KR100328095B1

KR100328095B1 - 정제헤파린,이의제조방법및그를함유하는제약학적조성물

Info

Publication number: KR100328095B1
Application number: KR1019940010033A
Authority: KR
Inventors: 쟝프랑소아브라넬렉; 호세에스뻬호; 필립삐까르
Original assignee: 사노피-신델라보
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-07
Publication date: 2002-06-20
Also published as: PL178294B1; FI107388B; DE69400385T2; JP3529835B2; EP0623629A1; CA2122930A1; MY110862A; CZ287889B6; FR2704861A1; TW438812B; CN1096034A; HU9401446D0; CN1066155C; ATE141618T1; HK1007432A1; NO306952B1; DK0623629T3; AU6191294A; HU221595B; CZ113294A3

Abstract

본 발명은 아질산염으로 해중합된 헤파린에 UV 를 조사하여 제조되며, 총니트로소 화합물을 150 ppn 이하 함유하는 저분자량의 헤파린에 관한 것이다.

Description

정제 헤파린, 이의 제조 방법 및 그를 함유하는 제약학적 조성물

본 발명은 정제 헤파린, 더 구체적으로는 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 헤파린, 이의 제조 방법 및 그를 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 실제적으로 니트로소 화합물을 함유하지 않으며 아질산 해중합 반응으로 수득한 헤파린에 관한 것이다.

헤파린 분획은 예를 들어 특허출원 EP-A-0,014,184 및 EP-A-0,027,087 에 기재된 바와 같이 아질산 해중합에 의해 수득됨이 공지되어 있다. 아질산 해중합에 의해 제조된 일부 헤파린 분획은 "저분자량의 헤파린" 또는 "분자량이 적은 헤파린" 의 명칭하에 통상적으로 사용하는 의약품의 유형 성분이다.

의약품으로서 사용된 저분자량의 헤파린, 그의 분석 및 황산염/카르복실 비로 나타낸 황산화도에 관련된 모든 세부 사항은 문헌 "Heparines de faible masse moleculaire" [Heparins of small molecular mass], Pharmeuropa, October 1991, 3, N. 3, pp. 161~165, 뿐만 아니라 유럽 약전에 제출된 전공논문 "Heparina massae molecularis minorls", February 1993 (PA/PH/Exp. 3T (92) 93) 에 기재되어 있다. 상기와 같이 제조되었으며 의약품의 유형 성분으로서 유용한 일부 저분자량의 헤파린은 특허출원 FR-A-2478646, EP-A-0,037,319, EP-A-0,076,279 및 EP-A-0,181,259 에 기재되어 있다. 이들은 국제 비상표명 (INN) 인 나드로파린 칼슘, 달테파린 나트륨 및 레비파린 나트륨으로 공지되어 있으며, 시판중이거나 시판예정인 특제품의 유형 성분의 구성 요소이다. 특히, 레비파린 나트륨은 독일에서 시판되는 특제품 CLIVARIL의 유형 성분의 구성 요소이다. 아질산 해중합 반응에 의해 수득된 그 외의 저분자량의 헤파린도 또한 독일 (MONOEMBOLEXNM), 오스트리아 (SADOPARIN및 TROPARIN) 및 스위스 (SANDOPARINE) 에서 의학적으로 공인된 일부 특제품내에 존재한다.

아질산 해중합 반응의 방법은 헤파린 또는 그의 분획 또는 분절에 존재하며 니트로화되기 쉬운 화합물에 -NO 기를 첨가함으로써 비휘발성 니트로소 화합물 (이하, N-NO 화합물 또는 단순히 N-NO) 을 생성하는 것을 수반한다. 헤파린 분획에 존재하는 니트로소 화합물의 양이 매우 작고, 상기 화합물이 비휘발성이기 때문에 의약품으로서의 용도에 악영향을 끼치지는 않지만, 상기 제품을 공업적 규모로 제조하는 것은 대량의 분제 취급을 수반한다. 따라서, 제약학적 특제품의 유형 성분으로서 사용되는 저분자량의 헤파린의 특성을 완성시키기 위해 이들을 완전히 또는 거의 완전히 제거하는 것이 유용할 수도 있다.

평균 분자량이 적은 저분자량의 헤파린의 경우에, 예를 들어 이후에 CY222 로 명명될 제품(평균 분자량: 1,700Da∼3,300Da)의 경우에, 니트로소 화합물의 양은 고 분자량 제품내의 니트로소 화합물의 양보다 많을 수 있다. 상기 제품은 특허출원 FR-2,478,646 및 EP-0,037,319 에 청구된 제품의 정의와 일치하며, 상기 동일 특허출원 또는 특허에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

따라서, 상기 제시한 바와 같은 이유 때문에, 아질산 해중합 반응에 의해 수득되었으며 실제적으로 니트로소 화합물을 전혀 함유하지 않는 헤파린 분획의 시판이 매우 요망된다.

200 nm 미만, 바람직하게는 185 nm 미만의 파장 및 염기성 pH 에서 UV 광선으로 조사함으로써, 물을 살균함과 동시에 음료수에서 질산염을 제거하는 방법은 논문 [P. PRINCZ et al., Water Supply, 1988, 6, 199∼205] 에 기재되어 있다. 하지만, 물 처리에 관련된 상기 문헌에서는, UV 광선을 이용한 조사가 생물학적 활성 제품의 생물학적 특성 및/또는 물리화학적 특성에 역효과를 야기하지 않고도 생물학적 활성 제품에 적용될 수 있는지의 여부를 예측할 수 없다.

이제, 아질산 해중합으로 수득한 헤파린 분획에 UV 광선(이하, UV)의 활성을 가함으로써, 존재하는 니트로소 화합물을 거의 완전히 제거할 수 있으며, 총니트로소 화합물의 함량이 천연 헤파린에서의 함량과 동일하거나 이보다 적은 정제 헤파린 분획이 수득됨을 발견하였다.

또한, 사용된 조건하에서 UV 조사가 헤파린 분획의 구조를 변형시키지 않으며, 헤파린 분획은 그의 모든 생물학적 특성 및 물리화학적 특성을 보유함도 발견 되었다.

따라서, 그 중의 한 양태에 따라, 본 발명은 총니트로소 화합물의 함량이 500 ppb 이하, 유익하게는 150 ppb 이하, 바람직하게는 100 ppb 이하, 더욱 더 바람직하게는 현재의 지식 수준으로 정량가능한 최소량인 50 ppb 이하인, 아질산 해중합으로 수득한 헤파린 분획에 관한 것이다, 상기 분획은 바람직하게는 저분자량의 헤파린이다.

제 1 도는 폐쇄형 장치를 나타내는 단면도이다.

제 2 도는 본 발명의 분석방법에 사용된 장치이다.

도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

<제 1 도>

1: UV램프 2: 석영 외피

3: 순환액 외피 4: 주입구

5: 출구

<제 2 도>

1 : 플라스크 2: 냉각기

3: 기포기 4 및 5: 냉각 트랩

6: 화학발광 검출기 7: 적분기/기록기

유익한 양태에 따라, 본 발명은 아질산 해중합으로 수득한 정제 저분자량의 헤파린, 즉 바람직하게는 돼지 장 점막 또는 소 폐 유래의 천연 헤파린 또는 그 외의 각종 동물 조직 또는 기관으로부터 추출한 천연 헤파린을 아질산 해중합하여 수득한, 제약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는 나트륨 또는 칼슘염의 형태인 해중합된 헤파린에 관한 것으로서, 하기인 것을 특징으로 하는 해중합된 헤파린에 관한 것이다:

- 평균 분자량은 8,000Da 미만이고,

- 모든 구성 성분의 60% 이상의 분자량은 8,000Da 미만이고,

- 항Xa 인자 활성은 60 IU/mg 이상이고;

- 항Xa 인자/항IIa 인자 활성비는 1.5 이상이고;

- 총니트로소 화합물의 함량은 500 ppb 이하, 유익하게는 150 ppb 이하, 바람직하게는 100 ppb 이하, 더욱 더 바람직하게는 50 ppb 이하이다.

항Xa 인자 활성 및 항Xa 인자/항IIa 인자 활성비는 저분자량의 헤파린의 국제 표준을 참고로 하여 측정된다 (참고: WHO 1-85/600).

상기 평균 분자량은 유럽 약전에 제출된 전공 논문 (상기 참고문헌 참조) 에 준하여 측정된다.

본 명세서에서, 용어 "총니트로소 화합물을 함유하지 않는"은, 아질산 해중합에 의해 수득되었으며, 총니트로소 화합물을 500 ppb 이하, 유익하게는 150 ppb 이하, 특히 100 ppb 이하, 바람직하게는 50 ppb 이하 함유하는 헤파린 분획, 즉 저분자량의 헤파린을 한정하기 위해 사용된다. 용어 "구성 성분"은 저분자량의 헤파린을 구성하는 분자 세트를 지칭하는데 사용된다.

본 발명의 주제인, 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 저분자량의 헤파린은, 그의 구성 성분 대부분이 비환원 말단상에 2-0-술포-α-L-이도피라노수론 구조및 환원 말단상에 6-0-술포-2,5-안히드로-D-만니톨 구조를 가지며, 황산화도가 천연 유래 미분획화 헤파린의 황산화도와 실질적으로 다르지 않다. 상기 황산화도는 2~2.5, 바람직하게는 2.0∼2.3 이다.

본 발명에 따른 유익한 저분자량의 헤파린은 분자량 분포가 다양하며, 그의 구성 성분의 90% 의 분자량은 2,000Da∼10,000Da 의 범위, 바람직하게는 2,000Da∼9,000Da 의 범위, 유익하게는 2,000Da∼8,000Da 의 범위이다. 또한, 상기 헤파린의 주된 분자량은 3,000Da∼6,000Da, 바람직하게는 4,000Da∼5,000Da 이다.

그 외의 바람직한 본 발명의 저분자량의 헤파린의 주된 분자량은 1,700Da∼3,300Da 의 범위이며, 모든 구성 성분의 90% 의 분자량은 1,000Da∼8,000Da 의 범위이다.

용어 "주된 분자량" 은 λ= 205 nm 에서 UV 검출기를 사용하여 배제 크로마토그래피에 의해 수득된 크로마토그래피 프로파일의 피크에 상응하는 헤파린의 구성 성분의 분자량을 지칭하기 위해 사용된다.

돼지 장 점막 유래의 천연 헤파린을 아질산 해중합하여 수득한 해중합된 헤파린의 나트륨 염으로서 정의되는 하기의 정제 CY 222 는 본 발명에 따른 바람직한 헤파린 분획을 나타낸다:

- 주된 분자량은 1,700Da∼3,300Da 의 범위이고,

- 모든 구성 성분의 90% 의 분자량은 1,000Da∼8,000Da 의 범위이며,

- 구성 성분의 대부분의 비환원 말단에 2-0-술포 -α- L-이도피라노수론 구조를 가지며 환원 말단에 6-0-술포-2,5-안히드로-D-만니톨 구조를 가지고,

- 황산화도는 약 2.1 이고,

- 항Xa 인자 활성은 60∼80 IU/mg 이고,

- 항IIa 인자 활성은 25 IU/mg 이하, 더 구체적으로는 10∼15 IU/mg 이며,

- 총니트로소 화합물의 함량은 100 ppb 이하 (제품 1 mg 당 1 x 10^-7mg 의 니트로소 화합물), 바람직하게는 50 ppb 이하 (제품 1 mg 당 5 x 10^-8mg 의 니트로소 화합물) 이다.

총니트로소 화합물을 함유하지 않는 본 발명의 헤파린 분획 (저분자량의 헤파린) 은 본 발명의 또 다른 양태에 따라 제조된다.

따라서, 본 발명은 또한 아질산 해중합으로 수득한 헤파린 분획의 수용액에 UV 조사를 수행함을 특징으로 하는, 총니트로소 화합물을 500 ppb 이하로 함유하는 헤파린 분획의 제조방법에 관한 것이다.

출발 물질로는, 아질산 해중합으로 수득한 헤파린 분획을 사용할 수 있다. 상기와 같은 출발 물질은 통상적으로 총니트로소 화합물의 함량이 1,000∼20,000 ppb 이다.

총니트로소 화합물의 정량은, 문헌 [Analyst, September 1989, 114, pp. 1103∼1108] 및 [Analyst, July 1987, 112, pp. 945∼949] 에 기재된 비. 피그나텔리 등 (B. Pignatelli et al) 의 방법에 의해 수행되며, 이는 헤파린 및 그의 분획, 바람직하게는 저분자량의 헤파린에 적합하다.

본 발명의 방법은, 아질산 해중합 단계 후 및 순수 제약학적 등급 제품의 분리 전에, 물에 용해된 제약학적 등급 저분자량의 헤파린 상에서 또는 공업적 제조시 수행될 수 있다. 제약학적 등급 저분자량의 헤파린을 사용하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 방법을 위한 출발 물질로는 아질산 해중합으로 수득한 저분자량의 헤파린을 사용할 수 있다. 방법의 최대 효율을 수득하기 위해서는, 현탁미세 입자를 함유하지 않는 해중합된 헤파린 용액을 사용하는 것이 유익하다. 상기 미세입자의 존재는 해중합된 헤파린의 불량한 용해도 또는 각종 불순물에 기인하거나, 또는 해중합 또는 정제시 사용된 시료의 잔류물에 기인할 수 있다. 따라서, 각종 해중합된 헤파린 용액에 선행 여과를 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 니트로소 화합물을 간단하고 신속 및 안전하게 제거할 수 있으므로 매우 효율적이고 응용적이다. 또한, 본 발명의 방법은 헤파린 분획의 구조의 변형을 야기하지 않으며, 그의 생물학적 특성 및 물리화학적 특성은 엄격하게 동일하게 유지시킨다.

본 발명의 방법은 아질산 해중합으로 수득한 헤파린 분획의 5∼15% m/v 수용액, 바람직하게는 정제되는 저분자량의 헤파린의 5∼15% m/v 수용액을, 5∼50℃ 의 온도, 유익하게는 15∼35℃, 바람직하게는 실온에서 180∼350 nm, 바람직하게는 254 nm 의 파장으로 UV 조사계하에 노출시킴으로써 수행될 수 있다.

용액의 pH 는 약산성 또는 약염기성이며, 특히 3∼8, 바람직하게는 5∼8 이다.

조사 시간은 사용된 조사계, 조사력, 헤파린 분획에 존재하는 제거되는 총니트로소 화합물의 양에 따라 달라진다. 비록 통상적으로는 정제가 9∼15 분 후에 실질적으로 완료되기는 하지만, 조사 시간은 대략 2∼30 분이다.

UV 조사계로는, 헤파린 분획 용액이 UV 조사원 주위를 순환할 수 있도록 하는 정적계 또는 동적계 모두를 고려할 수 있다. 동적계가 바람직하다. 후자의 경우, UV 조사원을 실린더형 튜브 ("폐쇄" 형 장치) 또는 도관 ("개방" 형 장치)과 결합시킬 수 있다. "폐쇄" 형 장치로서 JR1-50 (KATADYN) UV 멸균기 또는 그외의 동등한 장치를 사용할 수 있다.

제 1 도는 "폐쇄" 형 장치의 단면을 나타낸다. 상기 장치는 UV 램프 (1) 및 그 주위에 고정된 석영 외피 (2) 로 구성된다. 저분자량의 헤파린을 함유하는 용액은 석영 상자로 보호된 UV 램프 주위를 순환한다(순환액 외피 (3)). 이들은 UV 램프의 한 말단에 위치한 주입구 (4) 를 통해 도입되며, 출구 (5) 는 UV 램프의 다른쪽 말단에 위치한다.

동적계를 사용할 경우, UV 조사원 주위를 순환하는 헤파린 분획 용액의 유속은 니트로소 화합물을 제거하는데 필요한 조사 시간을 수득하기 위해서 적절히 조절되어야 한다. 관련될 수 있는 다른 변수는 순환액 외피의 직경, UV 조사원의 크기 및/또는 세기, 상기 수용액의 헤파린 분획 농도 및 상기 분획에 함유된 제거되는 니트로소 화합물의 양이다.

상기와 같이 수득된 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 헤파린 분획, 바람직하게는 저분자량의 헤파린은 통상적인 방법을 이용하여 회수할 수 있다.

출발 물질로서 이미 제약학적 등급인 저분자량의 헤파린을 사용할 경우, 이는 제품을 물에 용해시키고, 용액의 pH 를 3∼8, 바람직하게는 5∼8 로 조정하고, 상기 용액에 본 발명의 방법을 수행하기에 충분하다.

출발 물질로서, 유익하게는 염 형태의 미분획화 천연 헤파린, 특히 바람직하게는 돼지 장 점막 유래 헤파린 나트륨을 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 본 발명의 방법은, 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 최종 정제 제품의 제조시 아질산 해중합 이후 1단계를 구성한다. 헤파린으로부터 출발하는 전체적인 방법은 본 발명의 추가의 주제를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따라, 본 발명은 아질산 해중합으로 총니트로소 화합물의 함량이 500 ppb 이하, 유익하게는 150 ppb 이하, 바람직하게는 100 ppb 이하, 더욱 더 바람직하게는 50 ppb 이하인 저분자량의 헤파린을 제조하는 방법에 있어서, 하기인 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

(a) pH 1∼5, 바람직하게는 1.5∼4 에서 염산의 존재하에 20∼50분 동안 5∼15% m/V 의 수중 미분획화 헤파린 나트륨 용액을, 도입된 헤파린 1 kg 당 아질산염 15∼69 g 의 비율로 알칼리 금속 아질산염, 바람직하게는 아질산 나트륨의 용액으로 처리하고, 상기와 같이 수득된 생성물에 헤파린 출발 물질 1 kg 당 수소화붕소나트륨 5∼20 g 을 사용하여 바람직하게는 알칼리성 매질 내에서 환원을 수행하고, 과량의 수소화 붕소 나트륨을 염산으로 제거하고, 필요에 따라 반응 매질을 중화하고 생성물을 에탄올로 침전시킨 다음, 상기와 같이 수득된 저분자량의 헤파린에 필요에 따라 1 회 이상의 알콜 분획화를 수행하고,

(b) 상기와 같이 수득된 용액에 UV 조사를 수행하고,

(c) 필요에 따라 크로마토그래피 정제를 수행하고, 정제되었으며 총니트로소화합물을 함유하지 않는 해중합된 헤파린 나트륨을 염화나트륨 및 에탄올로 침전시킴으로써 분리하고, 필요에 따라

(d) 나트륨 염을 그 외의 제약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는 칼슘염으로 변환시킨다.

바람직한 양태에 따라, 본 발명은 돼지 장 점막 유래의 천연 헤파린을 아질산 해중합하여 수득한 해중합된 헤파린의 나트륨 염으로서 정의되는 하기의 정제 CY 222 의 제조방법에 관한 것이며:

- 주된 분자량 범위는 1,700Da∼3,300Da 이고,

- 구성 성분 90%의 분자량 범위는 1,000Da∼8,000Da 이고,

- 구성 성분 대부분의 비환원 말단에 2-0-술포-α-L-이도피라노수론 구조를 갖고 환원 말단에 6-0-술포-2,5-안히드로-D-만니톨 구조를 가지며,

- 황산화도는 약 2.1 이고,

- 항Xa 인자 활성은 60∼80 IU/mg 이고,

- 항IIa 인자 활성은 25 IU/mg 이하이고,

- 니트로소 화합물의 함량은 100 ppb 이하, 바람직하게는 50 ppb 이하이다;

상기 방법은 하기 단계로 이루어짐을 특징으로 한다:

(a) pH 를 산성으로 유지시키고 음성 반응이 일어날 때까지 아질산 이온의 존재를 관측기록하면서, 천연 유래의 미분획화 헤파린 나트륨 수용액을 염산, 및 도입된 헤파린에 대해 3.5∼4 중량% 양의 알칼리 금속 아질산염으로 처리한 다음,혼합물을 알칼리성화하고, 생성물을 수소화붕소나트륨으로 환원시키고, 해중합 생성물을 중성 매질 내에서 에탄올로 침전시킴으로써 분리한 다음,

(b) 상기와 같이 수득된 생성물의 수용액을 254 nm 의 UV 조사계하에 pH 약 7 에서 통과시킨 다음, 상기와 같이 수득된 용액을 음이온 교환 컬럼의 상부에 도입하고, 컬럼을 물로 세척한 후 pH 약 7 에서 염화나트륨 및 에탄올로 침전시킴으로써 최종 생성물을 회수한다.

단계 (a) 에서, 알칼리 금속 아질산염으로는 상기 비율의 아질산나트륨을 사용한다.

바람직하게는 상기 방법의 단계 (b) 에서, UV 조사계에는 16W 램프가 장치되며, 254 nm 에서 UV 조사에의 노출 시간은 약 9∼15 분이다. 동적 UV 조사계가 바람직하며, 특히 "폐쇄" 형 장치가 바람직하다. 유익하게는, UV 조사가 수행되는 용액의 농도는 8∼12% m/V 이다.

또 다른 태양에 따라, 본 발명은 유형 성분으로서, 상술한 바와 같은, 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 정제 헤파린 분획, 바람직하게는 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 정제 저분자량의 헤파린을 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 헤파린 분획은 동결 건조물 형태이거나, 물과 같은 생물학적으로 허용가능한 멸균 용매 또는 생리학적 용액 중 피하 주사액용 용액, 앰풀, 유리병, 예비 충전된 주사기 또는 "편"형 자가 주사장치 내에 존재할 수 있다. 제약학적 투여 조성물의 각 단위는 항Xa 인자를 50∼50,000 IU 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 헤파린 분획은 단독으로, 또는 그 외의 유형 성분과 함께 혼합하여 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다. 또한, 이들은 비강내 또는 폐내 분무 요법에 의해 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 제약학적 조성물은 단위 제형에 대해 상기의 CY222 10∼5,000 mg를 유형 성분으로 함유한다.

상술한 바와 같이, 총니트로소 화합물의 정량은 문헌 [Analyst, September 1979, 114, pp. 1103∼1108] 및 [Analyst, July 1987, 112, pp 945∼949] 에 기재된 비. 피그나텔리 등 (B. Pignatelli et al) 의 방법에 의해 수행되며, 이는 헤파린 및 저분자량의 헤파린에 적합하다.

분석법

분석되는 제품은 바람직하게는 분말 형태이며, 따라서 용액 중에 존재하는 총니트로소 화합물을 정량할 경우에는 상기 용액의 냉동 건조를 먼저 수행한 다음, 냉동 건조된 시료를 분석한다.

1. 시약

헤파린 분획 100mg당 사용되는 시약은 하기와 같다;

- 20% m/V 술팜산으로 처리한 에틸 아세테이트 (1000 ml 의 에틸아세테이트중 술팜산 200g의 용액, 3 일간 교반하고 사용 전에 페이퍼로 여과한다),

- 아세트산 중 15% 브롬화수소산 (5 ml 의 30% 브롬화수소산을 함유하는 폴리에틸렌 마개의 작은 암베르 유리병을 아르곤 대기하에서 밀봉하여 암중 보관한다. 사용시에, 5 ml 의 순수한 아세트산을 첨가하고, 혼합물을 진탕하여 암중에서 작은 보관용기에 저장한다. 일련의 시험 분석당 하나의 유리병을 사용한다),

- 5% m/V 술팜산 처리 95% 포름아미드 (5% 의 정제수를 함유한 20 ml 의 포름아미드중 술팜산 1g용액)

2. 표준 용액 및 분석될 시료의 제조

N-니트로소디-n-프로필아민 (NDPA) 의 표준 용액

78.62 g 의 순수한 에탄올을 격막을 통해 1 g 의 N-니트로소디-n-프로필아민을 함유하는 시그마 이소팍 (ISOPAC) 병에 주입한다. 농도는 NDPA (3379 ppm 의 N-NO) 10,000 ppm 이다. 그리고 용액을 순수한 에탄올로 1/100 까지 희석시키고 작은 마개가 있는 유리병 내에 0.5 ml 분할량씩 분산시킨다. 농도는 NDPA 1000 ppm이다. 유리병은 4 ℃에서 어두운 곳에서 보관한다.

^*하위 표준 용액: 사용시에, 에탄을 중에 1/100 까지 희석하고, 처리된 포름이미드 중에 1/17 까지 희석을 한다. 농도는 NDPA 0.0588 ppm 이거나, N-NO 19.9 ppb 이다.

^*중위 표준 용액: 사용시에, 에탄을 중에 1/61 까지 희석하고, 처리된 포름 아미드 중에 1/11 까지 희석한다. 농도는 NDPA 0.149 ppm 이거나, N-NO 50.4 ppb 이다.

^*상위 표준 용액: 사용시에, 에탄올 중에 1/10 까지 희석을 하고, 처리된 포름아미드 중에 1/10 까지 희석을 한다. 농도는 NDPA 1 ppm 이거나, N-NO 338 ppb이다.

분석될 시료

헤파린 분획의 시료를 진공하 60 ℃ 에서 오산화인을 이응하여 12시간 동안 건조시킨다. 100 mg 의 헤파린 분획을 1 ml 의 처리된 포름아미드에 용해시키고 혼합물을 30분간 진탕기에서 진탕한다.

3. 사용되는 장치

사용되는 장치를 제2도에 나타낸다.

어셈블리

- 장치는 500 ml 의 파이렉스 등근바닥 플라스크 (1) 및 그 위에 놓인 -15℃까지 냉각되는 이중표면 냉각기 (2)로 이루어져 있다. 이 냉각기를 각각 30 ml 의 30% 수산화 나트륨을 함유하는 연속으로 장치된 세개의 기포기 (3) 에 연결한다. 상기 기포기를, 하나는-120 ℃ 에서 용융 에탄올로 제조되고 (4), 나머지 하나는-160 ℃ 에서 용융 이소펜탄으로 제조된 (5) 연속적으로 장치된 두 개의 냉각트랩에 연결한다. 이러한 트랩을 최종적으로 화학발광 검출기 (chemiluminescence detector: TEA) 모델 610(Thermedics Detection Inc.) 또는 그와 동등한 장치(6)에 연결한다. 검출기를 적분기/기록기 (7) 에 연결한다.

이 플라스크의 한쪽에는 아르곤 기류가 유입되는 카뉼라가 도입될 수 있도록 하는 관통마개 (8) 이 장치되어 있다. 다른 한쪽에는, 마개가 있는 스크류 조인트에 의해 GC 형 격막 (9) 을 부착할 수 있으며 이를 통하여 샘플이 주입된다. 아르곤 기류 및 TEA 의 진공펌프에 발생한 진공에 의해 가스를 TEA 쪽으로 끌어들인다.

4. 작동 프로토콜

4.1 검출기의 세팅

TEA 를 제조업자의 지시대로 세팅하여 최대 감도와 재생성을 수득한다.

시료분석 한시간 전에, 2 바아의 압력에서 산소를 공급하고, 유속을 TEA 610(Thermedics Detection Inc.) 의 유속미터기상의 0.02 로 조절한다.

4.2 수산화 나트륨 트랩의 제조

30 ml 의 30% 수산화 나트륨으로 각 트랩을 채운다.

4.3 냉각 트랩의 제조

- 120 ℃ 트랩: 액체 질소를 교반하에 250 ml 의 에탄올을 함유하는 듀워(Dewar) 병에 목재 스파출라를 이용하여 페이스트상이 생길 때까지 천천히 붓는다.

- 160 ℃ 트랩: 액체 질소를 교반하에 250 ml 의 이소펜탄을 함유하는 듀워병에 목재 스파출라를 이용하여 페이스트 상이 생길때 까지 천천히 붓는다.

두 개의 유리 트랩들을 각각의 듀워병에 위치시키고 연속적으로 회로에 연결한다.

4.4 플라스크-냉각기 어셈블리의 탈수반응

50 ml 의 에틸 아세테이트를 아르곤하에서 TEA 에 연결시키지 않고 1시간 동안 환류한다.

4.5 반응 및 분석

30 ml 의 처리된 에틸 아세테이트를 격막이 장치된, 세척하여 건조시킨 새둥근바닥 플라스크에 주입하고, 플라스크를 냉각기 아래에 설치하고 (저온유지장치는 -15℃에서 2시간 전에 미리 가동시켜야 한다), 플라스크 가열기를 자리에 놓고 플라스크를 가열한다 (위치 4). 아르곤 카뉼라를 연결하여 유속을 0.1ℓ /min 로 조절하고 누출로부터의 전체 회로의 자유도를 체크한다. TEA 로의 연결로만을 개방하여 과다한 압력을 피한다. 에틸아세테이트를 환류중일 경우 진공을 매우 서서히 가하고 동시에 TEA 로의 도입은 경색된다. 진공은 회로를 통하여 보급되고 계가 평형을 이룰 때, 2∼4 mmHg 에 도달한다. 영점은 TEA상에서 적분기/기록기의 전체 크기의 10%에 세팅한다.

적막을 통하여, 0.5 ml 의 정제수, 2 ml 의 희석 수소화브름산을 연속적으로 주입한 후에, 2 ml 의 희석 수소화브롬산을 다시 주입하고; 각 주입 사이에 인디케이터가 적분기/기록기의 베이스라인에 복귀했는지를 확인한다. 시약을 플라스크에 주입하였을 때에는 인디케이터를 베이스라인에 복귀시키고, 50 ㎕ 의 표준 용액 또는 시약을 주입한다. 주입 사이에, 인디케이터를 베이스라인으로 복귀시킨다. 이 분석에서, 5 샘플을 2 표준 용액 사이에 넣고, 완전한 조작이 60 분 이상 걸리지 않는 방법으로 이 과정을 수행한다.

4.6 총니트로소 화합물의 양 측정

ppb 단위의 N-NO 의 양은 하기식으로 계산한다:

N=NO (ppb) =

(샘플 면적 ×Cs 0.05 ×44 ×1000) ÷(표준 용액면적 ×0.05 ×0.1 ×130.2)

(식 중,

- Cs: NDPA 의 ppm 으로 표시된 표준 용액의 농도 (0.0588 또는 0.149 또는 1 ppm)

- 0.05: (분자) 표준 용액의 시험 견본 (ml)

- 44: N-NO 의 분자량

- 1.000: ppm 의 ppb 로의 전환

- 0.05: (분모) 샘플의 시험 견본 (ml)

- 0.1: 그램단위 시약의 시험 견본

- 130.2: NDPA 의 분자량)

하기의 실시예는 본 발명을 예증한다.

실시예 1

총니트로소 유도체 함량이 100ppb미만인 정제 나드로파린 칼슘의 제조

단계 A: 해중합화 및 에탄올 분획화

반응기예, 20 kg 의 돼지 장 점막 유래 헤파린 나트륨을 정제수에 용해하여 10.3% (m/V) 부근의 최종 농도를 수득한다. 용액의 pH 는 진한 염산으로 2.5 로 조절한다.

진한 염산을 이용하여 pH를 2.5로 유지하면서 아질산 나트륨 572g을 반응기에 도입한다.

녹말/요오드화 칼륨 시험페이퍼를 사용하여 해중합화 반응을 측정기록한다. 시험 결과가 음성일 때 반응을 완결한다. 반응용액의 pH 를 진한 수산화나트륨을사용하여 10 으로 조절하고, 200 g 의 수소화붕소 나트륨을 첨가한다. 혼합물을 15시간 동안 교반하고, pH 를 진한 염산을 사용하여 4 및 3.5 로 조절함으로써 과량의 수소화붕소 나트륨을 파괴한다. 그리고 진한 수산화 나트륨을 첨가하여 pH를 7 로 조절한다. 이어서 수용액 1 부피당 2 부피의 에탄올을 첨가함으로써 생성물을 침전시킨다. 침전물을 가라앉히고 수성-알콜 상청액을 제거한다. 침전물을 400 ml 의 정제수에 용해시킨다. 염화나트륨을 이 용액에 첨가하여 20,000 μS/cm 부근의 전도도가 수득될 때까지 염화나트륨을 이 용액에 첨가한다. 그리고 진한염산으로 pH를 4 부근의 값으로 조절하고 1 부피의 무수 에탄올을 이 용액에 교반하면서 첨가한다. 생성물을 약 60시간 동안 가라앉히고 수성-알콜 상청액을 제거한다. 상기와 같이 나드로파린은 나트륨 염의 형태로 수득된다.

그리고 침전을 정제수에 용해시켜 초기에 주입된 헤파린 나트륨의 양을 기준으로 약 18% m/V 농도의 용액을 수득하고, 진한 수산화 나트륨을 사용하여 pH 를 7 로 조절한다. 그리고 용액을 다공률 0.2 ㎛ 의 필터 카트리지를 장착한 계상에서 여과한다. 나드로파린 나트륨을 함유하는 여과 용액으로부터 단계 B 에 기재된 방법 (UV 조사 처리) 으로 처리되지 않는 샘플을 수거한다. 이 샘플을 "대조" 라고 명한다.

단계 B: UV 조사 처리

UV 조사 처리를 위해서, 유효부피 750ml의 카타딘(Katadyn)형 JRI-50 튜브를 사용한다. 사용된 파장은 254 nm이다. 정제수를 이용한 연동 펌프에 의해 주행유속을 미리 적절하게 조절하여(4,800 ml/시간), 재순환시키지 않고 주행하였을 때의총 UV 노출 시간은 약 9분이었다. 이어서, 처리될 나드로파린 나트륨 용액을 도입하고, 처리된 생성물이 카타딘 JR1-50 튜브의 출구에 고정된 탱크내에 완전히 회수될 때까지 회로를 정제수로 세척한다.

단계 C: 크로마토그래피에 의한 정제 및 칼슘염으로의 변환

선행단계에서 수득된 나드로파린 용액을 음이온 교환 컬럼(0.5 ℓ/kg의 헤파린 도입)상에서 정제한다. 수거한 유출액의 전도도를 염화 나트륨으로 10,000∼20,000 uS/cm로 조절한 다음, 에탄올 1.5 부피를 첨가한다. 약 41시간 동안 생성물을 가라앉히고 상청액을 제거한다.

침전을 정제수에 용해시키고(도입된 헤파린 나트륨의 양을 기준으로 한 C=18% m/V), 염화칼슘 6수화물(도입된 헤파린 나트륨 9.63 g/g)을 첨가한다. 이어서, 에탄올 1.5 부피를 첨가함으로써 에탄올 침전을 수행한다. 염화칼슘 6수화물을 이용한 염화단계 및 에탄올 침전에 의한 정제단계를 반복한다. 수득된 침전을 60℃이하의 온도에서 건조시킨다.

상기와 같이 배치 1을 수득한다.

단계 A에서 수득된 "대조" 배치도 또한 상기 단계 C에 기재된 방법에 준하여 처리하고, 나드로파린 칼슘의 "대조" 배치를 분리한다.

배치 1의 샘플 및 나드로파린 칼슘의 "대조" 배치상에서 물리화학적 분석 뿐만 아니라 그들의 생물학적 활성을 측정하기 위한 분석을 수행한다.

하기의 표1 은 물리화학적 시험의 결과를 나타내고, 표2는 생물학적 시험의 결과를 나타낸다.

[표1]

[표2]

표1 및 2 에 나타난 결과는 UV 처리가 나드로파린의 어떠한 변질도 유발하지 않음을 나타낸다. 사실상, 생성물의 크로마토그래프 프로파일, 이종 불순물의 함량, 항Xa 인자 활성 및 항-Ⅱa 인자 활성과 같은 배치 1 의 각종 물리화학적 및 생물학적 특성은 하나의 예외 말고는 UV 비조사 처리된 대조의 특성과 동일하다. 비처리 대조내 총니트로소 화합물의 함량은 UV조사 처리를 수행한 배치 1 의 총니트로소 화합물의 함량의 약 60 배 정도 높다.

또한, 전자 상자기성 공명 분석 결과에 의해 UV 조사 처리가 자유 라디칼의 방출을 야기하지 않음이 확인된다.

실시예 2

50 ppb 이하의 총니트로소 화합물 함량을 갖는 CY 222 나트륨 염의 제조

단계 A: 해중합

반응기에, 250 g 의 돼지 장 점막 유래 헤파린 나트륨을 정제수에 용해하여 10.3% (m/V) 부근의 최종 농도를 수득한다. 용액의 pH 는 진한 염산으로 2.5 로 조절한다. pH를 2.5로 유지하면서 아질산 나트륨 9.49g 을 반응기에 도입한다. 녹말/요오드화 칼륨 시험페이퍼를 사용하여 해중합화 반응을 측정기록한다. 시험 결과가 음성일 때, 반응을 완결한다. 반응용액의 pH 를 진한 수산화나트륨을 사용하여 10 내지 10.5 사이로 조절하고, 2.5 g 의 수소화붕소 나트륨을 첨가한다. 혼합물을 15시간 동안 교반하고, pH 를 진한 염산을 사용하여 3.5 및 4 로 조절함으로써 과량의 수소화붕소를 제거한다. 그리고 진한 수산화 나트륨을 첨가하여 pH를 7 로 조절한다. 이어서 수용액 1 부피당 2 부피의 에탄올을 첨가함으로써 생성물을 침전시킨다. 침전물을 가라앉히고 상청액을 제거한다. 이렇게하여 CY 222 를 나트륨 염의 형태로 수득한다. 이렇게 하여 수득된 제품은 총니트로소 화합물을 3,000 ppb∼10,000 ppb 함유하고 있다 (3 회 제조의 결과).

단계 B: UV 조사 처리

선행 단계에서의 침전물을 정제수에 용해시켜, 주입된 헤파린 나트륨의 양을 기준으로 약 10% m/V 농도의 최종 용액을 수득하고, 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 pH 를 7 로 조절한다. 펌프의 출력을 조정한 뒤에, 이렇게 수득한 용액을 254 nm UV 조사계 (16 W 램프가 장치된 카타딘 JR1-50 시스템) 하에 통과시킨다. UV 조사 노출 시간은 9∼15 분이다.

단계 C: 크로마토그래피에 의한 정제 및 최종 침전

UV 조사 처리후 수득된 용액을, 주입된 헤파린 나트륨의 1 kg 당 음이온 교환수지 2 리터 이상을 함유하는 크로마토그래피 컬럼상에서 정제한다. 수거된 용출액의 전도도를 염화 나트륨으로 30∼35 mS/cm로 조절한 다음, 염산을 사용하여 이 pH 를 7 로 조절한다. 그리고 수용액 1 부피당 2 부피의 에탄올을 첨가한다. 침전물을 가라앉히고 상청액을 제거한다. 침전을 정제수에 용해시켜 처음에 도입된 헤파린 나트륨의 양을 기준으로 20% m/V 의 농도에서 최종 용액을 수득하고, 용액의 전도도를 염화나트륨을 사용하여 30∼35 mS/cm 로 조절하고 진한 염산 또는 진한 수산화나트륨을 사용하여 pH 를 7 과 7.5 사이로 조절한다. 그리고 용액을 2 부피의 무수 에탄올로 침전시키고 침전을 정착시킨다. 침전을 수거하고, 에탄올로 세척하고 60℃ 이하의 온도에서 건조시킨다. 돼지 장 점막 유래 헤파린의 아질산 해중합으로 수득한 해중합된 헤파린의 나트륨 염으로서 정의된 순수 CY 222 는 이렇게 수득하며, 제품은 ;

- 주된 분자량 범위가 1,700Da∼3,300Da 이고 구성 성분의 90% 의 분자량 범인가 1,000Da∼8,000Da 이며,

- 성분 대다수의 비환원 말단에 2-0-술포-α-L-이도피라노수론 구조및 환원말단에 6-0-술포-2,5-안히드로-D-만니톨 구조를 갖고,

- 황산화도가 약 2.1 이고,

- 항Xa 인자 활성이 60∼80 IU/mg 이고,

- 항IIa 인자 활성이 25 IU/ms 이하이고 구체적으로는 10∼15 IU/ms 이며,

- 니트로소 화합물의 함량이 50 ppb 미만이다.

본 발명에 있어서, 실제적으로 니트로소 화합물을 함유하지 않으며 아질산 해중합 반응으로 수득한 헤파린 분획 및 이를 함유하는 의약품을 얻을 수 있다.

Claims

돼지 장 점막 또는 소 폐 유래의 천연 헤파린 또는 그 외의 각종 동물 조직 또는 기관에서 추출한 천연 헤파린을 아질산 해중합하여 수득한 저분자량의 헤파린으로서, 총니트로소 화합물의 함량이 500 ppb이하이고 하기 특성을 갖는, 제약학적으로 허용가능한 염의 형태인 저분자량의 헤파린:

- 평균 분자량은 8,000Da 미만이고,

- 모든 구성 성분의 60% 이상의 평균 분자량은 8,000Da 미만이고,

- 항X2 인자 활성은 60 IU/mg 이상이고,

- 항Xa 인자/항IIa 인자 활성비는 1.5 이상이다.
제 1 항에 있어서, 나트륨염 또는 칼슘염의 형태인 것을 특징으로 하는 헤파린 분획.
돼지 장 점막 유래의 천연 헤파린을 아질산 해중합하여 수득한, 하기의 해중합된 헤파린의 나트륨 염:

- 주된 분자량은 1,700Da∼3,300Da 의 범위이고,

- 모든 구성 성분의 90% 의 분자량은 1,000Da∼8,000Da 의 범위이며,

- 구성 성분의 대부분의 비환원 말단에 2-0-술포 -α- L-이도피라노수론 구조를 가지며 환원 말단에 6-0-술포-2,5-안히드로-D-만니톨 구조를 가지고,

- 황산화도는 약 2.1 이고,

- 항Xa 인자 활성은 60∼80 IU/mg 이고,

- 항IIa 인자 활성은 25 IU/mg 이하이고,

- 총니트로소 화합물의 함량은 100 ppb 이하이다.
제 3 항에 있어서, 총니트로소 화합물의 함량이 50 ppb 이하임을 특징으로 하는 해중합된 헤파린의 나트륨 염.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 헤파린 분획의 제조방법에 있어서, 아질산 해중합으로 수득한 헤파린 분획의 수용액에 UV를 조사함을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 아질산 해중합에 의해 수득되고, pH 가 3~8 이며, 농도 5∼15% m/V 인 헤파린 분획 수용액을 5∼50℃ 의 온도 및 180∼350 nm 의 파장에서 UV 조사계하에 노출시킴을 특징으로 하는 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 노출이 254 nm, 15~35℃ 의 온도 및 pH 5∼8 에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 저분자량의 헤파린의 제조방법에 있어서, 하기로 이루어진 방법:

(a) pH 1∼5 에서 염산의 존재하에 20∼50 분 동안 5∼15% m/V 의 수중 미분획화 헤파린 나트륨 용액을, 도입된 헤파린 1 kg 당 아질산염 15∼69 g 의 비율로 아질산 나트륨의 용액으로 처리하고, 상기와 같이 수득된 생성물에 헤파린 출발 물질 1 kg 당 수소화붕소 나트륨 5∼20 g 을 사용하여 환원을 수행하고, 과량의 수소화 붕소 나트륨을 염산으로 제거하고, 이때 반응 매질을 중화시킬 수 있으며, 생성물을 에탄올로 침전시킨 다음, 상기와 같이 수득된 저분자량의 헤파린에 1 회 이상의 알콜 분획화를 수행할 수 있고,

(b) 상기와 같이 수득된 용액에 UV 조사를 수행하고,

(c) 크로마토그래피 정제를 수행할 수 있고, 정제되었으며 총니트로소 화합물을 함유하지 않는 해중합된 헤파린 나트륨을 염화나트륨 및 에탄올로 침전시킴으로써 분리하고,

(d) 상기 나트륨 염을 그 외의 제약학적으로 허용가능한 염으로 변환시킬 수 있다.
제 4 항에 따른 해중합된 헤파린 나트륨 염의 제조 방법에 있어서, 하기로 이루어진 방법:

(a) pH 를 산성으로 유지시키고, 음성 반응이 일어날 때까지 아질산 이온의 존재를 관측기록하면서, 미분획화 헤파린 나트륨 수용액을 염산, 및 도입된 헤파린에 대해 3.5∼4 중량% 양의 알칼리 금속 아질산염으로 처리한 다음, 혼합물을 알칼리성화하고, 생성물을 수소화붕소나트륨으로 환원시키고, 해중합 생성물을 중성 매질 내에서 에탄올로 침전시킴으로써 분리한 다음,

(b) 상기와 같이 수득된 생성물의 수용액을 254 nm 의 UV 조사계하에 pH 약 7 에서 통과시킨 다음, 상기와 같이 수득된 용액을 음이온 교환 컬럼의 상부에 도입하고, 컬럼을 물로 세척한 후, pH 약 7 에서 염화나트륨 및 에탄올로 침전시킴으로써 최종 생성물을 회수한다.
제 9 항에 있어서, 단계 (b) 에서 254 nm 의 UV 조사계가 16 W UV 램프를 이용하여 9∼15 분간 사용되며, UV 조사를 수행한 생성물 수용액의 농도가 8∼12% m/V 임을 특징으로 하는 제조방법.
항혈전 활성을 갖는 제약학적 조성물로서, 유형 성분으로서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 저분자량의 헤파린을 함유하는 제약학적 조성물.
항혈전 활성을 갖는 제약학적 조성물로서, 유형 성분으로서 단위 제형에 대해 제 4 항의 생성물 10~5,000 mg 을 함유하는 제약학적 조성물.
제 8 항에 있어서, (a)의 염산의 pH 가 1.5∼4 인 방법.
제 8 항에 있어서, 단계(a)의 환원이 알칼리성 매질내에서 수행되는 방법.