JP2003525946A - ヘパリナーゼｉｉｉおよびその使用 - Google Patents

ヘパリナーゼｉｉｉおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘパリナーゼＩＩＩおよびその変異体に関する。ヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）の配列決定、溶液からの活性な硫酸ヘパランの除去、新脈管形成の阻害などを含む多様な目的に有用な、酵素活性を減少された改変された形態のヘパリナーゼＩＩＩが、本発明により発見された。他の局面において、本発明はまた、ヘパリナーゼＩＩＩを用いて癌を処置する方法ならびに腫瘍細胞の増殖および／または転移を阻害する方法、あるいはＨＬＧＡＧのヘパリナーゼＩＩＩによる酵素的切断により生成される生成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、へパリナーゼＩＩＩおよびその変異体に関する。特に、本発明は、
減少した酵素活性を有するへパリナーゼＩＩＩの改変形態に関し、これは、ヘパ
リン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）の配列決定、溶液からのＨＬＧＡＧ
の除去、新脈管形成の阻害、凝集の阻害などを含む種々の目的のために有用であ
る。他の局面において、本発明は、へパリナーゼＩＩＩあるいはへパリナーゼＩ
ＩＩを用いて酵素的切断によって生成されたＨＬＧＡＧ産物を使用して癌を処置
し、そして腫瘍細胞の増殖および／または転移を阻害する方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） ヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）は、細胞外マトリックスの重
要な成分であり、浸潤、移動、増殖および接着を含む広範な種々の細胞活性を調
節すると考えられる。（Ｋｈｏｄａｐｋａｒら、１９９８；Ｗｏｏｄｓら、１９
９８）。ＨＬＧＡＧは、増殖因子、モルフォゲン、酵素、細胞外タンパク質を含
む多様な分子に結合し、そしてその生物学的活性を調節することによって、これ
らの機能のいくつかを達成する。ＨＬＧＡＧは、α−Ｂ−ヘキソサミン（Ｈ）に
１，４結合したウロン酸［α−Ｌ−イズロン酸（Ｉ）またはβ−Ｄ−グルクロン
酸（Ｇ）］のジサッカライドの繰り返し単位によって特徴付けられる、直鎖多糖
類である。（１）２０〜１００個のジサッカライド単位のこれらのポリマーは、
Ｎ−硫酸化およびＯ−硫酸化を介してさらに改変され、このウロン酸部分のＣ５
位でエピマー化され、これらの情報密度の高い分子に対してさらなる微小不均一
性（ｍｉｃｒｏ−ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）が付加され得る（１．５）。
【０００３】 ＨＬＧＡＧの構造および化学は、かなり十分に理解されているが、特定のＨＬ
ＧＡＧ配列が異なる生物学的プロセスをどのように改変するかについての情報は
、得るのが困難であることが証明された。本発明者らは、最近、配列特異的な様
式で未知のＨＬＧＡＧポリマーを改変するかまたは分解するための化学的手段お
よび酵素的手段を使用する、多糖類のための迅速な配列決定方法論を開発した。
（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、５３７−５４
２（１９９９）、ならびに両方とも２０００年４月２４日に出願された米国特許
出願番号０９／５５７，９９７および同０９／５５８，１３７）。この配列決定
プロセスにおける重要な酵素的手段は、へパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含
むへパリナーゼである。これら３つのへパリナーゼは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍによって生成され得るＨＬＧＡＧ分解酵素である。
これらのへパリナーゼの各々は、そこで切断するそれぞれの独自のＨＬＧＡＧ配
列を有し、これらの酵素を、配列特異的な情報を得ることにおける価値ある手段
にしている。へパリナーゼＩは、主に、ヘパリン様領域において主に見出される
ＨＮＳ，６Ｘ−Ｉ２Ｓ ２結合でＨＬＧＡＧを切断する（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．ら、Ｃ
ｒｉｔ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０、３８７−４４４
（１９９５）、Ｄｅｓａｉ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２、８１４
０−８１４５（１９９３）、およびＪａｎｄｉｋ，Ｋ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ、４、２８９−２９６（１９９４））。へパリナーゼＩＩＩは、ヘパラン
硫酸に見出される主要なジサッカライドであるＨＮＡＣ−Ｉ結合およびＨＮＹ， ６Ｘ −Ｇ２結合で切断する（前出のＥｒｎｓｔら、（１９９５）およびＬｉｎｈ
ａｒｄｔ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２６１１−２６１７（１
９９０））。へパリナーゼＩＩは、両方の基質結合のセットを認識し、そして切
断し得る（前出のＥｒｎｓｔら、（１９９５））。本発明者らは、最近、へパリ
ナーゼＩおよびへパリナーゼＩＩの活性に決定的ないくつかの残基を同定した。
へパリナーゼＩのシステイン１３５およびヒスチジン２０３、ならびにリジン１
９８、１９９および１３２が、この分子の酵素活性に決定的であることを見出し
た。システイン３４８ならびにヒスチジン２３８、４５１および５７９は、へパ
リナーゼＩＩの活性に重要であることが決定された。（係属中の米国特許出願番
号０９／３８４，９５９；Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、３４、１４４４１−１４４４８（１９９５）；Ｇｏｄａｖａｒｔｉ
，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、６８４６−６８５２（１９９６）
；Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２４８−２５５（１９９８）；Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２２９０４−２２９１２（１９９８）
；ならびにＳｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、１０１
６０−１０１６７（１９９８））。
【０００４】 へパリナーゼＩＩＩは、これがへパリナーゼファミリーの、ヘパラン硫酸を認
識しかつ優先的に切断する唯一のメンバーである点において独特である。へパリ
ナーゼＩＩＩはまた、そのアミノ酸配列中にシステインを含まない。
【０００５】 腫瘍転移は、主に脈管構造を介した、身体の離れた部位への腫瘍細胞の伝播を
含む。細胞外マトリックスが分解されるにつれて、腫瘍細胞−細胞外マトリック
スの相互作用が分解され、腫瘍細胞が毛細血管床を通じて自由に外へさまようと
考えられる。異常な進行は、コラーゲンおよび関連のタンパク質、細胞外マトリ
ックスタンパク質を分解して腫瘍の新脈管形成および／または腫瘍細胞の浸潤を
調節する酵素（コラゲナーゼなど）の役割が解明されている。最近、ＨＬＧＡＧ
分解酵素であるへパリナーゼが、細胞外マトリックスの崩壊において補助して、
腫瘍の増殖、新脈管形成および転移を調節するという仮説がまた立てられた。腫
瘍の発達に関連するへパリナーゼの発現が、転移性腫瘍から非転移性腫瘍への切
り替えを示し、そして転移プロセスの開始における役割を果たすということが示
唆されている。この仮説は、ヒトへパリナーゼ遺伝子の最近のクローニング、お
よびへパリナーゼについての遺伝子産物の過剰発現によって増大した癌細胞の悪
性度の実証によって再確認された。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面に従って、へパリナーゼの発現が、必ずしも一次腫瘍から
転移性疾患状態への切り替えを表さないことが発見された。最近のパラダイムと
一致して、へパリナーゼＩ活性は、腫瘍の増殖を促進し、増大した転移に相関す
ることが見出された。しかし、驚くべきことに、へパリナーゼＩＩＩは、一次腫
瘍の増殖を阻害し、転移を有意に減少させることが見出された。従って、１つの
局面において、本発明は、腫瘍の増殖を予防するために腫瘍細胞の増殖を予防す
るためのへパリナーゼＩＩＩの有効量に腫瘍細胞を曝露することによって、腫瘍
の増殖を予防するための方法である。他の局面において、本発明は、関門を横切
る腫瘍細胞の浸潤を予防するために、へパリナーゼＩＩＩの有効量に腫瘍細胞を
曝露することによって腫瘍細胞の転移を予防するための方法である。へパリナー
ゼＩＩＩは、天然のへパリナーゼＩＩＩ分子または改変されたへパリナーゼＩＩ
Ｉ分子であり得る。天然のへパリナーゼＩＩＩは、合成され得るかまたは単離さ
れ得る。
【０００７】 さらに、本発明に従って、治療的なＨＬＧＡＧフラグメントが、癌を処置する
ために使用され得ることが発見されている。これらのフラグメントは、腫瘍の増
殖を予防するために、そして転移を予防するために有用である。これらのフラグ
メントは、癌細胞のへパリナーゼＩＩＩ処理によって生成され得る。癌細胞のへ
パリナーゼＩＩＩ処理によって生成されるこれらのフラグメントは、このフラグ
メントを生成するために使用されるよりも、同じかまたは異なる癌細胞由来の癌
を予防または処置するために使用され得る。さらに、これらは、このフラグメン
トを生成するために使用されるよりも、同じかまたは異なる被験体における癌を
処置または予防するために使用され得る。
【０００８】 腫瘍細胞は、当該分野で公知の任意の方法によってへパリナーゼＩＩＩに曝露
され得る。例えば、この腫瘍細胞がインビトロの腫瘍細胞である場合、へパリナ
ーゼＩＩＩは、インビトロの培養物に添加され得る。この腫瘍細胞がインビボで
ある場合、へパリナーゼＩＩＩは、腫瘍にへパリナーゼＩＩＩを送達するための
任意の方法によって投与され得る。例えば、いくつかの実施形態においては、へ
パリナーゼＩＩＩは、例えば、経口送達、注射などによって全身的に投与され得
るか、あるいは、例えば、腫瘍もしくは腫瘍部位内への直接注射、または外科的
操作の間の直接の適用などによって局所的に投与され得る。
【０００９】 へパリナーゼＩＩＩは、単独でかまたは他の治療（例えば、抗癌薬物）と共に
投与され得る。いくつかの実施形態において、この腫瘍は、前立腺癌または黒色
腫である。
【００１０】 他の局面において、本発明は、腫瘍の処置のための治療剤を調製するための方
法である。この方法は、腫瘍の少なくとも一部を単離する工程、へパリナーゼＩ
ＩＩでこの腫瘍の一部を処理してＨＬＧＡＧフラグメントを生成する工程、およ
びＨＬＧＡＧフラグメントを単離する工程を包含し、ここで、このＨＬＧＡＧフ
ラグメントは、治療剤である。いくつかの実施形態において、この方法はまた、
ＨＬＧＡＧフラグメントの配列を決定する工程を包含し得る。
【００１１】 本発明の他の局面において、腫瘍を有する被験体を処置するための方法が、提
供される。この方法は、腫瘍を処置するために被験体に治療的ＨＬＧＡＧフラグ
メントを投与する工程を包含する。必要に応じて、この方法は、腫瘍がへパリナ
ーゼＩＩＩに接触される場合に生成されるＨＬＧＡＧを同定することによって、
治療的ＨＬＧＡＧフラグメントを同定する工程を包含し得る。いくつかの実施形
態において、この治療的ＨＬＧＡＧフラグメントは、この腫瘍がへパリナーゼＩ
ＩＩに接触される場合に同定されるＨＬＧＡＧフラグメントの配列に基づいて生
成される、合成ＨＬＧＡＧフラグメントである。他の実施形態において、被験体
に投与されるＨＬＧＡＧフラグメントは、腫瘍がへパリナーゼＩＩＩに接触され
た場合に生成される、単離されたＨＬＧＡＧフラグメントである。
【００１２】 別の局面において、本発明は、被験体に治療的ＨＬＧＡＧフラグメントを投与
することによって、癌を有するかまたは癌が発達する危険性を有する被験体を処
置または予防するための方法である。いくつかの実施形態において、この治療的
ＨＬＧＡＧフラグメントは、ＨＬＧＡＧフラグメントの組成物であり、ここで、
ＨＬＧＡＧフラグメントの少なくとも５０％、７５％または９０％が、二硫酸化
ジサッカライドまたは三硫酸化ジサッカライドである。他の実施形態において、
この治療的ＨＬＧＡＧフラグメントは、一硫酸化ジサッカライドまたは非硫酸化
ジサッカライドを含まない。
【００１３】 本発明の別の局面に従って、組成物が提供される。この組成物は、薬学的に受
容可能なキャリア中に、腫瘍細胞の転移を予防するための有効量でへパリナーゼ
ＩＩＩまたは治療的ＨＬＧＡＧフラグメント、および腫瘍に対してへパリナーゼ
ＩＩＩを標的化するための標的化分子を含む。いくつかの実施形態において、こ
のへパリナーゼＩＩＩは、改変されたへパリナーゼＩＩＩであり、そして他の実
施形態においては、これは天然のへパリナーゼＩＩＩである。例えば、この標的
化分子は、腫瘍細胞の表面上の抗原に特異的に結合する化合物であり得る。
【００１４】 別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中の、腫瘍細胞の
転移を予防するための有効量でのへパリナーゼＩＩＩまたは治療的ＨＬＧＡＧフ
ラグメント、ならびに抗癌化合物の組成物である。
【００１５】 他の局面において、本発明は、へパリナーゼＩＩＩ分子内の重要な残基の同定
に基づく。本発明に従って、へパリナーゼＩＩＩ分子内の特定のヒスチジン残基
の改変が、酵素の酵素的速度ならびにこの酵素によって生成される生成物プロフ
ィールにおける変化を引き起こすことが発見された。特に、ヒスチジン２９５お
よびヒスチジン５１０が、へパリナーゼＩＩＩによるヘパラン硫酸の酵素的分解
について重要であることが発見された。これら２つのヒスチジンが他のアミノ酸
に変化された場合、この酵素の活性の全てが失われた。他のヒスチジン残基の改
変は、酵素の速度定数における変化を生じたが、この酵素はなお活性を保持した
。従って、別の局面において、本発明は、配列番号２の成熟ペプチドのアミノ酸
配列を有するポリペプチド、または酵素的な機能に必須でない残基内にその保存
的置換を有するポリペプチドを含む、実質的に純粋なへパリナーゼＩＩＩであり
、ここで、Ｈｉｓ３６、Ｈｉｓ１０５、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１３９、Ｈｉｓ１
５２、Ｈｉｓ２２５、Ｈｉｓ２３４、Ｈｉｓ２４１、Ｈｉｓ４２４、Ｈｉｓ４６
９およびＨｉｓ５３９からなる群より選択される少なくとも１つのヒスチジン残
基が、アラニン、セリン、チロシン、スレオニンおよびリジンからなる群より選
択される残基で置換されている。いくつかの実施形態において、このポリペプチ
ドは、Ｈｉｓ１１０またはＨｉｓ２４１での置換を有する。他の局面において、
本発明は、配列番号２の成熟ペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ま
たは酵素的な機能に必須でない残基内にその保存的置換を有するポリペプチドを
含む、実質的に純粋なへパリナーゼＩＩＩであり、ここで、Ｈｉｓ２９５および
Ｈｉｓ５１０からなる群より選択される少なくとも１つのヒスチジン残基が、任
意の他のアミノ酸で置換されている。
【００１６】 別の局面において、本発明は、改変された生成物プロフィールを有する改変さ
れたへパリナーゼＩＩＩである、実質的に純粋なへパリナーゼＩＩＩであり、こ
こで、この改変されたへパリナーゼＩＩＩの改変された生成物プロフィールは、
天然のへパリナーゼＩＩＩの天然の生成物プロフィールとは、少なくとも１０％
異なる。
【００１７】 別の局面において、本発明は、改変されたヘパリナーゼＩＩＩである実質的に
純粋なヘパリナーゼＩＩＩであって、これは改変されたヘパリナーゼＩＩＩ ｋ ｃａｔ 値を有するＨＬＧＡＧ基質を切断し得、ここでこの改変されたヘパリナー
ゼＩＩＩ ｋｃａｔ値は、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値よりも
少なくとも１０％異なる。本発明はまた、実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩ分
子のいずれかおよび薬学的に受容可能なキャリアの薬学的調製物を含む。本発明
はまた、固体支持膜に固定された本発明の改変されたヘパリナーゼＩＩＩを含む
。
【００１８】 ＨＬＧＡＧを特異的に切断する方法が、本発明の別の局面に従って提供される
。ＨＬＧＡＧを特異的に切断する方法は、ＨＬＧＡＧを本発明の改変されたヘパ
リナーゼＩＩＩと接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、こ
の方法は、上記のような腫瘍細胞の増殖または転移を防止するための方法である
。他の実施形態において、この方法は、ＨＬＧＡＧを配列決定するための方法で
ある。なお他の実施形態において、この方法は、活性なＨＬＧＡＧをＨＬＧＡＧ
含有流体から除去するための方法、新脈管形成を阻害するための方法、新生血管
形成（例えば、眼の疾患に関連する）を阻害するための方法、乾癬を処置するた
めの方法、または凝固を阻害する方法である。
【００１９】 本発明はまた、ＬＭＷＨを産生するために、ＨＬＧＡＧサンプルを改変された
ヘパリナーゼＩＩＩ分子と接触させることによって、ＬＭＷＨを調製するための
方法を包含する。他の局面において、本発明は、この方法によって生成されたＬ
ＭＷＨの組成物である。なお別の局面において、本発明はまた、凝固、腫瘍、乾
癬または新生血管形成に関連する障害を処置または予防するためのこの組成物の
有効量を被験体に投与することによる、凝固、腫瘍、乾癬または新生血管形成に
関連する障害を処置または予防するための方法である。
【００２０】 本発明の制限の各々は、本発明の種々の実施形態を含み得る。したがって、任
意の１つのエレメントまたはエレメントの組合せを含む本発明の制限の各々は、
本発明の各々の局面に含まれ得ることが予測される。
【００２１】 （配列の簡単な説明） 配列番号１は、Ｆ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のヘパリナーゼＩＩＩの核酸配列
である。
【００２２】 配列番号２は、Ｆ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のヘパリナーゼＩＩＩのアミノ酸
配列である。
【００２３】 配列番号３は、ペプチドフラグメントである。
【００２４】 （詳細な説明） いくつかの局面において、本発明は、ヘパリナーゼＩＩＩ、その改変形態、お
よびその使用に関する。本発明は、ヘパリナーゼ生物学の分野を展開するいくつ
かの科学的発見から生じた。特に、本発明は、ヘパリナーゼの新しい改変形態が
、変化する酵素活性を有し、そして異なる生成物プロフィールを生じるという発
見に一部基づく。本発明はまた、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩ、ヘパリナー
ゼＩＩＩの改変形態、およびヘパリナーゼＩＩＩ様の活性を有するヘパリナーゼ
ＩＩの改変形態が、腫瘍細胞の増殖および転移の処置および予防に有用であると
いう発見に基づく。
【００２５】 本発明は、一連の新しい改変ヘパリナーゼＩＩＩ分子を提供する。特に、ヘパ
リナーゼＩＩＩの詳細な構造的および機能的特徴に基づいて、変化した安定性、
活性および特異性を有する新しいヘパリナーゼが提供される。本発明の改変され
たヘパリナーゼは、多くのインビボ、インビトロおよびエキソビボでの有用性を
有する。例えば、これらは、臨床使用のための低分子量のＨＬＧＡＧ、ヘパラン
硫酸、またはヘパラン硫酸フラグメントの生成における重大な価値を有する。さ
らに、これらは、ヘパラン硫酸含有ＨＬＧＡＧの機能を中和するために使用され
得るか、またはこれらはＨＬＧＡＧの配列を同定するために使用され得る。他の
使用は、本明細書中に記載される。
【００２６】 ヘパリナーゼＩＩＩは、その唯一の基質として硫酸ヘパリンを認識し、そして
切断するヘパリナーゼファミリーの唯一のメンバーであることにおいて、独特で
ある。ヘパリナーゼＩＩＩはまた、これがその一次アミノ酸配列にシステインを
含まないことにおいて、そのヘパリン分解ファミリーメンバーの中でも独特であ
る（Ｓｕ，Ｈ．，Ｂｌａｉｎ，Ｆ．，Ｍｕｓｉｌ，Ｒ．Ａ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａ
ｎｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｕ，Ｋ．およびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．Ｃ．（１９９６）Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６２，２７２３−３４ならびにＧｏｄａｖ
ａｒｔｉ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｃｏｏ
ｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．
（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２
２５，７５１−５８）。しかし、ヘパリナーゼＩＩＩは、１３のヒスチジンを含
み、このうち１つまたはいくつかが、この酵素の活性に関与し得る。化学的修飾
、ペプチドマッピング、および部位特異的変異誘発の組合せを通して、ヘパリナ
ーゼＩＩＩの触媒活性におけるヒスチジンの役割は、本発明に従って同定される
。
【００２７】 ヘパリナーゼＩＩＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１および
配列番号２に示される。ヘパリナーゼＩＩＩの配列は、Ｓｕ，Ｈ．，Ｂｌａｉｎ
，Ｆ．，Ｍｕｓｉｌ，Ｒ．Ａ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｕ，Ｋ．
およびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．Ｃ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉ
ｃｒｏ．６２，２７２３−３４．ならびにＧｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｄａｖｉ
ｓ，Ｍ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌａｎ
ｇｅｒ，Ｒ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２５，７５１−５８、米国
特許第５，９１９，６９３号および同第５，６８１，７３３号において報告され
、そして登録番号Ｉ７１３６５に列挙される。これらの配列は、Ｆ．ｈｅｐａｒ
ｉｎｕｍのネイティブのヘパリナーゼＩＩＩの一次構造における第１の見識を提
供した。
【００２８】 本開示は、ヘパリナーゼＩＩＩの二次および三次構造についてのさらなる情報
、ならびにこの酵素の種々の領域の機能的役割に関する情報を提供する。この情
報は、この酵素における重要な部位の詳細な生化学的マッピング、ならびに速度
論研究を介するこれらの部位の特徴付け、部位特異的変異誘発によって生成され
る変異体の特徴付けなどに基づく。この結果は、ヘパリナーゼＩＩＩの一次、二
次および三次構造の詳細な画像ならびにこの酵素の種々の領域の機能的役割、な
らびにその特定の変異体の機能である。
【００２９】 本発明は、いくつかの科学的知見に基づく。本発明によって、ヘパリナーゼＩ
ＩＩ内の種々のアミノ酸残基が、これらの酵素の触媒作用に必須であり、そして
これらの化合物の酵素活性を変化するために改変され得ることが発見された。他
のアミノ酸残基は、ヘパリナーゼＩＩＩの作用について絶対的に重大であり、そ
してこれらが置換または改変される場合、これらの化合物の活性は完全に損なわ
れることもまた発見された。特に、化学的改変、ペプチドマッピング、および部
位特異的変異誘発実験の組合せを介して、２つのヒスチジン（ヒスチジン２９５
およびヒスチジン５１０）はヘパリナーゼＩＩＩによるＨＬＧＡＧの酵素分解に
重大であることが本発明によって示された。
【００３０】 実施例の節に示されるように、ＤＥＰＣを、ヘパリナーゼＩＩＩの分析の最初
の工程において使用した。ＤＥＰＣは、酵素機能におけるヒスチジンの役割の解
明において非常に有用である。しかし、ＤＥＰＣが他の求核性アミノ酸（例えば
、チロシン、リジンまたはシステイン）を改変しないことを保証するように注意
しなければならない（Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌ
ａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６８４６−５２ならびにＳｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｈｕ
，Ｙ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７３，１０１６０−６７）。ヘパリナーゼＩＩＩの場合、この一次アミ
ノ酸配列中にはシステインが存在せず、化学的改変研究における潜在的な混乱要
因としてのこのアミノ酸を排除する。また、ヘパリナーゼＩＩＩをＤＥＰＣと共
にインキュベートした後に、２７８ｎｍでの吸光度における減少は観察されず、
チロシン残基が改変されていなかったことを示す。反応の順序における変化なし
での不活化速度論の増加が、ｐＨ６．０〜７．５でのＤＥＰＣ処置の際に観察さ
れた。さらに、このＤＥＰＣの改変は、３００ｍＭのヒドロキシルアミンとのイ
ンキュベートの際に９０％可逆的であった。８．０より高いｐＨでは、不活化速
度論はもはやＤＥＰＣに対して一次ではなく、そしてこの改変はヒドロキシルア
ミンによって反転され得ず、ヒスチジン以外の残基（すなわち、リジン）が、こ
のｐＨで改変されたことを示す。しかし、中性のｐＨでは、このデータは、ＤＥ
ＰＣがヘパリナーゼＩＩＩのヒスチジン残基を特異的に改変することを示す。
【００３１】 ＤＥＰＣがヒスチジン残基を改変しているという観察と一致して、時間の関数
としての２４０ｎｍでの吸光度における増加が存在する。これは、Ｎ−カルボエ
トキシヒスチジル（ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｈｉｓｔｉｄｙｌ）誘導体（ＤＥＰＣ
とヒスチジン残基との間の反応生成物）の形成を示す。１０分の経過にわたって
、１．８個のヒスチジン残基が改変され、そして酵素活性は９０％減少した。ま
た、硫酸ヘパリンとのプレインキュベーションは、ＤＥＰＣによるヘパリナーゼ
ＩＩＩのより低い不活化速度論を生じた。これらのデータは、ＤＥＰＣが、ヘパ
リナーゼＩＩＩの基質結合／活性部位に近接する重大なヒスチジン残基を特異的
に改変して、この酵素を不活化することを示した。
【００３２】 見かけ上の矛盾は、ＤＥＰＣとヘパリナーゼＩＩＩとの反応が偽一次速度論に
従い、なお２つのヒスチジンが独立して改変されているようであるというという
点でこれらの結果から生じ、表面の近接可能な２つのヒスチジンが、同一の速度
でＤＥＰＣと反応していることを示唆する。改変された残基の１つまたは両方の
いずれかが、この酵素の不活化の原因である場合であり得る。部位特異的変異誘
発実験を、２つのヒスチジンがヘパリナーゼＩＩＩの触媒活性に必須であるか否
かを決定するために行った。この部位特異的変異誘発実験からの結果は、表面の
接近可能なヒスチジンがヘパリナーゼＩＩＩ活性にとって重大であるという化学
的改変データを確認し、そして拡大した。これらの結果は、一次ヒスチジンとし
てのヒスチジン２９５およびヒスチジン５１０が、ヘパリナーゼＩＩＩによるＨ
ＬＧＡＧの分解に関与することを確認する。これらの残基がアラニンで置換され
る場合、この酵素はその基質に対する全ての活性を失う。アラニンに変異する場
合、他のヒスチジン残基は、いずれも活性の完全な損失を示さない。ペプチドマ
ッピング研究からのこの結果は、ヒスチジン２９５の表面接近可能性の重要性を
確認する。
【００３３】 Ｈ２９５ＡおよびＨ５１０Ａ酵素を用いた活性の減少は、いくつかの様式にお
いて説明され得る。これらのヒスチジンは、ヘパリナーゼＩＩＩの適切な折り畳
みに必要であるかもしれない。しかし、Ｈ２９５Ａ、Ｈ５１０Ａおよび組換えヘ
パリナーゼＩＩＩのＣＤスペクトルは、ほとんど同一であり、このことが当ては
まらないことを強く示した。おそらく、ヒスチジン２９５およびヒスチジン５１
０は、酵素へのＨＬＧＡＧの結合において直接役割を果たすか、またはヒスチジ
ン２９５およびヒスチジン５１０は、ＨＬＧＡＧの触媒分解に直接関与する重要
な活性部位残基である。Ｈｉｓ２９５または５１０のアミノ酸の変化を有する改
変ヘパリナーゼＩＩＩ分子は、種々の目的のために（例えば、機能的ヘパリナー
ゼＩＩＩに対する競合性インヒビターとして）有用であり得る。
【００３４】 実施例の節において記載される研究はまた、活性レベルが変化されたが、依然
として活性であるいくつかのヘパリナーゼＩＩＩ変異体を同定した。これらの変
異体としては、以下の変異された残基または置換された残基を有するヘパリナー
ゼＩＩＩ分子が挙げられる：Ｈｉｓ３６、Ｈｉｓ１０５、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ
１３９、Ｈｉｓ１５２、Ｈｉｓ２２５、Ｈｉｓ２３４、Ｈｉｓ２４１、Ｈｉｓ４
２４、Ｈｉｓ４６９およびＨｉｓ５３９。従って、本発明は、Ｆ．ｈｅｐａｒｉ
ｎｕｍのヘパリナーゼＩＩＩの配列ならびに本明細書中に開示された構造的特徴
および機能的特徴に基づいて合理的に設計された、新規の改変ヘパリナーゼを提
供する。
【００３５】 本明細書中の記載において、配列番号２に開示されるネイティブのヘパリナー
ゼＩＩＩのアミノ酸残基および残基位置に対して参照する。詳細には、残基およ
び残基位置は、ヘパリナーゼＩＩＩの特定の残基または残基位置に「対応する」
と呼ばれる。当業者に明らかであるように、これらの位置は、相対的であり、従
って、１つ以上の残基の挿入および欠失は、下流残基のナンバリングを変更する
効果を有する。詳細には、Ｎ末端挿入または欠失は、全ての引き続く残基のナン
バリングを変更する。従って、本明細書中で使用される場合、組換え改変ヘパリ
ナーゼにおける残基は、完全ヘパリナーゼＩＩＩの残基に標準的配列比較プログ
ラムを使用してそれらが整列される場合、「対応する」と呼ばれる。多数のこの
ような配列アライメントプログラムは、現在当業者によって利用可能であり、そ
して配列比較におけるこれらの使用は、一般的になっている。本明細書中で使用
される場合、これらの対応するヘパリナーゼＩＩＩ残基によって組換え改変ヘパ
リナーゼの残基位置を参照するこの慣例は、Ｎ末端挿入または欠失を含む実施形
態だけでなく、内部挿入または欠失（例えば、「ループ」領域における挿入また
は欠失）を含む実施形態まで広がる。
【００３６】 さらに、本明細書中の記載において、組換え改変ヘパリナーゼにおける１つの
アミノ酸残基の別のアミノ酸残基での特定の置換は、「保存的置換」と呼ばれる
。本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」または「保存的置換」
は、置換したアミノ酸残基が、置換される残基と類似の電荷であり、かつ置換さ
れる残基と同じかまたはそれより小さいサイズであるアミノ酸置換をいう。アミ
ノ酸の保存的置換は、以下の群のアミノ酸の間でなされる置換を含む：（ａ）小
さい無極性アミノ酸、Ａ、Ｍ、Ｉ、ＬおよびＶ；（ｂ）小さい極性アミノ酸、Ｇ
、Ｓ、ＴおよびＣ；（ｃ）アミドアミノ酸、ＱおよびＮ；（ｄ）芳香族アミノ酸
、Ｆ、ＹおよびＷ；（ｅ）塩基性アミノ酸、Ｋ、ＲおよびＨ；ならびに（ｆ）酸
性アミノ酸、ＥおよびＤ。電荷中性でありかつより小さい残基で残基を置換する
置換もまた、これらの残基が、異なる群にある場合でさえ、「保存的置換」とみ
なされ得る（例えば、より小さいイソロイシンでのフェニルアラニンの置換）。
用語「保存的アミノ酸置換」はまた、アミノ酸アナログまたは改変体の使用をい
う。
【００３７】 アミノ酸置換、付加または欠失を作製する方法は、当該分野で周知であり、か
つ以下の実施例において詳細に記載される。用語「保存的置換」、「非保存的置
換」、「無極性アミノ酸」、「極性アミノ酸」および「酸性アミノ酸」は全て、
先行技術の用語法と一貫して使用される。これらの用語の各々は、当該分野で周
知であり、多数の刊行物（標準的な生化学の教科書（例えば、Ｇｅｏｆｆｒｅｙ
Ｚｕｂａｙによる「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌ
ｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９８６版：これは、保存的置換および
非保存的置換、ならびに極性、無極性または酸性としてのアミノ酸の定義を導く
アミノ酸の特性を記載する）を含む）に広範に記載されている。
【００３８】 置換を行う前にその正確な効果を予測することが困難な場合でさえも、当業者
は、その効果が、慣用なスクリーニングアッセイ、好ましくは本明細書中に記載
される生物学的アッセイによって評価され得ることを理解する。熱安定性、疎水
性、タンパク分解に対する感受性、またはキャリアと共にかもしくは多量体へと
凝集する傾向を含むペプチド特性の改変は、当業者に周知の方法によってアッセ
イされる。タンパク質化学および構造のさらなる詳細な記載については、Ｓｃｈ
ｕｌｚ，Ｇ．Ｅら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔａｉｎ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９およ
びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔａｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａ
ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆
Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８４を参照のこと。
【００３９】 さらに、アミノ酸置換のいくらかは、非保存的置換である。置換が活性部位ま
たは結合部位から離れている特定の実施形態において、非保存的置換は、それら
がネイティブのヘパリナーゼの三次構造特徴を保存し、それによって、活性およ
び結合部位を保存する場合、容易に許容される。例えば、上記群内よりもむしろ
群間（または、上記に示されない２つの他のアミノ酸の群）の非保存的置換は、
（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の荷電もし
くは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対するそれらの効果においてよ
り有意に異なる。
【００４０】 １局面において、本発明は、改変されたヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値を有
する改変ヘパリナーゼＩＩＩである実質的に純粋なヘパリナーゼであり、ここで
、改変されたヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値は、ネイティブのヘパリナーゼＩ
ＩＩのｋｃａｔ値よりも少なくとも１０％異なる。好ましい実施形態において、
改変されたヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値は、ネイティブのヘパリナーゼＩＩ
Ｉｋｃａｔ値よりも少なくとも２０％異なる。別の好ましい実施形態において、
改変されたヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値は、ネイティブのヘパリナーゼＩＩ
Ｉのｋｃａｔ値よりも少なくとも５０％異なる。本明細書中で使用される場合、
「改変されたヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値」は、硫酸ヘパラン様グリコサミ
ノグリカン基質についてのその改変ヘパリナーゼＩＩＩ酵素の触媒活性の測定値
である。
【００４１】 このｋｃａｔ値は、ヘパリナーゼ酵素の活性を評価するために有用である、任
意の酵素活性アッセイ（例えば、以下の実施例に示されるアッセイ）を使用して
決定され得る。いくつかのこのようなアッセイは、当該分野で周知である。例え
ば、ｋｃａｔを測定するためのアッセイは、Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．Ｅ．，Ｖｅｎｋａ
ｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｓ．，Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｌ
ａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ．Ｒ．
（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１５，５８９〜５９７に記載される。「ネ
イティブのヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値」は、ネイティブのヘパリナーゼＩ
ＩＩの酵素活性の測定値である。
【００４２】 改変ヘパリナーゼは、ＨＬＧＡＧについて減少した酵素活性を有し得る。「減
少した酵素活性」は、ネイティブのヘパリナーゼのｋｃａｔ値と改変ヘパリナー
ゼのｋｃａｔ値とを比較することによって評価される。好ましくは、改変ヘパリ
ナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値は、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩのｋｃａｔ値の
７５％より小さいかまたはそれに等しい。ＨＬＧＡＧについて減少した酵素活性
を有する改変ヘパリナーゼは、触媒活性に必須な残基における改変を有するもの
である。例えば、Ｈｉｓ１１０またはＨｉｓ２４１の変異は、そのヘパリナーゼ
ＩＩＩが減少した酵素活性を有するようにさせる。増加した酵素活性を有する改
変ヘパリナーゼＩＩＩは、より高い酵素活性を有する酵素を産生する変更された
残基を有するものである。例えば、Ｈｉｓ１３９の変異は、増加した酵素活性を
有する改変ヘパリナーゼＩＩＩ分子を生成する。さらに、Ｈｉｓ２２５が、ヘパ
リナーゼＩＩＩにおいて変異される場合、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩとほ
とんど同じ酵素活性を示す改変ヘパリナーゼＩＩＩが産生される。これらの酵素
もまた、有用である。
【００４３】 ヘパリナーゼについて、本明細書中で使用される場合、用語「実質的に純粋」
とは、ヘパリナーゼが、それらの意図される使用のために実用的かつ適切な程度
までに、それらと共に天然またはインビボ系で見出され得る他の物質を実質的に
含まないことを意味する。特に、ヘパリナーゼは、例えば、薬学的調製物の生成
または配列決定において十分有用であるように、それらの宿主細胞の他の生物学
的構成要素を含まない。本発明のヘパリナーゼは、薬学的調製物において薬学的
に受容可能なキャリアと混合され得るので、このヘパリナーゼは、この調製物の
数重量％のみを含有し得る。それにもかかわらず、このヘパリナーゼは、それが
実質的に生物系において関連し得る物質から分離される点において、実質的に純
粋である。
【００４４】 本明細書中に提供される開示に基づいて、当業者は、ネイティブのヘパリナー
ゼＩＩＩ分子についての変更された酵素活性を有する他の改変ヘパリナーゼＩＩ
Ｉを同定し得る。
【００４５】 別の局面において、本発明は、改変された生成物プロフィールを有する改変ヘ
パリナーゼＩＩＩである、実質的に純粋なヘパリナーゼであり、ここで、この改
変ヘパリナーゼＩＩＩの改変された生成物プロフィールは、ネイティブのヘパリ
ナーゼＩＩＩのネイティブ生成物プロフィールよりも少なくとも１０％異なる。
好ましくは、それは、少なくとも２０％または少なくとも５０％でさえある。本
明細書中で使用される場合、「改変された生成物プロフィール」は、改変ヘパリ
ナーゼによって産生される分解産物のセットであり、これらは、同一の酵素条件
下でネイティブのヘパリナーゼによって産生される分解産物とは異なる。生成物
プロフィールにおける相違は、ネイティブのヘパリナーゼと比較した、改変ヘパ
リナーゼよって形成される異なる酵素産物の存在または単に酵素産物の数、ある
いはこれら２つの組み合わせに起因し得る。例えば、ネイティブのヘパリナーゼ
とは対照的に、改変ヘパリナーゼによる異なる酵素産物の形成は、改変された生
成物プロフィールを構成する。さらに、同じ型の酵素産物の産生ではあるが、ネ
イティブのヘパリナーゼとは対照的に、その改変ヘパリナーゼによる、より小さ
いかまたはより大きい量における産生もまた、改変された生成物プロフィールを
構成する。
【００４６】 改変ヘパリナーゼまたはネイティブのヘパリナーゼによって生成される生成物
プロフィールは、ヘパリナーゼによって産生される分解産物の型または量を試験
するための当該分野で公知の任意の方法によって決定され得る。この産物の型お
よび量を決定するための１つの好ましい方法は、Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊら、
ＰＮＡＳ，ｖ.９５、ｐ.４１７６〜４１８１（１９９８年４月）（これは本明細
書中でその全体が参考として援用される）に記載される。Ｒｈｏｍｂｅｒｇの参
考文献に開示される方法は、マススペクトロメトリおよびキャピラリー電気泳動
技術の組み合わせを使用して、ヘパリナーゼによって産生される酵素産物を同定
する。このＲｈｏｍｂｅｒｇの研究は、ＨＬＧＡＧを分解してＨＬＧＡＧオリゴ
糖を生成するためにヘパリナーゼを使用する。ＭＡＬＤＩ（マトリクス関連レー
ザー蓄積イオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒ
ｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ））マススペクトロメトリは、酵素反応にお
ける基質、酵素および最終産物の同定および半定量的測定のために使用され得る
。キャピラリー電気泳動技術は、産物を分離して、この産物間の小さい相違でさ
え分解し、そして産生される産物を定量化するためにマススペクトロメトリと組
み合わせて適用される。キャピラリー電気泳動法は、ジサッカライドとそのセミ
カルバゾン誘導体との間の相違でさえ分解し得る。多糖類および他のポリマーを
配列決定するための詳細な方法は、共有に係る米国特許出願シリアル番号０９／
５５７，９９７号および０９／５５８，１３７号（この両方は、２０００年４月
２４日に出願され、そして共通の発明者関係を有する）に開示される。両出願の
全内容が、本明細書中で参考として援用される。
【００４７】 簡潔には、本方法を、酵素消化、それに続くマススペクトロメトリおよびキャ
ピラリー電気泳動法によって行う。この酵素アッセイは、このアッセイが改変ヘ
パリナーゼおよびネイティブのヘパリナーゼに対して同様に行われる限り、種々
の様式において行われ得、それによって、それらの結果を比較し得る。Ｒｈｏｍ
ｂｅｒｇの参考文献に記載される例において、酵素反応を、５ｍＬの基質溶液に
１ｍＬの酵素溶液を添加することによって行う。次いで、消化を、室温（２２℃
）で実行し、そして反応を、０．５ｍＬの反応混合物を除去しそして４．５ｍＬ
のＭＡＬＤＩマトリクス溶液（例えば、カフェイン酸（約１２ｍｇ／ｍＬ））お
よび７０％のアセトニトリル／水を添加することによって、種々の時点で停止す
る。次いで、この反応混合物を、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリに供する。こ
のＭＡＬＤＩ表面を、ＸｉａｎｇおよびＢｅａｖｉｓの方法によって調製する（
ＸｉａｎｇおよびＢｅａｖｉｓ（１９９４）Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ.Ｍａｓ
ｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．８；１９９〜２０４）。塩基性ペプチド（Ａｒｇ／Ｇｌ
ｙ）１５の２倍より低いアクセスを、オリゴ糖溶液に添加する前に、マトリクス
と予め混合する。１〜３ピコモルのオリゴ糖を含むサンプル／マトリクス混合物
の１ｍＬのアリコートを、その表面上に堆積する。結晶化した後に（代表的には
、６０分以内に）、過剰の液体を水で洗い流す。次いで、ＭＡＬＤＩマススペク
トロメトリスペクトルを、３３７ナノメーター窒素レーザーを取り付けたＰｅｒ
Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）Ｖｏｙ
ａｇｅｒ Ｆｌｉｔｅ反射飛行時間計測器を使用して、直線モードにおいて獲得
する。遅延抽出法を用いて、分解能を増加させる（２２ｋＶ、９３％の格子、０
．１５％のガイドワイヤ、１５０ｎｓのパルス遅延、１０００の低質量ゲート、
１２８ショットの平均）。マススペクトルを、タンパク質化合物（Ａｒｇ／Ｇｌ
ｙ）１５およびオリゴ糖とのその複合体のシグナルを使用することによって、外
部で較正する。
【００４８】 次いで、キャピラリー電気泳動が、コーティングされていない溶融シリカキャ
ピラリー（内径７５マイクロメートル、外径３６３マイクロメートル、１ｄｅｔ ７２．１ｃｍ、および１ｔｏｔ ８５ｃｍ）を使用することによって、Ｈｅｗ
ｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ３Ｄ ＣＥ ユニットにおいて実施される。分析物を
、２３０ｎｍでのＵＶ検出および延長された光路セル（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃ
ｋａｒｄ）を使用することによって、モニタリングする。電解質は、１０ｍＬの
硫酸デキストランおよび５０ミリモル濃度のＴｒｉｓ／リン酸（ｐＨ２．５）の
溶液である。硫酸デキストランは、シリカの壁とのヘパリンオリゴ糖との非特異
的な相互作用を抑制するために、使用される。分離を、３０ｋＶにおいて、検出
器側にアノードを用いて（逆の極性）実施する。１／５−ナフタレンジスルホン
酸および２−ナフタレンスルホン酸（各々１０マイクロモル濃度）の混合物を、
内部標準として使用する。
【００４９】 生成物プロフィールを評価するための他の方法もまた、利用され得る。例えば
、他の方法としては、粘度（Ｊａｎｄｉｋ，Ｋ．Ａ．，Ｇｕ，Ｋ．およびＬｉｎ
ｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．，（１９９４），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４：２８４
−２９６）または全ＵＶ吸光度（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．ら、（１９９６），Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．，３１５：５８９−５９７）のようなパラメータに依存する方法、
あるいは質量分析またはキャピラリー電気泳動単独が挙げられる。
【００５０】 本発明の改変されたヘパリナーゼを、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩと同じ
任意の目的で、使用し得る。例えば、改変されたヘパリナーゼＩＩＩ分子を使用
して、ＨＬＧＡＧ基質を本発明の改変されたヘパリナーゼの１つと接触させるこ
とによって、ＨＬＧＡＧを特異的に切断し得る。本発明は、ＨＬＧＡＧを切断す
ることが有用である、インビトロ、インビボおよびエキソビボでの種々の方法に
おいて、有用である。
【００５１】 改変されたヘパリナーゼＩＩＩを、例えば、新脈管形成を阻害するための方法
において、使用し得る。この方法において、新脈管形成を阻害するために有効な
量のヘパリナーゼＩＩＩが、その処置を必要とする被験体に投与される。本明細
書中において使用される場合に、新脈管形成とは、新たな血管の不適切な形成で
ある。「新脈管形成」は、しばしば、内皮細胞が、内皮細胞の伸長および増殖を
引き起こす内皮に対してマイトジェン性である増殖因子の群を分泌する場合に、
腫瘍において起こり、これが、新たな血管の発生を生じる。脈管形成マイトジェ
ンのいくつかは、内皮細胞増殖因子に関連するヘパリン結合ペプチドまたは硫酸
ヘパリン結合ペプチドである。
【００５２】 改変されたヘパリナーゼはまた、癌細胞の増殖または転移を処置または予防す
るために有用である。本発明のこの局面は、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩと
改変されたヘパリナーゼＩＩＩとの両方に関して、以下にさらに詳細に議論され
る。
【００５３】 改変されたヘパリナーゼはまた、眼の疾患のような疾患に関連する新生血管形
成を阻害するために有用である。新生血管形成、または新脈管形成とは、新たな
動脈の成長および発達である。これは、血管系の正常な発達（損傷の修復を含む
）のために重要である。しかし、異常な新生血管形成によって特徴付けられる状
態（糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、慢性関節リウマチ、および特定の癌が挙
げられる）が存在する。例えば、糖尿病性網膜症は、失明の主要な原因である。
２つの型（単純および増殖性）の糖尿病性網膜症が存在する。増殖性網膜症は、
新生血管形成および瘢痕によって特徴付けられる。増殖性網膜症を罹患する患者
の約半分が、約５年以内に失明に進行する。
【００５４】 異常な新生血管形成の別な例は、固形腫瘍に関連するものである。腫瘍の所望
でない増殖は、新脈管形成に依存していること、および脈管形成因子の遊離促進
による新脈管形成の誘導は、発癌現象の重要な工程であり得ることが、現在確立
されている。例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、いくつかの癌
細胞によって遊離促進され、そして癌性新脈管形成において重要な役割を果たす
。本明細書中において使用される場合に、脈管形成状態とは、新生血管形成を含
む病理を有する疾患または所望でない医学的状態を意味する。このような疾患ま
たは状態としては、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障および慢性関節リウマチ（
非癌性脈管形成状態）が挙げられる。癌性脈管形成状態とは、固形腫瘍、および
新生血管形成と他の様式で関連する癌または腫瘍（例えば、血管内皮腫、血管種
およびカポージ肉腫）を意味する。
【００５５】 内皮および血管平滑筋細胞の増殖は、新生血管形成の主要な特徴である。従っ
て、本発明の改変されたヘパリナーゼＩＩＩは、このような新生血管形成に全体
的にかまたは部分的に依存する脈管形成状態の増殖を予防するため、および従っ
て、進行をともに阻害または停止するために、有用である。
【００５６】 新生血管形成および新脈管形成はまた、多数の他の病理学的プロセス（関節炎
、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性炎症、強皮症、血管腫、水晶体後線維増殖症なら
びに血友病者の関節における異常な毛細血管増殖、過長月経および出血、ならび
に雌性の生殖系の他の障害を含む）において重要である（Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１巻，２７−３１頁，（１９９５）；Ｊ．
Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，第１４５巻，５７４−５８４頁（１
９９４）；Ａ．Ｐ．Ａｄａｍｉｄら、Ａｍｅｒ．Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌ．，第１１
８巻，４４５−４５０頁（１９９４）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，第９３巻，２３５７−２３６４頁（１９９４）；Ｄ．Ｊ．
Ｐｅａｃｏｃｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，第１７５巻，１１３５−１１３８頁
（１９９２）；Ｂ．Ｊ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．
第４４巻、８２０−８２８頁（１９９４）；Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｓｔｅｒｏｉ
ｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ，Ｎ．Ｊ．
ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＣ．ｄ’Ａｒｃａｎｇｕｅｓ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，
１４４−１５８頁（１９９２））。従って、別の実施形態において、改変された
ヘパリナーゼは、乾癬のような疾患を処置するために投与される。乾癬は、慢性
炎症によって引き起こされる通常の皮膚疾患である。
【００５７】 Ｈ２９５ＡおよびＨ５１０Ａの改変されたヘパリナーゼはまた、本発明によれ
ば、ヘパリナーゼＩＩＩ活性のインヒビターとして、有用である。これらの改変
されたヘパリナーゼは、ネイティブなヘパリナーゼからの最低１つの塩基対改変
を有するが、酵素活性を有さない。従って、Ｈ２９５ＡまたはＨ５１０Ａ改変を
有する改変されたヘパリナーゼは、ネイティブなヘパリナーゼＩＩＩまたはヘパ
リナーゼＩＩＩの機能的改変形態の競合インヒビターとして、使用され得る。こ
れらの化合物は、ヘパリナーゼＩＩＩ活性をブロックすることが望ましい場合（
例えば、細胞の増殖および移動が所望である場合）または溶液中でのヘパリナー
ゼＩＩＩの活性をブロックすることが望ましい場合にはいつでも、有用である。
【００５８】 本発明の改変されたヘパリナーゼはまた、ＨＬＧＡＧを配列決定するためのツ
ールとして有用である。多糖類および他のポリマーを配列決定するための詳細な
方法は、同時係属中の米国特許出願番号０９／５５７，９９７および同０９／５
５８，１３７（両方２０００年４月２４日に出願され、そして同一発明者である
）に開示されている。これらの方法は、配列決定プロセスにおいて、ヘパリナー
ゼのようなツールを利用する。本発明の改変されたヘパリナーゼＩＩＩは、この
ようなツールとして有用である。
【００５９】 本発明の改変されたヘパリナーゼはまた、ＨＬＧＡＧ含有流体から活性ＨＬＧ
ＡＧを除去するために使用され得る。ＨＬＧＡＧ含有流体は、本発明の改変され
たヘパリナーゼＩＩＩと接触して、ＨＬＧＡＧを分解する。この方法は、血液か
らのＨＬＧＡＧのエキソビボ除去のために、特に有用である。本発明の１つの実
施形態において、改変されたヘパリナーゼは、当該分野において一般的であるよ
うに、固体支持体に固定される。固定された改変されたヘパリナーゼを含む固体
支持体は、全身ヘパリン化用の体外循環医療デバイス（例えば、血液透析機、人
工心肺装置）において、このデバイス内の血液が凝固することを防止するために
、使用され得る。固定されたヘパリナーゼＩＩＩを含む支持膜は、このデバイス
の端部に配置されて、血液が身体に戻される前に、ＨＬＧＡＧを中和する。
【００６０】 別の局面において、本発明は、固定された実質的に純粋な本発明のヘパリナー
ゼである。ヘパリナーゼは、任意の型の支持体に固定され得るが、この支持体が
インビボまたはエキソビボで使用される場合には、この支持体は滅菌され、そし
て生体適合性であることが望ましい。生体適合性の支持体とは、被験体において
使用される場合に、免疫反応も他の型の損傷反応も引き起こさない支持体である
。ヘパリナーゼは、当該分野において公知の任意の方法によって、固定され得る
。タンパク質を支持体に固定するための多くの方法が、公知である。
【００６１】 ヘパリナーゼＩＩＩは、いくつかの実施形態において、固体支持体に固定され
る。本明細書中において使用される場合に、「固体支持体」とは、タンパク質が
固定され得る任意の固体材料をいう。固体支持体としては、例えば、膜（例えば
、天然セルロースおよびニトロセルロースのような改変セルロース、またはナイ
ロン）、セファロース、アガロース、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、ポリアクリルアミド、ポリビニリデ
ンジフルオリド、他のアガロース、ならびに磁鉄鉱（磁気ビーズを含む）が挙げ
られるが、これらに限定されない。キャリアは、完全に不溶性であるか、または
部分的に可溶性であり得、そして任意の可能な構造的配置を有し得る。従って、
支持体は、ビーズにおいてのように球状であっても、試験管もしくはマイクロプ
レートウェルの内部表面または棒の外部表面においてのように円筒形であっても
よい。あるいは、表面は、シート、試験ストリップ、マイクロプレートウェルの
底部表面などのように平坦であってもよい。
【００６２】 改変されたヘパリナーゼＩＩＩ分子はまた、多くの治療用途を有するＬＭＷＨ
を発生させるために、有用である。改変されたヘパリナーゼＩＩＩ分子およびＬ
ＭＷＨを、ＬＭＷＨ治療が有用な治療であると確認された任意の型の状態の処置
（例えば、凝固の予防、乾癬の予防）のために、使用し得る。
【００６３】 従って、改変されたヘパリナーゼ分子は、凝固に関連する障害を処置または予
防するために、有用である。本明細書中において使用される場合に、「凝固に関
連する疾患」とは、心筋梗塞または脳梗塞に対して見られるような、血液から組
織への供給を担う血管の遮断に起因する、組織への血液供給における中断から生
じる、局所的炎症によって特徴付けられる状態をいう。大脳虚血発作または大脳
虚血は、脳への血液供給が遮断される虚血状態の一形態である。脳への血液供給
のこの中断は、種々の原因（血管自体の内因性の遮断または閉塞、遠隔位置を起
源とする閉塞源、大脳の不適切な血流を生じる低下した灌流圧力または増加した
血液粘度、あるいはクモ膜下腔または大脳内組織における破裂した血管を含む）
から生じ得る。
【００６４】 本発明の方法はまた、大脳虚血を処置するために有用である。大脳虚血は、一
過性かまたは永久的な欠損のいずれかを生じ得、そして大脳虚血を経験した患者
において、神経学的損傷の重篤度は、虚血性事象の強度および持続時間に依存す
る。一過性の虚血性発作とは、脳への血流が短時間のみ妨害され、そして一時的
な神経学的欠損（これはしばしば、２４時間未満で消滅する）を引き起こすもの
である。ＴＩＡの症状としては、顔面または四肢の麻痺または弱化、明瞭に話す
能力および／または他人の話を理解する能力の損失、視力の損失または視力のぼ
やけ、ならびに眩暈感を感じることが挙げられる。永久的な大脳虚血発作（ａｔ
ｔａｃｋ）（発作（ｓｔｒｏｋｅ）ともまた称される）は、血栓塞栓症のいずれ
かから生じる、脳への血流のより長い妨害によって、引き起こされる。発作は、
ニューロンの損失を引き起こし、代表的に、神経学的欠損を生じ、これはよくな
り得るが完全には回復しない。血栓塞栓症発作は、血栓または塞栓による、頭蓋
外または頭蓋内の血管の閉塞に起因する。発作が血栓症によって引き起こされる
か塞栓症によって引き起こされるかを見分けることはしばしば困難であるので、
用語「血栓塞栓症」は、これらの機構のいずれかによって引き起こされる発作を
網羅するよう使用される。
【００６５】 本発明の方法は、いくつかの実施形態において、改変されたヘパリナーゼＩＩ
Ｉまたはそれを用いて生成したＬＭＷＨを使用する、急性血栓塞栓性発作の処置
に関する。急性の発作は、脳への血液供給の中断である虚血性事象から生じる、
神経学的損傷が関与する、医学的症状である。
【００６６】 単独でかまたは別の治療剤と組み合わせた、改変されたヘパリナーゼＩＩＩま
たはそれを用いて生成したＬＭＷＨの、発作の処置のための有効量とは、発作か
ら生じるインビボでの脳損傷を低減するに十分な量である。脳損傷の低減とは、
本発明の処置なしでは血栓塞栓性の発作を経験する患者においてそれ以外に起こ
る、脳の損傷の任意の予防である。いくつかの生理学的パラメータ（より小さな
塞栓サイズ、改善された局所的大脳血流、および低下した頭蓋内圧（例えば、予
め処置した患者、未処置の発作患者、または血栓崩壊性因子単独で処置された発
作患者のパラメータと比較して）が挙げられる）を使用して、脳損傷の低減を評
価し得る。
【００６７】 改変されたヘパリナーゼＩＩＩまたはそれを用いて生成するＬＭＷＨは、単独
でかまたは凝固に関連する疾患を処置するための治療薬剤と組み合わせて、使用
され得る。凝固に関連する疾患を処置する際に有用な治療剤の例としては、抗凝
固性因子、抗血小板因子、および血栓崩壊性因子が挙げられる。
【００６８】 抗凝固性因子は、血液成分の凝固を防止し、従って、血餅形成を予防する。抗
凝固剤としては、ヘパリン、ワルファリン、クマジン（ｃｏｕｍａｄｉｎ）、ジ
クマロール、フェンプロクーモン、アセノクマロール、ビスクマ酢酸エチル、お
よびインダンジオン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】 抗血小板因子は、血小板の凝固を阻害し、そしてしばしば、一過性の虚血性の
発作（ａｔｔａｃｋ ｏｒ ｓｔｒｏｋｅ）を経験した患者において、血栓塞栓
性発作を予防するために、使用される。抗血小板因子としては、アスピリン、チ
エノピリジン誘導体（例えば、チクロポジン（ｔｉｃｌｏｐｏｄｉｎｅ）および
クロピドグレル）、ジピリダモールおよびスルフィンピラゾン、ならびにＲＧＤ
模倣物およびまた抗トロンビン剤（例えば、ヒルジンであるが、これに限定され
ない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】 血栓溶解剤は、血栓塞栓性発作を生じる血餅を溶解する。血栓溶解剤は、急性
の血管の血栓塞栓および肺塞栓の処置において用いられており、そして当該分野
で周知である（例えば、Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄ
ｉｏｌ；ｖ．２５（補遺７）、ｐ１８Ｓ〜２２Ｓ（１９９５）；Ｈｏｌｍｅｓら
、Ｊ．Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ；ｖ．２５（補遺７）、ｐ．１０Ｓ〜１
７Ｓ（１９９５）を参照のこと）。血栓溶解剤としては、プラスミノーゲン、ａ ２ −抗プラスミン、ストレプトキナーゼ、抗ストレプラーゼ（ａｎｔｉｓｔｒｅ
ｐｌａｓｅ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、およびウロキナー
ゼが挙げられるがこれらに限定されない。「ｔＰＡ」とは、本明細書において用
いる場合、ネイティブｔＰＡおよび組み換えｔＰＡ、ならびにネイティブｔＰＡ
の酵素活性または繊維素溶解性活性を保持しているｔＰＡの改変形態を含む。ｔ
ＰＡの酵素活性は、この分子がプラスミノーゲンをプラスミンに変換する能力を
評価することによって測定され得る。ｔＰＡの繊維素溶解活性は、Ｃａｒｌｓｏ
ｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８，４２８〜４３５（１９８８）によっ
て記載される精製血餅溶解アッセイ、およびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｗ．Ｆ．ら、１９
９１，（前出）（これらの内容全体が本明細書において参考として援用されてい
る）に記載のその改変型のような、当業者に公知の任意のインビトロでの血餅溶
解活性によって決定され得る。
【００７１】 本発明はまた、ヘパリナーゼＩＩＩ、その改変型、ヘパリナーゼＩＩの改変型
およびヘパリナーゼの分解産物（ＨＬＧＡＧフラグメント）が、現実に、癌細胞
の増殖および転移を処置および予防するのに有用であるという発見に関する。従
って、本発明の別の局面に従って、癌を有するかまたは癌の危険性を有する被験
体の処置のための方法が提供される。
【００７２】 ヘパリナーゼは、α−Ｄ−ヘキソサミン（Ｈ）と１，４結合した、ウロン酸［
α−Ｌ−イズロン酸（Ｉ）またはβ−Ｄ−グルクロン酸（Ｇ）］のジサッカライ
ド反復単位によって特徴付けられる直線状ポリサッカライドであるＨＬＧＡＧを
分解する。ＨＬＧＡＧは、ほとんど酸性であり、外来の、そしてジサッカライド
反復単位の非常に化変性化学修飾に起因して天然に見出された情報高密度バイオ
ポリマー（主にＨのＮ−、３Ｏおよび６Ｏ位、そしてウロン酸の２Ｏ位での硫酸
化の形態で）である。決定的に、ＨＬＧＡＧ（コラーゲンとともに）は、細胞表
面の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）インターフェースの重要な成分である。コラ
ーゲン様タンパク質は、組織に接着しそして組織を形成するための細胞の必須の
細胞外の足場を提供するが、複合ポリサッカライドは、足場によって作成された
間隙を充填し、そして増殖因子、サイトカインなどのような、多くのシグナル伝
達分子に特異的に結合して生物学的活性を調節することによって分子スポンジと
して働く。細胞が、配列中に存在する異常な情報内容を用いて、別個のＨＬＧＡ
Ｇ配列を合成し、そしてこれらの配列でそれ自体を装飾して、多くのシグナル伝
達分子に特異的に結合して、それにより種々の生物学的プロセスを調節すること
が最近認識されている。
【００７３】 腫瘍転移は、ＥＣＭの分解を通じた腫瘍細胞−ＥＣＭ相互作用の分解後の、主
に血管を介する腫瘍細胞の伝播、および毛細管床を通じた腫瘍細胞の滲出に関す
る。最近の証拠では、ＥＣＭのタンパク質成分を分解するコラーゲン（および関
連タンパク質）、酵素（コラゲナーゼなど）が、腫瘍新脈管形成またはＥＣＭの
腫瘍細胞浸出の調節において役割を果たし得ることが示唆されている。しかし、
複合ポリサッカライドの化学的異質性および有効なツールを欠く事により、腫瘍
増殖および転移におけるＨＬＧＡＧの役割の研究には重大な限界がある。しかし
、興味深いことに、コラーゲンおよびプロテアーゼと同時に、ＨＬＧＡＧ分解酵
素（ヘパリナーゼ）がＥＣＭの崩壊を補助し、腫瘍増殖、新脈管形成および転移
を促進するという仮説が立てられた。最近の腫瘍ヘパリナーゼ遺伝子のクローニ
ングのような他の証拠によって、ＨＬＧＡＧ分解酵素の発現は、原発性腫瘍から
転移性の疾患状態への「切り替え（スイッチ）」をあらわすという実例（パラダ
イム）が導かれた。
【００７４】 先行技術の知見に比べて驚くべきことに、ＨＬＧＡＧ分解酵素が、腫瘍増殖お
よび転移に寄与し得るという言及において先行技術が誤っていただけでなく、実
際には特定のＨＬＧＡＧ分解酵素およびＨＬＧＡＧフラグメント（ヘパリナーゼ
ＩＩＩによって生成されたＬＭＷＨ組成物を含む）が、癌細胞増殖および転移を
阻害するのに、現実に、非常に有効であるということが、本発明によってここで
発見された。詳細には、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩに対して類似の機能的
活性を有するヘパリナーゼが、インビトロで腫瘍増殖および転移を妨げることが
発見されている。ヘパリナーゼＩＩＩの酵素産物（ＨＬＧＡＧフラグメントおよ
びＬＭＷＨ）が、腫瘍増殖および転移を防止するのに有用であることもまた発見
された。
【００７５】 実施例の節では、腫瘍増殖および転移を防止することにおけるヘパリナーゼの
有効性を実証するインビトロおよびインビボのデータを提示している。癌の２つ
の異なる動物モデル（Ｂ１６ＢＬ６およびＬＬＣ）を用いて、際立って類似のデ
ータが得られ、このことは、腫瘍増殖および転移におけるＨＬＧＡＧの重要な役
割を示す。このデータはまた、ヘパリナーゼＩおよびＩＩＩ、ならびにＨＬＧＡ
Ｇフラグメント（生理学的プロセスにおいてこれらのヘパリナーゼによって生成
された）の異なる効果を実証した。ヘパリナーゼＩは、癌細胞増殖または転移を
防止できなかった。このことは、この効果がヘパリナーゼＩＩＩおよびその機能
的な改変体に特異的であることを示す。これらの結果は、ヘパリナーゼの特有の
特異性と一致しており、従ってそれらが生成する別個のオリゴサッカライド産物
と一致している。さらに、このデータは、１つの細胞型については、ＨＬＧＡＧ
フラグメントが、別の細胞型に影響し得ることを実証しており、このことは、腫
瘍増殖および転移に対する調節効果におけるＨＬＧＡＧの特定の配列の関与を強
力に示す。
【００７６】 従って、本発明は、被験体にヘパリナーゼＩＩＩ分子（ネイティブまたは改変
）および／または治療用ＨＬＧＡＧフラグメント（ＬＭＷＨを含む）を投与する
ことによって、腫瘍形成および／または転移を処置または予防するための方法を
包含する。
【００７７】 本発明のこの局面において有用なヘパリナーゼとしては、ネイティブヘパリナ
ーゼＩＩＩ、改変ヘパリナーゼＩＩＩ、および改変ヘパリナーゼ（ヘパリナーゼ
ＩＩＩの機能的活性を有する）が挙げられる。本明細書において用いる場合、「
ネイティブヘパリナーゼＩＩＩ」とは、単離型の、天然に存在するヘパリナーゼ
ＩＩＩ分子をいう。Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の天然に存在する分子の配列は
、配列番号１（核酸配列）および配列番号２（アミノ酸配列）として提供され、
そして当該分野で広範に記載されている（発行された特許を含む）。単離された
分子とは、実質的に純粋であり、そして実用的な程度まで、そして意図される用
途に適切である程度まで、他の物質（天然にまたはインビボ系で通常見出される
）を含まない分子である。詳細には、この分子種は、十分に純粋であり、そして
宿主細胞の他の生物学的成分を十分に除去されており、そのため、例えば、この
分子種が核酸、ペプチドまたはポリサッカライドである場合に、薬学的調製また
は配列決定において有用である。本発明の単離された分子種は、薬学的調製物に
おいて薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るので、この分子種は、調製物
のわずか（重量パーセント）しか含まれない。それにもかかわらず、この分子種
は、実質的に純粋であり、すなわち、生存する系に関与し得る物質から実質的に
分離されている。
【００７８】 本明細書において用いる場合、「改変ヘパリナーゼＩＩＩ」とは、ネイティブ
のヘパリナーゼＩＩＩに比べて、少なくとも１つの変異、欠失または置換を有す
るが、硫酸ヘパリンを酵素的に切断する能力を保持している任意のヘパリナーゼ
ＩＩＩ分子である。これらとしては、本明細書に記載の特定の改変ヘパリナーゼ
、および適切な機能を有する任意の他の改変ヘパリナーゼが挙げられる。これら
は、上記の方法または実施例の節の方法を用いて、当業者に同定され得る。例え
ば、改変されたヘパリナーゼＩＩＩは、酵素活性または折り畳み（フォールディ
ング）に重要でない（従って、ヘパリナーゼが基質を切断する能力に影響を有さ
ない）、分子の領域内の単一の保存的置換を有してもよい。さらに、ヘパリナー
ゼの酵素活性または産物のプロフィールに影響するが、なおいくらかの酵素活性
を保持している、本明細書に記載のヒスチジン置換のような置換もまた、本発明
のこの局面に有用である。なぜなら、それらは、依然としてヘパラン硫酸を切断
できるからである。しかし、全ての活性を失った、２つのヒスチジン変異体（Ｈ
ｉｓ２９５およびＨｉｓ５１０）は、本発明のこの局面において有用でない。（
これらの２つの変異体は、競合インヒビターのような、他の有用性を有する）。
【００７９】 用語「ヘパリナーゼＩＩＩの機能的活性を有する改変ヘパリナーゼ」とは、本
明細書において用いる場合、（ヘパラン硫酸に対して酵素的に活性であるがヘパ
リンに対しては活性が最小限であるかまたは活性を有さないように）改変された
ヘパリナーゼＩＩＩ以外のヘパリナーゼをいう。例えば、ヘパリン結合に関与す
る残基である、ヘパリナーゼＩＩのＣｙｓ３４８の変異は、ヘパリナーゼＩＩの
ヘパリンに関する酵素活性を低下させる。この改変によって、独占的にヘパラン
硫酸分解酵素となる、改変ヘパリナーゼＩＩを生じる。さらに、ヘパリナーゼＩ
ＩＩにおいてヒスチジン４４０が変異されている場合、改変ヘパリナーゼＩＩＩ
（ヘパリンに関して酵素活性が減少しているが、ヘパラン硫酸を基質として用い
る場合、ネイティブのヘパリナーゼＩＩＩとほぼ同じ酵素活性を示す）が生成さ
れる。ヘパリナーゼＩＩのヒスチジン４５１、２３８、および５７９の変異は、
ヘパラン硫酸に関して、酵素活性が減少している改変ヘパリナーゼＩＩ分子を生
じる。従って、Ｃｙｓ３４８またはＨｉｓ４４０が変異されている改変ヘパリナ
ーゼＩＩ分子は、本発明による、「ヘパリナーゼＩＩＩの機能活性を有する改変
ヘパリナーゼ」であるが、ヒスチジン４５１、２３８、または５７９が変異され
たヘパリナーゼは、この分類（クラス）の分子には入らない。
【００８０】 本発明はまた、腫瘍細胞増殖および転移の処理および防止のための治療用ＨＬ
ＧＡＧの使用を意図する。本明細書において用いる場合、治療用ＨＬＧＡＧフラ
グメントとは、ネイティブなヘパリナーゼＩＩＩ、改変ヘパリナーゼＩＩＩおよ
び改変ヘパリナーゼ（上記の、ヘパリナーゼＩＩＩの機能的活性を有する）の使
用を通じて同定されたＨＬＧＡＧの断片またはフラグメントである分子をいう。
ＨＬＧＡＧフラグメントはまた、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を含む。いくつ
かの治療用ＨＬＧＡＧの組成上の分析は、以下の実施例の節に記載している。
【００８１】 本発明はまた、腫瘍の処置および転移の防止のための治療用ＨＬＧＡＧフラグ
メントを同定するためのスクリーニングアッセイを包含する。このアッセイは、
ヘパリナーゼＩＩＩ（ネイティブまたは改変型）で腫瘍または単離された腫瘍細
胞を処置すること、および得られたＨＬＧＡＧフラグメントを単離することによ
って達成される。驚くべきことに、これらのＨＬＧＡＧフラグメントは、腫瘍細
胞増殖および転移の防止において治療活性を有する。実施例の節でより詳細に記
載されているように、これらのＨＬＧＡＧフラグメントは、他の腫瘍と同様に、
ＨＬＧＡＧフラグメントが生成された腫瘍細胞の処置のための治療剤として有用
である。従って、本発明は、腫瘍または腫瘍の一部が被験体から単離され、治療
用ＨＬＧＡＧフラグメントを調製するために用いられる、個別の治療を包含する
。これらの治療用フラグメントは、さらなる腫瘍細胞の増殖もしくは転移、また
は（腫瘍がもはや転移性でない場合は）転移の開始から、被験体を防御するため
に被験体に再投与され得る。あるいは、このフラグメントは、同じタイプの腫瘍
または異なるタイプの腫瘍を有する異なる被験体において用いられ得る。
【００８２】 用語、「治療用ＨＬＧＡＧフラグメント」とは、本明細書において用いる場合
、腫瘍細胞の増殖および／または転移を妨げるという点で、治療活性を有するＨ
ＬＧＡＧをいう。このような化合物は、ヘパリナーゼＩＩＩを用いて生成され治
療用フラグメントを生じてもよいし、またはこのような化合物は新規に合成され
てもよい。推定ＨＬＧＡＧフラグメントは、本明細書中に記載されるか、または
当該分野で公知の任意のアッセイを用いて治療活性について試験され得る。従っ
て、治療用ＨＬＧＡＧフラグメントは、腫瘍がヘパリナーゼＩＩＩに接触される
ときに同定されたＨＬＧＡＧフラグメントの配列に基づいて生成された合成ＨＬ
ＧＡＧフラグメントであり得るか、またはこの化合物の活性を妨害しないわずか
な改変を有するフラグメントである。あるいは、治療用ＨＬＧＡＧフラグメント
は、腫瘍がヘパリナーゼＩＩＩに接触されるときに生成される単離されたＨＬＧ
ＡＧフラグメントであり得る。
【００８３】 本発明は、被験体において腫瘍細胞増殖または転移を処置および／または予防
するために有用である。用語「防止（予防）」および「防止する（妨げる、予防
する、防ぐ）」とは、本明細書において用いる場合、癌または腫瘍細胞の増殖ま
たは転移を完全にまたは部分的に阻害すること、および癌または腫瘍細胞の増殖
または転移におけるいかなる増大をも阻害することをいう。
【００８４】 「癌を有する被験体」とは、検出可能な癌細胞を有する被験体である。癌は、
悪性の癌であっても悪性でない癌であってもよい。癌または腫瘍としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：胆道癌；脳の癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛
癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺
癌（例えば、小細胞癌および非小細胞癌）；黒色腫；神経芽細胞種；口腔癌；卵
巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎
臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫。
【００８５】 本明細書で用いられる「癌を有する危険性がある被験体」とは、癌を発症する
高い確率を有する被験体である。例えば、これらの被験体は、遺伝的な異常を有
する被験体、相対的に癌発症する高い確率を示す被験体、およびタバコ、アスベ
スト、または他の化学的毒素等の発癌因子に曝された被験体、あるいは以前に癌
の処置を受けて見かけ上は寛解している被験体を含む。癌発症の危険性がある被
験体がヘパリナーゼＩＩＩで処置される場合、この被験体は、発症する癌細胞を
殺し得る。
【００８６】 ネイティブなヘパリナーゼＩＩＩ、改変されたヘパリナーゼ、または本発明の
治療のためのＨＬＧＡＧの有効量が、このような処置の必要のある被験体に投与
される。有効量は、医学的に受け入れがたい他の副作用を生じることなく、細胞
増殖または転移において所望される減少を生じる量である。このような量は、慣
用的な試験のみで決定され得る。１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量
（投与形態に依存する）が効果的であると考えられる。絶対量は、種々の因子（
投与が他の処置方法と組み合わされているか否か、投与回数および個々の患者の
パラメーター（年齢、体調、サイズおよび体重を含む）の組み合せであるかを含
む）に依存し、慣用的な試験で決定され得る。一般的に、適切な医学的判断に従
う最も安全な用量である最大用量を用いることが好ましい。投与形態は、経口投
与、皮下投与、静脈内投与などを含む任意の医学的に受容可能な形態であり得る
。
【００８７】 本発明のいくつかの局面において、ヘパリナーゼＩＩＩの有効量は、関門をよ
こぎって腫瘍細胞が侵潤するのを防ぐために有効な量である。癌の侵潤および転
移は、形質転換した細胞に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を通って侵潤および移
動することを可能にし、足場に依存しない増殖特性を得ることを可能にした細胞
接着特性の変化を含む複合プロセスである。Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ．Ａ．ら、Ｃｅｌ
ｌ ６４：３２７〜３３６（１９９１）。これらの変化の一部は、膜に結合した
シグナル分子、細胞骨格に結合したシグナル分子、および細胞内シグナル伝達分
子を含む細胞／ＥＣＭの接触点である局所的な接着を生じる。斑種性の病巣の腫
瘍細胞病巣がこれらの増殖および伝播を支持する組織に斑種される場合、転移性
疾患が生じ、そして腫瘍細胞の第２の伝播が多数の癌に関する罹患率および死亡
率に反映される。したがって、本明細書で用いられる用語「転移」は、最初の腫
瘍部位から離れた腫瘍細胞の侵潤および移動を示す。
【００８８】 腫瘍細胞に対する関門は、インビトロでの人為的な関門またはインビボでの天
然の関門であり得る。インビトロの関門は、細胞外マトリックスコートされた膜
（例えば、マトリゲル）を含むが、これに限定されない。したがって、ヘパリナ
ーゼ組成物は、Ｐａｒｉｓｈ、Ｃ．Ｒ．ら、「Ａ Ｂａｓｅｍｅｎｔ−Ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｗｈｉｃｈ Ｃｏｒｒｅｌ
ａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏ
ｆ Ｔｕｍｏｕｒ Ｃｅｌｌｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）５２：
３７８〜３８３において詳細に記載されるような、マトリゲル侵潤アッセイ系で
腫瘍細胞の侵潤を阻害する能力を試験され得る。マトリゲルは、ＩＶ型コラーゲ
ン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えば、ペルレカン（ｐｅｒｌ
ｅｃａｎ））を含む再構成された基底膜であり、これは、ｂＦＧＦ、ビトロネク
チンおよびトランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ウロキナーゼ型プラ
スミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）お
よびプラスミノゲン活性化因子インヒビターＩ型（ＰＡＩ−Ｉ）として公知のセ
ルピンに結合および局在する。転移についての他のインビトロおよびインビボア
ッセイは、先行技術に記載される（例えば、参考として援用される１９９９年８
月１０日に発行された米国特許第５，９３５，８５０号）。インビボ関門は、被
験体の体内に存在する細胞性関門を示す。
【００８９】 一般に、治療の目的で投与される場合、本発明の処方物は、薬学的に受容可能
な溶液中で適用される。このような調製物は、慣用的に薬学的に受容可能な濃度
の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性のキャリア、アジュバント、および必要に応じ
て他の治療的成分を含み得る。
【００９０】 本発明の組成物は、それ自体（ニート）でか、または薬学的に受容可能な塩の
形態で投与され得る。薬物に用いる場合、塩は、薬学的に受容可能であるべきで
あるが、薬学的に受容可能でない塩は、これらの薬学的に受容可能な塩を調製す
るのに慣用的に使用され得て、本発明の範囲から除外されない。このような薬理
学的および薬学的に受容可能な塩は、以下の酸から調製される塩を含むが、これ
らに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸
、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸
、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンス
ルホン酸。また薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金
属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、またはカルボン酸群のカルシウム塩）と
して調製され得る。
【００９１】 適切な緩衝化剤は、以下を含む：酢酸および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）；クエン酸
および塩（１〜３％Ｗ／Ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）；お
よびリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）。適切な保存剤は、塩化ベンザルコ
ニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）；クロロブタノール（０．３％〜０．
９％Ｗ／Ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）およびチメロサール（
０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）を含む。
【００９２】 本発明は、医学的用途のための薬学的組成物（ネイティブなヘパリナーゼＩＩ
Ｉ、本発明の改変ヘパリナーゼ、または１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア
および必要に応じた他の治療用成分と共に用いる治療的ＨＬＧＡＧフラグメント
を含む）を提供する。本明細書で用いられ、以下により十分に記載される用語「
薬学的に受容可能なキャリア」は、ヒトまたは他の動物の投与に適切な、１つ以
上の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤またはカプセル化材料を意味する
。本発明において用語「キャリア」とは、適用を容易にするために活性化成分が
、組み合される有機成分または無機成分（天然物または合成物）を示す。所望の
薬学的効力を実質的に損なう相互作用を起さないような様式で、薬学的組成物の
成分はまた、本発明の改変ヘパリナーゼとともにおよび互いに混ぜ合わされ得る
。
【００９３】 種々の投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は当然、選択された
特定の改変ヘパリナーゼ、処置される特定の状態および治療効力のために必要と
される投薬量に依存する。一般的に言えば、本発明の方法は、医学的に受容可能
な任意の投与形態を用いて実施され得、臨床的に受容しがたい副作用を引き起こ
さずに有効なレベルの免疫応答を生じる任意の形態を意味する。好ましい投与形
態は、非経口経路である。用語「非経口」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔
内、胸骨下の注射または注入技術を含む。他の投与形態は、経口、粘膜、直腸内
、腟内、舌下、鼻腔内、気管内、吸入、眼内、経皮等を含む。
【００９４】 経口投与のために、化合物は、活性化合物を当該分野で周知の薬学的に受容可
能なキャリアと合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリア
は、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ
剤、スラリー剤、懸濁剤など、処置される被験体によって経口摂取されるために
処方され得る。経口使用のための薬学的調製物は、固形賦形剤として得られ得、
必要に応じて生じた混合物を粉砕し、そして適切な補助剤を添加後、顆粒混合物
に加工し得て、必要な場合、錠剤または糖剤の核を得る。特に、適切な賦型剤は
、増量剤（例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビ
トール）、セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン
、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、および／または、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）である。
必要な場合、崩壊剤（例えば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、または
アルギン酸、またはこれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が添加され
得る。必要に応じて、経口処方物はまた、生理食塩水中または内部の酸条件の中
和のための緩衝液中に処方され得るか、またはいかなるキャリアも伴わずに投与
され得る。
【００９５】 糖剤のコアは、適切なコーティングを提供される。この目的のために、濃縮さ
れた糖溶液（必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カ
ルボポールゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、およ
び／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合
物を含み得る）を用い得る。識別のためにか、または異なる組み合せの活性化合
物の用量を特定するために、染料または色素を錠剤または糖剤に添加し得る。
【００９６】 経口的に使用され得る薬学的調製物は、ゼラチン製プッシュフィット（ｐｕｓ
ｈ−ｆｉｔ）カプセル、およびゼラチンならびに可塑剤（例えば、グリセロール
またはソルビトール）で作られた軟性シールカプセルを含む。プッシュフィット
カプセルは、増量剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）、お
よび／また滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）、および
必要に応じて安定化剤との混合物に活性成分を含み得る。軟カプセル剤において
、活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリ
エチレングリコール）に溶解または懸濁され得る。さらに、安定化剤が添加され
得る。経口投与のために処方されたミクロスフェアもまた使用され得る。このよ
うなミクロスフェアは、当該分野でよく特徴付けられている。経口投与のための
すべての処方物は、このような投与のために適切な用量にあるべきである。
【００９７】 頬腔においての投与のために、組成物は、従来の様式で処方された錠剤または
ロゼンジの形態をとり得る。
【００９８】 吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、加圧されたパ
ックまたは噴霧器から、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、ト
リクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または
他の適切なガス）を使用して提供されるエアロゾルスプレーの形態で都合よく送
達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、測定された量を送達
するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器に
おいての使用のための（例えば、ゲラチンの）カプセルおよび薬包が、化合物お
よび適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）含有粉末混合物を処
方し得る。
【００９９】 化合物を全身に送達するのが望ましい場合、この化合物は、注射（例えば、ボ
ーラス注射または継続注入）によって非経口投与されるよう処方され得る。注射
のための処方物は、保存薬の入った単回投薬形態（例えば、アンプル中または複
数回用量の容器）において提供され得る。この組成物は、懸濁物、油状または水
性のビヒクル中の溶液またはエマルジョンのような形態を取り得、そして懸濁剤
、安定剤、および／または分散剤のような処方因子を含み得る。
【０１００】 非経口投与のための薬学的処方物は、水溶性の形態において活性化合物の水溶
液を含む。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な場合には、油状の注射懸濁物
として調製され得る。適切な脂肪親和性溶媒またはビヒクルは、脂肪油（例えば
、ごま油、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグ
リセリド））、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、懸濁物の粘性を増
大する物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、
またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、適切な安定化
剤または化合物の可溶性を増大して高濃度の溶液の調製を許容する因子を含む。
【０１０１】 あるいは、活性化合物は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含
まない滅菌水）とともに構成される粉末形態中にある。
【０１０２】 化合物はまた、直腸内または膣内用組成物に処方され得る（例えば、坐剤また
は保持型浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅｍａｓ）（例えば、ココアバターま
たは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む））。
【０１０３】 被験体は、任意のヒトまたは非ヒト脊椎動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウ
シ、ブタ）である。
【０１０４】 先に記載された処方物に加えて、化合物はまた、デポー剤調製物（ｄｅｐｏｔ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）として処方され得る。このような長時間作用する処
方物は、適切なポリマー物質または疎水性物質（例えば、受容可能な油中のエマ
ルジョン）またはイオン交換樹脂と共に処方され得るか、または可溶性の不足し
た誘導体として（例えば、可溶性の低い塩）として処方され得る。
【０１０５】 薬学的組成物はまた、適切な固相、またはゲル相のキャリアもしくは賦形剤を
含み得る。このようなキャリアもしくは賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸
カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエ
チレングリコールのようなポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】 適切な液体または固体の薬学的調製物形態は、例えば、以下である：吸入のた
めの水溶液または生理食塩水溶液、マイクロカプセル化、蝸牛殻状化（ｅｎｃｏ
ｃｈｌｅａｔｅｄ）、微視的な金粒子上でのコート化、リポソーム中への含有、
噴霧剤中、エアロゾル、皮膚移植のためのペレット剤、皮膚へ引っかくような鋭
利な物体上で乾燥される。薬学的組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コートされ
た錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁剤、クリ
ーム、ドロップ、または活性化合物の放出が延長された調製物（この調製物中に
賦形剤、添加物、および／または補助剤（例えば、崩壊剤、結合剤、コーティン
グ剤、膨張剤、滑沢剤、矯味剤、甘味料、または可溶化剤）が上に記載のように
慣用的に使用される）を含む。薬学的組成物は、種々の薬物送達系において使用
されるのに適切である。薬物送達の方法の簡潔な総説は、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３、１９９０であり、これは本明細書で参
考として援用される。
【０１０７】 組成物は、単位投薬形態で首尾良く提供され得、そして薬学の分野で周知の任
意の方法によって調製され得る。全ての方法は、活性な改変へパリナーゼを１以
上の修飾成分を構築するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、この組
成物は、ポリマーを、液体キャリア、微細固体キャリア、またはそれらの両方に
均一かつ親密に会合させること、必要な場合、この生成物を形成することによっ
て調製される。このポリマーは、凍結乾燥されて貯蔵され得る。
【０１０８】 他の送達システムは、時間放出送達システム、遅延放出送達システムまたは徐
放送達システムが挙げられ得る。このようなシステムは、本発明のへパリナーゼ
の繰り返し投与を回避し、被験体および医者の利便性を向上させる。放出送達シ
ステムの多くのタイプが、利用可能であり、そして当業者に公知である。これら
としては、以下が挙げられる：ポリマーベース系（例えば、ポリ乳酸およびポリ
グリコール酸、ポリ無水物およびポリカプロラクトン）；ステロールを含む脂質
である非ポリマー系（例えば、コレステロール、コレステロールエステルおよび
脂肪酸、または中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグ
リセリド））；ヒドロゲル放出系；シラスチック系；ペプチドベース系；ワック
スコーティング、従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠、部分的に融合し
た移植片など。具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：（ａ）浸食系（ここで、ポリサッカリドは、マトリクス内の形態で含まれ、
米国特許第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔ）；同第４，６６７，０１４号（Ｎ
ｅｓｔｏｒら）；ならびに同第４，７４８，０３４号および同第５，２３９，６
６０号（Ｌｅｏｎａｒｄ）に見出される）ならびに（ｂ）拡散系（ここで、活性
成分は、ポリマーを介して制御された速度で透過し、米国特許第３，８３２，２
５３号（Ｈｉｇｕｃｈｉら）および同第３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒｏ
ｎｉ）に見出される）。さらに、ポンプベースハードウェア送達系を使用し得、
これらのいくつかは、移植のために適用される。
【０１０９】 癌治療を受けている患者に投与される場合、へパリナーゼＩＩＩ化合物は、他
の抗癌剤を含むカクテル中で投与され得る。この化合物はまた、放射線治療の副
作用を処置する薬剤（例えば、抗嘔吐剤、放射線保護剤など）を含むカクテル中
に投与され得る。
【０１１０】 本発明の化合物と同時に投与され得る抗癌薬物としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾールヒドロク
ロリド；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼリシン（Ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ
）；アルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）；アルトレタミン；アンボマ
イシン；アメタントロンアセテート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナ
ストロゾール（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；アントラマイシン（Ａｎｔｈｒａｍ
ｙｃｉｎ）；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチ
ジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；
ベンゾデパ；ビカルトアミド（Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；ビサントレンヒド
ロクロリド；ビスナフィドジメシレート（Ｂｉｓｎａｆｉｄｅ Ｄｉｍｅｓｙｌ
ａｔｅ）；ビゼレシン（Ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；硫酸ブレオマイシン；ナトリウ
ムブレキナル；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン
；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン
；カルゼレシン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴール（Ｃｅｄｅｆｉｎ
ｇｏｌ）；クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）；シロレマイシン；シ
スプラチン；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）；クリスナトールメシレー
ト；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウ
ノルビシンヒドロクロリド；デシタビン；デキソルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａ
ｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセ
タキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）；ドキソルビシン；ドキソルビシンヒドロクロ
リド；ドロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタロ
ン（Ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；ズアゾマイシン
；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔ
ｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロマート（Ｅ
ｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピ
ルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラム
スチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エ
トプリン；塩酸ファドロゾール（Ｆａｄｒｏｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ）；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビ
ン；フルオロウラシル；フルロシタビン（Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホス
キドン；ナトリウムホストリエシン（Ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ）；
ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホ
スファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−
２ｂ；インターフェロンα−−ｎｌ；インターフェロンα−ｎ３；インターフェ
ロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン
（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；酢酸ランレオチド（
Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ Ａｃｅｔａｔｅ）；レトロゾール（Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ
）；酢酸ロイプロリド（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ Ａｃｅｔａｔｅ）；塩酸リアロ
ゾール（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ナトリウムロメ
トレキソール（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ Ｓｏｄｉｕｍ）；ロムスチン；塩酸ロソ
キサントロン（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；マ
ソプロコール；マイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）；塩酸メクロレタミン（
Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；酢酸メゲス
トロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプ
リン；メトトレキサート；ナトリウムメトトレキサート；メトプリン；メツレデ
パ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌ
ｌｉｎ）；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキ
サトロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン（Ｎｏｇａｌａｍ
ｙｃｉｎ）；オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン；パクリ
タキセル；ペガスパルガーゼ（Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペリオマイシン；
ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン（Ｐｅｐｌ
ｏｍｙｃｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）；ペルホスファミド（Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄ
ｅ）；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン
；プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ナトリウムプロフィマー；ポルフィ
ロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；塩酸プロ
マイシン；ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン（Ｒｉｂｏｐ
ｒｉｎｅ）；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール（Ｓａ
ｆｉｎｇｏｌ）；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホス
酸ナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；
スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリ
ゾマイシン；テコガランナトリウム（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ Ｓｏｄｉｕｍ）；テ
ガフール；塩酸テロキサトロン（Ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌ
ｏｒｉｄｅ）；テモポルフィン（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）；テニポシド；テロキ
シロン；テストラクトン；チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグア
ニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン（Ｔ
ｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレ
ストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレ
キサート；トリプトレリン；塩酸ルブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ
；バプレオチド；ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；硫酸ビンブラ
スチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；
硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイソシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロ
シジン；硫酸ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ）；ボロ
ゾール（Ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノス
タチン；塩酸ゾルビシン。
【０１１１】 このへパリナーゼＩＩＩ化合物はまた、標的分子に連結され得る。標的分子は
、特定の細胞または組織に対して特異的であり、そしてヘパリナーゼＩＩＩを細
胞または組織に指向するために使用され得る、任意の分子または化合物である。
好ましくは、この標的分子は、癌細胞または腫瘍と特異的に相互作用する分子で
ある。例えば、この標的分子は、腫瘍抗原を認識し、そしてそれと特異的に相互
作用する、タンパク質または他のタイプの分子であり得る。
【０１１２】 腫瘍抗原としては、以下が挙げられる：Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍ Ａ ＲＴ−１、
ジペプチジルペプチダーゼ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）ＩＶ
（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ−結合タンパク質（ａｄｅｎｏｓｉｎ
ｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＤＡｂｐ）、
シクロフィリンｂ、結腸直腸随伴抗原（ＣＲＱ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３
３、癌胚抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＥＡ
）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍ
ｌｌ、前立腺特異的抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ）（ＰＳＡ）およびその免疫原エピトープ（ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰ
ＳＡ−３）、前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅ
ｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＰＳＭＡ）、Ｔ−細胞レセプター／ＣＤ３−
ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａｌ、ＭＡＧＥ−
Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、Ｍ
ＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ
−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ
−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ
−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２，ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）
、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１，ＧＡＧＥ−２、Ｇ
ＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡ
ＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、Ｇｎ
Ｔ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、Ｈ
ＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カド
ヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇ
ｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、脳グリコーゲンホス
ホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、
ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、ＣＴ−７、ｃｄｃ２７、腺腫様ポリープ
大腸菌タンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ
ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰＣ）、ホドリン、Ｐ１Ａ、コネキシン３７、Ｉｇ−イデ
ィオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシドおよびＧＤ２ガングリオ
シド、ウイルス産物（例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原の
Ｓｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、ＥＢＶ−コード核酸抗原（ＥＢＮＡ）−１、
ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２。
【０１１３】 ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかまたは両方と結合
する腫瘍抗原の例は、以下の参考文献を参照のこと：
【０１１４】
【化１】 これらの抗原および他の抗原は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６０１に開
示される。
【０１１５】 本発明の開示を照らし合わせて、当業者は、標準的な技術（組換え技術、直接
的な合成、変異誘発などを含む）によって、ネイティブへパリナーゼまたは改変
へパリナーゼのいずれかの実質的に純粋な調製物を生成することを可能にする。
例えば、組換え技術を使用して、当業者は、配列番号１の適切なコドンを置換し
て、標準的な部位特異的変異誘発技術によって所望のアミノ酸の置換物を産生し
得る。明らかに、当業者はまた、部位特異的変異誘発のための開始点として遺伝
子コードの縮重にのみ起因する、配列番号１とは異なる任意の配列を使用し得る
。次いで、変異した核酸配列は、適切な発現ベクターにライゲーションされ、そ
してＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉのような宿主中で発現され得る
。次いで、この得られた改変へパリナーゼは、当該分野で周知の技術（以下に開
示される技術およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎら（１９９３）の技術が挙げられ
る）によって、精製され得る。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に純
粋」とは、タンパク質が、意図される使用のために実用的かつ適切である程度ま
で、他の物質を本質的に含まないことを意味する。実際に、タンパク質は、そし
て例えば、タンパク質の配列決定、または薬学的調製物の製造に有用であるよう
に十分に純粋であり、かつそれらの宿主細胞の他の生物学的構築物を十分に含ま
ない。
【０１１６】 別の実施形態のセットにおいて、本発明の実質的に純粋な改変へパリナーゼを
コードする単離された核酸が、提供される。核酸に関して本明細書中で使用され
る場合、用語「単離された」は、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によってインビボで増幅されること；（ｉｉ）クローニングによって組換えに
より産生されること；（ｉｉｉ）例えば、切断およびゲル分離によって精製され
ること；または（ｉｖ）例えば、化学的合成によって合成されることを意味する
。単離された核酸は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって、容易に操作
され得る核酸である。従って、ベクターに含まれるヌクレオチド配列であって、
その５’および３’制限部位が既知であるか、またはそのヌクレオチド配列につ
いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーが開示されているヌクレオチ
ド配列は、単離されると考えられるが、その天然の宿主中にネイティブな状で存
在する核酸配列は、単離されると考えられない。単離された核酸は、実質的に精
製され得るが、精製される必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発
現ベクター内で単離される核酸は、純粋でなく、ここで、この核酸は、この核酸
が通常存在する細胞における材料の低い割合のみを含み得る。しかし、このよう
な核酸は、この用語が本明細書中で使用される場合、単離される。なぜならば、
当業者に公知の標準的な技術によって容易に取り扱い可能であるからである。
【０１１７】 本明細書中で使用される場合、コード配列および調節配列は、コード配列の発
現または転写を調節配列の影響下または制御下に配置するような方法で共有結合
される場合、「作動可能に連結された」といわれる。コード配列が機能的タンパ
ク質に翻訳されることが所望される場合、コード配列は、調節配列に作動可能に
連結される。２本のＤＮＡ配列は、以下の場合に作動可能に連結される：５’調
節配列中のプロモーターの導入により、コード配列の転写が生じる場合、および
２本のＤＮＡ配列間の連結の性質により、（１）フレームシフト変異の導入を生
じるか、（２）コード配列の転写を指向するために、プロモーター領域の能力と
干渉するか、または（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の
能力と干渉する場合。従ってプロモーター領域が、このＤＮＡ配列の転写物を生
じ得、その結果、この得られた転写物が、所望のタンパク質またはポリペプチド
に翻訳される得た場合に、プロモーター領域は、コード配列に作動可能に連結さ
れる。
【０１１８】 遺伝子発現に必要な制御配列の正確な特徴は、種間または細胞型間で変化し得
るが、一般的に、必要に応じて、それぞれ転写のおよび翻訳の開始に関与する５
’非転写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング
配列、ＣＡＡＴ配列など）を含むべきである。特に、このような５’非転写調節
配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含
むプロモーター領域を含む。プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。
調節配列はまた、必要に応じて、エンハンサー配列または上流アクチベータ配列
を含み得る。
【０１１９】 本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、所望の配列が、異なる遺伝環境
間の輸送または宿主細胞における発現のために、制限およびライゲーションによ
って挿入され得る多数の核酸のいずれかであり得る。ベクターは、代表的には、
ＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターもまた使用し得る。ベクターとしては、プラ
スミドおよびファージミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニン
グベクターは、宿主細胞において複製し得、かつベクターが決定可能な様式で切
断され得かつ所望のＤＮＡ配列が連結され得る１つ以上のエンドヌクレアーゼ制
限部位によってさらに特徴付けられるベクターであり、その結果、新たな組換え
ベクターは、宿主細胞において複製するその能力を保持する。プラスミドの場合
、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌中のコピー数を増加する場合に、
多数回起こり得るか、この宿主が有糸***によって再生する場合には、宿主細胞
１つあたり一回だけ起こり得る。ファージの場合、複製は、溶解期の間に活発に
起こり得るか、または溶原期に不活発に起こり得る。発現ベクターは、所望のＤ
ＮＡ配列が制限およびライゲーションによって挿入され得るベクターであり、そ
の結果、これは調節配列に作動可能に連結され、そしてＲＮＡ転写物として発現
され得る。ベクターは、このベクターで形質転換またはトランスフェクトされた
かまたはされていない細胞の同定において使用するために適切な１つ以上のマー
カー配列をさらに含み得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化
合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少するタンパク質をコ
ードする遺伝子、その活性が当該分野で公知の標準アッセイによって検出可能な
酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコード
する遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトした細胞、宿主、コロニー
またはプラークの表現型に視覚的に影響を与える遺伝子が挙げられる。好ましい
ベクターは、これらのベクターが作動可能に連結されるＤＮＡセグメント中に存
在する構造遺伝子産物を自発的に複製および発現し得るベクターである。
【０１２０】 本明細書中で使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、当業者に公知
のパラメーターをいう。ストリンジェントな条件の一例は、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ポリビ
ニルピロリドン、０．０２％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２５ｍＭ Ｈａ
Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）における６５℃
でのハイブリダイゼーションである。ＳＳＣは、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム／
０．１５Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナ
トリウムであり；そしてＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸である。同じ程度
のストリンジェンシーを生じる、使用され得る他の条件、試薬などが存在する。
当業者は、このような条件を熟知しており、従って、これらの条件は、本明細書
中で示さない。当業者また、このような分子の発現について細胞をスクリーニン
グするための方法に熟知しており、従って、これらの分子は、慣用的に単離され
、続いて、適切な核酸が単離される。従って、本発明の実質的に純粋な改変ヘパ
リナーゼのホモログまたは対立遺伝子、ならびにこれらをコードする核酸は、慣
用的に得られ得、そして本発明は、開示される特定の配列に制限されることを意
図しない。
【０１２１】 原核生物系について、複製部位および宿主と適合性の種由来のコントロール配
列を含むプラスミドベクターが使用され得る。適切なプラスミドベクターの例と
しては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが挙げられ；適切なファー
ジベクターまたはバクテリオファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１
１などが挙げられ；そして適切なウイルスベクターとしては、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ
、ｐＫＲＣなどが挙げられる。好ましくは、本発明の選択されたベクターは、選
択された宿主細胞において自発的に複製する能力を有する。有用な原核生物宿主
としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ
，Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａなどのような細菌が挙げられる。
【０１２２】 原核生物細胞において本発明の実質的に純粋な改変ヘパリナーゼを発現するた
めに、本発明の実質的に純粋な改変ヘパリナーゼの核酸配列を、機能的原核生物
プロモーターに作動可能に連結することが必要である。このようなプロモーター
は、構成的であるか、または好ましくは調節可能（すなわち、誘導性または抑制
可能）のいずれかであり得る。構成的プロモーターの例としては、バクテリオフ
ァージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子配列のｂ
ｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーターなどが挙げられる。誘導性原核生
物プロモーターの例としては、バクテリオファージλの主要右プロモーターおよ
び主要左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター
、ｒｅｃＡプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ｌａｃＩプロモーターおよび
ｇａｌプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラーゼプロモーター（Ｕ
ｌｍａｎｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６〜１８２（１９８５
））およびζ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ３２：１１〜２０（１９８４））、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオ
ファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモータ
ー（Ｗａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８〜４７８（１９
８６））が挙げられる。
【０１２３】 原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１
：２７７〜２８２（１９８７））；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ
６８：５０５〜５１６（１９８６））；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５〜４４２（１９８４））により総説されてい
る。
【０１２４】 原核生物細胞における適切な発現はまた、コード配列の上流のリボソーム結合
部位の存在を必要とする。このようなリボソーム結合部位は、例えば、Ｇｏｌｄ
ら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５〜４０４（１９８１）
）により開示される。
【０１２５】 原核生物細胞は、正常な真核生物グルコシル化により本発明の改変ヘパリナー
ゼを産生しないため、真核生物宿主による本発明の改変ヘパリナーゼの発現は、
グリコシル化が所望される場合には可能である。好ましい真核生物宿主としては
、例えば、インビボまたは組織培養のいずれかにおける、酵母、細菌、昆虫細胞
および哺乳動物細胞が挙げられる。宿主として有用であり得る哺乳動物細胞とし
ては、ＨＥＬａ細胞、線維芽細胞由来の細胞（例えば、ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−
Ｋ１）、またはリンパ由来の細胞（例えば、ハイブリドーマＳＰ２／０−ＡＧ１
４またはメラノーマＰ３ｘ６３ｓｇ８）、およびそれらの誘導体が挙げられる。
好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ、ならびに正
確な翻訳後のプロセシングのより優れた能力を提供し得る神経芽細胞腫細胞株（
例えば、ＩＭＲ ３２２）が挙げられる。本発明のいくつかの局面によると、移
植可能器官の胚性細胞および成熟細胞もまた有用である。
【０１２６】 さらに、植物細胞もまた、宿主として使用可能であり、そして植物細胞と適合
性の制御配列（例えば、ノパリンシンターゼプロモーター配列およびポリアデニ
ル化シグナル配列）が使用可能である。
【０１２７】 別の好ましい宿主は、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ幼虫における昆虫細胞で
ある。昆虫細胞を宿主として使用して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコールデヒド
ロゲナーゼプロモーターを使用し得る（Ｒｕｂｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：
１４５３〜１４５９（１９８８））。あるいは、バキュロウイルスベクターが、
昆虫細胞において多量の本発明の改変ヘパリナーゼを発現するように操作され得
る（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３）１９８７）；Ｍｉｌｌｅ
ｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６）、Ｓｅｔｌｏｗ，
Ｊ．Ｋ．ら編、Ｐｌｅｎｕｍ、第８巻、２７７〜２９７頁）。
【０１２８】 解糖酵素をコードする遺伝子由来のプロモーターエレメントおよび終結エレメ
ントを組込み、酵母がグルコースを多く含む培地で増殖する場合に、多量に産生
される任意の一連の酵母遺伝子配列発現系がまた使用可能であり得る。公知の解
糖遺伝子配列はまた、非常に効率的な転写制御シグナルを提供し得る。酵母は、
それらがまた翻訳後のペプチド改変を行い得るという点で、かなりの利点を提供
する。強力なプロモーター配列、および酵母における所望のタンパク質の産生の
ために使用され得る高コピー数プラスミドを使用する、多数の組換えＤＮＡ法が
存在する。酵母は、クローン化哺乳動物遺伝子配列産物上のリーダー配列、およ
び分泌ペプチド保有リーダー配列（すなわち、プレペプチド）を認識する。
【０１２９】 広範な転写調節配列および翻訳調節配列は、宿主の特徴に基づいて用いられ得
る。転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス供給源（例えば、ア
デノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）由来であり得
、ここでこの制御シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子配列と会合
している。あるいは、哺乳動物発現産物（例えば、アクチン、コラーゲン、ミオ
シンなど）由来のプロモーターが用いられ得る。抑制または活性化を可能にする
転写開始調節シグナルが選択され得、その結果、遺伝子配列の発現が調節され得
る。温度感受性であり、その結果、温度を変えることによって、発現が阻止また
は開始され得る調節シグナル、または化学的（例えば、代謝）調節に供される調
節シグナルに興味がもたれる。
【０１３０】 上記のように、真核生物宿主における本発明の改変ヘパリナーゼの発現は、真
核生物調節領域の使用を必要とする。このような領域は、一般に、ＲＮＡ合成の
開始を指向するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモー
ターとしては、例えば、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（
Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３〜２８８（１９８２
））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ ３
１：３５５〜３６５（１９８２））；ＳＶ４０早期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓ
ｔら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４〜３１０（１９８１））；
酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１〜６９８５（１９８２）；Ｓ
ｉｌｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９
５１〜５９５５（１９８４））が挙げられる。
【０１３１】 広く知られているように、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、第１メチオニンをコー
ドするコドンにおいて開始される。このため、真核生物プロモーターと本発明の
改変ヘパリナーゼをコードするＤＮＡ配列との間の結合が、メチオニンをコード
し得るいずれの介在コドン（すなわち、ＡＵＧ）も含まないことを保証すること
が好ましい。このようなコドンの存在により、融合タンパク質の形成（ＡＵＧコ
ドンが本発明の改変ヘパリナーゼのコード配列と同じリーディングフレームに存
在する場合）、またはフレームシフト変異の形成（このＡｕｇコドンが、本発明
の改変ヘパリナーゼのコード配列と同じリーディングフレームに存在しない場合
）のいずれかが生じる。
【０１３２】 一実施形態において、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組込み得るベク
ターが用いられる。導入されたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組み込む細胞は
、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを再び導
入することによって、選択され得る。このマーカーは、例えば、栄養素要求性宿
主に原栄養体を提供し得るか、または例えば、抗生物質、重金属などに対する殺
菌耐性を与え得る。選択マーカー遺伝子配列は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に
直接連結され得るか、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入
され得るかのいずれかである。さらなるエレメントはまた、本発明のｍＲＮＡの
改変ヘパリナーゼの最適な合成に必要であり得る。これらのエレメントとしては
、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シ
グナルが挙げられる。このようなエレメントを組み込むｃＤＮＡ発現ベクターと
しては、Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９
８３）に記載されるベクターが挙げられる。
【０１３３】 好ましい実施形態において、導入された配列は、レシピエント宿主において自
発的に複製し得るプラスミドベクターまたはウイルスベクターに組み込まれる。
任意の広範なベクターが、この目的のために用いられ得る。特定のプラスミドま
たはウイルスベクターの選択において重要な因子としては以下が挙げられる：ベ
クターを含むレシピエント細胞が、認識され、そのベクターを含まないレシピエ
ント細胞から選択され得る容易さ；特定の宿主で所望されるベクターのコピーの
数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャッフル」し得ることが望ま
しいか否か。好ましい原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製し
得るようなプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｃｏｌｉｌ、ｐＳＣ１０１、ｐ
ＡＣＹＣ１８４、およびπＶＸ）が挙げられる。このようなプラスミドは、例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、Ｆｒｉｔｓｃｈ
，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８９）に開示される。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、
ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが挙げられる。このようなプラスミド
は、Ｇｒｙｃｚａｎ（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２）、３
０７〜３２９頁）に開示される。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドと
しては、ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：
４１７７〜４１８３（１９８７））、およびφＣ３１のようなストレプトミセス
バクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒら、Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ（
１９８６）、４５〜５４頁）が挙げられる。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏ
ｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３〜７０４（１９８６））、
およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９〜７４２（
１９７８））により総説される。
【０１３４】 好ましいし原核生物プラスミドとしては、例えば、ＢＰＶ、ＥＢＶ、ＳＶ４０
、２ミクロンサークルなど、またはそれらの誘導体が挙げられる。このようなプ
ラスミドは、当該分野で公知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔ
ｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５〜２７４（１９８２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，４４５〜４７０頁（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ
，Ｃｅｌｌ ２８：２０３〜２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９〜４８頁（１９８０）；Ｂａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒ
ｅａｔｉｓｅ，第３巻、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，５６３〜６０８（１９８０））。他の好
ましい真核生物ベクターは、ウイルスベクターである。例えば、制限しないが、
ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、および様々なレトロウ
イルスが用いられ得る。このウイルスベクターは、挿入ＤＮＡまたは挿入ＲＮＡ
の発現を生じるＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのいずれかを含み得る。さ
らに、本発明のポリペプチドの改変ヘパリナーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、細胞に直接注入され得るか、または微粒子に接着された後に、細胞膜を通
して挿入され得る。
【０１３５】 一旦構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列が、発現のために調製されると、
ＤＮＡ構築物は、種々の適切な手段（すなわち、形質転換、トランスフェクショ
ン、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈
殿、直接的な微小注入など）のいずれかによって、適切な宿主細胞に導入され得
る。ベクターの導入後、レシピエント細胞は、選択的な培地において増殖され、
これは、ベクター含有細胞の増殖について選択する。クローニングされた遺伝子
配列の発現は、本発明の改変されたヘパリナーゼの生成を生じる。これは、それ
自体でか、またはこれらの細胞が分化するのを誘導した後に、形質転換された細
胞において生じ得る（例えば、ブロモデオキシウラシルの神経芽腫細胞などへの
投与によって）。
【０１３６】 本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、実施例は、いかなる様式で
もさらなる制限として解釈されるべきではない。本願中に引用される全ての参考
文献（文献の参照、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属特許
出願）の全体の内容は、本明細書中に参考文献として明確に援用される。
【０１３７】 （実施例） （材料および方法：） （化学薬品および材料） ヒドロキシルアミン塩酸塩および尿素はＥＭ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）からであった。化学的改変試薬ジエチ
ルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）をＳｉｇｍａから購入し、そしてそのまま使用
した（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）。ヘパリン硫酸は、Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から購入された。Ｌｙｓｏｂ
ａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ（ＥＣ ３．４．２１．５０）由来のＬｙ
ｓ−Ｃは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からであった。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＥＣ４．２．２．８）由来のヘパリナーゼＩＩＩを、以前
に記載されたように精製し（Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ
．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６８４６−５２ならびにＬｏｈｓｅ，Ｄ．およ
びＬｉｎｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，
７８１−８７）、そしてＩＢＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａ
ｌ，Ｃａｎａｄａ）から贈呈された。
【０１３８】 （ヘパリナーゼＩＩＩ活性アッセイ） ヘパリナーゼＩＩＩの活性を、ヘパリナーゼＩおよびヘパリナーゼＩＩ（Ｇｏ
ｄａｖａｔｉ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＳａ
ｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６
８４６−５２；Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｈｕ，Ｙ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒ
ａｎ，Ｒ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１０１６０−６７；
ならびにＬｏｈｓｅ，Ｄ．およびＬｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９２）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，７８１−８７）について報告されたアッセイと同
様のＵＶ２３２ｎｍアッセイを使用して測定した。手短に言うと、時間の関数と
しての２３２ｎｍでの吸光度の増加を、飽和基質条件下でモニターした。全ての
アッセイを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６中２ｍｇ／ｍｌの濃度で、
硫酸ヘパリンを用いて行なった。酵素活性測定についての温度を、３５℃で一定
に維持した。
【０１３９】 （ＤＥＰＣを用いるヘパリナーゼＩＩＩの化学的改変） （（Ａ）ヘパリナーゼＩＩＩのＤＥＰＣ不活化） ６．０から８．０の範囲の
ｐＨ値で、ヘパリナーゼＩＩＩ（５０μｇ／ｍＬ）を、２５℃で５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液中のＤＥＰＣと共にインキュベートした。ＤＥＰＣストック溶
液（６．９Ｍ）をエタノールで希釈した。コントロール反応は、ＤＥＰＣの代わ
りに等量のエタノールを含み、実験の時間の範囲にわたって酵素活性に影響しな
いことが見出された。各ｐＨにおいて、３つの反応を、５０μＭから２．５ｍＭ
の範囲の異なるＤＥＰＣの濃度を使用して行なった。固定した時間間隔で、２５
μＬのアリコートをＵＶ２３２ｎｍ活性アッセイのために反応混合物から汲み出
した。
【０１４０】 ヘパリナーゼＩＩＩのＤＥＰＣ不活化の速度論を、（ＤＥＰＣの分解を説明す
るために）パーセント活性対調節された時間の自然対数をプロットすることによ
って決定した。手短に言うと、この調節された時間（ｔ’）を、以下の等式に従
って計算した：
【０１４１】
【数１】 この等式において、ｋ’は、ＤＥＰＣ加水分解についての一次速度定数であり
、そして、ｔは、ＤＥＰＣをヘパリナーゼＩＩＩ溶液に添加した後の測定された
時間である。各ｐＨにおいて、ＤＥＰＣの反応次数を、各ｐＨ対ｌｏｇ［ＤＥＰ
Ｃ］で、観察された不活化の速度定数をプロットすることによって決定した。こ
のグラフの勾配は、ｎ（ＤＥＰＣに関する反応次数）である（Ｌｕｎｄｂｌａｄ
，Ｒ．（１９９５）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）。
【０１４２】 （（Ｂ）ヒドロキシルアミンを用いるＤＥＰＣ改変酵素の再活性化） ヘパリ
ナーゼＩおよびＩＩ（Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌ
ａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６８４６−５２ならびにＳｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｈｕ
，Ｙ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７３，１０１６０−６７）を用いて完成したことと同様に、ヘパリナー
ゼＩＩＩ（５０μｇ／ｍＬ）を、その酵素活性がその最初の値の５０％まで減少
されるまで、０．９７ｍＭ ＤＥＰＣ、ｐＨ６．５と共にインキュベートした。
次いで、ヒドロキシルアミンを、０．５Ｍの最終濃度まで反応混合液に直ぐに添
加した。反応液を６時間室温でインキュベートした。アリコートを活性アッセイ
のために１時間ごとに汲み出した。コントロール混合物は、ＤＥＰＣを含まなか
ったが、非特異的活性の減少を説明するためにヒドロキシアミンと同じ濃度を含
んだ。コントロールの活性に対する反応混合物の活性の比率を計算し、酵素活性
の回復を決定する。
【０１４３】 （（Ｃ）ＤＥＰＣ不活化に対するヘパリナーゼＩＩＩの基質保護） ヘパリナ
ーゼＩＩＩ（５０μｇ／ｍＬ）を、１．５ｍＭ ＤＥＰＣの添加の前に３０分間
、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６中の２ｍｇ／ｍＬの硫酸ヘパリンと
共にプレインキュベートした。基質の先のインキュベーションを全く有さない、
コントロール反応をまた完成した。両方についての不活化の時間経過を、へパリ
ナーセＩＩＩ活性アッセイを使用して決定した。
【０１４４】 （（Ｄ）ＤＥＰＣによって改変されたヒスチジンの数の定量） ＤＥＰＣによる酵素の改変の程度は、Ｎ−カルベトキシルヒスチジル付加物の
形成を２４０ｎｍでモニタリングすることによって決定し得る。時間０において
、１．５ｍＭ ＤＥＰＣを、リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中にヘパリナ
ーゼＩＩＩを含むキュベットに添加した。２４０ｎｍにおける吸光度の変化を１
０分間１分毎にモニターした。改変された残基の数を、３，２００Ｍ−１ｃｍ− １ のモル吸光係数を使用して決定した（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．（１９９５）Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲ
Ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）。
【０１４５】 （ペプチドマッピング研究） どのヒスチジン残基が、ＤＥＰＣによって改変されるかを決定するために、プ
ロテアーゼＬｙｓ−Ｃを使用して、マッピング研究を完成した。ヘパリナーゼＩ
ＩＩ（１ｎｍｏｌｅ）を、１５分間４ｍＭ ＤＥＰＣと共にインキュベートし、
５５℃で６．５Ｍ尿素を用いて変成し、そして水を用いて希釈した。引き続き、
変成した改変されたヘパリナーゼＩＩＩをＬｙｓ−Ｃを用いて消化した。
【０１４６】 ヘパリナーゼＩＩＩ消化由来のペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＲＰＨＰＬＣ）によって分離し、そして２１０ｎｍ、２７７ｎｍ、および２４
０ｎｍにおいてモニターした。コントロール消化物中に存在しないペプチドピー
クを回収し、そして、オンラインモデル１２０ ＰＴＨアミノ酸分析器（Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＩＴ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４７７を使用して配
列決定した。
【０１４７】 （部位特異的変異誘発） ヘパリナーゼＩＩＩの１３個のヒスチジン残基の各々を、１５サイクル、重複
する伸長ＰＣＲを使用して、アラニンに対して変異誘発した（Ｈｉｇｕｃｈｉ，
Ｒ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ｇｅｌｆａｎ
ｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．編）１７
７〜８３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。ＰＣＲ反
応を可融アガロースゲル上で分離し、そして適切な分子量に対応するバンドを切
除した。ＤＮＡを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ
，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してゲルから抽出し、そして、インサートを
、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクロ
ーニングした。全ての点変異の有効性および遺伝子の残りの統合性を配列決定に
よって検証した。１３個の変異体ヘパリナーゼＩＩＩ配列を、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してｐＣＲ２．１中で
調製し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、発現のためにｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にクローニングした。ｐＥＴ−１５ｂプラスミド
は、Ｎｉ２＋カラム精製について、ＮＨ２末端Ｈｉｓタグを含む。組換えヘパリ
ナーゼＩＩＩをまた発現し、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕ
ｍから直接単離したネイティブのヘパリナーゼＩＩＩと比較した。
【０１４８】 （Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒ−ヘパリナーゼＩＩＩおよび変異体の発現、単離、
および精製） ０．０２ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ａｍｐ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ
ｉ（ＬＢ）ブロス（５ｍｌ）の一晩の培養物を使用して、０．１の最初のＯＤ６ ００ で、５００ｍｌ ＬＢ／ａｍｐ培養物を播種した。この培養物を、中間対数
期（ＯＤ６００ ０．７〜０．９）に１ｍＭイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導し、そして、３７℃でもう１時間インキ
ュベートした。細胞を収穫するために、培養物を５，０００ｒｐｍでスピンし、
そして上清を捨てた。
【０１４９】 細胞ペレットを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミ
ダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．９（最初の培養容量の１／５０）中で再懸濁した。
再懸濁した細胞を、氷上に配置し、そして、以前に記載されるように超音波処理
した（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，
Ｓ．Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．
およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１
５，５８９−９７）。細胞溶解物の可溶性タンパク質を、４℃で２０分間、１２
，０００ｒｐｍで遠心分離することによって単離した。上清を０．４５μｍフィ
ルターを通してろ過し、そして、Ｂｉｏｃａｄ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を使用して、ニッケルカラムにロードし
た。カラムを洗浄し、そして、タンパク質を引き続き、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５
００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．９中で溶出し
た。前もって成形された１２％ゲル、Ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＩＩ装置、およ
びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｕｓキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅ
ｓ，ＣＡ）を使用するＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を実施して、
個々のタンパク質の濃度および純度を決定した。
【０１５０】 （ヘパリナーゼＩＩＩ活性の糖類生成物のＨＰＬＣ分析） ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６中の３ｍｇ／ｍｌ硫酸ヘパラン
の徹底的な消化を、変異体（２０μｇタンパク質）の各々について、３７℃で一
晩行なった。反応液をＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｓ５ ＳＡＸカラム（Ｗａｔｅｒ
ｓ）にロードし、そして０．２〜１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ３．５の直線勾配を
使用して溶出した。生成物を、２３２ｎｍでモニターし、そして、主要なピーク
の各々を収集した。これらの組成を決定するために、収集された画分をキャピラ
リー電気泳動によって分析し、そして、公知の標準との同時移動によって同定し
た。
【０１５１】 （円二色性（ＣＤ）） 組換え的に発現されたヘパリナーゼＩＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩ変異体（
Ｈ２９５ＡおよびＨ５１０Ａ）を濃縮し、そして、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０
Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓ
ｅｔｔｓ）を使用して、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中に緩衝液交換
した。ＣＤスペクトルを、温度自動制御機を備え、そしてＩＢＭマイクロコンピ
ューターにインターフェースしたＡｖｉｖ ６２ＤＳ分光偏光計で収集した。測
定を、１ｍｍの路程を有する石英セル中で実施した。スペクトルを、１．０ｎｍ
のバンド幅および３ｎｍ／分のスキャン速度で、２０５ｎｍと２６０ｎｍの間の
１０スキャンの平均で、２５℃で記録した。ＣＤバンド強度を、度・ｃｍ２・ｄ
ｍｏｌ−１でモル楕円率（θＭ）として表す。
【０１５２】 （Ｂ１６細胞のトランスフェクション：） Ｂ１６ＢＬ６黒色腫細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１中のアンチセンス２ＯＳＴを用
いてトランスフェクトした。適切なトランスフェクト体クローンを、Ｇ４１８を
用いて選択し、そして増殖した。トランスフェクションの成功を、トランスフェ
クション細胞のＰＣＲスクリーニングを用いて確認した。
【０１５３】 （インビトロ侵襲アッセイ：） １０５個のＢ１６ＢＬ６およびＢ１６ＢＬ６トランスフェクト体を、１５μｇ
のＭａｔｒｉｇｅｌを用いてコートしたインサートにロードした。４０ｎｇ／ｍ
ｌのｂＦＧＦを含むＭＥＭ−αを、化学誘引物質として使用した。３７℃での２
０時間のインキュベーション後、インサートを固定し、そして染色した。非遊走
細胞を除去し、そして、遊走細胞を光学顕微鏡下でカウントした。
【０１５４】 （インビボ原発性腫瘍増殖：） ４×１０５個のＢ１６ＢＬ６（それぞれトランスフェクトされたかまたはトラ
ンスフェクトされていない）を、ヌードマウスの横腹に皮下注射した。腫瘍の大
きさの測定を、腫瘍細胞注射後、１０日目で開始し、そして、マウスを、注射後
１６日目で安楽死させた。
【０１５５】 （インビボ肺転移：） ０．２ｍｌＰＢＳ中、２×１０５個のＢ１６ＢＬ６（それぞれトランスフェク
トされたかまたはトランスフェクトされていない）を、Ｃ５７ＢＬ６マウスの尻
尾の静脈を介して注射した。１３日後、マウスを安楽死させ、肺を収穫し、そし
て分析した。
【０１５６】 （Ｂ１６細胞のヘパリナーゼ処理に起因するＨＬＧＡＧの組成分析） Ｂ１６細胞をヘパリナーゼＩ、ＩＩＩまたはＰＢＳのいずれかで処理した。こ
の上清を収集し、煮沸しそして０．４５μｍフィルターを通して濾過した。次い
で、このサンプルを、５ｋＤａの名目分子量カットオフを伴うセントリコンスピ
ンカラムを使用する分画に供した。この残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を水へ移
し、そして凍結乾燥によって５０倍濃縮した。
【０１５７】 オリゴ糖の組成分析を、ヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩでの高分子量画分の徹底的な
消化によって完了した。９μｌのオリゴ糖水溶液に、２５ｍＭの酢酸ナトリウム
、２ｍＭの塩化カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に１ｍＵのヘパリナーゼＩ〜
ＩＩＩを添加した。この反応を、ＣＥ分析が完了した後、３７℃で一晩進行させ
た。
【０１５８】 組成分析を、非コーティング石灰ガラスキャピラリー（内径７５μＭ）を使用
することによってＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ３Ｄ ＣＥユニットにおい
て完了した。分析物を、長い経路長のキャピラリーを使用して測定した。この電
解液は、５０ｍＭ トリス／リン酸塩（ｐＨ２．５）であった。分離を、リバー
スポラリティを用いて３０ｋＶで実行した。ジサッカライドの割当ておよび定量
を、既知の標準と比較して行なった。
【０１５９】 （結果） （実施例１：ＤＥＰＣはヘパリナーゼＩＩＩを不活化する） ヘパリナーゼＩＩＩの酵素学的活性に重要であるヒスチジンを同定するための
第１の工程として、ヘパリナーゼＩＩＩの酵素学的活性に対する修飾試薬ＤＥＰ
Ｃの効果を決定した。ＤＥＰＣは、酵素における触媒的に重要なヒスチジンの決
定のために使用される通常の試薬である。早期の刊行物（Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，
Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，およびＳａｓｉｓｅｋｈ
ａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６８４６−５２
およびＳｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．Ｈｕ．Ｙ．，およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ
．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１０１６０−６７）に示され
るように、ＤＥＰＣは、触媒的に重要なヒスチジンの決定に有用であるが、他の
求核性残基（すなわち、チロシン、リシンおよびシステイン）は修飾されないこ
とを保証するように注意を払う必要がある。
【０１６０】 ヘパリナーゼＩＩＩを、ｐＨ６．５および２５℃で０．３１ｍＭ（□）、０．
５４ｍＭ（■）、０．９７ｍＭ（○）、１．５ｍＭ（▲）、１．９ｍＭ（△）の
ＤＥＰＣと共にインキュベートした（図１の挿入図に示す）。残っている活性の
パーセントの対数を、ＤＥＰＣの分解を計上するために調整された時間（ｔ’）
に対してプロットした。種々のＤＥＰＣ濃度における線の各々の勾配は、不活化
の擬一次速度定数を示す。それぞれのＤＥＰＣ濃度に対するこれらの擬一次速度
定数のプロットは、不活性の二次速度定数０．２０±０．０４ｍＭ−１分―１を
生じる。
【０１６１】 ヘパリナーゼＩＩＩに関して、ヘパリナーゼＩおよびＩＩと同様に、ＤＥＰＣ
が、用量依存様式で阻害することを見出した。測定された二次速度定数０．２０
±０．０４ｍＭ−１分―１は、インヒビターの濃度を変化させることによって得
られる。ヘパリナーゼＩＩＩとＤＰＣの両方において一次であるこの反応との一
致に、ｋｉｎａｃｔ対ｌｏｇ［ＤＥＰＣ］のプロットは、勾配１を有する線を生
じた（図１）。
【０１６２】 ＤＥＰＣが、擬一次の用量依存様式でヘパリナーゼＩＩＩを不活化するという
事実は、ＤＥＰＣが、硫酸ヘパランの触媒的な分解に関与する残基を直接的に修
飾することを示唆する。不活化の二次速度定数（０．２０±０．０４ｍＭ−１分 ―１ ）はまた、ＤＥＰＣが、ヘパリナーゼＩＩＩ機能の強力なインヒビターであ
ることを示唆する。
【０１６３】 ヘパリナーゼＩＩＩとＤＥＰＣとの相互作用が、ヒスチジン修飾を通してであ
ることを保証するために、本発明者らは、ヘパリナーゼＩＩＩの他の求核性アミ
ノ酸が、ＤＥＰＣと相互作用するかどうかを調べた。まず、ヘパリナーゼＩまた
はＩＩとは違って、ヘパリナーゼＩＩＩは、その一次アミノ酸配列にシステイン
を含まないので、システイン修飾の可能性はない。さらに、チロシンが修飾され
なかった場合は予想されように、ヘパリナーゼＩＩＩとＤＥＰＣのインキュベー
ションの際に２７８ｎｍにおける吸光度の損失がなかった。最後に、ＤＥＰＣ修
飾ヘパリナーゼＩＩＩへのヒドロキシアミンの添加は、強くこの不活化にほとん
どを逆転した、このことは求核性残基（例えば、リジン）が、ＤＥＰＣによって
修飾されなかったことを示す（表１）。
【０１６４】
【表１】 ヘパリナーゼＩＩＩのヒスチジンとＤＥＰＣとの相互作用をさらに規定する試
みにおいて、不活化速度論に対するｐＨの効果を試験した。ｐＨの関数としての
不活化の速度の試験を使用して、修飾された残基に対するｐＫａを誘導した。な
ぜならヒスチジンの場合、非プロトン化形態は、プロトン形態よりも容易に修飾
されるからである。不活化の二次速度定数のｐＨ依存性を、図２に示す。（ヘパ
リナーゼＩＩＩを、２５℃、ｐＨ６．０〜８．０で、５０μＭ〜２．５ｍＭのＤ
ＥＰＣと共にインキュベートし、そして不活化の二次速度定数を、各ｐＨについ
て計算した）。ヘパリナーゼＩＩＩを用いる場合、反応のｐＨを６．０から７．
５へと増大することは、反応の次数を変化させずに不活化速度論の増大を生じる
（図２）。しかし、ｐＨ８．０およびより高いｐＨにおいて、この反応は、ＤＥ
ＰＣにおいてもはや一次ではなく、このことは他の残基（おそらくリジン）が、
このｐＨにおいてＤＥＰＣと相互作用をすることを示す。この解釈に一致して、
ヒドロキシアミンは、ｐＨ８．０において休止をもはや逆転できない。従って、
以下に記載されるマッピング研究および基質保護実験をｐＨ７．０において実施
した。これらの実験は、反応性を最大にすると同時にヒスチジンのみが、ＤＥＰ
Ｃ修飾の標的であったと保証した。
【０１６５】 ヘパリナーゼＩＩＩにおけるＤＥＰＣ修飾化ヒスチジン残基を、定量化した（
図３に示す）。０時間において、１．５ｍＭのＤＥＰＣを、リン酸ナトリウム（
ｐＨ７．０）中にヘパリナーゼＩＩＩ（５４０μｇ／ｍＬ）を含むキュベットに
添加した。２４０ｎｍにおける吸光度の変化を、１０分間の時間間隔においてモ
ニターした。修飾化ヒスチジンの数を、ε＝３２００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して
計算した。実験の最初と最後において、ヘパリナーゼＩＩＩのアリコートを、収
集し、そして活性について試験した。最初の活性の５％未満が、ＤＥＰＣとの１
０分間のインキュベーション後残存した。
【０１６６】 ＤＥＰＣが、ヘパリナーゼＩＩＩにおけるヒスチジン残基と相互作用ていると
いう考えと一致して、時間の関数として２４０ｎｍにおける吸光度の増大が存在
し、Ｎ−カルベトキシヒスチジル誘導体から得られた。図３は、修飾ヒスチジン
の数の定量化を示す。１０分間の過程にわたって、１酵素分子あたり１．８個の
ヒスチジンが、修飾され、９０％を超える活性の消失を生じた。従って、ＤＥＰ
Ｃによって修飾された、１つまたはおそらく２つのヒスチジンは、ヘパリナーゼ
ＩＩＩに関する酵素学的活性の消失を生じるようである。
【０１６７】 ＤＥＰＣによるヘパリナーゼＩＩＩの不活化の基質保護をまた、評価した（図
４）。ヘパリナーゼＩＩＩ（５０μｇ／ｍＬ）を、２ｍｇ／ｍＬの硫酸ヘパラン
と３０分間インキュベートした。１．５ｍＭのＤＥＰＣを、この反応に添加し、
そして不活化のタイムコースを、ヘパリナーゼＩＩＩ活性アッセイを使用して完
了した（Ｏ）。硫酸ヘパランとのプレインキュベーションなしのコントロール反
応もまた行った（□）。
【０１６８】 ＤＥＰＣの添加まえの硫酸ヘパラン基質とのヘパリナーゼＩＩＩのプレインキ
ュベーションは、より低い不活化速度論を生じた（図４）、これは、ＤＥＰＣに
よって修飾されるヒスチジンが、ヘパリナーゼＩおよびＩＩに関して観察された
こと類似して、ヘパリナーゼＩＩＩの基質結合部位および／または活性部位に近
いことを示唆した（Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｌａ
ｎｇｅｒ，Ｒ．，およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６８４６−５２、およびＳｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｈｕ
．Ｙ．，およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７３，１０１６０−６７）。
【０１６９】 （実施例２：ＤＥＰＣによって修飾されたヒスチジンのペプチドマッピング） 酵素学的活性の消失を生じたＤＥＰＣによって修飾されたヒスチジンを同定す
るために、ＤＥＰＣ修飾化ヘパリナーゼＩＩＩを、Ｌｙｓ−Ｃで消化した。コン
トロール消化物と比較して保持時間および２４０ｎｍにおける吸光度の増加を有
するペプチドを、収集しそして配列決定した（図５）。変化した保持時間および
２４０ｎｍでの増加した吸光度を有する３つのペプチドを単離しそして配列決定
した。これらのペプチドのうち２つは、ヒスチジン２９５を含み、そして１つは
、修飾化ヒスチジン残基を含まなかった。
【０１７０】 ＤＥＰＣ反応性ヒスチジンの標識化を、まず、ＤＥＰＣとヘパリナーゼＩＩＩ
を反応させること、次いで尿素中でこのタンパク質を変性することによって変性
した。Ｌｙｓ−Ｃを用いて一晩消化後、得られたペプチドを、１２０分にわたる
１．６％−７８．４％のアセトニトリルグラジエントを使用することによって分
離した（これは、ランの開始時に５分間のイソラティク（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
相（１．６％のアセロニトリル、０．１％のトリフルオロ酢酸）を含む）。Ｌｙ
ｓ−Ｃペプチドを、２１０ｎｍ、２４０ｎｍおよび２７７ｎｍにおいてモニター
した。新しいペプチドピーク（コントロール消化物において存在せず、そして２
７７ｎｍにおいて著しい吸収を有する）を収集しそして配列決定した。これらの
ペプチドを、クロマトグラムにおいてアスタリスクを用いて印した。６２分およ
び７１分において移動したペプチドは、ヒスチジン２９５を含む配列：ＱＶＹＡ
ＤＧＭＱＦＥＬＳＰＩＹＨＶＡＡＩＤＩＦＬＫ（配列番号３）を含んだ。もう１
つと一致して標識されたペプチドは、ヒスチジンを含まなかった。図５Ａは、Ｄ
ＥＰＣに暴露されなかったヘパリナーゼＩＩＩのＬｙｓ−Ｃ消化物のＣ４ ＲＰ
ＨＬＰＬＣプロフィールを示し、そして図５Ｂは、ＤＥＰＣで標識されたヘパリ
ナーゼＩＩＩのペプチドプロフィールを示す。
【０１７１】 （実施例３：ヘパリナーゼＩＩＩの部位特異的変異誘発） マッピング研究と並行して化学的修飾実験の結果を確認するために、ヘパリナ
ーゼＩＩＩに存在する１３個のヒスチジン残基各々を、アラニンに変異させた。
組換えヘパリナーゼＩＩＩ変異体タンパク質を発現され、精製しそして硫酸ヘパ
ランに対する酵素学的活性を評価した（表２）。
【０１７２】
【表２】 ａ硫酸ヘパランに関する分子量１５ｋＤａと仮定して起算された。
【０１７３】 ｂタンパク質発現レベルが、ヘパリナーゼＩＩＩ速度論アッセイにとって低す
ぎる。
【０１７４】 コントロールとして、推定シグナル配列を含まないｒ−ヘパリナーゼＩＩＩ構
築物を発現させた。全ての組換え酵素調製物の濃度および純度、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを使用して決定した。組換え発現されたヘパリナーゼＩＩＩをまた、Ｆ．ｈｅ
ｐａｒｉｎｕｍから単離されたヘパリナーゼＩＩＩと比較して、同じ分子量であ
ることを保証した。硫酸ヘパランの徹底的なヘパリナーゼＩＩＩ消化物のＳＡＸ
分析を、図６において示す。ヘパリナーゼＩＩＩ（２０μｇ／ｍＬ）を、３７℃
で、４ｍｇ／ｍＬの硫酸ヘパランと共に一晩インキュベーションした。この反応
を、ＳＡＸカラムにロードし、そして糖生成物を、０．２〜１．０ＭのＮａＣｌ
（ｐＨ３．５）のグラジエントを３０分間にわたって使用して溶出し、そして２
３２ｎｍにおいてモニターした。（Ａ）Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナ
ーゼＩＩＩで消化した硫酸ヘパラン。（Ｂ）組換えヘパリナーゼＩＩＩで消化し
た硫酸ヘパラン。（Ｃ）Ｈ２９５Ａ変異酵素で消化した硫酸ヘパラン。（Ｄ）Ｈ
５１０Ａ変異酵素で消化した硫酸ヘパラン。（Ｅ）Ｈ１０５Ａ変異酵素で消化し
た硫酸ヘパラン。
【０１７５】 両方の酵素は、硫酸ヘパランに対する類似の速度論活性を示し、ＳＡＸ−ＨＰ
ＬＣによって決定した場合同じ分解プロフィールを生じた（図６）。次いで、徹
底的な消化の生成物を、キャピラリー電気泳動を使用して分析した。ＳＡＸ−Ｈ
ＰＬＣクロマトグラムにおいて観察された第１の主要なピーク（５分）は、ΔＵ
−ＨＮＡｃと同一である移動時間を有する。第２のピーク（７．５分）は、ΔＵ
−ＨＮＣと同一である移動時間を有する（データは示していない）。従って、組
換えヘパリナーゼＩＩＩによる硫酸ヘパラン分解は、野生型ヘパリナーゼＩＩＩ
の分解に同一の生成物プロフィールを生じ、このプロフィールは、少なくとも機
能的には、これらの酵素が、同じであることを示す アラニン残基によるヒスチジン２９５およびヒスチジン５１０の置換は、硫酸
ヘパランに対するヘパリナーゼＩＩＩの活性を完全に取り除いた（表２）。Ｈ２
９５Ａ変異体酵素およびＨ５１０Ａ変異体酵素は、発現レベルまたは分子量に関
して差異を示さなかった。しかし、Ｈ２９５ＡおよびＨ５１０Ａに対する速度論
データと徹底的な消化プロフィールの両方は、酵素が、完全に不活性であること
示唆する（図６）。ｒ−ヘパリナーゼＩＩＩと比較した場合、ヒスチジン変異体
のうち９つ（Ｈ３６Ａ、Ｈ１５２Ａ、Ｈ２２５Ａ、Ｈ２３４Ａ、Ｈ２４１Ａ、Ｈ
４６９Ａ、Ｈ４２４Ａ、Ｈ５１０ＡおよびＨ５３９Ａ）は、組換えタンパク質収
率、酵素活性または速度論パラメーターにおける有意な変化を示さなかった。十
分に興味深いことに、１３個のヒスチジン変異体のうち３つ（Ｈ１０５Ａ、Ｈ１
１０ＡおよびＨ１３９Ａ）は、組換えヘパリナーゼＩＩＩまたは他の変異体のい
ずれかよりも大いに少ない組換えタンパク質を生じた。より低いタンパク質レベ
ルにかかわらず、Ｈ１１０ＡおよびＨ１３９Ａ変異タンパク質は、速度論分析を
行えたが、Ｈ１０５Ａ変異体タンパク質は、行えなかった。しかし、硫酸ヘパラ
ン一晩消化物のＳＡＸ−ＨＰＬＣは、より低いレベルの組換え発現にもかかわら
ず、これらの過少発現された酵素の３つすべてが、触媒活性を保持することに確
認した（図６）。
【０１７６】 組換え発現されるヘパリナーゼＩＩＩ、Ｈ２９５Ａ変異体、およびＨ５１０Ａ
変異体を、円偏光二色性（ＣＤ）を使用して比較した。組換え体ヘパリナーゼＩ
ＩＩおよびＨ２９５Ａ変異体酵素の円偏光二色性分析を図７に示す。組換え体ヘ
パリナーゼＩＩＩ（黒丸）、Ｈ２９５Ａ変異体酵素（白丸）、およびＨ５１０Ａ
変異体酵素（黒四角）を濃縮し、緩衝液を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０に交換した。２５℃で１ｍｍの経路長を有する石英セルを使用して読み
を取った。スペクトルを、２０５ｎｍと２６０ｎｍとの間で、１０回のスキャン
の平均で記録した；バンド幅は、１．０ｎｍであった；そしてスキャン速度は、
３ｎｍ／分であった。ＣＤバンド強度は、モル楕円率θＭ（度ｃｍ２ｄｍｏｌ− １ ）として表現する。
【０１７７】 ヒスチジン２９５および／またはヒスチジン５１０が、酵素の折り畳みまたは
三次構造にどうにかして原因であり、かつ直接触媒作用に関与しなかったという
可能性が残っていた。しかし、Ｈ２９５ＡおよびＨ５１０ＡについてのＣＤスペ
クトルは、組換え体ヘパリナーゼＩＩＩのＣＤスペクトルとほぼ同一であった（
図７）。ＣＤプロフィールの近い同一性はＣＤプロフィールに表されないヒスチ
ジン２９５およびヒスチジン５１０の周りの局所的な環境に摂動が存在する可能
性を妨げないが、ヒスチジン２９５およびヒスチジン５１０をアラニンに変異さ
せることによって誘導される全体のコンフォメーション変化がないことを示唆す
る。
【０１７８】 （実施例４：ヘパリナーゼＩおよびＩＩＩ ｒｅ腫瘍増殖および転移の比較） ヘパリナーゼＩおよびＩＩＩ（ＨＬＧＡＧの切断に関して非常に異なる基質特
異性を有する）を、腫瘍増殖および転移におけるＨＬＧＡＧの役割を調査するた
めのツールとして使用した。ヘパリナーゼＩはＨＬＧＡＧの高度に硫酸化された
領域において切断するが、ヘパリナーゼＩＩＩのみが多糖類鎖の過小硫酸化領域
において切断し、これによって、これらの酵素は、発生、形態形成、新脈管形成
などにおけるＨＬＧＡＧのインビボおよびインビトロの役割を調査するのに強力
なツールになる。腫瘍増殖および転移におけるＨＬＧＡＧの役割を調べるために
、本発明者らは、モデル系としてＢ１６ＢＬ６メラノーマを使用し、そして原発
性腫瘍増殖と腫瘍転移との両方を調査するために、ヘパリナーゼＩまたはＩＩＩ
のいずれかで腫瘍保持マウスを処理した。この例と一致して、ヘパリナーゼＩは
、腫瘍増殖を加速した（図８）。ヘパリナーゼＩの０．５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬
量において、腫瘍増殖は、約３９％増加した。しかし、最も驚くべきことに、ヘ
パリナーゼＩＩＩは、原発性腫瘍増殖を阻害した（図８）。ヘパリナーゼＩＩＩ
によるメラノーマ増殖の阻害は、用量依存的であることが示された。ヘパリナー
ゼＩＩＩによる原発性腫瘍増殖の阻害は、最初に、２ｍｇ／ｋｇ／日で観察され
た。腫瘍増殖は、１２ｍｇ／ｋｇ／日（この研究において試験された最大投薬量
）で７３％阻害した（図８）。熱不活化されたヘパリナーゼＩＩＩで処理された
コントロールマウスは、ＰＢＳで処理されたマウスの増殖曲線に匹敵する増殖曲
線を示し（図８）、ヘパリナーゼＩＩＩの触媒活性が原発性腫瘍増殖を阻害する
ヘパリナーゼＩＩＩの能力の原因であったことを示唆する。腫瘍サンプルの組織
学的試験は、ヘパリンＩＩＩ処理腫瘍において増加したアポトーシスを明らかに
したが、一方、ヘパリナーゼＩ処理された腫瘍は、減少したアポトーシスを明か
にした。
【０１７９】 マウスを、Ｂ１６ＢＬ６メラノーマを用いた腫瘍移植の１５日後に試験した。
０．１ｍｌ ＰＢＳ中の４×１０５個の対数増殖期のＢ１６ＢＬ６メラノーマ細
胞を、１日目にＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。０．１ｍｌのＰＢＳ
、熱不活化ｈｅｐ ＩＩＩまたは活性ヘパリナーゼＩＩＩ（２ｍｇ／ｍｌ、組換
え発現され、精製され、ＰＢＳで緩衝液交換され、そして濃縮された）の毎日の
注射を４日目に開始し、そしてこの試験を通して、続けた。７日目に、ＰＢＳま
たは３ｍｇ／ｍｌ ｈｅｐ ＩＩＩを含む浸透圧ポンプ（１時間当たり０．５μ
ｌで送達する１００μｌ容量）を、腫瘍部位から離れた場所に皮下的に移植した
。マウスを１５日目に屠殺した。視覚的検査時に、ＰＢＳまたは不活化Ｈｅｐ
ＩＩＩで処理されたコントロールのマウスは、活性なＨｅｐ ＩＩＩで処理され
たマウスよりも有意に大きい腫瘍の塊を有した。
【０１８０】 図８は、上記マウスから単離された腫瘍の腫瘍容積を示す。腫瘍容積は、カリ
パーを用いて７日後に毎日測定し、そして式［容積＝０．５２×（幅）２×（長
さ）］を用いて計算した。このデータは、ＰＢＳ、不活化ｈｅｐ ＩＩＩおよび
活性ｈｅｐ ＩＩＩを用いて処理されたメラノーマを有するマウスの増殖曲線と
して示す。
【０１８１】 これらの観察が選択された腫瘍モデルに限定されなかったことを確認するため
に、ｈｅｐ ＩＩＩを使用してＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）腫瘍を有するマウスを
処理した。ＰＢＳまたはヘパリナーゼＩＩＩのいずれかで処理されたＣ５７ＢＬ
／６マウスにおけるＬＬＣ腫瘍についての原発性腫瘍増殖の増殖曲線をプロット
した。４×１０５個の対数期ＬＬＣ細胞を１日目にマウスの側腹部に皮下的に注
射した。０．１ｍｌのＰＢＳまたは２ｍｇ／ｍｌの組換え的に発現されたヘパリ
ナーゼＩＩＩのいずれかの毎日の注射を、４日目に開始し、そしてこの試験を通
して、続けた。８日目に、ＰＢＳまたは３ｍｇ／ｍｌ ｈｅｐ ＩＩＩを含む浸
透圧ポンプ（１時間当たり０．５μｌで送達する１００μｌ容量）を、腫瘍部位
から離れた場所に皮下的に移植した。マウスを２０日目に屠殺した。尾静脈を介
して注射されたＬＬＣ細胞の肺転移を多数の肺小節として定量化した。対数増殖
ＬＬＣ細胞を３０秒間トリプシン処理し、そしてＰＢＳ中で１ｍｌ当たり１×１
０６の最終濃度に再懸濁した。実験群について、細胞を３７℃で３０分間、２０
０ｎｍ ｈｅｐ ＩＩＩとともにインキュベートし、その後、尾静脈を介して０
．２ｍｌの細胞懸濁液を注入した。尾静脈注射の１２日後にマウスを安楽死させ
、肺を採取し、水道水でリンスし、そしてＢｏｕｉｎ溶液中で一晩固定した。肺
表面上の小節の数を、解剖顕微鏡の補助により数えた。
【０１８２】 Ｂ１６ＢＬ６と同様に、１日当たり１２ｍｇ／ｋｇでのＬＬＣ腫瘍保有マウス
のヘパリナーゼＩＩＩ処置は、腫瘍増殖における阻害を示した。さらに、ヘパリ
ナーゼＩＩＩ処置においてＬＬＣ細胞に存在するＨＬＧＡＧコート（およびＨＬ
ＧＡＧフラグメントの存在）の除去は、Ｂ１６ＢＬ６実験と同様に、ＬＬＣ細胞
が肺においてコロニー形成することを阻害した。本発明者らは、ＬＬＣ細胞から
誘導されるＨＬＧＡＧフラグメントが、Ｂ１６ＢＬ６の腫瘍増殖および転移を支
持する能力または阻害する能力のいずれかについて調査した。ヘパリナーゼＩと
ＩＩＩとの両方が産生する、ＬＬＣ細胞由来のＨＬＧＡＧフラグメントを単離し
、ＰＢＳ中で採取した。Ｂ１６ＢＬ６の結果と一致して、ヘパリナーゼＩ産生Ｌ
ＬＣ ＨＬＧＡＧフラグメントは、Ｂ１６ＢＬ６腫瘍細胞の増殖を促進したが、
一方、ヘパリナーゼＩＩＩ産生ＬＬＣ ＨＬＧＡＧフラグメントは、Ｂ１６ＢＬ
６細胞の増殖に対して最小の影響を示した。同様に、Ｂ１６ＢＬ６細胞をマウス
への注射の前に、ヘパリナーゼ誘導ＬＬＣ ＨＬＧＡＧフラグメントとともにイ
ンキュベートした場合、ヘパリナーゼＩＩＩ誘導ＬＬＣ ＨＬＧＡＧフラグメン
トは、肺に対するＢ１６ＢＬ６転移を阻害した。従って、インビトロ細胞培養実
験とともに、インビボ研究は、種々の腫瘍細胞型の腫瘍形成能を減少させるｈｅ
ｐ ＩＩＩの酵素的作用を示す。
【０１８３】 ヘパリナーゼが腫瘍細胞に対して作用し得る２つの可能な機構がある。例えば
、細胞のヘパリナーゼＩＩＩ処理は、それらの独特の表面ＨＬＧＡＧコートを失
う細胞を生じ得、これは、増殖するかまたは転移するそれらの能力に直接的また
は間接的に影響する。他方、細胞のヘパリナーゼＩＩＩ処置はまた、異なるＨＬ
ＧＡＧフラグメントの産生を生じ、次いで、これらのフラグメントは、腫瘍細胞
機能を直接的または間接的に調節し得る。ヘパリナーゼＩＩＩがこれらの機構の
いずれか１つかまたはこれらの機能のいくつかの組み合わせによって機能し得る
と考えられる。さらに作用機構を調査するために、本発明者らは、Ｂ１６ＢＬ６
細胞をヘパリナーゼＩまたはＩＩＩのいずれかで処理して、腫瘍細胞表面のＨＬ
ＧＡＧコートを除去した。興味深いことに、ヘパリナーゼＩまたはＩＩＩのいず
れかによるＨＬＧＡＧコートの除去は、未処理の細胞と比べて、これらの細胞が
マウスにおいて増殖する能力に効果を有さない。以下に示されるように、本発明
者らは、ＨＬＧＡＧフラグメントが腫瘍細胞機能を調節し得ることを見出し、こ
れが、ヘパリナーゼＩＩＩがその抗腫瘍機能および抗転移機能を発揮する機構で
あることを示唆する。
【０１８４】 本発明者らは、次に、ヘパリナーゼ処理Ｂ１６ＢＬ６メラノーマ細胞が肺に転
移する能力を調査した。Ｂ１６ＢＬ６細胞の尾静脈注射の１３日後のＢ１６ＢＬ
６メラノーマの肺転移を図９に示す。対数増殖期におけるＢ１６ＢＬ６細胞を手
短にトリプシン処理し、そしてＰＢＳ中で１ｍｌ当たり１×１０６個の最終濃度
に再懸濁させた。注射の前に、細胞をＰＢＳ、ｈｅｐ Ｉ（２００ｎｍ）または
ｈｅｐ ＩＩＩ（２００ｎｍ）を用いて３０分間３７℃で処理した。０．２ｍｌ
の細胞懸濁液（２×１０５細胞）を尾静脈を介してゆっくり注射した。マウスを
１３日後に屠殺し、そして肺を採取し、水道水でリンスした。肺表面の小節の数
を解剖顕微鏡の補助により数えた。＊は、ｐ＜０．０５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎ
ｅｙ検定）を示す。
【０１８５】 Ｂ１６ＢＬ６細胞をヘパリナーゼＩまたはＩＩＩのいずれかで処理して、次い
で、同系のマウスの尾静脈を介して注射した。興味深いことに、ヘパリナーゼＩ
ＩＩ処理Ｂ１６ＢＬ６細胞は、肺へ有意により少なく転移し得たが、一方、ヘパ
リナーゼＩ処理細胞は、コントロールＰＢＳ処理細胞と比較した場合、肺へ転移
するそれらの能力は、（もしあれば）わずかにもたらせられた（図９）。従って
、Ｂ１６ＢＬ６腫瘍細胞に存在する特定のＨＬＧＡＧコートの除去は、腫瘍細胞
が転移する能力を有意に影響を与えたが、Ｂ１６ＢＬ６腫瘍細胞の増殖に対する
効果を有さなかった。細胞のヘパリナーゼ処理が、Ｂ１６ＢＬ６表面の特定のタ
ンパク質になお結合して腫瘍細胞転移を阻害し得るＨＬＧＡＧフラグメントを産
生することを指摘すべきである。
【０１８６】 Ｂ１６ＢＬ６ ＨＬＧＡＧコートのヘパリナーゼ処置において産生するＨＬＧ
ＡＧフラグメントについての腫瘍増殖および転移におけるもっともらしい役割を
調査するために、Ｂ１６ＢＬ６細胞由来のヘパリナーゼＩ産生ＨＬＧＡＧフラグ
メントとヘパリナーゼＩＩＩ産生ＨＬＧＡＧフラグメントとの両方を単離し、Ｐ
ＢＳ中で採取し、そして試験した（図１０）。Ｂ１６ＢＬ６メラノーマを、ｈｅ
ｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩを用いたＢ１６ＢＬ６細胞の処理から産生したＧＡ
Ｇフラグメントを用いて処理した。手短に述べると、８０〜９０％コンフルエン
トな細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。２００ｎｍのヘパリナーゼＩまたはＩＩＩ
を含む１．５ｍｌのＰＢＳをフラスコに加え、２時間振盪機で、３７℃でインキ
ュベートした。上清をチューブにプールし、５分間３０００ｒｐｍで遠心分離し
、１５分間沸騰させ、そして濾過した。最後に、この溶液を３７℃で２時間、Ｃ
ｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ ＡＢＣとともにインキュベートし、この反応を１
分間沸騰させることによって停止させた。４×１０５個のＢ１６ＢＬ６細胞を１
日目に図８に記載されるように皮下的に注射した。浸透圧ポンプ（１時間当たり
０．５μｌで送達する２００μｌ容量）を、２日目に皮下的に移植した。０．１
ｍｌ ＧＡＧフラグメント溶液およびＰＢＳの毎日の注射を５日目に開始し、そ
してこの実験を通して続けた。マウスを１５日目に安楽死させた。腫瘍容積を図
１０Ａに示す。Ｂ１６ＢＬ６メラノーマの肺転移を調べた。ＰＢＳ、ヘパリナー
ゼＩ産生フラグメントおよびヘパリナーゼＩＩＩ産生フラグメントの溶液中に再
懸濁した２×１０５個のＢ１６ＢＬ６を、マウスの尾静脈を介して注射した（ｎ
＝７または８）。肺を注射の１３日目に採取し、処理し、そして先に記載したよ
うに数えた。＊は、ｐ＜０．０５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）を示す。肺
小節の数を計算した。
【０１８７】 興味深いことに、ヘパリナーゼＩ産生ＨＬＧＡＧフラグメントは原発性腫瘍増
殖を有意に促進したが、一方、ヘパリナーゼＩＩＩ産生フラグメントは促進しな
かったことを示した（図１０）。増強した腫瘍増殖と一致して、腫瘍サンプルの
組織学的試験は、ヘパリナーゼＩ産生ＨＬＧＡＧフラグメント処理について減少
したアポトーシスを明らかにした。他方、最も驚くべきことに、Ｂ１６ＢＬ６細
胞がマウスの尾静脈注射の前に、ヘパリナーゼＩＩＩ産生ＨＬＧＡＧフラグメン
トを含むＰＢＳ中に懸濁された場合、これらのフラグメントは、Ｂ１６ＢＬ６細
胞の肺転移を阻害したが、一方、ヘパリナーゼＩ産生フラグメントは、存在した
としてもわずかな影響を示した。従って、ヘパリナーゼ処置によりＢ１６ＢＬ６
細胞から産生されるＨＬＧＡＧフラグメントはまた、腫瘍増殖および転移におい
て一定の役割を演じるようである。
【０１８８】 この結論のさらなる支持として、いずれかのヘパリナーゼを用いた腫瘍細胞に
存在するＨＬＧＡＧコートのエキソビボ消化、続いてインビボ注射の前の、細胞
表面から放出される酵素およびＨＬＧＡＧフラグメントを除去するための遠心分
離およびＰＢＳ中の再懸濁は、機能的にコントロールと同一である細胞を生じる
。従って、放出される腫瘍細胞ＨＬＧＡＧフラグメントは、腫瘍増殖および転移
を調節する際に重要な役割を演じるようである。
【０１８９】 （Ｐａｒａｎｇｉら、１９９６；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９４）に記載され
るものを微小に改変させて、免疫組織化学を行った。手短に述べると、ｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）染色および末端デオキシヌクレオチドトラ
ンスフェラーゼ（ＴｄＴ）標識のために一晩４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアル
デヒド中でか、またはＫｉ−６７核抗原染色のために一晩Ｇｌｙｏ−Ｆｉｘｘ溶
液中でのいずれかで、腫瘍組織を固定した。組織を標準的な組織学的な手順に従
ってパラフィンに包埋した。ｖＷＦ染色のために、切片（５μｍの厚み）を１０
分間０．２Ｎ ＨＣｌとともにインキュベートし、１５分間、標的回収溶液（Ｄ
ａｋｏ）で浸されたＣｏｐｌｉｎビン中でオートクレーブ処理し、そして１５分
間３７℃で２μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて透過化処理をした。西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｄａｋｏ）と結合したウサギ抗ヒトｖＷＦ抗
体とともに切片をインキュベートした。陽性の染色をジアミノベンジジンとの基
質反応によって検出した。切片をＧｉｌｌのヘマトキシリンで対比染色し、そし
てＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）にマウントした。Ｋｉ−６７抗原染色（Ｈ
ＲＰと結合したウサギ抗ヒトＫｉ−６７抗原抗体、Ｄａｋｏ）およびＴｄＴ標識
（ＤｅａｄＥｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、本質的に製造業者のプロトコ
ルに従って行った。高出力視野（ＨＲＰ、×２００）当たりのｖＷＦ陽性毛細管
の数を数えることによって毛細管密度を決定した。生存可能な腫瘍の領域内の腫
瘍細胞の増殖指数およびアポトーシス指数を、４００倍の倍率で、光学顕微鏡下
で評点付けされた細胞の割合から推定した。２０００個の細胞の最小値を、各動
物で数えた。＃は、標準誤差を示す。
【０１９０】 Ｂ１６ＢＬ６およびＬＬＣ動物モデルについてのデーターの全体の類似性は、
腫瘍増殖および転移におけるＨＬＧＡＧについて重要な役割を示唆する。ヘパリ
ナーゼＩおよびＩＩＩ、ならびにヘパリナーゼによって生成されるＨＬＧＡＧフ
ラグメントの差示的効果は、ヘパリナーゼの固有の特異性と一致し、従って、そ
れらが生成する別個のオリゴサッカリド産物と一致する。さらに、１つの細胞型
に対するＨＬＧＡＧフラグメントは、別の細胞型に対する効果に影響し得、腫瘍
増殖および転移に対する効果を調節する際のＨＬＧＡＧの特定の配列の関与を強
く示唆する。
【０１９１】 Ｂ１６ＢＬ６黒色腫細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１中のアンチセンス２ＯＳＴでト
ランスフェクトし、そしてインビトロでの浸潤アッセイにおいて試験した。移動
した細胞を取り出し、そして計数した。アンチセンス２ＯＳＴでトランスフェク
トされた細胞についての高出力場（×４００）あたりの移動した細胞の数は、ト
ランスフェクトされていないＢ１６Ｂ１６細胞の数の２倍ほどであった。図１１
の棒グラフで、これらの結果を示す。
【０１９２】 トランスフェクトされた細胞が原発性腫瘍に発展する能力を、４×１０５個の
Ｂ１６ＢＬ６（トランスフェクトされたものおよびトランスフェクトされていな
いもの、それぞれ）の、ヌードマウスの脇腹への皮下接種によってアッセイした
。トランスフェクトされた群の平均腫瘍体積および腫瘍重量は、図１２ａおよび
ｂにそれぞれ示されるように、トランスフェクトされていないコントロールのそ
れよりも２倍より大きかった。
【０１９３】 トランスフェクトされた細胞が転移する能力を、Ｃ５７ＢＬ６マウスの尻尾の
静脈を介して、トランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされていな
い細胞の、０．２ｍｌＰＢＳ中の２×１０５個のＢ１６ＢＬ６の注射によって決
定した。トランスフェクトされた群に対する肺表面の転移性節の数は、トランス
フェクトされていないコントロールのそれの３倍より大きかった。従って、２Ｏ
ＳＴアンチセンスのトランスフェクトされたＢ１６ＢＬ６は、より高い転移の可
能性および増殖速度を有して、より浸潤的であるようである。
【０１９４】 （実施例５：別個の組成を有するＨＬＧＡＧフラグメントは、腫瘍増殖および
転移の強力なインヒビターである） 方法：Ｂ１６ＢＬ６細胞を、ａ、ｈｅｐ Ｉ；ｂ、ｈｅｐ ＩＩＩ；またはｃ
、ＰＢＳコントロールおよび回収された放出されたＨＬＧＡＧフラグメントのい
ずれかで処理した。サッカリドフラグメントをＰＢＳ中に回収し、そして精製お
よび分画に供した。最初に、サンプルを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＥＡＥ膜に結
合させ、これを、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌと平衡
化した。それらを、同じ緩衝液で洗浄し、そして１．０Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出した。次いで、フラグメント
を濃縮し、そして緩衝液を、ミクロコン（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）カラム（ＭＷＣＯ
＝３，０００Ｄａ）への適用によって、超純水に交換した。このサンプルを、２
５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ酢酸カルシウム（ｐＨ７．０）中のｈｅｐ Ｉ−
ＩＩＩ（各１ｍＵ）のカクテルと共に、一晩消化した。分析を、５０ｍＭ ｔｒ
ｉｓ／ホスフェートｐＨ２．５のランニング緩衝液を用いて、逆極性下で、高感
度フローセルを使用するキャピラリー電気泳動によって完了した。ジサッカライ
ド同定を、既知の標準を用いる共遊走によってなし、ピークの同一性を、ａおよ
びｂに列挙する。ｄ，表は、ｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩ生成フラグメントに
おけるＨＬＧＡＧジサッカライドの相対割合を示す。この割合を、ａおよびｂに
おける異なるジサッカライドの規格化されたピーク面積に基づいて得た。ｈｅｐ
Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩ生成フラグメントの相対組成は、かなり異なることに
注意すること。各サッカリドの英数字での整列がまた、以前に概略されたように
列挙される（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍ
ａｎ，Ｒ．＆ Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍ
ｐｌｅｘ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，５３７
−４２（１９９９））。２ＯＳＴ（−）でトランスフェクトされたＢ１６ＢＬ６
細胞のサッカリド分析は、２−Ｏスルフェート含有サッカリド（特に、トリスル
フェート化ジサッカライドΔＵ２Ｓ−ＨＮＳ，６Ｓ）の非存在を示した。ｈｅｐ
Ｉ（ｅ）およびｈｅｐ ＩＩＩ（ｆ）由来ＨＬＧＡＧサッカリドフラグメント
の質量分析的オリゴサッカリドマッピング。ｈｅｐ Ｉまたはｈｅｐ ＩＩＩ由
来ＨＬＧＡＧサッカリドフラグメントを、１０ｍＭエチレンジアミン、１０μＭ
オブアルブミン、１μＭ硫酸デキストラン（ｐＨ７．０）中の１００ｎＭ（８μ
ｇ／ｍｌ）ヘパリナーゼ ＩＩによる部分的な酵素切断に、１時間供した。得ら
れた消化物を、塩基性ペプチド（ＲＧ）１９Ｒと複合体化させ、そしてマトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化質量分析に供した。このＨＬＧＡＧフラグメント
のフィンガープリントは、各々構造的に異なることに一致して、ｈｅｐ Ｉ 対
ｈｅｐ ＩＩＩ生成フラグメントとは異なる。
【０１９５】 結果：ヘパリナーゼ処理の際に生成されるＨＬＧＡＧサッカリドフラグメント
の比較研究は、ｈｅｐ Ｉまたはｈｅｐ ＩＩＩによてＢ１６ＢＬ６細胞から放
出されるＨＬＧＡＧフラグメントは、組成的に異なり、そして構造的に異なるこ
とを確認した（図１３ａ−ｆ）。徹底的な酵素消化と組合せた、キャピラリー電
気泳動を使用して、サッカリドフラグメントに関する組成的な情報を導いた（図
１３）。ｈｅｐ ＩＩＩ処理由来のサッカリドフラグメントは、より多くのトリ
スルフェート化およびジスルフェート化したジサッカライドを有し、一方で、ｈ
ｅｐ Ｉ処理ＨＬＧＡＧは、より多くのモノスルフェート化および未スルフェー
ト化されたジサッカライドを有した（図１３ａ、ｂ）。このことは、ヘパリナー
ゼの既知の基質特異性と一致する。さらに、ＨＬＧＡＧの質量分析研究により、
処置の各々から生成したオリゴサッカリドの「フィンガープリント」を得、そし
て異なる処理から生成されたサッカリドフラグメントが、構造的に異なることを
証明した（図１３ｅ、ｆ）。
【０１９６】 ２−ＯＳＴアンチセンス構築物の組成分析は、これら変異体が、スルフェート
化されたＨＬＧＡＧＡにおいて、特異的に２−Ｏスルフェート化を有するという
欠損を例証した。この変異体についての細胞表面ＨＬＧＡＧと、トランスフェク
トされていないＢ１６ＢＬ６細胞由来のｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩ生成フ
ラグメントについてのそれの組成の間の比較は、変異体のＨＬＧＡＧが、ｈｅｐ
ＩＩＩ生成フラグメントよりｈｅｐ Ｉフラグメントと比較して、化学的によ
り近いことを示す。
【０１９７】 （実施例６：作用機構：特定のシグナル伝達分子の生物学的活性に対するＨＬ
ＧＡＧの干渉） 腫瘍および脈管のコンパートメントの両方に対する異なるＨＬＧＡＧフラグメ
ントが有する顕著で反対の効果を観察して、本発明者らは、腫瘍進行におけるＨ
ＬＧＡＧの存在する分子的機構を解明しようと努めた。多くのＨＬＧＡＧ結合タ
ンパク質は、増殖因子でありそしてサイトカインであるので、従って、本発明者
らは、腫瘍細胞の表面から生成するＨＬＧＡＧフラグメントの中間体標的を同定
するための腫瘍病理生物学における重要な役割を果たすＨＬＧＡＧ結合増殖因子
を体系的に検索した。ＦＧＦ２シグナル伝達は、オートクライン様式で腫瘍増殖
を促進する黒色腫進行のために、必須であることが示されている。そしてＦＧＦ
２またはＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）活性のいずれかと干渉することによるＦ
ＧＦ２オートクラインループの妨害は、黒色腫の進行の阻害を生じる（Ｒｏｄｅ
ｃｋ，Ｕ．ら、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕ
ｌｔｉｐｌｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｅｌａｎｏ
ｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｎｏｒｍａｌ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ．
Ｊ ｌｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ９７，２０−６（１９９１）。Ｂｅｃｋ
ｅｒ，Ｄ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ｂ．＆ Ｈｅｒｌｙｎ，Ｍ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｉｓ
ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｓｉｃ ｆｉｂ
ｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｅｍｂｏ Ｊ８，３６８５−９
１ （１９８９）．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｌｅｅ，Ｐ．Ｌ．，Ｒｏｄｅｃｋ，Ｕ
．＆ Ｈｅｒｌｙｎ，Ｍ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂ
ｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ （ＦＧＦＲ−
１） ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍａｌ
ｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｓ ｉｎｄｉｃａｔｉ
ｖｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７，２３０
３−１３ （１９９２）．Ｔｏｒｃｉａ，Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌ
ｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏ
ｍａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗ
ｉｔｈ ｔｈｅ ｂＦＧＦ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｉｒｃｕｉ
ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２６２，８３８
−４４（１９９９）．）。一方で、正常なメラノサイトにおけるＦＧＦ２の発現
の上方制御は、それらの悪性の形質転換を生じる（Ｎｅｓｂｉｔ，Ｍ．ら、Ｂａ
ｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ
ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈ
ｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，６４６９−７
６（１９９９）．）。さらに、ＦＧＦ２は、黒色腫の新生血管形成を調節する強
力で必須の脈管形成因子である（Ｗａｎｇ，Ｙ．＆ Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ
ｓ ｂｌｏｃｋｓ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａ
ｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ３，８８７−９３（１９９
７）．Ｂｉｒｃｋ，Ａ．，Ｋｉｒｋｉｎ，Ａ．Ｆ．，Ｚｅｕｔｈｅｎ，Ｊ．＆
Ｈｏｕ Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂ
ｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅ
ｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ
ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍ
ｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ ９，３７５−８１（１９９
９）．）。最も重要なことには、特定のＨＬＧＡＧ構造は、ＦＧＦに結合し、そ
してＦＧＦ２活性を調節することが知られており、そしてそれらの構造に依存し
て、ＨＬＧＡＧ配列が、ＦＧＦ２活性を促進し得るかまたは阻害し得るかのいず
れかであることの証拠が増加している（Ｇｕｉｍｏｎｄ，Ｓ．Ｅ．＆ Ｔｕｒｎ
ｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｄｉｃｔａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｃｕ
ｒｒ Ｂｉｏｌ ９，１３４３−６（１９９９）．）。ＦＧＦの活性についての
ＨＬＧＡＧに対するＦＧＦの厳密な依存性とともに、黒色腫の進行における重要
なキースイッチとしてのＦＧＦ２が関係する複数のラインを考慮すると、本発明
者らは、腫瘍由来のＨＬＧＡＧフラグメントの中間標的が、本当にＦＧＦ２であ
るか否かを決定すると考えた。
【０１９８】 ｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩ由来のフラグメントが、ＦＧＦ２に結合しそ
してその活性に影響するか否かを試験するために、本発明者らは、最初に、ｈｅ
ｐ ＩＩＩ処理が、インビトロでＢ１６ＢＬ６細胞のＦＧＦ誘導増殖を阻害する
ことを確立し、そしてさらにおよび直接的に、ＦＧＦ媒介下流シグナル経路、す
なわちＭＡＰキナーゼ経路（すなわち、Ｅｒｋ−１，２）（細胞増殖および分化
に導くＦＧＦ２の主要なシグナル伝達経路）を試験することによってこのことを
確認した（Ｓｅｇｅｒ，Ｒ．＆ Ｋｒｅｂｓ，Ｅ．Ｇ．Ｔｈｅ ＭＡＰＫ ｓｉ
ｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ．Ｆａｓｅｂ Ｊ ９，７２６−３５（１９９
５）．）。
【０１９９】 方法：１０ｃｍの培養皿中のＢ１６ＢＬ６細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２
で刺激する前に、４８時間の血清飢餓された。細胞を２０分間刺激し、その後、
細胞溶解物全てを、種々の酵素インヒビターを含む１ｍｌの改変ＲＩＰＳ緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％
デオキシコール酸ナトリウム、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタ
チン、１ｍＭ活性化Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ）を用いて刺激した。溶解物
中のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａ
ｄ）を使用して測定し、そして従って、電気泳動分析のために調整した。ヘパリ
ナーゼ処理群について、細胞を、ｈｅｐ Ｉまたはｈｅｐ ＩＩＩ（２００ｎＭ
）のいずれかで、ＦＧＦ２の添加の前に、３７℃で３０分間処理した。免疫ブロ
ットを、抗Ｅｒｋ−１，２または抗ホスホ−Ｅｒｋ−１，２抗体（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；ＭＡ）でプローブし、そしてＨＲＰに結合した抗
ウサギＩｇＧによって、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）を使用して検出した。
【０２００】 （ｂ．ｈｅｐ Ｉまたはｈｅｐ ＩＩＩのいずれかを用いて生成されたＨＬＧ
ＡＧフラグメントの存在下での、トランスフェクトされたＦＧＦＲを用いるＢａ
Ｆ３細胞のＦＧＦ媒介増幅） ＦＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、以下のような様式で増殖させた。初期の
細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンターによって計数し、１×１０５細胞／ｍｌの密
度で、６ｍｌの１２個のサンプルに再懸濁した。細胞の各サンプルを、室温で１
０８５×ｇで３分間遠心分離し、そしてＰＢＳ中のＨＬＧＡＧ調製物中に再懸濁
し、同じ培地中の２つのセットの細胞を生成した。各セットの一方は、５０ｎｇ
／ｍｌのＦＧＦ２（
【数２】 ）で補充されるが、もう一方は、補充されない（■）。各セットからの１ｍｌを
、２４ウェル組織培養プレート上の各々３ウェルに添加した。これらの細胞を、
３７℃／５％ ＣＯ２で、７２時間インキュベートした。全細胞数を、Ｃｏｕｌ
ｔｅｒカウンターによって実験の終わりに計数した。この手順を３回繰り返した
。収集したデータを、増殖指標（ＰＩ）を使用して、以前に記載されたように、
規格化した（Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｂｅｒｒ
ｙ，Ｄ．，Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．＆ Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．ＦＧ
Ｆ−２／ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ／ｈｅｐａｒｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｆ
ＧＦ−２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｆａｓｅｂ Ｊ １３，１６７７−８７（１９
９９）．）。この指標は、ポジティブコントロールについての細胞数の増加によ
って除算される、実験ケースについての細胞の増加として定義される。ポジティ
ブコントロールは、１０％ ＢＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５００ｎｇ／ｍｌヘパリン
、および５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ中の細胞であった。ネガティ
ブコントロールは、１０％ ＢＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５００ｎｇ／ｍｌヘ
パリンを含むＤＭＥＭ中の細胞であった。
【０２０１】 （ｃ，ＰＢＳと比較した、ＦＧＦＲ１におけるｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩ
Ｉを用いる腫瘍の処置の効果） 腫瘍サンプル中のリン酸化ＦＧＦＲ１のレベルを、標準的な免疫沈降アッセイ
によって評価し、次いで、ホスホチロシン特異的抗体を用いるウエスタンブロッ
ティングを行った。原発性Ｂ１６ＢＬ６腫瘍を増幅させ、そして先に記載された
ように処理し、そして１５日目に、腫瘍を酵素インヒビターを含む改変冷ＲＩＰ
Ａ緩衝液中に回収し、そしてホモジナイズした。このホモジネートを、２５ゲー
ジの針に３回通過させ、遠心分離した。上清を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッ
セイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、タンパク質濃度について調節した。
ＦＧＦＲ１を、ポリクローナル抗ＦＧＦＲ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を使用しえ、免疫沈降させた。次い
で、サンプルをペレット化し、洗浄し、サンプル緩衝液の添加によってビーズか
ら溶出し、そして３分間沸騰させた（Ｋａｐｉｌａ，Ｙ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．
＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｐａｒ
ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｎ
ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｖ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅ
ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｐｌ２５（ＦＡＫ）ｌｅｖｅｌｓ ｐｌｕｓ
ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ
ｃａｓｐａｓｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，３０９０６−１３（１９
９９）．）。電気泳動後、このゲルを、標準的な方法によってニトロセルロース
膜に移した。免疫ブロットを、ＨＰＲ（ＲＣ２０；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）に結合したホスホチロ
シン特異的抗体を用いてプローブし、そしてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ
Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質を用いて、発光させた。Ｆ
ＧＦＲ１の分子量は、１２０ＫＤａであった。
【０２０２】 （ｄ，Ｂ１６ＢＬ６腫瘍におけるＦＡＫに活性化に対するヘパリナーゼ処理の
効果） ＦＡＫタンパク質を、上記の手順に従って、マウス抗ＦＡＫモノクローナル抗
体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏ
ｎ，ＫＹ）を用いて免疫沈降させた。このリン酸化ＦＡＫをホスホチロシン特異
的抗体ＲＣ２０を使用して検出した。
【０２０３】 （ｅ，ヘパリナーゼ処理Ｂ１６ＢＬ６腫瘍における全Ｅｒｋ−１，２およびリ
ン酸化Ｅｒｋ−１，２のレベル） 腫瘍ホモジネートを、ｃに記載されるように調製し、そして処理した。上清を
、全タンパク質濃度アッセイおよび免疫ブロッティングのために使用した。この
免疫ブロットを、ａに記載されるように検出した。
【０２０４】 （ｆ，Ａｋｔ活性化に対するヘパリナーゼ処理の効果） 原発性腫瘍を、上記のように処理し（ｔｒｅａｔ）、そして処理した（ｐｒｏ
ｃｅｓｓ）。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＡｋｔ抗体および
ホスホＡｋｔ抗体を使用して、免疫ブロットをプローブした。
【０２０５】 （結果）ＦＧＦ２刺激の際、減少したＥｒｋ−１、２活性化が、ｈｅｐ ＩＩ
Ｉ処理細胞において見出され、一方、増加したＥｒｋ−１、２活性化が、ｈｅｐ
Ｉを用いて処理した細胞で見出された。インビトロデータを、Ｆ３２細胞を用
いてさらに確認した。このＦ３２細胞は、ＦＧＦＲでトランスフェクトされ、し
ばしば、他の増殖因子および／またはレセプターによって開始されるシグナル伝
達事象と関連する複雑化によって開放される、細胞培養においてＦＧＦ媒介シグ
ナル伝達を研究するためのモデル系として使用されている前リンパ球細胞株であ
る（Ｏｒｎｉｔｚ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉ
ｌｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，１５２９２−７（１９９６））。Ｂ１
６ＢＬ６細胞において観察されたことと類似して、ｈｅｐ ＩＩＩフラグメント
がこれらの細胞におけるＦＧＦ２媒介細胞増殖を阻害するのに対して、ｈｅｐ
Ｉフラグメントは促進する（図１４）。考え合わせると、インビトロにおける知
見は、細胞表面由来のＨＬＧＡＧフラグメントが実質的かつ特異的にＦＧＦ２シ
グナル伝達に影響を及ぼし得るという事実を示す。
【０２０６】 インビトロにおける観察と一致して、本発明者らは、ｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩ由来のＢ１６ＢＬ６フラグメントが、インビボにおいてＦＧＦシグナル
伝達経路に有意に影響を及ぼすことを見出す。動物の腫瘍内において、本発明者
らは、ｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩ処理動物におけるＦＧＦＲリン酸化なら
びにＥｒｋ−１およびＥｒｋ−２シグナル伝達の両方を調べた。ｈｅｐ ＩＩＩ
（またはその作製されたフラグメント）を用いた原発性腫瘍の処理は、ＦＧＦＲ
１のリン酸化を阻害したが、ｈｅｐ Ｉ処理は、ＦＧＦＲ１のリン酸化に対して
反対の効果を有した。一貫して、ｈｅｐ ＩＩＩを用いた原発性腫瘍の処理は、
低いレベルの活性化Ｅｒｋ−１をもたらした。
【０２０７】 ２．さらなる細胞内シグナル伝達事象（例えば、フォーカルアドヒージョンキ
ナーゼ（ＦＡＫ）活性（これは、細胞接着および細胞移動のプロセスに関与する
）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｌ．Ｗｈｙ ｄｏ ｓｏ
ｍａｎｙ ｓｔｉｍｕｌｉ ｉｎｄｕｃｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＡＫ？、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２１，１０６９−７
５（１９９９）Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ，Ｄ．Ｄ．，Ｈａｕｃｋ，Ｃ．Ｒ．＆Ｓｉ
ｅｇ，Ｄ．Ｊ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓ
ｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７１，
４３５−７８（１９９９）））は、腫瘍のｈｅｐ Ｉおよびｈｅｐ ＩＩＩ処理
によって同様に調節された。これらの知見と一致して、ｈｅｐ ＩＩＩ処理は、
ＦＡＫ活性化を阻害した。特に、ｈｅｐ Ｉまたはｈｅｐ ＩＩＩのいずれを用
いた処理もＡｋｔの活性化を変化させず、これは、リン酸化における変化が特異
的であり、そして特定のシグナル伝達経路のみのダウンレギュレーションから生
じたことを示す。考え合わせると、これらの結果は、ＨＬＧＡＧフラグメントが
ＦＧＦ２シグナル伝達を媒介し、ｈｅｐ Ｉ由来フラグメントがＦＧＦ２活性を
促進し、そしてｈｅｐ ＩＩＩから作製されたフラグメントが、このＦＧＦ２活
性を阻害することを示唆する。この効果は、細胞表面レセプター（ＦＧＦＲ）か
らシグナル伝達事象の下流を通した、ＦＧＦ媒介シグナル伝達の重要な工程にお
いて観察された。
【０２０８】 （実施例７：Ｂ１６ＢＬ６フラグメントによるインビボにおけるＦＧＦ２活性
化の調節） （方法：ａ〜ｃ）ラット角膜ポケットアッセイを用いたインビボにおけるＦＧ
Ｆ２シグナル伝達の評価。ＦＧＦ２、ＦＧＦ２を伴うｈｅｐ Ｉフラグメント、
およびＦＧＦ２を伴うｈｅｐ ＩＩＩフラグメントを含むＨｙｄｒｏｎペレット
を用いた移植の６日後の、ラット角膜の代表的な細隙灯写真。各ペレットに充填
したＦＧＦ２の量は、約１２０ｎｇであり、そしてＨＬＧＡＧフラグメントの量
は、約１ｎｇであった。これらのペレットを、本質的に記載されるように（Ｋｅ
ｎｙｏｎ，Ｂ．Ｍ．ら、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｎｅａ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ
Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３７，１６２５−３２（１９９６））調製し、そして移植し
た。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝５）の角膜への移植の６日後、
角膜の新血管新生を、細隙灯を用いて写真に撮り、そして新血管新生の程度を、
記載されるように（Ｋｅｎｙｏｎ，Ｂ．Ｍ．ら、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇ
ｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｎｅａ．Ｉｎｖｅｓｔ
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３７，１６２５−３２（１９９６）
）、直線の長さおよび周囲時計時間（ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｌｏ
ｃｋ ｈｏｕｒ）として表した。結果を表に要約する。ＦＧＦ２を含まないコン
トロールペレットは、新血管新生を誘導しなかった。ｈｅｐ ＩＩＩ由来のフラ
グメントによる新血管新生の阻害が、依存性であり、最初の阻害が約０．０２ｎ
ｇ／ペレットで観察されたことに注意する。さらに、ｈｅｐ ＩＩＩ由来フラグ
メントによる新血管新生の阻害は、移植部位に非依存性であることが見出され、
ｈｅｐ ＩＩＩ由来フラグメントをＦＧＦ２のみのペレットと縁との間の第２の
ペレットとして移植した場合、類似の阻害が観察された。＃は、平均およびＳＥ
を示す。
【０２０９】 （ｂ、ＦＧＦ２シグナル伝達の潜在的なＨＬＧＡＧ調節因子の形成のモデル） ＨＬＧＡＧ（プロテオグリカンの一部として）とＦＧＦ２およびＦＧＦＲのヘ
パリン結合ドメインとの相互作用は、ＦＧＦ２シグナル伝達の基礎を形成する細
胞表面における三元複合体の形成を可能にする。ｈｅｐ Ｉを用いたコーティン
グされた細胞のＨＬＧＡＧの消化は、ＦＧＦ２およびＦＧＦＲの両方に対して最
適な「適合」を可能にする２Ｏ−スルフェート基、６Ｏ−スルフェート基、およ
びＮ−スルフェート基の適切な空間的な提示を有するフラグメントを放出し、チ
ロシンキナーゼ活性化を介したシグナル伝達を導く。逆に、別のパターンのスル
フェート基を提示するｈｅｐ ＩＩＩで作製されたＨＬＧＡＧフラグメントは、
なおＦＧＦ２に結合し得るが、細胞表面において構成的なシグナル伝達複合体を
形成できず、従って、ＦＧＦ２活性を阻害する。
【０２１０】 （結果）Ｂ１６ＢＬ６ ＨＬＧＡＧフラグメントとその直の標的ＦＧＦ２との
間のインビボにおける直接的な相互作用を実証するために、本発明者らは、角膜
新血管新生アッセイを用いて、インビボにおいて細胞移動、細胞増殖、および細
胞分化を導くＦＧＦ誘導応答を調節する、Ｂ１６ＢＬ６ ＨＬＧＡＧフラグメン
トの能力を評価した（図１５ａ、表）。このモデルにおいて、ＦＧＦ２と混合さ
れたｈｅｐ Ｉで作製されたフラグメントは、増殖因子に結合し、ＦＧＦ２に応
答してインビボ新血管新生を促進し（図１５ａ、表）、一方、ＦＧＦ２と混合さ
れたｈｅｐ ＩＩＩで作製されたフラグメントは、増殖因子に結合したが、その
活性を劇的に阻害した（図１５ａ、表）。この結果は、腫瘍の免疫組織学研究に
おいて観察された新血管新生における変化と一致する。これらを考え合わせると
、上記の結果は、ヘパリナーゼ処理によって放出されたＨＬＧＡＧフラグメント
の直接的なインビボ標的がＦＧＦ２であることを示す。従って、ｈｅｐ Ｉで作
製されたフラグメントは、ＦＧＦ２がその同族レセプターへ架橋するために作用
して細胞内シグナル伝達経路を活性化し、一方、ｈｅｐ ＩＩＩ由来のフラグメ
ントはアンタゴニストであり、細胞表面におけるシグナル伝達複合体の形成を回
避すると結論づけられ得る。従って、ＦＧＦ２シグナル伝達を直接活性化するか
または阻害することによって、これらの生物活性フラグメントは、腫瘍増殖およ
び転移の強力な調節因子である。本明細書中に示される結果は、腫瘍異常生理学
において役割を果たす他のＨＬＧＡＧ結合増殖因子に対する、ＨＬＧＡＧフラグ
メントの直接または間接的な効果を排除しない。しかし、本明細書中に示される
証拠の多くの系列に基づいて、ＦＧＦ２は、酵素的に誘導されたＨＬＧＡＧフラ
グメントに対する真に直の標的のようである。
【０２１１】 本明細書中に示される結果は、特定のシグナル伝達分子の生物学的活性に衝突
することによって、ＨＬＧＡＧが腫瘍増殖および転移に直接的な役割を果たすこ
とを実証する。最も重要なことには、腫瘍細胞の細胞表面におけるＨＬＧＡＧは
、未決定の「活性化」ＨＬＧＡＧ配列および「阻害」ＨＬＧＡＧ配列の両方を含
む（図１５ｂ）。１セットの配列の特異的な分解（例えば、ｈｅｐ Ｉによる）
は、ＨＬＧＡＧ結合シグナル伝達分子の生物学的な活性を促進し、従って腫瘍増
殖および転移のスイッチとして作用するフラグメントの放出をもたらす。逆に、
直交する基質特異性を有する酵素による分解（例えば、ｈｅｐ ＩＩＩによる）
は、この均衡を反対の方向に傾かせ、ＨＬＧＡＧ結合シグナル伝達分子を拮抗す
るフラグメントを放出し、腫瘍増殖および転移の阻害を導く。従って、本発明者
らは、本明細書中において最初に、細胞表面における化学的に複合したＨＬＧＡ
Ｇが、特異的なＨＬＧＡＧ分解酵素による細胞表面からのその放出の際に生物学
的に活性になる、腫瘍増殖および転移の「潜在的な」促進因子またはインヒビタ
ーであることを実証した。
【０２１２】 単にコラゲナーゼは、ＥＣＭのタンパク質区分を削減して、腫瘍増殖を増加す
るためか（例えば、基底膜の破壊）または腫瘍を阻害するためか（例えば、コラ
ーゲンＸＶＩＩＩからのエンドスタチンの形成）のいずれかに作用するするので
、多糖成分は、類似の現象を示す。重要なことに、タンパク質分解性に切断され
たコラーゲンフラグメントのエンドスタチンのように、腫瘍細胞表面からの酵素
切断による放出の際の異なるＨＬＧＡＧオリゴ糖は、腫瘍進行の強力なインヒビ
ターとして作用し得る。従って、本研究は、多糖が腫瘍増殖および転移を調節す
る方法の新規な範例を可能にするだけでなく、ＨＬＧＡＧベースの新規抗癌分子
の発達に対する枠組みを提供することによって新規治療標的を同定する。
【０２１３】 本明細書中に示すデータは、ＨＬＧＡＧが腫瘍増殖および転移を調節する方法
の可能な機構および生理学的な推測に関する重要な知見を実証する。ＨＬＧＡＧ
フラグメントは、オートクライン増殖および脈管形成因子を含む多くの経路を通
じてか、またはＥＣＭ分子との相互作用を通して、その効果を発揮し得る。さら
に、内因性ＨＬＧＡＧ分解酵素の供給源およびその基質特異性がまた、重要にな
る。ヘパリナーゼＩに類似した基質特異性を有するＨＬＧＡＧ分解酵素の産生（
おそらく腫瘍細胞による）は、腫瘍細胞に対して有利である。腫瘍細胞によるＨ
ＬＧＡＧ分解酵素の分泌は、特異的ＨＬＧＡＧ配列（それ自体のコーティングま
たは腫瘍ベッドＥＣＭから）の産生を導き、これは、オートクラインおよび脈管
形成増殖因子を介してかまたは他のシグナル伝達経路を介して効果を発揮し得、
腫瘍増殖および転移を支持する。一方、へパリナーゼＩＩＩに類似した基質特異
性を有するＨＬＧＡＧ分解酵素の産生は、宿主に対して極めて有利である。例え
ば、腫瘍またはマクロファージ付近の内皮細胞は、腫瘍増殖および転移を阻害す
る特異的ＨＬＧＡＧ配列の産生を導くへパリナーゼＩＩＩの基質特異性を有する
酵素を分泌し得る。このようなモデルと一致して、へパリナーゼＩＩＩを用いた
動物のプライミングは、腫瘍増殖を優位に阻害し、へパリナーゼＩＩＩの腫瘍抑
制因子特性を示唆する。ＨＬＧＡＧ分解酵素または他の機構を通した特有のＨＬ
ＧＡＧ配列のバイオアベイラビリティ（ｂｉｏａｖａｉｌｉｂｉｌｉｔｙ）の調
節における均衡は、腫瘍増殖および転移の支持または阻害のいずれかのための重
要なスイッチの役割を果たし得る。
【０２１４】 上記のように、ｈｅｐ ＩＩＩ処理は、ｈｅｐ ＩＩＩの皮下注射を用いたヌ
ードマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方の原発性腫瘍増殖において優位な
阻害を引き起こした。これらの結果は、ｈｅｐＩＩＩ処置に対する応答が投与経
路にも媒介される免疫にも依存しないことを示す。
【０２１５】 現在好ましい実施形態を本発明に従って記載してきたが、他の改変、バリエー
ションおよび変更が本明細書中に示される教示を考慮して当業者に対して提案さ
れることが考えられる。従って、すべてのそのようなバリエーション、改変、お
よび変更は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内に
あると考えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、速度定数に対するヘパリナーゼＩＩＩのＤＥＰＣ不活化の影響を示す
グラフである。
【図２】 図２は、ヘパリナーゼＩＩＩと変化する濃度のＤＥＰＣとのインキュベーショ
ンの際の、不活化の二次速度定数のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図３】 図３は、時間にわたるヘパリナーゼＩＩＩにおけるＤＥＰＣ改変されたヒスチ
ジン残基の定量化を示すグラフである。
【図４】 図４は、ＤＥＰＣ ＩＩＩによるヘパリナーゼＩＩＩ不活化の基質保護を示す
グラフである。
【図５】 図５は、ヘパリナーゼＩＩＩ ＤＥＰＣに暴露されていないｌｙｓ−Ｃ消化の
逆相ＨＰＬＣプロフィール（上パネル）およびＤＥＰＣで標識したヘパリナーゼ
ＩＩＩのペプチドプロフィール（下パネル）である。
【図６Ａ】 図６Ａは、硫酸ヘパリンの消耗性ヘパリナーゼＩＩＩ消化のＳＡＸ分析を示す
一連のグラフである。硫酸ヘパリンを、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナ
ーゼＩＩＩ（パネルＡ）、組換えヘパリナーゼＩＩＩ（パネルＢ）、Ｈ２９５Ａ
変異体酵素（パネルＣ）、Ｈ５１０Ａ変異体酵素（パネルＤ）、またはＨ１０５
Ａ変異体酵素（パネルＥ）のいずれかで消化した。
【図６Ｂ】 図６Ｂは、硫酸ヘパリンの消耗性ヘパリナーゼＩＩＩ消化のＳＡＸ分析を示す
一連のグラフである。硫酸ヘパリンを、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナ
ーゼＩＩＩ（パネルＡ）、組換えヘパリナーゼＩＩＩ（パネルＢ）、Ｈ２９５Ａ
変異体酵素（パネルＣ）、Ｈ５１０Ａ変異体酵素（パネルＤ）、またはＨ１０５
Ａ変異体酵素（パネルＥ）のいずれかで消化した。
【図６Ｃ】 図６Ｃは、硫酸ヘパリンの消耗性ヘパリナーゼＩＩＩ消化のＳＡＸ分析を示す
一連のグラフである。硫酸ヘパリンを、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナ
ーゼＩＩＩ（パネルＡ）、組換えヘパリナーゼＩＩＩ（パネルＢ）、Ｈ２９５Ａ
変異体酵素（パネルＣ）、Ｈ５１０Ａ変異体酵素（パネルＤ）、またはＨ１０５
Ａ変異体酵素（パネルＥ）のいずれかで消化した。
【図６Ｄ】 図６Ｄは、硫酸ヘパリンの消耗性ヘパリナーゼＩＩＩ消化のＳＡＸ分析を示す
一連のグラフである。硫酸ヘパリンを、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナ
ーゼＩＩＩ（パネルＡ）、組換えヘパリナーゼＩＩＩ（パネルＢ）、Ｈ２９５Ａ
変異体酵素（パネルＣ）、Ｈ５１０Ａ変異体酵素（パネルＤ）、またはＨ１０５
Ａ変異体酵素（パネルＥ）のいずれかで消化した。
【図６Ｅ】 図６Ｅは、硫酸ヘパリンの消耗性ヘパリナーゼＩＩＩ消化のＳＡＸ分析を示す
一連のグラフである。硫酸ヘパリンを、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナ
ーゼＩＩＩ（パネルＡ）、組換えヘパリナーゼＩＩＩ（パネルＢ）、Ｈ２９５Ａ
変異体酵素（パネルＣ）、Ｈ５１０Ａ変異体酵素（パネルＤ）、またはＨ１０５
Ａ変異体酵素（パネルＥ）のいずれかで消化した。
【図７】 図７は、組換えヘパリナーゼＩＩＩ、ならびにＨ２９５Ａ変異体酵素およびＨ
５１０Ａ変異体酵素の円偏光二色性分析を示す。
【図８】 図８は、マウスならびにヘパリナーゼＩで処置したマウスにおける腫瘍体積を
示すグラフである。
【図９】 図９は、Ｂ１６ ＢＬ６細胞の尾静脈注射の１３日後に発症した肺小結節の数
を示す棒グラフである。この細胞を、ＰＢＳ、ヘパリナーゼＩ、またはヘパリナ
ーゼＩＩＩのいずれかで処置した。
【図１０】 図１０のパネルＡは、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩＩ、またはＰＢＳの
いずれかで処置したＢ１６ ＢＬ６細胞から生成したＧＡＧフラグメント、ある
いはＬＬＣ細胞のヘパリナーゼＩ処置から生成したフラグメントで処置したマウ
スの腫瘍体積を示す。腫瘍体積は、腫瘍細胞の注入後７日と１５日との間の時間
にわたって測定した。パネルＢは、パネルＡに示されるマウスの肺小結節の数を
定量化する棒グラフである。
【図１１】 図１１は、Ｂ１６細胞の遊走およびｐｃＤＮＡ３．１中でのアンチセンス２Ｏ
ＳＴを用いるトランスフェクションの侵襲の影響を示す棒グラフである。
【図１２】 図１２は、図１２のトランスフェクトされた細胞が、平均の腫瘍体積（１２ａ
）および腫瘍質量（１２ｂ）によって評価されるように、一次腫瘍へと進展する
能力を示す棒グラフを示す。
【図１３Ａ】 図１３Ａは、Ｂ１６ ＢＬ６細胞から放出されたＨＬＧＡＧサッカライドフラ
グメントの組成分析の結果を示す。
【図１３Ｂ】 図１３Ｂは、Ｂ１６ ＢＬ６細胞から放出されたＨＬＧＡＧサッカライドフラ
グメントの組成分析の結果を示す。
【図１３Ｃ】 図１３Ｃは、Ｂ１６ ＢＬ６細胞から放出されたＨＬＧＡＧサッカライドフラ
グメントの組成分析の結果を示す。
【図１３Ｄ】 図１３Ｄは、Ｂ１６ ＢＬ６細胞から放出されたＨＬＧＡＧサッカライドフラ
グメントの組成分析の結果を示す。
【図１３Ｅ】 図１３Ｅは、Ｂ１６ ＢＬ６細胞から放出されたＨＬＧＡＧサッカライドフラ
グメントの組成分析の結果を示す。
【図１３Ｆ】 図１３Ｆは、Ｂ１６ ＢＬ６細胞から放出されたＨＬＧＡＧサッカライドフラ
グメントの組成分析の結果を示す。
【図１４】 図１４は、ＨＬＧＡＧフラグメントによって調節されたＦＧＦ２シグナル伝達
を示す棒グラフである。
【図１５】 図１５は、Ｂ１６ ＢＬ６フラグメントによるＦＧＦ２活性のインビボ調節を
示す表（１５ａ）および略図（１５ｂ）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 17/06 ４Ｃ０８４ 17/06 27/02 ４Ｃ０８６ 27/02 35/00 ４Ｃ０９０ 35/00 35/04 35/04 Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ０８Ｂ 37/10 // Ｃ０８Ｂ 37/10 Ａ６１Ｋ 37/56 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ドンファン， リウ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01701， フラミンガム， メリアム ロ ード 16 (72)発明者 ポジャセック， ケビン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， インマン ス トリート 26 ナンバー３シー (72)発明者 シュリバー， ザチャリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， インマン ス トリート 26 ナンバー３シー (72)発明者 ホリー， クリスティン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02114， ボストン， テンプル ストリ ート 21 ユニット ナンバー８ (72)発明者 エル−シャブラウィ， ヨスフ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， マサチューセ ッツ アベニュー 77 (72)発明者 ベンカタラマン， ガネッシュ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01801， ウォバーン， ローカス アベ ニュー 111 ナンバー17シー２ (72)発明者 サシセックハラン， ラム アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， マサチューセ ッツ アベニュー 2130 ナンバー713 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA02 4B050 CC04 DD02 GG10 LL01 4B063 QA11 QQ20 QQ67 QR18 QR23 4B064 AF17 AF22 CA22 DA05 4C076 AA95 BB01 BB11 CC27 CC41 EE59 4C084 AA02 AA03 BA01 BA02 BA23 BA42 BA44 DC26 MA02 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA332 ZA362 ZA892 ZB262 ZC192 4C086 AA01 AA02 EA27 MA01 MA02 MA04 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA33 ZA36 ZA89 ZB26 ZC19 4C090 AA04 AA09 BA68 BB02 BB17 BB22 BB24 BB55 BC27 CA42 DA09 DA23

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 腫瘍の増殖を防止するための方法であって、腫瘍細胞を該腫
    瘍細胞の増殖を防止するために有効な量のヘパリナーゼＩＩＩに曝して、該腫瘍
    の成長を防止する工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、改変されたヘパリナーゼＩＩＩ
    である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、ネイティブのヘパリナーゼＩＩ
    Ｉである、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、前記腫瘍にインビボで注入され
    る、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、腫瘍を有する被験体に全身投与
    される、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、腫瘍を有する被験体に経口投与
    される、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記腫瘍細胞が、前記ヘパリナーゼＩＩＩをインビトロで投
    与される、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、抗癌剤と組み合わせて投与され
    る、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、非転移性腫瘍を有する被験体に
    投与されて、該腫瘍が転移性になるのを防止する、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記腫瘍が、前立腺腫瘍および黒色腫からなる群より選択
    される、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、任意の付加的な抗癌剤を伴わ
    ずに被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 腫瘍細胞の転移を防止するための方法であって、関門を超
    えて該腫瘍細胞が浸潤するのを防止するために有効な量のヘパリナーゼＩＩＩに
    該腫瘍細胞を曝す工程を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、改変されたヘパリナーゼＩＩ
    Ｉである、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、ネイティブのヘパリナーゼＩ
    ＩＩである、請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、インビボで抗癌剤と組み合わ
    せて投与される、請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記関門が、インビボの細胞関門である、請求項１２に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記関門が、細胞外マトリクスで被覆された膜のインビト
    ロの関門である、請求項１２に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 腫瘍の処置のために治療剤を調製するための方法であって
    、以下： 腫瘍の少なくとも一部を単離する工程； 該腫瘍の一部をヘパリナーゼＩＩＩで処理し、ＨＬＧＡＧフラグメントを生成
    する工程；および ＨＬＧＡＧフラグメントを単離する工程、 を包含し、ここで、該ＨＬＧＡＧフラグメントが該治療剤である、方法。
  19. 【請求項１９】 前記ＨＬＧＡＧフラグメントの配列を決定する工程をさら
    に包含する、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 腫瘍を有する被験体を処置するための方法であって、該被
    験体に治療用ＨＬＧＡＧフラグメントを投与して、該腫瘍を処置する工程を包含
    する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記被験体に投与される前記治療用ＨＬＧＡＧフラグメン
    トは、前記腫瘍がヘパリナーゼＩＩＩに接触されるときに同定される該ＨＬＧＡ
    Ｇフラグメントの配列に基づき生成された合成ＨＬＧＡＧフラグメントである、
    請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記被験体に投与される前記治療用ＨＬＧＡＧフラグメン
    トは、前記腫瘍がヘパリナーゼＩＩＩに接触されるときに産生される、単離され
    たＨＬＧＡＧフラグメントである、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 薬学的に受容可能なキャリア中に、腫瘍細胞の転移を防止
    するために有効な量のヘパリナーゼＩＩＩまたは治療用ＨＬＧＡＧフラグメント
    、および該ヘパリナーゼＩＩＩを該腫瘍に標的化するための標的化分子を含む組
    成物であって、ここで、該ヘパリナーゼＩＩＩまたは治療用ＨＬＧＡＧフラグメ
    ントが、該標的化分子に連結されている、組成物。
  24. 【請求項２４】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、改変されたヘパリナーゼＩＩ
    Ｉである、請求項２３に記載の組成物。
  25. 【請求項２５】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、ネイティブのヘパリナーゼＩ
    ＩＩである、請求項２３に記載の組成物。
  26. 【請求項２６】 前記標的化分子が、前記腫瘍細胞の表面上の抗原に対して
    特異的に結合する化合物である、請求項２３に記載の組成物。
  27. 【請求項２７】 薬学的に受容可能なキャリア中に、腫瘍細胞の転移を防止
    するために有効な量のヘパリナーゼＩＩＩまたは治療用ＨＬＧＡＧフラグメント
    、および抗癌性化合物を含む、組成物。
  28. 【請求項２８】 実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩであって、配列番号２
    の成熟ペプチドのアミノ酸配列を有するか、または酵素機能に非必須である残基
    にそれらの保存的な置換を有するポリペプチドを含み、ここで、Ｈｉｓ３６、Ｈ
    ｉｓ１０５、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１３９、Ｈｉｓ１５２、Ｈｉｓ２２５、Ｈｉ
    ｓ２３４、Ｈｉｓ２４１、Ｈｉｓ４２４、Ｈｉｓ４６９、およびＨｉｓ５３９か
    らなる群より選択される少なくとも１つのヒスチジン残基が、アラニン、セリン
    、チロシン、スレオニン、およびリジンからなる群より選択される残基で置換さ
    れている、ヘパリナーゼＩＩＩ。
  29. 【請求項２９】 前記ポリペプチドが、Ｈｉｓ１１０およびＨｉｓ２４１か
    らなる群より選択されるヒスチジン残基に少なくとも１つの置換を有する、請求
    項２８に記載の実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩ。
  30. 【請求項３０】 前記ポリペプチドが、Ｈｉｓ１１０での置換を有する、請
    求項２８に記載の実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩ。
  31. 【請求項３１】 前記ポリペプチドが、Ｈｉｓ２４１での置換を有する、請
    求項２９に記載の実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩ。
  32. 【請求項３２】 実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩであって、改変された
    生成物プロフィールを有する改変されたヘパリナーゼＩＩＩを含み、ここで、該
    改変されたヘパリナーゼＩＩＩの該改変された生成物プロフィールは、ネイティ
    ブのヘパリナーゼＩＩＩのネイティブの生成物プロフィールと少なくとも１０％
    異なる、ヘパリナーゼＩＩＩ。
  33. 【請求項３３】 実質的に純粋なヘパリナーゼＩＩＩであって、改変された
    ペパリナーゼＩＩＩ Ｋｃａｔ値を有する硫酸ヘパラン基質を切断し得る改変さ
    れたヘパリナーゼＩＩＩを含み、ここで、該改変されたペパリナーゼＩＩＩ Ｋ ｃａｔ 値は、ネイティブのペパリナーゼＩＩＩ Ｋｃａｔ値と少なくとも１０％
    異なる、ヘパリナーゼＩＩＩ。
  34. 【請求項３４】 請求項２８〜請求項３３のいずれか１項に記載の実質的に
    純粋なヘパリナーゼＩＩＩの滅菌処方物および薬学的に受容可能なキャリアを含
    む、薬学的調製物。
  35. 【請求項３５】 固定された実質的に純粋な改変されたヘパリナーゼＩＩＩ
    であって、請求項２８〜請求項３３のいずれか１項に記載される改変されたパリ
    ナーゼＩＩＩおよび固体支持体を含み、ここで、該改変されたヘパリナーゼＩＩ
    Ｉが、該固体支持体に固定されている、ヘパリナーゼＩＩＩ。
  36. 【請求項３６】 ヘパリン様グリコサミノグリカンを特異的に切断する方法
    であって、ヘパリン様グリコサミノグリカンと、請求項２８、請求項３２、また
    は請求項３３のいずれか１項に記載の改変されたヘパリナーゼＩＩＩを接触させ
    る工程を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 前記方法が、ＨＬＧＡＧフラグメント含有液体から活性な
    ＨＬＧＡＧフラグメントを除去する方法である、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、固体支持体に固定化されてい
    る、請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記方法が、新脈管形成を阻害するための方法であり、そ
    して新脈管形成を阻害するために有効な量の前記ヘパリナーゼＩＩＩが、その処
    置の必要な被験体に投与される、請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、腫瘍に投与される、請求項３
    ６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、生物分解性、生物適合性のポ
    リマー送達デバイス中で投与される、請求項３６に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、注射のために薬学的に受容可
    能なビヒクル中で投与される、請求項３６に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、腫瘍に成長する血管の数を減
    少させるために有効な量で投与される、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、眼への局所適用のために薬学
    的に受容可能なビヒクル中で投与される、請求項３６に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、異常な新生血管形成により特
    徴付けられる眼の疾患の症状を減少させるために有効な量で投与される、請求項
    ４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、局所投与に適した薬学的なビ
    ヒクル中で投与される、請求項３６に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記ヘパリナーゼＩＩＩが、乾癬の症状を減弱させるのに
    有効な量で投与される、請求項３６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記方法が、細胞増殖を阻害するための方法である、請求
    項３６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記方法が、ＨＬＧＡＧフラグメントを配列決定するため
    の方法である、請求項３６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 癌を有するかまたは癌を発症する危険を有する被験体を、
    該被験体に治療用ＨＬＧＡＧフラグメントを投与することにより、処置または防
    止する工程を包含する、方法。
  51. 【請求項５１】 前記治療用ＨＬＧＡＧフラグメントが、ＨＬＧＡＧフラグ
    メントの組成物であり、ここで、該ＨＬＧＡＧフラグメントの少なくとも５０％
    が、二硫酸化または三硫酸化されたジサッカライドである、請求項５０に記載の
    方法。
  52. 【請求項５２】 前記治療用ＨＬＧＡＧフラグメントが、ＨＬＧＡＧフラグ
    メントの組成物であり、ここで、該ＨＬＧＡＧフラグメントの少なくとも７５％
    が、二硫酸化または三硫酸化されたジサッカライドである、請求項５０に記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 前記治療用ＨＬＧＡＧフラグメントが、ＨＬＧＡＧフラグ
    メントの組成物であり、ここで、該ＨＬＧＡＧフラグメントの少なくとも９０％
    が、二硫酸化または三硫酸化されたジサッカライドである、請求項５０に記載の
    方法。
  54. 【請求項５４】 前記治療用ＨＬＧＡＧフラグメントが、一硫酸化されてい
    るかまたは硫酸化されていないジサッカライドを含まない、請求項５０に記載の
    方法。
  55. 【請求項５５】 ＬＭＷＨを調製するための方法であって、ＨＬＧＡＧサン
    プルと、改変されたヘパリナーゼＩＩＩ分子を接触させて、ＬＭＷＨを生成する
    工程を包含する、方法。
  56. 【請求項５６】 請求項５５の方法により生成されたＬＭＷＨを含む、組成
    物。
  57. 【請求項５７】 凝固に関連する障害を処置または防止するための方法であ
    って、有効量の請求項５６に記載の組成物を被験体に投与して、凝固に関連する
    障害を処置または防止する工程を包含する、方法。
  58. 【請求項５８】 腫瘍を処置または防止するための方法であって、有効量の
    請求項５６に記載の組成物を被験体に投与して、該被験体における腫瘍を処置ま
    たは防止する工程を包含する、方法。
  59. 【請求項５９】 乾癬を処置または防止するための方法であって、有効量の
    請求項５６に記載の組成物を被験体に投与して、該被験体における乾癬を処置ま
    たは防止する工程を包含する、方法。
  60. 【請求項６０】 新生血管形成を処置または防止するための方法であって、
    有効量の請求項５６に記載の組成物を被験体に投与して、該被験体における新生
    血管形成を処置または防止する工程を包含する、方法。
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