM-1, CD2, EGFR, TGF-beta, TNF-alpha, E-selectin, Fact VII, TNF, Her2 / neu, F gp, CD11 / 18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L , CD4, CD23, Beta2-Integrin, Alpha 4beta7, CD52, HLA DR, CD22, CD64 (FcR), TCR Alpha Beta, CD2, CD3, Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpIIbIIIa, IgE , IL-5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD Any of 30, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, HLA, VNR Integrin, CD25, IL-23 and IL-12 Can be manipulated for one or a combination thereof.

항체 생성Antibody Production

본 발명의 적어도 하나의 항원 특이적 항체, 예를 들어 항-CD20 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 선택적으로 세포주, 혼합 세포주, 무한증식 세포 또는 무한증식 세포의 클론 집단에 의해 생성될 수 있다. 예컨대 [Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow 및 Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]를 참조할 수 있다.At least one antigen specific antibody, such as an anti-CD20 antibody, of the invention may optionally be produced by a clonal population of cell lines, mixed cell lines, endogenous cells, or endogenous cells as is well known in the art. . See, eg, Ausubel, et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., Eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001).

하나의 접근법에서, 하이브리도마는 적당한 무한증식 세포주(예컨대, 골수종 세포주, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NS0, NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A 등, 또는 헤테로골수종, 이의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 당업계에 알려진 바와 같은 임의의 다른 적당한 세포주)(예컨대, www.atcc.org, www.lifetech.com. 등 참조)를, 항체를 생성하는 세포, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 분리 또는 클론화 비장, 말초 혈액, 림프, 편도, 또는 다른 면역 또는 B 세포 포함 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 골격 또는 CDR서열을 발현하는 임의의 다른 세포와, 내생 또는 비상동 핵산으로서, 또는 재조합 또는 내생의 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵생물, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말, 면양(ovine), 염소, 양, 영장류, 진핵동물, 유전체 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화 등 또는 이의 임의의 조합으로서 융합함으로써 생성된다. 예컨대, 문헌[Ausubel, supra, and Colligan, Immunology, supra, chapter 2]을 참조하며, 이는 전체가 본원에 참조로 포함된다.In one approach, hybridomas may be selected from suitable endogenous cell lines (eg, myeloma cell lines such as, but not limited to, Sp2 / 0, Sp2 / 0-AG14, NS0, NS1, NS2, AE-1, L.). 5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL -60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A, etc., or heteromyeloma, fusion products thereof, or any cells or fusion cells derived therefrom, any other suitable cell line as known in the art (eg, www.atcc) .org, www.lifetech.com., etc.), cells that produce antibodies, such as, but not limited to, isolated or cloned spleen, peripheral blood, lymph, tonsils, or other immune or B cell-containing cells, Or any other cell expressing heavy or light chain constant or variable or backbone or CDR sequences and endogenous or heterologous nucleic acid. Or recombinant or endogenous viruses, bacteria, birds, prokaryotes, amphibians, insects, reptiles, fish, mammals, rodents, horses, ovine, goats, sheep, primates, eukaryotic animals, genomic DNA, cDNA, resulting from fusion as rDNA, mitochondrial DNA or RNA, chloroplast DNA or RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, single, double or triple strands, hybridization, or any combination thereof. See, eg, Ausubel, supra , and Colligan, Immunology , supra , chapter 2, which is incorporated herein by reference in its entirety.

항체를 생성하는 세포는 또한 관심의 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적당한 동물의 말초 혈액, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수 있다. 임의의 다른 적당한 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체, 이의 특화된 절편 또는 변이체를 암호화하는 비상동 또는 내생 핵산을 발현하는데 사용될 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적인 배양 조건 또는 다른 적당한 공지된 방법을 사용하여 분리되고, 한계 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 공지된 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 원하는 특이성을 가지는 항체를 생성하는 세포는 적당한 분석(예컨대, ELISA, 보다 구체적으로 CD20 ELISA)에 의해 선택될 수 있다.The cells producing the antibody can also be obtained from the peripheral blood of a human or other suitable animal immunized with the antigen of interest, or preferably from the spleen or lymph node. Any other suitable host cell can also be used to express nonhomologous or endogenous nucleic acids encoding antibodies of the invention, specialized fragments or variants thereof. The fused cells (hybridoma) or recombinant cells can be isolated using selective culture conditions or other suitable known methods and cloned by limiting dilution or cell sorting, or other known methods. Cells producing antibodies with the desired specificity can be selected by appropriate assays (eg, ELISA, more specifically CD20 ELISA).

인간 항원 특이적 항체는, 본원에 기술 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이 추가적으로 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 비인간 영장류 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 항원 특이적 항체를 생성하는 세포는 이러한 동물로부터 분리될 수 있고 적당한 방법, 예를 들어 본원에 기술된 방법을 사용하여 무한증식될 수 있다.Human antigen specific antibodies are characterized by immunization of transgenic animals (eg, mice, rats, hamsters, non-human primates, etc.) capable of additionally producing a repertoire of human antibodies as known herein and / or in the art. Can be generated. Cells that produce antigen specific antibodies can be isolated from such animals and proliferated using a suitable method, such as the methods described herein.

CD20과 같은 인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 마우스는 공지된 방법(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Lonberg et al.의 미국 특허 제5,770,428호, 제5,569,825호, 제5,545,806호, 제5,625,126호, 제5,625,825호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,789,650호; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. 미국 특허 제5,545,807호, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, 문헌[Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)], [Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)], [Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994)], [Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)], [Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992)], [Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993)], [Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995)] 및 [Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)]에 의해 생성될 수 있으며, 이들은 각각 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 일반적으로, 이들 마우스는 기능적으로 재배열되거나, 또는 기능적 재배열을 겪을 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 좌위로부터의 DNA를 포함하는 적어도 하나의 이식유전자를 포함한다. 이러한 마우스에서 내생 면역글로불린 좌위는 파괴 또는 결실되어 내생 유전자에 의해 암호화되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거할 수 있다.Transgenic mice capable of producing a repertoire of human antibodies that bind to human antigens such as CD20 are known methods (e.g., but are not limited to, U.S. Pat. Nos. 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 and 5,789,650; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. US Patents 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368: 856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6 (4) 579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997)], Taylor et a l., Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90 (8) 3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13 (1): 65-93 (1995) and Fishwald et al., Nat Biotechnol 14 (7): 845-851 (1996), each of which is incorporated herein by reference in its entirety. It is. In general, these mice comprise at least one transgene comprising DNA from at least one human immunoglobulin locus which may be functionally rearranged or undergo functional rearrangement. Endogenous immunoglobulin loci in such mice may destroy or delete the animal's ability to produce antibodies encoded by endogenous genes.

유사한 단백질 또는 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 것은 통상적으로 펩티드 디스플레이 라이브러리, 파지 디스플레이 및 다른 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 펩티드 디스플레이 방법은 원하는 기능 또는 구조를 가지는 개별적인 구성원에 대한 펩티드의 대규모 집합의 스크리닝을 수반한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 당업계에 잘 알려져 있다. 표시된 펩티드 서열은 길이가 3 내지 5000개 이상의 아미노산일 수 있으며, 빈번하게는 5~100개 아미노산 길이, 종종 약 8 내지 25개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하는 직접적인 화학적 합성 방법에 더하여, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기술되었다. 한 가지 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열의 디스플레이를 수반한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특히 디스플레이된 펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 방법은 PCT 특허 공개 제91/17271, 91/18980, 91/19818, 및 93/08278호에 기술되어 있다.Screening for antibodies that specifically bind to similar proteins or fragments can typically be accomplished using peptide display libraries, phage display, and other known methods. Peptide display methods involve the screening of large sets of peptides for individual members having the desired function or structure. Antibody screening of peptide display libraries is well known in the art. The indicated peptide sequences may be from 3 to 5000 or more amino acids in length, frequently from 5 to 100 amino acids in length, often from about 8 to 25 amino acids in length. In addition to direct chemical synthesis methods for generating peptide libraries, several recombinant DNA methods have been described. One type involves the display of peptide sequences on the surface of a bacteriophage or cell. Each bacteriophage or cell in particular comprises a nucleotide sequence encoding a displayed peptide sequence. Such methods are described in PCT Patent Publications 91/17271, 91/18980, 91/19818, and 93/08278.

펩티드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 시험관 내 화학적 합성 및 재조합 방법 둘 모두의 양태를 가진다. 이러한 시스템의 예는 예를 들어 PCT 특허 공개 제92/05258, 92/14843 및 96/19256호에 기술되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,658,754 및 5,643,768호를 참조할 수 있다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(Carlsbad, Calif.), 및 Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire, UK)와 같은 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 이러한 시스템의 예는 예를 들어 Enzon에게 양도된 미국 특허 제4,704,692호; 제4,939,666호; 제4,946,778호; 제5,260,203호; 제5,455,030호; 제5,518,889호; 제5,534,621호; 제5,656,730호; 제5,763,733호; 제5,767,260호; 제5,856,456호; Dyax에게 양도된 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,571,698호; 제5,837,500호; Affymax에게 양도된 미국 특허 제5,427,908호; 제5,580,717호; Cambridge Antibody Technologies에게 양도된 미국 특허 제5,885,793호; Genentech에게 양도된 미국 특허 제5,750,373호; Xoma, et al.에게 양도된 미국 특허 제5,618,920호; 제5,595,898호; 제5,576,195호; 제5,698,435호; 제5,693,493호; 제5,698,417호; 및 상기한 Sambrook에 기술되어 있다. 본 발명의 CD20 항체는 또한 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 항원 특이적 항체를 사용하여 제조되어, 젖에 이러한 항체를 생성하는 형질전환 동물 또는 포유동물, 예를 들어 염소, 소, 말, 양, 토끼 등을 제공할 수 있다. 이러한 동물은 공지된 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 이러한 방법의 예는 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 미국 특허 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 제5,304,489호 등에 기술되어 있다. 본원에 언급된 각각의 참조문헌은 전체가 참조로 포함되어 있다.Other systems for generating libraries of peptides have aspects of both in vitro chemical synthesis and recombination methods. Examples of such systems are described, for example, in PCT Patent Publication Nos. 92/05258, 92/14843 and 96/19256. See also US Pat. Nos. 5,658,754 and 5,643,768. Peptide display libraries, vectors, and screening kits are commercially available from suppliers such as Invitrogen (Carlsbad, Calif.), And Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Examples of such systems are described, for example, in US Pat. No. 4,704,692, assigned to Enzon; No. 4,939,666; No. 4,946,778; 5,260,203; 5,260,203; 5,455,030; 5,455,030; No. 5,518,889; 5,534,621; 5,534,621; 5,656,730; 5,656,730; No. 5,763,733; 5,767,260; 5,767,260; 5,856,456; 5,856,456; US Patent No. 5,223,409 assigned to Dyax; 5,403,484; 5,403,484; 5,571,698; 5,837,500; US Patent No. 5,427,908, assigned to Affymax; 5,580,717; 5,580,717; US Patent No. 5,885,793 assigned to Cambridge Antibody Technologies; US Patent No. 5,750,373 assigned to Genentech; US Patent No. 5,618,920 assigned to Xoma, et al .; 5,595,898; 5,595,898; 5,576,195; 5,698,435; 5,693,493; 5,693,493; 5,698,417; 5,698,417; And Sambrook, supra. CD20 antibodies of the invention are also prepared using at least one antigen specific antibody that encodes a nucleic acid to produce a transgenic animal or mammal, such as goats, cattle, horses, sheep, rabbits, which produce such antibodies in the milk. Etc. can be provided. Such animals can be provided using known methods. Examples of such methods are, for example, but not limited to, US Pat. Nos. 5,827,690; 5,849,992; 5,849,992; No. 4,873,316; 5,849,992; 5,849,992; 5,994,616; 5,994,616; 5,565,362; 5,565,362; 5,304,489 and the like. Each reference mentioned herein is incorporated by reference in its entirety.

본 발명의 항-CD20 항체는 추가적으로 식물 부분 또는 이로부터 배양된 세포에서 이러한 항체, 특화된 부분 또는 변이체를 생성하는 형질전환 식물 및 배양된 식물 세포(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 담배 및 옥수수(maize))를 제공하는 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 항원 특이적 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 담배 잎은, 예컨대 유도성 프로모터를 사용하여, 대량의 재조합 단백질을 제공하는데 성공적으로 사용된다. 예컨대, 문헌[Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다. 또한, 형질전환 옥수수는, 다른 재조합 시스템에서 생성된 단백질 또는 자연적 공급원으로부터 정제된 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가진 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현하는데 사용된다. 예컨대, 문헌[Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다. 항체(항체 절편, 예를 들어 단일 사슬 항체(ScFvs)를 포함함)는, 담배 종자 및 감자 괴경을 포함하여 형질전환 식물 종자로부터 대량으로 생산된다. 예컨대, 문헌[Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 CD20 항체는 공지된 방법을 따라서, 형질전환 식물을 사용하여 생성된다. 또한 예컨대 문헌[Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (October, 1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994)], 및 여기에서 인용된 참조문헌을 참조할 수 있다.Anti-CD20 antibodies of the invention additionally include transgenic plants and cultured plant cells (eg, but not limited to tobacco and maize) that produce such antibodies, specialized portions or variants in plant parts or cells cultured therefrom. It can be prepared using at least one antigen specific antibody that encodes a nucleic acid that provides)). As a non-limiting example, transgenic tobacco leaves expressing recombinant proteins have been successfully used to provide large amounts of recombinant protein, such as using inducible promoters. See, eg, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) and the references cited therein. Transgenic maize is also used to express mammalian proteins with biological activity equivalent to proteins produced in other recombinant systems or proteins purified from natural sources at commercial production levels. See, eg, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) and the references cited therein. Antibodies (including antibody fragments, eg, single chain antibodies (ScFvs)) are produced in large quantities from transgenic plant seeds, including tobacco seeds and potato tubers. See, eg, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) and the references cited therein. Thus, the CD20 antibodies of the invention are produced using transgenic plants, according to known methods. See also, eg, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (October, 1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 (1994), and references cited therein.

항체 조작, 인간화 및 Antibody manipulation, humanization and 재표면화Resurfacing

비인간 또는 인간 항체를 조작, 인간화 또는 재표면화하는 방법이 또한 사용될 수 있으며 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 인간화, 재표면화 또는 유사하게 조작된 항체는 비인간, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 또는 다른 포유동물인 공급원 유래의 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "이입(import)" 잔기로서 일컬어지며, 이는 전형적으로 공지된 인간 서열의 "이입" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 취해진다.Methods of manipulating, humanizing or resurfacing non-human or human antibodies can also be used and are well known in the art. Humanized, resurfaced or similarly engineered antibodies may have one or more amino acid residues from a source that is non-human, such as, but not limited to, mouse, rat, rabbit, non-human primate or other mammal. Such non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from "import" variable, constant or other domains of known human sequences.

공지된 인간 Ig 서열은 예컨대, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.Known human Ig sequences are described, for example, in www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

이러한 이입된 서열은 당업계에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화도, 온율(on-rate), 오프율(off-rate), 결합활성, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적당한 특성을 감소, 향상 또는 변형하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 CD20 결합에 영향을 미치는 것에 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 수반된다. 따라서, 비인간 또는 인간 CDR 서열의 부분 또는 전부는 유지되는 한편, 가변 및 불변 영역의 비인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.Such imported sequences reduce immunogenicity as known in the art, or bind, affinity, on-rate, off-rate, binding activity, specificity, half-life or any other It can be used to reduce, enhance or modify suitable properties. In general, CDR residues are directly and most substantially involved in influencing CD20 binding. Thus, some or all of the non-human or human CDR sequences are retained while the non-human sequences of the variable and constant regions can be replaced with human or other amino acids.

항체는 또한 선택적으로 항원 CD20 및 다른 유리한 생물학적 특성에 대하여 높은 친화도를 유지하는 인간화, 재표면화, 조작 또는 조작된 인간 항체일 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 인간화(또는 인간) 또는 조작된 항-CD20 항체 및 재표면화 항체는 선택적으로, 부모, 조작 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념상의 인간화 및 조작된 생성물의 분석 공정에 의해 제조될 수 있다. 3차원의 면역글로불린 모델은 상업적으로 입수가능하며 이는 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 표현하는 컴퓨터 프로그램이 입수가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 CD20과 같은 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방법으로, 골격(FR) 잔기는 콘센서스로부터 선택되고 조합되며 서열을 이입할 수 있어 원하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도를 획득할 수 있다.The antibody may also be a humanized, resurfaced, engineered or engineered human antibody that optionally maintains high affinity for antigen CD20 and other advantageous biological properties. To achieve this goal, humanized (or human) or engineered anti-CD20 antibodies and resurfacing antibodies are optionally humanized and engineered in parental sequences and various conceptually using three-dimensional models of parental, engineered and humanized sequences. It can be prepared by the analytical process of the product. Three-dimensional immunoglobulin models are commercially available and are familiar to those skilled in the art. Computer programs are available that describe and represent possible three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Examination of such displays allows analysis of the possible role of residues in the function of candidate immunoglobulin sequences, ie analysis of residues that affect the ability of candidate immunoglobulins to bind antigens such as CD20. In this way, backbone (FR) residues can be selected, combined, and sequenced from consensus to obtain desired antibody properties, eg, increased affinity for the target antigen (s).

본 발명의 항체의 인간화, 재표면화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 문헌[Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5,639,641호; 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 제4,816,567호; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; 및 7,342,110]에 기술된 것을 사용하여 실행될 수 있으며, 여기에서 인용된 참조문헌을 포함하여 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.Humanization, resurfacing or manipulation of the antibodies of the invention is by any known method, such as, but not limited to, Winter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332 : 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), US Pat. No. 5,639,641; 5,723,323; 5,976,862; 5,976,862; 5,824,514; 5,824,514; 5,817,483; 5,817,483; 5,814,476; 5,814,476; 5,763,192; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,766,886; No. 5,714,352; 6,204,023; 6,204,023; No. 6,180,370; 5,693, 762; 5,530,101; 5,585,089; No. 5,225,539; 4,816,567; 4,816,567; PCT /: US98 / 16280; US96 / 18978; US91 / 09630; US91 / 05939; US94 / 01234; GB89 / 01334; GB91 / 01134; GB92 / 01755; WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; And 7,342,110, each of which is incorporated herein by reference in its entirety, including the references cited herein.

FcFc 영역 domain

특징 양태에서, 항체는 변형된(예컨대, 돌연변이된) Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, Fc 영역은 항체의 효과기 기능을 감소 또는 향상시키도록 변형된다. 일부 양태에서, Fc 영역은 IgM, IgA, IgG, IgE, 또는 다른 아이소타입으로부터 선택된 아이소타입이다.In a feature aspect, the antibody comprises a modified (eg, mutated) Fc region. For example, in some embodiments, the Fc region is modified to reduce or enhance the effector function of the antibody. In some embodiments, the Fc region is an isotype selected from IgM, IgA, IgG, IgE, or other isotypes.

대안적으로 또는 추가적으로, 아미노산 변형을 C1q 결합 및/또는 항원 결합 분자의 Fc 영역의 보체 의존성 세포독성(CDC) 기능을 변형하는 하나 이상의 추가 아미노산 변형과 조합하는 것이 유용할 수 있다. 특정 관심의 출발 폴리펩티드는 C1q에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 기존 C1q 결합 활성이 있고, 선택적으로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 가지는 폴리펩티드는 변형될 수 있어 이들 활성의 하나 또는 둘 다 향상된다. C1q를 변형하고/변형하거나 이의 보체 의존성 세포독성 기능을 변형하는 아미노산 변형은, 예를 들어 WO0042072에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.Alternatively or additionally, it may be useful to combine amino acid modifications with one or more additional amino acid modifications that modify the complement dependent cytotoxic (CDC) function of the Fc region of the Clq binding and / or antigen binding molecule. The starting polypeptide of particular interest may be one that binds to C1q and exhibits complement dependent cytotoxicity. Polypeptides that have existing C1q binding activity and optionally further have the ability to mediate CDC can be modified to enhance one or both of these activities. Amino acid modifications that modify C1q and / or modify its complement dependent cytotoxic function are described, for example, in WO0042072, which is incorporated herein by reference in its entirety.

예컨대 C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형시키고 이에 의해 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 변경된 효과기 기능을 가지는 본 발명의 항체의 Fc 영역을 설계할 수 있다. "효과기 기능"은 (예컨대, 개체에서) 생물학적 활성을 활성화 또는 감소시키는 것을 담당한다. 효과기 기능의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체(BCR))의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 Fc 영역이 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 할 수 있고, 다양한 분석(예컨대, Fc 결합 분석, ADCC 분석, CDC 분석 등)을 사용하여 평가될 수 있다.For example, by modifying C1q binding and / or FcγR binding and thereby altering CDC activity and / or ADCC activity, one can design the Fc region of an antibody of the invention having altered effector function. An “effector function” is responsible for activating or reducing biological activity (eg, in an individual). Examples of effector functions include, but are not limited to, C1q binding; Complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); Phagocytic action; Down regulation of cell surface receptors (eg, B cell receptor (BCR)), and the like. Such effector function may require the Fc region to be combined with a binding domain (eg, antibody variable domain) and may be assessed using various assays (eg, Fc binding assay, ADCC assay, CDC assay, etc.).

예를 들어, 개선된 C1q 결합 및 개선된 FcγRIII 결합을 가진(예컨대, 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성을 모두 가지는) 조작된 항-CD20 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 대안적으로, 효과기 기능이 감소되거나 또는 제거되는 것이 바람직하다면, 감소된 CDC 활성 및/또는 감소된 ADCC 활성을 가지는 변이체 Fc 영역은 조작될 수 있다. 다른 양태에서, (예컨대, 개선된 ADCC 활성을 가지지만, 감소된 CDC 활성을 가지는 Fc 영역 변이체를 생성하기 위하여, 또한 이와 반대이도록) 이러한 활성 중 단지 하나만 증가될 수 있고, 선택적으로 또한 다른 활성은 감소될 수 있다. 예시적인 Fc 돌연변이체는 삼중 잔기 변화, 즉 S239D, A330L 및 I332D(EU 번호 체계)이며, 여기에서 ADCC는 향상되고 CDC 활성은 감소된다. 이러한 돌연변이체를 설계하는 비제한적인 방법은 예를 들어 문헌[Lazar et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(11): 4005-4010); 및 Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5):1239-49)]에서 찾아볼 수 있다. 또한 WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO2006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635를 참조할 수 있다.For example, variant Fc regions of engineered anti-CD20 antibodies with improved C1q binding and improved FcγRIII binding (eg, with both improved ADCC activity and improved CDC activity) can be generated. Alternatively, if the effector function is desired to be reduced or eliminated, variant Fc regions with reduced CDC activity and / or reduced ADCC activity can be engineered. In another embodiment, only one of these activities can be increased (eg, to produce Fc region variants with improved ADCC activity but also with reduced CDC activity, and vice versa), and optionally also other activities Can be reduced. Exemplary Fc mutants are triple residue changes, namely S239D, A330L and I332D (EU numbering system), where ADCC is enhanced and CDC activity is reduced. Non-limiting methods of designing such mutants are described, for example, in Laza et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (11): 4005-4010); And Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336 (5): 1239-49). See also WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO2006 / 047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635.

Fc 돌연변이는 또한 조작된 항체로 도입되어 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 항체의 상호작용을 변경하며 이의 약동학 특성을 개선할 수 있다. FcRn에 대한 결합이 개선된 인간 Fc 변이체의 집합이 기술되었으며, 예를 들어 문헌[Shields et al., 2001]을 포함한다. FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1에 대한 결합 부위의 고해상도 맵핑(high resolution mapping) 및 FcγR에 대한 결합이 개선된 IgG1 변이체의 설계가 문헌[J. Biol. Chem. 276:6591-6604]에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.Fc mutations can also be introduced into engineered antibodies to alter the interaction of the antibody with the neonatal Fc receptor (FcRn) and improve its pharmacokinetic properties. A set of human Fc variants with improved binding to FcRn has been described and includes, for example, Shields et al., 2001. High resolution mapping of binding sites for human IgG1 to FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcRn and the design of IgG1 variants with improved binding to FcγR are described in J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, which is incorporated herein by reference in its entirety.

아미노산 치환의 다른 유형은 항체의 Fc 영역의 글리코실화 패턴을 변경하는 역할을 한다. Fc 영역의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 일반적으로 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어트의 부착을 지칭한다. 아스파라긴 측쇄 펩티드 서열에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착에 대한 인식 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이며, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이러한 펩티드 서열의 어느 것의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다. O-연결 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있지만, 일반적으로 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다.Another type of amino acid substitution serves to alter the glycosylation pattern of the Fc region of an antibody. Glycosylation of the Fc region is typically either N-linked or O-linked. N-linking generally refers to the attachment of a carbohydrate moiety to the side chain of an asparagine residue. Recognition sequences for enzymatic attachment of carbohydrate moieties to asparagine side chain peptide sequences are asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline. Thus, the presence of any of these peptide sequences in a polypeptide forms a potential glycosylation site. For O-linked glycosylation, 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine may also be used, but in general hydroxyamino acids, most commonly serine or threonine, sugar N-acetylgalactosamine, galactose or xylose Refers to the attachment of either.

항체 또는 그의 절편의 글리코실화 패턴은, 예를 들어 폴리펩티드에서 발견된 하나 이상의 글리코실화 부위(들)을 결실, 및/또는 상기 폴리펩티드에 존재하지 않은 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 첨가함으로써 변경될 수 있다. 항체 또는 항체 절견의 Fc 영역에서 글리코실화 부위의 제거는 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 수행될 수 있으며 이는 (N-연결 글리코실화 부위에 있어서) 상기 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 제거한다. 예시적인 글리코실화 변이체는 중쇄의 잔기 N297 내지 A297(EU 번호 체계)의 아미노산 치환을 가진다. O-연결 글리코실화 부위의 제거는 또한 세린 또는 트레오닌 이외의 임의의 아미노산으로 하나 이상의 글리코실화된 세린 또는 트레오닌 잔기의 치환에 의해 이루어질 수 있다.The glycosylation pattern of an antibody or fragment thereof can be altered by, for example, deleting one or more glycosylation site (s) found in a polypeptide and / or adding one or more glycosylation site (s) not present in the polypeptide. Can be. Removal of the glycosylation site in the Fc region of an antibody or antibody excavation can be conveniently performed by altering the amino acid sequence, which removes one or more of the tripeptide sequences described above (in the N-linked glycosylation site). Exemplary glycosylation variants have amino acid substitutions of residues N297 to A297 (EU number system) of the heavy chain. Removal of O-linked glycosylation sites can also be accomplished by substitution of one or more glycosylated serine or threonine residues with any amino acid other than serine or threonine.

항체가 Fc 영역을 포함할 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스는 예를 들어 미국 특허출원 US 2003/0157108(Presta, L.) 및 US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)에 기술되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 2등분하는 항체는 예를 들어 WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.) 및 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al)에서 참조되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 가지는 항체는 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al)에 기록되어 있다. 또한, Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물이 있는 항체에 관하여 WO 1998/58964 및 WO 1999/22764(Raju, S.)를 참조할 수 있다. 또한, 변형된 글리코실화가 있는 항체-결합 분자에 대하여 예를 들어 US 2005/0123546(Umana et al.)을 참조할 수 있다.If the antibody comprises an Fc region, the carbohydrate attached thereto may be altered. For example, fucose attached to the Fc region of an antibody is described, for example, in US patent applications US 2003/0157108 (Presta, L.) and US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Antibodies that bisected N-acetylglucosamine (GlcNAc) in carbohydrates attached to the Fc region of an antibody are described, for example, in WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.) And US Pat. No. 6,602,684 (Umana et al). It is. Antibodies having at least one galactose residue in an oligosaccharide attached to the Fc region of the antibody are for example reported in WO 1997/30087 (Patel et al). See also WO 1998/58964 and WO 1999/22764 (Raju, S.) regarding antibodies with altered carbohydrates attached to the Fc region. See also US 2005/0123546 (Umana et al.) For antibody-binding molecules with modified glycosylation.

특정 양태에서, 글리코실화 변이체는 Fc 영역을 포함하며, 여기에서 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 푸코스가 없다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가진다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; 문헌[Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생성하는 세포주의 비제한적인 예는 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 US 2003/0157108 AI(Presta, L); 및 WO 2004/056312 AI(Adams et al.), 특히 실시예 11), 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004)), 및 푸코실화 경로 억제제, 예를 들어 세포 배양 배지에서 카스타노스퍼민의 사용을 통한 것(미국 특허출원 제2009/0041765호)을 포함한다.In certain embodiments, the glycosylated variants comprise an Fc region, wherein the carbohydrate structure attached to the Fc region is free of fucose. Such variants have improved ADCC function. Examples of publications related to “defucosylated” or “fucose-deficient” antibodies include: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005 / 053742; Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336: 1239-1249 (2004); Yamane Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004). Non-limiting examples of cell lines producing defucosylated antibodies include Lec13 CHO cells deficient in protein fucosylation (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); US patent application US 2003/0157108 AI (Presta, L); and WO 2004/056312 AI (Adams et al.), In particular Example 11), knockout cell lines, for example alpha-1,6-fucosyltransferase gene, FUT8, knockout CHO cells (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004)), and through the use of fucosylation pathway inhibitors, such as castanospermine in cell culture media (US Patent Application 2009/0041765). H).

특정 양태에서, 본 발명의 항체는 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III(GnT III)를 발현하는 세포에서 발현되어, GnT III 은 조작된 인간 항체 특이적 항체에 GlcNAc에 첨가된다. 이러한 방식으로 항체를 생성하는 방법은 WO/9954342, WO/03011878, 특허 공개 20030003097A1, 및 문헌[Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999]에서 제공된다.In certain embodiments, the antibodies of the invention are expressed in cells expressing beta (1,4) -N-acetylglucosaminyltransferase III (GnT III) such that GnT III is GlcNAc to engineered human antibody specific antibodies. Is added to. Methods for generating antibodies in this manner are provided in WO / 9954342, WO / 03011878, Patent Publication 20030003097A1, and Umana et al., Nature Biotechnology, 17: 176-180, February 1999.

항체 친화도Antibody affinity

본 발명의 항체는 광범위한 친화도(KD)로, 인간 CD20에 결합한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 적어도 하나의 mAb는 선택적으로 높은 친화도로 인간 항원에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 조작된 인간 또는 인간화 또는 재표면화 mAb는, 당업자에 의해 실행되는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 또는 KinExA(등록상표) 방법에 의해 측정된 바와 같이, 약 10-7M과 동등하거나 또는 미만, 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 0.1~9.9(또는 이것 내의 임의의 범위 또는 값)×10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 이것 내의 임의의 범위 또는 값인 KD로 인간 항원에 결합할 수 있다. 항-CD20 항체는 약 10-9M 이하, 보다 구체적으로는 약 10-9 내지 10-10M의 Kd로 결합한다.Antibodies of the invention bind to human CD20 with broad affinity (K D ). In a preferred embodiment, at least one mAb of the invention can optionally bind to a human antigen with high affinity. For example, human or engineered human or humanized or resurfacing mAbs are measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), surface plasmon resonance (SPR) or KinExA® methods performed by those skilled in the art. , Equivalent to or less than about 10 −7 M, including but not limited to, for example, 0.1 to 9.9 (or any range or value therein) × 10 −7 , 10 −8 , 10 −9 , 10 −10 , Can bind to a human antigen with K D in the range 10 −11 , 10 −12 , 10 −13 , 10 −14 , 10 −15, or any range or value therein. The anti-CD20 antibody binds with a Kd of about 10 −9 M or less, more specifically about 10 −9 to 10 −10 M.

항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합활성은 당업계에 잘 알려진 임의의 적당한 방법, 예컨대 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역측정법(RIA), 또는 동역학(예컨대, BIACORE(상표명) 분석법)을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 직접 결합 분석법뿐만 아니라 경쟁적 결합 분석 포맷이 용이하게 이용될 수 있다. 예를 들어 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 여기에 기술된 방법을 참조한다. 상이한 조건(예컨대, 염 농도, pH, 온도) 하에서 측정된다면 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 다를 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터(예컨대, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 당업계에 공지된 바와 같이 바람직하게 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예를 들어 본원에 기술된 완충액으로 이루어진다.Affinity or binding activity of an antibody to an antigen can be determined by any suitable method known in the art, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or radioimmunoassay (RIA), or kinetics (eg, BIACORE ™ assay). Can be measured experimentally. Competitive binding assay formats as well as direct binding assays can be readily utilized. See, eg, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, WE, Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, WH Freeman and Company: New York, NY (1992); And the method described herein. The measured affinity of a particular antibody-antigen interaction can be different if measured under different conditions (eg salt concentration, pH, temperature). Thus, the determination of affinity and other antigen-binding parameters (eg, KD or K d , K on , K off ) is preferably standardized solutions of antibodies and antigens, and standardized buffers, eg, as known in the art. For example, with the buffer described herein.

하나의 양태에서, 결합 분석법은 CD20 항원을 이용한 효소결합 면역흡착 분석법(예컨대, ELISA)을 사용하여 실행될 수 있다. 예를 들어, CD20-발현 B 세포주 또는 재조합 단백질로부터 제조된 미정제(crude) 세포 융해물은 본원에 기술된 바와 같이 CD20 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 CD20 항원 제조물은 50mM 탄산나트륨(pH 9.6)으로 100㎕/웰에서 대략 18 내지 24시간 도안 4℃에서 Immulon 2HB 플레이트 상으로 코팅된다. 플레이트는 세척 완충액(TBS 중 0.1% Tween-20, pH 7.4)으로 세척한다. 그 이후에, 플레이트는 TBS(pH 7.4) 중 1% 카세인으로 1시간 동안 실온에서 차단한다. 항체의 단계 희석물이 플레이트에 첨가되고 대략 3시간 동안 실온에서 항온처리한 다음, 앞서와 같이 세척한다. 검출을 위하여, HRP-컨쥬게이트된 염소-항-인간 또는 염소-항-뮤린 항체는 2차 항체로서 첨가되고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 플레이트는 앞서와 같이 세척되고 TMB1 기질(BioFX)의 100㎕/웰이 첨가되어 진행된다. 반응은 대략 20분 후에 450nm 정지 시약(BioFX) 100㎕/웰로 퀀칭한다. 450nm에서 흡광도를 판독하고 각각의 항체에 대한 항체 농도에 대하여 플롯팅한다. S자형의 투여량-반응 곡선은 결합 곡선에 대하여 일치시키고, EC50 값은 디폴트 파라미터를 이용하여 GraphPad Prism v4(GraphPad software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)와 같은 프로그램을 사용하여 계산된다. EC50 값은 각각의 항체에 대한 겉보기 해리 상수 "Kd" 또는 "KD"에 대한 척도로서 사용될 수 있다.In one embodiment, the binding assay can be performed using an enzyme linked immunosorbent assay (eg, ELISA) using a CD20 antigen. For example, crude cell fusions made from CD20-expressing B cell lines or recombinant proteins can be used as a source of CD20 antigens as described herein. This CD20 antigen preparation is coated onto Immulon 2HB plate at 50 [deg.] C. at 18 [deg.] C. at 100 [mu] l / well with 50 mM sodium carbonate (pH 9.6). Plates are washed with wash buffer (0.1% Tween-20 in TBS, pH 7.4). Afterwards, the plate is blocked with 1% casein in TBS pH 7.4 for 1 hour at room temperature. A step dilution of the antibody is added to the plate and incubated at room temperature for approximately 3 hours and then washed as before. For detection, HRP-conjugated goat-anti-human or goat-anti-murine antibody is added as secondary antibody and incubated for 1 hour at room temperature. Plates are washed as before and proceed with 100 μl / well of TMB1 substrate (BioFX) added. The reaction is quenched with 100 μl / well of 450 nm stop reagent (BioFX) after approximately 20 minutes. Absorbance at 450 nm is read and plotted against antibody concentration for each antibody. The sigmoidal dose-response curves were matched against the binding curves and EC50 values were calculated using a program such as GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) using default parameters. EC50 values can be used as a measure for the apparent dissociation constant "K d " or "KD" for each antibody.

펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 아미노산 서열 동일성 백분율(%)은 또한, 필요하다면 최대 서열 동일성 백분율을 획득하기 위하여 서열을 정렬하고 간격을 도입하며, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후에, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 측정하는 목적을 위한 정렬은 당업계 기술에 속하는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용함에 의한 것과 같이 본원에 논의된 것으로 획득될 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기 위하여, 비교될 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 적절할 파라미터를 결정할 수 있다. ALIGN-2가 이용가능하여 아미노산 서열 비교를 위하여 이용될 수 있는 경우의 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대하여, 이와 함께 또는 이에 반하여 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대하여, 이와 함께 또는 이에 반하여 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)가 다음과 같이 계산된다: 100 ×분수 X/Y(여기에서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬이라는 점에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 공통되는 것으로서 평가된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않을 경우에, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동등하지 않을 것이다.The percent amino acid sequence identity relative to the peptide or polypeptide sequence also aligns the sequences and introduces gaps if necessary to obtain the maximum sequence identity, and does not consider any conservative substitution as part of the sequence identity. , As a percentage of an amino acid residue in a candidate sequence that is identical to an amino acid residue in a specific peptide or polypeptide sequence. Alignment for the purpose of determining the percentage of amino acid sequence identity is as described in the art, such as by using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. It may be obtained as discussed herein. Those skilled in the art can determine appropriate parameters, including any algorithms needed to obtain maximal alignment over the full length of the sequences being compared, to determine alignment. In situations where ALIGN-2 is available and can be used for amino acid sequence comparison, for a given amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A, in combination with or against it, which is alternatively a given amino acid sequence For B, it can be expressed as a given amino acid sequence A with or including a specific% amino acid sequence identity, or in contrast thereto, as follows: 100 x fractional X / Y, where X is A And the number of amino acid residues evaluated as equal in common by the sequence alignment program ALIGN-2 in that it is the program alignment of B, and Y is the total number of amino acid residues in B. The length of amino acid sequence A is the length of amino acid sequence B If not equal to%, the amino acid sequence identity of A to B is identical to the amino acid sequence of B to A It will not be equal to% last name.

바람직하게는, 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 100% 동일하다. 특별히 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 예를 들어 ALIGN-2 또는 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 얻어진다.Preferably, the two or more amino acid sequences are at least 50%, 60%, 70%, 80% or 90% identical. More preferably, the two or more amino acid sequences are at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or even 100% identical. Unless specifically stated otherwise, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained as described in the preceding paragraphs using, for example, the ALIGN-2 or BLAST computer program.

항체 용도Antibody Uses

일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항원 특이적 항체의 일부 형태는 선택적으로 항원에 대하여 높은 친화도 결합을 특징으로 할 수 있으며, 선택적으로 그리고 바람직하게는, 수용체에 대한 낮은 독성 및 반대 결과를 가지는 것으로서 특징으로 할 수 있다. 특히, 가변 영역, 불변 영역 및 골격과 같은 개별적인 성분이 개별적으로 및/또는 집합적으로, 선택적으로 및 바람직하게 낮은 면역원성을 가지는 경우에 본 발명의 항체, 특화된 절편 또는 변이체는 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 선택적으로 증상의 측정가능한 완화 및 낮은/낮거나 허용가능한 독성이 있는 장기간 동안 환자를 치료하는 능력을 특징으로 한다. 낮은 또는 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도, 뿐만 아니라 다른 적당한 특성이 획득되는 치료적 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은, 치료되는 환자의 25% 미만으로, 바람직하게는 치료 기간 동안 권장 기간 동안 권장 투여량으로 치료된 환자의 10% 미만으로 일어나는, 항체로 치료된 환자에서 항원에 대하여 항체의 적정가능한 수준의 최소한의 발생으로서 본원에서 정의된다In general, some forms of antigen specific antibodies useful in the methods and compositions of the present invention may optionally be characterized by high affinity binding to the antigen, optionally and preferably with low toxicity and adverse consequences for the receptor. It can be characterized as having. In particular, the antibodies, specialized fragments or variants of the invention are useful in the present invention where individual components such as variable regions, constant regions and backbones, individually and / or collectively, have selective and preferably low immunogenicity. . Antibodies that can be used in the present invention are optionally characterized by the measurable alleviation of symptoms and the ability to treat patients for long periods of low / low or acceptable toxicity. Low or acceptable immunogenicity and / or high affinity, as well as other suitable properties, may contribute to the therapeutic outcome obtained. "Low immunogenicity" means less than 25% of patients being treated, preferably less than 10% of patients treated at the recommended dosage for the recommended period of time during the treatment period. Defined herein as the minimum occurrence of an appropriate level

본 발명의 분리 핵산은 적어도 하나의 CD20 특이적 항체, 이의 절편 또는 이의 특화된 변이체의 생성에 사용될 수 있으며, 이는 세포, 조직, 기간 또는 동물(포유동물 및 인간을 포함함)에서 측정 또는 영향을 미치는데, 또는 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성 및/또는 신경학적 장애 또는 질환, 또는 다른 공지된 또는 특화된 항원 관련 병태 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 병태를 진단, 모니터, 조절, 치료, 완화, 이의 발생을 방지하는 것을 돕거나, 또는 이의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.The isolated nucleic acids of the invention can be used for the production of at least one CD20 specific antibody, fragment thereof or specialized variant thereof, which measures or affects cells, tissues, periods or animals (including mammals and humans). Or at least one condition selected from at least one of, but not limited to, an immune disorder or disease, a cardiovascular disorder or disease, an infectious, malignant and / or neurological disorder or disease, or other known or specialized antigen related condition. It can be used to help diagnose, monitor, control, treat, relieve, prevent the occurrence of, or reduce its symptoms.

이러한 방법은 적어도 하나의 항원 특이적 항체, 예를 들어 항-CD20 항체 또는 절편을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을, 증상, 효과 또는 메커니즘에서 이러한 조절, 치료, 완화, 방지 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 유효량은 단일(예컨대, 볼루스), 다중 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 500㎎/㎏의 양을 포함할 수 있거나, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여 당 약 0.01~5000㎍/㎖ 혈청 농도의 혈청 농도를 획득하기 위하여, 또는 공지된 방법을 사용하여 행해지고 측정된 바와 같이, 본원에 기술되거나 관련 업계에서 알려진 바와 같이 여기에서 임의의 효과적인 범위 또는 값을 획득하도록 포함할 수 있다.Such methods require an effective amount of a composition or pharmaceutical composition comprising at least one antigen specific antibody, eg, an anti-CD20 antibody or fragment, in such symptoms, effects or mechanisms that such control, treatment, alleviation, prevention or reduction is necessary. Administration to cells, tissues, organs, animals, or patients. An effective amount can comprise an amount of about 0.001 to 500 mg / kg per single (eg bolus), multiple or continuous administration, or a serum concentration of about 0.01-5000 μg / ml serum per single, multiple or continuous administration It can be included to obtain concentrations, or as obtained and measured using known methods, to obtain any effective range or value herein as described herein or known in the art.

예시적인 항체Exemplary Antibodies

본 발명의 바람직한 항원 특이적 CD20 항체는 나타낸 서열을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 항원 특이적 항체는 표 1에 나타낸 경쇄 CDR 서열(즉, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3) 중 하나 및/또는 표 1에 나타낸 중쇄 CDR 서열(즉, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 중 하나를 포함한다. 보다 구체적으로, 항-CD20-6 항체는 서열번호25의 CDRL1, 서열번호 26의 CDRL2, 서열번호 27의 CDRL3, 서열번호 28의 CDRH1, 서열번호 29의 CDRH2, 서열번호 30의 CDRH3을 가진다. 항-CD20-7 항체는 서열번호 17의 CDRL1, 서열번호 18의 CDRL2, 서열번호 19의 CDRL3, 서열번호 20의 CDRH1, 서열번호 21의 CDRH2, 서열번호 22의 CDRH3을 가진다.Preferred antigen specific CD20 antibodies of the invention have the sequence shown. For example, the antigen specific antibodies of the invention may be selected from one of the light chain CDR sequences shown in Table 1 (ie CDRL1, CDRL2 and CDRL3) and / or the heavy chain CDR sequences shown in Table 1 (ie CDRH1, CDRH2 and CDRH3). It includes one. More specifically, the anti-CD20-6 antibody has CDRL1 of SEQ ID NO: 25, CDRL2 of SEQ ID NO: 26, CDRL3 of SEQ ID NO: 27, CDRH1 of SEQ ID NO: 28, CDRH2 of SEQ ID NO: 29, CDRH3 of SEQ ID NO: 30. The anti-CD20-7 antibody has CDRL1 of SEQ ID NO: 17, CDRL2 of SEQ ID NO: 18, CDRL3 of SEQ ID NO: 19, CDRH1 of SEQ ID NO: 20, CDRH2 of SEQ ID NO: 21, CDRH3 of SEQ ID NO: 22.

본 발명의 예시적인 양태는 다음을 포함한다:Exemplary aspects of the invention include the following:

뮤린Murine 아미노산 서열 Amino acid sequence

muCD20-7LCmuCD20-7LC

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC [서열번호 1];DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNFKKKLTGSDEQQVKSL

muCD20-7LC 가변 영역muCD20-7LC variable region

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMR [서열번호 32]DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMR [SEQ ID NO: 32]

muCD20-7HC muCD20-7HC

QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [서열번호 2];QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [SEQ ID NO: 2];

muCD20-7HC 가변 영역muCD20-7HC variable region

QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호 34]QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 34]

muCD20-6LC muCD20-6LC

DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC [서열번호 3];DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFKKKIDGSDSQQTSNSNS

muCD20-6LC 가변 영역muCD20-6LC variable region

DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKR [서열번호46]DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKR [SEQ ID NO: 46]

muCD20-6HC QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [서열번호 4];muCD20-6HC QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [SEQ ID NO: 4];

muCD20-6HC 가변 영역muCD20-6HC variable region

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호47]QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 47]

인간화 아미노산 서열Humanized amino acid sequence

huCD20-7LCv1.0 DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열번호 5];huCD20-7LCv1.0 DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTIVVCLEQRTKQVKKRLKRTVAAPSVFIFPPSQQKSG

huCD20-7LCv1.0 가변 영역huCD20-7LCv1.0 variable region

DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKR [서열번호33]DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKR [SEQ ID NO: 33]

huCD20-7HCv1.0 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호 6];huCD20-7HCv1.0 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 6];

huCD20-7HCv1.0 가변 영역huCD20-7HCv1.0 variable region

ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호35]ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 35]

huCD20-7HCv1.1 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호 7];huCD20-7HCv1.1 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 7];

huCD20-7HCv1.1 가변 영역huCD20-7HCv1.1 variable region

ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [서열번호36]ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 36]

뮤린Murine 가변 영역  Variable area DNADNA 서열 order

muCD20-7LC muCD20-7LC

gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtggaagtgttgatagttttggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcggtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaagctgatgatattgcaacctatttctgtcagcaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgatgcgg [서열번호 8];gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtggaagtgttgatagttttggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcggtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaagctgatgatattgcaacctatttctgtcagcaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgatgcgg [SEQ ID NO: 8];

muCD20-7HC muCD20-7HC

cagctccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatagtttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccatcttatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagcaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtacgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [서열번호 9];cagctccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatagtttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccatcttatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagcaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtacgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [SEQ ID NO: 9];

muCD20-6LC gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctttagggcagagggccattatatcctgcagagccagtgaaagtgttgataattttggcaatagctttatgcactggtaccagcagaagccaggacagccacccacactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccgttaatcctgtggaggctgatgatattgcaacttattactgtcaacaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg [서열번호 10];muCD20-6LC gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctttagggcagagggccattatatcctgcagagccagtgaaagtgttgataattttggcaatagctttatgcactggtaccagcagaagccaggacagccacccacactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccgttaatcctgtggaggctgatgatattgcaacttattactgtcaacaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg [SEQ ID NO: 10];

muCD20-6HC muCD20-6HC

cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataaattcacaaacgttggaatgaactgggtgaagcaggttccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccagcatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttttctttggaaacctctgccagcgctgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtatgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [서열번호 11];cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataaattcacaaacgttggaatgaactgggtgaagcaggttccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccagcatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttttctttggaaacctctgccagcgctgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtatgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [SEQ ID NO: 11];

인간화 및 Humanization and 키메라chimera 가변 영역  Variable area DNADNA 서열  order

huCD20-7LCv1.0 huCD20-7LCv1.0

gaattcgccaccatgggctggagctgtattattctgttcctggtagcaaccgctacaggtgtacactccgatattgttcttacccaaagcccagcctccctcgctgtcagtccaggccagcgagccactatctcctgccgtgcaagtggatctgtcgacagctttggaaatagcttcatgcactggtaccagcagaagcctggtcagcccccaaaactcctgatttatcgggcttccaatctggagtcaggagtgcccgcaaggttctctggcgggggcagccggacagatttcacattgactataaatcccgtggaggctaacgatatcgcaacatacttctgtcagcagtcttatgaggaccccttcacattcggccagggcacaaagctggagctcaaacgtacg [서열번호 12];gaattcgccaccatgggctggagctgtattattctgttcctggtagcaaccgctacaggtgtacactccgatattgttcttacccaaagcccagcctccctcgctgtcagtccaggccagcgagccactatctcctgccgtgcaagtggatctgtcgacagctttggaaatagcttcatgcactggtaccagcagaagcctggtcagcccccaaaactcctgatttatcgggcttccaatctggagtcaggagtgcccgcaaggttctctggcgggggcagccggacagatttcacattgactataaatcccgtggaggctaacgatatcgcaacatacttctgtcagcagtcttatgaggaccccttcacattcggccagggcacaaagctggagctcaaacgtacg [SEQ ID NO: 12];

huCD20-7HCv1.0huCD20-7HCv1.0

aagcttgccaccatgggatggagttgcatcatcctgttcctcgtcgcaaccgcaacaggggtgcattccgaactgcagctggtccagtctggtggtgagttgaagaaaccaggggaaacagttcgcattagctgtgctgcaagcggctatacattcacaaattatggaatgaattgggtgaaacaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggataaatacctatactggagagcctagttacgccgctcccttcaaggggcggtttgccttctctcttgagacaagtgccagcaccgcctatttgcagatttctagtttgaaaaccgaagacacagctacatacttctgcgcccgcggcgcatattacagatatgatctggggatggactattggggccagggtacctccgtgaccgtatcatccgcctccacaaagggccc [서열번호 13];aagcttgccaccatgggatggagttgcatcatcctgttcctcgtcgcaaccgcaacaggggtgcattccgaactgcagctggtccagtctggtggtgagttgaagaaaccaggggaaacagttcgcattagctgtgctgcaagcggctatacattcacaaattatggaatgaattgggtgaaacaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggataaatacctatactggagagcctagttacgccgctcccttcaaggggcggtttgccttctctcttgagacaagtgccagcaccgcctatttgcagatttctagtttgaaaaccgaagacacagctacatacttctgcgcccgcggcgcatattacagatatgatctggggatggactattggggccagggtacctccgtgaccgtatcatccgcctccacaaagggccc [SEQ ID NO: 13];

huCD20-7HCv1.1 huCD20-7HCv1.1

aagcttgccaccatgggttggtcttgcatcattctgtttctggtagcaactgcaactggagtgcacagcgagctgcaactcgtccagagcggaggtgagcttaagaagccaggagagaccgtgcgaatctcttgcgccgcatccggctactctttcacaaattacggaatgaattgggtcaagcaggcaccaggtaagggactcaaatggatgggctggatcaatacctacaccggcgagcctagttatgccgcacccttcaagggtcgatttgcattcagcctggagaccagtgcttctacagcttatttgcagatcagctctctgaagaccgaggacacagctacatacttctgcgcccgtggtgcctactaccgatacgatctgggcatggactattggggccaaggcacctcagtgactgtgtcttcagcatcaaccaagggccc [서열번호 14];aagcttgccaccatgggttggtcttgcatcattctgtttctggtagcaactgcaactggagtgcacagcgagctgcaactcgtccagagcggaggtgagcttaagaagccaggagagaccgtgcgaatctcttgcgccgcatccggctactctttcacaaattacggaatgaattgggtcaagcaggcaccaggtaagggactcaaatggatgggctggatcaatacctacaccggcgagcctagttatgccgcacccttcaagggtcgatttgcattcagcctggagaccagtgcttctacagcttatttgcagatcagctctctgaagaccgaggacacagctacatacttctgcgcccgtggtgcctactaccgatacgatctgggcatggactattggggccaaggcacctcagtgactgtgtcttcagcatcaaccaagggccc [SEQ ID NO: 14];

chCD20-7LCchCD20-7LC

gaattcgccaccatggggtggtcatgtatcatcctcttccttgtggcaaccgcaacaggcgtacactccgacattgtactgacccagtcacctgcctccctcgccgtatcccttgggcagagagccactattagttgcagggctagtggcagtgtcgattctttcggcaattcatttatgcactggtatcagcagaaaccagggcagccacccaagttgctcatataccgcgcctcaaaccttgagtccggggtcccagcccggttttccggaggcgggtcccgcaccgacttcaccctgacaatcaacccagtagaagcagatgatatcgctacttatttctgtcagcagagctatgaagacccttttacatttggggccggaaccaagttggagctcaagcgtacg [서열번호 15];gaattcgccaccatggggtggtcatgtatcatcctcttccttgtggcaaccgcaacaggcgtacactccgacattgtactgacccagtcacctgcctccctcgccgtatcccttgggcagagagccactattagttgcagggctagtggcagtgtcgattctttcggcaattcatttatgcactggtatcagcagaaaccagggcagccacccaagttgctcatataccgcgcctcaaaccttgagtccggggtcccagcccggttttccggaggcgggtcccgcaccgacttcaccctgacaatcaacccagtagaagcagatgatatcgctacttatttctgtcagcagagctatgaagacccttttacatttggggccggaaccaagttggagctcaagcgtacg [SEQ ID NO: 15];

chCD20-7HCchCD20-7HC

aagcttgccaccatgggatggagctgcatcattttgtttcttgtcgctaccgcaactggcgtccactcacagctgcagctggtgcagagtgggcctgagcttaagaaacccggtgagactgtgaagatctcatgtaaggctagcggctattcctttacaaattatggcatgaattgggtgaagcaggcccctgggaagggtctcaagtggatgggatggattaacacctatactggagagccttcatacgccgatgatttcaaagggaggttcgccttctccttggaaacctctgcttctactgcctaccttcagatttctaacctcaagaacgaggacactgcaacctatttttgcgctcgtggcgcatactatcgatatgatctgggcatggattattggggtcaaggcacatccgtaaccgtgtcctcagctagcactaagggccc [서열번호 16];aagcttgccaccatgggatggagctgcatcattttgtttcttgtcgctaccgcaactggcgtccactcacagctgcagctggtgcagagtgggcctgagcttaagaaacccggtgagactgtgaagatctcatgtaaggctagcggctattcctttacaaattatggcatgaattgggtgaagcaggcccctgggaagggtctcaagtggatgggatggattaacacctatactggagagccttcatacgccgatgatttcaaagggaggttcgccttctccttggaaacctctgcttctactgcctaccttcagatttctaacctcaagaacgaggacactgcaacctatttttgcgctcgtggcgcatactatcgatatgatctgggcatggattattggggtcaaggcacatccgtaaccgtgtcctcagctagcactaagggccc [SEQ ID NO: 16];

뮤린Murine 및 인간  And human CD20CD20 -7 -7 재표면화Resurfacing CDRCDR

경쇄 Light chain

CD20-7_LC_CDR1 RASGSVDSFGNSFMH [서열번호 17];CD20-7_LC_CDR1 RASGSVDSFGNSFMH [SEQ ID NO: 17];

CD20-7_LC_CDR2 RASNLES [서열번호 18]; CD20-7_LC_CDR2 RASNLES [SEQ ID NO: 18];

CD20-7_LC_CDR3 QQSYEDPFT [서열번호 19]; CD20-7_LC_CDR3 QQSYEDPFT [SEQ ID NO: 19];

중쇄Heavy chain

CD20-7_HC_CDR1 NYGMN [서열번호 20]; CD20-7_HC_CDR1 NYGMN [SEQ ID NO: 20];

CD20-7_HC_CDR2 WINTYTGEPS [서열번호 21]; CD20-7_HC_CDR2 WINTYTGEPS [SEQ ID NO: 21];

CD20-7_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [서열번호 22]; CD20-7_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [SEQ ID NO: 22];

Kabat 한정된 뮤린 및 인간화 CD20-7 HC CDR2Kabat-limited murine and humanized CD20-7 HC CDR2

뮤린 muCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYADDFKG [서열번호 23]; Murine muCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYADDFKG [SEQ ID NO: 23];

인간화 huCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYAAPFKG [서열번호 24]; Humanized huCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYAAPFKG [SEQ ID NO: 24];

뮤린Murine CD20CD20 -6 -6 CDRCDR 서열 order

경쇄Light chain

CD20-6_LC_CDR1 RASESVDNFGNSFMH [서열번호 25]; CD20-6_LC_CDR1 RASESVDNFGNSFMH [SEQ ID NO: 25];

CD20-6_LC_CDR2 RASNLES [서열번호 26]; CD20-6_LC_CDR2 RASNLES [SEQ ID NO: 26];

CD20-6_LC_CDR3 QQSYEDPFT [서열번호 27]; CD20-6_LC_CDR3 QQSYEDPFT [SEQ ID NO: 27];

중쇄Heavy chain

CD20-6_HC_CDR1 NVGMN [서열번호 28]; CD20-6_HC_CDR1 NVGMN [SEQ ID NO: 28];

CD20-6_HC_CDR2 WINTYTGEPA [서열번호 29]; CD20-6_HC_CDR2 WINTYTGEPA [SEQ ID NO: 29];

CD20-6_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [서열번호　30]; 및CD20-6_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [SEQ ID NO: 30]; And

Kabat 한정된 HC CDR2Kabat Limited HC CDR2

CD20-6_HC_KabCDR2 WINTYTGEPAYADDFKG [서열번호 31].CD20-6_HC_KabCDR2 WINTYTGEPAYADDFKG [SEQ ID NO 31].

당업자는 본 출원 내 서열이 비제한적인 예임을 이해한다.Those skilled in the art understand that the sequences in the present application are non-limiting examples.

기능적 Functional 동등물Equivalent , 항체 , Antibody 변이체Mutant 및 유도체 And derivatives

기능적 동등물은 전체 또는 온전한 항체의 것에 대한 동일한 또는 비교할 만한 결합 특성을 가지는 항체의 절편을 포함한다. 이러한 절편은 Fab 절편 또는 F(ab')2 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 상보성 결정 영역의 전부보다 적은 CDR, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 CDR을 포함하는 절편이 또한 기능적이더라도, 바람직하게 항체 절편은 전체 항체의 6개 상보성 결정 영역 모두를 포함한다. 또한, 기능적 동등물은 다음 면역글로불린 부류 중 임의의 하나의 구성원일 수 있거나 또는 상기 구성원을 조합할 수 있다: IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 및 이의 하위부류.Functional equivalents include fragments of an antibody that have the same or comparable binding properties to that of the whole or intact antibody. Such fragments may comprise one or both of Fab fragments or F (ab ') 2 . Although fragments comprising fewer than all of the CDRs of the complementarity determining regions, for example 1, 2, 3, 4 or 5 CDRs, are also functional, preferably the antibody fragment comprises all six complementarity determining regions of the entire antibody. In addition, the functional equivalent may be a member of any one of the following immunoglobulin classes or combine such members: IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, and subclasses thereof.

본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 변형되어 융합 단백질, 즉 비상동 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 융합된 항체 또는 절편을 생성할 수 있다. 특정 양태에서, 항-CD20 항체의 부분에 융합된 단백질은 ADEPT의 효소 성분이다. 항-CD20 항체와 융합 단백질로서 조작될 수 있는 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 포도상구균의 엔테로톡신-A(Staphylococcal enterotoxin-A), 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 및 슈도모나스 내독소(Pseudomonas endotoxin)와 같은 독소를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Pastan et al., Cell, 47:641 (1986)]; 및 Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994)]을 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 절편은 디프테리아 A 독소, 디프네리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 큐르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinaliss) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 비제한적인 예는 예를 들어 1993년 10월 28일자로 공개되고 전체가 본원에 참조로 포함된 WO 93/21232에 포함되어 있다.In certain embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody can be modified to produce an antibody or fragment fused to a fusion protein, ie, a nonhomologous protein, polypeptide or peptide. In certain embodiments, the protein fused to a portion of an anti-CD20 antibody is an enzyme component of ADEPT. Examples of other proteins or polypeptides that can be engineered as anti-CD20 antibodies and fusion proteins include, but are not limited to, lysine, avrine, ribonucleases, DNase I, Staphylococcal enterotoxin-A ), Toxins such as pokeweed antiviral protein, gelonin, diphtherine toxin, Pseudomonas exotoxin, and Pseudomonas endotoxin. See, eg, Pastan et al., Cell, 47: 641 (1986); And Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994). Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A toxin, non-binding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain ( Pseudomonas aeruginosa )), lysine A chain, abrin A chain, modexin A chain, alpha-sarsine, flow ( Aleurites fordii ) protein, diantine protein, Phytolaca americana americana ) proteins (PAPI, PAPII and PAP-S), bitter gourd ( momordica charantia ) inhibitor, cursin, crotin, sapaonaria officinalis s) inhibitors; Non-limiting examples are included, for example, in WO 93/21232, published October 28, 1993 and incorporated herein by reference in its entirety.

추가적인 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링(집합적으로 "DNA 셔플링"으로 불림)의 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 항체 또는 그의 절편(예컨대, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리도를가지는 항체 또는 그의 절편)의 활성을 변경하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호, 및 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33]; [Harayama, 1998, Trends Biotechnol., 16(2):76-82]; [Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol., 287:265-76]; 및 [Lorenzo 및 Blasco, 1998, Biotechniques, 24(2):308-313]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다. 항체는 또한 본원에 참조로 전체가 포함되어 있는 미국 공개 20030118592, 미국 공개 200330133939, 및 PCT 공개 WO 02/056910(모두 Ledbetter et al.)에 기술되어 있는 바와 같은 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백직일 수 있다.Additional fusion proteins can be generated through techniques of gene-shuffling, motif-shuffling, exon-shuffling, and / or codon-shuffling (collectively called "DNA shuffling"). DNA shuffling can be used to alter the activity of an antibody or fragment thereof (eg, an antibody or fragment thereof with higher affinity and lower dissociation). Generally US Pat. No. 5,605,793; 5,811,238; 5,811,238; 5,830,721; 5,830,721; 5,834,252; 5,834,252; And 5,837,458, and Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol., 16 (2): 76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol., 287: 265-76; And Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques, 24 (2): 308-313, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The antibody may also be a binding-domain immunoglobulin fusion protein as described in US Publication 20030118592, US Publication 200330133939, and PCT Publication WO 02/056910 (All Ledbetter et al., Which are incorporated herein by reference in their entirety). .

도메인 항체. 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD20 항체는, 인간 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 영역에 해당하는, 도메인 항체, 예컨대 항체의 소기능 결합 단위를 포함하는 항체일 수 있다. 도메인 항체의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, Domantis Limited(영국 케임브리지 소재) 및 Domantis Inc.(미국 매사추레츠주 케임브리지 소재)로부터 입수가능하며, 치료 표적에 특이적인 것(예를 들어, WO04/058821; WO04/003019; 미국 특허 제6,291,158호; 제6,582,915호; 6,696,245호; 및 제6,593,081호 참조)을 포함한다. 도메인 항체의 상업적으로 입수가능한 라이브러리는 항-CD20 도메인 항체를 식별하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 CD20 기능적 결합 단위 및 Fc 감마 수용체 기능적 결합 단위를 포함한다.Domain antibodies. The anti-CD20 antibody of the compositions and methods of the invention may be a domain antibody, such as an antibody comprising small functional binding units of the antibody, corresponding to the variable region of the heavy chain (VH) or light chain (VL) of a human antibody. Examples of domain antibodies are, but are not limited to, available from Domantis Limited (Cambridge, UK) and Domantis Inc. (Cambridge, Mass.) And specific for the therapeutic target (eg, WO04 / 058821). WO04 / 003019; US Pat. Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,696,245; and 6,593,081. Commercially available libraries of domain antibodies can be used to identify anti-CD20 domain antibodies. In certain embodiments, an anti-CD20 antibody of the invention comprises a CD20 functional binding unit and an Fc gamma receptor functional binding unit.

다이아바디. 용어 "다이아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 절편을 지칭하며, 상기 절편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개 도메인 사이에서 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 하며 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 다이아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 완전하게 기술되어 있다.Diamond. The term “diabody” refers to a small antibody fragment having two antigen-binding sites, the fragment comprising a heavy chain variable domain (VH) linked to a light chain variable domain (VL) within the same polypeptide chain (VH-VL). do. Using a linker that is too short to allow pairing between two domains on the same chain, the domain pairs with the complementary domains of the other chain and forms two antigen-binding sites. Diabodies are described, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; And Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

백시바디(Vaccibody). 본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 백시바디이다. 백시바디는 이량체 폴리펩티드이다. 백시바디의 각각의 단량체는 힌지 영역 및 Cg3을 통하여 제2 scFv에 연결된 APC 상의 표면 분자에 대하여 특이성을 가지는 scFv로 이루어진다. 본 발명의 다른 양태에서, 하나같이 scFv로 이루어진 백시바디는 항-CD20 항체 절편은 파괴될 B 세포 및 ADCC를 매개하는 효과기 세포를 병치하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Bogen et al.의 미국 특허출원 공개 제20040253238호를 참조할 수 있다.Vaccibody. In certain embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody is a backbody. Vaxibodies are dimeric polypeptides. Each monomer of the backbody consists of a scFv having specificity for the surface molecule on the APC linked to the second scFv via the hinge region and Cg3. In another embodiment of the present invention, a backbone body consisting of one scFv can be used to juxtapose B cells to be disrupted and effector cells that mediate ADCC. See, eg, US Patent Application Publication No. 20040253238 to Bogen et al.

선형 항체. 본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 선형 항체이다. 선형 항체는 항원-결합 영역의 쌍을 형성하는 나란한 Fd 분적의 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다. 선형 항체의 비제한적인 예는 예를 들어 문헌[Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)]에 개시되어 있다.Linear antibodies. In certain embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody is a linear antibody. Linear antibodies include pairs of side by side Fd droplets (VH-CH1-VH-CH1) that form pairs of antigen-binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific. Non-limiting examples of linear antibodies are disclosed, for example, in Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995).

부모 항체. 본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 부모 항체이다. "부모 항체"는 본원에 개시된 바와 같은 변경된/돌연변이 항체와 비교하여 이의 하나 이상의 초가변 영역에서 또는 이와 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기가 없거나 또는 결핍된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 따라서, 부모 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항체 돌연변이체의 해당하는 초가변 영역보다 더 짧은 초가변 영역을 가진다. 부모 폴리펩티드는 원래의 서열(즉, 자연적으로 생성되는) 항체(자연적으로 생성되는 대립유전자 변이체를 포함함) 또는 자연적으로 생성되는 서열의 기존 아미노산 서열 변형(예를 들어 다른 삽입, 결실 및/또는 치환)을 가진 항체를 포함할 수 있다. 바람직하게 부모 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.Parent antibodies. In certain embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody is a parent antibody. A “parent antibody” is an antibody comprising an amino acid sequence that lacks or lacks one or more amino acid residues in or near one or more hypervariable regions thereof as compared to an altered / mutated antibody as disclosed herein. Thus, the parent antibody has a hypervariable region that is shorter than the corresponding hypervariable region of the antibody mutant as disclosed herein. The parent polypeptide may be a native sequence (ie, naturally occurring) antibody (including naturally occurring allelic variants) or an existing amino acid sequence modification (eg, other insertions, deletions and / or substitutions) of the naturally occurring sequence. May comprise an antibody. Preferably the parent antibody is a humanized antibody or human antibody.

항체 절편. "항체 절편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로는 항원 결합 또는 이의 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 특히 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편; 다이아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 절편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.Antibody fragments. An "antibody fragment" includes a portion of a full length antibody, generally an antigen binding or variable region thereof. Examples of antibody fragments include, in particular, Fab, Fab ', F (ab') 2, and Fv fragments; Diamond body; Linear antibodies; Single-chain antibody molecules; And multispecific antibodies formed from antibody fragments.

전통적으로, 절편은 온전한 항체의 단백질분해성 절단을 통해 유래된다(예컨대, 문헌[Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 절편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 절편은 본원에 논의된 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편은 대장균(E. coli)으로부터 직접적으로 회수될 수 있으며 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 절편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 절편의 생성을 위한 다른 기법은 본 명세서에서 상세한 교시 내용이 주어진 숙련된 실시자에게 명백하다. 다른 양태에서, 선택된 항체는 단일-사슬 Fv 절편(scFv)이다. 예를 들어, WO 93/16185를 참조할 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 Fab 절편이 아니다.Traditionally, fragments are derived through proteolytic cleavage of intact antibodies (see, eg, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985). However, fragments can now be produced directly by recombinant host cells. For example, antibody fragments can be isolated from antibody phage libraries as discussed herein. Alternatively, Fab'-SH fragments can be recovered directly from E. coli and chemically coupled to form F (ab ') 2 fragments (Carter et al., Bio Technology, 10 : 163-167 (1992). According to another approach, F (ab ') 2 fragments can be isolated directly from recombinant host cell culture. Other techniques for the generation of antibody fragments are apparent to the skilled practitioner given the detailed teaching herein. In other embodiments, the antibody of choice is a single-chain Fv fragment (scFv). See, for example, WO 93/16185. In certain embodiments, the antibody is not a Fab fragment.

이중특이적 항체. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대하여 결합 특이성을 가지는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 CD20의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이러한 항체는 CD20에 결합하고 제2 항원에 추가로 결합할 수 있다. 대안적으로, CD20 결합 팔(arm)은, 표적에 대한 세포 방어 메커니즘에 집중하기 위하여, 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T 세포 수용체 분자(예컨대, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 팔과 조합된다. 이중특이적 항체는 또한 표적에 세포독성제를 국재화하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 세포 마커-결합 팔 및 세포독성제(예컨대, 사포린, 항-인터페론α, 빈카알카로이드, 리신 A 사슬, 메톨라-엑세이트(methola-exate) 또는 방사성 동위언소 합텐)에 결합하는 팔을 가진다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 절편(예컨대, F(ab'): 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.Bispecific antibodies. Bispecific antibodies are antibodies that have binding specificities for at least two different epitopes. Exemplary bispecific antibodies may bind to two different epitopes of CD20. Other such antibodies may bind to CD20 and further bind to a second antigen. Alternatively, the CD20 binding arm may be a triggering molecule on leukocytes, such as a T cell receptor molecule (eg, CD2 or CD3), or an Fc receptor for IgG, in order to focus on cellular defense mechanisms against the target. FcγR). Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic agents to a target. Such antibodies may bind to cell marker-binding arms and cytotoxic agents (eg, saporin, anti-interferonα, vinca alkaloids, lysine A chains, metola-exate or radioisotope hapten). Has Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (eg, F (ab '): bispecific antibodies).

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]; [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]; [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]; [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]; [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]; [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,81호; 제5,731,168호; 제4,676,980호; 및 제4,676,980호, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; EP 03089 및 US 2009/0048122를 참조할 수 있다.Methods of making bispecific antibodies are known in the art. See, eg, Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983); Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991); Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986); Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994); US Patent No. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 5,601,81; 5,731,168; No. 4,676,980; And 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; See EP 03089 and US 2009/0048122.

본 발명의 특정 양태에서, 조성물 및 방법은 T 세포 수용체의 인간 CD20 및 CD3 엡실론 사슬에 대한 특이성을 가지는 이중특이적 뮤린 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트, 예를 들어 문헌[Daniel et al., Blood, 92:4750-4757 (1998)]에 기술된 이중특이적 항체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD20 항체 또는 그의 절편 및/또는 이의 컨쥬게이트가 이중특이적일 경우, 항-CD20 항체는 인간 또는 인간화된 것이고, T 세포 상의 인간 CD20 및 에피토프에 대하여 특이성을 가지거나 또는 인간 효과기-세포, 예를 들어 단핵구/대식세포 및/또는 세포 사멸에 영향을 미치는 자연 살생 세포에 결합할 수 있다.In certain embodiments of the invention, the compositions and methods comprise bispecific murine antibodies or fragments thereof and / or conjugates thereof having specificity for human CD20 and CD3 epsilon chains of T cell receptors, eg, Daniel et al. , Blood, 92: 4750-4757 (1998). In a preferred embodiment, when the anti-CD20 antibody or fragment thereof and / or conjugate thereof of the compositions and methods of the invention is bispecific, the anti-CD20 antibody is human or humanized and is directed against human CD20 and epitope on T cells. It can bind to natural killer cells that have specificity or that affect human effector-cells, such as monocytes / macrophages and / or cell death.

항체 결합 친화도Antibody Binding Affinity

본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 CD20 및 이의 항원 절편에 결합 친화도를 변경하도록 변형될 수 있다. 결합 특성은 당업계에 알려진 다양한 시험관 내 분석법, 예컨대 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역측정법(RIA), 또는 동역학(예컨대, BIACORE(상표명) 분석법)에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로 낮은 KD를 가지는 결합 분자가 바람직함이 이해된다.In certain embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody may be modified to alter binding affinity to CD20 and antigen fragments thereof. Binding properties can be measured by various in vitro assays known in the art, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or radioimmunoassay (RIA), or kinetics (eg, BIACORE ™ assay). It is generally understood that binding molecules with low KD are preferred.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체 또는 항체 절편은 CD20 및 이의 항원 절편에 10-5M 미만, 또는 10-6M 미만, 또는 10-7M 미만, 또는 10-8M 미만, 또는 10-9M 미만, 또는 10-10M 미만, 또는 10-11M 미만, 또는 10-12M 미만, 또는 10-13M 미만의 해리 상수 또는 KD 또는 Kd(koff/kon)로 특이적으로 결합한다.In one embodiment of the invention, the antibody or antibody fragment is less than 10 −5 M, or less than 10 −6 M, or less than 10 −7 M, or less than 10 −8 M, or 10 −9 in the CD20 and antigen fragments thereof. Binds specifically with a dissociation constant of less than M, or less than 10 -10 M, or less than 10 -11 M, or less than 10 -12 M, or less than 10 -13 M or KD or Kd (k off / k on ) .

다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 절편은 CD20 및/또는 이의 항원 절편에 1×10-3s-1 미만, 또는 3×10-3s-1 미만의 Koff로 결합한다. 다른 양태에서, 항체는 CD20 및이의 항원 절편에 10-3s-1 미만, 5×10-3s-1 미만, 10-4s-1 미만, 5×10-4s-1 미만, 10-5s-1 미만, 5×10-5s-1 미만, 10-6s-1 미만, 5×10-6s-1 미만, 10-7s-1 미만, 5×10-7s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5×10-8s-1 미만, 10-9s-1 미만, 5×10-9s-1 미만, 또는 10-10s-1 미만의 Koff로 결합한다.In other embodiments, the antibody or fragment of the invention binds CD20 and / or antigenic fragments thereof with a K off of less than 1 × 10 −3 s −1 , or less than 3 × 10 −3 s −1 . In other embodiments, the antibody comprises less than 10 −3 s −1, less than 5 × 10 −3 s −1, less than 10 −4 s −1, less than 5 × 10 −4 s −1 , 10 with CD20 and antigenic fragments thereof -5 s -1 is less than, 5 × 10 -5 s -1 is less than, less than 10 -6 s -1, 5 × 10 -6 s -1 is less than, less than 10 -7 s -1, 5 × 10 -7 s - K off less than 1, less than 10 −8 s −1, less than 5 × 10 −8 s −1, less than 10 −9 s −1, less than 5 × 10 −9 s −1 , or less than 10 −10 s −1 To combine.

다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 절편은 CD20 및/또는 이의 항원 절편에 적어도 105M-1s-1, 적어도 5×105M-1s-1, 적어도 106M-1s-1, 적어도 5×106M-1s-1, 적어도 107M-1s-1, 적어도 5×107M-1s -1, 또는 적어도 108M-1s-1, 또는 적어도 109M-1s-1의 결합도 상수 또는 비율로 결합한다.In another embodiment, an antibody or fragment of the invention comprises at least 10 5 M −1 s −1 , at least 5 × 10 5 M −1 s −1 , at least 10 6 M −1 s −1 to CD20 and / or antigenic fragments thereof At least 5 × 10 6 M -1 s -1 , at least 10 7 M -1 s -1 , at least 5 × 10 7 M -1 s -1 , or at least 10 8 M -1 s -1 , or at least 10 9 The binding degree of M −1 s −1 is constant or in proportion.

당업자는 본 발명의 컨쥬게이트는 본원에 기술된 바와 동일한 특성을 가짐을 이해한다.Those skilled in the art understand that the conjugates of the present invention have the same properties as described herein.

항체 Antibody pIpI 및  And TmTm

본 발명의 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 등전점(pI)를 변경하도록 변형될 수 있다. 모든 폴리펩티드와 같이 항체는 pI를 가지며, 이는 일반적으로 폴리펩티드가 순전하를 가지지 않는 때의 pH로서 정의된다. 단백질 용해도는 전형적으로 용액의 pH가 단백질의 등전점(pI)와 동일할 때 가장 낮은 것으로 당업계에 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 pI 값은 우세한 전하 형태의 pI로서 정의된다. 단백질의 pI는, 이에 한정되는 것은 아니지만 등전점 전기영동 및 다양한 컴퓨터 알고리즘(예컨대, 문헌[Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis, 14:1023] 참조)을 포함한 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 항체의 Fab 도메인의 열 용융 온도(Tm)는 항체의 열 안정성의 우수한 지표일 수 있으며, 반감기의 표시를 추가로 제공할 수 있다. Tm이 낮을수록 응집이 더 많이 일어나고/안정성이 더 낮음을 나타내는 반면, Tm이 높을수록 응집이 더 적게 일어나고/안정성이 더 높음을 나타낸다. 따라서, 특정 양태에서 더 높은 Tm을 가지는 항체가 바람직하다. 단백질 도메인의 Tm(예컨대, Fab 도메인)은 당업계에 알려진 임의의 표준 방법을 사용하여 예를 들어 시차 열량 주사법(예컨대, 문헌[Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404]; [Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154] 참조)에 의해 측정될 수 있다.In certain embodiments of the invention, the anti-CD20 antibody may be modified to alter the isoelectric point (pI). Like all polypeptides, antibodies have pi, which is generally defined as the pH when the polypeptide has no net charge. Protein solubility is typically known to be lowest when the pH of the solution is equal to the isoelectric point (pI) of the protein. As used herein, a pI value is defined as pI in the prevailing charge form. The pi of a protein can be measured by a variety of methods, including but not limited to isoelectric point electrophoresis and various computer algorithms (see, eg, Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis, 14: 1023). In addition, the thermal melting temperature (Tm) of the Fab domain of the antibody may be an excellent indicator of the thermal stability of the antibody and may further provide an indication of half-life. Lower Tm indicates more aggregation / lower stability, while higher Tm indicates less aggregation / higher stability. Thus, in certain embodiments antibodies with higher Tm are preferred. The Tm of the protein domain (eg, Fab domain) can be determined using any standard method known in the art, for example using differential calorimetry (see Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78: 394-404). (Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154).

따라서, 본 발명의 추가적인 비배타적 양태는 임의의 바람직한 생화학적 특징, 예를 들어 특정한 등전점(pI) 또는 용융 온도(Tm)를 가지는 변형된 항체를 포함한다.Thus, further non-exclusive embodiments of the invention include modified antibodies having any desirable biochemical characteristics, for example, a particular isoelectric point (pI) or melting temperature (Tm).

보다 구체적으로, 하나의 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 5.5 내지 9.5 범위의 pI를 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 약 5.5 내지 약 6.0, 또는 약 6.0 내지 약 6.5, 또는 약 6.5 내지 약 7.0, 또는 약 7.0 내지 약 7.5, 또는 약 7.5 내지 약 8.0, 또는 약 8.0 내지 약 8.5, 또는 약 8.5 내지 약 9.0, 또는 약 9.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 가진다. 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 5.5~6.0, 또는 6.0 내지 6.5, 또는 6.5 내지 7.0, 또는 7.0~7.5, 또는 7.5~8.0, 또는 8.0~8.5, 또는 8.5~9.0, 또는 9.0~9.5 범위의 pI를 가진다. 보다 더 구체적으로, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 5.5, 또는 적어도 6.0, 또는 적어도 6.3, 또는 적어도 6.5, 또는 적어도 6.7, 또는 적어도 6.9, 또는 적어도 7.1, 또는 적어도 7.3, 또는 적어도 7.5, 또는 적어도 7.7, 또는 적어도 7.9, 또는 적어도 8.1, 또는 적어도 8.3, 또는 적어도 8.5, 또는 적어도 8.7, 또는 적어도 8.9, 또는 적어도 9.1, 또는 적어도 9.3, 또는 적어도 9.5의 pI를 가진다. 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 약 5.5, 또는 적어도 약 6.0, 또는 적어도 약 6.3, 또는 적어도 약 6.5, 또는 적어도 약 6.7, 또는 적어도 약 6.9, 또는 적어도 약 7.1, 또는 적어도 약 7.3, 또는 적어도 약 7.5, 또는 적어도 약 7.7, 또는 적어도 약 7.9, 또는 적어도 약 8.1, 또는 적어도 약 8.3, 또는 적어도 약 8.5, 또는 적어도 약 8.7, 또는 적어도 약 8.9, 또는 적어도 약 9.1, 또는 적어도 약 9.3, 또는 적어도 약 9.5의 pI를 가진다.More specifically, in one embodiment, the modified antibody of the invention has a pI in the range of 5.5 to 9.5. In another specific embodiment, the modified antibody of the invention is about 5.5 to about 6.0, or about 6.0 to about 6.5, or about 6.5 to about 7.0, or about 7.0 to about 7.5, or about 7.5 to about 8.0, or about 8.0 To pi, or from about 8.5 to about 9.0, or from about 9.0 to about 9.5. In another specific embodiment, the modified antibody of the invention is 5.5-6.0, or 6.0-6.5, or 6.5-7.0, or 7.0-7.5, or 7.5-8.0, or 8.0-8.5, or 8.5-9.0, or 9.0-9.5 Has a pI in the range. Even more specifically, the modified antibody of the invention may be at least 5.5, or at least 6.0, or at least 6.3, or at least 6.5, or at least 6.7, or at least 6.9, or at least 7.1, or at least 7.3, or at least 7.5, or at least 7.7. , Or at least 7.9, or at least 8.1, or at least 8.3, or at least 8.5, or at least 8.7, or at least 8.9, or at least 9.1, or at least 9.3, or at least 9.5. In another specific embodiment, the modified antibody of the invention is at least about 5.5, or at least about 6.0, or at least about 6.3, or at least about 6.5, or at least about 6.7, or at least about 6.9, or at least about 7.1, or at least about 7.3 Or at least about 7.5, or at least about 7.7, or at least about 7.9, or at least about 8.1, or at least about 8.3, or at least about 8.5, or at least about 8.7, or at least about 8.9, or at least about 9.1, or at least about 9.3 Or a pi of at least about 9.5.

항체에서 이온화가능한 잔기의 수 및 위치를 변경함으로서 용해도를 최적화시켜 pI를 조정할 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드의 pI는 적절한 아미노산을 치환시킴으로써(예컨대, 알라닌과 같은 비하전된 잔기를 리신과 같은 하전된 아미노산으로 치환시킴으로써) 조작될 수 있다. 임의의 특정한 이론에 구속되는 것을 원하는 것은 아니지만, 상기 항체의 pI를 변화시키는 항체의 아미노산 치환은 항체의 용해도 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다. 당업자는 아미노산 치환이 원하는 pI를 획득하기 위하여 특정 항체에 대하여 가장 적절할 것임을 이해할 것이다. 하나의 양태에서, 치환은 본 발명의 항체에서 일어나서 pI를 변경시킨다. FcγR(상기 기술됨)에 대한 결합을 변경시키는 Fc 영역의 치환(들)은 또한 pI에서 변화를 초래할 수 있음이 구체적으로 고려된다. 다른 양태에서, Fc 영역의 치환(들)은 구체적으로 FcγR 결합에서 원하는 변경 및 pI에서 임의의 원하는 변화 둘 다에 영향을 미치도록 선택된다.By changing the number and position of ionizable residues in an antibody, the solubility can be optimized to adjust pi. For example, the pi of a polypeptide can be engineered by substituting the appropriate amino acid (eg, by replacing uncharged residues such as alanine with charged amino acids such as lysine). While not wishing to be bound by any particular theory, amino acid substitutions of an antibody that change the pi of the antibody may improve the solubility and / or stability of the antibody. Those skilled in the art will understand that amino acid substitutions will be most appropriate for a particular antibody to obtain the desired pi. In one embodiment, substitutions occur in the antibodies of the invention to alter pi. It is specifically contemplated that substitution (s) of the Fc region that alters binding to FcγR (described above) may also result in a change in pi. In other embodiments, the substitution (s) of the Fc region is specifically selected to affect both the desired change in FcγR binding and any desired change in pi.

하나의 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 65℃ 내지 120℃ 범위의 Tm을 가진다. 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 약 75℃ 내지 약 120℃, 또는 약 75℃ 내지 약 85℃, 또는 약 85℃ 내지 약 95℃, 또는 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 105℃ 내지 약 115℃, 또는 약 115℃ 내지 약 120℃ 범위의 Tm을 가진다. 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 75℃ 내지 120℃, 또는 75℃ 내지 85℃, 또는 85℃ 내지 95℃, 또는 95℃ 내지 105℃, 또는 105℃ 내지 115℃, 또는 115℃ 내지 120℃ 범위의 Tm을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 약 65℃, 또는 적어도 약 70℃, 또는 적어도 약 75℃, 또는 적어도 약 80℃, 또는 적어도 약 85℃, 또는 적어도 약 90℃, 또는 적어도 약 95℃, 또는 적어도 약 100℃, 또는 적어도 약 105℃, 또는 적어도 약 110℃, 또는 적어도 약 115℃, 또는 적어도 약 120℃의 Tm을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 65℃, 또는 적어도 70℃, 또는 적어도 75℃, 또는 적어도 80℃, 또는 적어도 85℃, 또는 적어도 90℃, 또는 적어도 95℃, 또는 적어도 100℃, 또는 적어도 105℃, 또는 적어도 110℃, 또는 적어도 115℃, 또는 적어도 120℃의 Tm을 가진다.In one embodiment, the modified antibody of the invention has a Tm in the range of 65 ° C to 120 ° C. In a specific embodiment, the modified antibody of the invention is about 75 ° C to about 120 ° C, or about 75 ° C to about 85 ° C, or about 85 ° C to about 95 ° C, or about 95 ° C to about 105 ° C, or about 105 ° C To Tm in the range from about 115 ° C, or from about 115 ° C to about 120 ° C. In another specific embodiment, the modified antibody of the invention is 75 ° C to 120 ° C, or 75 ° C to 85 ° C, or 85 ° C to 95 ° C, or 95 ° C to 105 ° C, or 105 ° C to 115 ° C, or 115 ° C to Tm in the range of 120 ° C. In another specific embodiment, the modified antibody of the invention is at least about 65 ° C., or at least about 70 ° C., or at least about 75 ° C., or at least about 80 ° C., or at least about 85 ° C., or at least about 90 ° C., or at least Or a Tm of about 95 ° C, or at least about 100 ° C, or at least about 105 ° C, or at least about 110 ° C, or at least about 115 ° C, or at least about 120 ° C. In another specific embodiment, the modified antibody of the invention is at least 65 ° C, or at least 70 ° C, or at least 75 ° C, or at least 80 ° C, or at least 85 ° C, or at least 90 ° C, or at least 95 ° C, or at least 100 Or Tm of at least 105 ° C, or at least 110 ° C, or at least 115 ° C, or at least 120 ° C.

조작된 효과기 기능Manipulated Effector Function

예를 들어 B 세포 연관 질환, 암, GVHD 또는 거부를 치료하는데 있어서 항체의 유효성을 향상시키기 위하여, 효과기 기능에 대하여 본 발명의 항-CD20 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)은 Fc 영역에 도입될 수 있고, 이에 의하여 이 영역 내 사슬 내 이황화 결합 형성을 허용한다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 살생 및/또는 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)]을 참조할 수 있다. 향상된 활성을 가지는 동종이량체 항체는 또한 문헌[Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 헤테로이작용성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 가지는 항체가 조작될 수 있으며, 이에 의하여 향상된 보체 융해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)]을 참조할 수 있다.It may be desirable to modify the anti-CD20 antibodies of the invention for effector function, for example to improve the effectiveness of the antibody in treating B cell associated diseases, cancer, GVHD or rejection. For example, cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing the formation of disulfide bonds in the chain in this region. Homodimeric antibodies so produced may have improved internalization capacity and / or increased complement-mediated cell killing and / or antibody-dependent cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B., J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with enhanced activity may also be prepared using heterobifunctional crosslinkers as described in Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, antibodies with double Fc regions can be engineered, thereby having improved complement fusion and ADCC ability. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

효과기 기능을 변경하기 위하여 항체의 Fc 영역을 조작하는 다른 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 공개 제20040185045호 및 PCT 공개 WO 2004/016750(둘 다 Koenig et al.), 이들은 FCγRIIA에 대한 결합 친화도와 비교하여 FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 향상시키기 위하여 Fc 영역을 변경하는 것을 기술함; 또한, PCT 공개 WO 99/58572(Armour et al.); WO 99/51642(Idusogie et al.); 및 미국 특허 제6,395,272호(Deo et al.); 이들의 개시 내용은 본원에 전체가 포함되어 있음). FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 감소시키기 위하여 Fc 영역을 변형하는 방법이 또한 당업계에 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 공개 20010036459 및 PCT 공개 WO 01/79299(둘 다 Ravetch et al.), 이들의 개시 내용은 본원에 전체가 포함되어 있음). 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 향상된 결합 친화도를 가지는 변이체 Fc 영역을 가지는 변형된 항체가 알려져 있다(예컨대, PCT 공개 WO 2004/063351(Stavenhagen et al.); 이의 개시 내용은 본원에 전체가 포함되어 있음).Other methods of manipulating the Fc region of an antibody to alter effector function are known in the art (eg, US Patent Publication No. 20040185045 and PCT Publication WO 2004/016750 (both Koenig et al.), Which for FCγRIIA). Altering the Fc region to enhance binding affinity for FcγRIIB as compared to binding affinity, see also PCT Publication WO 99/58572 (Armour et al.) And WO 99/51642 (Idusogie et al.); And US Pat. No. 6,395,272 to Deo et al., The disclosures of which are incorporated herein in their entirety. Methods of modifying the Fc region to reduce binding affinity for FcγRIIB are also known in the art (eg, US Patent Publication 20010036459 and PCT Publication WO 01/79299 (both Ravetch et al.), The disclosures thereof). Is incorporated herein in its entirety). Modified antibodies with variant Fc regions with improved binding affinity for FcγRIIIA and / or FcγRIIA compared to wild type Fc regions are known (eg, PCT Publication WO 2004/063351 (Stavenhagen et al.); Incorporated herein in its entirety).

당업계에 공지된 시험관 내 분석은 예를 들어 본 발명의 항-CD20 항체, 조성물, 컨쥬게이트 및 방법이 본원에 기술된 것과 같이 ADCC를 매개할 수 있다.In vitro assays known in the art can mediate ADCC, for example as the anti-CD20 antibodies, compositions, conjugates and methods of the invention are described herein.

변이체 Fc 영역. 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질의 제형을 제공한다. 이는, 자연적으로 생성되지 않는 영역, 예를 들어 하나 이상의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 또한 본 발명의 변이체 Fc은 아미노산 결실, 추가 및/또는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.Variant Fc region. The present invention provides formulations of proteins comprising variant Fc regions. It includes regions that are not naturally occurring, such as Fc regions comprising one or more naturally occurring amino acid residues. Variants Fc of the invention also include Fc regions comprising amino acid deletions, additions and / or modifications.

본원에서 사용되는 Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외하고 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함함이 이해될 것이다. 따라서 Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 지칭한다. IgA 및 IgM에 대하여, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG에 대하여, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3(Cγ2 및 Cγ3) 및 Cγ1(Cγ1) 및 Cγ2(Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계선은 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 카복실-말단에 대한 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되며, 여기에서 번호 붙이기는 문헌[Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)]에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. "Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스"는 상기 Kabat et al.에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호 붙이기를 지칭한다. Fc는 별개로 이러한 영역, 또는 항체, 항체 절편, 또는 Fc 융합 단백질의 내용에서 이러한 영역을 지칭할 수 있다. Fc 변이체 단백질은 항체, Fc 융합, 또는 Fc 영역을 포함하는 임의의 단백질 또는 단백질 도메인일 수 있다. 특히 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질이 바람직하며, 상기 변이체 Fc 영역은 Fc의 자연적으로 생성되지 않는 변이체이다. 다형성은 다수의 Fc 위치에서 관찰되며, 이는 이에 한정되는 것은 아니지만 Kabat 270, 272, 312, 315, 356, 및 358을 포함하고, 따라서 제시된 서열 및 종래 기술에서의 서열들 사이에서 약간의 상이함이 존재할 수 있으며 이는 본원의 교시 내용을 기초로 하여 당업자에게 알려질 것이다.As used herein, it will be understood that the Fc region includes a polypeptide comprising the constant region of an antibody except for the first constant region immunoglobulin domain. Thus Fc refers to the last two constant region immunoglobulin domains of IgA, IgD, and IgG, the last three constant region immunoglobulin domains of IgE and IgM, and the flexible hinge N-terminus for these domains. For IgA and IgM, Fc may comprise a J chain. For IgG, Fc comprises a hinge between the immunoglobulin domains Cγ2 and Cγ3 (Cγ2 and Cγ3) and Cγ1 (Cγ1) and Cγ2 (Cγ2). Although the boundaries of the Fc region can vary, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined as comprising residues C226 or P230 for the carboxyl-terminus, wherein the numbering is described in Kabat et al. As per (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). "EU index as set forth in Kabat" refers to the residue numbering of human IgG1 EU antibodies as described in Kabat et al., Supra. Fc may refer to these regions separately or in the context of an antibody, antibody fragment, or Fc fusion protein. The Fc variant protein may be any protein or protein domain comprising an antibody, Fc fusion, or Fc region. Especially preferred are proteins comprising variant Fc regions, wherein the variant Fc regions are naturally occurring variants of the Fc. Polymorphisms are observed at a number of Fc positions, which include but are not limited to Kabat 270, 272, 312, 315, 356, and 358, so that there are slight differences between the presented sequences and those in the prior art Which may be present and will be known to those skilled in the art based on the teachings herein.

본 발명은 비슷한 분자(예컨대, 야생형 Fc 영역을 가지는 것을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질)에 대하여 Fc 리간드(예컨대, Fc 수용체 C1q)에 대한 변경된 결합 특성을 가지는 Fc 변이체 단백질을 포함한다. 결합 특성의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만 결합 특이성, 평형 해리 상수(KD), 해리 및 결합도(Koff 및Kon), 결합 친화도 및/또는 결합활성을 포함한다. 일반적으로 낮은 KD를 가지는 결합 분자(예컨대, 항체와 같은 Fc 변이체 단백질)가 높은 KD를 가지는 결합 분자보다 바람직함이 이해된다. 그러나, 일부 경우에서, Kon 또는 Koff의 값은 KD의 값보다 더 관련이 있을 수 있다. 당업자는 어떤 동역학 파라미터가 주어진 항체 적용에 대하여 가장 중요한지를 결정할 수 있다.The present invention includes Fc variant proteins having altered binding properties for Fc ligands (eg, Fc receptor C1q) for similar molecules (eg, proteins having the same amino acid sequence except having a wild type Fc region). Examples of binding properties include, but are not limited to, binding specificity, equilibrium dissociation constants (K D ), dissociation and binding degrees (K off and K on ), binding affinity and / or binding activity. It is generally understood that binding molecules with low KDs (eg, Fc variant proteins such as antibodies) are preferred over binding molecules with high KDs. However, in some cases, the value of K on or K off may be more relevant than the value of KD. Those skilled in the art can determine which kinetic parameters are most important for a given antibody application.

리간드에 대한 Fc 도메인의 친화도 및 결합 특성은 Fc-FcγR 상호작용, 즉 FcγR에 대해 Fc 영역의 구체적인 결합을 측정하는 것에 대해 당업계에 알려진 다양한 시험관 내 분석 방법(생화학 또는 면역학에 기초한 분석법), 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 평형 방법(예컨대, 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역측정법(RIA)), 또는 동역학(예컨대, BIACORE(상표명) 분석법), 및 기타 방법 예를 들어 직접 결합 분석법, 경쟁적 억제 분석법, 형광 공명 에너지 전이(FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예컨대, 겔 여과)와 같은 다른 방법, 에 의해 측정될 수 있다.이들 및 기타 방법은 검사될 하나 이상의 성문 상의 표지를 이용할 수 있고/있거나 다양한 검출 방법, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 발색(chromogenic), 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 자세한 기술은 예를 들어 문헌[Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾아볼 수 있다.The affinity and binding properties of the Fc domain for ligands can be determined by various in vitro assays known in the art for determining Fc-FcγR interactions, i. Examples include, but are not limited to, equilibrium methods (eg, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or radioimmunoassay (RIA)), or kinetics (eg, BIACORE ™ assay), and other methods such as direct Other methods, such as binding assays, competitive inhibition assays, fluorescence resonance energy transfer (FRET), gel electrophoresis and chromatography (eg gel filtration), can be measured by these or other methods. Labels may be used and / or various detection methods, such as, but not limited to, chromogenic, fluorescent, luminescent, or isotope tables The can be used. Detailed descriptions of binding affinity and kinetics can be found, for example, in Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).

예를 들어, 하나 이상의 양성 조절제(예컨대, FcγRIIIA)에 대한 Fc 결합을 향상시키는 반면, 음성 조절제 FcγRIIB에 대한 Fc 결합을 변화시키지 않거나 또는 심지어 이를 감소시키는 변형은 ADCC 활성을 향상시키는데 보다 바람직할 것이다. 대안적으로, 하나 이상의 양성 조절제에 결합을 감소시키고/감소시키거나 FcγRIIB에 대한 결합을 향상시키는 변형은 ADCC 활성을 감소시키는데 바람직할 것이다. 따라서, 결합 친화도의 비율(예컨대, 평형 해리 상수(KD))은 Fc 변이체의 ADCC 활성이 향상 또는 감소되는지를 나타낼 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIA/FcγRIIB 평형 해리 상수(KD) 비율의 감소는 개선된 ADCC 활성과 관계가 있을 것인 반면, 비율의 증가는 ADCC 활성의 감소와 관계가 있을 것이다. 추가적으로, C1q에 대한 결합을 향상시키는 변형은 CDC 활성을 향상시키는데 바람직할 것이지만, C1q에 대한 결합을 감소시키는 변형은 CDC 활성을 감소 또는 제거하는데 바람직할 것이다.For example, modifications that enhance Fc binding to one or more positive modulators (eg, FcγRIIIA), while not altering or even reducing Fc binding to the negative regulator FcγRIIB, will be more desirable to enhance ADCC activity. Alternatively, modifications that reduce binding to one or more positive modulators and / or enhance binding to FcγRIIB will be desirable to reduce ADCC activity. Thus, the ratio of binding affinity (eg, equilibrium dissociation constant (KD)) may indicate whether the ADCC activity of the Fc variant is improved or decreased. For example, a decrease in the FcγRIIIA / FcγRIIB equilibrium dissociation constant (KD) ratio will be associated with improved ADCC activity, while an increase in ratio will be associated with a decrease in ADCC activity. In addition, modifications that enhance binding to C1q would be desirable to enhance CDC activity, while modifications that reduce binding to C1q would be desirable to reduce or eliminate CDC activity.

하나의 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 증가된 친화도를 가지는 FcγRIIIA에 결합한다. 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 증가된 친화도를 가지는 FcγRIIIA에 결합하고, 비슷한 분자에 비하여 변하지 않은 결합 친화도를 가지는 FcγRIIB에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 증가된 친화도를 가지는 FcγRIIIA에 결합하고, 비슷한 분자에 비하여 감소된 친화도를 가지는 FcγRIIB에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 감소된 FcγRIIIA/FcγRIIB 평형 해리 상수(KD)의 비율을 가진다.In one embodiment, Fc variants of the invention bind to FcγRIIIA with increased affinity compared to similar molecules. In another embodiment, the Fc variants of the invention bind to FcγRIIIA with increased affinity and to FcγRIIB with unchanged binding affinity compared to similar molecules. In another embodiment, the Fc variants of the invention bind to FcγRIIIA with increased affinity and to FcγRIIB with reduced affinity compared to similar molecules. In another embodiment, the Fc variants of the invention have a reduced ratio of FcγRIIIA / FcγRIIB equilibrium dissociation constant (KD) compared to similar molecules.

하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 향상된 결합을 가진다. 다른 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자의 Fc 리단드에 대한 친화도보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 높은 Fc 리간드에 대한 친화도를 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체에 대한 향상된 결합을 가진다. 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 향상된 결합을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체 FcRn에 대한 향상된 결합을 가진다. 또 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 C1q에 대한 향상된 결합을 가진다.In one embodiment, the Fc variant protein has enhanced binding to one or more Fc ligands as compared to similar molecules. In other embodiments, the Fc variant protein is at least 2 times, or at least 3 times, or at least 5 times, or at least 7 times, or at least 10 times, or at least 20 times, or at least the affinity of the similar molecule to the Fc bound. Affinity for an Fc ligand that is 30, or at least 40, or at least 50, or at least 60, or at least 70, or at least 80, or at least 90, or at least 100, or at least 200 times higher Have In specific embodiments, the Fc variant protein has improved binding to the Fc receptor. In another specific embodiment, the Fc variant protein has improved binding to the Fc receptor FcγRIIIA. In another specific embodiment, the Fc variant protein has improved binding to the Fc receptor FcRn. In another specific embodiment, the Fc variant protein has improved binding to C1q compared to similar molecules.

다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 약 2배 내지 약 10배, 또는 약 5배 내지 약 50배, 또는 약 25배 내지 약 250배, 또는 약 100배 내지 약 500배, 또는 약 250배 내지 약 1000배 감소된 평형 해리 상수(KD)를 가진다. 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 2배 내지 10배, 또는 5배 내지 50배, 또는 25배 내지 250배, 또는 100배 내지 500배, 또는 250배 내지 1000배 감소된 평형 해리 상수(KD)를 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체는 비슷한 분자에 비하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 a least 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배, 또는 적어도 400배, 또는 적어도 600배만큼 감소된 FcγRIIIA에 대한 평형 해리 상수(KD)를 가진다.In other embodiments, the Fc variants of the invention are about 2 to about 10 times, or about 5 to about 50 times, or about 25 to about 250 times, or about 100 to about 500 times, or similar to a similar molecule, or It has an equilibrium dissociation constant (KD) of about 250 to about 1000 times reduced. In other embodiments, the Fc variants of the invention have an equilibrium reduced by 2 to 10 times, or 5 to 50 times, or 25 to 250 times, or 100 to 500 times, or 250 to 1000 times compared to similar molecules. It has a dissociation constant (KD). In specific embodiments, the Fc variant is at least 2 times, or at least 3 times, or at least 5 times, or at least 7 times, or a at least 10 times, or at least 20 times, or at least 30 times, or at least 40 times as compared to similar molecules. Or FcγRIIIA reduced by at least 50 times, or at least 60 times, or at least 70 times, or at least 80 times, or at least 90 times, or at least 100 times, or at least 200 times, or at least 400 times, or at least 600 times. For the equilibrium dissociation constant (KD).

Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 혈청 반감기를 가진다.The serum half-life of a protein comprising an Fc region can be increased by increasing the binding affinity of the Fc region for FcRn. In one embodiment, the Fc variant protein has improved serum half-life compared to similar molecules.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예컨대, 자연 살생(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 Ig는 이러한 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 그 뒤에 표적 세포를 세포독소로 살생할 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. 높은-친화도 IgG 항체, 예를 들어 표적 세포의 표면으로 지정되는 IgG 항체는 세포독성 세포로 "무장"하고 이러한 살해를 할 수 있다. 표적 세포의 융해는 세포외이고, 직접적인 세포-대-세포 접촉을 필요로 하며, 보체를 수반하지 않는다. 항체에 더하여, 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 가지는 Fc 영역을 포함하는 다른 단백질, 구체적으로 Fc 융합 단백질은 세포-매개 세포독성에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 단순화를 위하여 Fc 융합 단백질의 활성에 의한 세포-매개 세포독성도 또한 본원에서 ADCC 활성으로 불린다."Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity" or "ADCC" refers to secreted bound on Fc receptors (FcRs) present on certain cytotoxic cells (eg, natural killer (NK) cells, neutrophils, and macrophages). Ig refers to a form of cytotoxicity that enables these cytotoxic effector cells to specifically bind antigen-bearing target cells and subsequently kill the target cells with cytotoxins. High-affinity IgG antibodies, eg, IgG antibodies directed to the surface of target cells, can be "armed" with cytotoxic cells and capable of such killing. Fusion of target cells is extracellular, requires direct cell-to-cell contact, and does not involve complement. In addition to the antibody, other proteins, including Fc regions, in particular Fc fusion proteins, which have the ability to specifically bind antigen-bearing target cells, may affect cell-mediated cytotoxicity. Cell-mediated cytotoxicity by the activity of the Fc fusion protein for simplicity is also referred to herein as ADCC activity.

ADCC에 의해 표적 세포의 융해를 매개하는 임의의 특정 Fc 변이체 단백질의 능력이 분석될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위하여 관심의 Fc 변이체 단백질은 면역 효과기 세포와 조합하여 표적 세포에 첨가되고, 이는 표적 세포의 세포융해를 초래하는 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있다. 세포융해는 일반적으로 융해된 세포로부터의 표지(예컨대, 방사성 기질, 형광 염료 또는 자연적 세포 내 단백질)의 방출에 의해 검출된다. 이러한 분석법에 유용한 효과기 세포는 말초 혈책 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살생(NK) 세포를 포함한다. 세포 내 ADCC 분석법의 구체적인 예는 문헌[Wisecarver et al., 1985, 79:277-282; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med, 166:1351-1361]; [Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods, 258:183-191]; 및 [Patel et al., 1995, J Immunol Methods, 184:29-38]에 기술되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심의 Fc 변이체 단백질의 ADCC 활성은 예컨대 문헌[Clynes et al., 1998, PNAS USA, 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체 내 평가될 수 있다.The ability of any particular Fc variant protein to mediate fusion of target cells can be analyzed by ADCC. To assess ADCC activity, the Fc variant protein of interest is added to a target cell in combination with an immune effector cell, which can be activated by an antigenic antibody complex that results in cytolysis of the target cell. Cytolysis is generally detected by the release of labels (eg, radioactive substrates, fluorescent dyes, or natural intracellular proteins) from fused cells. Effector cells useful for such assays include peripheral blood monocytes (PBMC) and natural killer (NK) cells. Specific examples of intracellular ADCC assays are described in Wisecarver et al., 1985, 79: 277-282; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med, 166: 1351-1361; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods, 258: 183-191; And Patel et al., 1995, J Immunol Methods, 184: 29-38. Alternatively or additionally, ADCC activity of the Fc variant protein of interest can be assessed in vivo in an animal model such as disclosed in Clynes et al., 1998, PNAS USA, 95: 652-656.

하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성을 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자의 ADCC 활성보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 높은 ADCC 활성을 가진다. 다른 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대하여 향상된 결합을 가지고 비슷한 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성을 가진다. 다른 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성 및 향상된 혈청 반감기를 가진다.In one embodiment, the Fc variant protein has enhanced ADCC activity compared to similar molecules. In specific embodiments, the Fc variant protein has ADCC activity at least 2 times, or at least 3 times, or at least 5 times, or at least 10 times, or at least 50 times, or at least 100 times higher than the ADCC activity of similar molecules. In another specific embodiment, the Fc variant protein has improved binding to the Fc receptor FcγRIIIA and has improved ADCC activity compared to similar molecules. In other embodiments, the Fc variant protein has improved ADCC activity and improved serum half-life compared to similar molecules.

"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 융해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 제1 성분(C1q)의 분자, 예를 들어 동족 항원과 복합체화된 항체에의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예컨대 문헌[Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163]에 기술된 바와 같은 CDC 분석이 실행될 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 CDC 활성을 가진다. 구체적인 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자의 CDC 활성보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 높은 CDC 활성을 가진다. 다른 양태에서, Fc 변이체 단백질은 비슷한 분자에 비하여 향상된 CDC 활성 및 향상된 혈청 반감기를 가진다."Complement dependent cytotoxicity" and "CDC" refer to the fusion of target cells in the presence of complement. The complement activation pathway is initiated by binding of the first component (C1q) of the complement system to an antibody complexed with a molecule, eg, a cognate antigen. To assess complement activation, see, eg, Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202: 163, can be performed CDC analysis as described. In one embodiment, the Fc variant protein has enhanced CDC activity compared to similar molecules. In specific embodiments, the Fc variant protein has a CDC activity that is at least 2 times, or at least 3 times, or at least 5 times, or at least 10 times, or at least 50 times, or at least 100 times higher than the CDC activity of similar molecules. In other embodiments, the Fc variant protein has improved CDC activity and improved serum half-life compared to similar molecules.

하나의 양태에서, 본 발명은 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 234, 235, 236, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333 및 334로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 선택적으로, Fc 영역은 당업자에게 알려지거나(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공개 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 및 WO 05/040217) 또는 본원에 개시된 바와 같은 첨가 및/또는 대안적인 위치에서 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.In one embodiment, the invention provides a formulation wherein the Fc region is 234, 235, 236, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, numbered by the EU index as set out in Kabat. Group consisting of 252, 254, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333 and 334 Amino acid residues not naturally occurring at one or more positions selected from: Optionally, the Fc region is known to those skilled in the art (eg, US Pat. Nos. 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; PCT Patent Publication WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 and WO 05/040217) or amino acid residues which do not occur naturally in addition and / or alternative positions as disclosed herein.

구체적인 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247V, 247G, 252Y, 254T, 256E, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 269H, 269Y, 269F, 269R, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 313F, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 및 332A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 선택적으로 Fc 영역은 당업자에게 알려진(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공개 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 및 WO 05/040217 참조) 추가적 및/또는 대안적인 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.In a specific embodiment, the invention provides an Fc variant protein formulation wherein the Fc region is 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, numbered by EU index as set out in Kabat. 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247V, 247G, 252Y, 254T, 256E, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I , 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A , 266M, 267Q, 267L, 269H, 269Y, 269F, 269R, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 298F , 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 313F, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D , 32 8N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332W At least one non-naturally occurring amino acid residue selected from the group consisting of 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, and 332A. Optionally, the Fc region is known to those skilled in the art (eg, US Pat. Nos. 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; PCT Patent Publication WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04 / 035752 and WO 05/040217) additional and / or alternative naturally occurring amino acid residues.

다른 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 239, 330 및 332로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 적어도 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 포함한다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 252, 254 및 256로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 추가적인 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제형을 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 포함하고, 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 자연적으로 생성되지 않는 아미노산은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호가 붙여진 252Y, 254T 및 256E로 이루어진 군으로부터 선택된다.In another aspect, the present invention provides an Fc variant protein formulation, wherein the Fc region is at least naturally occurring at one or more positions selected from the group consisting of 239, 330, and 332 numbered by EU index as set forth in Kabat. Includes amino acids that are not produced. In a specific embodiment, the invention provides an Fc variant protein formulation wherein the Fc region is not at least one naturally occurring selected from the group consisting of 239D, 330L and 332E, numbered by EU index as set out in Kabat. Does not contain amino acids. Optionally, the Fc region may further comprise additional naturally occurring amino acids at one or more positions selected from the group consisting of 252, 254 and 256, numbered by the EU index as set forth in Kabat. In a specific embodiment, the invention provides an Fc variant protein formulation wherein the Fc region is not at least one naturally occurring selected from the group consisting of 239D, 330L and 332E, numbered by EU index as set out in Kabat. And at least one non-naturally occurring amino acid at one or more positions is selected from the group consisting of 252Y, 254T and 256E, numbered by EU index as set forth in Kabat.

하나의 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 예시적인 Fc 변이체를 개시하는 문헌[Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15:637-40]; [Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564]; [Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657-2662]; [Lund et al, 1992, Mol. Immunol., 29:53-59]; [Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543]; [Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA, 92:11980-11984]; [Jefferis et al, 1995, Immunol Lett., 44:111-117]; [Lund et al., 1995, Faseb J., 9:115-119]; [Jefferis et al, 1996, Immunol Lett., 54:101-104]; [Lund et al, 1996, J. Immunol., 157:4963-4969]; [Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624]; [Idusogie et al, 2000, J. Immunol., 164:4178-4184]; [Reddy et al, 2000, J. Immunol., 164:1925-1933]; [Xu et al., 2000, Cell Immunol., 200:16-26]; [Idusogie et al, 2001, J. Immunol., 166:2571-2575]; [Shields et al., 2001, J Biol. Chem., 276:6591-6604]; [Jefferis et al, 2002, Immunol Lett., 82:57-65]; [Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans., 30:487-490]; 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; 및 WO 04/063351에 개시된 것과 같은 다른 공지된 Fc 변이체와 조합될 수 있다.In one embodiment, Fc variants of the invention are described in Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15: 637-40; Duncan et al, 1988, Nature 332: 563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol., 147: 2657-2662; Lund et al, 1992, Mol. Immunol., 29: 53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57: 1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA, 92: 11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett., 44: 111-117; Lund et al., 1995, Faseb J., 9: 115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett., 54: 101-104; Lund et al, 1996, J. Immunol., 157: 4963-4969; Armor et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613-2624; Idusogie et al, 2000, J. Immunol., 164: 4178-4184; Redd et al, 2000, J. Immunol., 164: 1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol., 200: 16-26; Idusogie et al, 2001, J. Immunol., 166: 2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol. Chem., 276: 6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett., 82: 57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans., 30: 487-490; U.S. Patent No. 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 5,677,425; 6,165,745; 6,165,745; No. 6,277,375; 5,869,046; 5,869,046; 6,121,022; 6,121,022; 5,624,821; 5,624,821; 5,648,260; 5,648,260; No. 6,528,624; 6,194,551; 6,194,551; No. 6,737,056; No. 6,821,505; No. 6,277,375; US Patent Publication 2004/0002587 and PCT Publication WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; And other known Fc variants such as those disclosed in WO 04/063351.

자연적으로 생성되지 않는 Fc 영역을 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 결실은 돌연변이유발 방법, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 위치-지정 돌연변이유발(예컨대, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985)), PCR 돌연변이유발(예컨대, Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), 및 카세트 돌연변이유발(예컨대, Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985))에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 위치-지정 돌연변이유발은 중복-신장 PCR 방법(예컨대, Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989))에 의해 실행된다. 대안적으로, 중복-신장 PCR의 기법(예컨대, 상기한 Higuchi)은 표적 서열(출발 DNA)로 임의의 원하는 돌연변이(들)를 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중복-신장 방법에서 PCR의 제1 라운드는 외부 프라이머(프라이머 1) 및 내부 돌연변이유발 프라이머(프라이머 3)을 이용하여, 그리고 별개로 제2 외부 프라이머(프라이머 4) 및 내부 프라이머(프라이머 2)를 이용하여 표적 서열을 증폭시켜 2개의 PCR 분절(분절 A 및 B)을 생성하는 단계를 수반한다. 내부 돌연변이유발 프라이머(프라이머 3)는 원하는 돌연변이(들)를 특화시키는 표적 서열에 대한 미스매치(mismatch)를 포함하도록 설계된다. PCR의 제2 라운드에서, PCR의 제1 라운드의 생성물(분절 A 및 B)은 2개의 외부 프라이머(프라이머 1 및 4)를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 전장 PCR 분절(분절 C)은 제한 효소를 이용하여 절단되고, 생성된 제한 절편은 적절한 벡터로 클로닝된다. 돌연변이유발의 제1 단계로서, 출발 DNA(예컨대, Fc 융합 단백질, 항체 또는 간단히 Fc 영역을 암호화함)는 돌연변이유발 벡터로 작동가능하게 클로닝된다. 프라이머는 원하는 아미노산 치환을 반영하도록 설계된다. 변이체 Fc 영역의 생성에 유용한 기타 예시적인 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375; 5,869,046; 6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351, 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있음).Methods of generating Fc regions that do not occur naturally are known in the art. For example, amino acid substitutions and / or deletions may be mutagenesis methods, such as but not limited to site-directed mutagenesis (eg, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985). ), PCR mutagenesis (eg, Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), and cassette mutagenesis (eg, Wells et al) , Gene, 34: 315-323 (1985)). Preferably, site-directed mutagenesis is performed by overlap-extension PCR methods (eg, Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989)). Is executed. Alternatively, techniques of overlap-extension PCR (eg Higuchi, supra) can be used to introduce any desired mutation (s) into the target sequence (starting DNA). For example, in the overlap-extension method, the first round of PCR uses an outer primer (primer 1) and an internal mutagenesis primer (primer 3), and separately a second outer primer (primer 4) and an inner primer (primer). A) to amplify the target sequence to generate two PCR segments (segments A and B). Internal mutagenesis primers (primer 3) are designed to include mismatches to the target sequence that characterize the desired mutation (s). In the second round of PCR, the products of the first round of PCR (segments A and B) are amplified by PCR using two external primers (primers 1 and 4). The resulting full length PCR fragment (Segment C) is cleaved using a restriction enzyme and the resulting restriction fragment is cloned into the appropriate vector. As a first step in mutagenesis, the starting DNA (eg, an Fc fusion protein, antibody or simply encoding an Fc region) is operably cloned into a mutagenesis vector. Primers are designed to reflect the desired amino acid substitutions. Other exemplary methods useful for generating variant Fc regions are known in the art (eg, US Pat. Nos. 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; US Patent Publication 2004/0002587 and PCT Publication WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351, the entire contents of which are incorporated herein by reference).

일부 양태에서, Fc 변이체 단백질은 하나 이상의 조작된 글리코폼(glycoform), 즉 Fc 영역을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 탄수화물 조성무을 포함한다. 조작된 글리코폼은 다양한 목적, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 효과기 기능을 향상 또는 감소시키는 것에 유용할 수 있다. 조작된 글리코폼은 본원에 개시된 방법 및 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여, 예를 들어 조작되거나 또는 변이체 발현 종류를 사용함으로써, 글리코실화에 영향을 미치는 성장 조건 또는 배지를 사용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III(GnTI11)와 공동 발현에 의하여, 다양한 유기체 또는 다양한 유기에 유래의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현함으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 조작된 글리코폼을 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만 문헌[Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17:176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng., 74:288-294]; [Shields et al., 2002, J Biol. Chem., 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol. Chem., 278:3466-3473]; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 출원 일련번호 제10/277,370호; 미국 출원 일련 번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1에 기술된 것; Potillegent(상표명) 기술(Biowa, Inc., 미국 뉴저지주 프린스턴 소재); GlycoMAb(상표명) 글리코실화 조작 기술(GLYCART(상표명) biotechnology AG, 스위스 취리히 소재)을 포함한다. 또한 예컨대 WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; 문헌[Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]을 참조할 수 있다.In some embodiments, the Fc variant protein comprises one or more engineered glycoforms, ie carbohydrate compositions covalently attached to a molecule comprising an Fc region. Engineered glycoforms can be useful for a variety of purposes, such as, but not limited to, enhancing or reducing effector function. The engineered glycoforms may be prepared by one or more enzymes, For example by co-expression with DI N-acetylglucosaminyltransferase III (GnTI11), by expressing a molecule comprising the Fc region in cell lines derived from various organisms or various organisms, or a molecule comprising an Fc region Can be produced by modifying the carbohydrate (s) after it is expressed. Methods for generating engineered glycoforms are known in the art and include, but are not limited to, Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17: 176-180; Davises et al., 20017 Biotechnol Bioeng., 74: 288-294; Shields et al., 2002, J Biol. Chem., 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol. Chem., 278: 3466-3473; US Patent No. 6,602,684; US Application Serial No. 10 / 277,370; US Application Serial No. 10 / 113,929; PCT WO 00 / 61739A1; PCT WO 01 / 292246A1; PCT WO 02/311140 A1; Those described in PCT WO 02 / 30954A1; Potillegent ™ technology (Biowa, Inc., Princeton, NJ); GlycoMAb ™ glycosylation engineering technology (GLYCART ™ biotechnology AG, Zurich, Switzerland). See also WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; See Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법Polynucleotides, Vectors, Host Cells, and Recombinant Methods

본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.The invention further provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an antibody of the invention or an epitope-binding fragment thereof.

본 발명은 또한 CD20에 결합할 수 있고 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 염격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 6x SSC, 0.5% SDS, 5x 덴하르트 용액, 및 100 ㎎ / ㎖ 열 변성 연어 정자 DNA에서 2시간 동안 60℃에서 예비혼성화; 18시간 동안 60℃에서 혼성화; 4x SSC, 0.5% SDS, 0.1% 파이로인산나트륨에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척하고, 2x SSC, 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척.The invention also encompasses polynucleotides encoding polypeptides that can bind to CD20 and hybridize under stringent hybridization conditions to the polynucleotides encoding the antibodies of the invention, wherein the stringent hybridization conditions include: 6x SSC , Prehybridization at 60 ° C. for 2 hours in 0.5% SDS, 5 × Denhardt solution, and 100 mg / ml heat denatured salmon sperm DNA; Hybridization at 60 ° C. for 18 hours; Wash twice at 60 ° C. for 30 minutes in 4 × SSC, 0.5% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate and twice at 60 ° C. for 30 minutes in 2 × SSC, 0.1% SDS.

당업계에 공지된 방법으로 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다면, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(예컨대, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기술된 바와 같음)로부터 집합될 수 있으며, 이는 간단하게 항체를 암호화하는 서열의 일부분을 포함하는 중복되는 올리고뉴클레오티드의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 그 다음 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 수반한다.Polynucleotides can be obtained by methods known in the art and the nucleotide sequence of the polynucleotide can be determined. For example, if the nucleotide sequence of the antibody is known, the polynucleotide encoding the antibody may be a chemically synthesized oligonucleotide (eg, Kutmeier et al., 1994, BioTechniques). 17: 242), which is simply a synthesis of overlapping oligonucleotides comprising a portion of the sequence encoding the antibody, annealing and ligation of such oligonucleotides, followed by ligation by PCR. Followed by amplification of the oligonucleotide.

항체를 암호화라는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 재조합 벡터의 조립 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 가변 도메인의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들 중 임의의 것의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.Methods of assembly of recombinant vectors comprising sequences encoding the antibody and appropriate transcriptional and translational control signals are well known in the art. Such methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Accordingly, the present invention comprises a nucleotide sequence encoding an epitope-binding fragment of an antibody molecule of the invention, or a heavy or light chain thereof, or a heavy or light chain of a variable domain, or any of these, operably linked to a promoter. Provide a replicable vector.

재조합 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 그 다음 형질감염된 세포는 종래의 기법에 의해 배양되어 본 발명의 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 비상동 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체, 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 바람작한 양태에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 암호화하는 벡터는 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있다.The recombinant vector is delivered to the host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce the antibodies of the invention. Accordingly, the invention includes host cells comprising a polynucleotide encoding an antibody of the invention, or an epitope-binding fragment thereof, operably linked to a nonhomologous promoter. In a preferred embodiment, vectors encoding both heavy and light chains can be co-expressed in host cells for the expression of whole immunoglobulin molecules.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 발현하는데 이용될 수 있다, 이러한 숙주-발현 시스템은 관심의 암호화 서열이 생성되고 그 후 정제될 수 있게 하는 비히클을 나타내고, 또한 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질변환 또는 형질감염될 때 동일계 내에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 이에 한정되는 것은 아니지만 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질변환된 미생물, 예를 들어 박테리아(예컨대, 대장균 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질변환된 효모(예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 피키아(Pichia)); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질변환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구조체가 숨어있는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함한다.Various host-expression vector systems can be used to express the antibody molecules of the invention, which host-expression systems represent vehicles that allow the coding sequence of interest to be generated and then purified, and also with appropriate nucleotide coding sequences. Cells capable of expressing the antibody molecule of the present invention in situ when transformed or transfected are shown. These include, but are not limited to, microorganisms transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors containing sequences encoding antibodies, such as bacteria (eg, E. coli and B. subtilis ). ); Yeast transformed with a recombinant yeast expression vector comprising a sequence encoding an antibody (eg, Saccharomyces and Pichia ); Insect cell systems infected with recombinant viral expression vectors (eg, baculovirus) comprising sequences encoding antibodies; Plant cells infected with a recombinant viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV); tobacco mosaic virus (TMV)) comprising a sequence encoding an antibody or transformed with a recombinant plasmid expression vector (eg Ti plasmid) system; Or a recombinant expression construct comprising a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter) Mammalian cell systems (eg, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 cells).

특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위하여 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스 유래의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 요소(major intermediate early gene promoter element)와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포가 항체에 대하여 효과적인 발현 시스템이다(예를 들어 문헌[Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2]에 개시된 바와 같음).Especially for the expression of the whole recombinant antibody molecule is preferably Escherichia bacterial cells, more preferably eukaryotic cells, such as the coli) is used for expression of recombinant antibody molecules. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) together with vectors such as major intermediate early gene promoter elements derived from human cytomegalovirus are effective expression systems for antibodies ( For example, as disclosed in Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio / Technology 8: 2).

재조합 단백질의 장기간 동안 고수율 생산을 위하여 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 전자 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적인 마커에 의해 제어된 DNA로 형질변환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 강화 배지에서 1~2일 동안 성장시킬 수 있으며, 그 다음 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 중 선택적인 마커는 선별에 대한 저항성을 제공하고, 세포가 플라스미드를 크로모좀으로 안정적으로 통합시킬 수 있게 하며, 성장하여 차례로 세포주로 클로닝되고 확장될 수 있는 중심을 형성한다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.Stable expression is desirable for high yield production of the recombinant protein for long periods of time. For example, cell lines that stably express the antibody molecule can be engineered. Rather than using expression vectors containing viral origins of replication, host cells are transfected with DNA controlled by appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, electron terminators, polyadenylation sites, etc.) and selective markers. Can be converted. After introduction of the foreign DNA, the engineered cells can be grown for 1-2 days in enriched medium and then replaced with selection medium. Selective markers in recombinant plasmids provide resistance to selection, allow cells to stably integrate the plasmid into chromosomes, and grow to form a center that can be cloned and expanded in turn into cell lines. Such methods can be advantageously used to engineer cell lines expressing antibody molecules. Such engineered cell lines may be particularly useful in the screening and evaluation of compounds that interact directly or indirectly with antibody molecules.

일단 본 발명의 항체 분자가 재조합으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제에 대하여 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 뒤의 특이적인 항원에 대한 친화도에 의한 크로마토그래피, 및 분립(sizing) 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도(differential solubility), 또는 단백질의 정제에 대하여 임의의 기타 표준 기법에 의하여 정제될 수 있다. 이와 관련하여, 미국 특허 제7,538,195호는 본 개시 내용에 언급되어 있으며, 이의 교시 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.Once the antibody molecule of the invention is recombinantly expressed, any method known in the art for purification of immunoglobulin molecules, e.g. chromatography (e.g., ion exchange, affinity, in particular to a specific antigen after protein A) Chromatography by affinity for, and sizing column chromatography), centrifugation, differential solubility, or purification of proteins can be purified by any other standard technique. In this regard, US Pat. No. 7,538,195 is mentioned in the present disclosure, the teachings of which are incorporated herein by reference in their entirety.

다른 양태에서, 다양한 항체 및 항체 절편뿐만 아니라 항체 모방체는 특정 세트의 CDR 옆에 위치하는 가변 및 불변 영역 서열 내에서 돌연변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 Ab의 상이한 부류가 상이한 중쇄의 치환에 의해 주어진 세트의 CDR에 대하여 가능하며, 이것에 의하여, 예를 들어 IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE 항체 유형 및 아이소타입이 생성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범주 내에 속하는 인공적인 항체는 전체적 합성 골격 내에 주어진 세트의 CDR 내에 삽입함으로써 생성될 수 있다. 용어 "가변"은 본원에서 항체 사이의 서열에서 상이한 가변 도메인의 특정 부분을 기술하는데 사용되며, 항원에 대하여 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성은 보통 항체의 가변 도메인을 통해 고르게 분포된다. 전형적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3가지 분절 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다의 초가변 영역에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분은 골격(FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 CDR에 연결된 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 골격 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에서는 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들어, 문헌[E. A. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, 1991, NIH] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합함에 있어서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.In other embodiments, various antibodies and antibody fragments, as well as antibody mimetics, can be readily produced by mutations, deletions, and / or insertions within variable and constant region sequences located next to a particular set of CDRs. Thus, for example, different classes of Ab are possible for a set of CDRs given by substitution of different heavy chains, whereby, for example, IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE antibody types and isotypes Can be generated. Similarly, artificial antibodies within the scope of the present invention can be generated by inserting into a given set of CDRs within the overall synthetic backbone. The term “variable” is used herein to describe specific portions of variable domains that differ in the sequences between the antibodies and in the binding and specificity of each particular antibody to the antigen. However, the variability is usually evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in the hypervariable regions of three segments or both light and heavy chain variable domains, typically called complementarity determining regions (CDRs). The more conserved portions of the variable domains are called the backbone (FR). The variable domains of the heavy and light chains each comprise four backbone regions that adopt predominantly beta-sheet sequences linked to three CDRs, which form a loop connecting the beta-sheet structures, and in some cases beta-sheet structures To form part of. In each chain the CDRs are bound in close proximity by the FR region and together with the CDRs from the other chain contribute to the formation of the antigen binding site of the antibody (see, eg, EA Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest , fifth edition, 1991, NIH). The constant domains are not directly involved in binding the antibody to the antigen, but represent the participation of the antibody in various effector functions, eg, antibody-dependent cytotoxicity.

인간화 항체, 또는 다른 포유동물에 의한 비거부에 대해 적응된 항체는 몇몇 기술, 예를 들어 재표면화 및 CDR 그래프팅을 사용하여 생성될 수 있다. 재표면화 기술에서, 분자 모델링, 통계적 분석 및 돌연변이유발은 표적 숙주의 공지된 항체의 표면과 유사한 가변 영역의 비-CDR 표면을 조정하도록 결합된다. 항체의 재표면화 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내 항체의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,639,641호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. CDR 그래프팅 기술에서, 뮤린 중쇄 및 경쇄 CDR은 완전 인간 골격 서열로 그래프팅된다.Humanized antibodies, or antibodies adapted for non-rejection by other mammals, can be generated using several techniques, such as resurfacing and CDR grafting. In resurfacing techniques, molecular modeling, statistical analysis and mutagenesis are combined to mediate non-CDR surfaces of variable regions similar to those of known antibodies of the target host. Resurfacing strategies and methods of antibodies, and other methods of reducing immunogenicity of antibodies in different hosts, are described, for example, in US Pat. No. 5,639,641, which is incorporated herein by reference in its entirety. In CDR grafting techniques, murine heavy and light chain CDRs are grafted into fully human framework sequences.

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 항체의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물은 항체의 결합 특징과 비슷한 결합 특징을 가지며, 예를 들어 키메라, 인간화 및 단일 사슬 항체뿐만 아니라 이의 절편을 포함한다. 이러한 기능적 동등물을 생성하는 예시적인 방법은 PCT 출원 WO 93/21319, 유럽 특허 출원 제239,400호; PCT 출원 WO 89/09622; 유럽 특허 출원 338,745; 및 유럽 특허 출원 EP　332,424에 개시되어 있으며, 이들은 각각 전체가 참조로 포함되어 있다.The invention also includes functional equivalents of the antibodies described herein. Functional equivalents have binding characteristics similar to those of antibodies, and include, for example, chimeric, humanized and single chain antibodies as well as fragments thereof. Exemplary methods for producing such functional equivalents are described in PCT Application WO 93/21319, European Patent Application No. 239,400; PCT Application WO 89/09622; European Patent Application 338,745; And European Patent Application EP # 332,424, each of which is incorporated by reference in its entirety.

기능적 동등물은 본 발명의 항체의 가변 또는 초가변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 서열에 적용되는 "실질적으로 동일한"은, 문헌[Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따라서 FASTA 검색 방법에 의하여 측정된 바와 같이, 다른 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 서열 동일성을 가지는 서열로서 본원에서 정의된다.Functional equivalents include polypeptides having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of the variable or hypervariable region of the antibody of the invention. “Substantially identical” as applied to amino acid sequences are described in Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988), at least about 90%, more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, and other amino acid sequences as measured by the FASTA search method; As defined herein, a sequence having 99% sequence identity.

키메라 항체는 바람직하게 인간 항체 불변 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 불변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터의 가변 영역의 서열로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 가변 영역을 가진다. 항체의 인간화 형태는, 예컨대 PCT 공개 제WO92/22653호에서와 같이, 인간 골격 도메인으로, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역을 치환함으로써 제조된다. 인간화 항체는 바람직하게 상응하는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 상보성 결정 영역(CDR) 이외에 불변 영역 및 가변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 CDR을 가진다.The chimeric antibody preferably has a constant region derived substantially or exclusively from human antibody constant regions, and a variable region derived substantially or exclusively from sequences of variable regions from mammals other than humans. Humanized forms of antibodies are prepared by substituting, for example, the complementarity determining regions of mouse antibodies with human skeletal domains, such as in PCT Publication No. WO92 / 22653. Humanized antibodies preferably have constant and variable regions, in addition to complementarity determining regions (CDRs) derived substantially or exclusively from corresponding human antibody regions, and CDRs derived substantially or exclusively from mammals other than humans.

또한 기능적 동등물은, 또한 단일-사슬 항체(scFv)로 알려진, 단일-사슬 항체 절편을 포함한다. 이러한 절편은, 하나 이상의 상호 연결 링커를 이용하여 또는 이용하지 않고 항체 가변 경쇄 서열(VL)의 적어도 하나의 절편에 묶인 항체 가변 중쇄 아미노산 서열(VH)의 적어도 하나의 절편을 포함한다. 일단 단일-사슬 항체 절편이 유래하는 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성을 유지하기 위하여 연결된다면, 이러한 링커는 (VL) 및 (VH) 도메인의 적절한 3차원 접힘이 일어나는 것을 확실히 하도록 선택되는 짧고 유연한 펩티드일 수 있다. 일반적으로, (VL) 또는 (VH) 서열의 카복실 말단은 상보적인 (VL) 및 (VH) 서열의 아미노산 말단에 이러한 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 단일-사슬 항체 절편은 분자 클로닝, 항체 파지 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 기법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단백질은 진핵 세포 또는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아에서 생성될 수 있다.Functional equivalents also include single-chain antibody fragments, also known as single-chain antibodies (scFv). Such segments include at least one segment of an antibody variable heavy chain amino acid sequence (V H ) that is bound to at least one segment of antibody variable light chain sequence (V L ) with or without one or more interconnecting linkers. Once the single-chain antibody fragments are linked to maintain the target molecule binding-specificity of the entire antibody from which they are derived, these linkers are short and selected to ensure proper three-dimensional folding of the (V L ) and (V H ) domains occurs. It may be a flexible peptide. In general, (V L) or (V H) of the carboxyl-terminal sequence can be coupled in a complementary (V L) and (V H) shared by such a peptide linker to the amino terminus of the sequence ever. Single-chain antibody fragments can be generated by molecular cloning, antibody phage display libraries, or similar techniques. Such proteins may be produced in eukaryotic or prokaryotic cells, such as bacteria.

단일-사슬 항체 절편은 본 명세서에 기술된 온전한 항체의 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 하나를 가지는 아미노산 서열을 포함하지만, 이러한 항체의 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결핍되어 있다. 이러한 불변 도메인은 항원 결합을 위하여 필요하지 않지만, 온전한 항체의 구조의 주요 부분을 구성한다. 그러므로 단일-사슬 항체 절편은 불변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체의 사용과 연관된 문제점의 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일-사슬 항체 절편은 생물학적 분자와 중쇄 불변 영역, 또는 다른 원치 않는 생물학적 활성 사이의 원하지 않는 상호작용에서 자유로운 경향이 있다. 추가적으로, 단일-사슬 항체 절편은 온전한 또는 전체 항체보다 상당히 더 작고, 따라서 온전한 항체보다 더 높은 모세혈관 투과성을 가져서, 단일-사슬 항체 절편이 표적 항원-결합 부위에 보다 효과적으로 국재화되고 이에 결합될 수 있게 할 수 있다. 또한, 항체 절편은 원핵 세포에서 비교적 대규모로 생성될 수 있으며, 따라서 이의 생성을 용이하게 한다. 또한, 단일-사슬 항체 절편의 비교적 작은 크기는 이 절편이 온전한 항체보다 수용체에서 면역 반응을 자극할 가능성이 더 낮게 한다.Single-chain antibody fragments comprise an amino acid sequence having at least one of a variable region or complementarity determining region (CDR) of an intact antibody described herein, but lacking some or all of the constant domains of such antibodies. Such constant domains are not required for antigen binding but constitute a major part of the structure of an intact antibody. Thus, single-chain antibody fragments can overcome some of the problems associated with the use of antibodies comprising some or all of the constant domains. For example, single-chain antibody fragments tend to be free from unwanted interactions between biological molecules and heavy chain constant regions, or other unwanted biological activity. In addition, single-chain antibody fragments are significantly smaller than intact or whole antibodies, and thus have higher capillary permeability than intact antibodies, so that single-chain antibody fragments can be more effectively localized and bound to the target antigen-binding site. You can do that. In addition, antibody fragments can be produced on a relatively large scale in prokaryotic cells, thus facilitating their production. In addition, the relatively small size of single-chain antibody fragments makes it less likely that these fragments will stimulate an immune response at the receptor than intact antibodies.

본원에 기술되어 있는 항-CD20 항체 및 이의 재표면화 또는 인간화 변이체에 대한 아미노산 및 핵산 서열의 지식은, 또한 인간 CD20에 결합하는 많은 항체를 개발하는데 사용될 수 있다. 몇몇 연구는, 1차 항체 서열의 지식을 기초로 하여, 결합 및 발현 수준과 같은 특성에 대하여 항체의 서열 중 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변화를 도입한 효과를 조사하였다(예컨대, 문헌[Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol . Biol ., 254, 392-403]; [Rader, C. et al., 1998, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 95, 8910-8915]; [Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539]).Knowledge of amino acid and nucleic acid sequences for the anti-CD20 antibodies and resurfacing or humanized variants thereof described herein can also be used to develop many antibodies that bind to human CD20. Some studies have investigated the effect of introducing one or more amino acid changes at various positions in an antibody's sequence on properties such as binding and expression levels, based on knowledge of primary antibody sequences (eg, Yang, WP). et al., 1995, J. Mol . Biol . , 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 95, 8910-8915; Vaughan , TJ et al., 1998, Nature Biotechnology , 16, 535-539].

이들 연구에서, 1차 항체의 변이체는, 올리고뉴클레오티드-매개 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR, DNA 셔플링(DNA shuffling)과 같은 방법, 또는 E. coli의 돌연변이 유발 유전자-균주를 사용하여, CDR1, CDR2, CDR3, 또는 골격 영역에서 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 생성되었다(Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in " Phage Display of Peptides and Proteins ", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). 1차 항체의 서열을 변화시키는 이러한 방법은 2차 항체의 친화도를 개선시켰다(예컨대, Gram, H. et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97, 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol . Biol ., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol . Chem ., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol . Chem ., 276, 27622-27628).In these studies, the variants of the primary antibody may be selected from methods such as oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis, cassette mutagenesis, error-prone PCR, DNA shuffling, orE. coliMutagenic gene-strains were used to alter the sequence of heavy and light chain genes in CDR1, CDR2, CDR3, or framework regions (Vaughan, T. J. et al., 1998,Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in" Phage Display of Peptides and Proteins ", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). This method of changing the sequence of the primary antibody improved the affinity of the secondary antibody (eg, Gram, H. et al., 1992,Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000,Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97, 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996,Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996,J. Mol . Biol ., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002,J. Biol . Chem ., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001,J. Biol . Chem ., 276, 27622-27628).

내용이 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는 특허 출원 공개 20090246195에 기술된 방법과 같은, 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시키는 유사한 지정된 전략에 의하여, 본 발명에 기술된 항체 서열은 개선된 기능을 가지는 항-CD20 항체를 개발하는데 사용될 수 있다.By similar designated strategies for changing one or more amino acid residues of an antibody, such as the method described in patent application publication 20090246195, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety, the antibody sequences described herein have improved functionality. It can be used to develop anti-CD20 antibodies.

면역컨쥬게이트Immunoconjugate

본 발명은 또한 약물 또는 전구약물에 연결 또는 컨쥬게이트되는, 본원에 개시된 바와 같은 항-CD20 항체, 항체 절편, 기능적 동등물, 개선된 항체 및 이들의 양태를 포함하는, 컨쥬게이트(또한 본원에서 면역컨쥬게이트로도 불림)에 관한 것이다. 적절한 약물 또는 전구약물은 당업계에 알려져 있다. 바람직한 약물 또는 전구약물은 세포독성제이다. 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에 사용되는 세포독성제는 세포의 사멸을 초래하거나, 또는 세포 사멸을 유도하거나, 또는 일부 방식에서 세포 생존력을 감소시키는 임의의 화합물일 수 있고, 예를 들어 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카마이신 및 듀오카마이신 유사체, 에네딘, 예를 들어 칼리키아마이신, 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴, 토메이마이신 유도체 및 렙토마이신 유도체, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈플라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 몰폴리노 독소루비신을 포함한다. 보다 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁산, CC-1065 및 CC-1065 유사체이다. 특히 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체가 바람직하며, 이들 중 다수는 미국 특허 공개 제20070048314호, 제20060233814호, 제 20080003652호, 제20060155110호, 제20060128970호, 제20090182038호, 제20090042837호, 제20080233618호, 제20080119558호, 제20060099235호, 제20050272727호, 제20050203174호, 제20050112726호, 제20060182750호, 제20090202536호, 제20090142361호, 제20080249085호, 제20080226659호, 제20080171865호, 제20080171856호, 제20080171040호, 제20080145374호, 제20080114153호, 제20070270585호, 제20070269447호, 제20070264266호, 제20070009541호, 제20070009540호, 제20070009539호, 제20060167245호, 제20060127407호, 제20060084141호, 제20050276812호, 제20050169933호, 제20050152913호, 제20050113571호, 제20050003513호, 제20040241174호, 제20040235840호, 제20040120949호, 제20040014980호, 제20030157694호, 제20020156318호, 제20020156274호, 제20020001587호에 기술되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.The invention also provides conjugates (also referred to herein as immunosuppressive), including anti-CD20 antibodies, antibody fragments, functional equivalents, improved antibodies, and embodiments thereof that are linked or conjugated to a drug or prodrug. Also called a conjugate). Suitable drugs or prodrugs are known in the art. Preferred drugs or prodrugs are cytotoxic agents. Cytotoxic agents used in the cytotoxic conjugates of the invention may be any compound that results in cell death, induces cell death, or in some ways reduces cell viability, for example maytansi Nooid and maytansinoid analogues, benzodiazepines, taxoids, CC-1065 and CC-1065 analogues, duocarmycin and duocarmycin analogues, enedines such as calicheamicin, dolastatin and dolastatin analogs, For example auristatin, tomycin derivatives and leptomycin derivatives, methotrexate, cisplatin, carboplatin, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinplastin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil and morpholino Doxorubicin. More preferred cytotoxic agents are maytansinoids and maytansinoid analogs, benzodiazepines, taxanes, CC-1065 and CC-1065 analogs. Especially maytansinoids and maytansinoid analogues are preferred, many of which are described in US Patent Publication Nos. 20070048314, 20060233814, 20080003652, 20060155110, 20060128970, 20090182038, 20090042837, 20080233618, 20080119558, 20060099235, 20050272727, 20050203174, 20050112726, 20060182750, 20090202536, 20090142361, 20080249085, 20080226659, 20080171865, 20080171856 No. 20080171040, 20080145374, 20080114153, 20070270585, 20070269447, 20070264266, 20070009541, 20070009540, 20070009539, 20060167245, 20060127407, 20060084141, 20050276812, 20050169933, 20050152913, 20050113571, 20050003513, 20040241174, 20040235840, 20040120949, 20040014980, 20030157694, 20020156318, 20020156274, 20020001587 As described in It was, of these is information includes a full herein by reference.

이러한 컨쥬게이트는 항체 또는 기능적 동등물에 약물 또는 전구악물을 연결하기 위하여 연결 기를 사용함으로써 제조될 수 있다. 적당한 연결 기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기를 포함한다.Such conjugates may be prepared by using a linking group to link a drug or prodrug to an antibody or functional equivalent. Suitable linking groups are well known in the art and include, for example, disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, light labile groups, peptidase labile groups and esterase labile groups.

약물 또는 전구약물은, 예를 들어 이황화 결합을 통하여 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결될 수 있다. 링커 분자 또는 가교제는 항-CD20 항체 또는 그의 절편과 반응할 수 있는 반응성 화학적 기를 포함한다. 세포-결합제와의 반응을 위한 바람직한 반응성 화학적 기는 N-석신이미딜 에스터 및 N-설포석신이미딜 에스터이다. 추가적으로, 링커 분자는 반응성 화학적 기, 바람직하게는 약물과 반응하여 이황화 결합을 형성할 수 있는 다이티오피리딜 기를 포함한다. 특히 바람직한 링커 분자는, 공지된 방법을 사용하는, 예를 들어 N-석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP)(예컨대, 문헌[Carlsson et al., Biochem . J., 173: 723-737 (1978)] 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트(SPDB)(예컨대, 미국 특허 제4,563,304호 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)2-설포뷰타노에이트(설포-SPDB)(미국 공개 제20090274713호 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오) 펜타노에이트(SPP)(예컨대, CAS 등록 번호 341498-08-6 참조), 2-이미노티올란, 또는 아세틸석시닉 무수물 및 다른 반응성 가교제, 예를 들어 미국 특허 제6,913,748호(이는 본원에 전체가 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,563,304호; 문헌[Carlsson et al, Biochem. J., 173:723-737 (1978)]; [Blattler et al, Biochem., 24:1517-1524 (1985)]; [Lambert et al, Biochem., 22:3913-3920 (1983)]; [Klotz et al, Arch. Biochem. Biophys., 96:605 (1962)]; 및 [Liu et al, Biochem., 18:690 (1979)], [Blakey 및 Thorpe, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1:1-16 (1988)]; [Worrell et al, Anti-Cancer Drug Design, 1:179-184 (1986)]을 참조하며, 이의 개시 내용은 참조로 본원에 전체가 포함되어 있다. 예를 들어, 항체 또는 세포 결합제는 가교 시약을 이용하여 변형될 수 있으며, 그 다음 이렇게 유래한 유리 또는 보호된 티올 기를 포함하는 항체 또는 세포 결합제는 이황화- 또는 티올-포함 메이탄시노이드와 반응하여 컨쥬게이트를 생성한다. 컨쥬게이트는 크로마토그래피, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 HPLC, 크기-배제, 흡착, 이온 교환 및 친화도 포획, 투석 또는 접선 흐름 여과에 의해 정제될 수 있다.The drug or prodrug may be linked to an anti-CD20 antibody or fragment thereof, for example, via disulfide bonds. Linker molecules or crosslinkers include reactive chemical groups capable of reacting with anti-CD20 antibodies or fragments thereof. Preferred reactive chemical groups for reaction with cell-binding agents are N -succinimidyl esters and N -sulfosuccinimidyl esters. In addition, the linker molecule contains a reactive chemical group, preferably a dithiopyridyl group, which can react with the drug to form disulfide bonds. Particularly preferred linker molecules are, for example, N -succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) using known methods (see, eg, Carlsson et al., Biochem . J.). ., 173: 723-737 (1978) reference), N - see succinimidyl 4- (2-pyridyl die thio) benzoate view Gaetano (SPDB) (e. g., U.S. Patent No. 4,563,304), N - succinimide already Dyl 4- (2-pyridyldithio) 2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB) (see US Publication No. 20090274713), N -succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate ( SPP) (see, eg, CAS Registry Number 341498-08-6), 2-iminothiolane, or acetylsuccinic anhydride and other reactive crosslinking agents, such as, for example, US Pat. No. 6,913,748, which is incorporated herein by reference in its entirety. It includes those described in). See, for example, US Pat. No. 4,563,304; See Carlsson et al, Biochem. J., 173: 723-737 (1978); Blattler et al, Biochem., 24: 1517-1524 (1985); Lambert et al, Biochem., 22: 3913-3920 (1983); Klotz et al, Arch. Biochem. Biophys., 96: 605 (1962); And Liu et al, Biochem., 18: 690 (1979), Blakey and Thorpe, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1: 1-16 (1988); See Worrell et al, Anti-Cancer Drug Design, 1: 179-184 (1986), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. For example, the antibody or cell binding agent may be modified using a crosslinking reagent, and then the antibody or cell binding agent comprising the free or protected thiol group thus derived may react with disulfide- or thiol-containing maytansinoids Create a conjugate. The conjugate can be purified by chromatography, such as, but not limited to, HPLC, size-exclusion, adsorption, ion exchange and affinity capture, dialysis or tangential flow filtration.

본 발명의 다른 양태에서, 항-CD20 항체는 면역컨쥬게이트의 효력, 용해도 또는 효능을 향상시키는데 있어서 이황화 결합 및 폴리에틸렌 글리콜 스페이서를 통하여 세포독성 약물에 연결된다. 이러한 절단성 친수성 링커는 WO2009/0134976에 기술되어 있다. 이러한 링커 설계의 추가적인 이익은 항체-약물 컨쥬게이트의 원하는 높은 단량체 비율 및 최소한의 응집이다. 구체적으로 이러한 양태에서 세포-결합제의 컨쥬게이트가 고려되며, 암 세포에 대하여 비교적 높은 강력한 생물학적 활성을 보이고, 높은 컨쥬게이션 수율 및 최소한의 단백질 응집이 있는 높은 단량체 비율의 원하는 생화학적 특성을 가지는 2~8의 좁은 범위의 약물 부하를 가지는 폴리에틸렌 글리콜 스페이서((CH2CH2O)n=1-14)를 가지는 이황화 기(-S-S-)를 통하여 연결된 약물이 기술된다.In another embodiment of the invention, the anti-CD20 antibody is linked to a cytotoxic drug via disulfide bonds and polyethylene glycol spacers in enhancing the potency, solubility or efficacy of the immunoconjugate. Such cleavable hydrophilic linkers are described in WO2009 / 0134976. A further benefit of this linker design is the desired high monomer ratio and minimal aggregation of the antibody-drug conjugate. Specifically in this embodiment a conjugate of cell-binding agents is contemplated, with 2 ~ 2 biomarkers exhibiting a relatively high potent biological activity against cancer cells and having the desired biochemical properties of high monomer ratio with high conjugation yield and minimal protein aggregation. Drugs linked through disulfide groups (-SS-) with polyethylene glycol spacers ((CH 2 CH 2 O) n = 1-14 ) having a narrow range of drug loadings of 8 are described.

구체적으로 이러한 양태에서 화학식 I의 항-CD20 항체 약물 컨쥬게이트 또는 화학식 I'의 컨쥬게이트가 고려되며:Specifically contemplated in this embodiment are anti-CD20 antibody drug conjugates of Formula I or conjugates of Formula I ':

[화학식 I](I)

CB-[Xl-(-CH2-CH2O-)n-Y-D]m CB- [X l -(-CH 2 -CH 2 O-) n -YD] m

[화학식 I'](I ')

[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-Xl]m-CB [DY-(-CH 2 -CH 2 O-) n -X l ] m -CB

여기에서,From here,

CB는 항-CD2- 항체 또는 절편을 나타내고;CB represents an anti-CD2- antibody or fragment;

D는 약물을 나타내며;D represents a drug;

X는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 또는 에테르 결합을 통하여 세포-결합제에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;X represents an aliphatic, aromatic or heterocyclic unit attached to a cell-binding agent via a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, or an ether bond;

Y는 이황화 결합을 통하여 약물에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내며;Y represents an aliphatic, aromatic or heterocyclic unit attached to the drug via a disulfide bond;

l은 0 또는 1이고;l is 0 or 1;

m은 2 내지 8이 정수이며;m is an integer from 2 to 8;

n은 1 내지 24의 정수이다.n is an integer from 1 to 24.

보다 바람직하게는, m은 2 내지 6의 정수이다.More preferably, m is an integer of 2-6.

또한, 훨씬 더 바람직하게는, m은 3 내지 5의 정수이다.And even more preferably, m is an integer from 3 to 5.

또한, 보다 바람직하게는, n은 2 내지 8의 정수이다. 대안적으로, 예를 들어 미국 특허 제6,441,163호 및 제7,368,565호에 개시된 바와 같이, 약물은 우선 변형되어 세포-결합제와 반응하기에 적당한 반응성 에스터를 도입할 수 있다. 세포-결합제와 활성화된 링커 모이어티를 포함하는 이들 약물의 반응은 세포-결합제 약물 컨쥬게이트를 생성하는 다른 방법을 제공한다. 메이탄시노이드는 또한 예를 들어 미국 특허 제6,716,821호에 제시된 바와 같은 PEG 연결 기를 사용하여 항-CD20 항체 또는 절편에 연결될 수 있다. 이러한 PEG-비절단성 연결 기는 물 및 비수성 용매 모두에서 용해하고, 세포 결합제에 하나 이상의 세포독성제를 연결하는데 사용될 수 있다. 예시적인 PEG 연결기는 한쪽 말단에서 기능적 설파이드릴 또는 이황화 기, 그리고 다른 말단에서 활성 에스터를 통하여 링커의 반대 말단에서 세포독성제 및 세포 결합제와 반응하는 헤테로이작용성 PEG 링커를 포함한다. PEG 연결 기를 사용하여 세포독성 컨쥬게이트의 합성의 일반적인 예로서, 다시 미국 특허 제6,716,821호가 언급되며, 이는 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 합성은 세포-결합제와 반응성 PEG 모이어티를 가지는 하나 이상의 세포독성제의 반응으로 시작하며, 이는 세포 결합제의 아미노산 잔기에 의해 각각의 반응성 PEG 모이어티의 말단 활성 에스터의 변위를 초래하여, PEG 연결 기를 통하여 세포 결합제에 공유 결합된 하나 이상의 세포독성제를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트를 생성한다. 대안적으로, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 반응성 이황화 모이어티(예를 들어 피리딜다이설파이드)를 도입할 수 있으며, 그 다음이는 티올-포함 메이탄시노이드로 처리되어 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 다른 방법에서, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 티올 모이어티를 도입할 수 있고, 그 다음 이는 반응성 이황화-포함 메이탄시노이드(예를 들어 피리딜다이설파이드)로 처리되어 컨쥬게이트를 생성한다.In addition, More preferably, n is an integer of 2-8. Alternatively, as disclosed, for example, in US Pat. Nos. 6,441,163 and 7,368,565, the drug may first be modified to introduce a suitable reactive ester to react with the cell-binding agent. The reaction of these drugs, including cell-binding agents and activated linker moieties, provides another method of generating cell-binding drug conjugates. Maytansinoids can also be linked to anti-CD20 antibodies or fragments using, for example, PEG linkage groups as set forth in US Pat. No. 6,716,821. Such PEG-non-cleavable linking groups can be used to dissolve in both water and non-aqueous solvents and to link one or more cytotoxic agents to the cell binder. Exemplary PEG linkers include functional sulfidyl or disulfide groups at one end and heterodifunctional PEG linkers that react with cytotoxic agents and cell binders at opposite ends of the linker via active esters at the other end. As a general example of the synthesis of cytotoxic conjugates using PEG linkage groups, US Patent No. 6,716,821 is mentioned again, which is incorporated herein by reference in its entirety. Synthesis begins with the reaction of the cell-binding agent with one or more cytotoxic agents having a reactive PEG moiety, which results in the displacement of the terminal active ester of each reactive PEG moiety by the amino acid residues of the cell binding agent, resulting in a PEG linkage group. To produce a cytotoxic conjugate comprising one or more cytotoxic agents covalently bound to the cell binding agent. Alternatively, cell binding can be modified with a bifunctional PEG crosslinker to introduce a reactive disulfide moiety (eg pyridyldisulfide), which is then treated with a thiol-containing maytansinoid to conjugate the conjugate. Can provide. In another method, cell binding can be modified with a bifunctional PEG crosslinker to introduce a thiol moiety, which is then treated with a reactive disulfide-containing maytansinoid (eg pyridyldisulfide) to generate a conjugate. do.

비절단성 링커를 가지는 항체-약물 컨쥬게이트는 또한 제조될 수 있다. 이러한 가교제는 당업계에 기술되어 있고(예컨대, 문헌[ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook] 및 미국 공개 제20050169933호 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함되어 있음), 이에 한정되는 것은 아니지만 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)를 포함하며, 이는 SMCC(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), β-말레이미도프로판산 N-석신이미딜 에스터(BMPS), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소시아네이트(PMPI), N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)의 "장쇄" 유사체이다. 바람직하게는, 항체는 문헌에 기술된 바와 같이, 가교 시약, 예를 들어 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 설포-SMCC, 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), 설포-MBS 또는 석신이미딜-아이오도아세테이트로 변형되어 1~10개의 반응성 기를 도입한다(Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); 및 Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)). 그 다음 변형된 항체는 티올-포함 메이탄시노이드 유도체로 반응하여 컨쥬게이트를 생성한다. 컨쥬게이트는 Sephadex G25 칼럼을 통해 겔 여과에 의해 또는 투석에 의해 또는 접선 흐름 여과에 의해 정제될 수 있다. 변형된 항체는 티올-포함 메이탄시노이드(1 내지 2몰 당량/말레이미도 기)로 처리되고, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 Sephadex G-25 칼럼을 통해 겔 여과, 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼, 투석 또는 접선 흐름 여과 또는 이의 방법의 조합에 의해 정제된다. 전형적으로, 평균 항체 당 1~10개의 메이탄시노이드가 연결된다. 바람직한 방법은 항체를 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)로 변형시켜 말레이미도 기를 도입한 다음, 변형된 항체를 티올-포함 메이탄시노이드와 반응시켜 티오에테르-연결된 컨쥬게이트를 제공하는 것이다. 다시 항체 분자 당 1 내지 10개의 약물 분자를 가지는 컨쥬게이트가 생성된다. 항체, 항체 절편, 단백질 호르몬, 단백질 호르몬, 단백질 성장 인자 및 다른 단백질의 메이탄시노이드 컨쥬게이트가 동일한 방식으로 제조된다.Antibody-drug conjugates with non-cleavable linkers can also be prepared. Such crosslinkers are described in the art (see, eg, ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook and US Publication No. 20050169933, each of which is incorporated herein by reference), but is not limited to N- succinimidyl. 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N- succinimidyl-4- ( N- maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate), This SMCC (LC-SMCC), κ- already helped maleic acid N- succinimidyl ester (KMUA), β- maleimido propanoic acid N - succinimidyl ester (BMPS), γ- maleimido butyric acid N- succinimide Imidyl ester (GMBS), ε-maleimidocaproic acid N -hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl- N -hydroxysuccinimide ester (MBS), N- (α-maleimido Acetoxy) -succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6- (β-maleimidopropionami) ) Hexanoate (SMPH), N- succinimidyl 4- (p- maleimido phenyl) butyrate (SMPB), and N- (p- maleimido phenyl) isocyanate (PMPI), N- succinimidyl 4- (iodoacetyl) -aminobenzoate (SIAB), N- succinimidyl iodoacetate (SIA), N- succinimidyl bromoacetate (SBA), and N- succinimidyl 3- (bro Moacetamido) propionate (SBAP) is a “long chain” analog. Preferably, the antibody is a crosslinking reagent, such as succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), sulfo-SMCC, maleimidobenzoyl, as described in the literature. Modified with -N-hydroxysuccinimide ester (MBS), sulfo-MBS or succinimidyl-iodoacetate to introduce 1-10 reactive groups (Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101: 395 -399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); and Liu et al, Biochem., 18: 690-697 (1979)). The modified antibody then reacts with a thiol-containing maytansinoid derivative to produce a conjugate. The conjugate can be purified by gel filtration through Sephadex G25 column or by dialysis or by tangential flow filtration. Modified antibodies are treated with thiol-containing maytansinoids (1-2 molar equivalents / maleimido group), and antibody-maytansinoid conjugates are gel filtered through a Sephadex G-25 column, ceramic hydroxyapatite column Purified by dialysis or tangential flow filtration or a combination thereof. Typically, 1-10 maytansinoids are linked per average antibody. A preferred method is to introduce a maleimido group by modifying the antibody with succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) and then modifying the antibody with thiol-containing maytansinoids. By reaction to provide a thioether-linked conjugate. Again a conjugate with 1 to 10 drug molecules per antibody molecule is generated. Maytansinoid conjugates of antibodies, antibody fragments, protein hormones, protein hormones, protein growth factors and other proteins are prepared in the same manner.

본 발명의 다른 양태에서, CD20 항체는 PEG 스페이서의 중개를 통하여 비절단성 결합을 통해 약물에 연결된다. 약물과 항-CD20 항체 또는 절편 사이의 링커를 형성하는 친수성 PEG 사슬을 포함하는 적당한 가교 시약은 또한 당업계에 잘 알려져 있거나, 또는 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, Quanta Biodesign, 미국 오하이오주 파월 소재). 적당한 PEG-포함 가교제는 또한 당업자에게 알려진 표준 합성 화학 기법을 사용하여 상업적으로 입수가능한 PEG 그 자체로부터 합성될 수 있다. 약물은, 미국 특허 공개 20090274713 및 WO2009/0134976에 상세하게 기술된 방법에 의해, 이작용성 PEG-포함 가교제와 반응하여 화학식 Z -Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D의 화합물을 제공할 수 있으며, 그 다음 이는 세포 결합제와 반응하여 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 대안적으로, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 티올-반응성 기(예를 들어 말레이미드 또는 할로아세트아마이드)를 도입할 수 있으며, 이는 그 다음 티올-포함 메이탄시노이드로 처리되어 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 다른 방법에서, 세포 결합은 이작용성 PEG 가교제로 변형되어 티올 모이어티를 도입할 수 있고, 이는 그 다음 티올-반응성 메이탄시노이드(예를 들어, 말레이미드 또는 할로아세트아마이드를 가지는 메이탄시노이드)로 처리되어 컨쥬게이트를 제공할 수 있다.In another embodiment of the invention, the CD20 antibody is linked to the drug via non-cleavable binding through the mediation of a PEG spacer. Suitable crosslinking reagents comprising hydrophilic PEG chains that form a linker between the drug and the anti-CD20 antibody or fragment are also well known in the art or are commercially available (eg, Quanta Biodesign, Powell, Ohio). Material). Suitable PEG-containing crosslinkers can also be synthesized from commercially available PEG itself using standard synthetic chemistry techniques known to those skilled in the art. The drug is reacted with a bifunctional PEG-containing crosslinker by the method described in detail in US Patent Publication 20090274713 and WO2009 / 0134976 to formula Z-X l -(-CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p A compound of -D can be provided, which can then react with the cell binding agent to provide a conjugate. Alternatively, cell binding can be modified with a bifunctional PEG crosslinker to introduce a thiol-reactive group (eg maleimide or haloacetamide), which is then treated with a thiol-containing maytansinoid to conjugate Can be provided. In another method, cell binding can be modified with a bifunctional PEG crosslinker to introduce a thiol moiety, which then may be a maytansinoid with a thiol-reactive maytansinoid (eg, maleimide or haloacetamide). ) To provide the conjugate.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 화학식 II 또는 화학식 II'의 항-CD20 항체 약물 컨쥬게이트이며;Thus, another aspect of the invention is an anti-CD20 antibody drug conjugate of Formula II or Formula II ′;

[화학식 II]≪ RTI ID = 0.0 &

CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m CB- [X l -(-CH 2 -CH 2 -O-) n -Y p -D] m

[화학식 II'][Formula II ']

[D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB[DY p -(-CH 2 -CH 2 -O-) n -X l ] m -CB

여기에서, CB는 항-CD20 항체 또는 절편을 나타내고;Wherein CB represents an anti-CD20 antibody or fragment;

D는 약물을 나타내며;D represents a drug;

X는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 또는 에테르 결합을 통하여 세포-결합제에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;X represents an aliphatic, aromatic or heterocyclic unit bound to the cell-binding agent via a thioether bond, an amide bond, a carbamate bond, or an ether bond;

Y는 티오에테르 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 에테르 결합, 아민 결합, 탄소-탄소 결합 및 하이드라존 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유 결합을 통하여 약물에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내며;Y is an aliphatic, aromatic or heterocyclic unit bound to the drug via a covalent bond selected from the group consisting of thioether bonds, amide bonds, carbamate bonds, ether bonds, amine bonds, carbon-carbon bonds and hydrazone bonds Represents;

l은 0 또는 1이고;l is 0 or 1;

p는 0 또는 1이며;p is 0 or 1;

m은 2 내지 15의 정수이고;m is an integer from 2 to 15;

n은 1 내지 2000의 정수이다.n is an integer from 1 to 2000.

바람직하게는, m은 2 내지 8의 정수이고;Preferably, m is an integer from 2 to 8;

바람직하게 n은 1 내지 24의 정수이다.Preferably n is an integer from 1 to 24.

보다 바람직하게는, m은 2 내지 6의 정수이다.More preferably, m is an integer of 2-6.

또한, 훨씬 더 바람직하게는, m은 3 내지 5의 정수이다.And even more preferably, m is an integer from 3 to 5.

또한, 보다 바람직하게는, n은 2 내지 8의 정수이다. 적당한 PEG-포함 링커의 예는 항-CD20 항체 또는 그의 절편과의 반응을 위한 N-석신이미딜 에스터 또는 N-설포석신이미딜 에스터 모이어티뿐만 아니라 상기 화합물과의 반응을 위한 말레이미도계 또는 할로아세틸계 모이어티를 가지는 링커를 포함한다. PEG 스페이서는 본원에 기술된 방법에 의해 당업계에 알려진 임의의 가교제로 혼입될 수 있다. PEG 스페이서와 혼입될 수 있는 말레이미도계 모이어티를 포함하는 가교 시약은 이에 한정되는 것은 아니지만 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복시레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)를 포함하며, 이는 SMCC(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소시아네이트(PMPI)의 "장쇄" 유사체이다. 할로아세틸계 모이어티를 포함하는 가교 시약은 N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)를 포함한다.In addition, More preferably, n is an integer of 2-8. Examples of suitable PEG-containing linkers include, but are not limited to, N- succinimidyl esters or N- sulfosuccinimidyl ester moieties for reaction with anti-CD20 antibodies or fragments thereof, as well as maleimide systems for reaction with such compounds or Linkers having haloacetyl-based moieties. PEG spacers can be incorporated into any crosslinking agent known in the art by the methods described herein. Crosslinking reagents comprising maleimido-based moieties that can be incorporated with PEG spacers include, but are not limited to, N- succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N- succinimidyl-4 -( N- maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate), which includes SMCC (LC-SMCC), κ - maleimidodecanoic acid N- succinimidyl ester ( KMUA), γ-maleimidobutyric acid N- succinimidyl ester (GMBS), ε-maleimidocaproic acid N -hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl- N -hydroxysuccinimide Ester (MBS), N- (α-maleimidoacetoxy) -succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6- (β-maleimidopropionamido) hexanoate (SMPH), N- succinimi Di- 4- (p-maleimidophenyl) -butyrate (SMPB), and “long chain” analogs of N- (p-maleimidophenyl) isocyanate (PMPI). Crosslinking reagents containing haloacetyl-based moieties include N- succinimidyl-4- (iodoacetyl) -aminobenzoate (SIAB), N- succinimidyl iodoacetate (SIA), N- succinimidyl bromine Moacetate (SBA), and N- succinimidyl 3- (bromoacetamido) propionate (SBAP).

황 원자가 없는 다른 가교 시약이 또한 사용될 수 있다. 이러한 링커는 다이카복실산계 모이어티로부터 유래할 수 있다. 적당한 다이카복실산계 모이어티는 이에 한정되는 것은 아니지만 하기에 나타낸 일반식의 α,ω-다이카복실산을 포함하며:Other crosslinking reagents free of sulfur atoms can also be used. Such linkers may be derived from dicarboxylic acid based moieties. Suitable dicarboxylic acid-based moieties include, but are not limited to, the α, ω-dicarboxylic acids of the general formula shown below:

HOOCHOOC -- A'A ' pp -- E'E ' qq -(-( CHCH 22 CHCH 22 OO )) nn G'G ' rr -- COOHCOOH

여기에서 A'는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 선택적인 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 또는 알카인일 기이고, E'는 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선택적인 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐 기이며, G'는 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선택적인 치환 또는 비치환 방향족 기이거나, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 기이되, 여기에서 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택되고, p, q 및 r은 각각 0 또는 1이며, p, q 및 r이 동시에 모두 0이 아니라면 n은 1 내지 2000의 정수이다.Wherein A 'is an optional linear or branched alkyl, alkenyl, or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms and E' is an optional cycloalkyl or cycloalkenyl having 3 to 10 carbon atoms And G 'is an optionally substituted or unsubstituted aromatic group having 6 to 10 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, wherein the hetero atom is selected from N, O or S, and p , q and r are each 0 or 1, and n is an integer from 1 to 2000 unless p, q and r are all zero at the same time.

본원에 개시된 많은 링커가 미국 특허 공개 제20050169933호 및 제20090274713호, 및 WO2009/0134976에 상세히 기술되어 있으며, 이들의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.Many linkers disclosed herein are described in detail in US Patent Publication Nos. 20050169933 and 20090274713, and WO2009 / 0134976, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

본 발명은 또한 하전된 링커를 제공하며, 여기에서 항-CD20 항체 또는 그의 절편의 변형 후에 그리고 생성된 약물 컨쥬게이트에서 모두 전하가 유지된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항-CD20 항체에 약물을 연결하는 하전된 링커의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 하전된 링커는 세포-결합제를 변형하고 이를 약물에 연결하는데 사용된다. 본 발명의 다른 양태에서, 하전된 링커는 약물을 변형하고 이를 항-CD20 항체 또는 절편에 연결하는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 하전된 링커는 동시에 약물 및 세포-결합제를 연결하는데 사용된다. 모든 경우에서, 바람직한 최종 결과는 약물-하전된 링커-세포 결합제 컨쥬게이트이고, 이는 화학식 CB-(-Lc-D)q로 표현될 수 있으며, 여기에서 CB는 항-CD20 항체 또는 그의 절편인 세포-결합제이고, Lc는 하전된 링커이며, D는 약물 분자이고, q는 1 내지 20의 정수이다. 세포 결합제-약물 컨쥬게이트 중 링커에서 하전된 기(들)의 존재는 몇몇 이점, 예를 들어 i) 최종 생성물의 더 큰 수용성, ii) 수용액 중 더 높은 농도에서 작용하는 능력, iii) 세포-결합제의 분자 당 더 많은 약물 분자를 연결하여 더 높은 효력을 생성하는 능력, iv) 표적 세포 내부에 유지되어 더 높은 효력을 생성하는 하전된 컨쥬게이트 종에 대한 잠재력, 및 v) 세포로부터 하전된 약물 종을 배출할 수 없을 것인 다중약물 내성 세포의 개선된 민감도를 제공한다. 본 발명은 또한 링커를 기술하며, 이는 약물과 세포 결합제에 연결되어 세포에서 대사 작용을 할 수 있는 컨쥬게이트를 제공하여 하나 이상의 하전된 모이어티를 포함하는 약물 대사산물을 생성할 수 있다. 이러한 링커는 미리-하전된 링커로 불릴 것이다. 세포 가공 후 하전될 링커의 모이어티는 미리-하전된 모이어티로 불릴 것이다.The invention also provides a charged linker wherein the charge is maintained both after modification of the anti-CD20 antibody or fragment thereof and in the resulting drug conjugate. More specifically, the present invention relates to the use of charged linkers to link drugs to anti-CD20 antibodies. In one embodiment of the invention, charged linkers are used to modify cell-binding agents and link them to drugs. In another embodiment of the invention, a charged linker is used to modify the drug and link it to an anti-CD20 antibody or fragment. In another aspect of the invention, the charged linker is used to link the drug and cell-binding agent at the same time. In all cases, the preferred end result is a drug-charged linker-cell binder conjugate, which can be represented by the formula CB-(-L c -D) q , where CB is an anti-CD20 antibody or fragment thereof Is a cell-binding agent, L c is a charged linker, D is a drug molecule, q is an integer from 1 to 20. The presence of charged group (s) in the linker in cell binder-drug conjugates has several advantages, such as i) greater water solubility of the final product, ii) the ability to act at higher concentrations in aqueous solutions, iii) cell-binding agents The ability to link more drug molecules per molecule of to produce higher potency, iv) the potential for charged conjugate species to remain inside the target cell to produce higher potency, and v) charged drug species from the cell It provides an improved sensitivity of multidrug resistant cells that will not be able to excrete them. The present invention also describes a linker, which can provide a conjugate that is linked to the drug and the cell binding agent for metabolism in the cell to produce a drug metabolite comprising one or more charged moieties. Such linkers will be called pre-charged linkers. The moiety of the linker to be charged after cell processing will be called a pre-charged moiety.

본 발명의 하나의 양태에서, 하전된 또는 미리-하전된 가교제는 화학식 III으로 표현되며, 여기에서 Y'는 세포-결합제와 반응할 수 있고 Q는 세포독성 약물과 반응할 수 있으며:In one embodiment of the invention, the charged or pre-charged crosslinker is represented by Formula III, wherein Y 'can react with the cell-binding agent and Q can react with the cytotoxic drug:

[화학식 III][Formula III]

Figure pct00001
Figure pct00001

식 중,Wherein,

Y'는 항-CD20 항체 또는 그의 절편과 반응할 수 있게 하는 기능성 기를 나타내고;Y ′ represents a functional group that allows reaction with an anti-CD20 antibody or fragment thereof;

Q는 이황화, 티오에테르, 티오에스터, 펩티드, 하이드라존, 에테르, 에스터, 카바메이트 또는 아마이드 결합을 통하여 세포독성 약물의 결합을 가능하게 하는 기능성 기를 나타내며;Q represents a functional group that enables binding of cytotoxic drugs through disulfide, thioether, thioester, peptide, hydrazone, ether, ester, carbamate or amide bonds;

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일 또는 상이하고, H, 1~6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 2 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 도는 고리형 알케닐 또는 알카인일, 음이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 SO3 -, X-SO3 -, OPO3 2 -, X-OPO3 2-, PO3 2 -, X-PO3 2 -, CO2 -, 양이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 질소 포함 헤테로사이클, N+R11R12R13 또는 X-N+R11R12R13, 또는 페닐이며, 여기에서R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are the same or different and H, linear alkyl having 1 to 6 carbon atoms, 3 to It minutes with 6 carbon atoms for a branched or cyclic alkyl, having from 2 to 6 linear carbon atoms, branched turning cyclic alkenyl or alkynyl, for example, are not limited to anionic SO 3 -, X- SO 3 -, OPO 3 2 - , X-OPO 3 2-, PO 3 2 -, X-PO 3 2 -, CO 2 -, a cation, for example but not limited thereto including nitrogen heterocycles, N + R 11 R 12 R 13 or XN + R 11 R 12 R 13 , or phenyl, wherein

R11, R12 및 R13은 동일 또는 상이하고, H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬이며, X는 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬을 나타내고;R 11 , R 12 and R 13 are the same or different and are H, linear alkyl having 1 to 6 carbon atoms, or branched or cyclic alkyl having 3 to 6 carbon atoms, X is phenyl or 1 to 1 Linear alkyl having 6 carbon atoms, or branched or cyclic alkyl having 3 to 6 carbon atoms;

l, m 및 n은 0 또는 1 내지 4의 정수이며;l, m and n are 0 or an integer from 1 to 4;

A는 페닐 또는 치환된 페닐이고, 여기에서 치환기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 또는 음이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 SO3 -, X-SO3 -, OPO3 2 -, X-OPO3 2-, PO3 2 -, X-PO3 2 -, CO2 -, 및 양이온 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 질소 포함 헤테로사이클, N+R11R12R13 또는 X-N+R11R12R13으로부터 선택된 하전된 치환기이며, 여기에서 X는 상기한 바와 동일한 정의를 가지고, g는 0 또는 1이며;A is phenyl or substituted phenyl wherein the substituents are linear alkyl having 1 to 6 carbon atoms, or branched or cyclic alkyl having 3 to 6 carbon atoms, or anions such as but not limited to SO 3 -, X-SO 3 -, OPO 3 2 -, X-OPO 3 2-, PO 3 2 -, X-PO 3 2 -, CO 2 - it is, and, for example, but not limited to cations comprising nitrogen A charged substituent selected from heterocycle, N + R 11 R 12 R 13 or XN + R 11 R 12 R 13 , wherein X has the same definition as above and g is 0 or 1;

Z는 화학식 (OCH2CH2)p,의 선택적인 폴리에틸렌옥시 단위이고, 여기에서 p는 0 또는 2 내지 약 1000의 정수이거나, 또는 F1-E1-P-E2-F2이며, 여기에서 E1 및 E2는 동일 또는 상이하고, C=O, O 또는 NR14이며, 여기에서 R14는 H, 1~6개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬, 3 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 2 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 괴형 알케닐 또는 알카인일이고; P는 2 내지 20개 아미노산 길이의 펩티드이며, 여기에서 E1 또는 E2는 말단 질소, 말단 탄소 또는 펩티드의 아미노산 중 하나의 측쇄를 통하여 펩티드에 연결될 수 있고; F1 및 F2는 동일 또는 상이하며, 화학식 (OCH2CH2)p의 선택적인 폴리에틸렌옥시 단위이되, 여기에서 p는 0 또는 2 내지 약 1000의 정수이고, Z가 F1-E1-P-E2-F2가 아니라면 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10의 적어도 하나는 하전된 치환기이거나 또는 g가 1일 때 A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10이 적어도 하나는 하전된 치환기이다. 이는 하전된 링커를 가지는 컨쥬게이트의 하나의 예시적인 실시형태이다. 다른 예는 2009-0274713으로서 공개된 미국 특허 출원 제12/433,604호(Ravi, et al.)에 기술되어 있으며, 이의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 적당한 하전된 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 공개 제20090274713호에 기술된 것을 포함하고, 이의 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.Z is an optional polyethyleneoxy unit of the formula (OCH 2 CH 2 ) p , wherein p is 0 or an integer from 2 to about 1000, or is F1-E1-P-E2-F2, wherein E1 and E2 Is the same or different and is C═O, O or NR 14 , wherein R 14 is H, linear alkyl having 1 to 6 carbon atoms, branched or cyclic alkyl having 3 to 6 carbon atoms, 2 Linear, branched or block alkenyl or alkynyl having from 6 to 6 carbon atoms; P is a peptide of 2 to 20 amino acids in length, wherein E1 or E2 can be linked to the peptide via the side chain of one of the amino acids of the terminal nitrogen, terminal carbon or peptide; F1 and F2 are the same or different and are optional polyethyleneoxy units of the formula (OCH 2 CH 2 ) p , wherein p is 0 or an integer from 2 to about 1000 and Z is F1-E1-P-E2-F2 If at least one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 is a charged substituent or when g is 1, then A, R 1 , At least one of R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 is a charged substituent. This is one exemplary embodiment of a conjugate having a charged linker. Another example is described in US Patent Application No. 12 / 433,604 (Ravi, et al.) Published as 2009-0274713, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. Suitable charged linkers are well known in the art and include, for example, those described in US Patent Publication No. 20090274713, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

본 발명은 약 2 내지 약 8개의 약물 분자("약물 부하"), 예를 들어 메이탄시노이드는 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 연결되는 양태를 포함하며, 컨쥬게이트의 항종양 효과는 동일한 세포 결합제에 연결된 약물의 더 낮은 또는 더 높은 약물 부하와 비교하여 훨씬 더 효과적이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "약물 부하"는 세포 결합제(예컨대 항-CD20 항체 또는 그의 절편)에 부착될 수 있는 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)의 수를 지칭한다. 하나의 양태에서 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 8(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1)로 평균할 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 7(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1)로 평균할 수 있다. 훨씬 더 바람직한 양태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 6(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1)으로 평균할 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 약 2 내지 약 5(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1)로 평균할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "평균"은 항-CD20 항체 또는 그의 절편 및 이에 연결된 약물의 흡광도의 분광광도 측정에 의해 결정된다. 다른 양태에서, 약물 항-CD20 항체 또는 그의 절편 컨쥬게이트는 화학식 (D)약 2 ~ 약 8-L-항i-CD20Ab로 표현되며, 여기에서 D는 약물(예컨대, 메이탄시노이드, 탁산 또는 CC1065 유사체)이고, L은 링커이며, 여기에서 상기 링커는 절단성 링커(예컨대, 이황화물 교환을 통해 절단가능한 링커) 또는 절단에 실질적으로 저항성인 링커(예컨대, 세포-결합제와 반응을 위한 N-석신이미딜 에스터 또는 N-설포석신이미딜 에스터 모이어티뿐만 아니라 말레이미도계 또는 할로아세틸계 모이어티를 가지는 링커)로부터 선택되고, 항-CD20Ab는 본원에 기술된 바와 같은 CD20에 결합하는 항체 또는 그의 절편이다. 바람직한 요소에서, 약물-세포 결합제 컨쥬게이트(예컨대, 면역컨쥬게이트)는 화학식 (May)약 2~약 8-L- 항-CD20Ab로 표현되며, 여기에서 May는 메이탄시노이드이고, L은 링커이되, 여기에서 상기 링커는 절단성 링커 또는 절단에 실질적으로 저항성인 링커이고; 항-CD20Ab는 본원에 기술된 바와 같은 CD20에 결합하는 항체 또는 그의 절편이다. 본 발명에서의 사용에 적당한 약물은 본원에 기술된 바와 같이 세포-결합제에 연결될 수 있는 세포독성 약물이다. 본 발명의 하나의 양태는 다음을 포함하는 변형된 방향족을 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체이다: (1) C-19-데클로로(dechloro)(미국 특허 제4,256,746호)(안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨); (2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소에 의해 제조됨); 및 (3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 제4,294,757호)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨). 다른 위치의 변형을 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다: (1) C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨); (2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호); (3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(노카르디아(Nocardia)로부터 제조됨); (4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); (5) C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호)(트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 분리됨); (6) C-18-N-탈메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 (7) 4,5-데옥시(deoxy)(미국 특허 제4,371,533호)(티타늄 트리클로라이드/메이탄시놀의 LAH 환원에 의해 제조됨). 본 발명에서 유용한 티올-포함 메이탄시노이드이 합성은 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 제7,276,497호에 완전히 개시되어 있다. C-3 위치, C-14 위치, C-15 위치 또는 C-20 위치에서 티올 모이어티를 가지는 메이탄시노이드는 전부 유용하다. C-3 위치가 바람직하며, 메이탄시놀의 C-3 위치는 특히 바람직하다. 또한 N-메틸-알라닌-포함 C-3 티올 모이어티 메이탄시노이드, 및 N-메틸-시스테인-포함 C-3 티올 모이어티 메이탄시노이드, 및 각각의 유사체가 바람직하다. 바람직한 메이탄시노이드는 미국 특허 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제6,333.410호; 제6,441,163호; 제6,716,821호; 제RE39,151호 및 제7,276,497호에 기술되어 있는 것이다. 물론, N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1) 및 N 2'-데아세틸-N2'-(4-메캅토-4-메틸-1-옥소펜틸) 메이탄신(DM4)이 바람직하다. 다른 약물은 발명의 본 양태, 예를 들어 본원에 기술된 것에서 사용될 수 있다. 다른 예는 미국 가출원 제61/049,296호 및 미국 특허 출원 제12/574,430호에 기술되어 있으며; 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.The present invention encompasses embodiments in which about 2 to about 8 drug molecules (“drug load”), for example maytansinoids, are linked to an anti-CD20 antibody or fragment thereof, wherein the antitumor effect of the conjugate is the same cell. It is much more effective compared to lower or higher drug loads of drugs linked to the binder. As used herein, “drug load” refers to the number of drug molecules (eg, maytansinoids) that can be attached to a cell binding agent (eg, an anti-CD20 antibody or fragment thereof). In one embodiment the number of drug molecules that can be attached to the cell binding agent is from about 2 to about 8 (eg, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1) Can be averaged as In a preferred embodiment, the number of drug molecules that can be attached to the cell binding agent is from about 2 to about 7 (eg, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1). In even more preferred embodiments, the number of drug molecules that can be attached to the cell binding agent is from about 2 to about 6 (eg, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1). In the most preferred embodiment, the number of drug molecules that can be attached to the cell binding agent is from about 2 to about 5 (eg, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1). As used herein, the term “average” is determined by spectrophotometric measurement of the absorbance of an anti-CD20 antibody or fragment thereof and a drug linked thereto. In another embodiment, the drug anti-CD20 antibody or fragment conjugate thereof is represented by Formula (D) about 2 to about 8 -L-anti-CD20Ab, wherein D is a drug (eg, maytansinoid, taxane or CC1065 analogue), L is a linker, wherein the linker is a cleavable linker (eg, a linker cleavable via disulfide exchange) or a linker substantially resistant to cleavage (eg, N- for reaction with a cell-binding agent). Linkers having succinimidyl esters or N-sulfosuccinimidyl ester moieties as well as maleimido or haloacetyl based moieties), wherein the anti-CD20Ab is an antibody that binds to CD20 as described herein, or Is his intercept. In a preferred element, the drug-cell binder conjugate (eg, immunoconjugate) is represented by Formula (May) about 2 to about 8- L-anti-CD20Ab, where May is a maytansinoid and L is a linker Wherein the linker is a cleavable linker or a linker that is substantially resistant to cleavage; Anti-CD20Ab is an antibody or fragment thereof that binds to CD20 as described herein. Drugs suitable for use in the present invention are cytotoxic drugs that can be linked to cell-binding agents as described herein. One aspect of the invention is a suitable analog of maytansinol having a modified aromatic, comprising: (1) C-19-dechloro (US Pat. No. 4,256,746) (ansamytosine P2 Prepared by LAH reduction); (2) C-20-hydroxy (or C-20-demethyl) +/- C-19-dechloro (US Pat. Nos. 4,361,650 and 4,307,016) (Streptomyces or Actinomyces ) Prepared by demethylation with or dechlorination with LAH; And (3) C-20-demethoxy, C-20-acyloxy (-OCOR), +/- dechloro (US Pat. No. 4,294,757) (prepared by acylation with acyl chloride). Specific examples of suitable analogs of maytansinol having modifications at other positions include: (1) C-9-SH (US Pat. No. 4,424,219) (H 2 S or P 2 S 5 and maytansi) Prepared by the reaction of knol); (2) C-14-alkoxymethyl (demethoxy / CH 2 OR) (US Pat. No. 4,331,598); (3) C-14-hydroxymethyl or acyloxymethyl (CH 2 OH or CH 2 OAc) (US Pat. No. 4,450,254) (manufactured from Nocardia ); (4) C-15-hydroxy / acyloxy (US Pat. No. 4,364,866) (prepared by the conversion of maytansinol by Streptomyces); (5) C-15-methoxy (US Pat. Nos. 4,313,946 and 4,315,929) ( isolated from Trewia nudiflora ); (6) C-18- N -demethyl (US Pat. Nos. 4,362,663 and 4,322,348) (prepared by demethylation of maytansinol by Streptomyces); And (7) 4,5-deoxy (US Pat. No. 4,371,533) (prepared by LAH reduction of titanium trichloride / maytansinol). Thiol-comprising maytansinoids useful in the present invention are fully disclosed in US Pat. Nos. 5,208,020, 5,416,064 and 7,276,497. Maytansinoids having thiol moieties at the C-3, C-14, C-15 or C-20 positions are all useful. The C-3 position is preferred, and the C-3 position of maytansinol is particularly preferred. Also preferred are the N -methyl-alanine-containing C-3 thiol moiety maytansinoid, and the N -methyl-cysteine-containing C-3 thiol moiety maytansinoid, and analogs of each. Preferred maytansinoids are described in US Pat. No. 5,208,020; 5,416,064; 6,333.410; 6,333.410; No. 6,441,163; 6,716,821; 6,716,821; US Pat. Nos. 39,151 and 7,276,497. Of course, N 2 '- acetyl-de-N 2' - (3- mercapto-1-methoxy-oxopropyl) - MEI tansin (DM1) and N 2 '- to 2-acetyl -N' - (4- methoxy-4-mercaptomethyl Methyl-1-oxopentyl) maytansine (DM4) is preferred. Other drugs can be used in this aspect of the invention, eg, those described herein. Another example is described in US Provisional Application No. 61 / 049,296 and US Patent Application No. 12 / 574,430; The entire contents of which are incorporated herein by reference.

이작용성 가교제를 항-CD20 항체 또는 그의 절편은 항-CD20 항체 또는 그의 절편과 반응시킴으로써 변형될 수 있으며, 이에 의해 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 링커 분자의 공유 부착을 초래한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이작용성 가교 시약"은 약물, 예를 들어 본원에 기술된 약물에 세포-결합제를 공유적으로 연결하는 임의의 화학적 모이어티이다. 다른 방법에서, 연결 모이어티의 일부분은 약물에 의해 제공된다. 이 점에서, 약물은 약물에 세포-결합제를 연결하는데 사용되는 더 큰 링커 분자의 부분인 연결 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 메이탄시노이드 DM1를 형성하기 위하여, 메이탄신의 C-3 하이드록실 기에서 측쇄는 유리 설파이드릴 기(SH)를 가지는 것으로 변형된다. 이러한 메이탄신의 티올화 형태는 변형된 세포-결합제와 반응하여 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 그러므로, 최종 링커는 2개의 성분으로부터 집합되고, 이 중 하나는 가고 시약에 의해 제공되는 반면, 다른 하나는 DM1으로부터 측쇄에 의해 제공된다.The bifunctional crosslinker may be modified by reacting the anti-CD20 antibody or fragment thereof with the anti-CD20 antibody or fragment thereof, resulting in covalent attachment of the linker molecule to the anti-CD20 antibody or fragment thereof. As used herein, a “ bifunctional crosslinking reagent” is any chemical moiety that covalently links a cell-binding agent to a drug, eg, a drug described herein. In another method, a portion of the linking moiety is provided by the drug. In this regard, the drug includes a linking moiety that is part of a larger linker molecule used to link the cell-binding agent to the drug. For example, to form maytansinoid DM1, the side chains at the C-3 hydroxyl group of maytansine are modified to have free sulfidyl groups (SH). Such thiolated forms of maytansine can react with modified cell-binding agents to form conjugates. Therefore, the final linker is aggregated from two components, one of which is provided by the reagent, while the other is provided by the side chain from DM1.

약물 분자는 또한 중개 담체 분자, 예를 들어 혈청 알부민을 통하여 항체 분자에 연결될 수 있다.The drug molecule can also be linked to the antibody molecule via an intermediary carrier molecule, such as serum albumin.

본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포-결합제에 연결된" 또는 "항- CD20 항체 또는 절편에 연결된"은 적당한 연결 기, 또는 이의 전구체를 통하여 세포-결합제 항-CD20 항체 또는 절편에 결합된 적어도 하나의 약물 유도체를 포함된 컨쥬게이트 분자를 지칭한다. 바람직한 연결 기는 SMCC이다.As used herein, the expression “ linked to a cell-binding agent” or “ linked to an anti- CD20 antibody or fragment” is at least one bound to the cell-binding anti-CD20 antibody or fragment via a suitable linking group, or precursor thereof. Refers to a conjugate molecule containing a drug derivative of. Preferred linking group is SMCC.

본 발명에서 유용한 특히 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체이다. 적당한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체의 에스터를 포함한다. 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체와 같은, 미세소관 형성을 억제하고 포유동물 세포에 대하여 매우 독성인 임의의 약물이 포함된다.Particularly preferred cytotoxic agents useful in the present invention are maytansinoids and maytansinoid analogs. Examples of suitable maytansinoids include esters of maytansinol and maytansinol analogues. Any drug that inhibits microtubule formation and is very toxic to mammalian cells, such as maytansinol and maytansinol analogues, is included.

적당한 메이탄시놀 에스터의 예는 변형된 방향족 고리를 가지는 것 및 다른 위치에서 변형을 가지는 것을 포함한다. 이러한 적당한 메이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,333,410호; 제7,276,497호 및 제7,473,796호에 개시되어 있다.Examples of suitable maytansinol esters include those having modified aromatic rings and those having modifications at other positions. Such suitable maytansinoids are described in US Pat. No. 4,424,219; 4,256,746; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,307,016; 4,313,946; 4,313,946; 4,315,929; 4,315,929; No. 4,331,598; No. 4,361,650; 4,362,663; No. 4,364,866; No. 4,450,254; No. 4,322,348; 4,371,533; 5,208,020; 5,208,020; 5,416,064; 5,475,092; 5,475,092; 5,585,499; 5,585,499; No. 5,846,545; 6,333,410; 6,333,410; 7,276,497 and 7,473,796.

변형된 방향족 고리를 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다:Specific examples of suitable analogs of maytansinol having a modified aromatic ring include:

(1) C-19-데클로로(미국 특허 제4,256,746호)(안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨);(1) C-19-dechloro (US Pat. No. 4,256,746) (prepared by LAH reduction of ansamitocin P2);

(2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소에 의해 제조됨); 및(2) C-20-hydroxy (or C-20-demethyl) +/- C-19-dechloro (US Pat. Nos. 4,361,650 and 4,307,016) (desorption using Streptomyces or Actinomyces) Prepared by methylation or dechlorination with LAH); And

(3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 제4,294,757호)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨).(3) C-20-demethoxy, C-20-acyloxy (-OCOR), +/- dechloro (US Pat. No. 4,294,757) (prepared by acylation with acyl chloride).

다른 위치의 변형을 가지는 메이탄시놀의 적당한 유사체의 구체적인 예는 다음을 포함한다:Specific examples of suitable analogs of maytansinol having modifications at other positions include:

(1) C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨); (1) C-9-SH (US Pat. No. 4,424,219) (prepared by the reaction of H 2 S or P 2 S 5 with maytansinol);

(2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호); (2) C-14-alkoxymethyl (demethoxy / CH 2 OR) (US Pat. No. 4,331,598);

(3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(노카르디아로부터 제조됨); (3) C-14-hydroxymethyl or acyloxymethyl (CH 2 OH or CH 2 OAc) (US Pat. No. 4,450,254) (manufactured from Nocardia);

(4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); (4) C-15-hydroxy / acyloxy (US Pat. No. 4,364,866) (prepared by the conversion of maytansinol by Streptomyces);

(5) C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호)(트레위아 누디플로라로부터 분리됨); (5) C-15-methoxy (US Pat. Nos. 4,313,946 and 4,315,929) (isolated from Trewia nudiflora);

(6) C-18-N-탈메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 (6) C-18- N -demethyl (US Pat. Nos. 4,362,663 and 4,322,348) (prepared by demethylation of maytansinol by Streptomyces); And

(7) 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)(티타늄 트리클로라이드/메이탄시놀의 LAH 환원에 의해 제조됨).(7) 4,5-deoxy (US Pat. No. 4,371,533) (prepared by LAH reduction of titanium trichloride / maytansinol).

바람직한 양태에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성제로서 공식적으로 N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메캅토-1-옥소프로필)-메이탄신으로 불리는 티올-포함 메이탄시노이드(DM1)를 이용한다. DM1은 다음의 구조식 IV에 의해 표현된다:In a preferred embodiment, the conjugates of the present invention are thiol-containing maytansinoids officially referred to as N 2′-deacetyl- N 2 ′ -(3-mecapto-1-oxopropyl) -maytansine as cytotoxic agents. (DM1) is used. DM1 is represented by the following structural formula IV:

[구조식 IV][Formula IV]

Figure pct00002
Figure pct00002

바람직한 양태에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성제로서 티올-포함 메이탄시노이드인 N 2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-메캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(예컨대, DM4)를 이용한다. DM4는 다음의 구조식 V에 의해 표현된다:In a preferred embodiment, the conjugates of this invention are thiol as a cytotoxic agent-containing maytansinoid in N 2 '- de-acetyl -N 2' (4- methoxy-4-mercaptomethyl-1-oxo-pentyl) - MEI tansin (Eg, DM4). DM4 is represented by the following structural formula V:

[구조식 V][Formula V]

Figure pct00003
Figure pct00003

입체적으로 방해된 티올 결합을 포함하는 측쇄를 포함하는 다른 바람직한 메이탄시노이드는 N 2'-데아세틸-N2'-(4-메캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3으로 불림)이며, 다음의 구조식 VI에 의해 표현된다: Other preferred maytansinoids comprising a side chain containing a sterically hindered thiol bond is N 2 '- to 2-acetyl -N' - (4- methoxy mercaptomethyl-1-oxo-pentyl) - MEI tansin (termed DM3) And is represented by the following structural formula VI:

[구조식 VI][Formula VI]

Figure pct00004
Figure pct00004

추가적인 메이탄시노이드는 화학식 VII-L, VII-D, 또는 VII-D,L에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:Additional maytansinoids include compounds represented by formulas VII-L, VII-D, or VII-D, L:

[화학식 VII-L]Formula VII-L

Figure pct00005
Figure pct00005

[화학식 VII-D]Formula VII-D

Figure pct00006
Figure pct00006

[화학식 VII-D,L]Formula VII-D, L

Figure pct00007
Figure pct00007

식 중,Wherein,

Y는 (CR7R8)l(CR5R5)m(CR3R4)nCR1R2SZ를 나타내되,Y represents (CR 7 R 8 ) l (CR 5 R 5 ) m (CR 3 R 4 ) n CR 1 R 2 SZ,

R1 및 R2는 각각 독립적으로, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 기이거나, 또는 추가로 R1 및 R2 중 하나는 H일 수 있으며;R 1 and R 2 are each independently linear or alkenyl having 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl having 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl, or hetero Is a cyclic group, or additionally R 1 And one of R 2 can be H;

R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이고;R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are each independently H, linear alkyl or alkenyl having 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic having 3 to 10 carbon atoms Alkyl or alkenyl, phenyl, substituted phenyl, or heterocyclic aromatic or heterocycloalkyl radicals;

l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이며, 추가로 n은 0일 수 있고;l, m and n are each independently an integer from 1 to 5, and further n may be 0;

Z는 H, SR 또는 -COR이며, 여기에서 R은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 비치환 또는 치환 아릴 또는 헤테로사이클릭 기이고;Z is H, SR or -COR, where R is linear or branched alkyl or alkenyl having 1 to 10 carbon atoms, cyclic alkyl or alkenyl having 3 to 10 carbon atoms, or unsubstituted or Substituted aryl or heterocyclic group;

May는 C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 데스메틸(desmethyl)에서 측쇄를 가지는 메이탄시노이드를 나타낸다. May represents a maytansinoid having a side chain at C-3, C-14 hydroxymethyl, C-15 hydroxy or C-20 desmethyl.

화학식 VII-L, VII-D 및 VII-D,L의 바람직한 양태는 화학식 VII-L, VII-D 및 VII-D,L의 화합물을 포함하며, 여기에서:Preferred embodiments of Formulas VII-L, VII-D and VII-D, L include compounds of Formulas VII-L, VII-D and VII-D, L, wherein:

R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z은 H이다.R 1 is H, R 2 is methyl, R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are each H, l and m are each 1, n is 0 and Z is H.

R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 H이다.R 1 and R 2 are methyl, R 5 , R 6 , R 7 , R 8 are each H, l and m are 1, n is 0 and Z is H.

R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는　-SCH3이다.R 1 is H, R 2 is methyl, R 5 , R 6 , R 7 , R 8 are each H, l and m are each 1, n is 0 and Z is —SCH 3 .

R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z은-SCH3이다.R 1 and R 2 are methyl, R 5 , R 6 , R 7 , R 8 are each H, l and m are 1, n is 0 and Z is —SCH 3 .

추가적인 메이탄시노이드는 또한 화학식 VIII에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:Additional maytansinoids also include compounds represented by Formula VIII:

[화학식 VIII](VIII)

Figure pct00008
Figure pct00008

식 중, Y는 화학식 VII에 대해서 정의된 바와 같다.Wherein Y is as defined for Formula (VII).

화학식 VIII의 바람직한 양태는 화학식 VIII의 화합물을 포함하며, 여기에서:Preferred embodiments of formula (VIII) include compounds of formula (VIII), wherein:

R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이고; l 및 m은 각각 1이며; n은 0이고; Z는 H이다.R 1 is H, R 2 is methyl, and R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are each H; l and m are each 1; n is 0; Z is H.

R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고; n은 0이며; Z는 H이다.R 1 and R 2 are methyl, R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are each H and l and m are 1; n is 0; Z is H.

R1은 H이고, R2는 메틸이며, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는 -SCH3이다.R 1 is H, R 2 is methyl, R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are each H, l and m are each 1, n is 0 and Z is —SCH 3 .

R1 및 R2는 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8은 각각 H이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 -SCH3이다.R 1 and R 2 are methyl, R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are each H, l and m are 1, n is 0 and Z is —SCH 3 .

추가적인 메이탄신은 화학식 IX-L, IX-D 또는 IX-D,L에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:Additional maytansines include compounds represented by formulas IX-L, IX-D or IX-D, L:

[화학식 IX-L][Formula IX-L]

Figure pct00009
Figure pct00009

[화학식 IX-D][Formula IX-D]

Figure pct00010
Figure pct00010

[화학식 IX-D,L][Formula IX-D, L]

Figure pct00011
Figure pct00011

식 중, Y2는 (CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2를 나타내되,Where Y 2 is (CR 7 R 8 ) l (CR 9 = CR 10 ) p (C≡C) q A o (CR 5 R 6 ) m D u (CR 11 = CR 12 ) r (C≡C ) s B t (CR 3 R 4 ) n CR 1 R 2 SZ 2 ,

R1 및 R2는 각각 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 기이며, 추가로 R1 및 R2 중 하나는 H일 수 있고;R 1 and R 2 are each independently linear alkyl or alkenyl having 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl having 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or heterocyclic And further one of R 1 and R 2 may be H;

A, B 및 D는 각각 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 단순 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이며;A, B and D are each independently cycloalkyl or cycloalkenyl, simple or substituted aryl, or heterocyclic aromatic or heterocycloalkyl radicals having 3 to 10 carbon atoms;

R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 , R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 기이고;R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are each independently H, linear alkyl or alkenyl having 1 to 10 carbon atoms, 3 Branched or cyclic alkyl or alkenyl, phenyl, substituted phenyl or heterocyclic groups having from 10 to 10 carbon atoms;

l, m, n, o, p, q, r, s 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이며, 한 번에 l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 적어도 둘이 0이고;l, m, n, o, p, q, r, s and t are each independently 0 or an integer from 1 to 5, and l, m, n, o, p, q, r, s and t at once At least two of them are zero;

Z2는 SR 또는 -COR이며, 여기에서 R은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이고Z 2 is SR or -COR, where R is linear alkyl or alkenyl having 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl having 3 to 10 carbon atoms, or simple or substituted Aryl or heterocyclic aromatic or heterocycloalkyl radicals

May는 메이탄시노이드이다.May is a maytansinoid.

화학식 IX의 화합물의 바람직한 양태는, R1이 H이고 R2가 메틸이며, R1은 메틸이고 R2는 메틸인 화합물을 포함한다.Preferred embodiments of compounds of Formula (IX) include compounds wherein R 1 is H, R 2 is methyl, R 1 is methyl and R 2 is methyl.

추가로 메이탄시노이드는 화학식 X에 의해 표현되는 화합물을 포함하며:Further maytansinoids include compounds represented by Formula X:

[화학식 X](X)

Figure pct00012
Figure pct00012

식 중, Y2'는 화학식 IX에 대해서 정의된 바와 같다.Wherein Y 2 ′ is as defined for Formula (IX).

미국 특허 제5,208,020호 및 제7,276,497호에 교시된 각각의 메이탄시노이드는 또한 본 발명의 컨쥬게이트에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 미국 특허 제5,208,020호 및 제7,276,697호의 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.Each maytansinoid taught in US Pat. Nos. 5,208,020 and 7,276,497 may also be used in the conjugates of the present invention. In this regard, the entire disclosures of US Pat. Nos. 5,208,020 and 7,276,697 are incorporated herein by reference.

메이탄시노이드 상의 많은 위치는 연결 모이어티를 화학적으로 연결하는 위치로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실 기를 가지는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시로 변형된 C-15 위치 및 하이드록시 기를 가지는 C-20 위치는 전부 유용할 것으로 예상된다. 그러나 C-3 위치가 바람직하고, 메이탄시놀의 C-3 위치가 특히 바람직하다.Many positions on maytansinoids can serve as positions that chemically link the linking moieties. For example, the C-3 position with a hydroxyl group, the C-14 position modified with hydroxymethyl, the C-15 position modified with hydroxy and the C-20 position with the hydroxy group are all expected to be useful. However, the C-3 position is preferred, and the C-3 position of maytansinol is particularly preferred.

바람직한 컨쥬게이트의 구조적 표현이 하기에 표시되어 있으며:Structural representations of preferred conjugates are shown below:

[화학식 XI](XI)

Figure pct00013
Figure pct00013

[화학식 XII](XII)

Figure pct00014
Figure pct00014

[화학식 XIII](XIII)

Figure pct00015
Figure pct00015

[화학식 XIV](XIV)

Figure pct00016
Figure pct00016

[화학식 XV](XV)

Figure pct00017
Figure pct00017

[화학식 XVI](XVI)

Figure pct00018
Figure pct00018

[화학식 XVII]Formula XVII]

Figure pct00019
Figure pct00019

[화학식 XVIII][Formula XVIII]

Figure pct00020
Figure pct00020

이러한 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 생성하는 몇몇 기술은 미국 특허 제6,333,410호, 및 미국 출원 제09/867,598호, 제10/161,651호 및 제10/024,290호에서 제공되며, 이들 각각은 본원에 전체가 포함되어 있다.Some techniques for generating such antibody-maytansinoid conjugates are provided in US Pat. No. 6,333,410, and US Application Nos. 09 / 867,598, 10 / 161,651, and 10 / 024,290, each of which is herein disclosed. All inclusive.

일반적으로, 수용성 완충액 중 항체의 용액은 반응성 기를 가지는 이황화 모이어티를 가지는 몰 과량의 메이탄시노이드와 함께 인큐베이션될 수 있다. 반응 혼합물은 과량 아민(예를 들어 에탄올아민, 타우린 등)의 첨가에 의해 퀀칭될 수 있다. 그 다음 메이탄시노이드-항체 컨쥬게이트는 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.In general, solutions of antibodies in aqueous buffers can be incubated with molar excess maytansinoids having disulfide moieties with reactive groups. The reaction mixture can be quenched by the addition of excess amines (eg ethanolamine, taurine, etc.). Maytansinoid-antibody conjugates can then be purified by gel filtration.

항체 분자 당 결합된 메이탄시노이드 분자의 수는 252nm 및 280nm에서 흡광도의 비율을 분광광도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 평균 1~10개 메이탄시노이드 분자/항체 분자가 바람직하고, 평균 2~5개가 훨씬 더 바람직하다.The number of maytansinoid molecules bound per antibody molecule can be determined by measuring the spectrophotometric ratio of absorbance at 252 nm and 280 nm. On average 1-10 maytansinoid molecules / antibody molecules are preferred, and on average 2-5 are even more preferred.

메이탄시노이드 약물과 항체의 컨쥬게이트는 다양한 원치 않는 세포주의 시험관 내 증식을 억제하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 인간 림프종 세포주 Daudi 및 인간 림프종 세포주 Ramos와 같은 세포주는 이들 화합물의 세포독성의 평가에 용이하게 사용될 수 있다. 4 내지 5일 동안 화합물에 평가될 세포를 노출시키고, 공지된 방법에 의해 직접적인 분석법으로 세포의 생존한 부분을 측정할 수 있다. 그 다음 IC50 값은 분석의 결과로부터 계산될 수 있다.Conjugates of maytansinoid drugs and antibodies can be assessed for their ability to inhibit in vitro proliferation of various unwanted cell lines. For example, cell lines such as human lymphoma cell line Daudi and human lymphoma cell line Ramos can be readily used for the assessment of the cytotoxicity of these compounds. The cells to be assessed for the compound can be exposed for 4 to 5 days and the viable portion of the cells can be determined by direct assay by known methods. IC 50 values can then be calculated from the results of the analysis.

미국 가출원 제61/150,201호에 기술된 벤조다이아제핀 화합물(예컨대, 인돌리노벤조다이아제핀 또는 옥사졸리디노벤조다이아제핀), 이의 유도체, 이의 중간체는 또한 항-CD20 항체 절편 또는 컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다.The benzodiazepine compounds (eg, indolinobenzodiazepine or oxazolidinobenzodiazepine) described in US Provisional Application No. 61 / 150,201, derivatives thereof, intermediates thereof may also be used to prepare anti-CD20 antibody fragments or conjugates. Can be.

유용한 벤조다이아제핀은 화학식 XIX, XX 및 XXI의 화합물을 포함하며, 여기에서 이량체 화합물은 선택적으로 세포 결합제에 연결을 허용하는 연결 기를 가진다.Useful benzodiazepines include compounds of formulas XIX, XX, and XXI, wherein dimer compounds optionally have linking groups that allow linkage to cell binders.

[화합물 XIX][Compound XIX]

Figure pct00021
Figure pct00021

[화합물 XX][Compound XX]

Figure pct00022
Figure pct00022

[화합물 XXI][Compound XXI]

Figure pct00023
Figure pct00023

여기에서 N과 C사이의 이중선

Figure pct00024
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 이중선이 이중 결합일 경우 X는 부재하고 Y는 H이며, 이중선이 단일 결합일 경우 X는 H 또는 화합물을 전구약물로 전환시키는 아민 보호 모이어티이고;Where doublet between N and C
Figure pct00024
Represents a single bond or a double bond, X is absent and Y is H when the doublet is a double bond, and X is H or an amine protecting moiety that converts the compound to prodrug when the doublet is a single bond;

Y는 -OR, -OCOR'에 의해 표현되는 에스터, -OCOOR'에 의해 표현되는 카보네이트, -OCONR'R''에 의해 표현되는 카바메이트, NR'R''에 의해 표현되는 아민 또는 하이드록실 아민, -NRCOR'에 의해 표현되는 아마이드, NRCOP에 의해 표현되는 펩티드로부터 선택되되, 여기에서 P는 아미노산 또는 2 내지 20개의 아미노산 단위를 포함하는 폴리펩티드, SR'에 의해 표현되는 티오에테르, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, 할로겐, 시아노, 아지도, 또는 티올이며, 여기에서 R, R' 및 R''는 동일 또는 상이하고, H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 치환 또는 비치환된 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리(여기에서 치환기는 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로부터 선택됨)로부터 선택되며, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12의 정의는 상기 주어진 바와 같고, 선택적으로 R''는 OH이며;Y is -OR, ester represented by -OCOR ', carbonate represented by -OCOOR', carbamate represented by -OCONR'R '', amine represented by NR'R '' or hydroxyl amine , An amide represented by -NRCOR ', a peptide represented by NRCOP, wherein P is an amino acid or a polypeptide comprising 2 to 20 amino acid units, a thioether represented by SR', SOR ' Sulfoxides represented, sulfones represented by -SO 2 R ', sulfite -SO 3 , bisulfite -OSO 3 , halogen, cyano, azido, or thiol, wherein R, R' and R ''Is the same or different and H, substituted or unsubstituted linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl having 1 to 10 carbon atoms, polyethylene glycol unit (-OCH 2 CH 2 ) n ( Where n is an integer from 1 to 2000), 6 to 10 carbon atoms Aryl having, heterocyclic ring having 3 to 10 carbon atoms, wherein the substituent is a sulfoxide represented by halogen, OR 7 , NR 8 R 9 , NO 2 , NRCOR ', SR 10, SOR',- Sulfone represented by SO 2 R ', sulfite -SO 3 , bisulfite -OSO 3 , sulfonamide represented by SO 2 NRR', cyano, azido, -COR 11 , OCOR 11 Or OCONR 11 R 12 ), the definitions of R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are as given above, and optionally R ″ is OH;

W는 C=O, C=S, CH2, BH, SO 또는 SO2이고;W is C═O, C═S, CH 2 , BH, SO or SO 2 ;

R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 치환 또는 비치환된 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 또는 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로부터 선택되는 치환기이되, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리으로부터 선택되며, 선택적으로 R10은 SR13 또는 COR13이되, 여기에서 R13은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리로부터 선택되고, 선택적으로 R11은 OR14이되, 여기에서 R14는 R과 동일한 정의를 가지며, 선택적으로 R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 또는 R4' 중 임의의 하나는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기이거나 또는 선택적으로 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기를 가지는 폴리피롤로, 폴리-인돌일, 폴리-이미다졸일, 폴리피롤로-이미다졸일, 폴리-피롤로-인돌일 또는 폴리이미다졸로-인돌일 단위로부터 선택되고;R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 1 ', R 2 ', R 3 'and R 4 ' are each independently H, substituted or unsubstituted linear, branched having 1 to 10 carbon atoms Or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl, polyethylene glycol units (-OCH 2 CH 2 ) n, where n is an integer from 1 to 2000, or halogen, guanidinium [-NH (C = NH) NH 2 ], OR 7 , NR 8 R 9 , NO 2 , sulfoxides represented by NRCOR ', SR 10 , SOR', sulfones represented by -SO 2 R ', sulfite -SO 3 , bisulfite- Sulphonamide, cyano, azido, represented by OSO 3 , SO 2 NRR ', -COR 11 , OCOR 11 Or a substituent selected from OCONR 11 R 12 , wherein R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are each independently H, linear, branched or cyclic alkyl having 1 to 10 carbon atoms , Alkenyl or alkynyl, polyethylene glycol unit (-OCH 2 CH 2 ) n (where n is an integer from 1 to 2000), aryl having 6 to 10 carbon atoms, hetero having 3 to 10 carbon atoms Selected from a cyclic ring, optionally R 10 is SR 13 or COR 13 wherein R 13 is a linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl, polyethylene glycol having 1 to 10 carbon atoms Unit (-OCH 2 CH 2 ) n (where n is an integer from 1 to 2000), aryl having 6 to 10 carbon atoms, heterocyclic ring having 3 to 10 carbon atoms, optionally R 11 OR 14 R 14, provided here Has the same definition as R, optionally, R 1, R 2, R 3 , R 4, R 1 ', R 2', R 3 any one of a 'or R 4' may be linked to the cell binding agent via a covalent bond Polypyrrole, which is a linking group which enables a linking group to be linked to the cell binder, or optionally a linking group that enables linkage to a cell binder, Is selected from the solo-indolyl unit;

Z는 (CH2)n(여기에서 n은 1, 2 또는 3임), CR15R16, NR17, O 또는 S로부터 선택되되, 여기에서 R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)이며;Z is selected from (CH 2 ) n (where n is 1, 2 or 3), CR 15 R 16 , NR 17 , O or S, wherein R 15 , R 16 and R 17 are each independently H , Linear, branched or cyclic alkyl having 1 to 10 carbon atoms, polyethylene glycol unit (-OCH 2 CH 2 ) n , where n is an integer from 1 to 2000;

R6은 OR, SR 또는 NRR'이되, 여기에서 R 및 R'는 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지고;R 6 is OR, SR or NRR ', wherein R and R' have the same definition as given above;

X'는 CH2, NR, CO, BH, SO 또는 SO2로부터 선택되되, 여기에서 R은 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지며;X 'is selected from CH 2 , NR, CO, BH, SO or SO 2 , wherein R has the same definition as given above;

Y'는 O, CH2, NR 또는 S이되, 여기에서 R은 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지고;Y 'is O, CH 2 , NR or S, wherein R has the same definition as given above;

X', Y' 및 Z'가 동시에 모두 CH2가 아니라면, Z'는 CH2 또는 (CH2)n(여기에서 n은 2, 3 또는 4임)이며,If X ', Y' and Z 'are not all CH 2 at the same time, Z' is CH 2 or (CH 2 ) n (where n is 2, 3 or 4),

A 및 A'는 동일 또는 상이하고, O, -CRR'O, S, -CRR'S, -NR15 또는 CRR'NHR15로부터 선택되되, 여기에서 R 및 R는 상기 주어진 바와 동일한 정의를 가지며 R15는 상기 R에 대하여 주어진 바와 동일한 정의를 가지고;A and A 'are the same or different and are selected from O, -CRR'O, S, -CRR'S, -NR 15 or CRR'NHR 15 , wherein R and R have the same definition as given above and R 15 is Has the same definition as given for R;

D 및 D'는 동일 또는 상이하며, 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일(선택적으로 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로 치환되되, 여기에서 R7, R8, R9, R10, R11 및 R12의 정의는 상기 주어진 바와 같음), 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)로부터 선택되고;D and D 'are the same or different and are independently linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl having 1 to 10 carbon atoms (optionally halogen, OR 7 , NR 8 R 9 , NO 2 , Sulfoxides represented by NRCOR ', SR 10 , SOR', sulfones represented by -SO 2 R ', sulfite -SO 3 , bisulfite -OSO 3 , SO 2 NRR' , Cyano, azido, -COR 11 , OCOR 11 Or OCONR 11 R 12 , wherein the definitions of R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are as given above, polyethylene glycol unit (—OCH 2 CH 2 ) n (here N is an integer from 1 to 2000;

L은 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 선택적으로 치환되는 선택적인 페닐 기 또는 헤테로사이클 고리(여기에서 치환기는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기임)이거나, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일(선택적으로 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로 치환되되, 여기에서 R7, R8, R9, R10, R11 및 R12의 정의는 상기 주어진 바와 같음), 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)로부터 선택되고; 선택적으로, 화합물이 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 단지 하나의 연결 기를 가진다면, L 자체는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기; 또는 이러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 용매화합물, 염, 수화물 또는 수화된 염, 이의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체 또는 다형성 결정질 구조이다.L is an optional phenyl group or heterocycle ring optionally substituted with 3 to 10 carbon atoms, in which the substituent is a linking group that enables linkage to the cell binder via a covalent bond, or 1 to 10 carbon atoms Linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl having the sulfoxide, optionally represented by halogen, OR 7 , NR 8 R 9 , NO 2 , NRCOR ', SR 10 , SOR' Sulfone represented by 2 R ', sulfite -SO 3 , bisulfite -OSO 3 , SO 2 sulfonamide represented by NRR', cyano, azido, -COR 11 , OCOR 11 Or OCONR 11 R 12 , wherein the definitions of R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are as given above, polyethylene glycol unit (—OCH 2 CH 2 ) n (here N is an integer from 1 to 2000; Optionally, if the compound has only one linking group that allows it to be linked to the cell binder via covalent bonds, then L itself may be linked to the cell binder via a covalent bond; Or pharmaceutically acceptable solvates, salts, hydrates or hydrated salts of such compounds, optical isomers, racemates, diastereomers, enantiomers or polymorphic crystalline structures thereof.

하나의 바람직한 양태에서, N과 C사이의 이중선

Figure pct00025
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 이중선이 이중 결합일 경우 X는 부재하고 Y는 H이며, 이중선이 단일 결합일 경우 X는 H 또는 화합물을 전구약물로 전환시키는 아민 보호 기이고;In one preferred embodiment, the doublet between N and C
Figure pct00025
Represents a single bond or a double bond, X is absent and Y is H when the doublet is a double bond, and X is H or an amine protecting group that converts the compound to prodrug when the doublet is a single bond;

Y는 -OR, NR'R", 설파이트 -SO3, 또는 바이설파이트 -OSO3으로부터 선택되며, 여기에서, R은 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임), 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 헤테로사이클릭 고리로부터 선택되고;Y is selected from -OR, NR'R ", sulfite -SO 3 , or bisulfite -OSO 3 , wherein R is H, branched or cyclic alkyl having 1 to 10 carbon atoms, al Kenyl or alkynyl, polyethylene glycol unit (-OCH 2 CH 2 ) n (where n is an integer from 1 to 2000), aryl having 6 to 10 carbon atoms, heterocyclic having 3 to 10 carbon atoms Selected from rings;

W는 C=O, CH2 또는 SO2이며;W is C═O, CH 2 or SO 2 ;

R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 H, NO2 또는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기로부터 선택되고;R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 1 ′, R 2 ′, R 3 ′, and R 4 ′ each independently from a linking group that allows for connection to a cell binder via H, NO 2 or a covalent bond. Selected;

R6은 OR18이며, 여기에서 R18는 R과 동일한 정의를 가지며;R 6 is OR 18 , where R 18 has the same definition as R;

Z는 (CH2)n(여기에서 n은 1, 2 또는 3임), CR15R16, NR17, O 또는 S로부터 선택되되, 여기에서 R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)이고;Z is selected from (CH 2 ) n (where n is 1, 2 or 3), CR 15 R 16 , NR 17 , O or S, wherein R 15 , R 16 and R 17 are each independently H , Linear, branched or cyclic alkyl having 1 to 10 carbon atoms, polyethylene glycol unit (-OCH 2 CH 2 ) n , where n is an integer from 1 to 2000;

X'는 CH2 또는 C=O로부터 선택되며;X 'is selected from CH 2 or C═O;

Y'는 O, NR 또는 S이되, 여기에서 R은 상기와 같이 정의되고;Y 'is O, NR or S, wherein R is defined as above;

Z'는 CH2 또는 (CH2)2이며;Z 'is CH 2 or (CH 2 ) 2 ;

A 및 A'는 각각 O이고;A and A 'are each O;

D 및 D'는 동일 또는 상이하며, 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일이고;D and D 'are the same or different and are independently linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl having 1 to 10 carbon atoms;

L은 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 선택적으로 치환되는 선택적인 페닐 기 또는 헤테로사이클 고리(여기에서 치환기는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기임)이거나, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일(선택적으로 할로겐, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, SOR'에 의해 표현되는 설폭사이드, -SO2R'에 의해 표현되는 설폰, 설파이트 -SO3, 바이설파이트 -OSO3, SO2NRR'에 의해 표현되는 설폰아마이드, 시아노, 아지도, -COR11, OCOR11 또는 OCONR11R12로 치환됨), 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-OCH2CH2)n(여기에서 n은 1 내지 2000의 정수임)로부터 선택되고; 선택적으로, L 자체는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기; 또는 이러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 용매화합물, 염, 수화물 또는 수화된 염, 이의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체 또는 다형성 결정질 구조이다.L is an optional phenyl group or heterocycle ring optionally substituted with 3 to 10 carbon atoms, in which the substituent is a linking group that enables linkage to the cell binder via a covalent bond, or 1 to 10 carbon atoms Linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl having the sulfoxide, optionally represented by halogen, OR 7 , NR 8 R 9 , NO 2 , NRCOR ', SR 10 , SOR' Sulfone represented by 2 R ', sulfite -SO 3 , bisulfite -OSO 3 , SO 2 sulfonamide represented by NRR', cyano, azido, -COR 11 , OCOR 11 Or substituted with OCONR 11 R 12 ), a polyethylene glycol unit (-OCH 2 CH 2 ) n , where n is an integer from 1 to 2000; Optionally, L itself may be a linking group that enables linkage to the cell binder through covalent bonds; Or pharmaceutically acceptable solvates, salts, hydrates or hydrated salts of such compounds, optical isomers, racemates, diastereomers, enantiomers or polymorphic crystalline structures thereof.

다른 바람직한 양태에서, 화합물은 화학식 XXII에 의해 표현되며:In another preferred embodiment, the compound is represented by Formula XXII:

Figure pct00026
Figure pct00026

여기에서 N과 C사이의 이중선

Figure pct00027
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 이중선이 이중 결합일 경우 X는 부재하고 Y는 H이며, 이중선이 단일 결합일 경우 X는 H 또는 화합물을 전구약물로 전환시키는 아민 보호 기이고, Y는 OH, -OR에 의해 표현되는 에테르, 설파이트 -SO3 또는 바이설파이트 -OSO3로부터 선택되되, 여기에서 R은 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 알케닐 또는 알카인일로부터 선택되며,Where doublet between N and C
Figure pct00027
Represents a single bond or a double bond, X is absent and Y is H if the doublet is a double bond, X is H or an amine protecting group to convert the compound to a prodrug if the doublet is a single bond, and Y is OH, Ether represented by —OR, sulfite —SO 3 or bisulfite —OSO 3 , wherein R is H, linear, branched or cyclic alkyl having 1 to 10 carbon atoms, alkenyl or Is selected from alkaneyl,

R2, R3 중 하나는 공유 결합을 통하여 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기이고 다른 하나는 H이며,One of R 2 and R 3 is a linking group which enables linkage to the cell binder through a covalent bond and the other is H,

L', L" 또는 L"' 중 하나는 세포 결합제에 연결할 수 있게 하는 연결 기인 반면, 다른 것들은 H이고; 바람직하게 L'는 연결 기이며 G는 CH 또는 N이다. 다른 예는 미국 특허출원 제61/150,201호에 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.One of L ', L "or L"' is a linkage that allows linkage to cell binders, while others are H; Preferably L 'is a linking group and G is CH or N. Other examples are described in US patent application Ser. No. 61 / 150,201, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

본 발명에 따른 세포독성 컨쥬게이트에 사용되는 세포독성제는 또한 탁산 또는 이의 유도체일 수 있다. 탁산은, 암의 치료에 광범위하게 사용되는 2가지 화합물인, 세포독성 천연물인 파클리탁셀(탁솔), 및 반합성 유도체인 도세탁셀(탁소텔)을 포함하는 화합물의 패밀리이다. 탁산은 튜불린의 해중합을 억제하는 유사분열방추 독이며, 세포 사멸을 초래한다. 도세탁셀 및 파클리탁셀은 암의 치료에 있어서 유용한 제제인 반면, 이들의 항암 활성은 정상 세포에 대한 비특이적인 독성때문에 제한된다. 또한, 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 화합물 그 자체는 본 발명의 항-CD20 항체 및 이의 절편과 같은 세포 결합체의 컨쥬게이트에 사용되기에 충분히 강력하지 않다. 본 발명에서 사용되기에 적당한 탁산은 미국 특허 제6,372,738호 및　제6,340,701호에 개시되어 있다. 본 발명의 탁산 및 세포 결합제의 컨쥬게이트는 현재 공지되거나 이후에 개발된 임의의 기법을 사용하여 형성될 수 있다. 수많은 컨쥬게이션 방법은 미국 특허 제5,416,064호 및 미국 특허 제5,475,092호에 교시되어 있다. 탁산은 또한 미국 특허 제7,598,290호, 미국 특허 공개 제20090099336호, 제20070031402호, 제20060233814호, 제20060233811호, 제20050123549호, 제20050085513호 및 제20040039176호에 교시되어 있으며, 이들 전부 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.Cytotoxic agents used in the cytotoxic conjugates according to the invention may also be taxanes or derivatives thereof. Taxanes are a family of compounds that include two compounds widely used in the treatment of cancer, paclitaxel (taxol), a cytotoxic natural product, and docetaxel (taxotel), a semisynthetic derivative. Taxanes are mitotic spindle poisons that inhibit the depolymerization of tubulin and cause cell death. Docetaxel and paclitaxel are useful agents in the treatment of cancer, while their anticancer activity is limited because of nonspecific toxicity to normal cells. In addition, compounds such as paclitaxel and docetaxel per se are not strong enough for use in the conjugates of cell conjugates such as the anti-CD20 antibodies of the invention and fragments thereof. Taxanes suitable for use in the present invention are disclosed in US Pat. Nos. 6,372,738 and 6,340,701. Conjugates of the taxanes and cell binding agents of the invention can be formed using any technique now known or later developed. Numerous conjugation methods are taught in US Pat. No. 5,416,064 and US Pat. No. 5,475,092. Taxanes are also taught in US Pat. No. 7,598,290, US Pat. All inclusive.

CC-1065 및 이의 유사체는 또한 본 발명에서 사용하기에 바람직한 세포독성 약물이다. CC-1065 및 이의 유사체는 미국 특허 제6,372,738호; 제6,340,701호; 제5,846,545호; 및 제5,585,499호에 개시되어 있다. CC-1065는 스트렙토마이세스 젤렌시스의 배양 브로스에서 분리된 강력한 항-종양 항생제이다. CC-1065는 흔히 사용되는 항암 약물, 예를 들어 독소루비신, 메톡트렉세이트 및 빈크리스틴보다 시험관 내에서 약 100배 더 강력하다(B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)).CC-1065 and analogs thereof are also preferred cytotoxic drugs for use in the present invention. CC-1065 and analogs thereof are described in US Pat. No. 6,372,738; 6,340,701; 6,340,701; No. 5,846,545; And 5,585,499. CC-1065 is a potent anti-tumor antibiotic isolated from the culture broth of Streptomyces gelensis. CC-1065 is about 100 times more potent in vitro than commonly used anticancer drugs such as doxorubicin, methoxtrexate and vincristine (BK Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)). ).

듀오카마이신은 본 발명에서의 사용에 매우 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 일련번호 제6,281,354호; 제6,066,742호; 제5,703,080호; 제4,994,578호; 제4,923,990호에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.Duocarmycin is a cytotoxic drug that is well suited for use in the present invention and is disclosed herein and in the art, for example US Pat. No. 6,281,354; 6,066,742; 6,066,742; 5,703,080; 5,703,080; 4,994,578; 4,923,990. Each reference is incorporated herein by reference in its entirety.

에네딘, 예를 들어 칼리키아마이신은 본 발명에서의 사용에 매우 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제5,436,361호; 제5,053,394호; 및 미국 특허 공개 제20090105461호에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.Enedines, such as calicheamicin, are cytotoxic drugs that are well suited for use in the present invention and are described herein and in the art, for example in US Pat. No. 5,436,361; 5,053,394; 5,053,394; And US Patent Publication No. 20090105461. Each reference is incorporated herein by reference in its entirety.

돌라스틴(dolastin) 및 돌라스틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴은 본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제7,084,110호; 제6,737,409호; 제6,686,445호; 제6,632,795호; 제6,458,765호; 제6,323,315호; 제6,248,865호; 제6,239,104호; 제6,143,721호; 제6,103,698호; 제6,034,065; 5,985,837호; 제5,965,537; 5,886,147호; 제5,554,725호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 및 4,879,278호에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다. Dolastin and dolastin analogs, such as auristatin, are cytotoxic drugs suitable for use in the present invention and are described herein and in the art, for example in US Pat. No. 7,084,110; No. 6,737,409; 6,686,445; 6,686,445; 6,632,795; 6,632,795; 6,458,765; 6,458,765; 6,323,315; 6,323,315; 6,248,865; 6,248,865; 6,239,104; 6,239,104; No. 6,143,721; No. 6,103,698; 6,034,065; 5,985,837; 5,965,537; 5,886,147; 5,554,725; 5,554,725; 5,138,036; 5,138,036; 5,076,973; 5,076,973; 4,986,988; 4,986,988; No. 4,978,744; And 4,879,278. Each reference is incorporated herein by reference in its entirety.

토메이마이신 유도체는 본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제4,427,588호, 문헌[Arima et al., "J. Antibiotics", vol. 25, No. 8, pp. 437-444, (1972)]; [Kariyone et al., "Chem. Pharm. Bull.", vol. 19, No. 11, pp. 2289-2293, (1971)]; 및 [Leimgruber et al., "J. Am. Chem. Soc.", vol. 90, pp. 5641-5643, (1968)]에 개시되어있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.Tomeicin derivatives are suitable cytotoxic drugs for use in the present invention and are disclosed herein and in the art, for example, in US Pat. No. 4,427,588, Arima et al., "J. Antibiotics", vol. 25, No. 8, pp. 437-444, (1972); Kariyone et al., “Chem. Pharm. Bull.”, Vol. 19, No. 11, pp. 2289-2293, (1971); And Leimgruber et al., “J. Am. Chem. Soc.”, Vol. 90, pp. 5641-5643, (1968). Each reference is incorporated herein by reference in its entirety.

렙토마이신 유도체는 본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 약물이며, 본원 및 당업계, 예를 들어 미국 특허 제7,446,196호, 문헌[Kudo et al. Experimental Cell Research, 1998, 242(2), 54-546]; [Kuhnt et al., Applied Environmental Microbiology, 1998, 64(2), 714-720]; 미국 출원 제10/856,703호; 문헌[Carl et al., J. Med. Chem. 1981, 24 (3), 479-480, "A Novel Connector Linkage Applicable in Prodrug Design"]; [Chemical Abstracts No. 105:102629 (일본 특허 61-109717 A2 (1986)의 요약)]; [Doherty et al., J. Nat. Cancer Inst. 2003, 95(24), 1859-1868, "Cell Cycle Checkpoint Function in Bladder Cancer"]; [Fukuda et al., Nature 1997, 390, 308-311, "CRM1 is responsible for intracellular transport mediated by the nuclear export signal"]; [Hamamoto et al., J. Antibiotics 1983, 36 (6), 639-645, "Leptomycins A and B, New Antifungal Antibiotics I. Taxonomy of the Producing Strain and Their Fermentation, Purification and Characterization"]; [Hayakawa et al., J. Antibiotics 1987, 40 (9), 1349-1352, "New Antitumor Antibiotics, Anguinomycins A and B"]; [Inoue et al., J. Biol. Chem. 2002, 277 (17), 15053-15060, "Nuclear Import and Export Signals in Control of the p53-related Protein p73"]; [Kobayashi et al., Ensho, Saisei 2004, 24(5), 578-583, "Role of matrix metalloproteinase-9 expression on cutaneous inflammation: possible treatment by leptomycin B application" (abstract)]; [Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 220-223, "Structural Study of a New Antitumor Antibiotic, Kazusamycin"]; [Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 224-229, "Antitumor Activity of a New Antibiotic, Kazusamycin"]; [Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (3), 427-429, "Antitumor activity of leptomycin B"]; [Kudo et al., Exp. Cell Res. 1998, 242, 540-547, "Lepto-mycin B Inhibition of Signal Mediated Nuclear Export by Direct Binding to CRM1"]; [Kudo et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 1999, 96 (3), 9112-9117, "Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region"]; [Kuhnt et al., Applied Environ. Microbiol. 1998, 64 (2), 714-720, "Microbial Conversion Products of Leptomycin B"; Lane et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 2000, 97, 8501-8506, "Activation of p53 in cervical carcinoma cells by small molecules"]; [Marabese et al., Nucleic Acids Res. 2003 31 (22), 6624-6632, "DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C-EBPa repression on E2F1"]; [Meissner et al., FEBS Letters 2004, 576(1-2), 27-30, "Ratjadone and leptomycin B block CRM1-dependent nuclear export by identical mechanisms" (abstract)]; [Nishi et al., J. Biol. Chem. 1994, 269 (9), 6320-6324, "Leptomycin B Targets a Regulatory Cascade of crm1, a Fission Yeast Nuclear Protein, Involved in Control of Higher Order Chromosome Structure and Gene Expression"]; [Peehl et al., Prostate 2003, 54, 258-267, "Leptomycin B Stabilizes and Activates p53 in Primary Prostatic Epithelial Cells and Induces Apoptosis in the LNCaP Cell Line"]; 및 [University of Dundee, Dept. Surgery & Molecular Oncology, Lain Group Website, http://www.dundee.ac.uk/surgery/Non-Genotoxic.htm, accessed Dec. 6, 2004, "Non-genotoxic activation of the p53 tumor suppressor function"]에 개시되어 있다. 각각의 참조문헌은 본원에 참조로 전체가 포함되어 있다.Leptomycin derivatives are suitable cytotoxic drugs for use in the present invention and are disclosed herein and in the art, for example in US Pat. No. 7,446,196, Kudo et al. Experimental Cell Research, 1998, 242 (2), 54-546; Kuhnt et al., Applied Environmental Microbiology, 1998, 64 (2), 714-720; US Application No. 10 / 856,703; Carl et al., J. Med. Chem. 1981, 24 (3), 479-480, "A Novel Connector Linkage Applicable in Prodrug Design"; Chemical Abstracts No. 105: 102629 (summary of Japanese Patent 61-109717 A2 (1986)); Doherty et al., J. Nat. Cancer Inst. 2003, 95 (24), 1859-1868, "Cell Cycle Checkpoint Function in Bladder Cancer"; Fukuda et al., Nature 1997, 390, 308-311, "CRM1 is responsible for intracellular transport mediated by the nuclear export signal"; Hamamoto et al., J. Antibiotics 1983, 36 (6), 639-645, "Leptomycins A and B, New Antifungal Antibiotics I. Taxonomy of the Producing Strain and Their Fermentation, Purification and Characterization"; Hayakawa et al., J. Antibiotics 1987, 40 (9), 1349-1352, "New Antitumor Antibiotics, Anguinomycins A and B"; Inoue et al., J. Biol. Chem. 2002, 277 (17), 15053-15060, "Nuclear Import and Export Signals in Control of the p53-related Protein p73"; Kobayashi et al., Ensho, Saisei 2004, 24 (5), 578-583, "Role of matrix metalloproteinase-9 expression on cutaneous inflammation: possible treatment by leptomycin B application" (abstract); Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 220-223, "Structural Study of a New Antitumor Antibiotic, Kazusamycin"; Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 224-229, "Antitumor Activity of a New Antibiotic, Kazusamycin"; Komiyama et al., J. Antibiotics 1985, 38 (3), 427-429, "Antitumor activity of leptomycin B"; Kudo et al., Exp. Cell Res. 1998, 242, 540-547, "Lepto-mycin B Inhibition of Signal Mediated Nuclear Export by Direct Binding to CRM1"; Kudo et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 1999, 96 (3), 9112-9117, "Leptomycin B inactivates CRM1 / exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region"; Kuhnt et al., Applied Environ. Microbiol. 1998, 64 (2), 714-720, "Microbial Conversion Products of Leptomycin B"; Lane et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 2000, 97, 8501-8506, "Activation of p53 in cervical carcinoma cells by small molecules"; Marabese et al., Nucleic Acids Res. 2003 31 (22), 6624-6632, "DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C-EBPa repression on E2F1"; Meissner et al., FEBS Letters 2004, 576 (1-2), 27-30, “Ratjadone and leptomycin B block CRM1-dependent nuclear export by identical mechanisms” (abstract); Nishi et al., J. Biol. Chem. 1994, 269 (9), 6320-6324, "Leptomycin B Targets a Regulatory Cascade of crm1, a Fission Yeast Nuclear Protein, Involved in Control of Higher Order Chromosome Structure and Gene Expression"; Peehl et al., Prostate 2003, 54, 258-267, "Leptomycin B Stabilizes and Activates p53 in Primary Prostatic Epithelial Cells and Induces Apoptosis in the LNCaP Cell Line"; And the University of Dundee, Dept. Surgery & Molecular Oncology, Lain Group Website, http://www.dundee.ac.uk/surgery/Non-Genotoxic.htm, accessed Dec. 6, 2004, "Non-genotoxic activation of the p53 tumor suppressor function". Each reference is incorporated herein by reference in its entirety.

본 발명의 다른 양태에서, siRNA 분자는 약물 대신에 본 발명의 항체에 연결될 수 있다. siRNA는 올리고뉴클레오티드의 변형에 흔히 사용되는 방법에 의해 본 발명의 항체에 연결될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제20050107325호 및 제20070213292호 참조). 따라서, 3' 또는 5' 포스포르아미다이트 형태에서 siRNA는 하이드록실 기능성을 가지는 가교제의 한쪽 말단과 반응하여 siRNA와 가교제 사이의 에스터 결합을 제공할 수 있다. 유사하게 말단 아미노 기를 가지는 가교제와 siRNA 포스포르아미다이트의 반응은 아민을 통하여 siRNA에 가교제의 연결을 초래한다. 대안적으로, siRNA는 표준 화학 방법에 의해 유도체화되어 티올 기를 도입할 수 있다. 이러한 티올-포함 siRNA는 활성 이황화 또는 말레이미드 모이어티를 도입하도록 변형된 항체와 반응되어, 절단성 또는 비절단성 컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 1 내지 20개 siRNA 분자는 이러한 방법에 의해 항체에 연결될 수 있다.In another embodiment of the invention, siRNA molecules may be linked to the antibodies of the invention instead of drugs. siRNAs can be linked to the antibodies of the invention by methods commonly used for modification of oligonucleotides (see, eg, US Patent Publications 20050107325 and 20070213292). Thus, in 3 'or 5' phosphoramidite forms, siRNA can react with one end of a crosslinking agent having hydroxyl functionality to provide an ester bond between the siRNA and the crosslinking agent. Similarly, the reaction of siRNA phosphoramidite with a crosslinking agent having a terminal amino group results in the linkage of the crosslinking agent to the siRNA through the amine. Alternatively, siRNAs can be derivatized by standard chemical methods to introduce thiol groups. Such thiol-containing siRNAs can be reacted with antibodies modified to introduce active disulfide or maleimide moieties, resulting in cleavable or non-cleavable conjugates. One to twenty siRNA molecules can be linked to the antibody by this method.

진단 및 연구 적용Diagnostic and research applications

본원에 논의된 항체의 치료적 용도에 더하여, 본 발명의 항체 및/또는 절편은 많은 공지된 진단 및 연구 적용에서 이용될 수 있다. 본 발명의 항체 및/또는 절편은 예를 들어 정제, 검출 및 CD20의 표적화에 사용될 수 있으며, 시험관 내 및 생체 내 진단 방법 모두에 포함된다. 예를 들어, 항체 및/또는 절편은 생물학적 샘플 내 세포에 의해 발현되는 CD20의 수준을 정성적으로 및 정량적으로 측정하기 위하여 면역분석법에 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조하며, 이는 참조로 본원에 전체가 포함되어 있다. In addition to the therapeutic uses of the antibodies discussed herein, the antibodies and / or fragments of the invention may be used in many known diagnostic and research applications. Antibodies and / or fragments of the invention can be used, for example, for purification, detection, and targeting of CD20, and are included in both in vitro and in vivo diagnostic methods. For example, antibodies and / or fragments can be used in immunoassays to qualitatively and quantitatively determine the level of CD20 expressed by cells in a biological sample. See, eg, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988), which is incorporated herein by reference in its entirety.

본 발명의 항체는, 예를 들어 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침강 분석법에 사용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).Antibodies of the invention can be used, for example, in competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).

예를 들어, 본 발명은 또한 CD20-매개 병태를 가지고 있는 것으로 알려지거나 또는 가지고 있는 것으로 의심되는 환자에서 CD20을 검출하는 진단 방법에서의 사용을 위하여, 하기 기술된 바와 같이, 검출가능하게 표지화된 상기 항-CD20 펩티드 및 항체를 제공한다. 본 발명의 항-CD20 펩티드 및/또는 항체는 샘플 내 CD20 또는 항-CD20 항체를 검출 또는 정량화하는 면역분석법에 유용하다. CD20에 대한 면역분석법은 전형적으로 CD20에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출가능하게 표지화된 높은 친화도의 항-CD20 펩티드 및/또는 항체의 존재 하에서 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계, 샘플 내에 결합된 표지화된 펩티드 또는 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 임상적 분석 절차는 당업계에, 예컨대 문헌[Immunoassays for the 80's, A. Voller et al., eds., University Park, 1981]에 기술된 바와 같이 잘 알려져 있다. 따라서, 항-CD20 펩티드 또는 항체 또는 그의 절편은 나이트로셀룰로오스, 또는 세포, 세포 입자 또는 용해성 단백질을 고정화시킬 수 있는 다른 고체 지지체에 첨가될 수 있다. 그 다음 지지체는 적당한 완충액으로 세척한 다음, 검출가능하게 표지화된 CD20-특이적 펩티드 또는 항체 또는 그의 절편으로 처리될 수 있다. 그 다음 고체상 지지체는 완충액으로 2번 세척하여 결합되지 않은 펩티드 또는 항체 또는 그의 절편을 제거할 수 있다. 그 다음 고체 지지체에 결합된 표지의 양은 공지된 방법의 단계에 의해 검출될 수 있다.For example, the present invention also provides for use in a diagnostic method of detecting CD20 in a patient known or suspected of having a CD20-mediated condition, as described below, detectably labeled as described above. Anti-CD20 peptides and antibodies are provided. Anti-CD20 peptides and / or antibodies of the invention are useful in immunoassays to detect or quantify CD20 or anti-CD20 antibodies in a sample. Immunoassay for CD20 typically involves incubating a biological sample in the presence of a detectably labeled high affinity anti-CD20 peptide and / or antibody capable of selectively binding to CD20, bound within the sample. Detecting the labeled peptide or antibody. Various clinical assay procedures are well known in the art, such as described in Immunassays for the 80's, A. Voller et al., Eds., University Park, 1981. Thus, the anti-CD20 peptide or antibody or fragment thereof may be added to nitrocellulose or other solid support capable of immobilizing cells, cell particles or soluble proteins. The support can then be washed with a suitable buffer and then treated with a detectably labeled CD20-specific peptide or antibody or fragment thereof. The solid phase support can then be washed twice with buffer to remove unbound peptide or antibody or fragments thereof. The amount of label bound to the solid support can then be detected by steps of known methods.

"고체상 지지체" 또는 "담체"는 펩티드, 항원 또는 항체 또는 그의 절편을 결합할 수 있는 임의의 지지체로 의도된다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 아가로오스, 및 자철석을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위하여 어느 정도까지 용해성 또는 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 결합된 분자가 CD20 또는 항-CD20 항체 또는 그의 절편에 결합할 수 있는 한 사실상 임의의 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드에서와 같은 구형, 또는 시험관의 내부 표면, 또는 막대기의 외부 표면에서와 같은 원통형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 시트, 배양 접시, 테스트 스트립 등과 같이 평면일 수 있다. 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 당업자는 항체 또는 그의 절편, 펩티드 또는 항원을 결합하기 위한 많은 다른 적당한 담체를 알 것이거나, 또는 통상적인 실험에 의해 그것을 확인할 수 있다.A "solid support" or "carrier" is intended to be any support capable of binding a peptide, antigen or antibody or fragment thereof. Well known supports or carriers include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylase, natural and modified celluloses, polyacrylamides, agarose, and magnetite. The nature of the carrier may be soluble or insoluble to some extent for the purposes of the present invention. The support material may have virtually any possible structural form as long as the bound molecule can bind to a CD20 or anti-CD20 antibody or fragment thereof. Thus, the support form may be spherical as in beads, or cylindrical as in the inner surface of a test tube, or the outer surface of a rod. Alternatively, the surface may be planar, such as sheets, petri dishes, test strips, and the like. Preferred supports include polystyrene beads. One skilled in the art will know many other suitable carriers for binding the antibody or fragment thereof, peptide or antigen, or can identify it by routine experimentation.

잘 알려진 방법의 단계는 주어진 다수의 항-CD20 펩티드 및/또는 항체 또는 그의 절편의 결합 활성을 측정할 수 있다. 당업자는 통상적인 실험에 의해 유효한 최적의 분석법을 결정할 수 있다.Steps of well known methods can measure the binding activity of a given plurality of anti-CD20 peptides and / or antibodies or fragments thereof. One skilled in the art can determine the optimal assay that is effective by routine experimentation.

CD20- 특이적 펩티드 및/또는 항체 또는 그의 절편을 검출가능하게 표지화하는 것은 효소 면역분석법(EIA), 또는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에서의 사용을 위한 효소에 연결시킴으로써 수행될 수 있다. 연결된 효소는 노출된 기질과 반응하여, 예를 들어 분광광도, 형광 측정에 의해 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 본 발명의 CD20-특이적 항체 또는 그의 절편을 검출가능하게 표지화하는데 사용될 수 있는 효소는 이에 한정되는 것은 아니지만 말레이트 데하이드로게나아제, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 아이소머라아제, 효모 알코올 데하이드로게나아제, 알파-글리세로인산 데하이드로게나아제, 3탄당인산 아이소머라아제, 호스래디쉬 퍼록시다아제, 알칼리 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제를 포함한다.Detectable labeling of CD20-specific peptides and / or antibodies or fragments thereof can be performed by linking to enzymes for use in enzyme immunoassay (EIA), or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The linked enzyme reacts with the exposed substrate to produce a chemical moiety that can be detected, for example, by spectrophotometry, fluorescence measurements or by visual means. Enzymes that can be used to detectably label CD20-specific antibodies or fragments thereof of the present invention include, but are not limited to, maleate dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta-5-steroid isomerase, yeast Alcohol dehydrogenase, alpha-glycerophosphate dehydrogenase, trisaccharide phosphate isomerase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase Ribonucleases, urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase and acetylcholinesterase.

CD20-특이적 항체 및/또는 이의 절편을 방사성으로 표지화함으로써, 방사면역측정법(RIA)의 사용을 통하여 CD20을 검출하는 것이 가능하다(예를 들어, 문헌[Work, et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978)] 참조). 방사성 동위원소는 감마 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 수단에 의해, 또는 자기방사법에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S, 14C이고, 바람직하게는 125I이다.By radiolabeling CD20-specific antibodies and / or fragments thereof, it is possible to detect CD20 through the use of radioimmunoassay (RIA) (see, eg, Work, et al., Laboratory Techniques and Biochemistry). in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY (1978). Radioisotopes can be detected by means such as the use of gamma counters or scintillation counters, or by self-radiography. Isotopes that are particularly useful for the purposes of the present invention are 3 H, 125 I, 131 I, 35 S, 14 C, preferably 125 I.

또한 형광 화합물을 이용하여 CD20-특이적 항체 및 이의 절편을 표지화하는 것이 가능하다. 형광 표지화된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출될 경우, 그러면 상기 항체의 존재는 형광으로 인해 검출될 수 있다. 가장 흔히 사용되는 형광 표지화 화합물 중에는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레사민이 있다.It is also possible to label CD20-specific antibodies and fragments thereof using fluorescent compounds. If a fluorescently labeled antibody is exposed to light of the appropriate wavelength, then the presence of the antibody can be detected due to fluorescence. Among the most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde and fluoresamine.

CD20-특이적 항체 또는 그의 절편은 또한 형광-발광성 금속, 예를 들어 25Eu, 또는 란탄 계열의 다른 것들을 사용하여 검출가능하게 표지화될 수 있다. 이러한 금속은 다이에틸렌트라이아민펜나아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트화 그룹을 사용하여 CD20-특이적 항체 또는 그의 절편에 부착될 수 있다.CD20-specific antibodies or fragments thereof may also be detectably labeled using fluorescent-luminescent metals such as 25 Eu, or others of the lanthanide series. Such metals may be attached to CD20-specific antibodies or fragments thereof using metal chelating groups such as diethylenetriaminephenaacetic acid (DTPA) or ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA).

CD20-특이적 항체 또는 그의 절편은 또한 화학 발광성 화합물에 결합시킴으로써 검출가능하게 표지화될 수 있다. 그러면 화학 발광성 표지화된 항체의 존재는 화학적 반응의 진행 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학 발광성 표지화 화합물의 예로는 루미놀, 아이소루미놀, 쎄로마틱 아크리디늄 에스터(theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터가 있다. 유사하게, 생물 발광성 화합물이 본 발명의 CD20-특이적 항체, 이의 절편 또는 유도체를 표지화하는데 사용될 수있다. 생물 발광은, 촉매 단백질이 화학 발광성 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학 발광의 종류이다. 생물 발광성 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정될 수 있다. 표지화의 목적을 위하여 중요한 생물 발광성 화합물은 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린이다.CD20-specific antibodies or fragments thereof may also be detectably labeled by binding to chemiluminescent compounds. The presence of chemiluminescent labeled antibodies is then determined by detecting the presence of luminescence that occurs during the course of the chemical reaction. Examples of particularly useful chemiluminescent labeling compounds are luminol, isoluminol, theromatic acridinium esters, imidazoles, acridinium salts and oxalate esters. Similarly, bioluminescent compounds can be used to label the CD20-specific antibodies, fragments or derivatives thereof of the invention. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in biological systems in which catalytic proteins increase the efficiency of chemiluminescent reactions. The presence of bioluminescent proteins can be measured by detecting the presence of luminescence. Important bioluminescent compounds for the purpose of labeling are luciferin, luciferase and equarin.

CD-특이적 항체, 이의 절편 또는 유도체의 검출은 예를 들어 검출가능한 표지가 방사성 감마 방출체라면 섬광 계수기에 의해, 또는 예를 들어 표지가 형광성 물질이라면 형광광도계에 의해 수행될 수 있다. 효소 표지의 경우에서, 검출은 효소에 대한 기질을 이용하는 발색법에 의해 수행될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여 기질의 효소 반응의 정도를 시각적으로 비교함으로써 수행될 수 있다.Detection of CD-specific antibodies, fragments or derivatives thereof can be performed, for example, by a scintillation counter if the detectable label is a radio gamma emitter or by a fluorophotometer if the label is a fluorescent substance. In the case of enzyme labels, detection can be performed by colorimetric methods using a substrate for the enzyme. Detection can also be performed by visually comparing the extent of the enzymatic reaction of the substrate compared to similarly prepared standards.

본 발명의 목적을 위하여, 상기 분석법에 의해 검출된 CD20은 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. CD20을 포함하는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈청, 림프액, 소변, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출액 또는 호모제네이트 등과 같은 생물학적 유체이다. 그러나, 본 발명은 이러한 샘플만을 사용하는 분석법으로 한정되지 않으며, 당업자는 다른 샘플의 사용을 허용하는 적당한 조건을 결정할 수 있다.For the purposes of the present invention, CD20 detected by the assay can be present in a biological sample. Any sample comprising CD20 can be used. Preferably, the sample is a biological fluid such as, for example, blood, serum, lymph, urine, inflammatory exudate, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, tissue extract or homogenate, and the like. However, the present invention is not limited to assays using only such samples, and those skilled in the art can determine appropriate conditions to allow the use of other samples.

동일계 내 검출은 환자로부터 조직염색 표본을 분리하고, 본 발명의 표지화된 항체의 조합을 상기 표본에 제공함으로써 수행될 수 있다. 항체 또는 그의 절편은 바람직하게 표지화된 항체 또는 그의 절편을 생물학적 샘플에 적용함으로써 또는 쒸움으로써 제공된다. 이러한 절차의 사용을 통하여, CD20의 존재뿐만 아니라 검사된 조직에서 CD20의 본포를 측정하는 것이 가능하다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 광범위하게 다양한 조직학적 방법(예를 들어 염색 절차) 중 임의의 것이이러한 동일계 내 검출을 달성하기 위하여 변형될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.In situ detection can be performed by separating a histostain sample from a patient and providing the sample with a combination of labeled antibodies of the invention. The antibody or fragment thereof is preferably provided by applying or removing the labeled antibody or fragment thereof to a biological sample. Through the use of this procedure, it is possible to measure the presence of CD20 as well as the main tissue of CD20 in the tissue examined. Using the present invention, those skilled in the art will readily recognize that any of a wide variety of histological methods (eg staining procedures) may be modified to achieve such in situ detection.

본 발명의 항체 또는 그의 절편은, "2자리" 또는 "샌드위치" 분석법으로도 알려진 면역계수측정법에서 이용을 위해 적합화될 수 있다. 전형적인 면역계수측정법에서, 다량의 비표지화 항체 또는 그의 절편은 처리될 유체에 불용성인 고체 지지체에 결합되고, 다량의 검출가능하게 표지화된 용해성 항체가 첨가되어 고체-상(solid-phase)의 항체, 항원 및 표지화된 항체 사이에 형성된 3성분 복합체의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 한다.Antibodies or fragments thereof of the present invention may be adapted for use in immuno counting assays, also known as "binary" or "sandwich" assays. In typical immuno counting assays, large amounts of unlabeled antibody or fragment thereof are bound to a solid support insoluble in the fluid to be treated and a large amount of detectably labeled soluble antibody is added to the solid-phase antibody, Enables detection and / or quantification of tricomponent complexes formed between antigens and labeled antibodies.

전형적이고 바람직한 면역계수측정법은, 고체상에 결합된 항체가 먼저 시험될 샘플과 접촉되어 2성분 고체상의 항체-CD20 복합체의 형성에 의해 샘플로부터 CD20을 추출하는 "전진" 분석법("forward" assay)을 포함한다. 적당한 인큐베이션 기간 후, 고체 지지체는 세척하여 만약에 있다면 미반응 CD20을 포함한 유체 샘플의 잔류물을 제거하고, 그 다음 공지된 양의 표지화된 항체("수용체 분자"로서 작용함)를 포함하는 용액과 접촉시킨다. 표지화된 항체가 비표지화된 항체 또는 그의 절편을 통하여 고체 지지체에 결합된 CD20과 복합체를 형성하도록 하는 제2 인큐베이션 기간 후에, 고체 지지체는 2번 세척하여 미반응 표지화된 항체 또는 그의 절편을 제거한다. 이러한 유형의 전진 샌드위치 분석법은 CD20이 존재하는지 여부를 결정하는 단순한 "네/아니오" 분석일 수 있거나 또는 표지화된 항체 도는 이의 절편의 양을 공지된 양의 CD20을 포함하는 표준 샘플에 대하여 얻은 것과 비교함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 "2자리" 또는 "샌드위치" 분석법은 Wide에 의해 기술되어 있다(Radioimmune Assay Method, Kirkham, ed., Livingstone, Edinburgh, 1970, pp. 199-206).A typical and preferred immunoassay is a "forward" assay in which an antibody bound to a solid phase is first contacted with a sample to be tested to extract CD20 from the sample by forming an antibody-CD20 complex on a bicomponent solid. Include. After a suitable incubation period, the solid support is washed to remove residues of the fluid sample, if any, including unreacted CD20, and then with a solution comprising a known amount of labeled antibody (acting as a "receptor molecule"). Contact. After the second incubation period such that the labeled antibody forms a complex with CD20 bound to the solid support through the unlabeled antibody or fragment thereof, the solid support is washed twice to remove the unreacted labeled antibody or fragment thereof. This type of advanced sandwich assay may be a simple "yes / no" assay to determine whether CD20 is present or compare the amount of labeled antibody or fragment thereof to that obtained for a standard sample containing a known amount of CD20. By quantification. Such "two digit" or "sandwich" assays are described by Wide (Radioimmune Assay Method, Kirkham, ed., Livingstone, Edinburgh, 1970, pp. 199-206).

또한 CD20에 유용할 수 있는 다른 유형의 "샌드위치" 분석법은 소위 "동시" 및 "역" 분석법이다. 동시 분석법은 단일 인큐베이션 단계를 수반하며, 여기에서 고체 지지체에 결합된 항체 및 표지화된 항체는 둘 다 시험될 샘플에 동시에 첨가된다. 인큐베이션이 완료된 후, 고체 지지체는 세척하여 유체 샘플 및 비복합체화 표지화된 항체의 잔류물을 제거한다. 그 다음 고체 지지체와 결합된 표지화된 항체의 존재는 통상적인 "전진" 샌드위치 분석법에서와 같이 측정된다.Other types of "sandwich" assays that may also be useful for CD20 are the so called "simultaneous" and "reverse" assays. Simultaneous assays involve a single incubation step, wherein both the antibody and labeled antibody bound to the solid support are added simultaneously to the sample to be tested. After incubation is complete, the solid support is washed to remove residues of fluid samples and uncomplexed labeled antibodies. The presence of the labeled antibody bound to the solid support is then measured as in conventional "advanced" sandwich assays.

"역" 분석법에서, 먼저 유체 샘플에 표지화된 항체 용액의 점차적인 첨가 후 적절한 인큐베이션 기간 후에 고체 지지체에 결합된 비표지화된 항체의 첨가가 이용된다. 제2 인큐베이션 후, 고체상은 통상적인 방식으로 세척하여 시험될 샘플 및 미반응 표지화된 향체의 용액의 잔류물을 제거한다. 그 다음 고체 지지체와 결합된 표지화된 항체의 측정은 "동시" 및 "전진" 분석법에서와 같이 측정된다. 하나의 양태에서, 개별적인 에피토프에 특이적인 본 발명의 항체의 조합은 민감한 3자리 면역방사 측정법을 구성하는데 사용돌 수 있다.In a "reverse" assay, first the gradual addition of a labeled antibody solution to the fluid sample followed by the addition of an unlabeled antibody bound to the solid support after an appropriate incubation period. After the second incubation, the solid phase is washed in a conventional manner to remove residues of the sample to be tested and the solution of unreacted labeled flavor. The measurement of the labeled antibody bound to the solid support is then measured as in the "simultaneous" and "advanced" assays. In one embodiment, the combination of antibodies of the invention specific for individual epitopes may be used to construct sensitive trident immunoassays.

본 발명의 항체 또는 그의 절편은 또한 생체 내 이미징에 유용하며, 여기에서 검출가능한 모이어티 예를 들어 방사선-불투과성 제제 또는 방사성 동위원소로 표지화된 항체는 개체에게, 바람직하게는 혈류로 투여되고, 숙주 내 표지화된 항체의 존재 및 위치가 분석된다. 이러한 이미징 기법은 악성 종양의 병기 결정(staging) 및 치료에 유용하다. 항체 또는 그의 절편은, 핵 자기 공명, 방사선학에 의하든, 또는 당업계에 공지된 다른 검출 수단에 의하든 숙주에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지화될 수 있다.Antibodies or fragments thereof of the present invention are also useful for in vivo imaging, wherein detectable moieties such as radiopaque agents or antibodies labeled with radioisotopes are administered to the subject, preferably in the bloodstream, The presence and location of the labeled antibody in the host is analyzed. Such imaging techniques are useful for staging and treatment of malignant tumors. The antibody or fragment thereof may be labeled with any moiety detectable in the host, whether by nuclear magnetic resonance, radiology, or by other detection means known in the art.

표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 검출가능한 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 표지는 비오틴 표지, 효소 표지(예컨대, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 및 호스래디쉬 퍼록시다아제), 방사성-표지(예컨대, 3H, 14C, 32P, 35S, 및 125I), 형광단 예를 들어 형광성 또는 화학 발광성 화합물(예컨대, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민), 조영제(예컨대, Tc-m99 및 ㅇ이인듐(111In)) 및 금속 이온(예컨대, 갈륨 및 유로퓸)일 수 있다.The label can be any detectable moiety capable of generating a detectable signal directly or indirectly. For example, the label may be a biotin label, an enzyme label (eg, luciferase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase and horseradish peroxidase), a radio-label (eg, 3 H, 14 C, 32). P, 35 S, and 125 I), fluorophores such as fluorescent or chemiluminescent compounds (eg fluorescein isothiocyanate, rhodamine), contrast agents (eg Tc-m99 and indium ( 111 In) ) And metal ions (eg, gallium and europium).

항체 또는 그의 절편을 표지에 컨쥬게이팅하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있으며, 이는 문헌[Hunter, et al., 1962, Nature 144:945; David et al., 1974, Biochemistry 13:1014; Pain et al., 1981, J. Immunol . Meth. 40:219; Nygren, J., 1982, Histochem . and Cytochem. 30:407]에 기술된 예시적인 방법을 포함한다.Any method known in the art for conjugating an antibody or fragment thereof to a label can be used, which is described by Hunter, et al., 1962, Nature 144: 945; David et al., 1974, Biochemistry 13: 1014; Pain et al., 1981, J. Immunol . Meth . 40: 219; Nygren, J., 1982, Histochem . and Cytochem . 30: 407].

본 발명의 항체 또는 그의 절편은 또한 이들의 세포 내 CD20의 기능의 억제에 기초한 생물학적 연구에서의 시약으로서 유용하다.Antibodies or fragments thereof of the invention are also useful as reagents in biological studies based on the inhibition of the function of CD20 in their cells.

본 발명의 항체 또는 그의 절편은 또한 친화 정화제(affinity purification agent)로서 유용하다. 이러한 공정에서, 항체는 예를 들어 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 적당한 지지체 상에 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 고정화된다. 따라서, CD20은 생물학적 샘플로부터 분리되고 정제될 수 있다.Antibodies or fragments thereof of the invention are also useful as affinity purification agents. In this process, the antibody is immobilized using methods well known in the art on a suitable support such as, for example, Sephadex resin or filter paper. Thus, CD20 can be isolated and purified from biological samples.

본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 절편 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.The invention further provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an antibody of the invention or a fragment thereof or an epitope-binding fragment thereof.

본 발명은 또한 CD20에 결합할 수 있고 본 발명의 항체 또는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 염격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 상기 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 6x SSC, 0.5% SDS, 5x 덴하르트 용액, 및 100㎎/㎖ 열 변성 연어 정자 DNA에서 2시간 동안 60℃에서 예비혼성화; 18시간 동안 60℃에서 혼성화; 4x SSC, 0.5% SDS, 0.1% 파이로인산나트륨에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척하고, 2x SSC, 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 2번 세척.The invention also encompasses polynucleotides encoding polypeptides that can bind to CD20 and hybridize under stringent hybridization conditions to polynucleotides encoding antibodies or fragments of the invention, wherein the stringent hybridization conditions include Pre-hybridize at 60 ° C. for 2 h in 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt's solution, and 100 mg / ml heat modified salmon sperm DNA; Hybridization at 60 ° C. for 18 hours; Wash twice at 60 ° C. for 30 minutes in 4 × SSC, 0.5% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate and twice at 60 ° C. for 30 minutes in 2 × SSC, 0.1% SDS.

당업계에 공지된 방법으로 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 항체 또는 그의 절편의 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(예컨대, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기술된 바와 같음)로부터 집합될 수 있으며, 이는 간단하게 항체를 암호화하는 서열의 일부분을 포함하는 중복되는 올리고뉴클레오티드의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 그 다음 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 수반한다.Polynucleotides can be obtained by methods known in the art and the nucleotide sequence of the polynucleotide can be determined. For example, using the nucleotide sequences of an antibody or fragment thereof presented herein, a polynucleotide encoding an antibody may be a chemically synthesized oligonucleotide (eg, Kutmeier et al., 1994, BioTechniques). 17: 242), which is simply a synthesis of overlapping oligonucleotides comprising a portion of the sequence encoding the antibody, annealing and ligation of such oligonucleotides, followed by ligation by PCR. Followed by amplification of the oligonucleotide.

항-CD20 항체 또는 절편을 암호화라는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 재조합 벡터의 조립 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 가변 도메인의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들 중 임의의 것의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.Methods of assembly of recombinant vectors comprising sequences encoding anti-CD20 antibodies or fragments and appropriate transcriptional and translational control signals are well known in the art. Such methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Accordingly, the present invention comprises a nucleotide sequence encoding an epitope-binding fragment of an antibody molecule of the invention, or a heavy or light chain thereof, or a heavy or light chain of a variable domain, or any of these, operably linked to a promoter. Provide a replicable vector.

재조합 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 그 다음 형질감염된 세포는 종래의 기법에 의해 배양되어 본 발명의 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 비상동 프로모터에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 항체, 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 바람작한 양태에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 암호화하는 벡터는 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있다.The recombinant vector is delivered to the host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce the antibodies of the invention. Accordingly, the invention includes host cells comprising a polynucleotide encoding an antibody of the invention, or an epitope-binding fragment thereof, operably linked to a nonhomologous promoter. In a preferred embodiment, vectors encoding both heavy and light chains can be co-expressed in host cells for the expression of whole immunoglobulin molecules.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 항-CD20 항체 또는 절편 분자를 발현하는데 이용될 수 있다, 이러한 숙주-발현 시스템은 관심의 암호화 서열이 생성되고 그 후 정제될 수 있게 하는 비히클을 나타내고, 또한 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질변환 또는 형질감염될 때 동일계 내에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 이에 한정되는 것은 아니지만 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질변환된 미생물, 예를 들어 박테리아(예컨대, 대장균 및 바실러스 서브틸리스); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질변환된 효모(예컨대, 사카로마이세스 및 피키아); 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질변환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구조체가 숨어있는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함한다.Various host-expression vector systems can be used to express anti-CD20 antibodies or fragment molecules of the invention, such host-expression systems exhibit a vehicle that allows the coding sequence of interest to be generated and then purified, and also Cells capable of expressing the antibody molecule of the invention in situ when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequence. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria (eg, E. coli and Bacillus subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors comprising sequences encoding antibodies; Yeast transformed with recombinant yeast expression vectors comprising sequences encoding antibodies (eg, Saccharomyces and Pichia); Insect cell systems infected with recombinant viral expression vectors (eg, baculovirus) comprising sequences encoding antibodies; Plant cells infected with a recombinant viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV); tobacco mosaic virus (TMV)) comprising a sequence encoding an antibody or transformed with a recombinant plasmid expression vector (eg Ti plasmid) system; Or a recombinant expression construct comprising a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter) Mammalian cell systems (eg, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 cells).

특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위하여 바람직하게는 대장균과 같은 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스 유래의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포가 항체에 대하여 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).Especially for the expression of the entire recombinant antibody molecule, preferably bacterial cells such as E. coli, more preferably eukaryotic cells, are used for expression of the recombinant antibody molecule. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) together with vectors such as the major intermediate early gene promoter element derived from human cytomegalovirus are effective expression systems for antibodies (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio / Technology 8: 2).

재조합 단백질의 장기간 동안 고수율 생산을 위하여 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전자 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적인 마커에 의해 제어된 DNA로 형질변환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 강화 배지에서 1~2일 동안 성장시킬 수 있으며, 그 다음 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 중 선택적인 마커는 선별에 대한 저항성을 제공하고, 세포가 플라스미드를 크로모좀으로 안정적으로 통합시킬 수 있게 하며, 성장하여 차례로 세포주로 클로닝되고 확장될 수 있는 중심을 형성한다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.Stable expression is desirable for high yield production of the recombinant protein for long periods of time. For example, cell lines that stably express the antibody molecule can be engineered. Rather than using an expression vector containing the viral origin of replication, the host cell is DNA controlled by appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, sequences, electron terminators, polyadenylation sites, etc.) and selective markers. Can be transformed into. After introduction of the foreign DNA, the engineered cells can be grown for 1-2 days in enriched medium and then replaced with selection medium. Selective markers in recombinant plasmids provide resistance to selection, allow cells to stably integrate the plasmid into chromosomes, and grow to form a center that can be cloned and expanded in turn into cell lines. Such methods can be advantageously used to engineer cell lines expressing antibody molecules. Such engineered cell lines may be particularly useful in the screening and evaluation of compounds that interact directly or indirectly with antibody molecules.

일단 본 발명의 항체 분자가 재조합으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제에 대하여 당업계에 알려진 임의의 분자, 예를 들어 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 뒤의 특이적인 항원에 대한 친화도에 의한 크로마토그래피, 및 분립 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도, 또는 단백질의 정제에 대하여 임의의 기타 표준 기법에 의하여 정제될 수 있다. 이와 관련하여, 미국 특허 제7,538,195호는 본 개시 내용에 언급되어 있으며, 이의 교시 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.Once the antibody molecule of the invention is recombinantly expressed, any molecule known in the art for purification of the immunoglobulin molecule, such as chromatography (eg, ion exchange, affinity, in particular a specific antigen after protein A) Chromatography by affinity for, and separate column chromatography), centrifugation, differential solubility, or purification of proteins, by any other standard technique. In this regard, US Pat. No. 7,538,195 is mentioned in the present disclosure, the teachings of which are incorporated herein by reference in their entirety.

다른 양태에서, 다양한 항체 및 항체 절편뿐만 아니라 항체 모방체는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 바와 같은 방법을 사용하여 특정 세트의 CDR 옆에 위치하는 가변 및 불변 영역 서열 내에서 돌연변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 Ab의 상이한 부류가 상이한 중쇄의 치환에 의해 주어진 세트의 CDR에 대하여 가능하며, 이것에 의하여, 예를 들어 IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE 항체 유형 및 아이소타입이 생성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범주 내에 속하는 인공적인 항체는 전체적 합성 골격 내에 주어진 세트의 CDR 내에 삽입함으로써 생성될 수 있다. 용어 "가변"은 본원에서 항체 사이의 서열에서 상이한 가변 도메인의 특정 부분을 기술하는데 사용되며, 항원에 대하여 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성은 보통 항체의 가변 도메인을 통해 고르게 분포된다. 전형적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3가지 분절 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다의 초가변 영역에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분은 골격(FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 CDR에 연결된 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 골격 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에서는 베타-시트 구조의 부분을 형성한다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(E. A. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, 1991, NIH). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합함에 있어서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.In other embodiments, various antibodies and antibody fragments, as well as antibody mimetics, may be mutated, deleted, and / or deleted within variable and constant region sequences positioned next to a particular set of CDRs using methods as disclosed herein or known in the art. Or by insertion. Thus, for example, different classes of Ab are possible for a set of CDRs given by substitution of different heavy chains, whereby, for example, IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE antibody types and isotypes Can be generated. Similarly, artificial antibodies within the scope of the present invention can be generated by inserting into a given set of CDRs within the overall synthetic backbone. The term “variable” is used herein to describe specific portions of variable domains that differ in the sequences between the antibodies and in the binding and specificity of each particular antibody to the antigen. However, the variability is usually evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in the hypervariable regions of three segments or both light and heavy chain variable domains, typically called complementarity determining regions (CDRs). The more conserved portions of the variable domains are called the backbone (FR). The variable domains of the heavy and light chains each comprise four backbone regions that adopt predominantly beta-sheet sequences linked to three CDRs, which form a loop connecting the beta-sheet structures, and in some cases beta-sheet structures To form part of. CDRs in each chain are bound in close proximity by the FR region and, together with CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen binding site of the antibody (EA Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest , fifth edition, 1991, NIH). The constant domains are not directly involved in binding the antibody to the antigen, but represent the participation of the antibody in various effector functions, eg, antibody-dependent cytotoxicity.

인간화 항체, 또는 다른 포유동물에 의한 비거부에 대해 적응된 항체는 몇몇 기술, 예를 들어 재표면화 및 CDR 그래프팅을 사용하여 생성될 수 있다. 재표면화 기술에서, 분자 모델링, 통계적 분석 및 돌연변이유발은 표적 숙주의 공지된 항체의 표면과 유사한 가변 영역의 비-CDR 표면을 조정하도록 결합된다. 항체의 재표면화 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내 항체의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은 미국 특허 제5,639,641호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. CDR 그래프팅 기술에서, 뮤린 중쇄 및 경쇄 CDR은 완전 인간 골격 서열로 그래프팅된다.Humanized antibodies, or antibodies adapted for non-rejection by other mammals, can be generated using several techniques, such as resurfacing and CDR grafting. In resurfacing techniques, molecular modeling, statistical analysis and mutagenesis are combined to mediate non-CDR surfaces of variable regions similar to those of known antibodies of the target host. Resurfacing strategies and methods of antibodies and other methods of reducing immunogenicity of antibodies in different hosts are disclosed in US Pat. No. 5,639,641, which is incorporated herein by reference in its entirety. In CDR grafting techniques, murine heavy and light chain CDRs are grafted into fully human framework sequences.

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 항체의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물은 항체의 결합 특징과 비슷한 결합 특징을 가지며, 예를 들어 키메라, 인간화 및 단일 사슬 항체뿐만 아니라 이의 절편을 포함한다. 이러한 기능적 동등물을 생성하는 방법은 PCT 출원 WO 93/21319, 유럽 특허 출원 제239,400호; PCT 출원 WO 89/09622; 유럽 특허 출원 338,745; 및 유럽 특허 출원 EP　332,424에 개시되어 있으며, 이들은 각각 전체가 참조로 포함되어 있다.The invention also includes functional equivalents of the antibodies described herein. Functional equivalents have binding characteristics similar to those of antibodies, and include, for example, chimeric, humanized and single chain antibodies as well as fragments thereof. Methods for producing such functional equivalents are described in PCT Application WO 93/21319, European Patent Application No. 239,400; PCT Application WO 89/09622; European Patent Application 338,745; And European Patent Application EP # 332,424, each of which is incorporated by reference in its entirety.

기능적 동등물은 본 발명의 항체의 가변 또는 초가변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 서열에 적용되는 "실질적으로 동일한"은, 문헌[Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따라서 FASTA 검색 방법에 의하여 측정된 바와 같이, 다른 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 가지는 서열로서 본원에서 정의된다. Functional equivalents include polypeptides having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of the variable or hypervariable region of the antibody of the invention. “Substantially identical” as applied to amino acid sequences are described in Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988), defined herein as having a sequence identity of at least about 90%, more preferably at least about 95% with respect to other amino acid sequences, as measured by the FASTA search method. do.

키메라 항체는 바람직하게 인간 항체 불변 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 불변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터의 가변 영역의 서열로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 가변 영역을 가진다. 항체의 인간화 형태는 인간 골격 도메인으로, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역을 치환함으로써 제조되며, 예컨대 PCT 공개 제W092/22653호를 참조할 수 있다. 인간화 항체는 바람직하게 상응하는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 상보성 결정 영역(CDR) 이외에 불변 영역 및 가변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 CDR을 가진다.The chimeric antibody preferably has a constant region derived substantially or exclusively from human antibody constant regions, and a variable region derived substantially or exclusively from sequences of variable regions from mammals other than humans. Humanized forms of antibodies are prepared by substituting the human framework domains, for example by complementarity determining regions of mouse antibodies, see eg PCT Publication No. W092 / 22653. Humanized antibodies preferably have constant and variable regions, in addition to complementarity determining regions (CDRs) derived substantially or exclusively from corresponding human antibody regions, and CDRs derived substantially or exclusively from mammals other than humans.

또한 기능적 동등물은, 또한 단일-사슬 항체(scFv)로 알려진, 단일-사슬 항체 절편을 포함한다. 이러한 절편은, 하나 이상의 상호 연결 링커를 이용하여 또는 이용하지 않고 항체 가변 경쇄 서열(VL)의 적어도 하나의 절편에 묶인 항체 가변 중쇄 아미노산 서열(VH)의 적어도 하나의 절편을 포함한다. 일단 단일-사슬 항체 절편이 유래하는 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성을 유지하기 위하여 연결된다면, 이러한 링커는 (VL) 및 (VH) 도메인의 적절한 3차원 접힘이 일어나는 것을 확실히 하도록 선택되는 짧고 유연한 펩티드일 수 있다. 일반적으로, (VL) 또는 (VH) 서열의 카복실 말단은 상보적인 (VL) 및 (VH) 서열의 아미노산 말단에 이러한 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 단일-사슬 항체 절편은 분자 클로닝, 항체 파지 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 기법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단백질은 진핵 세포 또는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아에서 생성될 수 있다.Functional equivalents also include single-chain antibody fragments, also known as single-chain antibodies (scFv). Such segments include at least one segment of an antibody variable heavy chain amino acid sequence (V H ) that is bound to at least one segment of antibody variable light chain sequence (V L ) with or without one or more interconnecting linkers. Once the single-chain antibody fragments are linked to maintain the target molecule binding-specificity of the entire antibody from which they are derived, these linkers are short and selected to ensure proper three-dimensional folding of the (V L ) and (V H ) domains occurs. It may be a flexible peptide. In general, (V L) or (V H) of the carboxyl-terminal sequence can be coupled in a complementary (V L) and (V H) shared by such a peptide linker to the amino terminus of the sequence ever. Single-chain antibody fragments can be generated by molecular cloning, antibody phage display libraries, or similar techniques. Such proteins may be produced in eukaryotic or prokaryotic cells, such as bacteria.

단일-사슬 항체 절편은 본 명세서에 기술된 전체 항체의 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 하나를 가지는 아미노산 서열을 포함하지만, 이러한 항체의 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결핍되어 있다. 이러한 불변 도메인은 항원 결합을 위하여 필요하지 않지만, 전체 항체의 구조의 주요 부분을 구성한다. 그러므로 단일-사슬 항체 절편은 불변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체의 사용과 연관된 문제점의 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일-사슬 항체 절편은 생물학적 분자와 중쇄 불변 영역, 또는 다른 원치 않는 생물학적 활성 사이의 원하지 않는 상호작용에서 자유로운 경향이 있다. 추가적으로, 단일-사슬 항체 절편은 전체 항체보다 상당히 더 작고, 따라서 전체 항체보다 더 높은 모세혈관 투과성을 가져서, 단일-사슬 항체 절편이 표적 항원-결합 부위에 보다 효과적으로 국재화되고 이에 결합될 수 있게 할 수 있다. 또한, 항체 절편은 원핵 세포에서 비교적 대규모로 생성될 수 있으며, 따라서 이의 생성을 용이하게 한다. 또한, 단일-사슬 항체 절편의 비교적 작은 크기는 이 절편이 전체 항체보다 수용체에서 면역 반응을 자극할 가능성이 더 낮게 한다.Single-chain antibody fragments comprise an amino acid sequence having at least one of the variable region or complementarity determining region (CDR) of the entire antibody described herein, but lacking some or all of the constant domains of such antibodies. Such constant domains are not required for antigen binding but constitute a major part of the structure of the entire antibody. Thus, single-chain antibody fragments can overcome some of the problems associated with the use of antibodies comprising some or all of the constant domains. For example, single-chain antibody fragments tend to be free from unwanted interactions between biological molecules and heavy chain constant regions, or other unwanted biological activity. In addition, single-chain antibody fragments are significantly smaller than whole antibodies, and thus have higher capillary permeability than whole antibodies, allowing single-chain antibody fragments to be more effectively localized and bound to the target antigen-binding site. Can be. In addition, antibody fragments can be produced on a relatively large scale in prokaryotic cells, thus facilitating their production. In addition, the relatively small size of the single-chain antibody fragments makes this fragment less likely to stimulate an immune response at the receptor than the entire antibody.

본원에 기술되어 있는 항-CD20 항체 및 이의 인간화 변이체에 대한 아미노산 및 핵산 서열의 지식은, 또한 인간 CD20에 결합하는 많은 항체를 개발하는데 사용될 수 있다. 몇몇 연구는, 1차 항체 서열의 지식을 기초로 하여, 결합 및 발현 수준과 같은 특성에 대하여 항체의 서열 중 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변화를 도입한 효과를 조사하였다(Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol . Biol ., 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539).Knowledge of amino acid and nucleic acid sequences for the anti-CD20 antibodies and humanized variants thereof described herein can also be used to develop many antibodies that bind to human CD20. Several studies have investigated the effect of introducing one or more amino acid changes at various positions in an antibody's sequence on properties such as binding and expression levels, based on knowledge of primary antibody sequences (Yang, WP et al., 1995, J. Mol . Biol . , 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 95, 8910-8915; Vaughan, TJ et al., 1998, Nature Biotechnology , 16, 535-539).

이들 연구에서, 1차 항체의 변이체는, 올리고뉴클레오티드-매개 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR, DNA 셔플링과 같은 방법, 또는 E.coli의 돌연변이 유발 유전자-균주를 사용하여, CDR1, CDR2, CDR3, 또는 골격 영역에서 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 생성되었다(Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in "Phage Display of Peptides and Proteins ", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). 1차 항체의 서열을 변화시키는 이러한 방법은 2차 항체의 친화도를 개선시켰다(Gram, H. et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97, 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol . Biol ., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol . Chem ., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem ., 276, 27622-27628).In these studies, variants of the primary antibody can be prepared using methods such as oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis, cassette mutagenesis, error-prone PCR, DNA shuffling, or mutagenesis gene-strains of E. coli , By altering the sequence of heavy and light chain genes in CDR1, CDR2, CDR3, or framework regions (Vaughan, TJ et al., 1998, Nature Biotechnology , 16, 535-539; Adey, NB et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in "Phage Display of Peptides and Proteins " , Eds. Kay, BK et al., Academic Press. This method of altering the sequence of the primary antibody improved the affinity of the secondary antibody (Gram, H. et al., 1992, Proc . Natl .. Acad Sci USA, 89, 3576-3580;.. Boder, eT et al, 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10701-10705;.... Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy , 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol . Biol . , 256, 77-88; Short, MK et al., 2002, J. Biol . Chem . , 277, 16365 -16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem . , 276, 27622-27628).

내용이 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는 특허 출원 공개 20090246195에 기술된 방법과 같은, 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시키는 유사한 지정된 전략에 의하여, 본 발명에 기술된 항체 서열은 개선된 기능을 가지는 항-CD20 항체를 개발하는데 사용될 수 있다.By similar designated strategies for changing one or more amino acid residues of an antibody, such as the method described in patent application publication 20090246195, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety, the antibody sequences described herein have improved functionality. It can be used to develop anti-CD20 antibodies.

검출가능한 모이어티에 항체를 컨쥬게이트하기 위하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 이는 문헌[Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)]; [David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)]; [Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]에 의해 기술된 것을 포함한다.Any method known in the art can be used to conjugate the antibody to a detectable moiety, including Hunter, et al., Nature 144: 945 (1962); David, et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); And Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982).

본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침강 분석법에 이용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).Antibodies of the invention can be used in any known assay method, eg, competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158). (CRC Press, Inc., 1987)).

본 발명의 항체는 또한 생체 내 이미징에 유용하며, 여기에서 검출가능한 모이어티 예를 들어 방사선-불투과성 제제 또는 방사성 동위원소로 표지화된 항체는 개체에게, 바람직하게는 혈류로 투여되고, 숙주 내 표지화된 항체의 존재 및 위치가 분석된다. 이러한 이미징 기법은 악성 종양의 병기 결정(staging) 및 치료에 유용하다. 항체는, 핵 자기 공명, 방사선학에 의하든, 또는 당업계에 공지된 다른 검출 수단에 의하든 숙주에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지화될 수 있다.Antibodies of the invention are also useful for in vivo imaging, wherein a detectable moiety such as a radio-impermeable agent or an antibody labeled with a radioisotope is administered to the subject, preferably in the bloodstream, and labeled in the host. The presence and location of the antibody was analyzed. Such imaging techniques are useful for staging and treatment of malignant tumors. Antibodies can be labeled with any moiety detectable in the host, whether by nuclear magnetic resonance, radiology, or by other detection means known in the art.

본 발명의 항체는 또한 친화 정화제로서 유용하다. 이러한 공정에서, 항체는 예를 들어 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 적당한 지지체 상에 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 고정화된다.Antibodies of the invention are also useful as affinity purification agents. In this process, the antibody is immobilized using methods well known in the art on a suitable support such as, for example, Sephadex resin or filter paper.

치료적Therapeutic 적용 apply

또한 CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법이 본 발명에 포함된다. 이러한 방법은 본 발명의 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트뿐만 아니라 본 발명의 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트를 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 이용한다. 적당한 치료제는 CD20을 발현하는 세포의 성장을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 것을 포함한다.Also included in the present invention are methods for inhibiting the growth of cells expressing CD20. Such methods utilize the antibodies or fragments or conjugates of the invention as well as the antibodies or fragments or conjugates of the invention in combination with one or more additional therapeutic agents. Suitable therapeutic agents include inhibiting, directly or indirectly, the growth of cells expressing CD20.

본원에서 사용된 용어 "억제하다" 및 "억제하는"은 세포 사멸을 포함하여 세포 성장에 대한 임의의 억제 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 억제 효과는 일시적 효과, 지속적 효과 및 영구적 효과를 포함한다.As used herein, the terms “inhibit” and “inhibiting” should be understood to include any inhibitory effect on cell growth, including cell death. Inhibitory effects include temporary effects, persistent effects, and permanent effects.

본 발명의 치료적 적용은 질환을 가지는 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법으로 치료되는 질환은 CD20의 발현을 특징으로 한다. 이러한 질환은 비호지킨 림프종 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병 및 B 세포 급성 림프구성 백혈병과 같은 B 세포 유래 악성 종양뿐만 아니라 비악성 자가면역 또는 염증성 장애, 예를 들어 RA를 포함하며, 여기에서 CD20 양성 B 세포는 질환 병태생리학에서 역할을 한다. 숙련된 기술자는 본 발명의 방법이 또한 CD20의 발현으로 기술되지만 이를 특징으로 하는 다른 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.Therapeutic applications of the invention include methods of treating a subject with a disease. The disease treated by the methods of the invention is characterized by the expression of CD20. Such diseases include non-malignant autoimmune or inflammatory disorders such as RA, as well as B cell-derived malignancies such as non-Hodgkin's lymphoma and B cell chronic lymphocytic leukemia and B cell acute lymphocytic leukemia, wherein CD20 positive B Cells play a role in disease pathophysiology. The skilled artisan can also be used to treat other diseases in which the methods of the invention are also described with the expression of CD20.

본 발명의 치료적 적용은 또한 시험관 내 및 생체 외에서 실시될 수 있다.Therapeutic application of the invention may also be carried out in vitro and ex vivo.

시험관 내 사용의 예는 B 세포 계통의 세포와 같이 CD20-양성 세포로 오염된 세포 집단의 정제를 포함한다. 상기 방법은 세포독성 huCD20-7 컨쥬게이트의 존재 하에서 세포 집단을 배양하고, 그 다음 사멸한 CD20-양성 세포의 제거를 포함한다. 비임상적 시험관 내 사용을 위한 조건은 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Uckun et al., 1986, J Exp . Med. 163,347-368]; [Uckun et al., 1985, J. Immunol. 134, 3504-3515]; [Ramakrishnan et al., 1985, J. Immunol. 135, 3616-3622] 참조).Examples of in vitro use include purification of a population of cells contaminated with CD20-positive cells, such as cells of the B cell lineage. The method comprises culturing a cell population in the presence of cytotoxic huCD20-7 conjugate and then removing dead CD20-positive cells. Conditions for nonclinical in vitro use are well known (eg, Uckun et al., 1986, J Exp . Med . 163,347-368); Uckun et al., 1985, J. Immunol . 134, 3504 -3515] (Ramakrishnan et al., 1985, J. Immunol . 135, 3616-3622).

고체 지지체에 부착된 본 발명의 항체, 절편 및 영역, 절편 또는 유도체는 또한 유체 또는 조직 또는 세포 추출물로부터 CD20을 제거하는데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 혈액 또는 혈장 생성물로부터 CD20을 제거하는데 사용된다. 다른 바람직한 양태에서, 뮤린 및 키메라 항체, 절편 및 영역은 체외 면역흡착제 장치에서 유리하게 사용되며, 이는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Seminars in Hematology, 26 (2 Suppl. 1) (1989)] 참조). 환자 혈액 또는 다른 체액은 부착된 항체에 노출되고, 체액이 신체로 되돌려진 후에, 순환하는 CD20(유리 또는 면역 복합체 형태)의 부분적 또는 완전한 제거를 초래한다. 이러한 면역흡착은 세포 원심분리 단계를 간섭하거나 또는 간섭하지 않고 연속 흐름 배열에서 시행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Terman, et al., J. Immunol. 11 7:1971-1975 (1976)]을 참조할 수 있다.Antibodies, fragments and regions, fragments or derivatives of the invention attached to a solid support can also be used to remove CD20 from a fluid or tissue or cell extract. In a preferred embodiment, it is used to remove CD20 from blood or plasma product. In another preferred embodiment, murine and chimeric antibodies, fragments and regions are advantageously used in in vitro immunosorbent devices, which are known in the art (see, eg, Seminars in Hematology, 26 (2 Suppl. 1) ( 1989). Patient blood or other body fluid is exposed to the attached antibody and after partial fluid returns to the body, results in partial or complete removal of circulating CD20 (in free or immune complex form). Such immunosorption can be performed in a continuous flow arrangement with or without interfering with the cell centrifugation step. See, eg, Terman, et al., J. Immunol. 11 7: 1971-1975 (1976).

본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 컨쥬게이트의 치료적 적용을 포함하며, 여기에서 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 개체에게 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 볼루스로서 정맥 내로 또는 일정 기간 동안 연속 주입에 의해, 근육 내, 피하, 관절 내, 활액 내(intrasynovial), 척추 강내, 경구, 국소적, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 또는 종양 내, 종양 주변부, 병변 내 또는 병변 주변부 경로에 의해 투여되어, 국부적뿐만 아니라 전신적 치료 효과를 발휘할 수 있다.The invention also encompasses therapeutic applications of the antibodies or conjugates of the invention, wherein the antibodies or conjugates may be administered to a subject in a pharmaceutically acceptable dosage form. The antibody or conjugate may be administered as a bolus intravenously or for a period of time by intramuscular, subcutaneous, intraarticular, intrasynovial, spinal, oral, topical, or inhalation routes. have. The antibody or conjugate can also be administered by the intratumoral, peri-tumoral, intra-lesional or peri-lesional route to exert local as well as systemic therapeutic effects.

약학적 제형Pharmaceutical formulation

치료적 적용을 위하여, 본 발명의 항체 또는 컨쥬게이트는 개체에게 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 투여된다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 볼루스로서 정맥 내로 또는 일정 기간 동안 연속 주입에 의해, 근육 내, 피하, 관절 내, 활액 내, 척추 강내, 경구, 국소적, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 컨쥬게이트는 또는 종양 내, 종양 주변부, 병변 내 또는 병변 주변부 경로에 의해 투여되어, 국부적뿐만 아니라 전신적 치료 효과를 발휘할 수 있다. 적당한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제는 잘 알려져 있으며, 임상적 상황 근거로서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 적당한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 다음을 포함한다: (1) 약 1㎎/㎖ 내지 25㎎/㎖ 인간 혈청 알부민을 포함하는 pH 약 7.4의 둘베코 인산 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline), (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v NaCl), (3) 5%(w/v) 덱스트로스 및 (4) 10mM 히스티딘 설페이트 pH 5.8, 6% 수크로스, 0.02% 폴리솔베이트 20.For therapeutic applications, an antibody or conjugate of the invention is administered to a subject in a pharmaceutically acceptable dosage form. The antibody or conjugate may be administered as a bolus intravenously or by a continuous infusion for a period of time, by intramuscular, subcutaneous, intraarticular, synovial, intravertebral, oral, topical, or inhalation route. The antibody or conjugate can also be administered by the intratumoral, peri-tumoral, intra-lesional or peri-lesional route to exert local as well as systemic therapeutic effects. Suitable pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients are well known and can be determined by one skilled in the art on the basis of clinical context. Examples of suitable carriers, diluents and / or excipients include: (1) Dulbecco's phosphate buffered saline at pH about 7.4 comprising about 1 mg / ml to 25 mg / ml human serum albumin. , (2) 0.9% saline (0.9% w / v NaCl), (3) 5% (w / v) dextrose and (4) 10 mM histidine sulfate pH 5.8, 6% sucrose, 0.02% polysorbate 20.

수용성 투약 형태에 존재할 때, 동결건조된 것보다는, 항체 또는 컨쥬게이트는 약 0.1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖ 범위 밖의 광범위한 변이가 허용되지만, 전형적으로 약 0.1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖의 농도에서 제형화될 것이다. 질환의 치료를 위하여, 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트의 적절한 투약량은, 항체 또는 컨쥬게이트는 예방 또는 상기 정의된 바와 같은 치료될 질환의 유형, 치료적 목적을 위하여 투여되든 아니든 질환의 중증도 및 진행, 이전 치료의 진행, 환자의 치료에 대한 병력 및 반응, 및 주치의의 판단에 좌우될 것이다. 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트는 동시에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 적당하게 투여된다.When present in a water soluble dosage form, rather than lyophilized, the antibody or conjugate allows for a wide variety of variations outside the range of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml, but typically at a concentration of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml Will be formulated. For the treatment of a disease, appropriate dosages of the antibody or fragment or conjugate may be used to determine the type of disease to be prevented or treated, the severity and progression of the disease, whether or not administered for therapeutic purposes as defined above. It will depend on the progress of treatment, the history and response of the patient's treatment, and the judgment of the attending physician. The antibody or fragment or conjugate is suitably administered to the patient simultaneously or over a series of treatments.

질환의 유형 및 중증도에 따라서, 환자 체중의 kg 당 항체 또는 컨쥬게이트 0.015 내지 25㎎은 예를 들어 하나 이상의 별개 투여에 의하여, 또는 연속 주입에 의하든 아니든 환자에게 투여를 위한 초기 후보 투약이다. 며칠 이상 동안 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라서, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투약 방법이 유용할 수 있으며 이는 배제되지 않는다.Depending on the type and severity of the disease, 0.015 to 25 mg of antibody or conjugate per kg of patient's body weight is the initial candidate dose for administration to the patient, for example by one or more separate administrations or by continuous infusion. For repeated administrations for a few days or more, depending on the condition, treatment is repeated until the desired inhibition of disease symptoms occurs. However, other dosage methods may be useful and are not excluded.

폐 투여를 위하여, 바람직하게 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 항체 절편 또는 컨쥬게이트 조성물은 폐 또는 부비강의 더 낮은 기도에 도달하는데 효과적인 입도로 전달된다. 본 발명에 따라서, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트는 흡입에 의한 치료제의 투여를 위하여 당업계에 공지된 다양한 흡입 또는 코 장치 중 임의의 것에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포에 에어로졸화된 제형을 침적시킨 수 있는 이러한 장치는 정량 흡입기, 네뷸라이저, 건조 분말 생성기, 분무기 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 코 투여를 지시하는데 적당한 다른 장치가 또한 당업계에 알려져 있다. 이러한 장치 모두 항체를 에어로졸로 분배하기 위하여 투여에 적당한 제형을 이용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. 벤토린(Ventolin(상표명)) 정량 흡입기와 같은 정량 흡입기는 전형적으로 추진제 기체를 사용하고 흡식 동안 작동을 필요로 한다(예컨대, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). 터부헬러(Turbuhaler(상표명))(Astra), 로타헬러(Rotahaler(상표명))(Glaxo), 디스커스(Diskus(상표명))(Glaxo), 스피로스(Spiros(상표명)) 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판되는 장치, 및 스핀헬러(Spinhaler(상표명)) 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡-작동(breath-actuation)을 사용한다(미국 특허 제4,668,218호 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, 미국 특허 제5,458,135호 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 전체가 본원에 참조로 포함되어 있음). AERx(상표명)(Aradigm), 울트라벤트(Ultravent(상표명)) 네뷸라이저(Mallinckrodt) 및 아콘 II(Acorn II(상표명)) 네뷸라이저(Marquest Medical Products)와 같은 네뷸라이저(미국 특허 제5,404,871호 Aradigm, WO 97/22376, 상기 참조문헌은 전체가 본원에 참고로 포함되어 있음)는 용액으로부터 에어로졸을 생성하는 반면, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소립자 에어로졸을 생성한다. 상업적으로 입수가능한 흡입 장치의 이러한 구체적인 예는 본 발명의 실시에 적당한 구체적인 장치의 대표적인 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게 믿음직하고, 재현가능하며 정확하다. 흡입 장치는 우수한 호흡적합성을 위하여 선택적으로, 예컨대 약 10㎛ 미만, 바람직하게는 약 1~5㎛인 건조 소립자를 전달할 수 있다.For pulmonary administration, preferably at least one anti-CD20 antibody or antibody fragment or conjugate composition is delivered at a particle size effective to reach the lower airways of the lung or sinus. In accordance with the present invention, at least one anti-CD20 antibody or fragment or conjugate may be delivered by any of a variety of inhalation or nasal devices known in the art for the administration of therapeutic agents by inhalation. Such devices capable of depositing aerosolized formulations in the sinus or alveoli of a patient include metered dose inhalers, nebulizers, dry powder generators, nebulizers, and the like. Other devices suitable for directing pulmonary or nasal administration of the antibody are also known in the art. All of these devices can utilize formulations suitable for administration to dispense the antibody into the aerosol. Such aerosols may consist of solutions (both aqueous and nonaqueous) or solid particles. Metered dose inhalers, such as the Ventolin ™ metered dose inhaler, typically use propellant gas and require operation during inhalation (see, eg, WO 94/16970, WO 98/35888). Turbuhaler (Astra), Rotahaler (Glaxo), Discus (Diskus) (Glaxo), Spiros (Spiros) Inhaler (Dura), Inhale Therapeutics Devices marketed by, and dry powder inhalers such as Spinhaler ™ powder inhalers use breath-actuation of mixed powders (US Pat. No. 4,668,218 Astra, EP 237507). Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US Pat. No. 5,458,135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, the entirety of which is incorporated herein by reference). Nebulizers (US Pat. No. 5,404,871 Aradigm, such as AERx®, Aradigm, Ultravent® Mallinckrodt, and Acorn II® Marquest Medical Products) WO 97/22376, the entirety of which is incorporated herein by reference in its entirety), produces aerosols from solution, while metered dose inhalers, dry powder inhalers and the like produce small particle aerosols. These specific examples of commercially available inhalation devices are intended to be representative of the specific devices suitable for the practice of the present invention, and are not intended to limit the scope of the present invention. Preferably, the composition comprising at least one anti-CD20 antibody or fragment or conjugate is delivered by a dry powder inhaler or nebulizer. There are some preferred features of the inhalation device for administering at least one antibody of the invention. For example, delivery by an inhalation device is advantageously reliable, reproducible and accurate. The inhalation device can optionally deliver dry small particles, such as less than about 10 μm, preferably about 1-5 μm, for good respiratory compatibility.

점막 표면을 통한 흡수를 위하여, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 절편 또는 컨쥬게이트를 투여하는 조성물 및 방법은 복수의 서브마이크론 입자, 점막 점착 고분자, 생물 활성 펩티드, 및 수성 연속상(이는 에멀젼 입자의 점막 점착을 달성함으로써 점막 표면을 통하여 흡수를 촉진함)을 포함하는 에멀젼을 포함한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀젼의 적용에 적당한 점액질 표면은 투여의 각막, 결막, 구강(buccal), 설하, 코, 질, 폐, 위, 장 및 직장 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제형, 예컨대 좌약은 부형제, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비강 내 투여용 제형은 고체일 수 있으며, 부형제로서, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 수성 또는 유성 용액의 점비액일 수 있다. 구강 투여에 있어서 부형제는 당, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 전호화분 녹말 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호).For absorption through the mucosal surface, compositions and methods for administering at least one anti-CD20 antibody or fragment or conjugate comprise a plurality of submicron particles, mucoadhesive polymers, bioactive peptides, and aqueous continuous phases (which are emulsions of emulsion particles). Emulsions to promote absorption through the mucosal surface by achieving mucoadhesive adhesion (US Pat. No. 5,514,670). Mucus surfaces suitable for application of the emulsions of the present invention may include corneal, conjunctival, buccal, sublingual, nasal, vaginal, lung, stomach, intestinal and rectal routes of administration. Formulations for vaginal or rectal administration, such as suppositories, may contain excipients such as polyalkylene glycols, petrolatum, cocoa butter and the like. Formulations for intranasal administration may be solid and may contain, for example, lactose or as nasal drops of aqueous or oily solutions. Excipients for oral administration include sugars, calcium stearate, magnesium stearate, pregelatinized starch and the like (US Pat. No. 5,849,695).

경피 투여에 있어서, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 컨쥬게이트는 전달 장치, 예를 들어 리포좀 또는 중합체 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어(달리 언급되어 있지 않다면 집합적으로 마이크로입자로서 지칭됨)로 캡슐화된다. 폴리하이드록시산 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 이의 공중합체, 폴리오르토에스터, 폴리안하이드라이드 및 폴리포스파젠과 같은 합성 중합체, 및 천연 중합체 예를 들어 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 알기네이트 및 기타 다당류, 및 이의 조합으로 만들어지는 마이크로입자를 포함하여, 다수의 적당한 장치가 알려져 있다(미국 특허 제5,814,599호).For transdermal administration, at least one anti-CD20 antibody or conjugate is a delivery device, such as liposomes or polymer nanoparticles, microparticles, microcapsules or microspheres (collectively referred to as microparticles unless otherwise stated). Is encapsulated. Polyhydroxy acids such as polylactic acid, polyglycolic acid, and copolymers thereof, synthetic polymers such as polyorthoesters, polyanhydrides and polyphosphazenes, and natural polymers such as collagen, polyamino acids, albumin and others Many suitable devices are known, including microparticles made from proteins, alginates and other polysaccharides, and combinations thereof (US Pat. No. 5,814,599).

본원에 인용된 모든 간행물 및 특허는 전체가 본원에 참조로 포함되어 있으며, 최신 기술 수준의 증거이다. 간행물은 임의의 과학적 또는 특허 공개물, 또는 모든 기록된, 전자 또는 인쇄된 형식을 포함하여 임의의 매체 형식으로 입수가능한 임의의 다른 정보를 지칭한다. 하기 참조문헌들은, 특히 본원에 기술된 바와 같은 항-CD20 항체, 절편, 컨쥬게이트, 제제, 조성물 등을 제조하는 것에 관련되는 내용에 대하여, 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow 및 Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001). 항체 및 이의 절편에 대한 다양한 언급은 또한 이의 사상 및 범주를 벗어나지 않고, 예를 들어 컨쥬게이트를 지칭하는 것으로 의미함이 당업자에게 명백하다. 이제 본 발명을 일반적으로 기술하며, 마찬가지로 특정 구체적인 실시예에 대한 언급에 의해 추가로 이해될 것이고, 실시예는 단지 예시의 목적으로 본원에 포함되어 있으며 달리 명시되어 있지 않다면 한정하는 것으로 의도되지 않는다.All publications and patents cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety and are evidence of the state of the art. A publication refers to any scientific or patent publication or any other information available in any media format, including all recorded, electronic or printed formats. The following references are hereby incorporated by reference in their entirety, particularly with respect to the contents relating to the preparation of anti-CD20 antibodies, fragments, conjugates, formulations, compositions and the like as described herein: Ausubel, et al. ., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., Eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001). It is apparent to those skilled in the art that various references to antibodies and fragments thereof are also meant to refer to, for example, conjugates without departing from its spirit and scope. The present invention is now described in general, and likewise will be further understood by reference to certain specific embodiments, which are included herein for illustrative purposes only and are not intended to be limiting unless otherwise specified.

실시예Example

세포주 및 성장Cell lines and growth

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달리 지시되지 않는다면 세포주를 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내 적절한 배지, 예를 들어 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신(시약 모두 Invitrogen 제품)으로 보충한 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 1주일에 2번씩 신선한 배지로 희석함으로써 계대배양하고, 0.2 ~ 1×106 세포수/㎖로 유지하였다.Unless otherwise indicated, the cell lines are supplemented with a suitable medium in a humidified 5% CO 2 incubator at 37 ° C., for example RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 1% penicillin-streptomycin (all reagents from Invitrogen). Grown in. Cells were passaged by dilution with fresh medium twice a week and maintained at 0.2-1 × 10 6 cells / ml.

실시예Example 1 One

뮤린Murine CD20CD20 항체의 생성 Generation of Antibodies

인간 CD20(GI 23110989)의 발현을 허용하는, XbaI 및 BamHI 제한 부위 옆에 위치하는 전체 CD20을 암호화하는 서열(CDS)를 포함하는 발현 플라스미드 pSRa-CD20을 구성하였다. Balb/c 마우스로부터 유래한 전 B 세포주인 300-19 세포를 상기 발현 플라스미드로 형질감염시켜 세포 표면 상에 높은 수준의 인간 CD20을 안정적으로 발현시키고, Balb/c VAF 마우스의 면역화에 사용하였다. 마우스는 당업자에게 공지된 표준 면역화 프로토콜, 예를 들어 ImmunoGen, Inc에서 사용된 프로토콜에 의하여 매 2~3주마다 마우스 당 대략 5×106 CD20-발현 300-19 세포를 이용하여 피하로 면역화하였다. 면역화된 마우스는 하이브리도마 생성을 위하여 희생되기 3일 전에 항원으로 부스팅시켰다. 마우스의 비장을 표준 동물 프로토콜, 예를 들어 2개의 살균한 반투명 현미경 슬라이드 사이에서 조직을 으깨서 RPMI-1640 배지 중 단일 세포 현탁액을 획득하는 것과 같은 프로토콜에 따라서 수집하였다. 비장 세포를 폴리에틸렌 글리콜-1500(Roche 783 641)을 사용하여 원심분리, 펠릿팅, 세척하고, 예를 들어 P3X63Ag8.653 세포(Kearney et al., J. Immunol., 123:1548-1550 (1979))와 같은 뮤린 골수종과 융합시켰다. 융합된 세포를 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT)(Sigma H-0262)을 포함하는 RPMI-1640 선택 배지에 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2에서 96-웰의 바닥이 평평한 배양 평판(Corning-Costar 3596, 웰 당 세포 현탁액 200㎕)에서의 성장을 위하여 선별하였다. 인큐베이션 5일 후, 배양 상청액 100㎕를 각각의 웰에서 제거하고, 하이포잔틴-티미딘(HT) 보충물(Sigma H-0137)을 포함하는 RPMI-1640 배지 100㎕로 대체하였다. 하이브리도마 클론이 항체 스크리닝을 위한 준비가 될 때까지 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션을 계속하였다. 면역화 및 하이브리도마 생성의 다른 기법, 예를 들어 문헌[Langone et al., Eds., "Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology, Academic Press, volume　121, Florida], 및 [Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988)]에 기술된 기법이 또한 사용될 수 있다.An expression plasmid pSRa-CD20 was constructed comprising a sequence (CDS) encoding the entire CD20, located next to the XbaI and BamHI restriction sites, which allowed expression of human CD20 (GI 23110989). 300-19 cells, a former B cell line derived from Balb / c mice, were transfected with the expression plasmid to stably express high levels of human CD20 on the cell surface and used for immunization of Balb / c VAF mice. Mice were immunized subcutaneously using approximately 5 × 10 6 CD20-expressing 300-19 cells per mouse every 2-3 weeks by standard immunization protocols known to those skilled in the art, such as those used by ImmunoGen, Inc. Immunized mice were boosted with antigen three days before sacrifice for hybridoma production. The spleens of the mice were collected according to standard animal protocols, for example protocols such as crushing tissue between two sterile translucent microscope slides to obtain a single cell suspension in RPMI-1640 medium. Spleen cells are centrifuged, pelleted, washed using polyethylene glycol-1500 (Roche 783 641), for example P3X63Ag8.653 cells (Kearney et al., J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979) And murine myeloma). The fused cells were resuspended in RPMI-1640 selection medium containing hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) (Sigma H-0262) and the bottom of the 96-well was flat at 37 ° C., 5% CO 2 . Selected for growth in culture plates (Corning-Costar 3596, 200 μl cell suspension per well). After 5 days of incubation, 100 μl of culture supernatant was removed from each well and replaced with 100 μl of RPMI-1640 medium containing hypoxanthine-thymidine (HT) supplement (Sigma H-0137). Incubation was continued at 37 ° C., 5% CO 2 until the hybridoma clones were ready for antibody screening. Other techniques of immunization and hybridoma production, such as Langone et al., Eds., "Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology , Academic Press, volume 121, Florida, and Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988) can also be used.

하이브리도마Hybridoma 스크리닝 및 선별 Screening and Screening

하이브리도마로부터의 배양 상청액은 CD20 발현 세포, 예를 들어 CD20-발현 300-19 세포에는 결합하지만 형질감염되지 않은 300-19 세포에는 결합하지 않는 마우스 단일클론 항체의 분비에 대하여 유세포 분석기로 스크리닝하였다. 하이브리도마 상청액 100μl를 3시간 동안 CD20-발현 300-19 세포 또는 형질감염되지 않은 300-19 세포(샘플 당 1×105 세포수)와 함께 100㎕ FACS 완충액(2% 정상 염소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 원심분리, 펠릿팅, 세척하고, PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG-항체(예를 들어 Jackson Laboratory에서 획득가능한 것, FACS 완충액 중 6㎍/㎖) 100㎕와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 원심분리, 펠릿팅하고, FACS 완충액으로 세척하며, 1% 폼알데하이드를 포함한 PBS 200㎕에 재현탁시켰다. 세포를 HTS 다중웰(multiwell) 샘플러를 가지는 FACSCalibur 유세포 분석기 또는 FACS 배열 유세포 분석기를 사용하여 획득하고, CellQuest Pro(모두 BD Biosciences(미국 샌디에이고 소재) 제품임)를 사용하여 분석하였다.Culture supernatants from hybridomas were screened by flow cytometry for the secretion of mouse monoclonal antibodies that bind to CD20 expressing cells, such as CD20-expressing 300-19 cells but not to untransfected 300-19 cells. . 100 μl of hybridoma supernatant was supplemented with 100 μl FACS buffer (2% normal goat serum) with CD20-expressing 300-19 cells or untransfected 300-19 cells (1 × 10 5 cells per sample) for 3 hours. Incubated in RPMI-1640 medium). Cells are then centrifuged, pelleted, washed and washed with 100 μl of PE-conjugated goat anti-mouse IgG-antibody (eg, available from Jackson Laboratory, 6 μg / ml in FACS buffer). Incubate for hours. Cells were again centrifuged, pelleted, washed with FACS buffer and resuspended in 200 μl of PBS with 1% formaldehyde. Cells were obtained using a FACSCalibur flow cytometer or FACS array flow cytometer with an HTS multiwell sampler and analyzed using CellQuest Pro (both from BD Biosciences, San Diego, USA).

양성 하이브리도마 클론을 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 유세포 분석기에 의하여 부모 세포와 CD20에 대하여 동일한 반응성을 보이는 각각의 하이브리도마로부터의 하나의 서브클론을 이후의 분석을 위하여 선택하였다. 안정적인 서브클론을 배양하고, 각각의 분비된 항-CD20 항체의 아이소타입을 상업적인 아이소타이핑 시약(Roche 1493027)을 사용하여 동정하였다. Positive hybridoma clones were subcloned by limiting dilution. One subclone from each hybridoma that showed identical reactivity to parent cells and CD20 by flow cytometry was selected for subsequent analysis. Stable subclones were cultured and the isotype of each secreted anti-CD20 antibody was identified using a commercial isotyping reagent (Roche 1493027).

항체 정제Antibody purification

항체는 표준 방법, 예를 들어 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(HiTrap Protein A 또는 G HP, 1㎖, Amersham Biosciences)를 사용하여 하이브리도마 서브클론 상청액으로부터 정제하였다. 간략하게, 상청액은 1M Tris/HCl 완충액(pH 8.0) 1/10 부피를 첨가함으로써 크로마토그래피용으로 준비하였다. pH-조절한 상청액을 0.22㎛ 여과막을 통하여 여과하고 결합 완충액(PBS, pH 7.3)으로 평형화시킨 칼럼 상에 로딩하였다. 280nm에서 흡광도가 없는 안정적인 기준선을 얻을 때까지 칼럼을 결합 완충액으로 세척하였다. 항체는 0.5㎖/분의 유속을 사용하여 0.15M NaCl을 포함하는 0.1M 아세트산 완충액(pH 2.8)으로 용출시켰다. 대략 0.25mL의 분획을 수집하고, 1M Tris/HCl(pH 8.0) 1/10 부피를 첨가함으로써 중화시켰다. 피크 분획(들)을 1×PBS에 대하여 2번 밤새 투석하고, 0.2㎛ 여과막을 통하여 여과시킴으로써 살균하였다. 정제된 항체는 A280에서 흡광도에 의해 정량화하였다.Antibodies were purified from hybridoma subclone supernatants using standard methods such as Protein A or G chromatography (HiTrap Protein A or G HP, 1 mL, Amersham Biosciences). Briefly, supernatants were prepared for chromatography by adding 1/10 volume of 1M Tris / HCl buffer (pH 8.0). The pH-controlled supernatant was filtered through a 0.22 μm filtration membrane and loaded onto a column equilibrated with binding buffer (PBS, pH 7.3). The column was washed with binding buffer until a stable baseline without absorbance at 280 nm was obtained. Antibodies were eluted with 0.1M acetic acid buffer (pH 2.8) containing 0.15M NaCl using a flow rate of 0.5ml / min. Approximately 0.25 mL of fractions were collected and neutralized by adding 1/10 volume of 1M Tris / HCl (pH 8.0). Peak fraction (s) were sterilized by dialysis twice over 1 × PBS and filtered through a 0.2 μm filtration membrane. Purified antibodies were quantified by absorbance at A280.

단백질 A 정제된 분획은 뮤린 항체에 대한 4차 암모늄(Q) 크로마토그래피와 함께 이온 교환 크로마토그래피(IEX)를 사용하여 추가로 폴리싱(polishing)하였다. 간략하게, 단백질 A 정제로부터의 샘플은 결합 완충액(10mM Tris, 10mM 염화나트륨, pH 8.0)으로 버퍼를 교환하고, 0.22㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 그 다음 준비한 샘플을 120㎝/hr의 유속에서 결합 완충액으로 평형화시킨 Q 빠른 흐름 수지(Q fast flow resin, GE Lifesciences) 상에 로딩하였다. 칼럼 크기는 샘플 중의 모든 MAb에 결합하기에 충분한 능력을 가지도록 선택하였다. 그 다음 280nm에서 흡광도가 없는 안정적인 기준선을 얻을 때까지 칼럼을 결합 완충액으로 세척하였다. 항체는 20 칼럼 부피(CV)에서 구배를 10mM 내지 500mM 염화나트륨으로 개시함으로써 용출시켰다. 피크 분획은 280nm에서(A280) 흡광도 측정에 기초하여 수집하였다. 단량체의 백분율은, Agilent HPLC 1100 시스템(Agilent, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)을 사용하여 SWXL 가드 칼럼(guard column), 6.0 × 40 mm(Tosoh Bioscience, 미국 펜실베니아주 몽고베리빌 소재)가 있는 TSK 겔 G3000SWXL, 7.8 ×300mm 상에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 평가하였다. 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획을 모으고, TFF 시스템을 사용하여 완충액을 PBS(pH 7.4)로 교환하였으며, 0.2㎛ 여과막을 통하여 여과시킴으로써 살균하였다. 정제된 항체의 IgG 농도는 흡광 계수 1.47을 사용하여 A280에 의해 결정하였다. 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT)와 같은 대안적인 방법이 또한 우수한 선택성을 가지는 항체를 폴리싱하는데 사용되었다. 입도가 40㎛인 II형 CHT 수지(Bio-Rad Laboratories)가 IEX 크로마토그래피에 대하여 기술된 바와 동일한 프로토콜을 가지고 사용되었다. CHT에 대한 결합 완충액은 20mM 인산나트륨(pH 7.0)에 해당하고, 항체는 20CV에 대하여 20~160mM 인산나트륨의 구배로 용출시켰다.Protein A purified fractions were further polished using ion exchange chromatography (IEX) with quaternary ammonium (Q) chromatography on murine antibodies. Briefly, samples from Protein A purification exchange buffers with binding buffer (10 mM Tris, 10 mM sodium chloride, pH 8.0) and filter through a 0.22 μm filter. The prepared samples were then loaded onto Q fast flow resin (GE Lifesciences) equilibrated with binding buffer at a flow rate of 120 cm / hr. The column size was chosen to have sufficient capacity to bind to all MAbs in the sample. The column was then washed with binding buffer until a stable baseline without absorbance at 280 nm was obtained. Antibodies were eluted by initiating a gradient with 10 mM to 500 mM sodium chloride at 20 column volumes (CV). Peak fractions were collected based on absorbance measurements at 280 nm (A280). Percentage of monomer was TSK gel with SWXL guard column, 6.0 × 40 mm (Tosoh Bioscience, Mongoberryville, Pa.) Using an Agilent HPLC 1100 system (Agilent, Santa Clara, Calif.) Evaluation was performed using G3000SWXL, size exclusion chromatography (SEC) on 7.8 × 300 mm. Fractions with a monomer content greater than 95% were collected and the buffer was exchanged into PBS (pH 7.4) using a TFF system and sterilized by filtration through a 0.2 μm filtration membrane. The IgG concentration of the purified antibody was determined by A280 using an extinction coefficient of 1.47. Alternative methods such as ceramic hydroxyapatite (CHT) have also been used to polish antibodies with good selectivity. Type II CHT resin (Bio-Rad Laboratories) with a particle size of 40 μm was used with the same protocol as described for IEX chromatography. Binding buffer for CHT corresponds to 20 mM sodium phosphate (pH 7.0), and antibodies were eluted with a gradient of 20-160 mM sodium phosphate over 20 CV.

실시예Example 2 2

유세포Flow cell 분석기에 의한 결합  Binding by analyzer 특징화Characterization

결합 특이성은 정제된 항체를 사용하여 유세포 분석기에 의해 시험하였다. CD20-발현 300-19 세포에 대한 muCD20-7 및 muCD20-6의 결합을 나타내는 FACS 히스토그램 및 부모 300-19 세포에의 결합 부재는 도 1에 나타내어져 있다. muCD20-7 또는 muCD20-6은 3시간 동안 CD20-발현 300-19 세포 또는 형질감염되지 않은 300-19 세포(샘플 당 1×105 세포수)와 함께 100㎕ FACS 완충액(2% 정상 염소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 펠릿팅, 세척하고, FITC-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG-항체(예를 들어 Jackson Laboratory에서 획득가능한 것, FACS 완충액 중 6㎍/㎖) 100㎕와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 펠릿팅하고, FACS 완충액으로 세척하며, 1% 폼알데하이드를 포함한 PBS 200㎕에 재현탁시켰다. 샘플을 HTS 다중웰(multiwell) 샘플러를 가지는 FACSCalibur 유세포 분석기 또는 FACS 배열 유세포 분석기를 사용하여 획득하고, CellQuest Pro(모두 BD Biosciences(미국 샌디에이고 소재) 제품임)를 사용하여 분석하였다.Binding specificity was tested by flow cytometry using purified antibodies. FACS histograms showing binding of muCD20-7 and muCD20-6 to CD20-expressing 300-19 cells and absence of binding to parent 300-19 cells are shown in FIG. 1. muCD20-7 or muCD20-6 were treated with 100 μl FACS buffer (2% normal goat serum) with CD20-expressing 300-19 cells or untransfected 300-19 cells (1 × 10 5 cells per sample) for 3 hours. Supplemented RPMI-1640 medium). Cells are then pelleted, washed and incubated for 1 hour with 100 μl of FITC-conjugated goat anti-mouse IgG-antibody (eg available from Jackson Laboratory, 6 μg / ml in FACS buffer). It was. Cells were pelleted again, washed with FACS buffer and resuspended in 200 μl of PBS with 1% formaldehyde. Samples were obtained using a FACSCalibur flow cytometer or FACS array flow cytometer with an HTS multiwell sampler and analyzed using CellQuest Pro (both from BD Biosciences, San Diego, USA).

muCD20-7 또는 muCD20-6과 함께 인큐베이션한 CD20-발현 300-19 세포의 FACS 히스토그램은 형광 편이(shift)를 나타낸 반면, 부모 300-19 세포는 그렇지 않았다(도 1). 또한, 어떤 세포주도 오직 FITC-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG-항체만과 인큐베이션하였을 때 유의한 형광 편이가 검출되지 않았다(도 1 하단).FACS histograms of CD20-expressing 300-19 cells incubated with muCD20-7 or muCD20-6 showed fluorescence shift, while parental 300-19 cells did not (FIG. 1). In addition, no cell lines detected significant fluorescence shift when incubated with only FITC-conjugated goat anti-mouse IgG-antibodies (bottom of FIG. 1).

형광 편이는 또한 BJAB 림프종 세포를 muCD20-7 또는 muCD20-6과 함께 인큐베이션하였을 때 관찰되었다(도 2). BJAB 세포는 다양한 농도의 muCD20-7 또는 muCD20-6항체와 함께 인큐베이션하였고, 유세포 분석법에 대하여 상기 기술한 바와 같이 처리하였다. 데이터 분석은 CellQuest Pro(BD Biosciences, 미국 샌디에이고 소재)를 사용하여 실행하였으며, 각각의 샘플에 대하여 FL1(MFI)에 대한 평균 형광 강도를 내보내어 반-대수(semi-log) 플롯으로 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. 투여량-반응 곡선은 비선형 회귀에 의해 생성되었고, BJAB 세포에의 결합에 대한 muCD20-7 또는 muCD20-6의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 GraphPad Prism v4(GraphPad software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 계산하였으며, 이는 각각 0.3nM 또는 0.4nM에 해당한다.Fluorescence shift was also observed when BJAB lymphoma cells were incubated with muCD20-7 or muCD20-6 (FIG. 2). BJAB cells were incubated with various concentrations of muCD20-7 or muCD20-6 antibodies and treated as described above for flow cytometry. Data analysis was performed using CellQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, USA), and the mean fluorescence intensity for FL1 (MFI) was exported for each sample to show antibody concentrations in a semi-log plot. Plot. Dose-response curves were generated by nonlinear regression, and the values for the apparent dissociation constant (K d ) of muCD20-7 or muCD20-6 for binding to BJAB cells were GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA, USA). Material), which corresponds to 0.3 nM or 0.4 nM, respectively.

실시예Example 3 3

뮤린Murine 항- term- CD20CD20 항체의  Antibody 프로아포토시스Proafotosis 활성 activation

항-CD20 항체 muCD20-2, muCD20-6 및 muCD20-7은 림프종 세포주의 아포토시스를 유도하였다. 아포토시스의 정도는 아넥신-V(Invitrogen)의 FITC 컨쥬게이트 및 TO-PRO(등록상표)-3(Invitrogen)으로 염색한 후 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 건강하고 정상인 세포에서, 포스파티딜세린은 막 이중층의 내부에 있고, 원형질막의 내부에서 외부 소엽으로 포스파티딜세린의 전위는 가장 일찍 검출가능한 아포토시스의 신호 중 하나이다. 아넥신 V는 온전한 세포의 세포막 이중층의 외부의 포스파티딜세린에 결합하지만 내부의 포스파티딜세린에는 결합하지 않는다. 그러므로 아넥신 V의 결합 정도는 아포토시스 유도의 지표이다. TO-PRO(등록상표)-3은 막 완결성(membrane integrity)이 아포토시스의 후기 단계에 일어나는 것과 같이 파괴되어 단지 원형질막을 관통할 수 있는 단량체 시아닌 핵산 염료이다. 세포의 3가지 집단이 2색 유세포 분석법으로 구별될 수 있다: 아포토시스가 아닌 세포(아넥신-V 음성 및 TO-PRO(등록상표)-3 음성), 초기 아포토시스 세포(아넥신-V 양성 및 TO-PRO(등록상표)-3 음성) 및 괴사 세포 또는 후기 아포토시스 세포(아넥신-V 양성 및 TO-PRO(등록상표)-3 양성).Anti-CD20 antibodies muCD20-2, muCD20-6 and muCD20-7 induced apoptosis of lymphoma cell lines. The degree of apoptosis was measured by flow cytometry after staining with FITC conjugate of Annexin-V (Invitrogen) and TO-PRO®-3 (Invitrogen). In healthy and normal cells, phosphatidylserine is inside the membrane bilayer and the translocation of phosphatidylserine from the interior of the plasma membrane to the outer lobules is one of the earliest detectable signals of apoptosis. Annexin V binds to phosphatidylserine outside of the cell membrane bilayer of intact cells, but not to phosphatidylserine inside. Therefore, the degree of binding of Annexin V is indicative of apoptosis induction. TO-PRO®-3 is a monomeric cyanine nucleic acid dye which can only penetrate the plasma membrane as membrane integrity is broken down as it occurs in the later stages of apoptosis. Three populations of cells can be distinguished by two-color flow cytometry: non-apoptotic cells (annexin-V negative and TO-PRO®-3 negative), early apoptotic cells (annexin-V positive and TO -PRO®-3 negative) and necrotic cells or late apoptotic cells (annexin-V positive and TO-PRO®-3 positive).

기하급수적으로 성장한 세포는 24-웰 플레이트에서 10% 소태아 혈청(FBS), 2mM L 글루타민, 및 50㎍/㎖ 겐타마이신으로 보충한 RMPI-1640 배지(하기 완전한 RMPI-1640 배지로서 나타냄)에 약 2×105 세포수/㎖로 도말(plating)하였다. 달리 언급되지 않는다면, 세포는 일반적으로 완전한 RMPI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 20~24시간 동안 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 항-CD20 항체 10nM과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 펠릿팅하고, 500㎕ PBS로 2번 세척하였으며, 100㎕ 결합 완충액(10mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2)에 재현탁시키고, 아넥신 V-FITC 5㎕로 얼음 상에서 15분 동안 염색하였다. 그 다음, 결합 완충액 400㎕ 및 TO-PRO(등록상표)-3 1μM을 혼합물에 첨가하고, FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3의 세포-결합 형광을 유세포 분석기로 즉시 측정하였다. 5000가지 경우를 각각의 샘플에 대하여 수집하였다. TO-PRO(등록상표)-3(FL4-H; y-축)의 형광 및 아넥신 V-FITC(FL1-H; x-축)에 대한 도트 플롯을 BD CellQuest 소프트웨어를 사용하여 생성하였다.Exponentially grown cells were weakly placed in RMPI-1640 medium (represented as complete RMPI-1640 medium below) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L glutamine, and 50 μg / ml gentamicin in 24-well plates. Plating was performed at 2 × 10 5 cell numbers / ml. Unless otherwise stated, cells were generally grown in complete RMPI-1640 medium. Cells were incubated with 10 nM anti-CD20 antibody in a humid 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 20-24 hours. Cells were then pelleted, washed twice with 500 μl PBS, resuspended in 100 μl binding buffer (10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2 ) and 5 μl Annexin V-FITC Were stained on ice for 15 minutes. 400 μL of binding buffer and 1 μM of TO-PRO®-3 were then added to the mixture and cell-bound fluorescence of FITC and TO-PRO®-3 was measured immediately by flow cytometry. 5000 cases were collected for each sample. Fluorescence of TO-PRO®-3 (FL4-H; y-axis) and dot plots for Annexin V-FITC (FL1-H; x-axis) were generated using BD CellQuest software.

아넥신-V 양성 세포(TO-PRO(등록상표)-3 양성 및 음성 세포 둘 다 포함함)의 백분율을 이들 플롯으로부터 각각의 샘플에 대하여 결정하였으며 이는 도 3에 나타내어져 있다. 본 발명자들의 항체 스크린으로부터 분리된 몇몇 항체는 프로아포토시스 활성에 대하여 리툭시맙과 비교하여 시험하였다. 미처리 세포의 약 5%만이 아넥신-V 양성인 것과 비교하여, muCD20-6, muCD20-7 또는 muCD20-2에 노출된 Ramos 세포의 70% 초과는 아넥신-V 양성이었다. 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 단지 13%만을 아넥신-V 양성 세포로 만들었다. 유사하게, 항체 muCD20-5를 이용한 처리는 12%를 아넥신-V 양성 세포로 만들었다.The percentage of Annexin-V positive cells (including both TO-PRO®-3 positive and negative cells) was determined for each sample from these plots and is shown in FIG. 3. Several antibodies isolated from our antibody screens were tested in comparison to rituximab for proapoptosis activity. More than 70% of Ramos cells exposed to muCD20-6, muCD20-7 or muCD20-2 were Annexin-V positive compared to only about 5% of untreated cells being Annexin-V positive. Treatment with the anti-CD20 antibody rituximab made only 13% of Annexin-V positive cells. Similarly, treatment with antibody muCD20-5 made 12% annexin-V positive cells.

마찬가지로, 미처리 세포의 5%가 아넥신-V 양성인 것과 비교하여, muCD20-7 또는 muCD20-2를 이용하여 처리된 Raji 세포의 60% 초과가 아넥신-V 양성 세포였다. 이러한 예상치 못한 활성은 이전에 분리된 II형 항체이며, 42%를 아넥신-V 양성 세포로 만드는 B1의 활성보다 훨씬 더 강하다. 리툭시맙과 함께 인큐베이션하면 14%가 아넥신-V 양성 세포로 되었다. muCD20-5 항체는 미처리 세포와 비교하여 보다 높은 백분율의 아넥신-V 양성 세포를 유도하지 않았다.Likewise, more than 60% of Raji cells treated with muCD20-7 or muCD20-2 were Annexin-V positive cells as compared to 5% of untreated cells annexin-V positive. This unexpected activity is a previously isolated type II antibody, which is much stronger than the activity of B1, which makes 42% Annexin-V positive cells. Incubation with rituximab resulted in 14% annexin-V positive cells. muCD20-5 antibody did not induce a higher percentage of Annexin-V positive cells compared to untreated cells.

실시예Example 4 4

지질뗏목Geological raft

항체 결합 후 지질뗏목으로 CD20의 재조직화는 효과적으로 보체 인자를 모집하고 CDC 활성을 유도하는 항체의 능력과 관련이 있었다. 지질뗏목으로 항체 유도된 CD20 재분배의 측정으로서, 본 발명자들은 상기한 문헌[Cragg et al. (2003)]으로부터 변형된 유세포 분석에 기초한 방법을 이용하였다. 본 분석법의 원리는 저온에서 지질뗏목 구획의 TritonX-100 불용성을 기초로 한다.Reorganization of CD20 into lipid rafts after antibody binding was associated with the ability of antibodies to effectively recruit complement factors and induce CDC activity. As a measure of antibody-induced CD20 redistribution with lipid rafts, the inventors described above in Cragg et al. (2003)] was used a method based on modified flow cytometry. The principle of this assay is based on TritonX-100 insolubility of the lipid raft compartment at low temperatures.

세포는 원심분리에 의해 수확하며, 1%　BSA가 있는 RPMI-1640에서 세척하고 재현탁시켰다. 2.5×106 세포수로 세포 0.2㎖를 이중으로 각각의 분석에 대하여 사용하였다. 항-CD20 항체를 10㎍/㎖로 첨가하고 샘플을 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 원심분리하고, 2번 세척하며 FACS 완충액(1×PBS, 1% BSA, 20mM Na-아자이드) 0.2㎖에 재현탁시켰다. 샘플을 얼음 상에서 차게 하고, 이때부터 차갑게 유지하였다. 항체 처리에 응하여 지질뗏목과 결합된 항원의 분획물을 검출하기 위하여, 샘플을 0.5% 트리톤X-100과 함께 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체의 전체 양을 검출하기 위하여, 샘플을 얼음 상에 15분 동안 그대로 두었다. 샘플을 FACS 완충액으로 2번 세척하였고, 1:200으로 희석된 FITC-결합된 염소 항-마우스-Ab를 이용하여 1시간 동안 얼음 상에서 염색하였다. 샘플을 원심분리하고, FACS 완충액으로 2번 세척하였으며, 고정을 위해 200㎕ PBS, 1% 폼알데하이드 중에 세포를 재현탁시켰다. 샘플을 유세포 분석기에 의해 획득하여 FL-1의 평균으로서 항-CD20 항체 결합을 결정하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 트리톤X-100 인큐베이션의 부재 하(미처리) 또는 존재 하(트리톤 처리)에서 각각의 샘플에 대하여 도 4에 플롯팅되어 있다.Cells were harvested by centrifugation, washed and resuspended in RPMI-1640 with 1% BSA. 0.2 ml cells were used for each assay in duplicate at 2.5 × 10 6 cell numbers. Anti-CD20 antibody was added at 10 μg / ml and the samples were incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Samples were centrifuged, washed twice and resuspended in 0.2 ml FACS buffer (1 × PBS, 1% BSA, 20 mM Na-azide). The sample was chilled on ice and kept cold from this time. Samples were incubated on ice for 15 minutes with 0.5% Triton X-100 to detect fractions of antigen bound to the lipid raft in response to antibody treatment. To detect the total amount of bound antibody, the sample was left on ice for 15 minutes. Samples were washed twice with FACS buffer and stained on ice for 1 hour using FITC-bound goat anti-mouse-Ab diluted 1: 200. Samples were centrifuged, washed twice with FACS buffer, and cells were resuspended in 200 μl PBS, 1% formaldehyde for fixation. Samples were obtained by flow cytometry to determine anti-CD20 antibody binding as the mean of FL-1. Average fluorescence intensity (MFI) is plotted in FIG. 4 for each sample in the absence (untreated) or presence (Triton treatment) of Triton X-100 incubation.

본 발명자들은, 대조군으로서 트리톤X-100 불용성 지질뗏목으로 CD20을 효율적으로 전위시키는 것으로 이미 밝혀진 I형 항체의 예인 리툭시맙을 사용하였다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 처리된 세포는 트리톤X-100 처리가 있는 경우와 트리톤X-100 처리가 없는 경우에 동일한 수준의 형광을 나타낸다. 반대로, muCD20-2로 염색된 세포의 MFI는 트리톤X-100 처리가 없는 경우보다 트리톤X-100 처리가 있는 경우에 훨씬 더 낮다. 이는, 앞서 기술된 II형 CD20 항체의 특징적인 특성인 지질뗏목으로 CD20을 재분배하는 muCD20-2의 무능력과 일관된다. 현저하게, muCD20-7로 염색된 세포의 MFI는 트리톤X-100 처리가 있는 경우 또는 없는 경우와 유사하다. 추가로, 본 발명자들은 또한 지질뗏목 활성의 muCD20-5 및 muCD20-6 항체를 시험하였다. muCD20-7에 대하여 보여지는 바와 같이, muCD20-5 또는 muCD20-6으로 염색한 세포의 MFI는 트리톤X-100 처리가 있는 경우 또는 없는 경우와 유사하다. 이러한 데이터는, 리툭시맙과 같이 muCD20-5, muCD20-6 및 muCD20-7이 림프종 세포막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있음을 나타낸다. 아넥신-V 분석법으로부터의 결과와 함께 취하면, 이는 muCD20-2가 II형 항체의 특징을 가짐을 입증한다. 이는 아포토시스를 강하게 유도할 수 있지만, 지질뗏목으로 CD20을 재분배를 시킬 수 없다. 반대로, muCD20-5는 I형 항체의 특징을 가진다. 이는 지질뗏목으로 CD20을 재분배시킬 수 있지만, 프로아포토시스 활성을 가지지 않는다.We used Rituximab, an example of a type I antibody that has already been found to efficiently translocate CD20 with Triton X-100 insoluble lipid rafts as a control. As expected, rituximab treated cells display the same level of fluorescence with Triton X-100 treatment and without Triton X-100 treatment. In contrast, the MFI of cells stained with muCD20-2 is much lower with Triton X-100 treatment than without Triton X-100 treatment. This is consistent with the inability of muCD20-2 to redistribute CD20 to lipid rafts, a characteristic characteristic of the type II CD20 antibodies described above. Remarkably, the MFI of cells stained with muCD20-7 is similar with or without Triton X-100 treatment. In addition, we also tested muCD20-5 and muCD20-6 antibodies of lipidraft activity. As shown for muCD20-7, MFI of cells stained with muCD20-5 or muCD20-6 is similar with or without Triton X-100 treatment. These data indicate that muCD20-5, muCD20-6 and muCD20-7, like rituximab, can efficiently translocate CD20 into the lipidraft compartment of lymphoma cell membranes. Taken together with the results from the Annexin-V assay, this demonstrates that muCD20-2 has the characteristics of type II antibodies. This can strongly induce apoptosis, but cannot redistribute CD20 to lipid rafts. In contrast, muCD20-5 has the characteristics of type I antibodies. It can redistribute CD20 to lipid rafts but does not have proapoptotic activity.

이러한 놀라운 결과는 muCD20-6 및 muCD20-7이 기능적인 특성의 특유하고 예상치 못한 조합을 가짐을 입증한다: 이것들은 I형 항체의 지질뗏목 활성 및 II형 항체에 대하여 전형적으로 나타나는 강한 프로아포토시스 활성을 모두 가진다.These surprising results demonstrate that muCD20-6 and muCD20-7 have distinctive and unexpected combinations of functional properties: they are indicative of the lipid raft activity of type I antibodies and the strong proapoptotic activity typically seen with type II antibodies. Have it all.

실시예Example 5 5

CD20CD20 -7 및 -7 and CD20CD20 -6 항체의 Of the -6 antibody VLVL 및  And VHVH 영역의  Area 클로닝Cloning 및 서열결정 And sequencing

전체 세포 RNA는 RNeasy 키트(QIAgen)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 CD20-7 및 CD20-6 하이브리도마의 5×106 세포로부터 제조하였다. 이후에 cDNA를 SuperScript II cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 전체 RNA로부터 합성하였다.Whole cell RNA was prepared from 5 × 10 6 cells of CD20-7 and CD20-6 hybridomas using the RNeasy kit (QIAgen) according to the manufacturer's protocol. The cDNA was then synthesized from total RNA using the SuperScript II cDNA Synthesis Kit (Invitrogen).

하이브리도마 세포로부터 유래한 cDNA 상의 제1 라운드 축퇴성 PCR 반응 동안의 절차는 문헌[Wang et al., (2000) J Immunol Methods. Jan 13;233(1-2):167-77] 및 [Co et al., (1992) J Immunol. Feb 15;148(4):1149-54)]에 기술된 방법을 기초로 하였다. VH 서열은 다음의 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다: EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(서열번호 37), EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(서열번호 48) 및 BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (서열번호 38). VL 서열은 다음의 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(서열번호 39) 및 HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(서열번호 40). (혼합된 염기는 다음과 같이 정의된다: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T).Procedures during the first round degenerate PCR reaction on cDNAs derived from hybridoma cells are described by Wang et al., (2000) J Immunol Methods. Jan 13; 233 (1-2): 167-77 and Co et al., (1992) J Immunol. Feb 15; 148 (4): 1149-54). VH sequences were amplified by PCR using the following degenerate primers: Eco MH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO: 37), Eco MH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO: 48) and BamIgG1 GGATTATCCATAGACAGAGGGG 38 VL sequences were amplified by PCR using the following degenerate primers: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO: 39) and HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO: 40). (Mixed bases are defined as follows: N = G + A + T + C, S = G + C, Y = C + T, M = A + C, R = A + G, W = A + T ).

그 다음 PCR 반응 혼합은 1% 저융점 아가로스 겔 상에서 실행되며, 300 내지 400bp의 밴드를 잘라내고, Zymo DNA 미니 칼럼을 사용하여 정제하며, 서열결정을 위하여 Agencourt Biosciences로 보냈다. 각각의 5' 및 3' PCR 프라이머를 서열결정 프라이머로서 사용하여 양 방향으로부터 가변 영역 cDNA를 생성하였다. VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 DNA 서열결정 결과로부터 추론하였다.PCR reaction mixing was then performed on a 1% low melting agarose gel, cut 300-400 bp bands, purified using a Zymo DNA mini column, and sent to Agencourt Biosciences for sequencing. Each 5 'and 3' PCR primer was used as a sequencing primer to generate variable region cDNA from both directions. The amino acid sequences of the VH and VL regions were inferred from the DNA sequencing results.

예비 cDNA 서열은, 항체 서열이 유래한 뮤린 생식세포계열 서열에 대한 NCBI IgBlast 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 검색하는데 사용하였다. 그 다음 PCR 프라이머는, 새로운 PCR 반응이 PCR 프라이머에 의해 변경되지 않는 완전한 가변 영역 cDNA 서열을 생성하도록 뮤린 항체의 생식세포계열이 연결된 리더 서열에 어닐링하도록 설계하였다. 추가로, RACE PCR 방법은 상기한 Co et al.의 문헌에 기술된 바와 같이 실행하여 CD20-7 중쇄의 완전 가변 영역 서열을 서열결정하였다. PCR 반응, 밴드 정제, 및 서열결정은 상기 기술된 바와 같이 실행하였다.The preliminary cDNA sequence was used to search the NCBI IgBlast site (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) for the murine germline sequence from which the antibody sequence was derived. The PCR primers were then designed to anneal to the leader sequence to which the germline of the murine antibody was linked so that the new PCR reaction produced a complete variable region cDNA sequence that was not altered by the PCR primers. In addition, the RACE PCR method was run as described in Co et al., Supra, to sequence the fully variable region sequences of the CD20-7 heavy chain. PCR reactions, band purification, and sequencing were performed as described above.

서열 확인을 위한 질량 결정Mass Determination for Sequence Identification

가변 영역에 대한 cDNA 서열 정보를 생식세포계열의 불변 영역 서열과 조합하여 전장 항체 cDNA 서열을 얻었다. 그 다음 중쇄 및 경쇄의 분자량을 계산하고, 뮤린 CD20-7 및 CD20-6 항체의 LC/MS 분석에 의하여 얻은 분자량과 비교하였다. 분자량 측정값은 CD20-7 및 CD20-6 경쇄 및 중쇄 둘 다에 대한 cDNA 서열과 일관된다.The full length antibody cDNA sequence was obtained by combining the cDNA sequence information for the variable regions with the constant region sequences of the germline. The molecular weights of the heavy and light chains were then calculated and compared to the molecular weights obtained by LC / MS analysis of murine CD20-7 and CD20-6 antibodies. Molecular weight measurements are consistent with cDNA sequences for both CD20-7 and CD20-6 light and heavy chains.

키메라화Chimera

경쇄 가변 영역에 대한 가변 서열은 pchCD20-7LCZ 플라스미드 내 EcoRI 및 BsiWI 부위로 클로닝한다. 중쇄 가변 영역은 pchCD20-7HCN 플라스미드 내 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝한다. 동등한 플라스미드를 chCD20-2, chCD20-9에 대하여 구성하였다. 이들 플라스미드는 표준 인산칼슘 절차(BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312)를 사용하여 HEK-293T 세포에서 키메라 항체를 발현시키는데 사용하였다. 상청액을 상기 기술된 바와 같이 표준 단백질 A 크로마토그래피 절차를 사용하여 정제하였으나, 폴리싱 크로마토그래피 단계는 카복시메틸(CM) 빠른 흐름 이온 교환(IEX) 수지(GE Lifesciences) 및 10mM 인산칼륨, 10mM 염화나트륨 결합 완충액(pH 7.5), 또는 상기 기술된 대안적인 CHT 방법을 사용하여 실행하였다.The variable sequences for the light chain variable regions are cloned into Eco RI and Bsi WI sites in the pchCD20-7LCZ plasmid. The heavy chain variable region is cloned into the Hind III and Apa 1 sites in the pchCD20-7HCN plasmid. Equivalent plasmids were constructed for chCD20-2 and chCD20-9. These plasmids were used to express chimeric antibodies in HEK-293T cells using standard calcium phosphate procedures (BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312). The supernatants were purified using standard Protein A chromatography procedures as described above, but the polishing chromatography step was performed using carboxymethyl (CM) fast flow ion exchange (IEX) resin (GE Lifesciences) and 10 mM potassium phosphate, 10 mM sodium chloride binding buffer. (pH 7.5), or using the alternative CHT method described above.

실시예Example 6 6

키메라chimera D20D20 -7의 -7 프로아포토시스Proafotosis 활성 activation

Ramos 세포 상에서 아포토시스를 유도하는 키메라 항체의 능력은 상기 실시예에서 뮤린 항체에 대하여 기술된 바와 같이 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3 염색을 사용하여 측정하였다. 각각의 키메라 항체 10nM을 Ramos 세포와 함께 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신-V 염색 및 유세포 분석법을 실시하였으며, 그 결과는 도 5에 제시되어 있다. 미처리 샘플에서 단지 11%만 아넥신-V 양성 세포이었던 것과 비교하여, chCD20-7 처리는 59%를 아넥신-V 양성 세포로 만들었다. chCD20-2 처리는 43%를 아넥신-V 양성 세포로 유도한 반면, 리툭시맙 처리는 미처리 세포와 유사한 수준의 아넥신-V 염색을 초래하였다. 그러므로, CD20-7은 키메라 후에 Ramos 세포에서 강한 아포토시스를 유래하는 현저한 능력을 유지하였다.The ability of chimeric antibodies to induce apoptosis on Ramos cells was determined using Annexin V-FITC and TO-PRO®-3 staining as described for murine antibodies in the above examples. Each chimeric antibody 10 nM was incubated with Ramos cells for 20 hours, followed by Annexin-V staining and flow cytometry, the results are shown in FIG. 5. The chCD20-7 treatment made 59% annexin-V positive cells, compared to only 11% of the annexin-V positive cells in the untreated samples. chCD20-2 treatment induced 43% of annexin-V positive cells, whereas rituximab treatment resulted in similar levels of annexin-V staining as untreated cells. Therefore, CD20-7 maintained a significant ability to induce strong apoptosis in Ramos cells after chimeras.

키메라chimera CD20CD20 -7의 -7 CDCCDC 활성 activation

키메라 항-CD20 항체의 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 평가하기 위하여, 세포를 기초로 한 분석을 공개된 방법(Gazzano-Santoro, J. Immunol . Methods , 202(2):163-171 (1997))에 따라서 실행하였다. 항체를 RHBP(RPMI-1640, 20mM HEPES, 0.1% BSA, 1% 페니실린-스트렙토마이신) 배지 중 전형적으로 5㎍/㎖(= 3.3×10-8M) 내지 2.3ng/㎖(= 1.5×10-11M)의 범위인 다양한 농도에서 평평한 바닥의 96-웰 조직 배양 플레이트에 50㎕/웰로 이중으로 나누어 넣었다. 표적 세포를 웰 당 RHBP 배지 100㎕ 중 5×104 세포수로 항체에 첨가하였다. 동결건조된 인간 보체(Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스 소재)를 바이알 당 1㎖ 살균 정제된 물과 함께 재구성하고, 사용 직전에 RHBP 배지를 이용하여 20% 저장액(stock)으로 5배 희석하였다.보체 용액을 50㎕/웰로 최종 농도 5%가 되도록 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 37℃, 5% CO2의 습한 인큐베이터에서 인큐베이션하여 보체 매개 융해가 일어나게 하였다. 인큐베이션 시간 후에, Alamar Blue 시약(Invitrogen)을 최종 농도가 10%가 되도록 각각의 웰에 첨가하여 남아있는 세포의 생존력을 측정하였다. EX540/EM590nm에서 형광을 측정(상대적 형광 단위(RFU)로 나타내)하기 전에 플레이트를 16 내지 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 대조군은 배지와 보체는 포함하지만 세포는 포함하지 않는 웰(배지만 있음, 생존력 0%) 및 세포와 보체는 포함하지만 항체는 포함하지 않는 웰(세포만 있음, 생존력 100%)의 3중 웰을 포함하였다. 각각의 샘플에 대한 구체적인 세포 생존력의 백분율은 다음의 식으로 결정하였다: 생존력 백분율 = (샘플 - 배지 단독)/(세포 단독 - 배지 단독).To assess complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity of chimeric anti-CD20 antibodies, a cell-based assay was published (Gazzano-Santoro, J. Immunol . Methods , 202 (2): 163-171 ( 1997). Antibodies are typically from 5 μg / ml (= 3.3 × 10 −8 M) to 2.3 ng / ml (= 1.5 × 10 − ) in RHBP (RPMI-1640, 20 mM HEPES, 0.1% BSA, 1% penicillin-streptomycin) medium. Divided into 50 μl / well in flat bottom 96-well tissue culture plates at various concentrations ranging from 11 M). Target cells were added to the antibody at 5 × 10 4 cell numbers in 100 μl of RHBP medium per well. Lyophilized human complement (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) was reconstituted with 1 ml sterile purified water per vial and diluted 5-fold with 20% stock using RHBP medium immediately before use. A solution was added to each well at 50 μl / well to a final concentration of 5%. Plates were incubated for 2 hours in a humid incubator at 37 ° C., 5% CO 2 to allow complement mediated fusion. After incubation time, Alamar Blue reagent (Invitrogen) was added to each well to a final concentration of 10% to determine the viability of the remaining cells. Plates were incubated at 37 ° C. for 16-20 hours before measuring fluorescence at EX540 / EM590 nm (expressed in relative fluorescence units (RFU)). Controls included triple wells of wells containing medium and complement but no cells (only medium, 0% viability) and wells containing cells and complement but no antibodies (only cells, 100% viability) It was. The specific percentage of cell viability for each sample was determined by the following formula: Percentage Viability = (Sample-Medium Only) / (Cell Only-Medium Only).

현저하게, chCD20-7 항체는 표 6에 나타낸 바와 같이 Daudi 및 WSU-DLCL-2 림프종 세포 둘 다에 대하여 리툭시맙과 유사한 CDC 활성을 가졌다. chCD20-7은 EC50이 Daudi 세포에 대하여 1.0nM이고 WSU-DLCL-2 세포에 대하여 2.2nM인 2가지 세포주 모두에서 세포 생존력을 완전히 감소시켰다. 리툭시맙은 EC50이 Daudi 세포에 대하여 1.1nM이고 WSU-DLCL-2 세포에 대하여 2.8nM인 CDC 활성을 가졌다. 전형적인 II형 항체에 대하여 예상된 바와 같이, chCD20-2는 Daudi 또는 WSU-DLCL-2 세포 어느 것에 대하여 CDC 활성을 가지지 않았다.Remarkably, the chCD20-7 antibody had CDX activity similar to rituximab against both Daudi and WSU-DLCL-2 lymphoma cells as shown in Table 6. chCD20-7 completely reduced cell viability in both cell lines where EC 50 was 1.0 nM for Daudi cells and 2.2 nM for WSU-DLCL-2 cells. Rituximab had CDC activity with an EC 50 of 1.1 nM for Daudi cells and 2.8 nM for WSU-DLCL-2 cells. As expected for a typical type II antibody, chCD20-2 did not have CDC activity against either Daudi or WSU-DLCL-2 cells.

실시예Example 7 7

항체 인간화Antibody Humanization

CD20-7 항체는 앞서 기술된 재표면화 방법, 예를 들어 문헌[Roguska et al., Proc . Natl. Acad . Sci ., USA, 91(3):969-973 (1994)] 및 [Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)]에 따라 인간화하였으며, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 재표면화는 일반적으로 경쇄 및 중쇄에서 가변 영역 표면 잔기의 동정 및 상기 잔기를 인간 동등물로 대체하는 것을 수반한다. 예시적인 CDR은 표 1에 나타낸 바와 같이 한정된다.CD20-7 antibodies can be prepared by the resurfacing methods described above, eg, in Roguska et al., Proc . Natl. Acad . Sci . , USA , 91 (3): 969-973 (1994) and Roguska et al., Protein Eng. 9 (10): 895-904 (1996), incorporated herein by reference in its entirety. Resurfacing generally involves identifying variable region surface residues in the light and heavy chains and replacing those residues with human equivalents. Exemplary CDRs are defined as shown in Table 1.

예시적인 Illustrative 재표면화Resurfacing CD20CD20 -7 -7 CDRCDR 경쇄Light chain CDR1: R A S G S V D S F G N S F M H (서열번호 17)CDR1: R A S G S V D S F G N S F M H (SEQ ID NO: 17) CDR2: R A S N L E S (서열번호 18)CDR2: R A S N L E S (SEQ ID NO: 18) CDR3: Q Q S Y E D P F T (서열번호 19)CDR3: Q Q S Y E D P F T (SEQ ID NO: 19) 중쇄Heavy chain CDR1: N Y G M N (서열번호 20)CDR1: N Y G M N (SEQ ID NO: 20) CDR2: W I N T Y T G E P S (서열번호 21)CDR2: W I N T Y T G E P S (SEQ ID NO: 21) CDR3: G A Y Y R Y D L G M D Y (서열번호 22)CDR3: G A Y Y R Y D L G M D Y (SEQ ID NO: 22) Kabat 한정된 Kabat Limited CD20CD20 -7 -7 HCHC CDR2CDR2 뮤린 HC CDR2: W I N T Y T G E P S Y A D D F K G (서열번호 23)Murine HC CDR2: WINTYTGEPS YADDFKG (SEQ ID NO: 23) 인간 HC CDR2: W I N T Y T G E P S Y A A P F K G (서열번호 24)Human HC CDR2: WINTYTGEPS YAAPFKG (SEQ ID NO: 24)

재표면화에 대하여 정의된 바와 같이 CD20-7 경쇄 및 중쇄 CDR은 표 1에 예로 주어져 있다. 중쇄 CDR2에 대한 Kabat 정의는 또한 뮤린 및 인간 CD20-7 둘 다에 대하여 주어져 있다. 밑줄친 서열은 재표면화를 위한 CDR로 여겨지지 않는 Kabat 중쇄 CDR2의 부분을 표시한다.CD20-7 light and heavy chain CDRs are given by way of example in Table 1 as defined for resurfacing. Kabat definitions for heavy chain CDR2 are also given for both murine and human CD20-7. Underlined sequences indicate portions of Kabat heavy chain CDR2 that are not considered CDRs for resurfacing.

표면 잔기 위치는 상대적인 접근가능성이 30% 이상인 임의의 위치로서 정의된다(Pedersen et al., J. Mol . Biol ., 235(3):959-973 (1994)). 표면 잔기는 가장 상동성인 인간 표면 서열을 동정하는 인간 생식세포계열 표면 서열과 함께 정렬된다. CD20-7에 대하여, 대체 서열로서 사용된 인간 생식세포계열 서열은 VL 및 VH 각각에 대하여 IGKV7-3*01 및 IGHV3-15*04이었다. 도 7의 목록으로부터 알 수 있는 바와 같이, 경쇄의 4개 표면 잔기 및 중쇄의 9개 표면 잔기 모두 인간 대응물로 대체하였다. 중쇄 잔기 S28은 CDR-H1에 아주 근접하여 있고, 인간 T28로의 치환은 결합 친화도의 감소를 초래할 수 있으므로, 뮤린 S28 잔기가 유지되는 제2 재표면화된 형태가 생성되었다. 도 8은 뮤린 대응물과 함께 경쇄 및 중쇄 모두의 CD20-7 가변 도메인에 대하여 재표면화된 서열의 정렬을 나타낸다.Surface residue positions are defined as any position where the relative accessibility is at least 30% (Pedersen et al., J. Mol . Biol . , 235 (3): 959-973 (1994)). Surface residues are aligned with human germline surface sequences that identify the most homologous human surface sequences. For CD20-7, the human germline sequences used as replacement sequences were IGKV7-3 * 01 and IGHV3-15 * 04 for V L and V H, respectively. As can be seen from the list in FIG. 7, all four surface residues of the light chain and nine surface residues of the heavy chain were replaced with human counterparts. Heavy chain residue S28 is in close proximity to CDR-H1, and substitution with human T28 can lead to a decrease in binding affinity, resulting in a second resurfaced form in which the murine S28 residue is maintained. 8 shows the alignment of the resurfaced sequences for the CD20-7 variable domains of both light and heavy chains with murine counterparts.

huCD20huCD20 -7 항체의 재조합 발현-7 Recombinant Expression of Antibody

huCD20-7에 대한 가변 영역 서열은 Blue Heron Biotechnology에 의해 코돈-최적화되고 합성하였다. 서열은 단일 사슬 포유동물 발현 플라스미드에서 각각의 불변 서열과 함께 인프레임(in-frame) 클로닝을 위한 제한 효소 부위가 옆에 위치한다. 경쇄 가변 영역은 phCD20-7LCZ 플라스미드 내 EcoRI 및 BsiWI 부위로 클로닝한다. 중쇄 가변 영역은 phCD20-7HCN 플라스미드 내 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝한다. 이들 플라스미드는 포유동물 세포에서 일시적 또는 안정적인 형질감염에서 huCD20-7을 발현하는데 사용될 수 있다. HEK-293T 세포에서 huCD20-7을 발현하는 일시적인 형질감염은 변형된 PEI 절차를 사용하여 실행하였다(Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30(2):E9 (2002)). 상청액은 키메라화된 항체에 대하여 상기 기술된 바와 같이 표준 절차를 사용하여 단백질 A 및 폴리싱 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다.The variable region sequence for huCD20-7 was codon-optimized and synthesized by Blue Heron Biotechnology. The sequence is flanked by restriction enzyme sites for in-frame cloning with each constant sequence in a single chain mammalian expression plasmid. The light chain variable region is cloned into the Eco RI and Bsi WI sites in the phCD20-7LCZ plasmid. The heavy chain variable region is cloned into the Hind III and Apa 1 sites in the phCD20-7HCN plasmid. These plasmids can be used to express huCD20-7 in transient or stable transfection in mammalian cells. Transient transfection expressing huCD20-7 in HEK-293T cells was performed using a modified PEI procedure (Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30 (2): E9 (2002)). Supernatants were purified by protein A and polishing chromatography steps using standard procedures as described above for chimericized antibodies.

참조 항체의 발현Expression of Reference Antibodies

huCD20-7의 항체를 비교하기 위하여, 앞서 동정된 항-CD20 항체를 클로닝하고 발현하였다. 2F2 항체(오파투무맙)의 HC 및 LC 가변 영역에 대한 아미노산 서열은, HC 가변 영역에 대하여 WO 2004/035607의 서열번호 2 및 LC 가변 영역에 대하여 WO 2004/035607의 서열번호 4를 사용하여 WO 2004/035607(Teeling et al. (2004), 상기함)로부터 유래하였다. 또한, GA101 항체의 HC 및 LC 가변 영역에 대한 아미노산 서열(아푸투주맙에 대한 기초)은 WO 2005/0448959로부터 유래하였다(Umana, 미국 특허 제5,639,641호(2005)). 기술된 B-HH6 구조체에 해당하는 WO 2005/0448959의 서열번호 40은 HC 가변 영역에 대하여 사용하였고, 기술된 B-KV1 구조체에 해당하는 WO 2005/0448959의 서열번호 76은 LC 가변 영역에 사용하였다.To compare the antibodies of huCD20-7, the previously identified anti-CD20 antibodies were cloned and expressed. The amino acid sequences for the HC and LC variable regions of the 2F2 antibody (Opatumumab) are given in WO using SEQ ID NO: 2 of WO 2004/035607 for HC variable region and SEQ ID NO: 4 of WO 2004/035607 for LC variable region. From 2004/035607 (Teeling et al. (2004), supra). In addition, the amino acid sequences for the HC and LC variable regions of the GA101 antibody (base for afutuzumab) were derived from WO 2005/0448959 (Umana, US Pat. No. 5,639,641 (2005)). SEQ ID NO: 40 of WO 2005/0448959, which corresponds to the described B-HH6 construct, was used for the HC variable region, and SEQ ID NO: 76 of WO 2005/0448959, which corresponds to the described B-KV1 construct, was used for the LC variable region. .

항체 모두에 대한 가변 영역 서열은 Blue Heron Biotechnology에 의해 코돈-최적화되고 합성하였다. 서열은 단일 사슬 포유동물 발현 플라스미드에서 각각의 불변 서열과 함께 인프레임(in-frame) 클로닝을 위한 제한 효소 부위가 옆에 위치한다. 클로닝, 발현 및 정제는 상기 huCD20-7에 대하여 기술된 바와 같이 수행하였다. 생성된 GA101-F 항체는 불변 영역에서 전형적인 푸코실화를 나타내고, 따라서 아푸투주맙에 사용된 탈푸코실화 형태가 아니다.Variable region sequences for all antibodies were codon-optimized and synthesized by Blue Heron Biotechnology. The sequence is flanked by restriction enzyme sites for in-frame cloning with each constant sequence in a single chain mammalian expression plasmid. Cloning, expression and purification were performed as described for huCD20-7 above. The resulting GA101-F antibodies exhibit typical fucosylation in the constant region and are therefore not the defucosylated form used for afutuzumab.

실시예Example 8 8

huCD20huCD20 -7의 결합 친화도Binding affinity of -7

BJAB 세포 및 muCD20-7, chCD20-7 또는 huCD20-7 항체를 사용하여 유세포 분석 결합 분석법을 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하고 분석하였다. 도 9는 각각의 항체에 대하여 비선형 회귀에 의해 생성된 투여량-반응 곡선을 나타낸다. 각각의 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 GraphPad Prism v4(GraphPad software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 계산하였다. muCD20-7, chCD20-7 및 huCD20-7에 대한 Kd는 각각 0.4nM, 0.5nM 및 0.5nM에 해당하므로, 키메라화 또는 인간화는 CD20-7의 결합 친화도에 영향을 미치지 않았다.Flow cytometric binding assays were performed and analyzed as described in Example 2 using BJAB cells and muCD20-7, chCD20-7 or huCD20-7 antibodies. 9 shows the dose-response curves generated by nonlinear regression for each antibody. The value for the apparent dissociation constant (K d ) of each antibody was calculated using GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA, USA). muCD20-7, chCD20-7 and so K d for huCD20-7 corresponds to each 0.4nM, 0.5nM and 0.5nM, chimeric or humanized did not affect the binding affinity of CD20-7.

ELISAELISA 에 의한 결합 Combined by 특징화Characterization

미정제 세포 융해물은 WSU-DLCL-2 세포(예컨대, CD20 항원의 공급원)로부터 제조하여 ELISA에 의해 결합 친화도를 측정하였다. WSU-DLCL-2 세포는 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내 롤러 병 중 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(시약 모두 Invitrogen 제품)으로 보충한 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고 세포 펠릿을 차가운 1×PBS로 2번 세척한 후, 용해 완충액(50mM Tris, pH 8, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜산나트륨, 25mM 옥틸글루코사이드)에서 융해하였다. 1㎖ 부피의 융해 완충액을 수확한 1×107 세포의 융해에 사용하였다. 세포 융해물을 22게이지 주사기 바늘을 10번 통과시킴으로써 균질화시켰고, 융해물을 45분 동안 4℃에서 회전시켰다. 상철액을 0.22마이크론 필터를 통하여 연과하고,분취하며, 액체 질소로 급속 냉동하고, -80℃에서 보관하였다. 전체 단백질 농도는 BCA 분석법(예컨대, Micro BCA Protein Assay Kit, PIERCE, US)에 의해 측정한다.Crude cell lysate was prepared from WSU-DLCL-2 cells (eg, a source of CD20 antigen) and measured binding affinity by ELISA. WSU-DLCL-2 cells were grown in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 1% penicillin-streptomycin (both reagents from Invitrogen) in roller bottles in a humidified 5% CO 2 incubator at 37 ° C. I was. The cells were harvested by centrifugation and the cell pellet washed twice with cold 1 × PBS, followed by lysis buffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 25 mM octylglucoside). A 1 ml volume of lysis buffer was used for fusion of harvested 1 × 10 7 cells. The cell lysate was homogenized by 10 passes through a 22 gauge syringe needle and the lysate was spun at 4 ° C. for 45 minutes. Supernatant was passed through a 0.22 micron filter, aliquoted, flash frozen with liquid nitrogen and stored at -80 ° C. Total protein concentration is determined by BCA assay (eg Micro BCA Protein Assay Kit, PIERCE, US).

ELISA 실험을 위하여, 융해물 제조물을 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6)중의 전체 단백질 5㎍/㎖로 희석하고, 100㎕/웰로 18 내지 24시간 동안 4℃에서 Immulon 2HB 플레이트 상에 코팅하였다. 그 다음 플레이트를 세척 완충액(TBST: 0.1% Tween-20/TBS, pH 7.4)으로 200㎕/웰로 3번 세척하였다. 플레이트는 차단 완충액(1% 카세인/TBS, pH 7.4) 200㎕/웰로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하였고, 그 다음 항체의 계열 희석물을 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 그 다음 이전과 같이 세척하였다. 차단 완충액 중 염소-항-인간 HRP의 1:5,000 희석물을 2차 항체로서 100㎕/웰로 첨가하였으며, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 그 다음 TMB1 기질(BioFX) 100㎕/웰을 첨가하였다. 반응은 20분 동안 진행시킨 후, 450nm 정지 시약(BioFX) 100㎕/웰로 퀀칭하였다. 450nm에서 흡광도를 판독하고 각각의 샘플에 있어서 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. S자형의 투여량-반응 곡선은 GraphPad Prism v4(GraphPad 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 결합 곡선에 대하여 일치시켰다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 10에 나타낸 huCD20-7 에 대한 결합 곡선으로부터 계산하였으며, 0.8nM에 해당한다.For ELISA experiments, the melt preparation is diluted with 5 μg / ml of total protein in coating buffer (15 mM Na 2 CO 3 , 35 mM NaHCO 3 , pH 9.6) and Immulon 2HB at 4 ° C. for 18-24 hours at 100 μl / well. Coating on the plate. Plates were then washed three times with 200 μl / well with wash buffer (TBST: 0.1% Tween-20 / TBS, pH 7.4). Plates were blocked with 200 μl / well of blocking buffer (1% casein / TBS, pH 7.4) at room temperature for 1 hour. Plates were washed as before and then serial dilutions of antibody were added to the plate at 100 μl / well. Plates were incubated for 3 hours at room temperature and then washed as before. A 1: 5,000 dilution of goat-anti-human HRP in blocking buffer was added at 100 μl / well as secondary antibody and incubated for 1 hour at room temperature. Plates were washed as before and then 100 μl / well of TMB1 substrate (BioFX) was added. The reaction was allowed to proceed for 20 minutes and then quenched with 100 μl / well of 450 nm stop reagent (BioFX). Absorbance was read at 450 nm and plotted against antibody concentration for each sample. S-shaped dose-response curves were matched against binding curves using GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA, USA). The value for the apparent dissociation constant (K d ) was calculated from the binding curve for huCD20-7 shown in FIG. 10 and corresponds to 0.8 nM.

실시예Example 9 9

mumu 및  And huCD20huCD20 -- 7의프로아포토시스7, proapopsis 활성 activation

huCD20-7의 프로아포토시스 활성을 muCD20-7의 활성과 비교하였다. Ramos 세포를 muCD20-7, huCD20-7 또는 huIgG 아이소타입 대조군 항체의 10nM, 1nM 또는 0.1nM 농도로 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 각각의 농도에 대하여 부모 아넥신-V 양성 세포는 도 11에 나타나 있다. huCD20-7은 muCD20-7의 강한 프로아포토시스 활성을 유지하였다. 아이소타입 대조군으로 처리된 세포의 6%가 아넥신-V 양성인 것과 비교하여, 어떤 항체 10nM로 처리한 후 Ramos 세포의 대략 60%가 아넥신-V 양성이다.The proapoptotic activity of huCD20-7 was compared with that of muCD20-7. Ramos cells were incubated at 10 nM, 1 nM or 0.1 nM concentrations of muCD20-7, huCD20-7 or huIgG isotype control antibodies for 20 hours and then stained with Annexin V-FITC and TO-PRO®-3 Analyzed with flow cytometer. Parent annexin-V positive cells for each concentration are shown in FIG. 11. huCD20-7 maintained the strong proapoptotic activity of muCD20-7. Approximately 60% of Ramos cells are Annexin-V positive after treatment with any antibody 10 nM compared to 6% of cells treated with the isotype control are Annexin-V positive.

huCD20huCD20 -7의 -7 프로아포토시스Proafotosis 활성 activation

Ramos 세포에 대한 huCD20-7의프로아포토시스 활성은 다른 CD20 항체와 비교하였다. 리툭시맙 및 2F2는 앞서 기술된 한정된 프로아포토시스 활성을 가지는 I형 항체인 반면, GA101 및 B1은 공지된 강한 프로아포토시스 활성을 가지는 II형 항체이다. "B1"은 벡사(상표명)(Coulter)의 비표지화된 형태에 해당하는 반면; "GA101-F"는 아푸투주맙 또는 GA101(Roche)의 푸코실화된 형태에 해당하고; "2F2"는 오파투무맙(Genmab)에 해당한다. 상이한 양의 각각의 항체를 Ramos 세포와 20시간 인큐베이션한 후, 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율은 도 12에 반-대수 플롯으로 항체 농도에 대하여 플롯팅하였고, EC50 값은 비선형 회귀 분석을 사용하여 일치시킨 곡선으로부터 계산하였다. huCD20-7은 아넥신-V 양성 세포의 최대 백분율이 50%이고 EC50가 0.2nM인 가장 강한 프로아포토시스 효과를 가진다. EC50가 0.8nM이면서 34%를 아넥신-V 양성 세포로 만드는 B1은 훨씬 더 강력하다. GA101-F는 덜 효과적이며 EC50이 1.7nM이면서 22%를 아넥신-V 양성 세포로 만든다. 리툭시맙은 Ramos 세포의 아포토시스에 대하여 한정된 영향을 미치며, EC50가 1.7nM이면서 12%를 아넥신-V 양성 세포로 만든다. 2F2 처리된 샘플 및 미처리된 샘플 모두 2F2는 Ramos 세포의 아포토시스를 유도하지 않음을 나타내는 2%의 아넥신-V 양성 세포를 포함한다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, B1에 의해 32%, GA101-F에 의해 20% 및 리툭시맙에 의해 10%가 유도된 것과 비교하여, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 48%의 아넥신-V 양성 Ramos 세포에 해당한다.The proapoptotic activity of huCD20-7 on Ramos cells was compared to other CD20 antibodies. Rituximab and 2F2 are type I antibodies with the limited proapoptic activity described above, while GA101 and B1 are known type II antibodies with strong proapoptic activity. "B1" corresponds to an unlabeled form of Coxter; "GA101-F" corresponds to the fucosylated form of aputuzumab or GA101 (Roche); "2F2" corresponds to opatumumab (Genmab). Different amounts of each antibody were incubated with Ramos cells for 20 hours, then stained with Annexin V-FITC and TO-PRO®-3 and analyzed by flow cytometry. The percentage of Annexin-V positive cells was plotted against antibody concentration in half-log plots in FIG. 12 and EC 50 values were calculated from the matched curves using nonlinear regression analysis. huCD20-7 has the strongest proapoptotic effect with a maximum percentage of Annexin-V positive cells of 50% and an EC 50 of 0.2 nM. B1, which has an EC 50 of 0.8 nM and makes 34% Annexin-V positive cells, is much more potent. GA101-F is less effective and makes 22% Annexin-V positive cells with an EC 50 of 1.7 nM. Rituximab has a limited effect on the apoptosis of Ramos cells, making 12% Annexin-V positive cells with an EC 50 of 1.7 nM. Both 2F2 treated and untreated samples included 2% Annexin-V positive cells indicating that 2F2 did not induce apoptosis of Ramos cells. After subtracting the untreated control value, it was 48% of annexin- induced by huCD20-7, compared to 32% by B1, 20% by GA101-F and 10% by rituximab. Corresponds to V positive Ramos cells.

세포주 패널에 대한 For cell line panels 프로아포토시스Proafotosis 활성 activation

GA101-F의 프로아포토시스 활성은 확장된 세포주 패널에 대하여 리툭시맙과 B1과 추가로 비교하였다. 각각의 세포주는 huCD20-7 또는 리툭시맙 10nM 또는 1.5㎍/㎖와 함께 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율은 각각의 항체 및 미처리 샘플에 대하여 플롯팅하였고, 이는 13A~13E에 제시되어 있다. huCD20-7 항체는 Ramos 및 Raji 림프종 세포주에서 리툭시맙 및 B1보다 더 활성적이었다. huCD20-7은 B1에 대하여 29%, 리툭시맙에 대하여 9%, 미처리 세포에 대하여 6%인 것과 비교하여 Ramos 림프종 세포에서 60%의 아넥신-V 양성 Ramos 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, B1에 의해 23% 및 리툭시맙에 의해 3%가 유도된 것과 비교하여, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 54%의 아넥신-V 양성 Ramos 세포에 해당한다. huCD20-7은 B1에 대하여 42%, 리툭시맙에 대하여 14%, 미처리 세포에 대하여 5%인 것과 비교하여 Raji 림프종 세포에서 58%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, B1에 의해 37% 및 리툭시맙에 의해 9%가 유도된 것과 비교하여, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 53%의 아넥신-V 양성 Raji 세포에 해당한다. 추가로, huCD20-7은 리툭시맙에 대하여 26%, 미처리 세포에 대하여 5%인 것과 비교하여 WSU-DLCL-2 DLBCL 세포에서 39%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 34%의 아넥신-V 양성 WSU-DLCL-2 세포에 해당하며, 리툭시맙에 의해서는 21%가 유도된다. huCD20-7은 리툭시맙에 대하여 9%, 미처리 세포에 대하여 8%인 것과 비교하여 Jeko-1 MCL 세포에서 20%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 12%의 아넥신-V 양성 Jeko-1 세포에 해당하며, 리툭시맙에 의해서는 단지 1%가 유도된다. 마지막으로, huCD20-7은 리툭시맙에 대하여 23%, 미처리 세포에 대하여 18%인 것과 비교하여 Granta-519 MCL 세포에서 58%의 아넥신-V 양성 세포를 유도하였다. 미처리 대조군 값을 차감한 후, 이는 huCD20-7에 의해 유도된 40%의 아넥신-V 양성 Granta-519 세포에 해당하며, 리툭시맙에 의해서는 단지 5%가 유도된다.The proapoptotic activity of GA101-F was further compared to rituximab and B1 for an expanded panel of cell lines. Each cell line was incubated with huCD20-7 or Rituximab 10 nM or 1.5 μg / ml for 20 hours, then stained with Annexin V-FITC and TO-PRO®-3 and analyzed by flow cytometry. The percentage of Annexin-V positive cells was plotted for each antibody and untreated sample, which is shown in 13A-13E. huCD20-7 antibody was more active than Rituximab and B1 in Ramos and Raji lymphoma cell lines. huCD20-7 induced 60% Annexin-V positive Ramos cells in Ramos lymphoma cells compared to 29% for B1, 9% for Rituximab, and 6% for untreated cells. After subtracting untreated control values, this corresponds to 54% of Annexin-V positive Ramos cells induced by huCD20-7 compared to 23% induced by B1 and 3% induced by rituximab. huCD20-7 induced 58% annexin-V positive cells in Raji lymphoma cells compared to 42% for B1, 14% for rituximab and 5% for untreated cells. After subtracting untreated control values, this corresponds to 53% Annexin-V positive Raji cells induced by huCD20-7, compared to 37% induced by B1 and 9% induced by rituximab. In addition, huCD20-7 induced 39% annexin-V positive cells in WSU-DLCL-2 DLBCL cells compared to 26% for rituximab and 5% for untreated cells. After subtracting the untreated control values, this corresponds to 34% of Annexin-V positive WSU-DLCL-2 cells induced by huCD20-7, with 21% induced by rituximab. huCD20-7 induced 20% Annexin-V positive cells in Jeko-1 MCL cells compared to 9% for rituximab and 8% for untreated cells. After subtracting untreated control values, this corresponds to 12% Annexin-V positive Jeko-1 cells induced by huCD20-7, with only 1% induced by rituximab. Finally, huCD20-7 induced 58% Annexin-V positive cells in Granta-519 MCL cells compared to 23% for rituximab and 18% for untreated cells. After subtracting untreated control values, this corresponds to 40% Annexin-V positive Granta-519 cells induced by huCD20-7, with only 5% induced by rituximab.

실시예Example 10 10

인간 항체를 사용한 지질뗏목 분석Lipid Raft Analysis Using Human Antibodies

Ramos 세포에 대한 지질뗏목 분석은 다른 CD20 항체와 비교하여 상기 기술된 바와 같이 huCD20-7에 대하여 수행하였다. 리툭시맙 및 2F2는 앞서 기술된 지질뗏목 활성을 가지는 I형 항체인 반면, GA101-F 및 B1 은 지질뗏목 활성이 없고 따라서 CDC 활성이 없는 II형 항체이다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 및 2F2 처리된 세포는 트리톤X-100 처리가 있는 경우와 트리톤X-100 처리가 없는 경우에 동일한 수준의 형광을 나타낸다(도 14). 반대로, B1 또는 GA101-F로 염색된 세포의 평균 형광은 지질뗏목으로 CD20을 재분배하는 B1 및 GA101-F의 무능력과 일관되게 트리톤X-100 처리가 없는 경우보다 트리톤X-100 처리가 있는 경우에 훨씬 더 낮다. 현저하게, huCD20-7로 염색된 세포의 평균 형광은 트리톤X-100 처리가 있는 경우 또는 없는 경우와 유사하다. 따라서, 리툭시맙 및 2F2와 같이 huCD20-7은 B 세포 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 효율적으로 전위시킬 수 있다.Lipid raft analysis on Ramos cells was performed on huCD20-7 as described above in comparison to other CD20 antibodies. Rituximab and 2F2 are type I antibodies with the lipidraft activity described above, while GA101-F and B1 are type II antibodies without lipidraft activity and thus no CDC activity. As expected, rituximab and 2F2 treated cells show the same level of fluorescence with Triton X-100 treatment and without Triton X-100 treatment (FIG. 14). In contrast, the mean fluorescence of cells stained with B1 or GA101-F is consistent with the inability of B1 and GA101-F to redistribute CD20 to lipid rafts in the presence of Triton X-100 treatment than in the absence of Triton X-100 treatment. Much lower. Remarkably, the mean fluorescence of cells stained with huCD20-7 is similar with or without Triton X-100 treatment. Thus, like rituximab and 2F2, huCD20-7 can efficiently translocate CD20 into the lipidraft compartment of the B cell membrane.

huCD20huCD20 -7의 -7 CDCCDC 활성 activation

리툭시맙 및 GA101-F와 비교하여 huCD20-7의 CDC 활성을 실시예 6에서 키메라 항체에 대하여 기술된 바와 같이 측정하였다. 현저하게, huCD20-7 항체는 도 15A에 나타낸 바와 같이 Daudi 림프종 세포에 대하여 리툭시맙과 유사한 CDC 활성을 가졌다. 리툭시맙 또는 huCD20-7 처리는 EC50이 각각 0.23 및 0.25㎍/㎖이어서 Daudi 세포 생존력을 완전히 감소시켰다. 예상된 바와 같이, 전형적인 II형 항체인 GA101-F는 Daudi 세포에 대하여 어떠한 CDC 활성을 보이지 않았다. 유사한 결과가 도 15B에 나타낸 바와 같이 Ramos 림프종 세포에서도 보여졌다. 리툭시맙 또는 huCD20-7 처리는 EC50이 각각 0.09 및 0.014㎍/㎖이어서 Ramos 세포 생존력을 완전히 감소시켰다. 예상된 바와 같이, 전형적인 II형 항체인 GA101-F는 Ramos 세포에 대하여 최소한의 CDC 활성을 가졌다.The CDC activity of huCD20-7 was measured as described for the chimeric antibody in Example 6 compared to rituximab and GA101-F. Remarkably, huCD20-7 antibody had CDX activity similar to rituximab against Daudi lymphoma cells as shown in FIG. 15A. Rituximab or huCD20-7 treatment completely reduced Daudi cell viability with EC 50 of 0.23 and 0.25 μg / ml, respectively. As expected, the typical type II antibody, GA101-F, showed no CDC activity against Daudi cells. Similar results were seen in Ramos lymphoma cells as shown in FIG. 15B. Rituximab or huCD20-7 treatment completely reduced Ramos cell viability with EC 50 of 0.09 and 0.014 μg / ml, respectively. As expected, the typical type II antibody, GA101-F, had minimal CDC activity against Ramos cells.

추가로, huCD20-7은 WSU-DLCL-2 및 RL 림프종 세포에 대하여 리툭시맙 보다 더 강력한 CDC 활성을 가졌다. 리툭시맙은 EC50이 1.9㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 WSU-DLCL-2 세포의 세포 생존력을 34%로 감소시켰다. 반대로, huCD20-7은 EC50이 0.58㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 WSU-DLCL-2 세포의 세포 생존력을 11%로 감소시켰다(도 16A). 리툭시맙은 EC50이 4.3㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 RL 세포의 세포 생존력을 56%로 중간 정도로 감소시켰다. 반대로, huCD20-7은 EC50이 훨씬 더 낮은 0.67㎍/㎖인 가장 높은 농도에서 RL 세포의 세포 생존력을 11%로 보다 더 완전히 감소시켰다(도 16B).In addition, huCD20-7 had stronger CDC activity than rituximab on WSU-DLCL-2 and RL lymphoma cells. Rituximab reduced the cell viability of WSU-DLCL-2 cells by 34% at the highest concentration with an EC 50 of 1.9 μg / ml. In contrast, huCD20-7 reduced the cell viability of WSU-DLCL-2 cells by 11% at the highest concentration with an EC 50 of 0.58 μg / ml (FIG. 16A). Rituximab moderately reduced the cell viability of RL cells to 56% at the highest concentrations with an EC 50 of 4.3 μg / ml. In contrast, huCD20-7 reduced the cell viability of RL cells more fully to 11% at the highest concentrations with a much lower EC 50 of 0.67 μg / ml (FIG. 16B).

실시예Example 11 11

huCD20huCD20 -7의 -7 ADCCADCC 활성 activation

락테이트 데하이드로게나아제(LDH) 방출 분석은 효과기 세포로서 새롭게 분리된 인간 자연 살생 세포(NK) 세포를 사용하여 종양 세포주의 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC)를 측정하는데 사용하였다(예컨대, Shields, J. Biol . Chem ., 276(9):6591-6604 (2001)). NK 세포는 NK Isolation Kit II(Miltenyi Biotech, 130-091-152)에 대한 변형된 프로토콜을 사용하여 먼저 정상 공여자(Research Blood Components, Inc., Brighton, MA)로부터의 인간 혈액으로부터 분리하였다. 혈액은 1×PBS를 이용하여 2배 희석하였다. 희석된 혈액 25㎖를 50㎖ 코니칼 튜브 중 Ficoll Paque 25㎖ 상에 조심스럽게 층을 이루게 하였고, 400g에서 45분 동안 실온에서 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 계면으로부터 수집하였고, 새로운 50㎖ 코니칼 튜브로 옮기며, 1×PBS로 한번 세척하였다. PBMC를 NK-분리 완충액(1×PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA) 2㎖에 재현탁시키고, 그 다음 Biotin-Antibody Cocktail 500㎕를 세포 현탁액에 첨가하였다. Biotin-Antibody Cocktail은 NK 세포를 제외한 림프구에 결합하는 비오틴화 항체를 포함하며, 이는 NK 세포의 음성 선별을 초래한다. 혼합물은 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 그 다음 NK-분리 완충액 1.5㎖ 및 Anti-Biotin Micro Bead 1㎖를 첨가하였다. 세포-항체 혼합물은 추가 15분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 NK-분리 완충액 50㎖를 이용하여 한번 세척하고 NK-분리 완충액 3㎖에 재현탁시켰다. 그 다음, MACS LS 칼럼을 autoMACS 분리기(Miltenyi Biotech) 상에 장착하고 NK-분리 완충액 3㎖를 이용하여 예비 세척하였다. 세포 현탁액을 자동으로 칼럼 상에 적용하고, 세척하며 비표지화 NK 세포를 포함한 용출액 분획을 새로운 50㎖ 코니칼 튜브로 수집하였다. 생성된 NK 세포는 완전 RPMI 배지(5% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1mM HEPES, 1mM 파이로인산나트륨, 1% 100X MEM 비필수 아미노산 용액이 보충된 RPMI-1640)의 30㎖로 밤새 도말하였다. 이후 분석 및 모든 희석은 RHBP 배지(20mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA 및 1%　페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 수행하였다.Lactate dehydrogenase (LDH) release assay was used to measure antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) of tumor cell lines using newly isolated human natural killer cells (NK) cells as effector cells (eg, Shields, J. Biol . Chem . , 276 (9): 6591-6604 (2001)). NK cells were first isolated from human blood from normal donors (Research Blood Components, Inc., Brighton, Mass.) Using a modified protocol for NK Isolation Kit II (Miltenyi Biotech, 130-091-152). Blood was diluted 2-fold using 1 × PBS. 25 ml of diluted blood were carefully layered on 25 ml Ficoll Paque in 50 ml conical tubes and centrifuged at 400 g for 45 minutes at room temperature. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected from the interface, transferred to a new 50 ml conical tube and washed once with 1 × PBS. PBMC was resuspended in 2 ml NK-separation buffer (1 × PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA), and then 500 μl Biotin-Antibody Cocktail was added to the cell suspension. Biotin-Antibody Cocktail contains biotinylated antibodies that bind to lymphocytes except NK cells, resulting in negative selection of NK cells. The mixture was incubated at 4 ° C. for 10 minutes, then 1.5 ml NK-separation buffer and 1 ml Anti-Biotin Micro Bead were added. The cell-antibody mixture was incubated at 4 ° C. for an additional 15 minutes. Cells were then washed once with 50 ml of NK-separation buffer and resuspended in 3 ml of NK-separation buffer. The MACS LS column was then mounted on an autoMACS separator (Miltenyi Biotech) and prewashed with 3 ml of NK-separation buffer. The cell suspension was automatically applied onto the column, washed and the eluate fractions containing unlabeled NK cells were collected in a new 50 ml conical tube. The resulting NK cells were with 30 ml of complete RPMI medium (RPM-1640 supplemented with 5% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, 1 mM HEPES, 1 mM sodium pyrophosphate, 1% 100X MEM non-essential amino acid solution). Smeared all night. Assays and all dilutions were then performed in RHBP medium (RPMI-1640 medium supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA and 1% penicillin-streptomycin).

RHBP 배지 중 다양한 농도의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 50㎕/웰로 이중으로 나누어 넣었다. 표적 세포를 RHBP 배지 중 106 세포수/㎖로 재현탁하고 항체 희석물을 포함하는 각각의 웰에 100㎕/웰로 첨가하였다. 표적 세포 및 항체 희석물을 포함하는 플레이트는 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, NK 세포를 표적 세포를 포함하는 웰에 50㎕/웰로 첨가하였다. 전형적인 비율은 3~4개 NK 세포에 대하여 약 1개의 표적 세포였다. 적어도 다음의 대조군을 각각의 실험에 대하여 설정하였다: NK 세포 단독, 표적 세포 단독(자발적인 LDH 방출), 표적 세포와 NK 세포(항체 독립적 LDH 방출), 표적 세포와 10% 트리톤X-100(최대 LDH 방출). 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 세포 융해가 가능하게 하였다. 플레이트를 10분 동안 1200rpm에서 원심분리하였고, 상청액 100㎕를 새로운 평평한 바닥의 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮겼다. Cytotoxicity Detection Kit(Roche 1 644 793)로부터의 LDH 반응 혼합물(100㎕/웰)을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 5 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 광학밀도를 490nm에서 측정하였다(OD490). 각각 샘플의 비 융해(specific lysis) 백분율은 다음 식을 사용하여 결정하였다: 비 융해 백분율 = (샘플 값 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출) * 100.Antibodies of varying concentrations in RHBP medium were divided in duplicate at 50 μl / well into round bottom 96-well plates. Target cells were resuspended at 10 6 cell count / ml in RHBP medium and added at 100 μl / well to each well containing antibody dilution. Plates containing target cells and antibody dilutions were incubated at 37 ° C. for 30 minutes. NK cells were then added at 50 μl / well to the wells containing the target cells. Typical ratios were about 1 target cell for 3-4 NK cells. At least the following controls were set for each experiment: NK cells alone, target cells alone (voluntary LDH release), target cells and NK cells (antibody independent LDH release), target cells and 10% Triton X-100 (maximum LDH). Release). The mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours to allow cell lysis. The plate was centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes and 100 μl of supernatant was carefully transferred to a fresh flat bottom 96-well plate. LDH reaction mixture (100 μl / well) from Cytotoxicity Detection Kit (Roche 1 644 793) was added to each well and incubated for 5-30 minutes at room temperature. The optical density of the sample was measured at 490 nm (OD490). The percent specific lysis of each sample was determined using the following formula: percent non-fusion = (sample value-spontaneous release) / (maximum release-spontaneous release) * 100.

huCD20-7와 함께 인큐베이션을 하면 인간 NK 효과기 세포의 존재 하에서 Ramos 림프종 및 JVM-13 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포에 대하여 우수한 ADCC를 야기한다. Ramos 림프종 세포에 대한 ADCC 활성은 huCD20-7, 리툭시맙, GA101-F 및　2F2에 대하여 비교하였다(도 17). huCD20-7을 이용한 처리는 대략 80%의 Ramos 세포 융해를 초래하였고, 이는 다른 CD20 항체를 이용하여 관찰된 활성과 유사하다. huCD20-7에 의한 ADCC 활성은 EC50가 1.1ng/㎖였고, 리툭시맙은 EC50가 3.5ng/㎖였으며, 2F2는 1.2ng/mL이고, GA101-F는 0.59ng/㎖였다. JVM-13 CLL 세포에 대한 huCD20-7의 ADCC 활성은 리툭시맙 및 2F2와 비교하였다. huCD20-7 처리는 리툭시맙 및 2F2와 유사한 대략 40%의 JVM-13 세포 융해를 야기하였다. huCD20-7에 의한 ADCC 활성은 EC50가 0.23ng/㎖였고, 리툭시맙은 EC50가 0.29ng/㎖였으며, 2F2는 0.17ng/㎖였다.Incubation with huCD20-7 results in good ADCC against Ramos lymphoma and JVM-13 chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells in the presence of human NK effector cells. ADCC activity against Ramos lymphoma cells was compared against huCD20-7, rituximab, GA101-F and 2F2 (FIG. 17). Treatment with huCD20-7 resulted in approximately 80% Ramos cell fusion, similar to the activity observed with other CD20 antibodies. ADCC activity by huCD20-7 was 1.1 ng / ml EC 50 , rituximab had 3.5 ng / ml EC 50 , 2F2 was 1.2 ng / ml and GA101-F was 0.59 ng / ml. ADCC activity of huCD20-7 on JVM-13 CLL cells was compared to rituximab and 2F2. huCD20-7 treatment resulted in approximately 40% JVM-13 cell lysis similar to rituximab and 2F2. ADCC activity by huCD20-7 was 0.23 ng / ml for EC 50 , Rituximab 0.22 ng / ml for EC 50 , and 0.17 ng / ml for 2F2.

실시예Example 12 12

에피토프Epitope 맵핑Mapping

CD20의 세포외 도메인은 2개의 세포외 루프를 포함한다. 더 큰 루프는 제3 막관통 도메인과 제4 막관통 도메인 사이에 대략 44개의 아미노산으로 이루어져 있다. 따라서 기술된 대부분의 CD20 항체는 효과적인 결합을 위하여 더 큰 루프에서 아미노산 잔기를 필요로 한다. 돌연변이유발 분석은 항체 결합에 있어서 중요한 잔기로서 적어도 알라닌 170(A170) 및 프롤린 172(P172)를 확인하였다(Polyak, Blood, 99:3256-3262 (2002); 및 Polyak, J. Immunol ., 161:3242-3248 (1998)). 세린으로 A170 및 P172를 변화시키면, 뮤린 CD20의 이 위치에서 발견되는 아미노산이 B1과 같이 CD20 항체의 결합을 무효화하였다. 또한 뮤린의 큰 세포외 루프를 포함하는 CD20으로 A170 및 P172 잔기의 도입은 B1 및 리툭시맙을 포함한 대부분의 CD20 항체의 결합을 허용하였다. 반대로, 2F2를 포함한 항체의 특이한 세포는 CD20 A170S P172S 변이체에 결합한다고 보고된것이 기술되어 있다 (상기한 Teeling et al. (2006)). 추가로, 아스파르트산으로 아스파라긴 163(N163) 또는 아스파라긴 166(N166)을 변화시키는 것은 2F2의 결합을 감소시키는 반면, 이는 B1 또는 리툭시맙과 같은 다른 항-CD20 항체의 결합에는 영향을 미치지 않았다(Teeling et al. (2006) Blood. 177:363-371). 이러한 신규 에피토프는 강력한 CDC 활성을 수반하지만 종양 세포에 대한 직접적인 프로아토포시스 활성을 한정하는 생물학적 활성에 관련되어 있음을 시사하였다. CD20-7 및 CD20-6을 추가로 특징화하기 위하여, 본 발명자들은 CD20 변이체에 대한 CD20-7 및 CD20-6 결합을 분석하였다.The extracellular domain of CD20 contains two extracellular loops. The larger loop consists of approximately 44 amino acids between the third transmembrane domain and the fourth transmembrane domain. Thus most of the CD20 antibodies described require amino acid residues in larger loops for effective binding. Mutagenesis analysis identified at least alanine 170 (A170) and proline 172 (P172) as important residues in antibody binding (Polyak, Blood , 99: 3256-3262 (2002); and Polyak, J. Immunol . , 161: 3242-3248 (1998). When A170 and P172 were changed with serine, the amino acid found at this position of murine CD20 negated the binding of the CD20 antibody like B1. The introduction of A170 and P172 residues into CD20, which also includes a large extracellular loop of murine, allowed binding of most CD20 antibodies, including B1 and rituximab. In contrast, it has been reported that specific cells of antibodies comprising 2F2 bind to the CD20 A170S P172S variant (Tiling et al. (2006), supra). In addition, changing asparagine 163 (N163) or asparagine 166 (N166) with aspartic acid reduced binding of 2F2, while this did not affect binding of other anti-CD20 antibodies such as B1 or rituximab ( Teeling et al. (2006) Blood. 177: 363-371). These new epitopes have been shown to be involved in biological activities that involve potent CDC activity but define direct proatopossis activity on tumor cells. To further characterize CD20-7 and CD20-6, we analyzed CD20-7 and CD20-6 binding to CD20 variants.

CD20CD20 변이체Mutant 클로닝Cloning 및 발현 And expression

발현 플라스미드 pSRa-CD20은 전체 인간 CD20 cDNA 서열, Blue Heron Biotechnologies에 의해 최적화되고 합성된 코돈을 포함하며, 이는 pSRa 벡터로 클로닝을 위한 XbaI 및 BamHI 제한 부위 옆에 위치한다. CD20-A170S P172S 변이체(CD20-AP)는, 5' 프라이머 hCD20sacAP-SS(ATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACT(서열번호 41))를 3' 말단 역방향 프라이머 SRaMfe1R(AATGCAATTGTTGTTGTTAACT(서열번호 42))와 함께 사용하여 PCR 돌연변이유발에 의해 형성되어, A170S P172S 돌연변이를 포함하는 pSRa-CD20 플라스미드의 SacI 내지 Mfe1 절편을 증폭하였다. 이러한 PCR 산물은 pSRa-CD20 플라스미드의 SacI 및 Mfe1 부위로 클로닝되었다. 돌연변이유발은, 제한 효소 절단 후 DNA 서열결정에 의해 확인된 생성된 클론에 EcoRI 부위 및 CD20 서열을 도입하였다. CD20 N163D N166D 이중 돌연변이체(CD20-NNDD) 및 CD20 N163D(CD20-N163D) 단일 돌연변이체는 5' 말단 프라이머에서 특이적 코돈을 변형함으로써 동일한 SacI 내지 Mfe1 절편의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성되었다. CD20 N163D N166D 돌연변이체 절편은 hCD20sacNN-DD 5' 말단 프라이머(ATTAGAGCTCACACACCATATATCGATATATACGATTGTGAACCA(서열번호 43))를 이용하여 증폭되었고, CD20 N163D 절편은 hCD20sacN163D 5' 말단 프라이머(ATTAGAGCTCACACACCATATATTGATATCTACAACTGTGA(서열번호 44))를 이용하여 증폭되었다. SacI 내지 Mfe1 PCR 절편은 pSRa-CD20의 SacI 및 Mfe1 내로 클로닝되었고, 구조체는 도입된 Cla1 또는 EcoRV 부위에 대하여 각각 스크리닝되었다. 양성 클론이 추가로 DNA 서열결정에 의해 확인되었다.The expression plasmid pSRa-CD20 contains the codon optimized and synthesized by the entire human CD20 cDNA sequence, Blue Heron Biotechnologies, which is located next to the Xba I and Bam HI restriction sites for cloning into the pSRa vector. The CD20-A170S P172S variant (CD20-AP) was sequenced with a 5 'primer hCD20sacAP-SS (ATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACT (SEQ ID NO: 41)) using the 3' terminal reverse primer SRaMfe1R (AATGCAATTGTTGTTGTTATA) mutation with sequence number Was formed to amplify the SacI to Mfe1 fragments of the pSRa-CD20 plasmid containing the A170S P172S mutation. This PCR product was cloned into the SacI and Mfe1 sites of the pSRa-CD20 plasmid. Mutagenesis introduced EcoRI sites and CD20 sequences into the resulting clones identified by DNA sequencing after restriction enzyme digestion. CD20 N163D N166D double mutant (CD20-NNDD) and CD20 N163D (CD20-N163D) single mutants were generated by PCR mutagenesis of the same SacI to Mfe1 fragments by modifying specific codons at the 5 'terminal primers. CD20 N163D N166D mutant fragments were amplified using hCD20sacNN-DD 5 ′ terminal primer (ATTAGAGCTCACACACCATATATCGATATATACGATTGTGAACCA (SEQ ID NO: 43)), and CD20 N163D fragment was amplified using hCD20sacN163D 5 ′ terminal primer (ATTAGAGC ACATACATATGT) . SacI to Mfe1 PCR fragments were cloned into SacI and Mfe1 of pSRa-CD20 and the constructs were screened for the introduced Cla1 or EcoRV sites, respectively. Positive clones were further confirmed by DNA sequencing.

안정적인 세포주는 공지된 전기천공법 절차를 사용하여 300-19 세포로 CD20 변이체 발현 플라스미드의 형질감염에 의해 생성되었다. 간략하게, 5×106 300-19 세포를 260V 및 960μF로 설정된 BioRad Gene Pulser를 사용하여 차가운 RPMI-1640 배지에서 전기청공하였다. 그 다음, 세포를 희석하고 96-웰 플레이트로 10% FBS 및 50μM β-메캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지 중에 도말하였다. 24시간 후 G418(예컨대, Invitrogen으로부터 입수가능한 것과 같은 것)을 최종 농도 2㎎/㎖로 첨가하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 2주 후, 단일 콜로니를 분리하고 확장하였다.Stable cell lines were generated by transfection of CD20 variant expression plasmids with 300-19 cells using known electroporation procedures. Briefly, 5 × 10 6 300-19 cells were electroporated in cold RPMI-1640 medium using BioRad Gene Pulser set at 260V and 960μF. Cells were then diluted and plated in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS and 50 μM β-mecaptoethanol in 96-well plates. After 24 hours, transfected cells were selected by adding G418 (eg, such as available from Invitrogen) at a final concentration of 2 mg / ml. After 2 weeks, single colonies were separated and expanded.

CD20CD20 변이체에In variants 대한 항체 결합 For antibody binding

인간 CD20 야생형 및 변이체를 발현하는 CD20 AP에 대한 다양한 CD20 항체의 결합은 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 도 18A 및 도 18B에서 알 수 있는 바와 같이, CD20-7 및 CD20-6을 포함한 모든 항체는 야생형 CD20 발현 세포에 결합하였다. CD20AP 변이체에 대하여 얻은 데이터는 도 19에 나타내어져 있다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 및 GA101-F는 CD20AP 변이체에 결합하지 않은 반면, B1은 최소한의 결합을 나타내었다. 반대로 2F2는 앞서 보고된 바와 같이 CD20AP 변이체에 결합할 수 있다(상기한 Teeling et al. (2006)). 놀랍게도, huCD20-7는 CD20AP 변이체에 결합한다(도 19A 참조). 유사하게, muCD20-6 및 muCD20-7은 또한 CD20AP 변이체에 결합할 수 있다(도 19B). N163D 및 N166D돌연변이는 2F2의 결합을 감소시키는 것으로 나타난 반면, B1 또는 리툭시맙과 같은 다른 항-CD20의 결합에는 영항을 미치지 않았다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 및GA101-F는 CD20-N163D 변이체에 결합한 반면, 2F2는 감소된 결합을 보였다(도 20A). 반대로, huCD20-7, muCD20-7 및 muCD20-6은 CD20 N163D에 대한 결합의 손실을 보였다. 유사하게, 리툭시맙 및 GA101-F는 CD20-N163D N166D 변이체에 결합한 반면, 2F2는 최소한의 결합을 보였다(도 21). 다시, huCD20-7, muCD20-7 및 muCD20-6은 CD20 N163D N166D에 대한 결합의 손실을 보였다.Binding of various CD20 antibodies to CD20 AP expressing human CD20 wild type and variants was analyzed by flow cytometry. As can be seen in FIGS. 18A and 18B, all antibodies, including CD20-7 and CD20-6, bound to wild type CD20 expressing cells. Data obtained for the CD20AP variant is shown in FIG. 19. As expected, Rituximab and GA101-F did not bind to CD20AP variants, while B1 showed minimal binding. In contrast, 2F2 can bind to CD20AP variants as previously reported (Teeling et al. (2006), above). Surprisingly, huCD20-7 binds to the CD20AP variant (see FIG. 19A). Similarly, muCD20-6 and muCD20-7 can also bind to CD20AP variants (FIG. 19B). N163D and N166D mutations have been shown to reduce binding of 2F2, while not affecting the binding of other anti-CD20s such as B1 or rituximab. As expected, Rituximab and GA101-F bound to CD20-N163D variants, whereas 2F2 showed reduced binding (FIG. 20A). In contrast, huCD20-7, muCD20-7 and muCD20-6 showed a loss of binding to CD20 N163D. Similarly, rituximab and GA101-F bound to CD20-N163D N166D variant, whereas 2F2 showed minimal binding (FIG. 21). Again, huCD20-7, muCD20-7 and muCD20-6 showed a loss of binding to CD20 N163D N166D.

이러한 예상치 못한 결과는 huCD20-7이 기능적으로 GA101 및 B1과 같은 II형 Abs에 관련되지만, 분명하게 이러한 항체보다는 상이한 에피토프를 필요로 함을 나타낸다. 대부분의 다른 항체와 달리, huCD20-7은 CD20의 A170 및 P172 잔기에 의존적이지 않다. 그러므로, huCD20-7은 지금까지 실현되지 않은 물리적 및 기능적 특성의 조합을 가진 신규한 CD20 항체이다.These unexpected results indicate that huCD20-7 is functionally related to type II Abs such as GA101 and B1, but clearly requires a different epitope than such antibodies. Unlike most other antibodies, huCD20-7 is not dependent on the A170 and P172 residues of CD20. Therefore, huCD20-7 is a novel CD20 antibody with a combination of physical and functional properties that have not been realized to date.

실시예Example 13 13

huCD20huCD20 -7--7- SPPSPP -- DM1DM1 의 제조Manufacturing

N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP) 링커를 에탄올에 용해시켰다. huCD20-7 항체를 50mM NaCl, 2mM EDTA, 및 5% 에탄올을 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5) 중에서 8㎎/㎖로 7배 몰 과량의 SPP 링커와 함께 대략 100분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 앞서 언급한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후의 단계에 사용하였다.N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate (SPP) linker was dissolved in ethanol. huCD20-7 antibody was incubated at room temperature for approximately 100 minutes with a 7-fold molar excess of SPP linker at 8 mg / ml in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, and 5% ethanol. The reaction mixture was purified using a SEPHADEX ™ G25F column equilibrated with the aforementioned potassium phosphate buffer. Fractions containing the antibody were collected and used for later steps.

예시적인 메이탄시노이드 DM1은 다이메틸아세트아마이드(DMA, 최종 농도는 3%임)에 용해시키고, 링커에 비하여 1.7배 몰 과량을 SPP 변형된 항체에 적가하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 컨쥬게이트된 항체를 pH 6.5에서 인산 완충 식염수(PBS)로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그 다음 huCD20-7-SPP-DM1 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM1 분자의 수는 항체 및 DM1에 대하여 앞서 보고된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). 컨쥬게이션 반응 후 존재하는 유리 메이탄시노이드의 백분율은 100mM 암모늄 아세테이트 완충액(pH 7.0) 중 25% 아세토나이트릴로 평형화된 HiSep(상표명) 칼럼 상에 20~50㎍ 컨쥬게이트를 주입하고, 아세토니트릴로 용출시킴으로서 결정하였다. 전체 유리 메이탄시노이드 종(구배로 용출되고 공지된 표준물질의 용출 시간과 비교하여 확인함)의 피크 면적은 파장이 252nm로 설정된 흡광도 검출기를 사용하여 측정하고 결합된 메이탄시노이드(칼럼 관류(flow-through) 분획에서 컨쥬게이트 피크로 용출됨)와 관련된 피크 면적과 비교하여 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율을 계산하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM1 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.Exemplary maytansinoid DM1 was dissolved in dimethylacetamide (DMA, final concentration is 3%) and a 1.7-fold molar excess relative to the linker was added dropwise to the SPP modified antibody. After incubation overnight at room temperature, the conjugated antibody was purified by chromatography on SEPHADEX® G25F equilibrated with phosphate buffered saline (PBS) at pH 6.5. The huCD20-7-SPP-DM1 conjugate was then dialyzed with buffer (pH 5.5) containing 10 mM histidine, 250 mM glycine, 1% sucrose. The number of linked DM1 molecules per antibody molecule was determined using the extinction coefficient previously reported for antibody and DM1 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). The percentage of free maytansinoids present after the conjugation reaction was injected with 20-50 μg conjugate on a HiSep ™ column equilibrated with 25% acetonitrile in 100 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0), and acetonitrile It was determined by eluting. The peak area of all free maytansinoid species (dissolved in gradients and compared to the elution times of known standards) was measured using an absorbance detector with the wavelength set to 252 nm and combined maytansinoids (column perfusion) The percentage of total free maytansinoid species was calculated as compared to the peak area associated with (eluted as a conjugate peak in the flow-through fraction). Conjugates with 3.5-4 DM1 molecules per huCD20-7 antibody were obtained with less than 1% unconjugated maytansinoids.

huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 제조Manufacturing

(석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) 링커를 DMA 중에 용해하였다. SMCC가 7.5 내지 10 몰 과량인 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA 중(pH 6.5)에서 항체를 인큐베이션함으로써 huCD20-7 항체를 SMCC로 변형하여 말레이미드를 항체로 도입하였다. 아르곤 하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 동일한 인산캄륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX™ G25 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후의 단계에 사용하였다.(Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) linker was dissolved in DMA 50 mM potassium phosphate, 50 mM NaCl, with 7.5 to 10 molar excess of SMCC The huCD20-7 antibody was transformed to SMCC to introduce the maleimide into the antibody by incubating the antibody in 2 mM EDTA (pH 6.5) After stirring for 2 to 4 hours at ambient temperature under argon, the reaction mixture was subjected to the same carmium phosphate buffer Purification using a SEPHADEX ™ G25 column equilibrated with the fractions containing the antibody were collected and used for subsequent steps.

SMCC-변형된 항체를 말레이미드 링커에 비하여 1.7몰 과량으로 10mM DM1 용액과 반응시켰다. 반응을 4 내지 약 16시간 동안 아르곤 하 주위 온도에서 교반하였다. 컨쥬게이션 반응 혼합물을 pH 6.5에서 1×PBS로 평형화된 SEPHADEX™ G25 겔 여과 칼럼을 통하여 여과하였다. 그 다음 huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM1 분자의 수 및 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM1 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.SMCC-modified antibodies were reacted with 10 mM DM1 solution in 1.7 molar excess relative to the maleimide linker. The reaction was stirred at ambient temperature under argon for 4 to about 16 hours. The conjugation reaction mixture was filtered through a SEPHADEX ™ G25 gel filtration column equilibrated to 1 × PBS at pH 6.5. The huCD20-7-SMCC-DM1 conjugate was then dialyzed with buffer (pH 5.5) containing 10 mM histidine, 250 mM glycine, 1% sucrose. The number of linked DM1 molecules per antibody molecule and the percentage of total free maytansinoid species were determined as described above. Conjugates with 3.5-4 DM1 molecules per huCD20-7 antibody were obtained with less than 1% unconjugated maytansinoids.

huCD20huCD20 -7--7- SPDBSPDB -- DM4DM4 의 제조Manufacturing

예시적인 N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트 (SPDB)를 에탄올 중에 용해하였다. huCD20-7 항체를 50mM NaCl, 2mM EDTA, 및 3% 에탄올을 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5) 중에서 8㎎/㎖로 5배 몰 과량의 SPDB 링커와 함께 대략 100분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 앞서 언급한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후의 단계에 사용하였다.Exemplary N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) butanoate (SPDB) was dissolved in ethanol. huCD20-7 antibody was incubated at room temperature for approximately 100 minutes with a 5-fold molar excess of SPDB linker at 8 mg / ml in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, and 3% ethanol. The reaction mixture was purified using a SEPHADEX ™ G25F column equilibrated with the aforementioned potassium phosphate buffer. Fractions containing the antibody were collected and used for later steps.

메이탄시노이드 DM4는 다이메틸아세트아마이드(DMA, 최종 농도는 3%임)에 용해시키고, 링커에 비하여 1.7배 몰 과량을 SPDB 변형된 항체에 적가하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 컨쥬게이트된 항체를 pH 6.5에서 인산 완충 식염수(PBS)(pH 6.5)로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그 다음 huCD20-7-SPDB-DM4 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수는 항체 및 메이탄시노이드에 대하여 앞서 보고된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다(Widdison, WC, et al.J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술도니 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM4 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.Maytansinoid DM4 was dissolved in dimethylacetamide (DMA, final concentration is 3%) and a 1.7-fold molar excess relative to the linker was added dropwise to the SPDB modified antibody. After incubation overnight at room temperature, the conjugated antibody was purified by chromatography on SEPHADEX® G25F equilibrated with phosphate buffered saline (PBS), pH 6.5 at pH 6.5. The huCD20-7-SPDB-DM4 conjugate was then dialyzed with buffer (pH 5.5) containing 10 mM histidine, 250 mM glycine, 1% sucrose. The number of linked DM4 molecules per antibody molecule was determined using the absorbance coefficient previously reported for antibodies and maytansinoids (Widdison, WC, et al. J Med Chem, 49: 4392-4408 (2006)). The percentage of total free maytansinoid species was determined as described above. Conjugates with 3.5-4 DM4 molecules per huCD20-7 antibody were obtained with less than 1% unconjugated maytansinoids.

huCD20huCD20 -7--7- PEG4PEG4 -- malmal -- DM4DM4 의 제조Manufacturing

DM4-mal-PEG4-NHS 시약을 DMA 중에 용해하여 12mM 저장 용액을 만들었다. huCD20-7 항체는 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7.5 및 10부피% DMA 중 항체 농도 4㎎/㎖로 15 당량의 DM4-mal-PEG4-NHS로 변형하였다. 아르곤 하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 동일한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25F 칼럼을 사용하여 정제하였다.DM4-mal-PEG4-NHS reagent was dissolved in DMA to make a 12 mM stock solution. The huCD20-7 antibody was modified with 15 equivalents of DM4-mal-PEG4-NHS at an antibody concentration of 4 mg / ml in 50 mM potassium phosphate, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.5 and 10 volume% DMA. After stirring for 2-4 hours at ambient temperature under argon, the reaction mixture was purified using a SEPHADEX ™ G25F column equilibrated with the same potassium phosphate buffer.

그 다음 huCD20-7-PEG4-mal-DM4 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수는 항체 및 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM4 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.The huCD20-7-PEG4-mal-DM4 conjugate was then dialyzed with buffer (pH 5.5) containing 10 mM histidine, 250 mM glycine, 1% sucrose. The number of linked DM4 molecules per antibody molecule was determined as described above as percentage of antibody and total free maytansinoid species. Conjugates with 3.5-4 DM4 molecules per huCD20-7 antibody were obtained with less than 1% unconjugated maytansinoids.

huCD20huCD20 -7--7- 설포Souso -- malmal -- DM4DM4 의 제조Manufacturing

DM4-mal-3-설포-NHS는 생체 내에서 60% DMA / 40% 200mM 석시네이트 완충액(pH 5) 중 3-설포-mal-NHS를 1.6 당량의 L-DM4-SH와 2시간 동안 주위 온도에서 반응시킴으로써 생성하였다. 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7.5 및 10부피% DMA 중 huCD20-7 항체마다(5㎎/㎖) 반응 혼합물(4mM 링커 농도)의 8 당량을 첨가하였다. 아르곤 하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 동일한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 SEPHADEX(상표명) G25 칼럼을 사용하여 정제하였다.DM4-mal-3-sulfo-NHS was in vivo subjected to 3-sulfo-mal-NHS in 60% DMA / 40% 200 mM succinate buffer (pH 5) with 1.6 equivalents of L-DM4-SH and ambient temperature for 2 hours. Produced by reacting at. Eight equivalents of the reaction mixture (4 mM linker concentration) was added per huCD20-7 antibody in 50 mM potassium phosphate, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.5 and 10% by volume DMA. After stirring for 2-4 hours at ambient temperature under argon, the reaction mixture was purified using a SEPHADEX ™ G25 column equilibrated with the same potassium phosphate buffer.

그 다음 huCD20-7-설포-mal-DM4 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스를 포함하는 완충액(pH 5.5)으로 투석하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수는 항체 및 전체 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. huCD20-7 항체 당 3.5~4개의 DM4 분자를 가지는 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 메이탄시노이드가 1% 미만으로 존재하는 것으로 얻어졌다.The huCD20-7-sulfo-mal-DM4 conjugate was then dialyzed with buffer (pH 5.5) containing 10 mM histidine, 250 mM glycine, 1% sucrose. The number of linked DM4 molecules per antibody molecule was determined as described above as percentage of antibody and total free maytansinoid species. Conjugates with 3.5-4 DM4 molecules per huCD20-7 antibody were obtained with less than 1% unconjugated maytansinoids.

실시예Example 14 14

컨쥬게이트의Conjugate 결합 친화도 Binding affinity

SMCC-DM1 또는 SPP-DM1에 대한 컨쥬게이션 후 huCD20-7의 결합 친화도를 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 22에 나타낸 결합 곡선으로부터 계산하였고, 이는 huCD20-7에 대하여 0.7nM, SMCC-DM1에 대하여 0.9nM, SPP-DM1 컨쥬게이트에 대하여 1.1nM에 해당한다. 이러한 결과는, 예를 들어 SMCC-DM1 또는 SPP-DM1 컨쥬게이션이 항체(예컨대, CD20-7)의 친화도를 현저하게 변경시키지 않음을 입증한다.The binding affinity of huCD20-7 after conjugation to SMCC-DM1 or SPP-DM1 was analyzed by ELISA as described in the examples above. The value for the apparent dissociation constant (K d ) was calculated from the binding curve shown in FIG. 22, which corresponds to 0.7 nM for huCD20-7, 0.9 nM for SMCC-DM1, and 1.1 nM for SPP-DM1 conjugates. . These results demonstrate, for example, that SMCC-DM1 or SPP-DM1 conjugation does not significantly alter the affinity of an antibody (eg, CD20-7).

추가로, 예를 들어 설포-mal-DM4에 대한 컨쥬게이션 후 huCD20-7의 결합 친화도는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 22B에 나타낸 결합 곡선으로부터 계산하였고, 이는 huCD20-7에 대하여 0.8nM, 설포-mal-DM4 컨쥬게이트에 대하여 1.3nM에 해당한다. 이러한 결과는, 설포-mal-DM4 컨쥬게이션이 항체(예컨대, huCD20-7)의 친화도를 현저하게 변경시키지 않음을 입증한다.In addition, the binding affinity of huCD20-7, for example after conjugation to sulfo-mal-DM4, was analyzed by ELISA as described in the examples above. The value for the apparent dissociation constant (K d ) was calculated from the binding curve shown in FIG. 22B, corresponding to 0.8 nM for huCD20-7 and 1.3 nM for sulfo-mal-DM4 conjugate. These results demonstrate that sulfo-mal-DM4 conjugation does not significantly alter the affinity of antibodies (eg, huCD20-7).

컨쥬게이트의Conjugate 프로아포토시스Proafotosis 활성 activation

SMCC-DM1 또는 SPDB-DM4에 대한 컨쥬게이션 후 huCD20-7의 프로아포토시스 활성을 Ramos 세포 상에서, 예를 들어 상기 기술된 바와 같이 아넥신-V 분석법에 의해 분석하였다. Ramos 세포는 다양한 농도의 huCD20-7 항체 또는 컨쥬게이트와 함께 20시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신 V-FITC 및 TO-PRO(등록상표)-3으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율은 도 23에 반-대수 플롯으로 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. huCD20-7로의 처리는 미처리 세포에 대하여 3%인 것과 비교하여 최대 51%를 아넥신-V 양성 세포로 만든다. 리툭시맙 처리는 단지 10%를 아넥신-V 양성 세포로 유도하였다. huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트로의 처리는 아넥신-V 양성 세포를 73%로 증가시킨 한편, huCD20-7-SPDB-DM4 처리는 82%로 더 증가시켰다. 반대로, 비결합 아이소타입 대조군 항체의 SMCC-DM1 또는 SPDB-DM4 컨쥬게이트는 각각 4% 또는 8%를 아넥신-V 양성 세포로 만들었다. 예를 들어, Ramos 세포에 대한 huCD20-7의 프로아포토시스 활성은 메이탄시노이드 컨쥬게이션에 의해 향상된다.The proapoptotic activity of huCD20-7 after conjugation to SMCC-DM1 or SPDB-DM4 was analyzed on Ramos cells, for example by an Annexin-V assay as described above. Ramos cells were incubated with various concentrations of huCD20-7 antibody or conjugate for 20 hours, then stained with Annexin V-FITC and TO-PRO®-3 and analyzed by flow cytometry. The percentage of Annexin-V positive cells was plotted against antibody concentration in a half-logarithmic plot in FIG. 23. Treatment with huCD20-7 makes up to 51% annexin-V positive cells compared to 3% for untreated cells. Rituximab treatment induced only 10% of Annexin-V positive cells. Treatment with the huCD20-7-SMCC-DM1 conjugate increased annexin-V positive cells to 73%, while huCD20-7-SPDB-DM4 treatment further increased to 82%. In contrast, SMCC-DM1 or SPDB-DM4 conjugates of unbound isotype control antibodies made 4% or 8% of Annexin-V positive cells, respectively. For example, the proapoptotic activity of huCD20-7 on Ramos cells is enhanced by maytansinoid conjugation.

컨쥬게이트의Conjugate CDCCDC 활성 activation

컨쥬게이션 후, 예를 들어 huCD20-7의 CDC 활성 상기 기술된 바와 같이 인간 보체의 존재하 림프종 세포에 대하여 분석하였다. Daudi 림프종 세포에 대하여 도 24A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7의 예시적인 SPDB-DM4 및 PEG4-mal-DM4 컨쥬게이트는 EC50이 대략 0.4㎍/㎖인 비컨쥬게이트된 항체와 유사한 CDC 활성을 가졌다. WSU-DLCL-2 미만성 거대 B 세포 림프종 세포에 대하여(도 24B), huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4 및 huCD20-7-PEG4-mal-DM4는 EC50이 대략 0.5㎍/㎖인 유사한 CDC 활성을 가졌다. WSU-DLCL-2 세포에 대하여 도 25A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, -SPP-DM1 및 설포-mal-DM4는 EC50이 대략 0.5㎍/㎖인 유사한 CDC 활성을 가졌다. Ramos 림프종 세포에 대하여(도 25B), huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, -SPP-DM1 및 설포-mal-DM4는 EC50이 대략 0.02㎍/㎖인 유사한 CDC 활성을 가졌다. 그러므로, 예를 들어 huCD20-7의 CDC 활성은 메이탄시노이드 컨쥬게이션 후에 유지된다.After conjugation, for example the CDC activity of huCD20-7 was analyzed for lymphoma cells in the presence of human complement as described above. As shown in FIG. 24A for Daudi lymphoma cells, exemplary SPDB-DM4 and PEG4-mal-DM4 conjugates of huCD20-7 had similar CDC activity as unconjugated antibodies with an EC 50 of approximately 0.4 μg / ml. . For WSU-DLCL-2 diffuse large B cell lymphoma cells (FIG. 24B), huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4 and huCD20-7-PEG4-mal-DM4 were similar with EC 50 of approximately 0.5 μg / ml Had CDC activity. As shown in FIG. 25A for WSU-DLCL-2 cells, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, -SPP-DM1 and sulfo-mal-DM4 have similar CDC activity with an EC 50 of approximately 0.5 μg / ml Had For Ramos lymphoma cells (FIG. 25B), huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1, -SPP-DM1 and sulfo-mal-DM4 had similar CDC activity with an EC 50 of approximately 0.02 μg / ml. Thus, for example, the CDC activity of huCD20-7 is maintained after maytansinoid conjugation.

컨쥬게이트의Conjugate ADCCADCC 활성 activation

SMCC-DM1에 대한 컨쥬게이션 후, 예를 들어 huCD20-7의 ADCC 활성을 상기 기술된 바와 같이 LDH 방출 분석에 의한 인간 NK 효과기 세포의 존재 하 Ramos 및 Granta-519 세포 상에서, 평가하였다. 도 26에서 알 수 있는 바와 같이, huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 Ramos 세포 상에서 비컨쥬게이트된 huCD20-7 항체와 유사한 ADCC 활성을 가지며, 각각 최대 세포 융해가 40%이고 EC50이 각각 1.8ng/㎖ 및 1.4ng/㎖이다. 유사한 결과는 표적 세포로서 다른 세포(예컨대, Granta-519 MCL 세포)를 사용하여 얻었다. huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 Granta-519 세포 상에서 비컨쥬게이트된 huCD20-7 항체와 비슷한 ADCC 활성을 가지며, 각각 최대 세포 융해가 대략 25%이고 EC50이 각각 0.22ng/㎖ 및 0.14ng/㎖이다. CDC에 대하여 나타낸 바와 같이, huCD20-7의 ADCC 활성은 메이탄시노이드 컨쥬게이션 후에 유지된다.After conjugation to SMCC-DM1, the ADCC activity of huCD20-7, for example, was assessed on Ramos and Granta-519 cells in the presence of human NK effector cells by LDH release assay as described above. As can be seen in Figure 26, huCD20-7-SMCC-DM1 conjugate on Ramos is a beacon having an ADCC activity similar to the gate juice huCD20-7 antibody, maximum cell fusion is 40% and 1.8 respectively, the EC 50, each cell ng / ml and 1.4 ng / ml. Similar results were obtained using other cells (eg, Granta-519 MCL cells) as target cells. The huCD20-7-SMCC-DM1 conjugate has ADCC activity similar to the unconjugated huCD20-7 antibody on Granta-519 cells, with a maximum cell lysis of approximately 25% and EC 50 of 0.22 ng / ml and 0.14 ng, respectively. / Ml. As shown for CDC, the ADCC activity of huCD20-7 is maintained after maytansinoid conjugation.

실시예Example 15 15

시험관 내 세포독성 분석In vitro Cytotoxicity Assay

세포 성장을 억제하는 예시적인 huCD20-7 컨쥬게이트의 능력을 시험관 내 세포독성 분석을 사용하여 측정하였다. 일반적으로, 표적 세포는 완전 RPMI 배지(RPMI-1640, 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 시약 모두 Invitrogen 제품임) 중 100㎕로 웰 당 5,000 세포로 도말하였다. 항체 및 컨쥬게이트는 3배 계열 희석을 사용하여 완전 RPMI 배지로 희석하였고, 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 최종 농도는 전형적으로 3×10-8M 내지 4.6×10-12M의 범위이었다. 세포를 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 4 내지 5일 동안 인큐베이션하였다. 남아있는 세포의 생존력은 비색 WST-8 분석법(Dojindo Molecular Technologies, Inc., 미국 메릴랜드주 록빌시에 소재)에 의해 측정하였다. WST-8은 살아있는 세포의 데하이드로게나아제에 의해 조직 배양 배지에 용해성인 오렌지색 포마잔 생성물로 환원된다. 생성된 포마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 정비례한다. WST-8을 최종 부피의 10%로 첨가하고 플레이트는 37℃의 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 추가 2~4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트는 다중웰 플레이트 판독기에서 450nm(A450)에서의 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 배지 및 WST-8만을 포함하는 웰의 배경 A450 흡광도를 모든 값에서 차감하였다. 생존력 백분율은 각각의 시험된 샘플 값을 미처리 세포가 있는 웰의 평균 값으로 나눔으로써 계산하였다. 생존력 백분율 = 100* (A450 처리 샘플 - A450 배경)/ (A450 미처리 샘플　-　A450 배경).The ability of exemplary huCD20-7 conjugates to inhibit cell growth was measured using an in vitro cytotoxicity assay. In general, target cells were plated at 5,000 cells per well with 100 μl in complete RPMI medium (RPMI-1640, 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 1% penicillin-streptomycin, all reagents from Invitrogen). Antibodies and conjugates were diluted in complete RPMI medium using 3-fold serial dilution and 100 μl per well was added. Final concentrations typically ranged from 3 × 10 −8 M to 4.6 × 10 −12 M. Cells were incubated for 4-5 days in a humidified 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Viability of remaining cells was measured by colorimetric WST-8 assay (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, USA). WST-8 is reduced to orange formazan product soluble in tissue culture medium by dehydrogenase of living cells. The amount of formazan generated is directly proportional to the number of living cells. WST-8 was added at 10% of the final volume and the plates were incubated for an additional 2-4 hours in a humid 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Plates were analyzed by measuring absorbance at 450 nm (A 450 ) in a multiwell plate reader. Background A 450 absorbance of wells containing only medium and WST-8 was subtracted from all values. Viability percentages were calculated by dividing each tested sample value by the average value of the wells with untreated cells. Percent viability = 100 * (A 450 treated sample - background 450 A) / (A 450 untreated sample - background 450 A).

생존력 백분율 값은 각각의 처리에 대하여 반-대수 플롯에서 항체 또는 컨쥬게이트 농도에 대하여 플롯팅하였다.Viability percentage values were plotted against antibody or conjugate concentrations in half-log plots for each treatment.

RamosRamos 세포 상  Cell phase huCD20huCD20 -7 및 -7 and huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성In vitro cytotoxicity

Ramos세포에 대한 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트와 비교하였다. 도 27A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 60%까지 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 80% 까지 생존력을 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는, EC50이 0.68nM이어서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 20nM이어서, huCD20-7-SMCC-DM1에 대하여 예상치 못하게 상당한 29배의 특이성 윈도우를 초래하였다.In vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 against Ramos cells was compared to rituximab and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. As shown in FIG. 27A, huCD20-7 incubation resulted in a reduction of viability by 60%, while rituximab reduced viability by 80%. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 completely reduced viability with an EC 50 of 0.68 nM, whereas the nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugate had an EC 50 of 20 nM, unexpectedly for huCD20-7-SMCC-DM1. It resulted in a significant 29-fold specificity window.

DaudiDaudi 세포 상에서  On the cell huCD20huCD20 -7 및 -7 and huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성In vitro cytotoxicity

Daudi 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 27B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 65%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 80%로 생존력을 보다 적당히 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.77nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 12nM이어서, Daudi 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 16배의 특이성 윈도우를 초래하였다.In vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 against Daudi cells was compared with the activity of rituximab and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. As shown in FIG. 27B, huCD20-7 incubation resulted in a decrease of viability by 65% at the highest concentration, while rituximab reduced the viability more moderately by 80%. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 completely reduced viability at the highest concentration tested, with an EC 50 of 0.77 nM, whereas the nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugate had an EC 50 of 12 nM, resulting in huCD20- for Daudi cells. This resulted in an unexpectedly significant 16-fold specificity window for 7-SMCC-DM1.

GrantaGranta -519 세포 상에서 On -519 cells huCD20huCD20 -7 및 -7 and huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성In vitro cytotoxicity

Granta-519 MCL 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 28A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 45%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 60%로 생존력을 보다 적당히 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.03nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 13nM이어서, Granta-519 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 419배의 특이성 윈도우를 초래하였다.In vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 against Granta-519 MCL cells was compared with the activity of rituximab and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. As shown in FIG. 28A, huCD20-7 incubation resulted in a reduction of viability by 45% at the highest concentration, whereas rituximab reduced the viability more moderately by 60%. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 completely reduced viability at the highest concentration tested, with an EC 50 of 0.03 nM, whereas the nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugate had an EC 50 of 13 nM for Granta-519 cells. It unexpectedly resulted in a significant 419-fold specificity window for huCD20-7-SMCC-DM1.

SCSC -1 세포 상에서 On -1 cells huCD20huCD20 -7 및 -7 and huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성In vitro cytotoxicity

SC-1 FL 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 28B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 35%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 75%로 생존력을 보다 적당히 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.39nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 31nM이어서, SC-1 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 79배의 특이성 윈도우를 초래하였다.In vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 against SC-1 FL cells was compared with the activity of rituximab and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. As shown in FIG. 28B, huCD20-7 incubation resulted in a decrease in viability by 35% at the highest concentration, while rituximab reduced the viability more moderately by 75%. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 completely reduced viability at the highest concentration tested with an EC 50 of 0.39 nM, whereas nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates had an EC 50 of 31 nM, resulting in SC-1 cells. It unexpectedly resulted in a significant 79-fold specificity window for huCD20-7-SMCC-DM1.

DOHHDOHH -2 세포 상에서 On -2 cells huCD20huCD20 -7 및 -7 and huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성In vitro cytotoxicity

DOHH-2 FL 세포에 대하여 huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 29A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 20%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 25%로 생존력을 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.12nM이어서 시험된 가장 높은 농도에서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 35nM이어서, DOHH-2 세포에 대하여 huCD20-7-SMCC-DM1에 대한 예상치 못하게 상당한 292배의 특이성 윈도우를 초래하였다.In vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 against DOHH-2 FL cells was compared with the activity of rituximab and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. As shown in FIG. 29A, huCD20-7 incubation resulted in a decrease in viability by 20% at the highest concentration, while rituximab reduced viability by 25%. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 completely reduced viability at the highest concentration tested with an EC 50 of 0.12 nM, whereas nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates had an EC 50 of 35 nM for DOHH-2 cells. This resulted in an unexpectedly significant 292-fold specificity window for huCD20-7-SMCC-DM1.

항원 음성 Antigen negative MoltMolt -4 세포 상에서 On -4 cells huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성In vitro cytotoxicity

huCD20-7-SMCC-DM1 세포독성의 특이성을 추가로 확인하기 위하여, huCD20-7-SMCC-DM1의 활성을 비-CD20 발현 Molt-4 T 세포 급성 림프구성 백혈병 세포주에 대하여 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트와 비교하였다. 증가된 농도의 2가지 컨쥬게이트를 본 실험에 사용하여 상대적으로 나쁜 비특이적 세포독성을 나타내었다. 도 29B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7-SMCC-DM1 및 비특이적 컨쥬게이트는 EC50이 33nM이어서 동일한 세포독성을 나타내었다.To further confirm the specificity of huCD20-7-SMCC-DM1 cytotoxicity, the activity of huCD20-7-SMCC-DM1 was determined by non-specific huIgG-SMCC-DM1 against non-CD20 expressing Molt-4 T cell acute lymphocytic leukemia cell line. Compared to the conjugate. Two conjugates of increased concentration were used in this experiment to show relatively poor nonspecific cytotoxicity. As shown in FIG. 29B, huCD20-7-SMCC-DM1 and the nonspecific conjugate showed the same cytotoxicity with an EC 50 of 33 nM.

huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 의 시험관 내 세포독성의 요약Of in vitro cytotoxicity

예를 들어, huCD20-7은 Ramos, Daudi, Grant-519, SC-1 및 DOHH-2 세포에 대하여 리툭시맙보다 놀랍게도 더 활성적이다. 표적 세포 생존력에서의 감소는 리툭시맙 처리에 있어서 나타난 것보다 huCD20-7과 함께 인큐베이션한 후에 더 크다. 추가로, 예를 들어 huCD20-7의 SMCC-DM1 컨쥬게이션은 항체에 강력한 세포독성 활성을 추가한다. 종양 세포의 생존력은 단독으로 항체 처리한 것과 비교하여 컨쥬게이트 처리에 응하여 보다 완전하게 감소하였다. 비표적화된 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 효능에 비하여 huCD20-7-SMCC-DM1 효능을 비교할 경우, 상당한 특이성 윈도우가 각각의 CD20-발현 세포주에 대하여 관찰되며, 이는 세포독성이 표적 세포에 결합하는 huCD20-7 항체의 결과임을 나타낸다. 추가로, 예를 들어 huCD20-7-SMCC-DM1 및 비특이적 컨쥬게이트는 항원-음성 Molt-4 세포에 대하여 동일한 나쁜 세포독성을 보였다. 따라서, huCD20-7-SMCC-DM1에 대하여 관찰된 세포독성은 CD20 발현에 의존적이다.For example, huCD20-7 is surprisingly more active than rituximab on Ramos, Daudi, Grant-519, SC-1 and DOHH-2 cells. The decrease in target cell viability is greater after incubation with huCD20-7 than shown for rituximab treatment. In addition, SMCC-DM1 conjugation of eg huCD20-7 adds potent cytotoxic activity to the antibody. The viability of tumor cells decreased more completely in response to conjugate treatment compared to antibody treatment alone. When comparing huCD20-7-SMCC-DM1 efficacy compared to the efficacy of the untargeted huIgG-SMCC-DM1 conjugate, a significant specific window is observed for each CD20-expressing cell line, which means that cytotoxicity binds to the target cell. indicates the result of a huCD20-7 antibody. In addition, huCD20-7-SMCC-DM1 and nonspecific conjugates, for example, showed the same poor cytotoxicity against antigen-negative Molt-4 cells. Thus, the cytotoxicity observed for huCD20-7-SMCC-DM1 is dependent on CD20 expression.

SMCC-DM1 컨쥬게이트에 대한 EC50 EC 50 for SMCC-DM1 conjugate

Figure pct00029
Figure pct00029

실시예Example 16 16

huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 은 silver RamosRamos 세포에 대하여  About the cell 리툭시맙Rituximab -- SMCCSMCC -- DM1DM1 보다 더 활성적이다More active than

예를 들어 Ramos 림프종 세포에 대하여, huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙, 리툭시맙-SMCC-DM1 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 30A에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 55%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 생존력을 유의하게 감소시키지 못하였다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 0.72nM이어서 생존력을 완전히 감소시킨 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 22nM이었다. 리툭시맙-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 3.3nM인 세포독성을 초래하였다. 따라서, huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 리툭시맙-SMCC-DM1보다 시험관 내에서 더 강력한 세포독성 활성을 가진다.For example, for Ramos lymphoma cells, in vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 is compared to the activity of rituximab, rituximab-SMCC-DM1 and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. It was. As shown in FIG. 30A, huCD20-7 incubation resulted in a decrease in viability by 55% at the highest concentration, while rituximab did not significantly reduce viability. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 completely reduced viability with an EC 50 of 0.72 nM, whereas the nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugate had 22 nM of EC 50 . Treatment with rituximab-SMCC-DM1 resulted in cytotoxicity with an EC 50 of 3.3 nM. Thus, the huCD20-7-SMCC-DM1 conjugate has stronger cytotoxic activity in vitro than rituximab-SMCC-DM1.

huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -- DM1DM1 은 silver DaudiDaudi 세포에 대하여  About the cell 리툭시맙Rituximab -- SMCCSMCC -- DM1DM1 보다 더 활성적이다More active than

예를 들어 Daudi 림프종 세포에 대하여, huCD20-7 및 huCD20-7-SMCC-DM1의 시험관 내 세포독성을 리툭시맙, 리툭시맙-SMCC-DM1 및 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. 도 30B에 나타낸 바와 같이, huCD20-7 인큐베이션은 가장 높은 농도에서 50%로 생존력의 감소를 초래한 반면, 리툭시맙은 생존력을 65%로 감소시켰다. huCD20-7-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 1.0nM이어서 생존력을 없앤 반면, 비특이적 huIgG-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 EC50이 15nM이었다. 리툭시맙-SMCC-DM1로의 처리는 EC50이 2.6nM인 세포독성을 초래하였다. 따라서, huCD20-7-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 리툭시맙-SMCC-DM1보다 더 강력한 세포독성 활성을 가진다.For example, for Daudi lymphoma cells, in vitro cytotoxicity of huCD20-7 and huCD20-7-SMCC-DM1 is compared to the activity of rituximab, rituximab-SMCC-DM1 and nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugates. It was. As shown in FIG. 30B, huCD20-7 incubation resulted in a reduction of viability by 50% at the highest concentration, while rituximab reduced viability to 65%. Treatment with huCD20-7-SMCC-DM1 eliminated viability because the EC 50 was 1.0 nM, whereas the nonspecific huIgG-SMCC-DM1 conjugate had 15 nM EC 50 . Treatment with rituximab-SMCC-DM1 resulted in cytotoxicity with an EC 50 of 2.6 nM. Thus, the huCD20-7-SMCC-DM1 conjugate has more potent cytotoxic activity than rituximab-SMCC-DM1.

실시예Example 17 17

방사능-표지화된 Radio-labeled 컨쥬게이트의Conjugate 제조 Produce

huCD20-7 및 리툭시맙의 방사능표지된 컨쥬게이트는 삼중수소로 표지화된 DM1([3H]DM1)을 사용한 것을 제외하고 비표지화된 컨쥬게이트에 대하여 Widdison et al.(Widdison et al. J Med Chem 2006;49:4392-408)에 의해 기술된 것과 본질적으로 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. 이 방법은 또한 Erickson et al.(Erickson et al. Bioconjug Chem 2010; 21:84-92)에 상세히 기술되어 있다.Radiolabeled conjugates of huCD20-7 and rituximab were tested by Widdison et al. (Widdison et al. J Med) for unlabeled conjugates except for the use of tritium labeled DM1 ([ 3 H] DM1). Chem 2006; 49: 4392-408). This method is also described in detail in Erickson et al. (Erickson et al. Bioconjug Chem 2010; 21: 84-92).

간략하게, 항체를 먼저 N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트(SMCC)를 이용하여 항체의 리신 잔기에서 변형시키고, 겔 여과에 의해 정제한 후, 삼중수소를 가지는 DM1과의 컨쥬게이션을 C-20-메톡시 기에서 안정적으로 통합시켰다. 삼중수소로 표지화된 DM1은 안사미토신(Ansamitocin) P-3으로부터 제조하였다. 안사미토신 P-3의 C20 메톡시 기는 박테리아 균주인 스트렙토마이세스 플란텐시스(Streptomyces platensis)와 함께 인큐베이션에 의해 제거되어 안사미토신 PDM-3을 제공하였다(Asai et al, 미국 특허 제4,307,016호). 그 다음 안사미토신 PDM-3의 C-20-OH 모이어티는 Sawada(Sawada et al. Bioconj Chem 1993;4:284-289)에 의해 기술된 방법에 의해 삼중수소로 표지화된 요오드화 메틸을 사용하여 메틸화하였다. 항체 분자 당 연결된 메이탄시노이드 분자의 비율(D/A) 및 비 방사능은 다음과 같았다: 리툭수맙(rituxumab)-SMCC-[3H]DM1(3.5 D/A, 1.9 Ci/mmol) 및 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1(3.4 D/A, 1.8 Ci/mmol).Briefly, the antibody is first modified at the lysine residue of the antibody with N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (SMCC) and purified by gel filtration, followed by tritium Conjugation with DM1 having a was incorporated stably in the C-20-methoxy group. Tritium labeled DM1 was prepared from Ansamitocin P-3. The C20 methoxy group of ansamitocin P-3 was removed by incubation with the bacterial strain Streptomyces platensis to provide an anamytocin PDM-3 (Asai et al, US Pat. No. 4,307,016). ). The C-20-OH moiety of ansamitocin PDM-3 was then purified using methyl iodide labeled with tritium by the method described by Sawada (Sawada et al. Bioconj Chem 1993; 4: 284-289). Methylated. The ratio (D / A) and non-radioactivity of the connected maytansinoid molecules per antibody molecule were as follows: rituxumab-SMCC- [ 3 H] DM1 (3.5 D / A, 1.9 Ci / mmol) and huCD20 -7-SMCC- [ 3 H] DM1 (3.4 D / A, 1.8 Ci / mmol).

리툭시맙Rituximab -- SMCCSMCC -[-[ 33 H]H] DM1DM1 및  And huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -[-[ 33 H]H] DM1DM1 의 활성Active in

2가지의 컨쥬게이트 및 해당하는 비변형된 항체는 모두 CD20 양성 SU-DHL-4 세포에 대하여 유사한 결합 친화도를 가지는 것으로 밝혀졌다(도 31A). CD20-양성 SU-DHL-4 세포 및 CD20-음성 COLO205 세포에 대한 2가지 컨쥬게이트의 세포독성 효력은 실시예 15에 기술된 바와 같은 세포-기반 생존력 분석법을 사용하여 평가하였다. 2가지 컨쥬게이트 모두 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 및 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1 컨쥬게이트 각각에 대하여 IC50 값이 대략 0.1nM 및 0.24nM이어서 강력한 것으로 밝혀졌다(도 31B). 예상된 바와 같이, 2가지 컨쥬게이트 모두 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 및 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1 컨쥬게이트 각각에 대하여 EC50 값이 34nM 및 11nM이어서 항원-음성 COLO205 결장암 세포주에 대하여 나쁜 효력을 가졌다. 이는 이들 2가지 컨쥬게이트에 의한 세포 살생이 CD20-의존적임을 나타낸다. Ramos 및 Daudi 세포에 대하여 실시예 16에 나타낸 바와 같이, huCD20-7-SMCC-[3H]DM 컨쥬게이트는 SU-DHL-4 세포에 대하여 리툭시맙-SMCC-DM1보다 더 강력한 세포독성 활성을 가진다.Both conjugates and corresponding unmodified antibodies were found to have similar binding affinity for CD20 positive SU-DHL-4 cells (FIG. 31A). The cytotoxic potency of the two conjugates against CD20-positive SU-DHL-4 cells and CD20-negative COLO205 cells was evaluated using a cell-based viability assay as described in Example 15. Two kinds of conjugated both huCD20-7-SMCC- [3 H] DM1 and rituximab -SMCC- [3 H] IC 50 value of approximately 0.1nM and 0.24nM respectively against DM1 conjugate was then been found to be robust (Fig. 31B). As expected, both conjugates had antigenic-negative COLO205 with EC 50 values of 34 nM and 11 nM for the huCD20-7-SMCC- [ 3 H] DM1 and Rituximab-SMCC- [ 3 H] DM1 conjugates, respectively. Had a bad effect on the colon cancer cell line. This indicates that cell killing by these two conjugates is CD20-dependent. As shown in Example 16 for Ramos and Daudi cells, huCD20-7-SMCC- [ 3 H] DM conjugates showed stronger cytotoxic activity than rituximab-SMCC-DM1 against SU-DHL-4 cells. Have

리툭시맙Rituximab -- SMCCSMCC -[-[ 33 H]H] DM1DM1 및  And huCD20huCD20 -7--7- SMCCSMCC -[-[ 33 H]H] DM1DM1 의 표적 세포 Target cells 대사산물Metabolite

방사능-표지화된 컨쥬게이트에 표적 세포의 노출 후에 형성된 대사산물의 양 및 유형을 평가하기 위하여, 10% FBS기 보충된 RPMI-1640 배지의 21㎖ 중 SU-DHL-4 세포(17×106)의 배양물을 3H-컨쥬게이트 40nM에 30분 동안 37℃, 6% CO2에서 노출시켰다. 세포를 RPMI-1640 배지에서 3번 세척하여 임의의 결합지 않은 컨쥬게이트를 제거하였고, 신선한 배양 배지에 재현탁시켰으며(8×105 세포수/㎖), 37℃, 6% CO2에서 22시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고 0.3㎖ Tris-완충 식염수(pH 7.5)에 현탁시켰다. 아세톤(4:3 v/v)을 첨가하고 샘플을 혼합하며, -80℃에서 1시간 동안 냉동시켜 단백질을 침전시켰다. 샘플을 해동하고 2,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 상청액과 펠릿을 분리하였다. 단백질이 없는 메이탄시노이드 대사산물을 포함하는 진공 원심분리기를 사용하여 상청액을 증발시켜 건조시켰다. 추출물을 0.025% 트라이플루오로아세트산을 포함하는 20% 수성 아세토니트릴 0.12㎖ 중에 용해하고, 메이탄시노이드 대사산물을 분석적 C-18 칼럼(Vydac, 0.46×25㎝) 상에서 분리하였다(Erickson et al. Cancer Res 2006;66:4426-33). 용출액을 1㎖ 분획으로 수집하고, 각각의 분획에 결합된 방사능을 각각의 바이알을 4㎖ Ultima Gold 액체 섬광 칵테일과 혼합한 후 Tri-Carb 2900T 액체 섬광 계수기에서 5분 동안 계수함으로써 측정하였다.SU-DHL-4 cells (17 × 10 6 ) in 21 ml of RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS group to assess the amount and type of metabolite formed after exposure of target cells to the radio-labeled conjugate. Cultures were exposed to 3 H-conjugate 40 nM for 30 minutes at 37 ° C., 6% CO 2 . Cells were washed three times in RPMI-1640 medium to remove any unbound conjugate, resuspended in fresh culture medium (8 × 10 5 cells / mL), 22 ° C. at 37 ° C., 6% CO 2 . Incubate for hours. Cells were collected and suspended in 0.3 ml Tris-buffered saline (pH 7.5). Acetone (4: 3 v / v) was added and the samples were mixed and frozen at −80 ° C. for 1 hour to precipitate the protein. Samples were thawed and centrifuged at 2,000 × g for 15 minutes to separate supernatants and pellets. The supernatant was evaporated to dryness using a vacuum centrifuge containing protein-free maytansinoid metabolite. The extract was dissolved in 0.12 mL of 20% aqueous acetonitrile containing 0.025% trifluoroacetic acid and the maytansinoid metabolite was separated on an analytical C-18 column (Vydac, 0.46 × 25 cm) (Erickson et al. Cancer Res 2006; 66: 4426-33). The eluate was collected in 1 ml fractions and the radioactivity bound to each fraction was measured by mixing each vial with a 4 ml Ultima Gold liquid scintillation cocktail and counting for 5 minutes on a Tri-Carb 2900T liquid scintillation counter.

아세톤 펠렛을 0.3㎖ 물에 재현탁하고, 1㎖ 분해가능 시약(Solvable reagent, Perkin Elmer)의 첨가에 의해 용해하였다. 그 다음 샘플을 밤새 50℃ 수욕에서 인큐베이션하였다. 샘플을 인큐베이션에서 제거하고, 0.1M EDTA 0.1㎖ 및 30% 과산화수소 0.3㎖를 각각의 샘플에 첨가한 후 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음 샘플을 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 1N HCl 0.2㎖를 각각의 샘플에 첨가한 후 15㎖ Ultima Gold 섬광 유체를 첨가하였다. 샘플을 격렬하게 교반하고 어둠 속에 밤새 둔 다음 LSC로 계수하였다.Acetone pellets were resuspended in 0.3 ml water and dissolved by addition of 1 ml degradable reagent (Solvable reagent, Perkin Elmer). The samples were then incubated overnight at 50 ° C. water bath. Samples were removed from incubation and 0.1 ml of 0.1 M EDTA and 0.3 ml of 30% hydrogen peroxide were added to each sample and incubated for 15 minutes at room temperature. The sample was then incubated at 50 ° C. for 1 hour. 0.2 ml of 1N HCl was added to each sample followed by 15 ml Ultima Gold scintillation fluid. The sample was vigorously stirred and placed in the dark overnight and counted by LSC.

SU-DHL-4 세포의 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 및 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1 둘 다에 대한 단기간 노출은 세포 당 결합된 컨쥬게이트의 유사하게 높은 수준을 초래하였다(도 32A). 세포 당 결합된 각각의 컨쥬게이트의 양은 컨쥬게이트에의 초기 노출 및 세척 단계 후 세포와 결합된 전체 방사능으로부터 결정하였다. 메이탄시노이드 대사산물은 아세톤 추출에 의한 노출 및 방사능-검출을 이용한 HPLC 분리 후 22시간 동안 정량화하였다. 2가지 컨쥬게이트에 노출하고 22시간 후에 세포 내에서 관찰된 유일한 대사산물은 리신-SMCC-[3H]DM1인 것으로 밝혀졌다. 어떠한 다른 대사산물도 관찰되지 않았다. 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물은 huC242-SMCC-[3H]DM1의 유일한 표적-세포 대사산물로서 이미 확인되었다(Erickson et al. Cancer Res 2006;66:4426-33). 세포가 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 컨쥬게이트에 노출하고 22시간 후 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물의 수준은 대략 0.6pmol/106 세포수인 것으로 밝혀졌다. 반대로, 리툭시맙-[3H]DM1 컨쥬게이트에 세포가 노출하고 22시간 후 리신-SMCC-[3H]DM1 대사산물의 수준은 대략 0.3pmol/106 세포수인 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 대사산물의 2배 더 높은 수준은 리툭시맙-SMCC-[3H]DM1에 대한 노출 후 보다 huCD20-7-SMCC-[3H]DM1에 대한 세포의 노출 후에 형성된다(도 32B). huCD20-7 컨쥬게이트에 의해 형성된 대사산물의 증가된 수준은 huCD20-7 컨쥬게이트의 더 높은 시험관 내 활성을 야기할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 huCD20-7은 시험관 내 비절단성 컨쥬게이트로서 보다 효과적이도록 할 수 있는 특유의 물리적 및 기능적 특성을 가진 항체이다.SU-DHL-4 cells When the DM1 and rituximab huCD20-7-SMCC- [3 H] Thank -SMCC- [3 H] DM1 both short-term exposure to the will result in similarly high degree of conjugated bonds per cell (FIG. 32A). The amount of each conjugate bound per cell was determined from the total radioactivity associated with the cells after the initial exposure to the conjugate and the washing step. Maytansinoid metabolites were quantified for 22 hours after HPLC separation using exposure by acetone extraction and radio-detection. It was found that the only metabolite observed in cells 22 hours after exposure to the two conjugates was lysine-SMCC- [ 3 H] DM1. No other metabolites were observed. Lysine -SMCC- [3 H] DM1 metabolites huC242-SMCC- [3 H] The only sign of the DM1 - have already been identified as a cellular metabolites (Erickson et al Cancer Res 2006; 66: 4426-33.). After 22 hours of exposure of the cells to the huCD20-7-SMCC- [ 3 H] DM1 conjugate, the level of lysine-SMCC- [ 3 H] DM1 metabolite was found to be approximately 0.6 pmol / 10 6 cell number. In contrast, the level of lysine-SMCC- [ 3 H] DM1 metabolite was found to be approximately 0.3 pmol / 10 6 cells 22 hours after cells were exposed to the rituximab- [ 3 H] DM1 conjugate. Thus, twice as high levels of metabolic products are formed after exposure of the cells to rituximab -SMCC- [3 H] huCD20-7-SMCC- [3 H] than after exposure to DM1 DM1 (Fig. 32B) . Increased levels of metabolites formed by the huCD20-7 conjugate can lead to higher in vitro activity of the huCD20-7 conjugate. Thus, for example, huCD20-7 is an antibody with unique physical and functional properties that can make it more effective as an in vitro non-cleavable conjugate.

실시예Example 18 18

상이한 링커를 가지는 With different linkers huCD20huCD20 -7 -7 컨쥬게이트의Conjugate 시험관 내 세포독성 In vitro cytotoxicity

huCD20-7-SMCC-DM1의 세포독성은 상이한 링커로 제조된 컨쥬게이트의 세포독성과 비교하였다. 도 33A에서 알 수 있는 바와 같이, 예를 들어 huCD20-7의 SPDB-DM4 및 PEG4-mal-DM4 컨쥬게이트는 Granta-519 세포에 대하여 SMCC-DM1 컨쥬게이트로서 유사한 세포독성 활성을 가진다. 상기 2가지 컨쥬게이트는 EC50이 0.06nM인 세포 생존력의 완전한 감소를 야기한다. 도 33B에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 huCD20-7의 SPP-DM1 및 설포-mal-DM4 컨쥬게이트는 또한 Granta-519 세포에 대하여 SMCC-DM1 컨쥬게이트로서 유사한 세포독성 활성을 가진다. 모든 컨쥬게이트는 EC50이 0.1nM인 세포 생존력의 완전한 감소를 야기한다.The cytotoxicity of huCD20-7-SMCC-DM1 was compared to the cytotoxicity of conjugates made with different linkers. As can be seen in FIG. 33A, for example, the SPDB-DM4 and PEG4-mal-DM4 conjugates of huCD20-7 have similar cytotoxic activity as SMCC-DM1 conjugates on Granta-519 cells. Both conjugates result in a complete decrease in cell viability with an EC 50 of 0.06 nM. As shown in FIG. 33B, for example, the SPP-DM1 and sulfo-mal-DM4 conjugates of huCD20-7 also have similar cytotoxic activity as SMCC-DM1 conjugates on Granta-519 cells. All conjugates result in a complete decrease in cell viability with an EC 50 of 0.1 nM.

실시예Example 19 19

SUSU -- DHLDHL -4 이종이식 모델에서 In the -4 xenograft model huCD20huCD20 -7 항체의 생체 내 효능In vivo efficacy of --7 antibodies

예시적인 huCD20-7 항체는 SCID 마우스에 피하로 이식된 SU-DHL-4 미만성 거대 B 세포 림프종 세포의 확립된 이종이식 모델을 사용하여 시험하였다. 마우스는 체중에 의하여 치료군으로 임의 추출하였고, huCD20-7 또는 리툭시맙 10 또는 1㎎/㎏으로 세포 접종 후 14, 21 및 28일에 1주일에 한번씩 3회 처치하였다. 상이한 치료 군의 중앙 종양 부피는 도 34에 플롯팅되어 있다. 리툭시맙 치료는 2가지 투여량 ahe에서 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피에서 감소를 초래하였으며, 1㎎/㎏ 투여량은 1㎎/㎏ 투여량보다 더 강력하였다. 1㎎/㎏에서 huCD20-7로의 처치는 동일 투여량에서 PBS와 비교하여 리툭시맙보다 중앙 종양 부피에서 보다 현저한 감소를 초래하였다. 10㎎/㎏에서 huCD20-7로의 처치는 리툭시맙과 비교하여 보다 극적인 종양 성장 감소를 초래하였다. 연구 66일째에, huCD20-7 처치 결과 10마리 중 7마리가 무종양 생존자(TFS)인 반면, 리툭시맙 처치 결과는 10마리 중 1마리만이 TFS이었다. 어떠한 TFS도 PBS 대조군과 2가지 1㎎/㎏ 처치 군에서 관찰되지 않았다.Exemplary huCD20-7 antibodies were tested using established xenograft models of SU-DHL-4 diffuse large B cell lymphoma cells subcutaneously implanted in SCID mice. Mice were randomized into treatment groups by body weight and treated three times a week at 14, 21 and 28 days after cell inoculation with huCD20-7 or rituximab 10 or 1 mg / kg. Central tumor volumes of different treatment groups are plotted in FIG. 34. Rituximab treatment resulted in a decrease in median tumor volume at the two doses ahe compared to the PBS control, and the 1 mg / kg dose was more potent than the 1 mg / kg dose. Treatment with huCD20-7 at 1 mg / kg resulted in a more significant decrease in median tumor volume than rituximab compared to PBS at the same dose. Treatment with huCD20-7 at 10 mg / kg resulted in a more dramatic tumor growth reduction compared to rituximab. On day 66 of the study, huCD20-7 treatment resulted in 7 of 10 tumor-free survivors (TFS), whereas rituximab treatment resulted in only 1 of 10 TFS. No TFS was observed in the PBS control group and two 1 mg / kg treatment groups.

실시예Example 20 20

DaudiDaudi 이종이식 모델에서  In the xenotransplantation model huCD20huCD20 -7 항체, --7 antibodies,- SPPSPP -- DM1DM1 , , SMCCSMCC -- DM1DM1 및  And BMPSBMPS -- DM1DM1 의 생체 내 효능In vivo efficacy of

huCD20-7 항체 및 이의 컨쥬게이트는 SCID 마우스에 정맥내로 이식된 Daudi 림프종 세포를 사용하여 이종이식 모델에서의 생체 내 효능에 대하여 시험하였다. 마우스는 체중에 의하여 치료군으로 임의 추출하였고, huCD20-7 10㎎/㎏, huCD20-7-SMCC-DM1 10㎎/㎏ 또는 huCD20-7-SPP-DM1 5㎎/㎏으로 세포 접종 후 7일째에 한번 처치하였다. 상이한 처치군에서 생존한 마우스의 수는 도 35A에 플롯팅되어 있다. 마우스의 PBS 처치군에 대한 중앙 생존은 27일이었다. huCD20-7 처치는 45일까지 중앙 생존에서 증가를 초래하였다. 2가지 컨쥬게이션에서 모두 항체와 비교하여 중앙 생존에서의 추가적 증가를 초래하였다. huCD20-7-SMCC-DM1 및 huCD20-7-SPP-DM1은 각각 64일 및 58일의 중앙 생존을 초래하였다.huCD20-7 antibodies and conjugates thereof were tested for in vivo efficacy in xenograft models using Daudi lymphoma cells intravenously implanted in SCID mice. Mice were randomized into the treatment group by body weight, once at 7 days post cell inoculation with huCD20-7 10 mg / kg, huCD20-7-SMCC-DM1 10 mg / kg or huCD20-7-SPP-DM1 5 mg / kg. It was treated. The number of mice surviving different treatment groups is plotted in FIG. 35A. Median survival for mice in the PBS treatment group was 27 days. huCD20-7 treatment resulted in an increase in median survival by 45 days. Both conjugations resulted in an additional increase in median survival compared to the antibodies. huCD20-7-SMCC-DM1 and huCD20-7-SPP-DM1 resulted in median survival of 64 and 58 days, respectively.

SCID 마우스에 정맥내로 이식된 Daudi 림프종 세포를 사용하는 유사한 이종이식 모델에서, 마우스는 huCD20-7, 리툭시맙, huCH20-7-SMCC-DM1 또는 huCH20-7-BMPS-DM1 10㎎/㎏으로 세포 접종 후 7일에 처치하였다. 상이한 처치군에서 생존한 마우스의 수는 도 35B에 플롯팅되어 있다. 마우스의 PBS 처치군에 대한 중앙 생존은 31일이었다. huCH20-7 처치는 49일까지 중앙 생존에서 증가를 초래하였다. 반대로, 리툭시맙 처치는 중앙 생존을 단지 40일까지의 증가를 초래하였다. 2가지 huCD20-7-기초 컨쥬게이트는 항체와 비교하여 생존에서 추가적 증가를 초래하였고, huCH20-7-SMCC-DM1 및 huCH20-7-BMPS-DM1은 각각 5일째 90% 및 100% 생존을 초래하였다.In a similar xenograft model using Daudi lymphoma cells intravenously implanted in SCID mice, mice received cells at 10 mg / kg of huCD20-7, rituximab, huCH20-7-SMCC-DM1 or huCH20-7-BMPS-DM1. Treatment was performed 7 days after inoculation. The number of mice surviving different treatment groups is plotted in FIG. 35B. Median survival for the PBS treated group of mice was 31 days. huCH20-7 treatment resulted in an increase in median survival up to 49 days. In contrast, rituximab treatment resulted in an increase in median survival up to only 40 days. Two huCD20-7-based conjugates resulted in an additional increase in survival compared to antibodies, and huCH20-7-SMCC-DM1 and huCH20-7-BMPS-DM1 resulted in 90% and 100% survival on day 5, respectively. .

huCD20huCD20 -7 항체 및 --7 antibodies and- SPPSPP -- DM1DM1 및  And SMCCSMCC -- DM1DM1 의 생체 내 효능In vivo efficacy of

예시적인 huCD20-7 항체 및 이의 컨쥬게이트는 DOHH-2 마우스에 피하로 이식된 DOHH-2 여포성 림프종 세포를 사용하여 미리 감지가능한 이종이식 모델에서 테스트하였다. 마우스는 체중에 의하여 치료군으로 임의 추출하였고, huCD20-7 10㎎/㎏, huCD20-7-SMCC-DM1 10㎎/㎏ 또는 huCD20-7-SPP-DM1 5㎎/㎏으로 세포 접종 후 3일째에 한번 처치하였다. 상이한 처치군에서 중앙 종양 부피는 도 36에 플롯팅되어 있다. huCD20-7 항체 처치는 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피에서 감소를 초래하였다. 향상된 효능은 비컨쥬게이트된 항체와 비교하여 huCD20-7 컨쥬게이트에 대하여 보여졌다. 연구의 마지막 90일째에 huCD20-7 처치 결과 10마리 중 2마리가 무종양 생존자(TFS)인 반면, huCD20-7-SMCC-DM1 처치 결과는 10마리 중 6마리가 TFS이었고, huCD20-7-SPP-DM1 처치 결과는 10마리 중 10마리가 TFS이었다. 어떠한 TFS도 PBS 대조군에서 관찰되지 않았다.Exemplary huCD20-7 antibodies and conjugates thereof were tested in a previously detectable xenograft model using DOHH-2 follicular lymphoma cells subcutaneously implanted in DOHH-2 mice. Mice were randomized into the treatment group by body weight and once every 3 days after cell inoculation with huCD20-7 10 mg / kg, huCD20-7-SMCC-DM1 10 mg / kg or huCD20-7-SPP-DM1 5 mg / kg. It was treated. The median tumor volume in the different treatment groups is plotted in FIG. 36. huCD20-7 antibody treatment resulted in a decrease in median tumor volume compared to the PBS control. Improved efficacy was shown for the huCD20-7 conjugate as compared to the unconjugated antibody. At the last 90 days of the study, two of 10 huCD20-7 treatments were tumor-free survivors (TFS), while six of 10 huCD20-7-SMCC-DM1 treatments were TFS and huCD20-7-SPP The DM1 treatment resulted in 10 of 10 TFS. No TFS was observed in the PBS control.

huCD20huCD20 -7-기초 -7-foundation 컨쥬게이트의Conjugate 생체 내 효능의 요약 Summary of efficacy in vivo

CD20 항체의 컨쥬게이트는 이미 기술되어 있다. 하나의 경우에서, 항-CD20 항체의 비절단성 SMCC-DM1 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 항체와 동일한 효능을 나타낸 반면, 동일한 항체의 절단성 SPP-DM1 컨쥬게이트는 SCID 마우스의 Granta-519 이종이식 모델에서 개선된 효능을 나타내었다(전술한 Polson et al.). 유사하게, 산-안정성 아마이드 링커를 이용하여 만든 리툭시맙의 칼리키아마이신 컨쥬게이트는 누드 마우스인 Ramos 이종이식 모델에서 개선된 생체 내 효능을 보이지 않았다. 단지 산-안정성 다이메틸 하이드라자이드 Ac-But 링커를 이용하여 만든 리툭시맙의 칼리키아마이신 컨쥬게이트만이 이 연구에서 개선된 생체 내 호능을 보였다(전술한 DiJoseph et al.).Conjugates of CD20 antibodies have already been described. In one case, the non-cleavable SMCC-DM1 conjugate of the anti-CD20 antibody showed the same potency as the unconjugated antibody, whereas the cleavable SPP-DM1 conjugate of the same antibody gave the Granta-519 xenograft model of SCID mice. Improved efficacy at (Polson et al., Supra). Similarly, the calicheamycin conjugate of rituximab made with an acid-stable amide linker did not show improved in vivo efficacy in the Ramos xenograft model, a nude mouse. Only calituamycin conjugates of rituximab made with the acid-stable dimethyl hydrazide Ac-But linker showed improved in vivo efficacy in this study (DiJoseph et al., Supra).

놀랍게도, 예를 들어 SMCC-DM1 또는 BMPS-DM1 컨쥬게이트와 같은 huCD20-7의 비절단성 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트 항체와 비교하여 2가지 상이한 이종이식 모델에서 극적으로 개선된 생체 내 효능을 나타낸다. 추가로, 예를 들어 SPP-DM1 컨쥬게이트와 같은 huCD20-7의 절단성 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 항체와 비교하여 동등한 개선된 생체 내 효능을 나타낸다. 예를 들어 huCD20-7은 생체 내에서 비절단성 컨쥬게이트로서 보다 효과적이도록 할 수 있는 물리적 및 기능적 특성의 가지는 항체이다.Surprisingly, non-cleavable conjugates of huCD20-7, such as, for example, SMCC-DM1 or BMPS-DM1 conjugates, show dramatically improved in vivo efficacy in two different xenograft models compared to non-conjugate antibodies. In addition, cleavable conjugates of huCD20-7, such as, for example, SPP-DM1 conjugates show equivalent improved in vivo efficacy compared to unconjugated antibodies. HuCD20-7, for example, is an antibody having physical and functional properties that can make it more effective as a non-cleavable conjugate in vivo.

본 발명은 구체적인 양태와 관련하여 상세하게 기술되어 있지만, 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 사상 및 범주를 벗어남 없이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백하다.While the invention has been described in detail with reference to specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention.

Claims (93)

CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편으로서, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스(apoptosis), 항체 의존성 세포매개 세포독성(antibody dependent cell mediated cytotoxicity: ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)을 유도할 수 있는 것인 항체 또는 그의 절편.An antibody or fragment thereof that specifically binds to CD20, wherein the antibody or fragment is apoptosis, antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) An antibody or fragment thereof that is capable of inducing. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 뮤린(murine), 비인간, 인간화, 키메라, 재표면화 또는 인간의 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment is of murine, nonhuman, humanized, chimeric, resurfaced or human. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 단일클론 또는 단일-사슬의 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment is of monoclonal or single-chain. 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 PTA-10486) 또는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 PTA-10487)에 의해 생성되는 항체 또는 그의 절편.Antibodies or fragments thereof produced by hybridomas (ATCC Accession No. PTA-10486) or hybridomas (ATCC Accession No. PTA-10487). 제1항에 있어서, 포유동물, 효모, 곤충, 식물 또는 박테리아 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 진핵 또는 원핵 숙주 세포로부터 얻어지는 것인, 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, obtained from a eukaryotic or prokaryotic host cell selected from the group consisting of mammalian, yeast, insect, plant or bacterial cells. 제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO, NS0, SP2/0, PER.C6 또는 HEK-293 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 5, wherein the mammalian cell is a CHO, NS0, SP2 / 0, PER.C6, or HEK-293 cell. 제5항에 있어서, 상기 효모 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.The method of claim 5, wherein the yeast cells Pichia Pastoris ( Pchia) pastoris ) or Saccharomyces cerevisiae ) cells, or fragments thereof. 제5항에 있어서, 상기 곤충 세포는 Sf-9 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 5, wherein the insect cell is an Sf-9 cell. 제5항에 있어서, 상기 식물 세포는 렘나(Lemna) 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 5, wherein the plant cell is a Lemna cell. 제5항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 대장균(E. coli) 세포인 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 5, wherein the bacterial cell is an E. coli cell. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20의 제3 막관통 도메인과 제4 막관통 도메인 사이에 위치하는 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment specifically binds to at least one amino acid comprising an amino acid residue located between the third transmembrane domain and the fourth transmembrane domain of CD20. 세포독성제에 연결된 제1항의 항체 또는 절편을 포함하는 컨쥬게이트.A conjugate comprising the antibody or fragment of claim 1 linked to a cytotoxic agent. 제12항에 있어서, 상기 세포독성제는 메이탄시노이드, 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065, CC-1065 유사체, 듀오카마이신, 듀오카마이신 유사체, 칼리키아마이신, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 아우리스타틴, 토메이마이신 유도체 및 렙토마이신 유도체 또는 컨쥬게이트의 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.The method of claim 12, wherein the cytotoxic agent maytansinoid, maytansinoid analogue, benzodiazepine, taxoid, CC-1065, CC-1065 analogue, duocarmycin, duocarmycin analogue, calicheamicin Conjugates selected from the group consisting of dolastatin, dolastatin analogs, auristatins, tomycin derivatives, and prodrugs of leptomycin derivatives or conjugates. 제1항에 기재된 항체 또는 절편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising the antibody or fragment of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 제12항의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising the conjugate of claim 12 and a pharmaceutically acceptable carrier. 제12항에 기재된 컨쥬게이트를 포함하는 진단 시약으로서, 상기 항체 또는 절편은 표지화되어 있는 것인 진단 시약.A diagnostic reagent comprising the conjugate of claim 12, wherein the antibody or fragment is labeled. 제16항에 있어서, 상기 표지는 군으로부터 선택된 방사능표지, 형광단, 발색단, 조영제 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 진단 시약.The diagnostic reagents of claim 16, wherein the label is selected from the group consisting of radiolabels, fluorophores, chromophores, contrast agents and metal ions selected from the group. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 서열번호 45의 아미노산, 또는 GI 21330989, GenBank Protein ID 23110989를 포함하는 적어도 하나의 아미노산에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment specifically binds an amino acid of SEQ ID NO: 45, or at least one amino acid comprising GI 21330989, GenBank Protein ID 23110989. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20을 발현하는 세포의 사멸을 유도할 수 있는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment is capable of inducing death of cells expressing CD20. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 절편은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 상당히 유도하는 능력을 가지고, CD20의 지질뗏목으로의 재분배를 야기하며 보체 의존성 세포독성(CDC)을 상당히 유도하는 능력을 가지는, III형 항체인 것인 항체 또는 그의 절편.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment has the ability to significantly induce apoptosis in the absence of a crosslinker, causes redistribution of CD20 to lipid rafts, and has the ability to significantly induce complement dependent cytotoxicity (CDC). The antibody or fragment thereof which is a type III antibody. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 절편은 웨스턴 블럿(Western blot)에서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment thereof specifically binds the CD20 in a Western blot. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 절편은 ELISA에서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment thereof specifically binds the CD20 in an ELISA. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 절편은 유세포 분석법에서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment thereof specifically binds the CD20 in flow cytometry. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGDCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 다이아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment of claim 1, wherein the antibody or fragment comprises a Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fd, single chain Fv or scFv, disulfide linked Fv, V-NAR domain, IgNar, intrabody, IgGDCH2, minibody, An antibody or fragment thereof comprising F (ab ') 3 , tetrabody, tribody, diabody, single-domain antibody, DVD-Ig, Fcab, mAb 2 , (scFv) 2 , or scFv-Fc. 제1항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1 comprising an immunoglobulin heavy chain constant domain. 제25항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 IgG1 불변 도메인, IgG2 불변 도메인, IgG3 불변 도메인 및 IgG4 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 25, wherein the immunoglobulin heavy chain constant domain is selected from the group consisting of an IgG1 constant domain, an IgG2 constant domain, an IgG3 constant domain, and an IgG4 constant domain. 제19항에 있어서, 상기 세포는 B 세포로부터 유래된 것인 항체.The antibody of claim 19, wherein said cell is derived from B cell. 제19항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인 것인 항체.The antibody of claim 19, wherein said cell is a cancer cell. 제28항에 있어서, 상기 암 세포는 B 세포 림프종, NHL, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종 및 비장 유형 변연부 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.The method of claim 28, wherein the cancer cells are B cell lymphoma, NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma and mature B cell neoplasia, B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) / slymphocytic lymphoma (SLL), B Cytoblastic Leukemia, Lymphoid Cellular Lymphoma, Mantle Cell Lymphoma (MCL), Follicle Lymphoma (FL), Low Grade, Medium Grade and High Grade (FL), Skin Follicle Central Lymphoma, Marginal B Cell Lymphoma, MALT Type Marginal B cell lymphoma, nodular marginal B cell lymphoma and spleen type marginal B cell lymphoma, hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disease, Waldenstrom macro Globulinemia, and retrograde large cell lymphoma (ALCL). 제19항에 있어서, 상기 세포는 원치 않는 면역 반응에 영향을 미치는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 19, wherein said cell affects an unwanted immune response. 제19항에 있어서, 상기 세포는 염증에 영향을 미치는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 19, wherein said cell affects inflammation. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The antibody of claim 1, wherein the antibody or fragment may kill at least about 48% of Ramos lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하고; 상기 항체는 약 0.018㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 CDC를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment is capable of killing at least about 48% of Ramos lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinker; Wherein said antibody is capable of killing Ramos lymphoma cells with an EC 50 of about 0.018 μg / ml or less, wherein said killing comprises CDC. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하고; 상기 항체 또는 절편은 약 0.018㎍/㎖ 이하의 EC50으로 Ramos 림프종 세포를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 CDC를 포함하고; 상기 항체 또는 절편은 상기 세포의 막의 지질뗏목 구획으로 CD20을 전위시킬 수 있는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment is capable of killing at least about 48% of Ramos lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinker; The antibody or fragment may kill Ramos lymphoma cells with an EC 50 of about 0.018 μg / ml or less, the killing comprising CDC; Wherein said antibody or fragment is capable of translocating CD20 to a lipid raft compartment of said cell's membrane. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Raji 림프종 세포의 적어도 약 53%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The antibody of claim 1, wherein the antibody or fragment may kill at least about 53% of Raji lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The antibody of claim 1, wherein the antibody or fragment may kill at least about 34% of WSU-DLCL-2 lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하고; 상기 항체 또는 상기 절편은 약 0.58㎍/㎖ 이하의 EC50으로 WSU-DLCL-2 림프종 세포를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 CDC를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment is capable of killing at least about 34% of WSU-DLCL-2 lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinker; The antibody or the fragment may kill WSU-DLCL-2 lymphoma cells with an EC 50 of about 0.58 μg / ml or less, wherein the killing comprises CDC. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Jeko-1 림프종 세포의 적어도 약 12%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The antibody of claim 1, wherein the antibody or fragment may kill at least about 12% of Jeko-1 lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 Granta-519 림프종 세포의 적어도 약 40%를 사멸할 수 있는데, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The antibody of claim 1, wherein the antibody or fragment may kill at least about 40% of Granta-519 lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment binds to an epitope on CD20, wherein the epitope does not comprise or require an amino acid residue proline at position 170 and / or 172 and / or the epitope is at position 163 and / or 166. An antibody comprising or requiring the amino acid residue asparagine. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 Ramos 림프종 세포의 적어도 약 48%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment binds to an epitope on CD20, wherein the epitope does not comprise or require an amino acid residue proline at position 170 and / or 172 and / or the epitope is at position 163 and / or 166. Include or require the amino acid residue asparagine; Said antibody or fragment may kill at least about 48% of Ramos lymphoma cells, said killing comprising apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하는 CD20 에피토프를 포함하거나 필요로 하고/하거나; 상기 항체 또는 절편은 Raji 림프종 세포의 적어도 약 53%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment binds to an epitope on CD20, wherein the epitope does not comprise or require an amino acid residue proline at position 170 and / or 172 and / or the epitope is at position 163 and / or 166. Include or require a CD20 epitope comprising the amino acid residue asparagine; Wherein said antibody or fragment is capable of killing at least about 53% of Raji lymphoma cells, wherein said killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 WSU-DLCL-2 림프종 세포의 적어도 약 34%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment binds to an epitope on CD20, wherein the epitope does not comprise or require an amino acid residue proline at position 170 and / or 172 and / or the epitope is at position 163 and / or 166. Include or require the amino acid residue asparagine; Wherein said antibody or fragment is capable of killing at least about 34% of WSU-DLCL-2 lymphoma cells, wherein said killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 Jeko-1 림프종 세포의 적어도 약 12%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment binds to an epitope on CD20, wherein the epitope does not comprise or require an amino acid residue proline at position 170 and / or 172 and / or the epitope is at position 163 and / or 166. Include or require the amino acid residue asparagine; Said antibody or fragment may kill at least about 12% of Jeko-1 lymphoma cells, said killing comprising apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 CD20 상의 에피토프에 결합하는데, 상기 에피토프는 위치 170 및/또는 172에서 아미노산 잔기 프롤린을 포함하거나 필요로 하지 않고/않거나 상기 에피토프는 위치 163 및/또는 166에서 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 상기 항체 또는 절편은 Granta-519 림프종 세포의 적어도 약 40%를 사멸할 수 있으며, 상기 사멸은 가교제의 부재 하에 아포토시스를 포함하는 것인 항체.The method of claim 1, wherein the antibody or fragment binds to an epitope on CD20, wherein the epitope does not comprise or require an amino acid residue proline at position 170 and / or 172 and / or the epitope is at position 163 and / or 166. Include or require the amino acid residue asparagine; The antibody or fragment may kill at least about 40% of Granta-519 lymphoma cells, wherein the killing comprises apoptosis in the absence of a crosslinking agent. 서열번호 25 내지 30 및 17 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 그의 절편.An antibody or fragment thereof comprising at least one complementarity determining region having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25-30 and 17-22. 제46항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 절편은 CD20에 결합하는 것인 항체 또는 그의 절편.47. The antibody or fragment thereof of claim 46, wherein said antibody or fragment is binding to CD20. 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 절편으로서, 상기 중쇄는 서열번호 20 내지 22 또는 28 내지 30의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 17 내지 19 또는 25 내지 27의 아미노산 서열을 가지는 3개의 순차적인 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 그의 절편.An antibody or fragment thereof comprising at least one heavy chain and at least one light chain, the heavy chain comprising three sequential complementarity determining regions having an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20-22 or 28-30, wherein the light chain is a sequence An antibody or fragment thereof comprising three sequential complementarity determining regions having amino acid sequences of numbers 17-19 or 25-27. 제48항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the heavy chain has at least 90% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35, or 36. 제48항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the heavy chain has at least 95% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35, or 36. 제48항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 47, 34, 35 또는 36의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the heavy chain has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, 34, 35, or 36. 제48항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the light chain has at least 90% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32, or 33. 제48항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein said light chain has at least 95% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32, or 33. 제48항에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 46, 32 또는 33의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein said light chain has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, 32 or 33. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the heavy chain comprises 1 to 5 conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the heavy chain comprises 1 to 3 conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35 or 36. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the heavy chain comprises three conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35, or 36. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 2개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the heavy chain comprises two conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35, or 36. 제48항에 있어서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 47, 34, 35 또는 36으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the heavy chain comprises one conservative substitution as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 34, 35, or 36. 49. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the light chain comprises 1 to 5 conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the light chain comprises 1 to 3 conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 3개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the light chain comprises three conservative substitutions compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 2개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the light chain comprises two conservative substitutions as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. 제48항에 있어서, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 46, 32 또는 33으로 표현되는 아미노산 서열과 비교하여 1개의 보존적 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.49. The antibody or fragment thereof of claim 48, wherein the amino acid sequence of the light chain comprises one conservative substitution as compared to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, 32 or 33. CD20에 특이적으로 결합하는 개선된 항체 또는 절편으로서,
(a) 서열번호 32 내지 36, 46, 47, 17 내지 22, 25 내지 30 및 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 항체 또는 그의 절편을 암호화하는 DNA를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 상기 DNA로의 삽입을 도입하여 상기 DNA에 의해 암호화된 상기 항체 또는 항체 절편의 아미노산 서열이 변화되는 단계;
(c) 상기 항체 또는 항체 절편을 발현하는 단계; 및
(d) 상기 개선에 대하여 상기 발현된 항체 또는 항체 절편을 스크리닝하여, 상기 개선된 항체 또는 항체 절편이 제조되는 단계;
에 의해 제조된 항체 또는 그의 절편.An improved antibody or fragment that specifically binds CD20,
(a) providing a DNA encoding an antibody or fragment thereof comprising at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32 to 36, 46, 47, 17 to 22, 25 to 30, and 1 to 7;
(b) introducing at least one nucleotide mutation, deletion or insertion into the DNA to change the amino acid sequence of the antibody or antibody fragment encoded by the DNA;
(c) expressing said antibody or antibody fragment; And
(d) screening the expressed antibody or antibody fragment for the improvement, thereby producing the improved antibody or antibody fragment;
An antibody prepared by or fragment thereof. 제65항에 있어서, 상기 개선은 CD20에 대하여 친화도의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.67. The antibody or fragment thereof of claim 65, wherein said improvement is an increase in affinity for CD20. 제65항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 결실 또는 삽입은 올리고뉴클레오티드-매개 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 실수유발 PCR, DNA 셔플링, 및 대장균의 돌연변이 유발 유전자-균주의 사용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 이루어지는 것인 항체 또는 그의 절편.66. The method of claim 65, wherein said at least one nucleotide mutation, deletion or insertion is achieved by use of oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis, cassette mutagenesis, error-prone PCR, DNA shuffling, and mutagenesis gene-strains of E. coli. The antibody or fragment thereof which is made by a method selected from the group consisting of. 서열번호 1 내지 7 및 17 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 절편.An antibody or fragment thereof comprising a polypeptide comprising at least one member selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-7 and 17-36. 제65항에 있어서, 상기 개선은 효과기 기능의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 65, wherein said improvement is an increase in effector function. 제65항에 있어서, 상기 개선은 CDC 활성의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.66. The antibody or fragment thereof of claim 65, wherein said improvement is an increase in CDC activity. 제65항에 있어서, 상기 개선은 ADCC 활성의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.67. The antibody or fragment thereof of claim 65, wherein said improvement is an increase in ADCC activity. 제65항에 있어서, 상기 개선은 ADCC 활성의 증가, CDC 활성의 증가 및 효과기 기능의 증가인 것인 항체 또는 그의 절편.66. The antibody or fragment thereof of claim 65, wherein said improvement is an increase in ADCC activity, an increase in CDC activity, and an increase in effector function. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 절편은 형질전환 발현 숙주로부터 얻은 것이며, 상기 숙주는 형질전환 염소, 닭, 소, 또는 계란으로 이루어진 것인 항체 또는 그의 절편.The antibody or fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or fragment is obtained from a transgenic expression host and the host consists of a transgenic goat, chicken, cow, or egg. 암 세포를 제1항에 기재된 항체 또는 절편과 접촉시키는 것을 포함하는 암 세포의 성장을 억제하는 방법.A method of inhibiting growth of cancer cells comprising contacting the cancer cells with the antibody or fragment of claim 1. CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편 또는 컨쥬게이트의 유효량을 암이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있는 것인 방법.A method of treating a patient with cancer comprising administering to a patient with cancer an effective amount of an antibody or fragment or conjugate thereof that specifically binds CD20, wherein the antibody or fragment is apoptosis, antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC). 제75항에 있어서, 상기 환자에게 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.76. The method of claim 75, further comprising administering a therapeutic agent to the patient. 제76항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제인 것인 방법.The method of claim 76, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic agent. 제19항의 컨쥬게이트의 유효량을 암이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법.A method of treating a patient with cancer comprising administering an effective amount of the conjugate of claim 19 to a patient with cancer. 제75항에 있어서, 상기 암은 B 세포 림프종, NHL, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종 및 비장 유형 변연부 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.76. The method of claim 75, wherein the cancer is B cell lymphoma, NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma and mature B cell neoplasia, B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) / slymphocytic lymphoma (SLL), B cell Prolymphocytic leukemia, lymphoplasmic lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL), low grade, medium grade and high grade (FL), cutaneous follicular central lymphoma, marginal zone B cell lymphoma, MALT type marginal zone B cell lymphoma, nodular marginal B cell lymphoma and spleen type marginal B cell lymphoma, hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disease, Waldenstrom's macroglobulin Blood pressure, and retrograde large cell lymphoma (ALCL). 암이 있는 것으로 의심도는 개체를 진단하는 방법으로서, 상기 방법은
제16항의 진단 시약을 상기 개체에게 투여하는 단계; 및
상기 개체 내에서 상기 시약의 분포를 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법.A method of diagnosing a subject suspected of having cancer, the method comprising
Administering the diagnostic reagent of claim 16 to the subject; And
Detecting the distribution of the reagent in the subject. 제80항에 있어서, 상기 암은 B 세포 림프종, NHL, 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 낮은 등급, 중간 등급 및 높은 등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종 및 비장 유형 변연부 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식 후 림프세포 증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역행성 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 진단 방법.81. The method of claim 80, wherein the cancer is B cell lymphoma, NHL, precursor B cell lymphocytic leukemia / lymphoma and mature B cell neoplasia, B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) / slymphocytic lymphoma (SLL), B cell Prolymphocytic leukemia, lymphoplasmic lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL), follicular lymphoma (FL), low grade, medium grade and high grade (FL), cutaneous follicular central lymphoma, marginal zone B cell lymphoma, MALT type marginal zone B cell lymphoma, nodular marginal B cell lymphoma and spleen type marginal B cell lymphoma, hairy cell leukemia, diffuse large B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, plasmacytoma, plasma cell myeloma, post-transplant lymphocyte proliferative disease, Waldenstrom's macroglobulin Blood pressure, and retrograde large cell lymphoma (ALCL). CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편 또는 컨쥬게이트의 유효량을 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 항체 또는 절편은 아포토시스, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도할 수 있는 것인 치료 방법.A method of treating a patient with an autoimmune or inflammatory disease comprising administering to a patient with an autoimmune or inflammatory disease an effective amount of an antibody or fragment or conjugate thereof that specifically binds CD20, wherein the antibody or fragment is A method of treatment capable of inducing apoptosis, antibody dependent cellular mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC). 제82항에 있어서, 상기 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP), 자가면역성 혈소판 감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-연관 한랭글로불린 혈관염, 만성 국소 뇌염, 수포성 유천포창, A형 혈우병, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성 근염, 만성 두드러기, 원발 담즙성 간경변, 시신경 척수염, 그레이브스 갑상선 이상성 질환, 수포성 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선성 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상 동맥 경화증, 백혈구 부착 결핍증, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스-연관 질환, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염, 피부근염, ANCA, 재생불량성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), VIII 인자 결핍증, A형 혈우병, 자가면역성 호중구 감소증, 캐슬만 증후군, 굿파스튜어 증후군, 고형 장기 이식 거부, 이식편대 숙주병(GVHD), 자가면역성 간염, 림프모양 사이질 폐렴(HIV), 폐색성 세기관지염(비이식), 길랭-바레 증후군, 대혈관 혈관염, 거대세포 (타카야수) 동맥염, 중간혈관 혈관염, 가와사키병 및 결절성 다발동맥염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.83. The method of claim 82, wherein said rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's disease, inflammatory bowel disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic Purpura (TTP), autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis, psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, Raynaud's syndrome, Crohn's disease, ulcerative colitis, gastritis, Hashimoto's thyroiditis, ankylosing spondylitis, Hepatitis C-associated cold globulin vasculitis, chronic focal encephalitis, bullous swelling, type A hemophilia, membrane proliferative glomerulonephritis, adult and pediatric dermatitis, adult polymyositis, chronic urticaria, primary biliary cirrhosis, optic nerve myelitis, Graves Thyroid abnormalities, bullous swelling, melanoma, glomerulonephritis, chug-strauss syndrome, asthma, psoriatic arthritis, skin , Respiratory distress syndrome, meningitis, encephalitis, uveitis, eczema, atherosclerosis, leukocyte adhesion deficiency, childhood diabetes, lighter disease, Behcet's disease, hemolytic anemia, atopic dermatitis, Wegener's granulomatosis, Omen syndrome, chronic renal failure, acute infectious mononucleosis, HIV and herpes-associated diseases, scleroderma, Sjogren's syndrome and glomerulonephritis, dermatitis, ANCA, aplastic anemia, autoimmune hemolytic anemia (AIHA), factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, castleman syndrome, goodpa Stewart syndrome, solid organ transplant rejection, graft-versus-host disease (GVHD), autoimmune hepatitis, lymphoid interstitial pneumonia (HIV), obstructive bronchiolitis (non-transplantation), Guillain-Barré syndrome, large vessel vasculitis, giant cells (Takaya) Male) arteritis, intermediate vessel vasculitis, Kawasaki disease and nodular polyarteritis. 제1항, 제4항, 제18항 및 제48항 중 어느 한 항의 항체 또는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.49. A polynucleotide encoding the antibody or fragment of any one of claims 1,4, 18 and 48. 제1항, 제4항, 제18항 및 제48항 중 어느 한 항의 항체 또는 절편의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.49. A polynucleotide encoding the light or heavy chain of the antibody or fragment of any one of claims 1, 4, 18 and 48. 제85항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.86. A vector comprising the polynucleotide of claim 85. 제86항에 있어서, 상기 벡터는 상기 항체 또는 항체 절편을 발현할 수 있는 발편 벡터인 것인 벡터.The vector of claim 86, wherein the vector is a fragment vector capable of expressing the antibody or antibody fragment. 제87항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.87. A host cell comprising the expression vector of claim 87. CD20에 특이적으로 결합하는 수단으로서, 상기 수단은 아포토시스, ADCC 및 CDC를 유도할 수 있는 것인 수단.Means for specifically binding to CD20, wherein the means are capable of inducing apoptosis, ADCC and CDC. 제1항에 기재된 항체 또는 절편을 유효량을 암이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 항체 도는 절편은 방사능표지된 화합물에 연결된 것인 방법.A method of treating a patient with cancer comprising administering an effective amount of the antibody or fragment of claim 1 to a patient with cancer, wherein the antibody or fragment is linked to a radiolabeled compound. 제12항에 있어서, 상기 세포독성제에 항체 또는 절편의 상기 연결은 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성기, 펩티다아제 불안정성 기 및 에스테라아제 불안정성 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 통하는 것인 컨쥬게이트.The method of claim 12, wherein the linking of the antibody or fragment to the cytotoxic agent is via a linker selected from the group consisting of disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, photolabile groups, peptidase labile groups, and esterase labile groups. Conjugate. 제91항에 있어서, 상기 링커는 N-석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)2-설포부타노에이트(설포-SPDB), N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), 2-이미노티올란 및 아세틸석시닉 안하이드라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.92. The method of claim 91, wherein the linker is N -succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), N -succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) butanoate ( SPDB), N -succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) 2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB), N -succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate (SPP) ), 2-iminothiolane and acetylsuccinic anhydride. 제91항에 있어서, 상기 링커는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), β-말레이미도프로판산 N-석신이미딜 에스터(BMPS), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소시아네이트(PMPI), N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.92. The method of claim 91, wherein the linker is N -succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N -succinimidyl-4- ( N- maleimidomethyl) -cyclohexane-1- carboxy- (6-amido-caproate) (LC-SMCC), κ- already helped maleic acid N- succinimidyl ester (KMUA), β- maleimido propanoic acid N-succinimidyl ester (BMPS), γ Maleimidobutyric acid N- succinimidyl ester (GMBS), ε-maleimidocaproic acid N -hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl- N -hydroxysuccinimide ester (MBS) , N- (α-maleimidoacetoxy) -succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6- (β-maleimidopropionamido) hexanoate (SMPH), N- succinimidyl 4- ( p-maleimidophenyl) -butyrate (SMPB), and N- (p-maleimidophenyl) isocyanate (PMPI), N- succinimidyl-4- (iodoacetyl) -aminobenzoate (SIAB), Ah already succinate N- deal The conjugate Goto acetate (SIA), N- succinimidyl bromoacetate (SBA), and N- succinimide already dill 3- (bromoacetaldehyde amido) propionate is selected from the group consisting of (SBAP).
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