FI107388B - Menetelmä puhdistettujen hepariinifraktioiden valmistamiseksi, jotka eivät sisällä nitrosoyhdisteitä - Google Patents

Description

107388

Menetelmä puhdistettujen hepariinifraktioiden valmistamiseksi, jotka eivät sisällä nitrosoyhdisteitä Tämä keksintö koskee menetelmää hepariinin puhdis-5 tettujen fraktioiden valmistamiseksi, joissa ei ole ollenkaan nitrosoyhdisteitä. Puhdistetut fraktiot ovat käyttökelpoisia lääkkeissä.

Tämä keksintö koskee erityisesti hepariinifraktioiden valmistusta, jotka on saatu typpihapokedepolyme-10 roinnilla ja joissa ei ole lainkaan nitrosoyhdisteitä.

On tunnettua, että hepariinin fraktioita valmistetaan typpihapokedepolymeroinnilla, kuten EP-hakemusjulkaisussa nro 0 014 184 ja 0 027 089 esimerkeissä kuvataan. Tietyt hepariinifraktiot, joita on valmistettu typpihapo-15 kedepolymeroinnilla, ovat vaikuttavina aineina lääkkeissä, joista yleisesti käytetään nimitystä "pienimolekyyliset hepariinit" tai "molekyylipainoltaan pienet hepariinit". Lääkkeinä käytettyjen pienimolekyylisten hepariinien muut yksityiskohdat, niiden pitoisuus ja sulfatoitumisaste, jo-20 ta kuvataan sulfaatti/karboksyylisuhteella, käyvät ilmi viittenä annetuista julkaisuista "Häparines de faible masse moleculaire". Pharmeuropa, lokakuu 1991, 3., nro 3, ss. 161 - 165 sekä monografiasta, jota on ehdotettu Euroopan . farmakopeaan "Heparina massae molecularis minoris", hei- « « 25 mikuu 1993, (PA/PH/Exp. 3T (92) 93) . Näin valmistettuja t · · ’·* * pienimolekyylisiä hepariineja, joita käytetään lääkkeiden • · · *·...* vakuttavina aineina, on kuvattu EP-hakemusjulkaisuissa nu- meroilla 0 037 319, 0 076 279, 0 181 259 tai FR-hakemus- •j* julkaisussa 2 478 646, Ne tunnetaan kansainvälisessä INN- :*·*: 30 luokituksessa kalsiumnadropariinina, natriumdaltepariini- na, natriumrevipariinina ja ne sisältävät vaikuttavina aineina kaupallisia tai potentiaalisesti kaupallisia eri- • · ... tyisyhdisteitä. Etenkin natriumrevipariini sisältää vai- kuttavana aineena CLIVARINEr-nimistä erityisyhdistettä, : 35 jota myydään kaupallisena Saksassa. Muita pienimolekyyli- • · • · « · « · 2 107388 siä hepariineja, joita on valmistettu typpihapokedepo-lymeroinnilla, on myös erikoisvalmisteissa, joita myy lääketehdas Saksassa (MONO-EMBOLEXR NM), Itävallassa (SANDOPARINr JA TROPARINr) ja Sveitsissä (SANDOPARINEr) .

5 Typpihapokedepolymeroinnissa muodostuu haihtumatto- mia nitrosoyhdisteitä (joita kutsutaan tästä lähtien N-NO-yhdisteiksi tai yksinkertaisesti N-NO:iksi) lisäämällä -NO-ryhmä hepariinissa tai sen fraktioissa tai fragmenteissa oleviin nitrautuviin komponentteihin. Vaikka nitro-10 soyhdisteiden määrä hepariinin fraktioissa olisikin hyvin pieni eikä estäisi niiden käyttöä lääkkeinä, koska kyse on haihtumattomista yhdisteistä, näiden yhdisteiden valmistaminen teollisuusmittakaavassa edellyttää suurten jauhemää-rien käsittelemistä. Niiden täydellinen tai lähes täydel-15 linen poistaminen olisi siis hyödyllistä pienimolekyylisten hepariinien ominaisuuksien parantamiseksi, joita käytetään vaikuttavina aineina farmaseuttisissa erityisvalmisteissa .

Pienimolekyylisten hepariinien tapauksessa, jossa 20 niiden keskimääräinen molekyylipaino on pieni, esimerkiksi yhdisteellä, jota tästä lähtien kutsutaan CY 222:ksi (keskimääräinen molekyylipaino 1 700 - 3 300 Da) , nitrosoyh-disteiden määrä voi olla suurempi kuin suurempimolekyyli- . sillä yhdisteillä. Tämä yhdiste vastaa määritelmää, joka • · ·;· · 25 on esitetty FR-hakemusjulkaisun nro 2 478 646 ja EP-hake- • » · V 1 musjulkaisun nro 0 037 319 patenttivaatimuksissa, ja sitä • · · ·...1 voidaan valmistaa samoissa patenttihakemuksissa tai -jul- • ♦ :/·♦ kaisuissa kuvatuilla menetelmillä.

*ϊ1 Edellä mainituista syistä johtuen on siis mitä suo- :1·1: 30 tavinta voida käyttää hepariinin fraktioita, joita on vai- mistettu typpihapokedepolymeroinnilla ja jotka ovat käy-tännöllisesti katsoen ilman nitrosoyhdisteitä.

• · .... Menetelmä nitraattien poistamiseksi juomavedestä yhtaikaa veden steriloinnin yhteydessä säteilyttämällä · 35 ultraviolettisäteillä, joiden aallonpituus on pienempi « « « • · · « « · • « • · · « · • · « · · 3 107388 kuin 200 nm, mieluiten 185 nm, ja emäksisessä pHrssa, on kuvattu P. PRINCZin et ai. artikkelissa, Water Supply, c 1998, 6., 199 - 205. Kuitenkaan tästä asiakirjasta, joka koskee veden käsittelyä, ei käy ilmi, voitaisiinko ultra-5 violettisäteilyä soveltaa biologisesti aktiiviseen yhdis teeseen ilman, että sillä olisi turmiollisia vaikutuksia sen biologisiin ja/tai fysikokemiallisiin ominaisuuksiin.

Nyt on keksitty, että säteilyttämällä ultraviolettisäteilyllä (jäljempänä käytetään yksinkertaisesti lyhen-10 nettä UV-säteily) typpihapokedepolymeroinnilla valmistet tuja hepariinifraktioita, voidaan poistaa melkein kokonaan siinä olevat nitrosoyhdisteet, jolloin saadaan puhdistettuja hepariinifraktioita, joiden nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on sama tai jopa pienempi kuin luonnon heparii-15 nissa.

Nyt on myös keksitty, että käytetyissä olosuhteissa UV-säteily ei muuta hepariinifraktioiden rakennetta, mikä säilyttää niiden kaikki biologiset ja fysikokemialliset ominaisuudet.

20 Keksinnön kohteena on menetelmä hepariinifraktion valmistamiseksi, jonka nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on pienempi tai yhtäsuuri kuin 500 ppb, siten, että hepariinifraktion vesiliuosta, joka on valmistettu typpihapokedepolymeroinnilla, säteilytetään ultraviolettisäteily!- ::U 25 lä· • · « *.· 1 Siten tämä keksintö koskee erään näkökohdan mukaan

Ml '·...· typpihapokedepolymeroinnilla saatujen hepariinifraktioi- • · :#·.ί den valmistusta, joiden nitrosoyhdisteiden kokonaispitoi- ··· suus on pienempi tai yhtäsuuri kuin 500 miljoonasosaa • · · · 30 (ppb) , edullisesti pienempi tai yhtäsuuri kuin 150 ppb, mieluiten pienempi tai yhtäsuuri kuin 100 ppb, mieluiten vielä pienempi kuin 50 ppb, 50 ppb:n pitoisuus on pienin • · ... nykyisellä tietämyksellä kvantitoitavissa oleva määrä.

*;1 Mainitut fraktiot ovat mieluiten pienimolekyylisiä hepa- ·.· · 35 riineja.

• « « • · • · • · · « · • · · • · · • 1 · · « · • · • · · 4 107388

Erään edullisen näkökohdan mukaan keksintö koskee pienimolekyylisen hepariinin valmistusta, jota on valmistettu typpihapokedepolymeroinnilla, nimittäin depolymeroi-dun hepariinin valmistusta, joka on valmistettu typpihapo-5 kedepolymeroinnilla luonnosta peräisin olevasta hepa- riinista, mieluiten sian ohutsuolen limakalvosta, naudan keuhkoista tai mistä muusta hepariinista tahansa, joka on uutettu erilaisten eläinten kudoksista tai elimistä ja joilla on seuraavat ominaispiirteet: 10 keskimääräinen molekyylipaino on pienempi kuin 8 000 Da, ainakin 60 % komponenteista on molekyylipainoltaan pienmpää kuin 8 000 Da, anti-faktori Xa -aktiivisuus ei ole pienempi kuin 15 60 IU/mg, suhde anti-faktori Xa/anti-faktori Ha ei ole pienempi kuin 1,5, nitrosoyhdisteiden kokokonaispitoisuus on yhtäsuuri tai pienempi kuin 500 ppb, edullisesti pienempi kuin 150 20 ppb, mieluiten pienempi kuin 100 ppb, mieluiten vielä pienempi kuin 50 ppb, mainittu depolymeroitu hepariini on farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodossa, mieluiten natrium- tai kal- . siumsuolana.

• · ;· · 25 Anti-faktori Xa -aktiivisuus ja suhde anti-faktori- V 1 Xa/antifaktori Ha -aktiivisuus evaluoidaan pienimolekyy- • · ·

·...· listen hepariinien kansaivälisellä standardilla; viite OMS

:2.i 1-85/600.

*:1 Keskimääräinen molekyylipaino määritetään Euroopan ;1·1; 3 0 farmakopealle ehdotetun monografian mukaan (katso edellä ollut viite).

Tässä kuvauksessa käyetään termiä "kokonaan ilman • · nitrosoyhdisteitä" kuvaamaan hepariinifraktioita tai pie- « nimolekyylisiä hepariineja, joita on valmistettu typpiha- • · :.· · 35 pokedepolymeroinnilla ja jotka sisältävät kaikkiaan kor- • · · • » • ♦ • · « · · · · • · 2 • « · 5 107388 keintaan 500 ppb, edullisesti korkeintaan 150 ppb, etenkin korkeintaan 100 ppb, mieluiten korkeintaan 50 ppb nitroso-yhdisteitä. Termillä "komponentit" tarkoitetaan molekyylien kokoelmaa, joista pienimolekyylinen hepariini on muo-5 dostunut.

Pienimolekyylisillä hepariineilla, joissa ei ole lainkaan nitrosoyhdisteitä ja joiden valmistus on tämän keksinnön kohteena, on suurimmassa osassa komponentteja 2-O-sulfo-a-L-idopyranoosiuronihapporakenne pelkistämättö-10 mässä päässä ja 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolirakenne pelkistävässä päässä ja sen sulfatoitumisaste ei eroa juurikaan luonnon fraktioimattomasta hepariinista. Tämä sul-fatoitumisaste on 2 - 2,5, mieluiten 2,0 - 2,3.

Pienimolekyylisten, tämän keksinnön mukaan edullis-15 ten hepariinien molekyylipainojakautuma vaihtelee, 90 % sen sisältämistä komponenteista on molekyylipainoltaan 2 000 - 10 000 Da, mieluiten 2 000 - 9 000 Da, edullisesti 2 000 - 8 000 Da. Toisaalta suurimmalla osalla näistä he-pariineista molekyylipaino on 3 000 - 6 000 Da, mieluiten 20 4 000 - 5 000 Da.

Toinen keksinnön mukainen hyvä pienimolekyylinen hepariini on pääasialliselta molekyylipainoltaan 1 700 - 3 300 Da, 90 % kaikista sen komponenteista on molekyyli-painoltaan 1 000 - 8 000 Da.

• < : 25 Termillä "pääasiallinen molekyylipaino" tarkoite-

Mf *.* * taan hepariinien komponenttien molekyylipainoja, jotka • · · :...· vastaavat kromatografiakäyrien piikkejä, jotka on saatu ♦ « geelisuodatuskromatografiällä, käyttämällä UV-detektoria, *:· jonka UV λ = 205 nm.

• · · · ·*·*· 3 0 Puhdistettu CY 222, joka on määritelty kuten depo- lymeroidun hepariinin natriumsuola, joka on valmistettu depolymeroimalla typpihapokkeella luonnollista sian ohut- • · suolen limakalvosta peräisin olevaa hepariinia, jonka: molekyylipaino on 1 700 - 3 300 Da, 90 % komponen- « « :,· · 35 teista on molekyylipainoltaan 1 000 - 8 000 Da, • « · « « • * « · * • · « « « • ·» • « 11» • · • · » « · 6 107388 pääasiallisten komponenttien rakenteessa on 2-0-sulfo-a-L-idopyranoosiuronihappo pelkistämättömässä päässä ja 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolirakenne pelkistävässä päässä, 5 sulfatoitumisaste on noin 2,1, anti-faktori Xa -aktiivisuus on 60 - 80 IU/mg, anti-faktori Ha -aktiivisuus ei ole suurempi kuin 25 IU/mg, tarkemmin 10 - 15 IU/mg, nitrosoyhdisteiden kokonaispitoisuus on pienempi 10 tai yhtäsuuri kuin 100 ppb (l1 10'7 mg nitrosoyhdisteitä mg:ssa yhdistettä), mieluiten pienempi tai yhtäsuuri kuin 50 ppb (5· 10'8 mg nitrosoyhdisteitä mg:ssa yhdistettä), esittää tämän keksinnön mukaista parasta hepariinifraktio-ta.

15 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan hepariini- fraktioita, jotka eivät sisällä lainkaan nitrosoyhdisteitä (pienimolekyylisiä hepariineja).

Hepariinifraktioita, jotka sisältävät korkeintaan kaikkiaan 500 ppb nitrosoyhdisteitä, valmistetaan säteily- 20 tettämällä typpihapokedepolymeroinnilla saadun hepariini- fraktion vesiliuosta ultraviolettisäteillä.

Lähtöaineena voidaan käyttää mitä tahansa typpihapokedepolymeroinnilla valmistettua hepariinifraktiota.

, Tällaisen lähtöyhdisteen sisältämä nitrosoyhdisteiden ko- « < 25 konaispitoisuus on yleensä 1 000 - 20 000 ppb.

• « 4 .1 ’ Nitrosoyhdisteiden kokonaismäärän määritys suorite- • · · taan B. Pignatellin et ai. menetelmällä, joka on kuvattu • « !,1·· julkaisussa Analyst, syyskuu 1989, 144. ss. 1103 - 1108 ja J1 Analyst, heinäkuu 1987, 112, ss. 945 - 949, sovellettuna

»IM

3 0 hepariinille ja sen fraktioille, mieluiten pienimolekyylisille hepariineille.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorit- • 0 ... taa farmaseuttista laatua olevalle pienimolekyyliselle he- « pariinille, joka on liuotettu veteen, tai teollisen vai- • · · 35 mistuksen aikana typpihapokedepolymerointivaiheen jälkeen : ja ennen farmaseuttista laatua olevan puhtaan tuotteen » • 1 « 1 · « · · » n t 1 4 « • · » 1 1 7 107388 eristämistä. Mieluiten käytetään farmaseuttista laatua olevaa pienimolekyylistä hepariinia.

Siten tämän keksinnön mukaisen menetelmän raaka-aineena voidaan käyttää mitä tahansa pienimolekyylistä 5 hepariinia, joka on valmistettu typpihapokedepolymeroin-nilla. Menetelmän maksimaalisen tehokkuuden saavuttamiseksi on edullista käyttää depolymeroituja hepariiniliuoksia, joissa ei ole suspendoituneita mikropartikkeleita. Mikro-partikkeleiden läsnäolo saattaa johtua depolymeroidun he-10 pariinin huonosta liukoisuudesta tai erilaisista epäpuhtauksista tai vielä tähteistä reagensseista, joita on käytetty depolymeroinnin tai puhdistuksen aikana. Erilaiset depolymeroituneet hepariiniliuokset siis suodatetaan mieluiten ennen käyttöä.

15 Tämän keksinnön mukainen menetelmä on äärettömän tehokas ja hellävarainen, sillä sen avulla poistetaan nit-rosoyhdisteet yksinkertaisesti, nopeasti ja varmasti. Lisäksi keksinnön mukainen menetelmä ei aiheuta minkäänlaista muutosta hepariinifraktioiden rakenteeseen, jonka bio-20 logiset ominaisuudet ja fysikokemialliset ominaispiirteet pysyvät tarkasti samanlaisina.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa puhdistettavalle 5 - 15-%:iselle w/v typpihapokedepolymeroin-nilla valmistetun hepariinifraktion, mieluiten pienimole-v 25 kyylisen hepariinin vesiliuokselle säteilyttämällä sitä UV-säteilyllä systeemissä, jossa säteilyn aallonpituus on :1·.· 180 - 350 nm, mieluiten 254 nm, 5-50 °C:n lämpötilassa, * · .:. edullisesti 15 - 35 °C:ssa, mieluiten huoneenlämpötilassa.

* « · ·

Liuoksen pH on mieluiten lievästi hapan tai lieväs- • · · 30 ti emäksinen, etenkin 3-8, mieluiten 5-8.

Säteilytyksen kesto riippuu käytetystä säteilytys-systeemistä, säteilyn voimakkuudesta ja hepariinifraktios- • · ·;·’ sa olevien poistettavien nitrosoyhdisteiden kokonaismää- i rästä. Se on noin 2-30 minuuttia, vaikka 9-15 minuutin 35 kuluttua puhdistuminen on yleensä melkein täydellistä.

« » · » · • · • · » I » 8 107388 UV-säteilysysteeminä voidaan käyttää joko staattista systeemiä tai dynaamista systeemiä, jonka avulla hepa-riinifraktioliuokset kiertävät UV-säteilylähteen ympärillä. Dynaamiset systeemit ovat parempia. Viimeksimainitussa 5 tapauksessa UV-säteilyn lähde voidaan yhdistää lieriömäiseen putkeen (tyypiltään "suljettu" laite) tai kanavaan (tyypiltään "avoin" laite). Tyypiltään "suljettuna" lait-tena voidaan käyttää UV-sterilointilaitetta JRl-50 (KATA-DYN) tai mitä tahansa vastaavaa laitetta.

10 Kuvio 1 esittää poikkileikkauksena tyypiltään "sul jettua" laitetta. Tämä laite on muodostunut UV-lampusta (1), jonka ympärille on laitettu kvartsisuojus (2). Pienimolekyylisiä hepariineja sisältävät liuokset kiertävät UV-lampun ympärillä, joka on suojattu kvartsisuojuksella 15 (kiertävän liuoksen suojus (3)). Ne pannaan laitteseen syöttöaukon (4) kautta, joka on sijoitettu UV-lampun toisen pään tasolle, ulostulo (5) on sijoitettu UV-lampun toiseen päähän.

Kun käytetään dynaamista systeemiä, hepariinifrak-20 tioiden liuosten nopeus, jolla ne kiertävät UV-säteilylähteen ympäri, täytyy säätää sopivaksi, että saavutetaan tarvittava säteilyn kesto nitrosoyhdisteiden poistamiseksi. Eri muuttujat, jotka voivat siihen vaikuttaa, ovat : kiertävän nesteen suojus, UV-säteilylähteen mitat ja/tai 25 teho, vesiliuoksen hepariinifraktion konsentraatio ja tä-hän fraktioon sisältyvien poistettavien nitrosoyhdisteiden • · · .·. ί määrä.

• · · • · Näin saatu hepariinifraktio, tai mieluiten pienimo- « ]1··, lekyylinen hepariini, joka ei sisällä lainkaan nitrosoyh- • · e 30 disteitä, voidaan ottaa talteen tavanomaisilla menetelmillä.

Kun lähtöyhdisteenä käytetään jo farmaseuttista laatua olevaa pienimolekyylistä hepariinia, riittää, kun • se liuotetaan veteen, säädetään pH välille 3-8, mielui- • · · · • ♦ · « « • ♦ · · « • · • · 9 107388 ten 5 - 8 ja toteutetaaan tällä liuoksella tämän keksinnön mukainen menetelmä.

Lähtöyhdisteenä voidaan myös käyttää fraktioimaton-ta luonnon hepariinia, edullisesti suolan muodossa, eten-5 kin natriumhepariinina, joka on mieluiten peräisin sian ohutsuolen limakalvosta. Tässä tapauksessa keksinnön mukainen menetelmä muodostuu yhdestä vaiheesta typpihapoke-depolymeroinnin jälkeen lopullisen puhdistetun tuotteen valmistamiseksi, jossa ei ole lainkaan nitrosoyhdisteitä. 10 Hepariinista lähtien suoritettava kokonaismenetelmä esittää tämän keksinnön seuraavaa kohdetta.

Siten tämä keksintö koskee erään toisen näkökannan mukaan menetelmää pienimolekyylisen hepariinin valmistamiseksi typpihapokedepolymeroinnilla, jossa hepariinin nit-15 rosoyhdisteiden kokonaismäärä on pienempi tai yhtäsuuri kuin 500 ppb, edullisesti pienempi tai yhtäsuuri kuin 150 ppb, mieluiten pienempi tai yhtäsuuri kuin 100 ppb, mieluiten vielä pienempi tai yhtäsuuri kuin 50 ppb, sille on tunnusomaista, että: 20 (a) 5 - 15 % w/v fraktioimatonta natriumhepariini- liuosta vedessä käsitellään alkaalimetallinitriittiliuok-sella, mieluiten natriumnitriittiliuoksella, jossa on 15 -69 g nitriittiä kg:aa kohti käytettävää hepariinia kloo-: rivetyhapon läsnä ollessa pH:n ollessa 1 - 5, mieluiten « 4 « V : 25 1,5-4, käsittely kestää 20 - 50 minuuttia, ja näin saatu « · · yhdiste pelkistetään mieluiten alkaalisessa liuoksessa, jossa on 5 - 20 g natriumborohydridiä kg:aa kohti lähtöai- ··· neen hepariinia, ylimäärä natriumborohydridistä tuhotaan • · · · .1:·. kloorivetyhapolla, reaktioliuos tehdään mahdollisesti 30 neutraaliksi, ja seostetaan etanolilla, sitten kun näin . saatu pienimolekyylinen hepariini on fraktioitu useita • · ... kertoja alkoholilla, '1··1 (b) näin saatua liuosta säteilytetään ultraviolet- : tisäteilyllä, « « · • · # • · · « w 1 • · • · · • · * · 10 107388 (c) suoritetaan mahdollisesti kromatografinen puhdistus ja eristetään depolymeroitu natriumhepariini, joka on puhdistettu ja joka ei sisällä lainkaan nitrosoyhdis-teitä, seostamalla natriumkloridilla ja etanolilla, ja 5 mahdollisesti (d) muutetaan natriumsuola toiseksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, mieluiten kalsiumsuolaksi.

Erään hyvän näkökannan mukaan tämä keksintö koskee menetelmää puhdistetun CY 222:n valmistamiseksi, joka mää-10 ritellään depolymeroidun hepariinin natriumsuolaksi, joka on valmistettu depolymeroimalla typpihapokkeella luonnon hepariinia, joka on peräisin sian ohutsuolen limakalvosta ja jossa: pääasiallinen molekyylipaino on 1 700 - 3 300 Da, 15 90 % komponenteista on molekyylipainoltaan 1 000 - 8 000 Da, pääosassa sen komponenteista on 2-0-sulfo-a-L-ido-pyranoosiuronihapporakenne pelkistämättömässä päässä ja 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolirakenne pelkistävässä 20 päässä, sulfatoitumisaste on noin 2,1, anti-faktori Xa -aktiivisuus on 60 - 80 IU/mg, anti-faktori Ha -aktiivisuus ei ole suurempi kuin : 25 IU/mg, V ' 25 nitrosoyhdisteiden määrä on pienempi tai yhtäsuuri kuin 100 ppb, mieluiten pienempi tai yhtäsuuri kuin 50 PPb, • · mainitulle menetelmälle on tunnusomaista, että: » · · · (a) luonnosta peräisin olevan hepariinin fraktioi- » · · 30 matonta vesiliuosta käsitellään kloorivetyhapolla ja al- . kaalimetallinitriitillä, jonka määrä on 3,5 - 4 % käytet- ... tävän hepariinin painosta, liuoksen pH pidetään koko ajan ·;* happamana ja tarkkaillaan nitriitti-ionien läsnäoloa, kun- : nes niitä ei enää ole, tehdään sitten emäksiseksi, pelkis- 35 tetään natriumborohydridillä ja eristetään depolymeroitu ♦ « · • · « · • · 11 107388 yhdiste neutraalissa ympäristössä seostamalla etanolilla, sitten (b) näin saadun yhdisteen vesiliuos kuljetetaan noin pH 7:ssä 254 nm: n ultraviolettisäteilysysteemiin, 5 sitten näin saatu liuos pannaan anioninvaihtopylvääseen ja kun sitä on huuhdeltu vedellä ja noin pH 7:ssä, lopullinen yhdiste otetaan talteen saostamalla natriumkloridilla ja etanolilla.

Vaiheessa (a) käytetään alkaalimetallinitriittinä 10 natriumnitriittiä edellä kuvattuissa suhteissa.

Menetelmän vaiheessa (b) ultraviolettisäteilysys-teemi on varustettu mieluiten 16 W:n lampulla ja 254 nm:n UV-säteilyn kesto on noin 9-15 minuuttia. Dynaaminen UV-säteilysysteemi on parempi ja etenkin tyypiltään "suljet-15 tu" laite. UV-säteilylle altistettujen liuosten kon-sentraatio on edullisesti 8 - 12 % w/v.

Keksinnön mukaisesti saadut hepariinifraktiot ovat käyttökelpoisia farmaseuttisissa valmisteissa, jotka sisältävät vaikuttavana aineena puhdistettua hepariinifrak-20 tiota, joka ei sisällä lainkaan nitrosoyhdisteitä, mieluiten puhdistettua pienimolekyylistä hepariinifraktiota, joka ei sisällä lainkaan nitrosoyhdisteitä, kuten edellä kuvattiin.

. Näissä valmisteissa hepariinifraktio voi esiintyä 25 lyofilisaattina tai subkutaanisena injektioliuoksena bio- • .·**. logisesti hyväksyttävässä steriilissä liuottimessa, kuten • a · .·. : vedessä tai fysiologisessa liuoksessa ampulleissa, pui- • · · *4;*# loissa, esitäytetyissä ruiskuissa tai itseinjektoivissa 4 Ύ/. "kynä"-tyyppisissä laitteissa. Kukin annosyksikkö far- • · · 30 maseuttista valmistetta voi sisältää 50 - 50 000 IU anti-faktori Xa:ta.

• * Keksinnön mukaisia hepariinifraktioita voidaan an- • · · taa myös laskimonsisäisinä injektioina yksinään tai sekoi-: .·, tettuna muihin vaikuttaviin aineisiin. Niitä voidaan vielä .··, 35 annostella sumuttamalla nenään tai keuhkoihin.

• · • · · • · • « · • a 12 107388

Eräs tämän keksinnön mukainen hyvä farmaseuttinen valmiste sisältää vaikuttavana aineena CY 222:a, joka ei sisällä lainkaan nitrosoyhdisteitä, kuten edellä kuvattiin, yksittäisannoksina, jotka sisältävät 10-5 000 mg 5 CY 222:a natriumsuolana.

Kuten edellä on osoitettu, nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä määritetään B. Pignatellin kuvaamalla menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Analyst, syyskuu 1979, 114, ss. 1103 - 1108 ja Analyst, heinäkuu 1987, 112, ss.

10 945 - 949, sovellettuna hepariinille ja pienimolekyylisil le hepariineille.

Analyyttinen menetelmä

Analysoitavat yhdisteet ovat mieluiten jauheina, sen takia määritettäessä liuoksessa olevien nitrosoyhdis- 15 teiden kokonaismäärää mainittu liuos lyofilisoidaan ensin ja analyysi suoritetaan lyofilisoidusta näytteestä.

1. Reagenssit 100 mg:aa hepariinifraktiota kohti käytetyt reagenssit ovat seuraavia: 20 etyyliasetaatti, jota on käsitelty 20-%:isella sul- famiinihapolla w/v (liuos, jossa on 200 g sulfamiinihappoa 1 000 ml:ssa etyyliasetaattia ja jota on sekoitettu 3 päivää ja suodatettu paperin läpi ennen käyttöä), ; ; 15-%:inen bromivetyhappo etikkahapossa (pienet tum- * ; 25 mat pullot, joissa polyetyleenikorkki ja jotka sisältävät « ·’**· 5 ml 30-%:ista bromivetyhappoa ja jotka on suljettu typen ··» : alla ja pidetty pimeässä. Käyttöhetkellä lisätään 5 ml puhdasta etikkahappoa, sekoitetaan ja pidetään pienessä ♦ 'IV.' astiassa pimeässä. Käytetään 1 pullo määrityssarjaa koh- ♦ ♦ « 30 ti), 95-%:inen formamidi, jota on käsitelty 5 %:sella (w/v) sulfamiinihapolla (liuos, jossa on 1 g sulfamiini- ·»· happoa 20 ml:ssa formamidia, joka sisältää 5 % puhdistet- • ;: tua vettä).

• · • « « · · ♦ • ♦ • · · • · · • « «tl • « • · • « · 13 107388 2. Standardiliuosten ja analysoitavien liuosten valmistus N-nitroso-di-n-propyyliamiinin (NDPA) standardi- liuos 5 Injektoidaan septumin läpi 78,62 g puhdasta etano lia Sigman ISOPAK-pulloon, joka sisältää 1 g N-nitroso-di-n-propyyliamiinia. Konsentraatio on 10 000 ppm NDPA:ta (3379 ppm N-NO). Laimennetaan sitten 1:100 puhtaalla etanolilla ja jaetaan 0,5 ml:n eriin pieniin kapseloituhin 10 pulloihin. Konsentraatio on 100 ppm NDPA:ta. Säilytetään pimeässä +4 °C:ssa.

matala standardiliuos: käyttöhetkellä laimennetaan 1:100 etanolilla, sitten 1:17 käsitellyllä formamidilla. Konsentraatio on 0,0588 ppm NDPA:ta tai 19,9 ppb N-NO:ta. 15 keskimmäinen standardiliuos: käyttöhetkellä laimen netaan 1:61 etanolilla, sitten 1:11 käsitellyllä formamidilla. Konsentraatio on 0,149 ppm NDPA:ta tai 50,4 ppb N-NO:ta.

Korkea standardiliuos: käyttöhetkellä laimennetaan 20 1:10 etanolilla, sitten 1:10 käsitellyllä formamidilla.

Konsentraatio on 1 ppm NDPA:ta tai 338 ppb N-NO:ta. Analysoitava näyte

Hepariinifraktionäytteitä kuivataan 12 tuntia . 60 °C:ssa vakuumissa, fosforipentoksidin kanssa. Liuote-

« I I I

25 taan 100 mg hepariinifraktiota 1 ml:aan käsiteltyä form- « .···. amidia ja sekoitetaan 30 minuuttia sekoitinravistelijalla.

: 3. Käytetty laitteisto • ·· ’ / Käytetty laitteisto on kuvattu kuviossa 2.

Ί1Ι Kokoonpano • · · 30 Laitteisto muodostuu 500 ml:n pyrex-kolvista (1), johon on asennettu kaksoisjäähdytin (2), joka on jäähdy- * ** tetty -15° C:seen. Se on kytketty kolmeen kuplittimeen • · · (3), jotka on kytketty sarjaan ja joista kukin sisältää : 30 ml 30-%:ista natriumhydroksidia. Viimeksi mainitut on ,·>, 35 kytketty kahteen kylmäloukkuun, jotka on asennettu sar- • t • · · • « 1 # · « « • · 14 107388 jaan, toinen on valmistettu sulamispisteessä olevasta etanolista -120 °C:ssa (4) ja toinen sulamispisteessä olevasta isopentaanista -160 °C:ssa (5). Nämä on lopuksi kytketty kemiluminesenssidetektoriin (TEA) malli 610 (Thermedics 5 Detection INC.) tai vastaavaan (6). Detektori on kytketty integraattori/rekisteröintilaitteeseen (7).

Kolvi on varustettu toiselta puoleltaan lävistettävällä korkilla (8), jonka läpi voidaan panna kanyyli, josta tulee argonvirta, ja toiselta puolelta hiosruuvilla, 10 joka on varustettu korkilla, johon voidaan liittää GPC:n tyyppinen septum (9), jonka kautta näyte injektoidaan. Argonvirta ja vakuumi, joka muodostetaan TEA:n vakuumipum-pulla, tuovat kaasun TEA:hän.

4. Toimintamalli 15 4.1 Detektorin säätäminen TEA säädetään valmistajan ohjeen mukaisesti, jotta saadaan maksimaalinen herkkyys ja toistettavuus.

Tuntia ennen määritystä happivirta avataan, paine on 0,2 MPa (2 baaria), se säädetään nopeuteen 0,02 TEA 610 20 nopeusmittarilla (Thermedics Detection INC.) 4.2 Natriumhydroksidiloukkujen valmistus Kukin loukku täytetään 30 ml:11a 30-%:ista natrium-hydroksidia.

: ‘ 4.3 Kylmäloukkujen valmistus 25 -120 °C:n loukku: Dewar-astiaan, joka sisältää 250 f :***· ml etanolia, kaadetaan varovasti ja puuspaattelilla se- • · · .\J koittaen nestetyppeä, kunnes etanoli muuttuu tahnamaisek- • · si.

♦ *~.1t -160 °C:n loukku: Dewar-astiaan, joka sisältää 250 • · « 30 ml isopentaania, kaadetaan varovasti ja puuspaattelilla sekoittaen nestetyppeä, kunnes isopentaani muuttuu tahna-maiseksi.

• · · .<<’ Nämä kaksi lasiloukkua pannaan vastaaviin Dewar-as- j tiohin ja kytketään sarjaan systeemissä.

• « 1 « • « « « · 9 9 9 9 · • « · • · · * 1 · • » * · · • · ·> 1 107388 4.4 Kolvi-jäähdytinsysteemin vedenpoisto

Kiehutetaan pystyjäähdyttejän alla 50 ml etyyliasetaattia 1 tunnin ajan argonin alla kytkemättä sitä TEA:han.

5 4.5 Reaktio j a määritys

Uuteen, puhtaaseen ja kuivaan kolviin, joka on varustettu septumilla, pannaan 30 ml käsiteltyä etyyliasetaattia, se asennetaan jäähdyttäjään (jäähdyttäjän täytyy olla käynnissä 2 tuntia aikaisemmin -15 °C:ssa), asenne-10 taan kolvinkuumennin ja aletaan kuumentaa (asento 4). Ar-gonkanyyli kytketään, nopeus säädetään 0,1 1/minuutti ja tarkistetaan koko systeemin tiiviys. Vain TEA:n haara jää auki ylipaineen välttämiseksi. Kun etyyliasetaatti kiehuu, vedetään vakuumia hyvin varovasti ja samalla suljetaan sen 15 pääsy TEA:han. Vakuumi syntyy koko systeemiin ja saavuttaa 267 - 533 kPa (2 - 4 mm Hg), kun systeemi on tasapainossa. TEA:n nolla säädetään 10 %:n kohdalle täydestä asteikosta integraattori/rekisteröintilaitteessa.

Septumin läpi injektoidaan peräkkäin 0,5 ml puhdis-20 tettua vettä, 2 ml laimennettua bromivetyhappoa, sitten uudelleen 2 ml laimennettua bromivetyhappoa, kunkin injektion välillä todetaan palautuminen perusviivalle inte-graattori/rekisteröintilaitteessa. Kun reagenssit on inji-. : ; soitu kolviin, odotetaan palautumista perusviivalle ja in- •T 25 jektoidaan 50 μΐ standardia tai näytettä. Kunkin injektion c j***j välissä odotetaan palautumista perusviivalle. Määrityksen ««« ;*.j aikana rajoitutaan määrittämään 5 näytettä 2 standardia • · kohti ja määritykset suoritetaan niin, että koko käsittely *!|I ei kestä kauempaa kuin 60 minuuttia.

• · · * 30 4.6 Nitrosoyhdisteiden kokonaismäärän laskeminen N-N0:n määrä ppb:einä lasketaan kaavasta: • · · . M_Nn - näytteen pinta-ala x Cs x 0,05 x 44 x 1 000 . 35 pp standardin pinta-ala x 0,05 x 0,1 x 130,2 < t ( I I • i i * • · * · » « I * ie 107388 jossa

Cs: NDPA-standardin konsentraatio ppm:inä (0,0588 tai 0,149 tai 1 ppm) 0,05: (nimittäjässä) standardin näytemäärä testis- 5 sä (ml) 44: N-N0:n molekyylipaino 1 000: muunnos ppm:stä ppb:hen 0,05 (osoittajassa) näytteen näytemäärä testissä (ml) 10 0,1: näytteen näytemäärä grammoina 130,2 : NDPA:n molekyylipaino Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

Esimerkki 1

Puhdistetun kalsiumnadropariinin valmistus, jonka 15 nitrosojohdannaisten kokonaispitoisuus on pienempi kuin 100 ppb

Vaihe A: Depolymerointi ja etanolifraktiointi Reaktioastiassa liuotetaan 20 kg natriumheparii-nia, jota on saatu sian ohutsuolen limakalvosta, puhdis-20 tettuun veteen niin, että lopulliseksi konsentraatioksi saadaan 10,3 % (w/v). Liuoksen pH säädetään 2,5:een väkevän kloorivetyhapon avulla.

Lisätään 572 g natriumnitriittiä reaktioastiaan ja ; ' pidetään pH 2,5:ssä väkevän kloorivetyhapon avulla.

• 25 Depolymerointireaktiota seurataan kaliumjodidi- ;***; tärkkelystestipaperin avulla. Reaktio on päättynyt, kun • · · .*. : testi on negatiivinen. Reaktioliuoksen pH säädetään 10:een väkevällä natriumhydroksidilla, lisätään sitten 200 g nat-riumborohydridiä. Sekoitetaan 15 tuntia, sitten pH sääde- • · · * 30 tään välille 4-3,5 väkevällä kloorivetyhapolla borohyd- ridiylimäärän tuhoamiseksi. Sitten pH säädetään 7:ään lisäämällä väkevää natriumhydroksidia. Saostetaan sitten li- • · · säämällä 2 tilavuutta etanolia yhtä tilavuutta kohti vesi- | .·. liuosta. Annetaan dekantoitua, poistetaan sitten vesi-al- » » ♦ * .··*, 35 koholipitoinen supernatantti. Sakka liuotetaan 400 ml:aan • » • <! * f * • · * • M • * »»» • · « · 17 107388 puhdistettua vettä. Tähän liuokseen lisätään natriumklori-dia, kunnes johtokyvyksi saadaan noin 20 000 pS/cm. Säädetään sitten pH noin 4:ään väkevän kloorivetyhapon avulla ja lisätään liuokseen sekoittaen 1 tilavuus absoluuttista 5 etanolia. Annetaan dekantoitua noin 60 tunnin aikana, sitten vesi-alkoholipitoinen supernatantti poistetaan. Näin saadaan nadropariinia natriumsuolana.

Sitten sakka liuotetaan puhdistettuun veteen niin, että saadaan noin 18-%:inen liuos (w/v) lähtöaineena käy-10 tetyn natriumhepariinin määrän perusteella, säädetään pH 7:ään väkevällä natriumhydroksidilla. Sitten liuos suodatetaan systeemillä, joka on varustettu 0,2 pm:n huokoskoon suodatinpatruunoilla. Otetaan näyte suodatetusta liuoksesta, joka sisältää natriumnadropariinia ja jota ei enää 15 käsitellä vaiheessa B kuvatulla menetelmällä (käsittely UV-säteilyllä). Tätä näytettä kutsutaan "kontrolliksi". Vaihe B: Käsittely UV-säteilyllä UV-säteilyllä käsittelyä varten käytetään JR1-50-tyyppistä Katadyn putkea, jonka hyötytilavuus on 750 ml. 20 Käytetty aallonpituus on 254 nm. Sen virtausnopeus säädetään sopivaksi (4 800 ml/h) etukäteen peristalttisella pumpulla käyttäen puhdistettua vettä niin, että yhden kierroksen UV-säteilytyksen kokonaisajaksi ilman kierrä-, tystä saadaan noin 9 minuuttia. Sitten käsiteltävä nat- *'·'· 25 riumnadropariiniliuos pannaan laitteeseen ja systeemi pes- « ♦***. tään vedellä, kunnes kaikki käsiteltävä yhdiste on saatu ··· ,*, : talteen astiaan, joka on liitetty Katadyn-putken JR1-50 * *· ulostuloon.

Vaihe C: Kromatografinen puhdistus ja muuttaminen « · · * 30 kalsiumsuolaksi

Edellisessä vaiheessa saatu nadropariiniliuos puh- * * distetaan anionipylväällä (0,5 1/kg käytettävää natrium- rtt hepariinia). Kerättyjen effluenttien johtokyky säädetään j \ 10 000 - 20 000 pS/cm natriumkloridilla ja lisätään sitten l i · i i I : i < t <

1 < I I

< « I i « t < *

I I

I < » « <

« I

It I

18 107388 1,5 tilavuutta etanolia. Annetaan dekantoitua noin 41 tuntia, sitten supernatantti poistetaan.

Sakka liuotetaan puhdistettuun veteen (C = 18 % w/v käytettyyn natriumhepariinimäärään perustuen) ja lisä-5 tään kalsiumkloridin heksahydraattia (9,63 g/g käytettyä natriumhepariinia). Jatketaan sitten etanolisaostuksella lisäämällä 1,5 tilavuutta etanolia. Toistetaan suolausvai-he kalsiumkloridin heksahydraatilla ja puhdistus vaihe etanolisaostuksella. Saatu sakka kuivataan lämpötilassa, joka 10 ei ylitä 60 °C.

Näin saadaan erä 1.

Vaiheessa A saatua "kontrolli"erää käsitellään myös vaiheessa C kuvatulla menetelmällä ja eristetään kal-siumnadropariinin "kontrolli"erä.

15 Erän 1 ja "kontrolli"erän kalsiumnadropariininäyt- teellä suoritetaan fysikokemialliset analyysit ja määritykset biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi.

Tulokset on koottu taulukoihin I ja II.

• I f · I « 014 • · · 0 0 • · • · · • · • · · • · · • 9 • · · 0 • 00· • · 0 • · · 0 0 0 0 0 0 • 00 « « 4 4 4 • « 4 4 4 4 4 « t · • 4 • · • · · • 0 0 0 4 4 • · 0 · 0 • · 4 0 19 107388

Taulukko 1

Fysikokemialliset kokeet 5 Määritettävä Erä 1 Kontrolli ominaisuus (UV-käsittely) (Ei UV-käsittelyä)

Nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä 53 ppb 3 150 ppb 10 Vapaat sulfaatit 0,05 % 0,06 % 5% liuoksen pH 6,0 6,0

Vapaat NH2:t < 30 ppm < 30 ppm HPLC-GPC (UV 205 nm)

Keskimääräinen 15 molekyylipaino (Mw) 5 017 Da 4 933 Da

Keskimääräinen molekyylikoko (Mn) 4 043 Da 4 052 Da

Huipun molekyylipaino 4 181 Da 4 192 Da

Dispersio 1,24 1,21 20 % MP > 100 00 Da 2,4 2,1 % MP > 8 000 Da 7,2 6,9 % MP < 2 000 Da 3,0 2,9 % MP < 1 800 Da 2,4 2,3 • · · • 1 · · -

25 Taulukko II

Biologiset kokeet • · · • · • · · • · · • · • · · __ Määritettävä Erä 1 Kontrolli • · « 30 ominaisuus (UV-käsittely) (Ei UV-käsittelyä) • -

Anti-faktori Xa * · » aktiivisuus 124 IU/mg 123 IU/mg j Anti-faktori Ha 35 aktiivisuus 29,3 IU/mg 30,4 IU/mg • · · • « ------ - - — — • · · · • · # · · 20 107388

Taulukoissa I ja II olevat tulokset osoittavat, että UV-käsittely ei aiheuta minkäänlaista muutosta nadro-pariinissa. Itse asiassa erän 1 eri fysikokemialliset ja biologiset ominaisuudet, kuten yhdisteen kromatografiapro-5 fiili, erilaisten epäpuhtauksien määrä, anti-faktori Xa -aktiivisuus ja anti-faktori Ha -aktiivisuus ovat identtisiä kontrolliin verrattuna, jota ei oltu käsitelty UV-sä-teilyllä, yhtä poikkeusta lukuunottamatta. Käsittelemättömän kontrollin nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on 60 ker-10 taa isompi kuin erän 1 nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä, jota erää oli käsitelty UV-säteilyllä.

Lisäksi elektronien paramagneettisen resonanssi-analyysin tulokset ovat vahvistaneet sen, että UV-säteily ei aiheuta vapaiden radikaalien syntymistä.

15 Esimerkki 2 CY 222:n natriumsuolan valmistus, jonka nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on pienempi kuin 50 ppb

Vaihe A: Depolymerointi

Reaktioastiassa liuotetaan 250 g natriumheparii-20 nia, jota on saatu sian ohutsuolen limakalvosta, puhdistettuun veteen niin, että lopulliseksi konsentraatioksi saadaan 10,3 % (w/v). Liuoksen pH säädetään 2,5:een väkevän kloorivetyhapon avulla. Lisätään 9,49 g natriumnit- riittiä reaktioastiaan ja pidetään pH 2,5:ssä. Depolyme-

< I I

: 25 rointireaktiota seurataan kaliumjodidi-tärkkelystestipape- rin avulla. Reaktio on päättynyt, kun testi on negatiivi-:1·.· nen. Reaktioliuoksen pH säädetään 10 - 10,5:een väkevällä • e natriumhydroksidilla, lisätään sitten 2,5 g natriumboro- • · · «

hydridiä. Seoksen annetaan sekoittua 15 tuntia, sitten pH

« O · 30 säädetään välille 3,5-4 väkevällä kloorivetyhapolla bo-. rohydridiylimäärän tuhoamiseksi. Sitten pH säädetään 7:ään lisäämällä väkevää natriumhydroksidia. Saostetaan sitten lisäämällä 2 tilavuutta etanolia yhtä tilavuutta kohti : liuosta. Annetaan sakan dekantoitua, sitten supernatantti 35 poistetaan. Näin saadaan CY 222 natriumsuolana. Näin saatu • 1 · • · · » · 2l 107388 yhdiste sisältää kaikkiaan 3 000 - 10 000 ppb nitrosoyh-disteitä (3 valmistuksen tulokset).

Vaihe B: Käsittely UV-säteilyllä

Edellisessä vaiheessa saatu sakka liuotetaan puh-5 distettuun veteen niin, että saadaan lopuksi 10-%:inen w/v liuos käytettyyn natriumhepariinimäärään perustuen, säädetään pH 7:ään kloorivetyhapolla tai natriumhydroksidilla. Kun pumpun nopeus on säädetty, näin saatu liuos saa virrata systeemiin, jossa on 254 nm:n ultraviolettisäteily (Ka-10 tadyn JR1-50, joka on varustettu 16 W:n lampulla). UV-sä-teilyaltistuksen kesto on 9 - 15 minuuttia.

Vaihe C: Kromatografinen puhdistus ja lopulliset saostukset

Saatu liuos puhdistetaan käsittelemällä UV-sätei-15 lyllä kromatografiapylväässä, joka sisältää ainakin 2 litraa anionihartsia kg kohti käytettyä natriumhepariinia. Kerättyjen effluenttien johtokyky säädetään 30 - 35 mS/cm natriumkloridin avulla ja pH säädetään 7:ään kloorivety-hapon avulla. Sitten lisätään 2 tilavuutta etanolia yhtä 20 tilavuutta kohti vesiliuosta. Sakan annetaan dekantoitua ja supernatantti poistetaan. Sakka liuotetaan puhdistettuun veteen niin, että saadaan lopuksi 20-%:inen (w/v) liuos lähtöaineena käytettyyn natriumhepariininäärään . : : perustuen, liuoksen johtokyky säädetään 30 - 35 mS/cm 25 natriumkloridilla ja pH säädetään 7 - 7,5:een väkevällä .***. kloorivetyhapolla tai väkevällä natriumhydroksidilla. Sit- * · · .·. : ten liuos seostetaan 2 tilavuudella absoluuttista etanolia • ·· • · ja sen annetaan dekantoitua. Sakka otetaan talteen, se * "II pestään etanolilla ja kuivataan lämpötilassa, joka ei yli- * 30 tä 60 °C. Näin saadaan puhdasta CY 222:a, joka määritel lään depolymeroituna hepariinin natriumsuolana, joka on valmistettu depolymeroimalla typpihapokkeella sian ohut- • · · suolen limakalvon hepariinia ja jossa: • # * 22 107388 pääasiallinen molekyylipaino on välillä 1 700 -3 300 Da, 90% sen komponenteista on välillä 1 000 - 8 000 Da, pääosassa sen komponenteista on 2-0-sulfo-a-L-ido-5 pyranoosiuronihapporakenne pelkistämättömässä päässä ja 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolirakenne pelkistävässä päässä, sulfatoitumisaste on noin 2,1, anti-faktori Xa -aktiivisuus on 60 - 80 IU/mg, 10 anti-faktori Ha -aktiivisuus ei ole suurempi kuin 25 IU/mg ja etenkin 10 - 15 IU/mg, nitrosoyhdisteiden määrä on pienempi tai yhtäsuuri kuin 50 ppb.

»·· * o « · • · « • · « · · • · * • · • • « e 4 «·«» • 4 « * · * « · 0 • · • · · • I t 4 · * * * • · · 4 · • ♦ ·

Claims (9)

107388

1. Menetelmä hepariinifraktion valmistamiseksi, jonka nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on pienempi tai 5 yhtäsuuri kuin 500 ppb, tunnettu siitä, että hepariinifraktion vesiliuosta, joka on valmistettu typpiha-pokedepolymeroinnilla, säteilytetään ultraviolettisäteilyllä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että käsiteltävä hepariinifraktio on pienimolekyylistä hepariinia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hepariinifraktion vesiliuos, joka on valmistettu typpihapokedepolymeroinnilla ja jonka 15 konsentraatio on 5 - 15 % w/v, säteilytetään ultraviolet-tisäteilysysteemillä, jossa säteilyn aallonpituus on 180 -350 nm, noin 5-50 °C:n lämpötilassa, liuoksen pH:n ollessa 3-8.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että UV-säteilytys suoritetaan 254 nm.-n aallonpituudella noin 15 - 35 °C:ssa ja pHrssa 5-8.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pienimolekyylisen hepariinin valmistamiseksi, joka on depolyme- . roitua hepariinia, joka on saatu typpihapokedepolymeroin- 25 nilla luonnon hepariinista, joka on peräisin sian suolen .1·1. limakalvosta, naudan keuhkoista tai muusta hepariinista, • · · .·. : joka on uutettu eri eläinten kudoksista tai elimistä, ja • ·· jonka ominaispiirteet ovat seuraavat: *!” keskimääräinen molekyylipaino on pienempi kuin • · · 30 8 000 Da, ainakin 60 % kaikista komponenteista on keskimääräiseltä ♦ * 1 molekyylipainoltaan pienempiä kuin 8 000 Da, • · · anti-faktori Xa -aktiivisuus ei ole pienempi kuin 60 IU/mg, t < t i 1 « « « • «« · « · 24 107388 anti-faktori-Xa/anti-faktori-IIa-aktiivisuuksien suhde ei ole pienempi kuin 1,5 farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana, t u n n e tt u siitä, että: 5 (a) 5 - 15 % w/v fraktioimatonta natriumhepariini- liuosta vedessä käsitellään natriumnitriittiliuoksella, suhteessa 15 - 69 g nitriittiä kg:aa kohti hepariinia kloorivetyhapon läsnä ollessa pH:n ollessa 1-5, edullisesti 1,5 - 4, käsittelyajan ollessa 20 - 50 minuuttia, 10 ja näin saatu yhdiste pelkistetään, edullisesti alkaali-sessa liuoksessa, 5-20 g:11a natriumborohydridiä kg:aa kohti lähtöaineena käytettyä hepariinia, ylimäärä natrium-borohydridistä tuhotaan kloorivetyhapolla, reaktioliuos tehdään mahdollisesti neutraaliksi, ja tuote saostetaan 15 etanolilla, sen jälkeen kun näin saatu pienimolekyylinen hepariini on haluttaessa fraktioitu yhden tai useita kertoja alkoholilla, (b) näin saatua liuosta säteilytetään ultraviolettisäteilyllä, 20 (c) suoritetaan haluttaessa kromatografinen puh distus ja eristetään depolymeroitu natriumhepariini, joka on puhdistettu ja joka ei sisällä lainkaan nitrosoyhdis-teitä, saostamalla natriumkloridilla ja etanolilla, ja . mahdollisesti « ·« ( 25 (d) muutetaan natriumsuola toiseksi farmaseutti- sesti hyväksyttäväksi suolaksi. ♦ ·· .·. : 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, • 9 9 *.* tunnettu siitä, että valmistetaan pienimolekyyli- **!* nen hepariini natriumsuolana tai kalsiumsuolana. • · « **° 30 7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan depolymeroidun hepariinin natriumsuola, joka on saatu depolymeroimalla • · · typpihapokkeella luonnon hepariinia, joka on peräisin sian : , suolen limakalvosta, ja jolla on seuraavat ominaispiir re' 35 teet: • t • « • « « « « · • · « t · · • « « · * • « « · • » * 107388 keskimääräinen molekyylipaino on 1 700 - 3 300 Da, 90. sen komponenteista on molekyylipainoltaan 1 000 - 8 000 Da, pääosassa sen komponenteista on 2-0-sulfo-a-L-ido-5 pyranoosiuronihapporakenne pelkistämättömässä päässä ja 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolirakenne pelkistävässä päässä, sulfatoitumisaste on noin 2,1, anti-faktori Xa -aktiivisuus on 60 - 80 IU/mg, 10 anti-faktori Ha -aktiivisuus ei ole suurempi kuin

25 IU/mg, nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on pienempi tai yhtäsuuri kuin 100 ppb.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan depolymeroidun hepariinin natriumsuola, joka on saatu depolymeroimalla typpihapokkeella luonnon hepariinia, joka on peräisin sian suolen limakalvosta ja jossa: keskimääräinen molekyylipaino on 1 700 - 3 300 Da, 20 90 % sen komponenteista on molekyylipainoltaan 1 000 - 8 000 Da, pääosassa sen komponenteista on 2-0-sulfo-a-L-ido-pyranoosiuronihapporakenne pelkistämättömässä päässä ja . 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolirakenne pelkistävässä 25 päässä, r .***. sulfatoitumisaste on noin 2,1, ··· ,·. : anti-faktori Xa -aktiivisuus on 60 - 80 IU/mg, • ·« anti-faktori Ha -aktiivisuus ei ole suurempi kuin 25 IU/mg, ja • « * *** 3 0 nitrosoyhdisteiden kokonaismäärä on pienempi tai yhtäsuuri kuin 50 ppb, • * tunnettu siitä, että: ··· (a) hepariinin fraktioimatonta vesiliuosta käsi- : tellään kloorivetyhapolla ja alkalimetallinitriitillä, ’ 35 jonka määrä on 3,5 - 4 % hepariinin painosta, liuoksen pH ( < < « • « < « · · • a • · » • · « · • · « 107388 pidetään koko ajan happamana ja tarkkaillaan nitriitti-ionien läsnäoloa, kunnes niitä ei enää ole, seos tehdään sitten emäksiseksi, pelkistetään natriumborohydridillä ja eristetään depolymeroitu yhdiste neutraalissa ympäristössä 5 saostamalla etanolilla, sitten (b) näin saadun yhdisteen vesiliuos viedään noin pH 7:ssä ultraviolettisäteilysysteemiin 254 nm:ssä, sitten näin saatu liuos pannaan anioninvaihtopylvääseen, pylväs huuhdellaan vedellä ja lopullinen yhdiste otetaan talteen 10 noin pH 7:ssä saostamalla natriumkloridilla ja etanolilla.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (b) käytetään 254 nm:n ultraviolettisäteilysysteemiä 9-15 minuutin ajan 16 W UV-lampun avulla, ja UV-säteilylle altistetun yhdis-15 teen liuoksen konsentraatio on 8 - 12 % w/v. « * • I I lit I < t I > I < • · e • e • * • · · • Φ • · · • ·· • ♦ ♦ ««« ··«* ««· • ♦ · « 9 « • · • · · • · « • · t * » • ♦ ♦ «I» • ♦ « · « « « f « • « 4 • · · • · • · · • » • · ·»» 27 107388