CN110922507A - 一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，包括：将肝素钠降解、还原、氧化，收集氧化液，调节为弱酸性，加入二氯甲烷，混合均匀，过滤；收集滤液，加入氯化钠，混合均匀后醇沉、紫外照射，分子量分级，冻干，即得。可以有效地提高低分子量肝素钠的纯度和收率。该方法制备成本低、操作简单容易、耗时少、效率高、稳定性好、环境友好，重复性好、易于普适性和规模化生产。

Description

一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺

技术领域

本发明属于低分子量肝素钠生产制备领域，具体涉及一种质量好收率高的低 分子量肝素钠生产工艺。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不 必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所 公知的现有技术。

肝素钠(Heparin sodium)能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝 血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合，而增强 后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用，其后果涉及阻止血小板 凝集和破坏、妨碍凝血激活酶的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，抑制凝血酶， 从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而发挥抗凝作用。

而低分子肝素钠与普通肝素钠相比，具有如下明显优势：更低的重均分子量(5600-6400)，更大的AXa/AIIa值(1.9-3.2)，更长的半衰期(2.8-4.1h)，这些特点使 达肝素钠较普通低分子肝素钠更为安全、有效。因此，低分子肝素钠制备工艺受 到本领域广泛关注。

但发明人发现：现有的低分子肝素钠的制备工艺受原料肝素钠质量影响较 大，产品的质量仍有待提升。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产 工艺。可以有效地提高低分子量肝素钠的纯度和收率。该方法制备成本低、操作 简单容易、耗时少、效率高、稳定性好、环境友好，重复性好、易于普适性和规 模化生产。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，包括：

将肝素钠进行降解、还原、氧化，收集氧化液，调节为弱酸性，加入二氯甲 烷，混合均匀，过滤；

收集滤液，加入氯化钠，混合均匀后醇沉、紫外照射，分子量分级，冻干， 即得。

本申请研究发现：在含肝素钠的氧化液中加入一定量的二氯甲烷，可以有效 地提高低分子量肝素钠的纯度和收率。

在一些实施例中，所述二氯甲烷的加入量为滤液体积的0.1-5％。

在一些实施例中，所述弱酸性的pH值为6.20±0.02。

在一些实施例中，所述弱酸性的调节采用强碱或弱碱盐。

在一些实施例中，所述弱酸性的调节采用氢氧化钠，其浓度为18.0～22.0％ W/V。

在一些实施例中，所述冻干处理前进行真空旋转干燥。

在一些实施例中，所述真空旋转干燥的具体步骤为：将终滤液进行真空旋转 干燥至待收集液体为滤液体积的1/3后，补水至原体积。

在一些实施例中，所述真空旋转干燥的温度为45℃以下。

本发明还提供了任一上述的方法制备的低分子量肝素钠。

本发明还提供了上述的低分子量肝素钠在制备抗栓、抗凝血、抗炎或抗肿瘤 药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明可以有效地提高低分子量肝素钠的纯度和收率。该方法制备成 本低、操作简单容易、耗时少、效率高、稳定性好、环境友好，重复性好、易于 普适性和规模化生产。

(2)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。 除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出， 否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或 它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对低分子量肝素钠纯度低、收率低的问题。因此， 本发明提出一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺。可以有效地提高低分 子量肝素钠的纯度和收率。该方法制备成本低、操作简单容易、耗时少、效率高、 稳定性好、环境友好，重复性好、易于普适性和规模化生产。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具 体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：

1.溶解

精密称定精品肝素钠，用纯化水溶解成10％(W/V)的溶液。

2.降解

精密称取亚硝酸钠固体，质量为上述肝素钠质量的2.5％(w/w)，倒入小烧 杯中，量取适量纯化水加入烧杯内使亚硝酸钠完全溶解，配置成25％(W/V) 的试液备用。肝素钠溶解完全后，调节料液的pH值至2.6。pH调节完成后将准 备好的亚硝酸钠溶液倒入反应体系中。体系反应半小时后，每十分钟取一次料液 与淀粉碘化钾试液(配置有效期内使用，也可使用淀粉碘化钾试纸代替)混合， 3s内淀粉碘化钾试液未变蓝则降解反应结束。

3.还原

降解反应完毕后，用pH计测量料液的pH,滴加20.0％(W/V)的氢氧化钠 溶液调节料液的pH至10.0，此操作在10min中完成。精密称取前述肝素钠质量 1％(w/w)的硼氢化钠固体倒入料液中，维持低速搅拌(搅拌速度视液面放出 气泡情况而定，以不放出或者少放出气泡为宜)和pH值反应12小时。还原反 应完成后，测量pH,滴加6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至4.0，维持反应30min。

4.氧化

还原结束后，加入20％(W/V)氢氧化钠调药液pH10，加入1.0％的过氧化 氢(30％,v/v)，每2小时调pH10维持稳定，静置氧化12小时。

5.紫外

氧化结束后过滤，过滤完成后，滴加20.0％(W/V)的氢氧化钠溶液调节药 液的ph至6.20，加入二氯甲烷若干(药液体积的2.5％(v/v))，搅拌30分以上， 再过滤。称取料液体积1.5％(w/v)的氯化钠固体加入滤液中，使溶解。用量筒 量取料液1倍体积的乙醇(95％乙醇需要过滤)，边搅拌边将量取的乙醇倒入烧 杯中，乙醇加入完毕后适量搅拌20min，静置放置，时间为9小时。(根据沉淀 现象决定时间，上清液越清越好)。沉淀结束后，倒掉上清液，留取沉淀。取纯 化水适量倒入烧杯中使溶解浓度为8％(w/v)，搅拌使沉淀溶解。沉淀完全溶解 后，用6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至6.20，将药液全部转移至紫外照射仪 内，开启紫外照射仪，照射时间为1h。

6分子量分级

照射后过滤，滤液测量其体积，称取料液1.5％的氯化钠固体，加入料液中， 搅拌使溶解。量筒量取料液体积0.9倍体积的乙醇(95％乙醇)，边搅拌边倒入 料液中，倒入完毕后静置9小时。静置结束后倾倒上清液，留取沉淀。

将沉淀用纯化水溶解，使成8％(w/v)的溶液。取料液2ml送检分子量， 用6mol/L盐酸溶液调节药液的ph至6.20，过滤(同上)。取滤液体积0.9倍体 积的乙醇(95％乙醇)，边搅拌边倒入料液中，倒入完毕后静置9小时。静置结 束后倾倒上清液，留取沉淀。将将沉淀用纯化水溶解，使成10％的溶液，取样 测分子量。若分子量检测不合格重复上述步骤6，直至分子量合格后，进行下一 步。

7.冻干

将步骤6中的终滤液，放入旋转干燥仪，进行真空旋干，条件为40℃，拉 真空，待收集液体为滤液体积的1/3后，停止真空干燥，对滤液进行补水至原体 积，过滤后滤液直接送入冻干机冻干。

实施例2：

1.溶解

精密称定精品肝素钠，用纯化水溶解成5％(W/V)的溶液。

2.降解

精密称取亚硝酸钠固体，质量为上述肝素钠质量的2.2％％(w/w)，倒入小 烧杯中，量取适量纯化水加入烧杯内使亚硝酸钠完全溶解，配置成25％(W/V) 的试液备用。肝素钠溶解完全后，调节料液的pH值至2.3。pH调节完成后将准 备好的亚硝酸钠溶液倒入反应体系中。体系反应半小时后，每十分钟取一次料液 与淀粉碘化钾试液(配置有效期内使用，也可使用淀粉碘化钾试纸代替)混合， 3s内淀粉碘化钾试液未变蓝则降解反应结束。

3.还原

降解反应完毕后，用pH计测量料液的pH,滴加20.0％(W/V)的氢氧化钠 溶液调节料液的pH至10.0，此操作在10min中完成。精密称取前述肝素钠质量 1％(w/w)的硼氢化钠固体倒入料液中，维持低速搅拌(搅拌速度视液面放出 气泡情况而定，以不放出或者少放出气泡为宜)和pH值反应12小时。还原反 应完成后，测量pH,滴加6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至4.0，维持反应30min。

4.氧化

还原结束后，加入20％(W/V)氢氧化钠调药液pH10，加入1.0％的过氧化 氢(30％,v/v)，每2小时调pH10维持稳定，静置氧化12小时。

5.紫外照射

氧化结束后过滤，过滤完成后，滴加20.0％(W/V)的氢氧化钠溶液调节药 液的pH至6.20，加入二氯甲烷若干(药液体积的0.1％(v/v))，搅拌30分以上， 再过滤。称取料液体积1.5％(w/v)的氯化钠固体加入滤液中，使溶解。用量筒 量取料液1倍体积的乙醇(95％乙醇需要过滤)，边搅拌边将量取的乙醇倒入烧 杯中，乙醇加入完毕后适量搅拌20min，静置放置，时间为12小时。(根据沉淀 现象决定时间，上清液越清越好)。沉淀结束后，倒掉上清液，留取沉淀。取纯 化水适量倒入烧杯中使溶解浓度为5％(w/v)，搅拌使沉淀溶解。沉淀完全溶解 后，用6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至6.20，将药液全部转移至紫外照射仪 内，开启紫外照射仪，照射时间为2h。

6分子量分级

照射后过滤，滤液测量其体积，称取料液1.5％的氯化钠固体，加入料液中， 搅拌使溶解。量筒量取料液体积0.7倍体积的乙醇(95％乙醇)，边搅拌边倒入 料液中，倒入完毕后静置12小时。静置结束后倾倒上清液，留取沉淀。

将沉淀用纯化水溶解，使成5％(w/v)的溶液。取料液2ml送检分子量， 用6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至6.20，过滤(同上)。取滤液体积0.7倍体 积的乙醇(95％乙醇)，边搅拌边倒入料液中，倒入完毕后静置12小时。静置结 束后倾倒上清液，留取沉淀。将将沉淀用纯化水溶解，使成5％的溶液，取样测 分子量。若分子量检测不合格重复上述步骤6，直至分子量合格后，进行下一步。

7.冻干

将步骤6中的终滤液，放入旋转干燥仪，进行真空旋干，条件为40℃下， 拉真空，待收集液体为滤液体积的1/3后，停止真空干燥，对滤液进行补水至原 体积，过滤后滤液直接送入冻干机冻干。

实施例3：

1.溶解

精密称定精品肝素钠，用纯化水溶解成15％(W/V)的溶液。

2.降解

精密称取亚硝酸钠固体，质量为上述肝素钠质量的2.9％(w/w)，倒入小烧 杯中，量取适量纯化水加入烧杯内使亚硝酸钠完全溶解，配置成25％(W/V) 的试液备用。肝素钠溶解完全后，调节料液的pH值至2.9。pH调节完成后将准 备好的亚硝酸钠溶液倒入反应体系中。体系反应半小时后，每十分钟取一次料液 与淀粉碘化钾试液(配置有效期内使用，也可使用淀粉碘化钾试纸代替)混合， 3s内淀粉碘化钾试液未变蓝则降解反应结束。

3.还原

降解反应完毕后，用pH计测量料液的pH,滴加20.0％(W/V)的氢氧化钠 溶液调节料液的pH至10.0，此操作在10min中完成。精密称取前述肝素钠质量 1％(w/w)的硼氢化钠固体倒入料液中，维持低速搅拌(搅拌速度视液面放出 气泡情况而定，以不放出或者少放出气泡为宜)和pH值反应12小时。还原反 应完成后，测量pH,滴加6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至4.0，维持反应30min。

4.氧化

还原结束后，加入20％(W/V)氢氧化钠调药液pH10，加入1.0％的过氧化 氢(30％,v/v)，每2小时调pH10维持稳定，静置氧化12小时。

5.紫外照射

氧化结束后过滤，过滤完成后，滴加20.0％(W/V)的氢氧化钠溶液调节药 液的pH至6.20，加入二氯甲烷若干(药液体积的5％(v/v))，搅拌30分以上， 再过滤。称取料液体积1.5％(w/v)的氯化钠固体加入滤液中，使溶解。用量筒 量取料液1倍体积的乙醇(95％乙醇需要过滤)，边搅拌边将量取的乙醇倒入烧 杯中，乙醇加入完毕后适量搅拌20min，静置放置，时间为6小时。(根据沉淀 现象决定时间，上清液越清越好)。沉淀结束后，倒掉上清液，留取沉淀。取纯 化水适量倒入烧杯中使溶解浓度为10％(w/v)，搅拌使沉淀溶解。沉淀完全溶 解后，用6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至6.20，将药液全部转移至紫外照射 仪内，开启紫外照射仪，照射时间为10min。

6分子量分级

照射后过滤，滤液测量其体积，称取料液1.5％的氯化钠固体，加入料液中， 搅拌使溶解。量筒量取料液体积1.0倍体积的乙醇(95％乙醇)，边搅拌边倒入 料液中，倒入完毕后静置6小时。静置结束后倾倒上清液，留取沉淀。

将沉淀用纯化水溶解，使成10％(w/v)的溶液。取料液2ml送检分子量， 用6mol/L盐酸溶液调节药液的pH至6.20，过滤(同上)。取滤液体积1.0倍体 积的乙醇(95％乙醇)，边搅拌边倒入料液中，倒入完毕后静置6小时。静置结 束后倾倒上清液，留取沉淀。将将沉淀用纯化水溶解，使成15％的溶液，取样 测分子量。若分子量检测不合格重复上述步骤6，直至分子量合格后，进行下一 步。

7.冻干

将步骤6中的终滤液，放入旋转干燥仪，进行真空旋干，条件为45℃下， 拉真空，待收集液体为滤液体积的1/3后，停止真空干燥，对滤液进行补水至原 体积，过滤后滤液直接送入冻干机冻干。

对比例1

与实施例1的不同之处在于：步骤5中，未加入二氯甲烷。

对比例2

与实施例1的不同之处在于：步骤5中，加入三氯醋酸代替二氯甲烷。

对比例3

与实施例1的不同之处在于：步骤5中，加入三氟三氯乙烷代替二氯甲烷。

对比例3

与实施例1的不同之处在于：步骤5中，加入醋酸乙烯代替二氯甲烷。

实验测试

实验过程中采用两种方法判断低分子肝素钠中蛋白质及核酸的残留是否符 合规定：一种是澄清度，质量标准规定澄清度应小于0.5号；一种是检测260nm、 280nm处紫外吸收，质量标准规定在260nm、280nm处肝素钠的紫外吸收均应 小于0.1，具体的检测方法如下：取本品，加水制成每1ml含2mg的溶液，照紫 外分光光度法(附录IV A)测定，在260nm的波长处，其吸光度不得大于0.10； 在280nm的波长处，其吸光度不得大于0.10；

表1低分子肝素钠检测结果

从上述实验数据可以看出，在步骤5中加入二氯甲烷的实验较不加入二氯甲 烷、加入三氯醋酸、三氟三氯乙烷、醋酸乙烯的产品澄清度符合标准要求，在 260nm、280nm处的紫外吸收值与其他对比实验相较紫外吸收数值更加低，说明 产品中蛋白质的杂质含量非常低，因此加入二氯甲烷使产品低分子肝素钠质量更 加的优越。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并 不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术 方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但 并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发 明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可 做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内，特别说明的是，低分子肝素钙是低分子肝素钠的延伸同样适用二氯甲烷去除杂质工 艺。

Claims (10)

1.一种质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，包括：

将肝素钠降解、还原、氧化，收集氧化液，调节为弱酸性，加入二氯甲烷，混合均匀，过滤；

收集滤液，加入氯化钠，混合均匀后醇沉、紫外照射，分子量分级，冻干，即得。

2.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述二氯甲烷的加入量为滤液体积的0.1-5％。

3.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述弱酸性的pH值为6.20±0.02。

4.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述弱酸性的调节采用强碱或弱碱盐。

5.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述弱酸性的调节采用氢氧化钠，其浓度为18.0～22.0％W/V。

6.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述冻干处理前进行真空旋转干燥。

7.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述真空旋转干燥的具体步骤为：将终滤液进行真空旋转干燥至待收集液体为滤液体积的1/3后，补水至原体积。

8.如权利要求1所述的质量好收率高的低分子量肝素钠生产工艺，其特征在于，所述真空旋转干燥的温度为45℃以下。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法制备的低分子量肝素钠。

10.权利要求9所述的低分子量肝素钠在制备抗栓、抗凝血、抗炎或抗肿瘤药物中的应用。