JPH02103203A - ヒアルロン酸の精製法 - Google Patents
ヒアルロン酸の精製法Info
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- JPH02103203A JPH02103203A JP25498588A JP25498588A JPH02103203A JP H02103203 A JPH02103203 A JP H02103203A JP 25498588 A JP25498588 A JP 25498588A JP 25498588 A JP25498588 A JP 25498588A JP H02103203 A JPH02103203 A JP H02103203A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発ＢＡはヒアルロン酸含有液からヒアルロン酸を分離
・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿
剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用
途が開かれてきている。
・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿
剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用
途が開かれてきている。
従来、ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、工業規模で
は、ニワトリのトサカ等からの抽出法により製造されて
いるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入したシ
、組織内に含まれるヒアルロニダーゼなどによって低分
子量化されやすい、従って高分子で高純度に精製された
ものは、コスト高になる。
は、ニワトリのトサカ等からの抽出法により製造されて
いるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入したシ
、組織内に含まれるヒアルロニダーゼなどによって低分
子量化されやすい、従って高分子で高純度に精製された
ものは、コスト高になる。
これら問題点ｔ−解決するため、近年醗酵法にょシヒフ
ルＨ７酸を製造することが行なわれている。
ルＨ７酸を製造することが行なわれている。
ヒアルロン酸がストレプトコツカス属のある群のバクテ
リアにより生産されることは、古くから知られ、多くの
報告がある（ゾエービー ウールコック（Ｊ、Ｂ、 Ｗ
ｏｏｌｃｏｃｋ ） 、シャ〜ナルーオグーゾエネラル
マイクロパイオロゾイ ８５ ３７２−５７５ １９７
６）。
リアにより生産されることは、古くから知られ、多くの
報告がある（ゾエービー ウールコック（Ｊ、Ｂ、 Ｗ
ｏｏｌｃｏｃｋ ） 、シャ〜ナルーオグーゾエネラル
マイクロパイオロゾイ ８５ ３７２−５７５ １９７
６）。
醗酵法によって製造されるヒアルロンｃＲは、抽出法に
比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製
品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値
は大きい。
比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製
品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値
は大きい。
しかしながら、醗酵液には、高分子化金物が不純物とし
て存在し、それらを分Ｗ／ｉ除去してＩ！６純度の製品
を得る方法が検討されてきた。
て存在し、それらを分Ｗ／ｉ除去してＩ！６純度の製品
を得る方法が検討されてきた。
例えば、本発明者らも先にアルミナを用いて発熱性物質
、タンパク質等を除去するヒアルロン酸の精製法を提案
した（％願昭６３−１４４７２８号明細誉）。
、タンパク質等を除去するヒアルロン酸の精製法を提案
した（％願昭６３−１４４７２８号明細誉）。
このアルミナを用いた方法も含め従来のｍ展処理方法嬬
、いずれもζアルロン酸を水溶液の状態で精製処理を行
なう方法であった。このような方法を用いた場合、原料
の違い等によシ発熱性物質、タンパク質等が十分に除去
されず、安定したｉｉ＆：云効果が得られない場合が多
（、実用上問題を残しており、医薬品として使用できる
高品質な製品を再現性よく、安定して得る方法の開発が
待たれていた。
、いずれもζアルロン酸を水溶液の状態で精製処理を行
なう方法であった。このような方法を用いた場合、原料
の違い等によシ発熱性物質、タンパク質等が十分に除去
されず、安定したｉｉ＆：云効果が得られない場合が多
（、実用上問題を残しており、医薬品として使用できる
高品質な製品を再現性よく、安定して得る方法の開発が
待たれていた。
本発明は簡便かつ高品質なヒアルロンｇＩＩを再棉性よ
く分離・積装する方＠を提供することを目的としている
。
く分離・積装する方＠を提供することを目的としている
。
タンパク質、核酸、金属等の不純物を効率よく、しかも
再現性よく分ｌＩｉ除去し、高純度、かつ構製過程で低
分子化が起こりにくい精製方法について、鋭意検討した
結果、ヒアルロン酸を、精製する際に、その一部又は全
工程を水と混和する有機溶剤を用いて行なうことで、安
定して発熱性物質等の不純物を除去し、その目的が達せ
られる事を見出し、本発明を完成するに到った。
再現性よく分ｌＩｉ除去し、高純度、かつ構製過程で低
分子化が起こりにくい精製方法について、鋭意検討した
結果、ヒアルロン酸を、精製する際に、その一部又は全
工程を水と混和する有機溶剤を用いて行なうことで、安
定して発熱性物質等の不純物を除去し、その目的が達せ
られる事を見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、ヒアルロン酸含有液を水と混和する
有機溶剤の水溶液で処理することを特徴とするヒアルロ
ン酸の＠＃！法である。
有機溶剤の水溶液で処理することを特徴とするヒアルロ
ン酸の＠＃！法である。
本発明で用いられる有４ＩＡ溶剤は、メタノール、エタ
ノール、プロパツールといったアルコール類、アセトン
といり九本と混和する有機溶剤ならば特に種類を問わな
いが、グレードとしては試薬グレードのものを使用する
ことが好ましい。本発明は、有機溶剤をとアルロン戚含
有水溶液に加えたり、ま九、所定濃度の古本有機溶剤に
ヒアルロン［’に溶解して精製処理を行なうことｔ−特
徴とする。この時の加える有機溶剤の濃度は、ヒアルロ
ン酸が析出しない程度の濃度までの広い濃度範囲で使用
できる。
ノール、プロパツールといったアルコール類、アセトン
といり九本と混和する有機溶剤ならば特に種類を問わな
いが、グレードとしては試薬グレードのものを使用する
ことが好ましい。本発明は、有機溶剤をとアルロン戚含
有水溶液に加えたり、ま九、所定濃度の古本有機溶剤に
ヒアルロン［’に溶解して精製処理を行なうことｔ−特
徴とする。この時の加える有機溶剤の濃度は、ヒアルロ
ン酸が析出しない程度の濃度までの広い濃度範囲で使用
できる。
しかしながら、最も安定した効果を得るには２０〜５〇
−程度の範囲が好ましい。
−程度の範囲が好ましい。
本発明で使用するヒアルロン酸含有液は動物組織から抽
出したものでも、又醗酵法で製造したものでも使用する
ことはできるが工業的に安価に、高品質な製品を安定に
製造するためには醗酵法で製造したものが望ましい。
出したものでも、又醗酵法で製造したものでも使用する
ことはできるが工業的に安価に、高品質な製品を安定に
製造するためには醗酵法で製造したものが望ましい。
醗酵法によるヒアルロン酸はストレプトコッカス属等の
バクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。
バクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。
醗酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレ
プトコツカス属等のヒアル党ン酸生産能を有する微生物
、また鉱、特開昭６３−１２５５９２号公報に記したス
トレプトコッカス・エキＩＦＭ−１００（倣工研菌寄第
９０２７号）のような高収率で安定にζアルクンｆＲｔ
生産する変異株が好まし一〇 そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物ヲクルコ
ース、シェークロース等の炭素源、ペゾトン、ポリペプ
トン、酵母エキス等の窒Ｘ源、ビタミン、無機塩等を用
いた培地中で好気的に培養して得られる培養液をヒアル
ロン酸が０．１〜５Ｉ／！濃度になるように希釈後、既
知の方法、例えは遠心分離による除菌、濾過による除菌
、凝集剤による除菌、カーボン、セライト等による除菌
などの方法で除菌した液を使用することが望ましい。
プトコツカス属等のヒアル党ン酸生産能を有する微生物
、また鉱、特開昭６３−１２５５９２号公報に記したス
トレプトコッカス・エキＩＦＭ−１００（倣工研菌寄第
９０２７号）のような高収率で安定にζアルクンｆＲｔ
生産する変異株が好まし一〇 そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物ヲクルコ
ース、シェークロース等の炭素源、ペゾトン、ポリペプ
トン、酵母エキス等の窒Ｘ源、ビタミン、無機塩等を用
いた培地中で好気的に培養して得られる培養液をヒアル
ロン酸が０．１〜５Ｉ／！濃度になるように希釈後、既
知の方法、例えは遠心分離による除菌、濾過による除菌
、凝集剤による除菌、カーボン、セライト等による除菌
などの方法で除菌した液を使用することが望ましい。
さらに望ましくは、透析処理による低分子化金物の除去
、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去、またヒアル
ロン酸含有液にアルコール、アセトン、ジオキサンなど
の水溶性有機溶剤を添加してヒアルロンＩ！を析出分ｌ
１１１ｉ後、再度０．１〜５．Ｆ／ｌ濃度にヒアルロン
酸を溶解して使用することである。
、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去、またヒアル
ロン酸含有液にアルコール、アセトン、ジオキサンなど
の水溶性有機溶剤を添加してヒアルロンＩ！を析出分ｌ
１１１ｉ後、再度０．１〜５．Ｆ／ｌ濃度にヒアルロン
酸を溶解して使用することである。
本発明における１ＩＩＩ裂処理方法としては、有機浴剤
含有液を用いて行なえるＷＩ製処理方法ならば何でも良
く限定されることはないが、アルミナや活性炭、７ａｊ
Ｊゾルを用いた処理方法では特に安定した効果が得られ
る。
含有液を用いて行なえるＷＩ製処理方法ならば何でも良
く限定されることはないが、アルミナや活性炭、７ａｊ
Ｊゾルを用いた処理方法では特に安定した効果が得られ
る。
ここで用いられるアルミナ、活性炭、フロリシルは、従
来の精１１１１Ｍ理法で用いられるもので、そのｌｉｄ
、形状等は特に限定されることはない。また地理の方法
としては、ヒアルロン酸含有液にこれらを粉状又は粒状
で添加攪拌するバッチ式と充填塔等に粒状又鉱成戯した
ものを充填後、ヒアルロン酸含有液を通液処理方法、ま
たその組合せや反復も可能であるが、バッチ式に比べて
、光槙塔方式の方が効果的である。またこの時の−は６
〜８が望ましく、ＧＶは０．１〜０．２が最も効果的で
ある。
来の精１１１１Ｍ理法で用いられるもので、そのｌｉｄ
、形状等は特に限定されることはない。また地理の方法
としては、ヒアルロン酸含有液にこれらを粉状又は粒状
で添加攪拌するバッチ式と充填塔等に粒状又鉱成戯した
ものを充填後、ヒアルロン酸含有液を通液処理方法、ま
たその組合せや反復も可能であるが、バッチ式に比べて
、光槙塔方式の方が効果的である。またこの時の−は６
〜８が望ましく、ＧＶは０．１〜０．２が最も効果的で
ある。
次に本発明の実施例を示す。
参考例（ブランク）
ストレプトコッカス・エクイＩＦＭ−１００（倣工研菌
寄第９０２７号）を用いて培養した培養液１５１’ｆｒ
Ｈ水で５０１に希釈しくヒフルロンＩＲ磯度１．１０．
＠／ノ）、遠心分離、ホローファイバー型限外ろ過を行
ない、菌体と培地成分を除いた。
寄第９０２７号）を用いて培養した培養液１５１’ｆｒ
Ｈ水で５０１に希釈しくヒフルロンＩＲ磯度１．１０．
＠／ノ）、遠心分離、ホローファイバー型限外ろ過を行
ない、菌体と培地成分を除いた。
このヒアルロン酸含有液５００ｄに食塩１５．Ｆを溶解
、−７に胸Ｍ５後、エタノール７５０Ｍで析出、エタノ
ール１００ｄで洗浄を行い、４０℃で真空乾燥し、０．
４９．９のヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を
表１に示した。
、−７に胸Ｍ５後、エタノール７５０Ｍで析出、エタノ
ール１００ｄで洗浄を行い、４０℃で真空乾燥し、０．
４９．９のヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を
表１に示した。
実施例１
参考例で得られた粗精製ヒアルロンＭ、ｔ−１，０，９
と９．水７００Ｍに溶解した後、エタノール３００ａを
加えて０．１チヒアルロン酸工タノール混合溶液とした
。
と９．水７００Ｍに溶解した後、エタノール３００ａを
加えて０．１チヒアルロン酸工タノール混合溶液とした
。
一方、内径１１．６α高さ１５ａｎのカラムに、昭ノ々
（６０ゴ／時）で通液した、カラム通過液を５００４と
９食ｆｆ１１ ！Ｍを加え、エタノール７５ｏＩＬｌで
析出・乾燥して、０．４＆のヒアルロン酸ナトリウムを
得た。分析結果を表１に示した。同一の操作を１０回行
なったが、結果はすべて表１に示した値であった。
９食ｆｆ１１ ！Ｍを加え、エタノール７５ｏＩＬｌで
析出・乾燥して、０．４＆のヒアルロン酸ナトリウムを
得た。分析結果を表１に示した。同一の操作を１０回行
なったが、結果はすべて表１に示した値であった。
比較例１
実施例１で、エタノールを水にかえた以外はく但し、析
出用エタノールは使用する〕、同様の操作を行なった。
出用エタノールは使用する〕、同様の操作を行なった。
この操作ｔ−１０回行ない分析結果の平均値を示した。
表 １
比較例１では、実施例１と同等の品質のヒアルロン酸の
得られる場合もめったが、再現性がなく、平均すると表
１に示す結果となった。
得られる場合もめったが、再現性がなく、平均すると表
１に示す結果となった。
実施例２
実施例１でエタノールをアセトンにかえた以外は（但し
、析出用エタノールは使用する）同様に行なった。
、析出用エタノールは使用する）同様に行なった。
実施例３
参考例の粗ｍ製ヒアルロン酸を０．１ ！Ｉとシ水７Ｑ
ａ＋７に溶解した後、エタノール６０ゴを加えて０．１
％ヒアルロン酸エタノール混甘せ液とした。
ａ＋７に溶解した後、エタノール６０ゴを加えて０．１
％ヒアルロン酸エタノール混甘せ液とした。
これに食塩６ｇを加えた後、活性Ｒ（和光社製、特級）
０．１ ／ ｔ−加え３Ｕ’Ｃ１ｈｒ攪拌した。その
後、０．２μフイルター処理を行なった後、１．５倍量
のエタノールを加えて析出させた〇析出したヒアルロン
酸の分析結果を表３に示した。同一の操作ｔ１０回行な
ったが、結果はすべて表６に示した値であり九。
０．１ ／ ｔ−加え３Ｕ’Ｃ１ｈｒ攪拌した。その
後、０．２μフイルター処理を行なった後、１．５倍量
のエタノールを加えて析出させた〇析出したヒアルロン
酸の分析結果を表３に示した。同一の操作ｔ１０回行な
ったが、結果はすべて表６に示した値であり九。
比較例２
実施例６でエタノールを水にかえた以外は（但し析出用
エタノールは使用する）同様の操作を１０回行なった。
エタノールは使用する）同様の操作を１０回行なった。
その結果の平均値を比較例２とした。
畳 比較例１の値を示した。
表
１０回行なった。その結果の平均値を比較例６とした。
実施例４
参考例の粗精製ヒアルロン酸を０．２Ｉとシ水１４０−
に溶解した後、エタノール６０ａを加え、これに食塩を
１２．ｆ？Ｉ肩させ丸。この溶液ｔ−１５ｇの６０−１
００メツシユの７ｏリシルを光横したカラム（直径１．
５ｃｍ）に５ｖ＝ｉで通液した。
に溶解した後、エタノール６０ａを加え、これに食塩を
１２．ｆ？Ｉ肩させ丸。この溶液ｔ−１５ｇの６０−１
００メツシユの７ｏリシルを光横したカラム（直径１．
５ｃｍ）に５ｖ＝ｉで通液した。
この溶液に１．５倍量エタノールを加えて析出させ、析
出したヒアルロン酸の分析結果を表４に示した。同一の
操作を１０回行なりたが結果はｔぺて表４に示した値で
あった。
出したヒアルロン酸の分析結果を表４に示した。同一の
操作を１０回行なりたが結果はｔぺて表４に示した値で
あった。
比較例３
実施例４でエタノールを水にかえた以外はく但し、析出
用エタノールは使用する〕同様の操作を測定法 １ン蛋白質含ｔ：精製とアルΩ７歳を％０．ＩＮ水酸化
ナトリウムに溶解し、 ローリ−法にて行なった。
用エタノールは使用する〕同様の操作を測定法 １ン蛋白質含ｔ：精製とアルΩ７歳を％０．ＩＮ水酸化
ナトリウムに溶解し、 ローリ−法にて行なった。
２）核 ＃ ：０．１９６ヒアルロン酸ナトリウム
溶液の２６０ ｎｍにおける吸 光度を測定した。
溶液の２６０ ｎｍにおける吸 光度を測定した。
６）発熱性物質：生化学工業社製トキシカラーシステム
によｐ比色分析する ことによシ行なった。
によｐ比色分析する ことによシ行なった。
本発明によれば、高品質なとアルキン酸を安定して得る
ことができる。またこの方法で得られたヒアルロン酸は
医薬方面の用途が期待される。
ことができる。またこの方法で得られたヒアルロン酸は
医薬方面の用途が期待される。
ｑ＃奸出出願
人気化学工業株式会社
Claims (1)
- ヒアルロン酸含有液を水と混和する有機溶剤の水溶液
で処理することを特徴とするヒアルロン酸の精製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63254985A JP2938880B2 (ja) | 1988-10-12 | 1988-10-12 | ヒアルロン酸の精製法 |
| US07/347,337 US4946780A (en) | 1988-10-12 | 1989-05-04 | Method for producing sodium hyaluronate by fermentation method |
| EP89108522A EP0363561B1 (en) | 1988-10-12 | 1989-05-11 | Method for producing sodium hyaluronate by fermentation method |
| DE68914236T DE68914236T2 (de) | 1988-10-12 | 1989-05-11 | Verfahren zur Herstellung von Natriumhyaluronat durch Gärung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63254985A JP2938880B2 (ja) | 1988-10-12 | 1988-10-12 | ヒアルロン酸の精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02103203A true JPH02103203A (ja) | 1990-04-16 |
| JP2938880B2 JP2938880B2 (ja) | 1999-08-25 |
Family
ID=17272608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63254985A Expired - Lifetime JP2938880B2 (ja) | 1988-10-12 | 1988-10-12 | ヒアルロン酸の精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2938880B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006104461A (ja) * | 2004-09-10 | 2006-04-20 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | グリコサミノグリカン画分中の不純物の除去方法 |
| US7575914B2 (en) | 2002-08-19 | 2009-08-18 | Kolon Life Science, Inc. | Microorganism producing hyaluronic acid and purification method of hyaluronic acid |
| JPWO2007142285A1 (ja) * | 2006-06-07 | 2009-10-29 | 協和発酵バイオ株式会社 | ヒアルロン酸塩の精製方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60133894A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-07-17 | マイルス・ラボラトリース・インコーポレーテツド | ヒアルロン酸およびその製造法 |
-
1988
- 1988-10-12 JP JP63254985A patent/JP2938880B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60133894A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-07-17 | マイルス・ラボラトリース・インコーポレーテツド | ヒアルロン酸およびその製造法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7575914B2 (en) | 2002-08-19 | 2009-08-18 | Kolon Life Science, Inc. | Microorganism producing hyaluronic acid and purification method of hyaluronic acid |
| JP2006104461A (ja) * | 2004-09-10 | 2006-04-20 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | グリコサミノグリカン画分中の不純物の除去方法 |
| JPWO2007142285A1 (ja) * | 2006-06-07 | 2009-10-29 | 協和発酵バイオ株式会社 | ヒアルロン酸塩の精製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2938880B2 (ja) | 1999-08-25 |
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