JPH06507398A - Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

ＨＩＶ感染治療のための異種複合抗体 発明の背景 本発明はヒトの免疫不全ウィルス感染の治療に関する。 ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の 病原体で、一種のレトロウィルスで、１４９２８球及び単球／マクロファージ系 のＣＤ４　細胞を含む一定の免疫系細胞に感染する。効果的な治療を行わないと ＡＩＤＳ＠者の死亡率はほぼ１００９６である（Ｆｕｃ　ｉ、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３０：６１７．　１９８８）。 優に１００を越えるＨＩＶの変種が確認されている。ＨＩＶエンベロープ糖蛋白 質ｇｐ１２０のアミノ酸配列は殊に変化し易い、そのアミノ酸は１つの種から次 の種へと２０−２５％も変化することがある。種から種への変化に加えて、逆転 写酵素の高いエラー率に起因するゲノム配列におけるさらに微妙な変化もある。 誤った組込みをする率は、１転写サイクル当たり、１ゲノムにつき１エラーを導 入する程十分に高い。従って、特定のウィルスとして分離されたものは、いずれ にせよ、類傭種の一団である。さらに、類似種の多様性と数は、１つのＨＩＶ変 種から次へと異なっているようである。これらの類似種はｉｎ　ｖｉ’Ｖｏ　で 進化するという十分な証拠がある。例えば、感染した個人から連続的に分離され たウィルスは、多様な類似種の比率に相当な一時的変動のあることを顕示してい る（Ｍｅｙｅｈａｎｓ、Ｃｅ／／　５８：９０１．　１９８９）、また、中和耐 性ＨＩＶ変種はＨＩＶが中和抗体の存在下に生育する時に、ｇｐ１２０をコード するウィルス配列における単一塩基の変化によって生じ得るという証拠もある（ Ｒｅｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ。、Ｃｅ／／　５４＋５７．　１９８８）。感染した個 人は、最初、ＨＩＶに対して体液性及び細胞性免疫応答を開始する。感染した個 人の免疫応答が実際ウィルスの蔓延及びより耐性の高い変種の発生を促すと信じ るべき理由がある（ＭｃＣｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、ｒｅツノ　６４：３５１．、 １９９１）。 ヒトＨＩＶ蛋白質に対するヒトモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ形成とＥ ｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ウィルスの形質転換によって生成された（Ｂａｎａｐ ｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、、１．　／ｍｍｕｎｏ／、　１３９：４０２７．　１９８ ７；　Ａｍａｄｏｃｉ　ｅｔ　ａｔ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　１ｔｙｄ　Ｈｕｍ Ｊ／７　Ｒｅｔｒｏｙｉｒｕｓｅｓ　５ニア３．　１９８９）。 さらに最近になって、ＣＤ４受容体の一部に融合された細胞毒からなる細胞毒性 ハイブリッド蛋白質が、ＨＩＶにコードされている蛋白質を発現している細胞を 破壊するための１手段として提唱されている。このアプローチは、ＨＩＶエンベ ロープ蛋白質、ｇｐ１２０が、１４９２８球及び単球／マクロファージ系のある 種の細胞上に存在するＣＤ４受容体を認識するという事実に依存するものである 。このようにして、ＣＤ４の可溶性誘導体は表面ｇｐ’１２０を発現しているＨ ＩＶ感染細胞を標的としてサイトトキシンを向けるために利用できるがもしれな い。Ｃｈａｕｄｈａｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３３５：３６９゜１ ９８８）は、ＣＤ４−シュードモナス外毒素ハイブリッド蛋白質をＨＩＶに慢性 感染しているリンパ球に投与すると全般的蛋白質合成に減少を起こすことを発見 した。Ｔｉ１ｌ　ｅｔ　ａｌ、（Ｓｃｉｅｔｙｃｅ　２４２：１１６６、１９８ ８）は、ＣＤ４−リシンＡ融合蛋白質が、慢性感染のＨ９細胞培養においてＤＮ Ａ合成を低減することを見いたした。この戦略の変法において、（：ａｐｏｎｅ ｔ　ａｌ、ＣＮｚ１ｕｒｅ　３３７：５２９．　１９８９）は、可溶性ＣＤ４と ある抗体の定常領域から成るハイブリッド蛋白質を立案した。この分子は免疫系 応答をｇｐ１２０に向けるために立案されたものである。この一般型の他の分子 は、補体を活性化することが示されている（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９ニア８．　１９８９）。 ２つの共有結合した抗体、あるいは抗体が細胞に、あるいはウィルスに仕向けら れた蛋白質に共有結合した抗体から成る異種複合分子が、細胞毒性細胞及び腫瘍 細胞やウィルス感染細胞に仕向ける手段として提唱されている。Ｓｅｇａ　１ｅ ｔ　ａｌ、（米国特許第４，６７６．９８０号）は、架橋異種抗体を免疫系細胞 を好ましくない、あるいはを害な細胞に仕向けるために、架橋異種抗体を用いる ことを提案している。Ｆａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（ＰＣＴ　公開　ＷＯ９１２ ・００３６０）は、この様な異種複合体をＡＩＤＳの治療に対して提案１７てい る。 特に、Ｆ　ａ　ｘｉ　ｇ　ｅ　ｒらは、ＣＤ４　（あるいはｇｐ１２０のＣＤ４ 結合ドメイン）に融合された高親和性Ｆｃγ受容体特異抗体をＡＩＤＳの治療に 用いることを提唱１−５ている。Ｆａｎｇｅｒらは、また、抗ｇｐ１．２０抗体 のようなＨＩ　Ｖ特異抗体に遊合された高親和性Ｆｅγ受容体特異抗体から成る 異種複合体をＡＩＤＳ冶吟に使用することを示唆している。Ｚａｒｌｉｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、（ＥＰ公開番号０３０８９．３６）は、ＨＩＶ感染細胞に発現された ＨＩＶ抗原に特異的な抗体で、末梢血液のエフェクター細胞に特異的で、ＨＩＶ 感染細胞を殺す能力のある第二抗体に架橋されたものから成る異種複合体抗体に ついて述べている。 発明の概要 一般に、本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴 とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗 体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶＭＮあるい はＨＩＶ　ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質の■３ループ配列に対する 抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓ ｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗 体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ− ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なく とも８０％低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第一、第二混合細胞培養 においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は、感染後１（月 」目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第一混合細胞培養に感 染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００−１．　ＯＯＯ単位の ＨＩＶ−ＭＮで感染される。 好適な態様において、第一細胞培養の逆転写酵素活性は、第二混合細胞培養の逆 転写酵素活性に比べて９［〕％以上減少する。 他の好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株に 感染さ第１たＣＥＭ−ｓｓｌｉＢ胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度 ２００ｎｇ／’ｍｌの異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、 エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩ　Ｖ株に感染した当該ＣＥＭ−ｓｓ 細胞を含む他の同一の第二細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも５０％低 下させる９゜ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター＝細胞は 当該ＣＥＭ−ｓＳ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０ＥコＩＩ に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１ ８時間にて添加され。 第一、第二細胞培養はＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株の１００−１０００感染単位 で感染された。 なお別の好適な態様において、異種複合抗体はＨＩＶ＝ＭＮ以外のＨＩ　Ｖ株の Ｖ３ループに結合する。 他の好適な態様において、エフェクター細胞は細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、単 球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択される。 そしてエフェクター細胞表面に存在する抗原はＣＤ３である。 もう１つの好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＩＩＩＢに感染 したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０日ｇ／ｍ＋の異種 複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に 比べて少くとも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養において、 エフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染 後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養 に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単 位の旧Ｖ−ＩＩＩＢで感染される。 なお別の好適な態様において、エフェクター細胞と、ＨＩＶ株の一つ（Ａｌａｂ ａｍａ、Ｄｕｋｅ６５８７−５、Ｄｕｋｅ６５８７−７、Ｄｕｋｅ７８８７−７ 、ＳＦ２．　ＷＭＪ　２．及びＩＩＩＢ）に感染したＣＥＭ　ｓｓ細胞を含む３ 種またはそれ以上の混合培養細胞において、２０日ｇ／ｍｌの異種複合抗体は、 各々の混合細胞培養の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞及び同じＨＩＶ株に 感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一・の混合細胞培養の逆転写酵素活性に 比べて少くとも８０？６低ｒさせる。ここで、第一、第二混合細胞培養において エフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染 後１０！１［１に測定され、異種ｉ（合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細 胞培養に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１．００ ０感染単位のＨＩＶ株で感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合

【また第−及び第二蛋白質を含む異種 複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する 抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨ ＩＶ−ＭＮあルイｌ！ＨＩ　Ｖ−ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のｖ ３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度１０ｎ ｇ／口〕ｌの異ｆ！複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エ フェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合 細胞培養と比較して少なくとも８０％低丁させる。ここで、エフェクター細胞は 、第一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写 酵素活性は、感染後１０日［１にＭ１定され、異ｆ！複合抗体及びエフェクター 細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養 は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩ Ｖ−ＭＮあるいはＨＩＶ−ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ル− プ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩ　Ｖ−Ｍ Ｎ感染ＣＩＩＪｆ−ｓｓ細胞を３む第一混合細胞培養において、初期濃度５ｎｇ ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェク ター細胞とＨ［Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培 養と比較して少なくとも８０９６低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第 一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素 活性は、感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第 一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００− １０００中位のＨＩＶ−ＭＮて感染される。 他の関連する態様において本発明は、共有結合（７た第一・及び第一蛋白質を八 む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存 在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現さ れたＨＩＶ−ＭＮあルＬ”ｌ；ｉＨＩ　Ｖ−ＭＮ変ｍのｇｐ１２０エンベロープ 蛋白質〕Ｖ３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞 及びＨＩ　Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初 期１度１ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性 を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓ５細胞を含む他の同一の第 二混合細胞培養と比較し、て少なくとも８０％低下させる。ここで、エフェクタ ー細胞は、第一、第二混合細胞培養においてＣＥｈ４−ｓｓ細胞の３倍過剰にあ り、逆転写酵素活性は、感染後１０ＥＥ目にＭ１定され、異種複合抗体及びエフ ェクター細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間ｊ７て加えられ、第一・、 第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＸＶ−ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はアミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦに対する抗 体を含んでいる。 好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓ ｓｍ胞を含む第一混合細胞培養において、２　（，１ｎ　ｇ／ｍ　ｌの異種複合 抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、細胞きＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ −ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くと も８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター 細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の′３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目 に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感象後１ ８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ −ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共存結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第一の抗体部分はアミノ酸配列ＩＸＩＧＰＧＲに対する 抗体を含んでいる。ここで、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。 好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓ ｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、第 一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥ Ｍ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少く とも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター 細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に 測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８ 時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はアミノ酸配列ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬ ＫＤＱＱＬＬＧ　ＩＷＧＣ５ＧＫＬ　ＩＣに対する抗体を含んでいる。 好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓ ｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、第 一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥ Ｍ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少く とも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター 細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に 測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８ 時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。 他の好適な態様において、エフェクター細胞は細胞毒性１９２６球、好中球、単 球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択される。 そしてエフェクター細胞表面に存在する抗原はＣＤ３である。 その他の好適な態様において本発明は、薬理学的に効果的な量の上述の異種複合 抗体を含む、薬理学的に許容できる混成物に関する。 関連する態様において本発明は、ＨＩＶに感染した患者の治療法に関し、この方 法には、上述の薬理学的に許容できる混成物の患者への投与を含む。 その他の態様において本発明は、（ａ）細胞表面抗原を発現するエフェクター細 胞、及び（ｂ）上述の異種複合抗体を含む、ＨＩＶを標的とするエフェクター細 胞に関する。 関連する態様において本発明は、ＨＩＶに感染した患者の治療法に関し、この方 法には、上述のＨＩＶを標的とするエフェクター細胞の患者への投与を含む。 ＭＮ基本型ウィルスは、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ領域中、位 置ＡＩ　’１７における特定のアミノ酸サブ配列に−Ｒ−に−Ｒ−１−Ｈ−１− Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋにより定義される。（アミノ酸配列は 標準的な一文字表記で示す。）ＭＮウィルス変種は、上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と 位置Ａ７〜Ａ１、のアミノ酸残基１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒが完全に一致し、残り１２ アミノ酸が上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と最低３６％の相同性を有するものである。 “に対する°とは、指示された抗原に結合する抗体を意味する。ｇｐ１２０のＶ ３ループは、Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７． １９８５）のｇｌ）１２０番号付けによるアミノ酸３０３〜３３８の３６アミノ 酸領域として定義される。 本発明の異種複合抗体は非常に効果的である。逆転写酵素アッセイにより示され る通り、低濃度においてもウィルス復製をほぼ完全に阻害する。好適な異種複合 抗体は、一つ以上の株に効果的なものである。 本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載する好適な実施例及び特許請求の範囲 から明確である。 発明の詳細な説明 ４、【図面の簡単な説明】 図１は、細胞毒性１９２８球存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞 の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合 物（黒菱形）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）の効果を示したグ ラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、細胞培養物中の初期抗体 濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。 図２は、細胞毒性１９２８球存在下でのＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆 転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（ 黒菱形）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）の効果を示したグラフ である。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度 （ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。 図３は、細胞毒性Ｔリンパ球非存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細 胞の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混 合物（白丸）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（黒丸）の効果を示したグラ フである。細胞毒性１９２６球のみ存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓ ｓｌ［胞の逆転写酵素活性（黒三角）；ＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞 のみの逆転写酵素活性（白玉角）；及び感染していないＣＥＭ−ｓｓ細胞のみの 逆転写酵素活性（黒画角）も併せて示している。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０ μｌ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している（抗 体を添加しない場合を除く）。 図４は、１μｇ／’ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体存在下での、逆転写 酵素活性に対する細胞毒性１９２６球とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の比 率の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、ＯＥ Ｍ−ｓｓ細胞に対する細胞毒性リンパ球の関数で示している（　ｌ　ｏ　ｇ　１ ０スケール）。 図５は、ＨＩＶ−ＭＮ（パネルＡ）　、ＨＩＶ−Ａｌａｂａｍａ　（パネルＢ） 、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ７８８７−７　（パネルＣ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７ −５（パネルＤ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７−７　（パネルＥ）　、ＨＩＶ −Ｉ　Ｉ　ＩＢ（パネルＦ）　、ＨＩＶ−５Ｆ２　（パネルＧ）、及びＨＩＶ− ＷＭＪ２（パネルＨ）に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、 細胞毒性１９２６球と０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）及び０ＫＴ３ 抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒三角）の効果を示したグラフで ある。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、感染後の日数の関数で示してい る。 図６は、ＨＩＶ−１１１８感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、複 合０ＫＴ３抗体と６Ｃ５抗体の混合物（白丸）及び０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗 体（黒丸）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ） は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。 ＡＩＤＳ治療に対する異種複合抗体 本発明の分子は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェ クター細胞表面に存在する抗原に対する第一の抗体を、ＨＩＶ感染細胞の表面に 存在するＨＩＶ抗原に対する第二の抗体に結合することにより作製した異種複合 抗体である。 本発明の異種複合抗体は非常に効力が高い。これらの異種複合抗体は、低濃度で も、ＨＩＶに感染した細胞とエフェクター細胞の混合細胞培養物中のＨＩＶ活性 を十分に低下させることができる。最も好適な異種複合抗体は、高い効力と広範 囲の反応性の両方を兼ね備えたものである。広範囲の反応性を有する異種複合抗 体とは、一つ以上のＨＩＶ株に対して効果的であるものを指す。例えば、広範囲 の反応性を有する異種複合抗体は、ＨＩＶ−ＭＮとＨＩＶ−３Ｆ２またはＩＩＶ −ＭＮとＨＩＶ−ＷＭＪ２まりｌ！ＨＩ　Ｖ−ＭＮとＨＩＶ−１１１Ｂｌ：対し て効果的である。 ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェクター細胞に対す る異種複合抗体の一部は、細胞毒性１９２６球、単球／マクロファージ、大型顆 粒リンパ球（細胞とＮＫ細胞を含む）及び好中球のような細胞の表面に存在する 抗原を認識する。細胞毒性免疫エフェクター細胞に対する抗体はエフェクター細 胞表面上の抗原に結合し、細胞溶解活性を誘発することが好ましい。例えば、認 識された抗原はＣＤ３受容体またはＣＤ１６　（Ｆｃ）受容体である。細胞溶解 活性を誘発するために複数のシグナルを必要とする受容体（例えば、ＣＤ２及び ＣＤ２８受容体）に対する抗体はあまり好ましくない。 ＨＩＶに感染した細胞表面に存在する抗原に対する異種複合抗体の一部は、（１ ）ＨＩＶ−１のＭＮ基本型（ＨＩ　Ｖ−ＭＮ）のｇｌ）１２０エンベロープ蛋白 質のｖ３ループ配列中のエピトープ、（２）ＨＩＶ−１のＭＮ基本型のウィルス 変種のｇｌ）１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ配列中のエピトープ、（３ ）アミノ酸５８４〜６１１の間にあるｇｐ４１の一部の中のエピトープを認識す ることが好ましい。 ｇｐ１２０の■３ループは、Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３１ ３：２７７．１９８５）のｇｌ）１２０番号付けによるアミノ酸３０３〜３３８ の３６アミノ酸領域である。ＭＮ基本型ウィルスは、ｇｐ１２０エンベロープ蛋 白質の中のアミノ酸サブ配列に−Ｒ−に−Ｒ−１−Ｈ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋ　（Ａ’　−Ａ’）により定義される。ＭＮウィルス変種 は、上述の旧Ｖ−ＭＮ配列と位置Ａ７〜Ａ１１のアミノ酸残基１−Ｇ−Ｐ−Ｇ− Ｒが完全に一致し、残り１２アミノ酸が上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と最低３６％の 相同性を有するものである。 上述の、ＨＩＶに対する抗体は、非常に効力の高い異種複合抗体を作製するため の良い候補である。しかし、作製された異種複合抗体の効力が高くない場合もあ る。最終的には本発明の異種複合抗体の作製における、ＨＩＶに対する特定の抗 体の有用性を評価するには、異種複合抗体を作製するしかない。例えば、）Ｉｔ ■に対する抗体を抗ＣＤ３抗体に共有結合させ、適切なアッセイ法により異種複 合抗体の効力を評価するなどである。一度、ＨＩＶに対する特定の抗体の異種複 合抗体作製における有用性が示されれば、その抗体を他のエフェクター細胞抗原 に対する抗体に共有結合させることにより、他の異種複合抗体を作製するのに使 用することができる。 上述の通り、最も好適な異種複合抗体は、効力の高さと共に広範囲の反応性を兼 ね備えたものである。（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆの配列を有するエピトープ 、（２）Ｉ−Ｘ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（ここでＸはいかなるアミノ酸でもよ０） の配列を有するエピトープ、または（３）ｇｐ４１のアミノ酸５８４〜６１１（ Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、５ｕｔｙｒｓの番号付けζこよる）部分の中（こ あるエピトープ、を認識するＨＩＶに対する抗体は、効力が高く広範囲の反応性 を有する異種複合抗体の作製に有用であると思われる。これは、ＨＩＶ−ＭＮの ｖ３ループ、ＨＩＶ−ＭＮウィルス変種のｖ３ループ、またはｇｐ４１中のエピ トープを認識する抗体を、効力が高く広範囲の反応性を有する異種複合抗体の作 製；こ使用することができないことを示すものではない。 異種複合抗体の調製にＹ−１用なＨＩＶに対する抗体を作製及びスクリーニング 技術、異種複合抗体の調製法、及び異種複合抗体の効力及び反応性の広さの評価 法を以下に記載する。広範囲の反応性を有する異種複合抗体を作製するためには 、広範囲の１（ＩＭ株を認識する、ＨＩＶに対する抗体（すなわち、株に特異的 ではない抗体）を選択するのが効果的である。アミノ酸配列Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ。 アミノ酸配列１−Ｘ−［−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（ここでＸはいかなるアミノ酸でもよ い）、またはｇｐ４１のアミノ酸５８４〜アミノ酸６１１部分の中にあるエピト ープに対する抗体を選択するのも効果的である。これらの抗体は、以下に記載す る標準的なエピトープマソビング技術を用いて同定することができる。 一般的に、有用な、ＨＩＶに対する抗体の作製及び選択過程には以下が含まれる 。（１）ハイブリドーマの作製及び反応性を有する抗体を生産するハイブリドー マの選択、（２）ＨｒＶエンベロープ蛋白質を発現する細胞への結合能を有する 抗体を生産するハイブリドーマの選択、（３）選択されたモノクローナル抗体の 増幅及び精製、（４）ｇｐ１２０　Ｖ３ループペプチドまたはｇｐ４１由来のペ プチドを用いた、抗体の反応性の解析、（５）エピトープマツピング。上述の通 り、これらの工程のすべてが必須なわけではない。１〜３の工程を簡略にし、異 種複合抗体を調製するのに精製された抗体を使用することができる。なお、この 異種複合抗体の効力及び反応性の広さは、以下に記載する逆転写酵素アッセイに より解析することができる。本発明の異種複合抗体を作製するために、精製され た、ＨＩＶに対する抗体を、免疫エフェクター細胞に対する抗体に共有結合させ る。異種複合抗体の効力及び反応性の範囲は、エフェクター細胞とＨＩＶに感染 した細胞の混合細胞培養物中で逆転写酵素アッセイを用いて測定することができ る。 異種複合抗体は、いかなる架橋法によっても形成することができる。適切な架橋 法には、５ＰＤＰＳＳＰＤＰとＳＭＣＣ，及びビオチン−アビジンが含まれる。 Ｓｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４，６７６．９８０号）は、多くの架橋 技術について記述している。その他の方法として、ハイブリッド−ハイブリドー マを経て２つの特異性を有する抗体を作製することにより（Ｓｕｒｅｓｈ　ｅｔ ａｌ、、Ａｆｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１°２１０．　 １９８６）　、または遺伝子工学により抗体を結合することができる。 ）１１Ｖに対する抗体の調製 本発明の異種複合抗体分子の調製に有用な抗体は、以下に記載する通りに作製及 びスクリーニングすることができる。ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＭＮのウィル ス変種のＶ３ループに対する抗体の調製及び解析も、１９９１年３月６日に出願 された米国特許出願第０７／６６５，３０６号（本発明の参考文献に取り入れら れている）に記載されている。 免疫原の調製 異種複合抗体分子の作製に有用な、ＨＩＶに対する抗体の１群は、ＨＩ　Ｖ−Ｍ ＮまたはＨＩ　Ｖ−ＭＮのウィルス変種のｖ３ループ中の配列を認識する。従っ て、これらの抗体の作製に使用する免疫原には、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、Ｖ３ Ｊレープの全体または一部を含むｇｐ１２０またはｇｐ１６０、またはｖ３ルー プの全体または一部を含む合成ペプチドが含まれる。すべての場合において、Ｖ ３／レープ配列はＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＭＮのウィルス変種のものである 。Ｖ３）レープに対する抗体の作製に好適な免疫原には、閉鎖的なループ中に形 成されるＲＰ７０ペプチドが含まれる（以下に記載）。 異種複合抗体分子の作製に有用な、ＨＩＶに対する抗体の他の群は、ｇｐ４１中 のアミノ酸５８４〜６１１領域中の配列を認識する。これらの抗体の作製１ご使 用する免疫原には、ｇｐ　１６０、ｇｐ４１、Ｖ３ループの全体または一部を含 むｇｐ４１のアミノ酸５８４〜６１１の間にある配列、すなわちＱ−Ａ−Ｒ−１ −Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｅ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−に−Ｄ−Ｑ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−１−Ｗ−Ｇ−Ｃ −８−Ｇ−に−Ｌ−１−Ｃ，の全体または一部を含むｇｐ１６０またはｇｐ４１ の断片が含まれる。 免疫化するペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質は、直鎖状である力）、また鑑 よ■３ループ配列末端のシスティン残基の間に形成されるジスルフィド結合Ｉこ より閉鎖的なループとなる■３ループを有することもある。免疫されるペプチド 力（一つ以上のＶ３ループを存する場合、各ループはジスルフィド結合を介して 別々のループを形成することもある。 目的の配列を有する合成ペプチドは、自動化ペプチド合成機を用いて合成するこ とができる。無傷の組み換えｇｐ１６０エンベローブポリベブチドは、本発明と 同一の譲渡人に譲渡されているＲｕ５ｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許出願第０ ９１．４８１号（１９８７年８月３１日に出願され、本発明の参考文献に取り入 れられている）に記載されている通り、バキュロウィルス発現系を用も）で昆虫 細胞中で生産し、精製することができる。 免疫原として使用する合成ペプチドまたは蛋白質断片は複合していなくても、ま たは、以下のように、例えば、スクシニルマレイミドメチルシクロへキサニルカ ルボキシルレー）（ＳＭＣＣ）を複合媒体としてｋｅｙｈｏｌｅ　ＩＬｍｐｅｔ ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミンのような免疫原性担体と複合させ ることもできる（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、）、Ｂ　ｉ　ｏ　ｃｈ　 ｅｍ。 ９２：１４１３．　１９８２）。 簡単に記載すると、ジメチルホルムアミド５０μｌに溶解した１ｍｇのＳＭＣＣ を５ｍｇの担体（０，１Ｍ　ＮａＰＯ、ｐＨ６，５中１０−２０ｍｇ／ｍ１の濃 度）に添加し、室温で０．　５時間インキュベートする。次（１で溶液をセファ デクスＧ−２５カラムに通して過剰な未反応ＳＭＣＣを除去し、２ｍｇのペプチ ドを添加する（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１．Ｍ　ＮａＰＣ）４　、ｐＨ８， １ｍＭ　ＥＤＴＡの脱気溶液中に懸濁）。溶液をＮ２　ガスと混合し、４℃で一 部インキユベートする。次いで、沈殿物が溶けるまで試料を６Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＰＯ、ｐＨ７で透析する。次いで試料を、６Ｍ尿素、Ｏ，ＩＭ　ＮａＰ０　 で平衡化したＢｉｏＧｅｌ　Ｐ−１０カラムに通す。溶出した蛋白質を回収し、 蒸留水で透析する。 免疫原に有用な数種のペプチド（ＲＰ１４２．ＲＰ７０．ＲＰ３４２．ＲＰＩｏ ｏ、ＲＰ１０２．ＲＰ１０８．ＲＰ１２３ｃ、ＲＰ１７４ｃ）の配列を表１（こ 示す。この一覧はすべてを網羅しているわけではない。免疫原として使用するこ とができるペプチドの極一部を示したにすぎない。 （以下余白） 表１：免疫原として有用なペプチドの例ＲＰ１４２　ＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧ ＲＡＦＹＴＴＫＮＩ　ＩＧ（Ｃ） ＲＰ３４２　１ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ ＲＰ７０　１ＮＣＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ　１１　 ＧＴ　Ｉ　ＲＱＡＨＣＮ　Ｉ　５ＲＰ１００　（ＳＧＧ）ＴＲＫＧ　ＩＨＩＧＰ ＧＲＡＩＹ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１０２　（ＳＧＧ）ＴＲＫＳ　Ｉ　Ｓ　ＩＧＰＧ ＲＡＦ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１０８　（ＳＧＧ）ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧ　（Ｇ ＧＳＣ）ＲＰ１２３ｃ　（Ｃ）ＨＩＧＰＧＲＡＦ　（Ｃ）ＲＰ１３５（［１１Ｂ ）ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（Ｃ） ＲＰ１７４ｃ　（Ｃ）ＮＮＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（ Ｃ） ＲＰ３３９　（ＲＦ）　ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹ　（Ｃ）注：カッコ内のアミノ酸 は、単離ペプチドの天然配列ではないペプチドＲＰ７０．ＲＰ１２３ｃ、ＲＰ１ ７４ｃは、アミノ酸配列末端に近し１２つのシスティン残基の間に形成されるジ スルフィド結合によりル−プを形成することができる。このような結合の形成方 法は、Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（５’ｔ’ｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　２７＋３７ ８５．１９８８）に記載されている。 ペプチドを、定法に従いフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュ７くンド中１； 乳化して免疫化用に調製した（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ ５ｌａｎｄ、ＮＹ）。 ）１１Ｖに対する抗体の作製 ＨＩＶに対する抗体は、マウスの系（Ｂａ　ｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６．Ａ、Ｓ Ｗ、　ＢＩＯ，ＢＲ，またはＢＩＯ，Ａ、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ、、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）の腹腔内において、マウス１匹につき１０〜５０μｇの環 状化ＲＰ７０　（表１）または組み換えｇｐ１６０を用いて免疫化することによ り調製した。免疫原を最初の投与の後２〜４週間の間隔で２〜３回、フロイント 不完全アジュバント中に乳化した、または可溶化した形で、マウスに追加投与し た。 マウスから採血し、免疫原との反応性を有する抗体の有無について血清を調べた 。 血清学的に強い反応性を示すマウスに追加抗原投与し、その３〜５日後にこれら のマウスのひ臓細胞を、重鎖及び軽鎖イムノグロブリンの両方を分泌することの できないＮ５−１　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＴｌＢ１８）　、５Ｐ２− ０　（Ａ、　Ｔ。 Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＣＲＬ８２８７．ＣＲＬ８００６）またはＰ３．Ｘ６３．ＡＣ３ ゜６５３骨髄腫細飽に、Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づい た定法ＣＮ１ｆｕｒｅ　２５６：４９５．１９７５）に従って融合させた（Ｋｅ ａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ／、１２３：１５４８，１９７９ ）。 融合後６〜２１日後に出現したハイブリドーマの上清について、以下の通りＥＬ ＩＳＡスクリーニングアンセグアより抗体の生産をスクリーニングした。ＲＰ７ ０により生産されたハイブリドーマにはＲＰ７０ペプチドを用い、ｇｐ１６０に より生産されたハイブリドーマにはｇｐ４１の残基５６７〜６４７のアミノ酸配 列と同一のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。 各ウェルにつき最終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌのペプチドを含む５０μｌのＰ ＢＳ溶液を用いて、９６ウエルＣｏ５ｔａｒ平底マイクロタイタープレートにペ プチドをコーティングした。ペプチド溶液を吸引し、ＰＢＳ＋０．５％　ＢＳＡ と置換した。インキュベーション後、ウェルを吸引、洗浄し、５０μｍのハイブ リドーマ上演を添加した。インキュベーション後、ＰＢＳを用いて細胞を３回洗 浄し、適切に希釈したヤギ抗マウス　イムノグロブリン−西洋ワサビパーオキシ ダーゼ護合体（ＨＲＰ、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ　Ｆｒ ａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）５０．ｃａｌとともにインキュベートした。ＰＢＳを用 いてウェルを再度３回洗浄し、ＨＲＰの基質である１ｍＭ　ＡＢＴＳ　（０，１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ）１４．２中の２，２ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ　（３−ｅ ｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄに１ ：１０ＯＯ希釈のＨ２Ｏ２を添加したもの）５０μｍを添加して、結合している 抗体を検出した。ＨＲＰ活性は４１０ｎｍの吸収を測定することによりモニター した。 ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で陽性のハイブリドーマについて、ＨＩＶエンベロープ蛋白質 を発現する細胞への結合能を試験することができる。このようなアッセイの一例 では、特定のＨＩＶ株のｅｎＶ遺伝子を発現する組み換えワクシニアウィルスを ＣＤ４＋ヒトＴ−リンパ腫系、ＣＥＭ−ｓｓ　（ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、ＭＤ、ｃａｔａｌｏｇ　＃７７６）の細胞に感染させる。ハイブリドー マ上清（または精製抗体）を感染細胞と共にインキュベートし、二次抗体及び蛍 光活性化細胞ソータを用いて間接的免疫蛍光により抗体の結合を検出する。対照 実験として、ｅｔｙｒ’遺伝子を発現しないこと以外は同一の細胞への結合を測 定する。 θ〃ト・を発現する細胞に結合するがｅｎｐ遺伝子を発現しない細胞には結合し ない抗体を生産するハイブリドーマについて、さらに解析を行なう。ＨＩＶ株の ｅ〃に遺伝子を発現する細胞は、以下に記載する通りに調製することができる。 ある場合（抗体の中和において）、シンシチウム形成阻害アッセイにより、ＨＩ Ｖに対する抗体を評価することができる。このアッセイにおいては、ＨＩＶ感染 細胞と非感染細胞の混合物にに抗体を添加し、巨大細胞の形成をモニターする。 このアッセイの詳細は、１９９１年３月６日に出願された米国特許出願第０７／ ６６５、’３０６号（本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されてい る。 組み換えワクシニアウィルスを用いたＨＩＶ　ｅｎｔｙを発現する細胞の調製Ｈ ＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現する細胞への結合アッセイには、実際にＨＩＶに感染 した細胞よりもむしろ、ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現するワクシニアウィルスに 感染した細胞を使用する。ワクシニアウィルスプロモータにより全ｉＨＩ　Ｖエ ンベロープ遺伝子を発現することができる組み換えワクシニアウィルスの構築は 、ＥＰ　公告番号０　２４３　０２９（本発明の参考文献に取り入れられている ）に記載されている。ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子と、第二のワクシニアウィルスプロ モータにより発現される大腸菌の／ｉｃＺ遺伝子、及びそれに隣接してチミジン キナーゼ（丁Ｋ）をコードするワクシニアウィルス配列を有する組み換えベクタ ーｐＳＣ２５を用いて組み換えウィルスを作製した。 ＨＩＶ−ＭＮ変種の特異性を有するエンベロープ遺伝子をコードするＤＮＡをて いる）を除去し、ＨＩＶ−ＭＮ　ｅｎｙ遺伝子由来の相似の３７１１１断片と置 換することにより調製した。その結果得られるプラスミドｐｓｃＲ２５０２は、 ベロープ遺伝子を有する。 上述の１８０アミノ酸の置換の代わりに、ＨＩＶ−ＭＮ　ｇｐ１６０蛋白質の小 さめの領域を使用することができる。例えば、いずれがのＨＩＶ株由来の３６他 の方法として、全長ＨＩＶ−ＭＮ　ｅｎｙ遺伝子を有する組み換え体を使用する ことができる。複数のＨＩＶエンベロープを発現する株は、抗体の特異性を評価 する上で有用である。 無傷のＴＫ遺伝子を有するワクシニアウィルスにあらがじめ感染したＣＶ−１宿 主細胞に、組み換えベクターｐｓｃＲ２５０２を感染させた。ＨＩＶエンベロー プ遺伝子は、ベクター上のＴＫ配列とウィルスゲノム中のＴＫ配列の間の相同組 み換えによりウィルスＤＮＡ中に組み込まれる。ＨＩＶエンベロープ遺伝子を６ する組み換え体は、ＴＫ欠損株細胞に感染させ、ブロモデオキシウリジン（ＢＵ ｄＲ）とＸ−ｇａｌを含む培地上にまくことにより選択した。ＢＵｄＲはＴＫ“ 細胞に対して毒性を示すので、ＴＫ−組み換え体を選択する。Ｘ−ｇａｌは１ｚ ｃ２遺伝子産物により分解される発色基質であり、ｊｚｃ２遺伝子が発現すると プラークが青（なり、ＨＩＶ−ｅｎｖ遺伝子も併せ持つ組み換えウィルスを同定 することができる。 抗体の精製及び増幅 ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおいて、ペプチド結合性を有することが示されたハイ ブリドーマを、限定希釈法によりサブクローニングした。ハイブリドーマ細胞と 、免疫化していない同系マウス由来の放射線照射したび臓細胞を混合しくそれぞ れ、最終濃度５細胞／ｍ＋と２．５Ｘ１０６細胞／ｍｌ）、混合懸濁液２００μ ＋をマイクロタイターウェルに入れ、各ウェルにつき１個のハイブリドーマ細胞 となるようにした。７〜１４日後に出現したサブクローンについて、再度上述の ＥＬＩＳＡ法により評価した。代表的な陽性クローンをもう一部サブクローニン グした。 ５種の主要なマウス　イムノグロブリン　アイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ１゜１ 　ｇＧ２Ａ、Ｉ　ｇＧ２Ｂ、Ｉ　ｇＧ３）にそれぞれ対応するヤギ抗マウス−Ｈ ＲＰ調製物を用いたＥＬＩＳＡ法により、抗体のアイソタイプを決定した。 ＥＬＩＳＡおよびシンシチウム阻害アッセイで陽性であることが繰り返し確認さ れたハイブリドーマサブクローンをｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ同系マウス の腹腔内に注入することにより、精製抗体を調製した。注入の２〜３週間後に腹 水を回収し、各抗体アイソタイプに応じた方法でモノクローナル抗体を以下に記 載する通りに精製した。溶出後、すべてのＩｇＧ抗体は、ＰＢＳに対して透析し た。 ＩｇＭ抗体は、対応するハイブリドーマ細胞を注入したマウスの腹水を５０％Ｎ Ｈ２ＳＯ４沈殿により精製し、次いで沈殿物を４ｘＰＢＳに対して透析した。 次いで、透析した抗体を、４ｘＰＢＳであらかじめ平衡化したＵｌ　ｔ　ｒａｇ ｅ　ＩＡ−６カラム（Ｂ　ｉｏ　ｔ　ｅｃｈｎ　ｉ　ｃｓ、Ｖｆ　Ｉ　１ｅｎｅ ｕｖｅ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に通した。ＥＬＩＳＡにより抗 体を含をする画分を同定した。 ＩｇＧ１抗体を含有する腹水は、４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３ＭＮ ａＣ１，ｐＨ８，９により希釈し、同じＴｒｉｓ−ＮａＣＩ緩衝液で平衡化した Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティ力ラムに通すことにより単離し た。０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ６，０を用いて抗体を溶出した。 Ｉ　ｇＧ２抗体を含有する腹水は、２倍量のＰＢＳにより希釈し、ＰＢＳで平衡 化したＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティカラムに結合させた。次 いで、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０によりカラムから溶出 した。溶出後、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　２　ＨＣＯ３を添加することにより抗体を迅速 に中和した。 ＩｇＧ３抗体を含有する腹水は、４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３ＭＮ ａＣ１，ｐＨ８，９により希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニ ティカラムに適し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸により抗体を溶出した 。 その他の方法として、すべてのＩｇＧサブクラスは、以下の方法により精製する ことができる。腹水を４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３Ｍ　ＮａＣ１゜ ｐＨ８，９により希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティ力ラ ムに通し、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０により溶出する。 抗体の特異性の決定 以下に記載するアッセイは、ＨＩＶに対する抗体の株特異性を決定し、ＨＩＶに 対する抗体により認識されるエピトープをマツプするのに使用することができる 。これらのアッセイの一部またはすべては、異種複合抗体を生産するためのＨＩ Ｖに対する抗体を選択するのに使用することができる。上述のＨＩＶ　ｅｎｙ遺 伝子を発現する細胞への結合アッセイも、抗体の特異性の評価に使用することが できる。Ｖ３に対する抗体により認識されるエピトープは、標準的なＥＬＩＳＡ アッセイまたは以下に記載する競合的ＥＬＩＳＡアッセイによりマツプすること ができる。ＥＬ　Ｉ　ＳＡアンセイにａｍなペプチドには、（１）多様なＨＩＶ 変種由来のｖ３ループ配列（表２）を代表する２４〜２５ｍｅｒの配列、（２） ＭＮ　Ｖ３ルーブチンブ配列（Ｃ）−に−Ｒ−１−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−（Ｃ）に対応する１２ｍｅｒの配列を含み、それぞれ最初の アルギニン（Ｒ）残基からチロシン（Ｙ）残基までの１つのアミノ酸がアラニン 残基に置換されているＭＮ置換配列を含む。置換配列においては、天然ではアラ ニンであるところがグリシンに置換されている。抗体の、ＭＮ配列中に含まれる エピトープ認識は、アラニンが置換されたペプチドに抗体が結合しにくくなるこ とから示される。アラニン置換により結合は阻害される。 競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイは、標準的なＥＬＩ　ＳＡアッセイを以下のよう に修正し０行なった。抗体をプレートにアプライする前に、１０ＭＭ−０，００ ４５μＭの濃度の、先に列記した試験ペプチドの１つと共に抗体をインキュベー トした。抗体と結合する上で、試験ペプチドが固定化免疫原と競合する場合、抗 体がプレートにほとんどまたはまったく結合しないことがＥＬＩ　ＳＡにより示 される。 ｇｐ４１に対する抗体により認識されるエピトープは、ｇｐ４１配列の全体また は一部に基づくアラニン置換配列を用いて類似の方法でマツプすることができる 。ｇｐ４１の一部に対応する配列を有するペプチドを使用することも可能である 。 ｖ３ループに対する抗体 ＨＩＶ−ＭＮ　ｇｐ１２０のｖ３ループ中の配列を認識し、異種複合抗体の作製 に使用することのできる抗体を以下に記載する。 ＢＡＬＢ／ＣマウスをＲＰ７０　（表１）免疫原により免疫化して、ハイブリド ーマＦ５９及びＦ８３を作製した。Ｆ５９／Ｐ５Ｂ３　（５９，１）及びＦ８３ ／Ｐ６Ｆ１２　（８３，１）と命名した抗体は、株特異的ではない抗体として同 定された。５９．１抗体との結合においてＲＰ７０と競合するアラニン置換ペプ チドは、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列中にアラニン置換を含まない。同様に、Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列を有するペプチドは５９．１抗体との結合においてＲ Ｐ７０と競合することができるが、この配列を有しないペプチド（すなわち、Ｒ ＰＩ２９及びＲＰ１７５）は競合することができない。これらの結果は、５９． １抗体がＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆエピトープを認識することを示唆している。こ の配列は広範囲にわたるＨＩＶ変種中に存在する。５９．１の株特異性は、上述 の技術を用いて解析した。これらのアッセイにより、５９．１がＨＩ　Ｖ−１ｖ ＩＮＳＨＩＶ−３Ｆ２、旧Ｖ−ＷＭＪ２及び旧Ｖ−１１１ＢのＶ３ループを認識 すルコとが示された。 ＥＬＩＳＡアッセイにより、８３．１抗体がｌ−Ｘ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピト ープ（Ｘはいかなるアミノ酸でもよい）を認識することが実証された。８３゜１ 抗体の株特異性は、上述の技術を用いて解析した。これらのアッセイにより、８ ３．１がＨＩＶ−ＭＮ、ＨＩＶ−Ａｌａｂａｍａ、ＨＩＶ−８Ｆ２、ＨＩＶ−Ｗ ＭＪ２及びＨＩＶ−Ｄｕｋｅ　７８８７−７のｖ３ループを認識することが示さ れた。 このように我々は、多くのＨＩＶ株を認識する抗体２種を同定した。８３．１抗 体はｌ−Ｘ−１〜Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピトープ（Ｘはいがなるアミノ酸でもよい） を認識する。一方、５９．１はＧＰＧＲＡＦエピトープを認識する。５９．１抗 体を用いて、５ｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、（７，Ｉｍｍｕｔｙｏｌｏｚｙ　１４０ ：８．１９８８）により異種複合抗体を作製した。 ｇｐ４１に対する抗体 組み換えｇｐ１６０を用いて、根本的には以下に記載する通りにモノクローナル 抗体を作製した。ＥＬＩ　ＳＡアッセイにより、これらの抗体の一種、６ｃ５が ｇｐ４１の一部分（アミノ酸５８４〜６１１）を認識することが示された。ｇｐ ４１のこの部分は、ＨＩＶ株の間で大きく異なることはない。従って、この領域 に対する抗体は株特異的ではないと予想される。この抗体を用いて、５ｃｏｔｔ ｅｔ　ａｌ、（）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｚｙ　１４０：８，１９８８）により異種 複合抗体を作製、精製した。 ０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体以下に記載する実験は、 種々のＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞（Ａｍｅｒｔｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ：Ａｃｃｅｓｓ ｉｏｎ　Ｎｏ、ＣＣＬ１１９）に対する２種の異種複合抗体、０ＫＴ３１５９． １及び０ＫＴ３／６Ｃ５の影響を示したものである。 ０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、０ＫＴ３を ＨＩＶ−ＭＮのｇｐ１２０サブユニットのｖ３領域中のエピトープに対する二番 目のモノクローナル抗体、５９．１に共有結合により架橋して作製した。０ＫＴ ３／６Ｃ５異種複合抗体は、０ＫＴ３をＨＩＶ−ＭＮのｇｐ４１サブユニットの 残基５８４〜６１１　（Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３： ２７７．１９８５の番号付けによる）中のエピトープに対するモノクローナル抗 体、６Ｃ５に共有結合により架橋して作製した。ＣＤ３は、抗原に対するＴ細胞 受容体（Ｔ　ＣＲ）と非常に関連性の高い受容体である。ＣＤ３受容体を発現す る細胞毒性１９２８球の存在下で感染細胞を培養した場合、本発明の異種複合抗 体は、ウィルスの逆転写酵素活性により測定される通り、ウィルスの複製を画期 的に減少させる。逆転写酵素活性は、ＨＩＶ活性の感度のよい指標であるため、 これらの結果はウィルスに感染した細胞が急激に減少することを示している。異 種複合抗体が、Ｔリンパ球を感染細胞に作用させることにより感染細胞の死滅を 促進することが、特定の理論に縛られることなく示された。 ＣＴＬの作製 異種複合抗体の活性の試験に使用するＣＴＬ細胞系（ＩＦ８）は、５ｃｏｔｔｅ ｔ　ａｌ、（）、Ｉｍｍｕｎｏｊｏｆｙ　１４０：８，１９８８）の方法を修正 した方法により調製した。簡単に記載すると、大量の供与体ＰＢＬ培養物を同種 異系の、ＥＢＶによりトランスフオームされたリンパ芽球細胞系（ステイミュレ ータ細胞）と共に２０％　ＦＢＳ　（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ ａｎｄ、ＮＹ）　、ＰＨＡに刺激されたＰＢＬ由来の上清及び１００Ｕ／ｍｌの 組み換えインターロイキン２を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地中で７日間イン キュベートした。次いで、Ｕ底トレー中で限定希釈する（１細胞／ウエル）こと により細胞をクローニングした。支持細胞層には放射線照射した自系ＰＢＬとス テイミュレータ細胞を使用した。クローンをＣＴＬ活性（ステイミュレータ細胞 の溶解により評価した）及びＮＫ活性（Ｋ５６２細胞の溶解：ＣＣＬ　２４３゜ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ、ＭＤ）についてスクリーニングした。ＣＴＬ活性を示すがＮＫ活性 ヲ示さないクローン１Ｆ８を選択した。 るウィルス複製の減少か逆転写酵素活性の測定により示された特記しない限り、 ＣＥＭ−ｓｓ細胞（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／ウエル）は、６４ 感染単位（ＩＵ）のＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１Ｂに感染させた。感染の １８時間後、エフェクタ細胞（ＩＦ８細胞、４５，０００／ウエル）を種々の濃 度の０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体または等量の複合していない抗体と共に感 染ＣＥＭ−ｓｓ細胞に添加した。ＣＴＬを１０％　ＦＢＳ（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ ／ＢＲＬ）を含むＲＰＦ、１１　１６４０中で生育させ、新鮮な培地で洗浄した 後、抗体を添加した。７８後無細胞培養上清を回収し、ｗｔｔ＋ｅｙｅｔ　ａｌ 、（）、Ｖｌｒｏ／、６２：１３９，１９８８）の方法により逆転写酵素活性を 測定した。 図１及び図２の通り、０．５日ｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（黒 菱形）は、ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＩＩＩＢのいずれかに感染したＣＥＭ− ｓｓ細胞中の逆転写酵素活性を事実上除去した。０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の 複合していない混合物（白四角）は、２，０００ｎｇ／ｍｌの場合でさえも逆転 写酵素活性に影響を及はさなかった。 図３では、別の実験を行ない、ＣＴＬ細胞細胞性存在下丸）では０ＫＴ３１５９ ．１異種複合抗体は逆転写酵素活性に影響を及ぼさないことを実証した。同様に 、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体非存在下（黒三角）ではＣＴＬはＨＩＶ−１ 目８感染細胞の逆転写酵素活性に事実上影響を及ぼさなかった。ＣＴＬ細胞細胞 性存在下複合していない抗体（白丸）及びＣＴＬのみ（白三角）は感染細胞の逆 転写酵素活性に事実上影響を及はさなかった。非感染細胞（黒四角）の逆転写酵 素活性は検出されなかった。すべての場合、ＣＴＬ及び／または抗体は、感染の １８時間後に添加した。 長時間のウィルス復製及びこれによるウィルスの蔓延が異種複合分子の効力に影 響を及はすかどうかを決定するために、抗体及びＣＴＬの添加に先立つＨｒＶ感 染時間を変化させた。抗体及びＣＴＬを添加する前に、ＣＥＭ−ｓｓ細胞をＨＩ Ｖ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１Ｂ（６４１Ｕ）と共に６．１８．４８または７２ 時間インキュベートした。逆転写酵素活性は、感染の７日後に測定した。０ＫＴ ３１５９．１異種複合抗体及びＣＴＬを添加する前に、６．１８または４８時間 感染させた場合、逆転写酵素活性を完全に除去するには０．５日ｇ／ｍｌの異種 複合抗体で十分であった。同一条件下で、逆転写酵素活性を除去するためには、 ２，０００ｎｇ／ｍ１以上の０ＫＴ３抗体及び５９．１抗体の複合していない混 合物が必要であった。抗体及びＣＴＬを添加する前に、７２時間感染させた場合 、逆転写酵素活性を除去するにはｌｎｇ／ｍｌのＯＫＴ’３１５９．１が必要で あった。この時点では、逆転写酵素活性を除去するためには、２．ＯＯＯｎｇ５ ／ｍ１以上の複合していない抗体か必要であった。 さらに、抗体の濃度を一定にし、ＣＴＬのＣＥＭ−ｓｓ細胞に対する比率を変化 させた実験を行ない、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体のｉｎ　ｖｊｔ’ｒｏに おける効勾を解析した。この実験におい°Ｃは、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗 体の濃度（１Ｕｇ／ｍｌ）　、ＣＥＭ−ｓ　ｓ細胞の数（１５，０００／ウエル ）及びＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１の感染用量（６４，ＩｔＪ）を一定に １２、培長物に添加するＣＴＬの数を変化させた。ＣＴＬ及び／または異種複合 抗体は感染の１８時間後に添加Ｌ、感染７日］」に逆転写酵素活性を測定］７た 。図４にお（翫て、逆転写酵素活性は、ＣＴＬ　：　ＣＥＭ−ｓ　ｓ比が０１１ の場合完全に除去され、ＣＴＬ　：　ＣＥＭ−ｓ　ｓ比か（’１．００６旨のよ うに低い場合でも時部分的に（≧６０９６）除去された。この結果は、ｌ’　Ｉ ）　Ｊ’　／’　Ｖθで見られる条件のように標的細胞（ＣＥＭ−ｓ　ｓ　）の 数がエフ−フタ−細胞の数よりも非常に多（Ｘ場合にも０ＫＴ３１５９．１異種 複合抗体が効果的であることを実証している。 ０ＫＴ３．１５９．１は多くのＨＩＶ株に対して効用的である０ＫＴ３１５９． １異種複合抗体が種々のＨＩ　Ｖ株に対して効果的である力覧否かを試験するた めに、ＣＥＭ−ｓｓ１！１胞（２４ウェルプレート中１５０．０００７７′ウエ ル）ｉ：ｘｏｏ〜１０００　１ＵのＨ［Ｖを感染させた。感染時１こｌよ、３倍 量のＣＴＬ　（４５０，０００／ウエル）及び’］、ｚｚｇ／ｒｎｌの０ＫＴ３ １５９．１異種Ｎ合抗体（またはｌｌＪｇ／ｍｌの単量体抗体）を培養物に添加 ［、た。培養物は、週に−う回分側し、４〜５［１毎に培養上清を回収して逆転 写酵素活性を測定した。抗体は、一度添加した後は追加添加しなかった。このた め、培養物を分割することにより抗体濃度及び標的細胞と１フエクター細胞の絶 対数は減少する。文■照実験Ｊし７て、ウィルスのみと共にＣＥＭ−ｓｓ細胞を 培養【７た。ＨＩ　Ｖ単離物を試験し、それらのＶ３配列を表２に示した。 表２：Ｖ３ループ配列 Ａｌａｂａｍａ　−ＫＳ−−−−−−−−−−Ｈ−−ＲＤｕｋｅ　６５８７−５ 　Ｖ−Ｎ　−−−一−−−−−−−Ｈ−−−３Ｆ２　Ｔ−−３−Ｙ−−−−−− −Ｈ−−ＧＷＭＪ２　Ｉ−Ｒ３ＬＳ−−−−−−ｍ＝−Ｒ，−ＲＥ１１　Ｉ　Ｂ ＫＳ　Ｉ　−ＱＲ−一−−−−−Ｖ−Ｉ　ＧＤＵＫＥ　６５８７−７　Ｔ　−− Ｇ　−−−−−−−−−１−Ａ−ＧＤＵＫＥ７８８７−７ＴＳＲＧ−Ｒ−−−− −−ＩＬＡ−Ｅこの表において、−”はぞの位置のアミノ酸がλ４Ｎと同一・で あることを示している。保存されたＧＰＧＲＡＦモチーフは下線で示している。 図６において、ＨＩＶ単離物がＧＰＧＲＡＦ配列を有する場合はずべて（ＭＮ。 Ａｌａｂａｍａ、、Ｄｕｋｅ　６５８７−５、ＩＮＩＢ、ＳＦ２、ＷＭＪ２．そ れぞれパネルＡＳＢ、、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）　、０ＫＴ３１５９．１　（白四角） は、逆転写酵素活性を抗体またはＣＴＬを添加ｔ、ないＣＥＭＳ８（黒丸）と比 較し２て９５９６以上阻害した。ＧＰＧＲＡＩモチーフを有する２種の単離物、 ＤＵＫＥ　６５８７−７　（パネルＥ）　、ＤＵＫＥ　７Ｂ８７−７　（パネル Ｃ）を試験したところ、１つ（ＤＵＫＥ　６５８７−７）は１１．［ｌ害した。 ０ＫＴ３と５９．１の複合していない混合物（黒三角）は効果を示さなかった。 ０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体は感染細胞中で逆転写酵素活性を阻害する０ＫＴ ３／６Ｃ５異種複合抗体の、ＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞中の逆転写 酵素活性を阻害する能力を試験した。簡単に記載すると、ＣＥＭ−’５ｓ（９６ ウエルプレート中１５，０００細胞／つｘル）を６４　１ＵのＨＩＶ−ＩＩＩＢ に表出した。１８時間後、ＣＴＬ　（４５，０００細胞／ウエル）及び種々の濃 度の０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体を添加した。７日後、上述の通りに逆転写酵 素活性を測定した。 図６において、０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体（白丸）は０．５ｎｇ／ｍｌのよ うな低濃度でも逆転写酵素活性を事実上除去した。これに対して、０ＫＴ３と６ Ｃ５の複合していない混合物は、逆転写酵素活性に対して特に影響を示さながっ た。 ０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５はＣＴＬ存在下で細胞毒性を有する異 種複合抗体の細胞毒性活性を試験するために、まず初めに我々は組み換えワクシ ニアウィルスに感染したＣＶＩ細胞を使用したモデル系中での５Ｉｃｒ放出アツ セイを行なった。ＨＩＶ−ＩＩＩＢ　ｅｎｖ遺伝子（ＶＰＥ１６）または旧Ｖ　 −ＭＮ　（ＶＭＮ）ｅｎｙ遺伝子のいずれかを発現する組み換えワクシニアウィ ルスによりＣＶＩ細胞を感染させた。ＨＩＶ　θｎＶ遺伝子を発現しない組み換 えワクシニアウィルス（ｖ　ｓ　Ｃ８）を負の対照として用いた。細胞培養混合 物は根本的には逆転写酵素アッセイの場合と同様に準備した。エフェクター細胞 としてＩＦ８細胞を使用した。この細胞自体はＣＶ１細胞またはワクシニアウィ ルスに感染したＣＶＩ細胞に対して細胞毒性を示さない。 表３において、１０μｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は５８％のＶ ＰＥ１６感染ＣＶＩ細胞及び６２％のＶＭＮ感染ＣＶＩ細胞を溶解した。非感染 細胞の溶解は非常に少なかった。１１１量体抗体を添加した場合にも細胞溶解は 同じくらい少なかった（データ示さず）。０ＫＴ３１５９．１を使用した場合の 溶解率が１００９６ではなく最大６０％なのは、恐らく、ワクシニアウィルスに よるＣＶＩ細胞への感染が不完全であったためであろう（ＣＶＩ細胞の限定希釈 によるシンシチウム形成アッセイにより、細胞の５０〜６０％がｇｐ１６０を発 現することを示した）。ｇｐ１２０のカルボキシル末端のエピトープを認識し、 ＨＩＶ　ｅｎｖを発現する（ＦＡＣ３により評価）細胞に結合する２種の抗体、 ＩＣ１または７Ｃ６を用いて形成した異種複合抗体は、ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩ Ｖ−ＩＩＩＢ　ｅ／７Ｖ蛋白質のいずれかを発現するワクシニアウィルスに感染 した細胞の溶解には相対的に効果的ではなかった。細胞表面結合は、ある所定の 抗体が細胞毒性異種複合抗体を作製できるかどうか決定するのに必要だが十分な 特性ではないことは明白である。 表３：異種複合抗体による細胞溶解 ０ＫＴ３１５９．１　６　５８　６２ ０ＫＴ３／７Ｃ６９１７Ｎ、Ｄ。 ０ＫＴ３／ＩＣ１１１８Ｎ、Ｄ。 以下に記載するアッセイは、本発明の異種複合抗体の効力を決定するのに使用す るものである。種々のＨＩＶ株を使用することにより、所定の異種複合抗体の反 応性の広さも併せて決定することができる。本発明の異種複合抗体の効力を正確 に決定するためには、慎重に制御された条件下で、ＨＩＶ感染細胞に対する異種 複合抗体の効果を測定することが重要である。好適なアッセイを以下に記載する 。 １００〜１０００感染単位（ＩＵ）の目的Ｈ夏■株によりＣＥＭ−ｓｓ細胞（２ ４ウエルマイクロタイタープレート、ウェル容Ｊｉ２ｍｌ中、１５０，０００細 胞／ウエル）を感染させる。感染の１８時間後、目的の初期濃度を達成するのに 十分な量の異種複合抗体と共に４５０，０００エフエクター細胞を添加する。 樟準的な条件下で細胞を培養し、３日毎に分割する。異種複合抗体は追加添加し ないため、培養物を分割する度に異種複合抗体濃度は半分になる。異種複合抗体 を添加しない以外は全く同一の条件の培養を対照実験とする。感染１０日１に、 Ｗｉｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（）、Ｖｊｒｏ１０！、）’　６２：１３９；１９ ８８）の方法により、両方の培養物の逆転写酵素活性を測定する。ウィルス生産 がピークに達するのに感染後１４０以上要するＨＩＶ株については、逆転写酵素 活性を感染１０日後に測定すべきてはない。代わりに、ウィルス生産が最大に近 い時点で逆転写酵素活性を測定すべきである。 感染単位はＫｉｂｅｒ法により決定する。ウィルスのタイターは保存中に低下す るため、ウィルス保存液のタイターは使用直前に測定することが重要である。 ウィルス保存液は不完全なウィルス粒子を少なくするよう慎重に調製すべきであ る。例えば、調製したウィルス保存液の感染の多重度は０．００１が望ましく、 細胞は対数増殖するような条件で培養すべきであり、また、ウィルスはウィルス 生産が最大の時点（逆転写酵素活性またはｐ２４発現が最大であることで判断す る）で回収すべきである。 組み換え異種複合抗体 モノクローナル抗体は大部分の場合ヒト以外の種の中で生産されるため、ヒトに 対して免疫原性を示すことが多い。ヒトの治療において異種複合抗体を効果的に 使用するために、抗原結合部分（可変領域）はある種に由来し、構造的安定性及 び生物学的機能に関与する部分（一定領域）はヒト抗体に由来するキメラ抗体分 子を作製する必要があるかもしれない。可変領域がある種に由来し一定領域が他 の種に由来するキメラ抗体の作製法は、当業者に熟知されている。例えば、Ｎｅ ｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＣＴ　公開　ＷＯ３６１０１５３３、優先口 １９８４年９月３日；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、ＥＰ公開番号０，１７３ ．４９４、優先臼１９８４年８月２７日参照のこと。その他の方法として、可変 領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみを、望ましい抗原特異性を有するイムノ グロブリン由来のＣＤＲ５と置換する方法がＷｉｎｔｅｒ（ＧＢ公開番号２゜１ ８８．６３８、優先８１９８６年３月２７日）により記載されている。ヒトＦＣ 部分を有する抗体を作製することによりマウスモノクローナルをヒトの治療に適 合するようにすることもできるＣＭｏｒｒｔｓｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９： １２０２．１９８５）。単一ポリペプチド鎖抗体も、組み換え法により従来の抗 体よりも簡便に作製することができる。単一ポリペプチド鎖抗体の作製方法はＬ ａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４．９４６，７７８号）により記載され ており、これらの方法は異種複合抗体の作製に応用することができる。′このよ うなハイブリッドモノクローナル抗体の構築、発現及び精製方法は確立している 。 二重の特異性を有する抗体の作製にクアドローマを使用することができる（Ｒｅ ａｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，４７４．８９３及び４，７１４．６ ８１）。 使用法 本発明の抗体は、静脈注射または筋肉注射のいずれかの経路により非経口的に投 与することができる。典型的な治療法は、約１週間〜約６か月間にわたって効果 的な量の抗体を投与するものである。患者の疾患を制御するために必要な治療回 数は、疾患の重さや進行段階及び患者の特性により各患者ごとに異なる。各治療 に必要な総用量は数回に分けても、−回で投与してもよい。ヒトモノクローナル 抗体は、単独で投与しても、また、患者の疾患を制御するためにＡＺＴのような 他のＨＩＶ治療と連動して投与してもよい。 異種複合抗体の薬理学的混成物は目的の投与モードに従って、リポソーム、溶液 、懸濁剤及び微粒子などの形状に作製する。 ある場合には、異種複合抗体を適切なエフェクター細胞と共に投与することが望 ましい（Ｎｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、１ｈｅ　１ａｎｃｅｔ　３３５：３６８゜ １９９０）。例えば、ＨＩＶ感染の治療が必要な患者（または適合する提供者） から抹消血液リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を回収し、異種複合抗体と共にインキュベ ートしてから細胞を再注入する。ある場合、ＰＢＬは培養物中に広がる（Ｒｏｓ ｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｔｙｃｅ　２３３：１３１８，１９８６ ）ｏＰＢＬはインターロイキン、インターフェロンまたは他のイムノモジュレー タと共にインキュベートしてもよい。さらに、細胞は、エフェクター細胞の細胞 溶解活性を刺激する受容体特異的抗体（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌｌｕ ｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｚｙ　１１４：３７０．１９８８）のような分子と共に インキュベートしてもよい。 請求の範囲： 配列表 （２）配列番号：コ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　６ ＣＢ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：１の配列： Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｐｈａ（２）配列番号：２ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：２の配列： １１＠　Ｘａａ工ｌ＠　（ｉｌｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ａｒｇ（２）配列番号・３ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：３の配列： Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＸＬｍ　Ｌ＠ＬＩ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙ−＾−ｐ　（ｉｎｎ　Ｇｉｎ　Ｌａ■ Ｓ　！Ｏｉｓ Ｌ＊ｕ　Ｇｌｙ　Ｘｌ・τｒｐ　Ｇｌｙ　ＣＹ＠　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｌ ４Ｌｌ工Ｘ＠Ｃｙｓ（２）配列番号：４ （ｉ）配列の特徴。 （Ａ）配列の長さ＝１７ （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （Ｘｌ）配列番号＝４の配列： Ｌｙｅ （２）配列番号：５ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　５ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：５の配列： ＸＬｍ　ＧＬＹ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ（２）配列番号＝６ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２４ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号二６の配列： Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　入ｒｇ　Ｘｉ・　１１１ｇ　ＸＬｍ 　Ｇｌｙ　１ｌｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒ９　ＡＬａ　Ｐｈ・　’pｒ Ｓ　１０　ｉｓ τｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙ＠　Ａｓｎ　！ｌｅ　！ｌｅ　ＧＬｙ　Ｃ１ｍ２゜ （２）配列番号ニア （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１１ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号ニアの配列： Ｘｉｓ　１１Ｌｍ　ＸＬｍ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈａ 　Ｔｙｒτ■（２）配列番号：８ （ｉ）配列の特？ｊｉ： （Ａ）配列の長さ＝４０ （ｘｉ）配列番号：８の配列： ！ｉ＠Ａｓｎ　ＣＹ＃　Ｔｈｘ　ｋｇ　Ｐｅａ＾−ｎ？ｙｒ＾−ｎ　ＬＦ　ＪＬ ｒｇ　ＬＦ　ｈｘｑ　ＸＬｍ　ＢＬｍ　！ｌｅＳ　１０　１ｓ ＧＩＹ　Ｐｒｏ　ａｌｙ　Ａｒ９　ＡＬａ　Ｐｈ＠Ｔｙｔ　Ｔｈｒ　テｈｒ　Ｌ ｙ−Ａｓｎ　ＸＬｍ　！ｌｅ　３１ｙ　Ｔｈｒ　Ｘｌ・＾ｒｑ　Ｇｉｎ　Ａｌａ 　ＸＬｍ　Ｃｙ−＾ｍＩ′１　工１ｍ　Ｂ＠ｒ３％　４０ （２）配列番号；９ （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：９の配列： Ｓ＠３？　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌ）ｎ　Ｏｌｙ　Ｈ＠Ｍｉ・Ｘｉ ｓ　ｃｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ＾ｌａ　！ｌ＠Ｓ　１０　１５ ？ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｏｌｙ　ＳＱＬ　ｃｙｓ（２）配列番号＝ｌＯ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２０ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号＝１０の配列： ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　ｃｘｙ　Ｔｈｒ　Ａｒ９　ＬＹ＠　ＳＱＬ”　ＸＬ拳Ｓ社ＸＬ ＠　Ｏｌｙ　ｐｒｏ　０１７　社ｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ５　１０　１ｓ Ｇｌｙ　Ｏｌｙ　ａ＠ｒ　Ｃｙｓ （２）配列番号：１１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１９ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列番号＝１１の配列： ＳＱＬ　Ｃ：Ｌｙ　Ｏｌｙ　Ｈ１ｓエエ＠　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ａｒｇ＾ Ｌａ　Ｐｈ＠Ｔｙｔ＾ｌａ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ（２）配列番号：１２ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０ ＣＢ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：１２の配列： Ｃｙｓ　１ｌｌｓ　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　！’ｒｏＧｌｙ　ｋｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ　Ｃ ｙｓＳ　ユ０ （２）配列番号；１３ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２５ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号＝１３の配列： ＾−ｎ　＾−ｎ　ｒｈｒ　＾ｘｑ　Ｌｙｓ　ｌｉ＠ｒ　Ｘｉｓ　Ａｒｇ　工１＠ 　ｃｔｎ　Ａ１９　ｓｔｙ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　＾ｘｑ　Ａ１■ ５　１０　１ｓ Ｐｈ＠　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｘｉｓ　ＧＡＹ　ＬＹ＠　ＸＩＪ　ｃｌｙ　ＣＹ＠（ ２）配列番号＝１４ （１）配列の特＠： （Ａ）配列の長さ：２６ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：１４の配列： ｑ−＾ａｎ　Ａ釦ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙ＃　１！＋＠ｒ　Ｘ１ｍ　社ｇ　１１ｍ 　Ｇｉｎ　社ｇ　Ｏｌｙ　ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ａｒ９５　工Ｏ工５ ＾１ｍ　１１）１＠　ＶＪＬＩＴｈｒ　Ｚ工＠　Ｏｌｙ　Ｌｙｓ工ｌ＊　（ｉｌ ｙ　ｃｙｍ（２）配列番号＝１５ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１１ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列番号＝１５の配列： Ｘｉｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＪＬｒｇ　ＶＪＬＬ　Ｉｌ ＠？ｙｒ　Ｃ’ｙｓ（２）配列番号：１６ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号＝１６の配列： Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　１１ｍ　ＲＬ＠　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ＾１ｍ　Ｐｈ・Ｔ７ｒ　Ｔｈｒτｈｒ　ＣＹ＠５　１０　ｉｓ （２）配列番号＝１７ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （Ｘｌ）配列番号＝１７の配列： （２）配列番号＝１８ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１７ （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号＝１８の配列： Ｌｙ＠Ｌｙ＠ｇｓｒ　Ｍｇ　工ｌ＠Ｉｕｓ　Ｘｉｓ　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 ｋｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ　ＨＬｍ丁ｈｒτｈｒ（２）配列番号２１９ （ｉ）配列の特徴工 （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号＝１９の配列： （２）配列番号＝２０ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号；２ｏの配列： （２）配列番号：２１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型ニ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （ｘｌ）配列番号＝２１の配列： ＶａＬ　＾ｒ９　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｅ　Ｓａｔ　Ｘｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 （Ａｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ｔｈｅ　入ｒ９　丁ｈｒ　＾ｘ９（２）配列番号：２ ２ （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ−１７ （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号−２２の配列： ＬＹＩＩ　ｓ＠ｒ　Ｘｌｅ　λｒ９　工１１１　ｃａｎ　ｍｇ　ＧＬｙ　Ｉ’ｒ ｏ　ＧＬｙ　入ｒｇ　入Ｌａ　ｔｈｅ　ＶｓｉＬ　Ｔｈｅ　氏B Ｓ　１０　ｉｓ ＩＹ （２）配列番号：２３ （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：２３の配列： Ｔｈｅ　入ｒｇ　ＬＹ＃　Ｇｌｙ　Ｘｌｅ　１ｌｉｓ　Ｘ１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　工↓ｓ　Ｔｙｒ　入Ｌａ　Ｔｈ■ （２）配列番号：２４ （ｉ）配列の特ｉｊｉ： （Ａ）配列の長さ＝１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号：２４の配列・ 丁ｈｒ　ｓ＠ｒ　＾ｔｑ　Ｏｌｙ　Ｘｌｅ　＾ｒ９　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｌ：ｏ 　ＯＬｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｘｌｅ　Ｉａ＠ｕ　入１ａ　Ｔ■■ Ｓ　１０　ｘｓ Ｇ↓υ （ｌｎ　Ｑｌ／ＬＬｌｄ：）） 峯穀危ＹＩ班 （Ｉｎ　０＋／ＬＬＩ（１：’） 峯ａ九）班 （ＬＬＩｄり）　峯！Ｉ危）研 感染後の日数 一◆−十対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）−→−ＣＴＬ十単量体 感染後の口数 ＋　ＣＴ　Ｌ＋異種複合体　図５（１）感染後の日数 一心−ＣＴＬ十異［複合体 図５（Ｃ） ０　２　４　６　８　ｔｏ　１２ 感染後の日数 図５（Ｄ） 感染後の１１数 −４−４一対照（ＣＴ　Ｌ、または抗体非仔在「）−１−ＣＴ　Ｌ　＋　ｆｉｔ 二体 −Ｏ−ＣＴ　ｉ、十異種複合体 図５（Ｅ） 感染後の日数 一◆−十対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）感染ｉその日数 ｍ＝１−　十対照（ＣＴ　Ｌまたは抗、体非存在下）感染後の日数 一→−（一対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）−一〇−−ＭＯＮ　０ＫＴ３＋６ Ｃ −一◆−−ＨＣ０ＫＴ３／６Ｇ５ 図６ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９２１０３６１６ ２、発明の名称 ＨＩＶ感染治療のための異種複合抗体 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ州　ケンブリッジビルディング　７ ００　ワン　ケンダル　スフウェア名　称　リブリジェン　コーポレーション国 　籍　アメリカ合衆国 ５、補正書の提出年月日 １９９３年　７月１４日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 く原文第１３頁の翻訳文〉 １Ｈｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体存在下での、逆転写酵素活性に 対する細胞毒性１９２８球とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の比率の効果を 示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、ＣＥＭ−ｓｓ細 胞に対する細胞毒性リンパ球の関数で示している（１Ｇｇｌｏスケール）。 図５　（Ａ）　〜５　（Ｈ）は、ＨＩＶ−ＭＮ　（５Ａ）　、ＨＩＶ−Ａｌ　ａ ｂａｍａ（５Ｂ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ７８８７−７　（５Ｃ）　、ＨＩＶ−Ｄ ｕｋｅ６５８７５　（５Ｄ）　、ＨＩ　Ｖ　Ｄｕｋ　ｅ６５８７　７　（５Ｅ） 　、ＨＩＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｓ　（５Ｆ）　、ＨＩＶ−３Ｆ２　（５Ｇ）　、及び ＨＩＶ−ＷＭＪ２　（５Ｈ）に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対 する、細胞毒性１９２８球と０ＫＴ３１５９゜１異種複合抗体（白四角）及び０ ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒二角）の効果を示したグ ラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ）は、感染後の日数の関数で示 している。 図６は、ＨＩＶ−Ｉ１１８感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、複 合０ＫＴ３抗体と６Ｇ５抗体の混合物（白丸）及び０ＫＴ３／６Ｇ５異種複合抗 体（黒丸）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ） は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎ　ｇ／ｍ　１　）の関数で示している。 ＡＩＤＳ治療に対する異種複合抗体 本発明の分子は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェ クター細胞表面に存在する抗原に対する第一の抗体を、ＨＩＶ感染細胞の表面に 存在するＨＩＶ抗原に対する第二の抗体に結合することにより作製した異種複合 抗体である。 く原文第３２頁の翻訳文〉 表２：ｖ３ループ配列 Ａ　ｌ　ａ　ｂ　ａｍａ　−ＫＳ　−−−−−−−−−−Ｈ−−ＲＤｕｋｅ　６ ５８７−５　Ｖ−Ｎ　−−−−−−−−−−Ｈ−−−８Ｆ２　”ｒ−−ｓ−ｙ− −−−−一−１（−−ｃＷＭＪ２　Ｖ−Ｒ８ＬＳ−−−−−−−Ｒ−ＲＥｌ　１ １　ＢＫＳ　ｌ　−−ＱＲ−−−−−−Ｖ−Ｉ　ＧＤＵＫＥ　６５８７−７　Ｔ −−Ｇ−−−−−−−−１−Ａ−ＧＤＵＫＥ　７８８７−７　ＴＳＲＧ−Ｒ−− −−−−ＩＬＡ−Ｅこの表において、°−１はその位置のアミノ酸がＭＮと同一 であることを示している。保存されたＧＰＧＲＡＦモチーフは下線で示している 。 図５（Ａ）〜５（Ｈ）において、ＨＩＶ単離物がＧＰＧＲＡＦ配列を有する場合 はすべて（ＭＮ、Ａ１ａｔ＋ａｍａ、Ｄｕｋｅ　６５８７−５、ＩＩＩＢ、ＳＦ ２、ＷＭＪ２　；＋ｔ’Ｌｆｔ’Ｌ図５Ａ、ＢＳＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）　、０ＫＴ３ １５９．１（白四角）は、逆転写酵素活性を抗体またはＣＴＬを添加しないＣＥ Ｍ−ｓｓ（黒丸）と比較して９５９６以上阻害した。ＧＰＧＲＡＩモチーフを有 する２Ｎの単離物、ＤＵＫＥ　６５８７−７　（図５Ｅ）　、ＤＵＫＥ　７８８ ７−７　（図５Ｃ）を試験しタトコロ、１つ（ＤＵＫＥ　６５８７−７）　は１ ｌＪ１害した。０ＫＴ３と５９．１の複合していない混合物（黒三角）は効果を 示さなかった。 ０ＫＴ３／６Ｇ５異種複合抗体は感染細胞中で逆転写酵素活性を阻害するＯＫＴ 　３／６　Ｃ５，ｆｌＦ！複合抗体の、ＨＩＶ−１１１感染ＣＥＦｖ１−ｓｓ細 胞中の逆転写酵素活性を阻害する能力を試験した。簡単に記載すると、ＣＥＭ− ｓｓ（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／ウエル）を６４　１ＵのＨＩ　 Ｖ−１目、に表出１〜た。１８時間後、ＣＴＬ　（４５，０００細胞／ウエル） 及び種々の濃度の０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体を添加した。７日後、上述の通 りに逆転写酵素活性を測定した。 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ １５／１３　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＩ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は 、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩ ＶｒＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少 なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二 混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素 活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細 胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細 胞培養は１００−１０００単位のＨｌＶ−ＭＮで感染される。
2. ２．前記第一細胞培養の前記逆転写酵素活性を、前記第二の細胞培養と比較して ９０％以上低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体。
3. ３．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度１０ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は 、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩ Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少 なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二 混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剩にあり、前記逆転写酵素 活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細 胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細 胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
4. ４．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度５ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、 前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少な くとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混 合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活 性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞 は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞 培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
5. ５．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度１ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、 前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少な くとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混 合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活 性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞 は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞 培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。
6. ６．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はアミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦに対する抗体を含んでいる。
7. ７．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はアミノ酸配列ＩＸＩＧＰＧＲに対する抗体を含んでいる、ここ で、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。
8. ８．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混 合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混合 培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染Ｃ ＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％ 低下させることを特徴とする請求項６または７に記載の異種複合抗体、ここで、 前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓ ｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、 前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後 １８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩ Ｖ−ＭＮで感染される。
9. ９．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＩＩＩＢ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第 一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一 混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＩＩＩ Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくと も８０％低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体、ここで、 前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓ ｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、 前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後 １８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩ Ｖ−ＩＩＩＢで感染される。
10. １０．前記エフェクター細胞と、Ａｌａｂａｍａ，Ｄｕｋｅ６５８７−５、Ｄｕ ｋｅ６５８７−７，Ｄｕｋｅ７８８７−７，ＳＦ２，ＷＭＪ２，及びＩＩＩＢか らなるＨＩＶ株の一つに感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む３種またはそれ以上の 混合培養細胞において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記エフェクター細 胞及び同じ前記ＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の混合細胞 培養の逆転写酸素活性に比べて少くとも８０％低下させることを特徴とする請求 項１に記載の異種複合抗体、ここで、前記第一、第二混合細胞培養において前記 エフェクター細胞は前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活 性は感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は 前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養 は１００−１０００単位の前記ＨＩＶ株で感染される。
11. １１．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋 白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前 記第二の抗体部分はアミノ酸配列ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＣＳＧＫＬＩＣに対する抗体を含んでいる。
12. １２．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一 混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混 合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染 ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０ ％低下させることを特徴とする請求項１１に記載の異種複合抗体、ここで、前記 エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細 胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活性は、感染後１０日目に測定され、前記 異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８ 時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。
13. １３．前記エフェクター細胞が細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、単球／マクロファ ージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択されることを特徴とする 請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体。
14. １４．前記エフェクター細胞表面に存在する抗原がＣＤ３であることを特徴とす る請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体。
15. １５．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株感染ＣＥＭ−ｓｓ 細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２００ｎｇ／ｍｌの異種複合抗 体が、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記 ＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細 胞培養と比較して少なくとも５０％低下させることを特徴とする請求項６または ７に記載の累積複合抗体、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混 合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活 性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞 は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞 培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株で感染される。
16. １６．異種複合抗体がＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株のＶ３ループに結合すること を特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体。
17. １７．薬理学的に効果的な量の請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体 を含む薬理学的に許容できる混成物。
18. １８．（ａ）細胞表面抗原を発現するエフェクター細胞と、（ｂ）請求項１また は請求項１１に記載の異種複合抗体と、を含むＨＩＶを標的とするエフェクター 細胞。