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Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Peptide, welche zur Verwendung bei der Impfung gegen AIDS geeignet
sind.
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Das menschliche Immunschwächevirus
(HIV) ist für
die Erkrankung verantwortlich, welche als erworbenes Immunschwächesyndrom
(AIDS) bekannt geworden ist. Obwohl erstmals 1981 erkannt, ist noch
kein Heilverfahren für
diese unvermeidlich tödliche
Krankheit gefunden worden. HIV wird über eine Vielzahl von Wegen
verbreitet, wie durch sexuellen Kontakt, infiziertes Blut oder infizierte
Blutprodukte und perinatal. Wegen der Komplexität einer HIV-Infektion und der
geringen Zahl von wirksamen Therapien wird die Ausrottung von AIDS
höchstwahrscheinlich
durch die Verhinderung neuer Infektionen als durch die Heilung der
bereits infizierten Personen erfolgen. Zu diesem Zweck sind große Anstrengungen
unternommen worden, um Verfahren zum Nachweis und zur Verhinderung
einer Infektion zu entwickeln. Diagnostische Verfahren sind entwickelt worden,
um Personen, Blut und andere biologische Produkte zu identifizieren,
welche infiziert sind.
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Wie die meisten Viren ruft das HIV
häufig
die Produktion von neutralisierenden Antikörpern hervor. Im Gegensatz
zu vielen anderen Viren und anderen infektiösen Agenzien, bei denen eine
Infektion eine schutzgewährende
Immunität
zur Folge hat, sind HIV-spezifische Antikörper jedoch nicht in der Lage,
den Verlauf der Erkrankung aufzuhalten. Daher könnte sich im Fall von HIV ein
Impfstoff, der die Immunität
einer natürlichen Infektion
hervorruft, als unwirksam erweisen. Tatsächlich scheinen Impfstoffe,
die aus dem HIV-Protein
gp160 hergestellt wurden, eine geringe Immunität gegen eine HIV-Infektion
bereitzustellen, obwohl sie neutralisierende Antikörper induzieren.
Das Mißlingen
des Versuchs, einen wirksamen anti-HIV-Impfstoff herzustellen, hat zu
der Vorhersage geführt,
daß ein
wirksamer Impfstoff nicht bis Ende der 1990er Jahre verfügbar sein
wird.
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Das HIV-Genom ist hinreichend charakterisiert
worden. Dessen etwa 10 kb codieren Sequenzen, die regulatorische
Segmente für
die HIV-Replikation als auch die gag-, pol- und env-Gene, die Kernproteine, die reverse
Transkriptase-Protease-Endonuclease und die internen bzw. externen
Hüllglycoproteine
codieren.
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Das HIV-env-Gen codiert das intrazelluläre Glycoprotein
gp160, das normalerweise durch proteolytische Spaltung prozessiert
wird, um gp120, das externe virale Glycoprotein, und gp41, das virale
Transmembranglycoprotein, zu bilden. Das gp120 bleibt mit den HIV-Virionen auf Grund
nichtkovalenter Wechselwirkungen mit gp41 assoziiert. Diese nicht-kovalenten Wechselwirkungen
sind schwach, folglich wird der größte Teil des gp120 aus den
Zellen und Virionen in löslicher
Form freigesetzt.
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Frühere Studien haben gezeigt,
daß die
Proteine, welche durch die gag- und insbesondere die env-Regionen
des HIV-1-Genoms codiert werden, immunogen sind, da Antikörper gegen
die Produkte der gag- und env-Gene in den Seren von HIV-infizierten,
AIDS- und ARC ("AIDS Related Condition")-Patienten nachgewiesen
wurden.
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Es ist bereits gezeigt worden, daß einige
Antikörper,
die aus Seren von AIDS- und ARC-Patienten sowie symptomlosen Individuen
erhalten wurden, die mit dem Virus infiziert sind, für gp120
und gp160 spezifisch sind. Vereinzelt sind diese Antikörper neutralisierend.
Die Hüllglycoproteine
stellen das HIV-1-Antigen dar, das am beständigsten durch Antikörper in
AIDS- und ARC-Patientenseren erkannt wird. Allan et al., "Major Glycoprotein
Antigens that Induce Antibodies in AIDS Patients are Encoded by
HTLV-III", Science
228 (1985), 1091–1094;
und Barin et al., "Virus
Envelope Protein of HTLV-III Represents Major Target Antigen for
Antibodies in AIDS Patients",
Science 228 (1985), 1094–1096.
Außerdem
erkennen Antikörper
in Patientenseren auch Epitope der Viruskernproteine, die durch
das gag-Gen codiert werden.
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Immunologisch wichtige HIV-1-Antigene
zur Verwendung bei der Diagnose und als potentielle Impfstoffzusammensetzungen
sind durch Clonierung von Teilen des HIV-1-Genoms in verschiedene Expressionssysteme
wie Bakterien, Hefe oder Vaccinia hergestellt worden. Cabradilla
et al., "Serodiagnosis
of Antibodies to the Human AIDS Retrovirus With a Bacterially Synthesized
env Polypeptide",
Biotechnology 4 (1986), 128–133;
und Chang et al., "Detection
of Antibodies to Human T-Cell Lymphotropic Virus-III (HTLV-III)
With an Immunoassay Employing a Recombinant Escherichia coli – Derived
Viral Antigenic Peptide",
Biotechnology 3 (1985), 905–909.
Durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellte HIV-1-Antigene müssen jedoch
noch gründlich
gereinigt werden, um schädigende
Nebenwirkungen bei der Impfung und falsch positive Reaktionen in
ELISA-Tests infolge einer Antikörperreaktivität gegen
Antigene des Expressionssystems, welche die HIV-1-Antigenzubereitung verunreinigen
können,
zu vermeiden. Auch kann eine Denaturierung von HIV-1-Antigenen während der
Reinigung wichtige Antigenaktivitäten aufheben. Die Präparation
von Proteinen aus intakten Viren kann auch eine Verunreinigung durch
das intakte Virus zur Folge haben.
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Mehrere Veröffentlichungen haben Daten
vorgestellt, welche die immunologische Reaktivität ausgewählter synthetischer Peptide
zeigen, welche den antigenen Proteinen von HIV-1 entsprechen. In
einer Studie wurde ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-Ile-Glu-Glu-Gly-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Gly-Cys
synthetisiert, das den Aminosäureresten
735–752
von HIV-1 entspricht. Kennedy et al., "Antiserum to a Synthetic Peptide Recognizes
the HTLV-III Envelope Glycoprotein", Science 231 (1986), 1556–1559. Dieses
aus einem Teil von gp41 abgeleitete Peptid wurde verwendet, um Kaninchen
bei dem Versuch zu immunisieren, eine neutralisierende Antikörperantwort
gegen HIV-1 zu induzieren. Ferner waren mehrere Seren von AIDS-Patienten,
die bekanntermaßen
anti-gp41-Antikörper
enthielten, mit diesem Peptid schwach reaktiv; auf diese Weise wurde
gezeigt, daß dieses
Peptid mindestens ein Epitop enthält, das in einem gewissen Umfang
durch Antikörper
gegen das native gp160/gp41 erkannt wird. Jedoch ist für dieses
Peptid nicht gezeigt worden, daß es
neutralisierende Antikörper
in von Kaninchen verschiedenen Säugern
induziert, noch ist es zur Verwendung als menschlicher Impfstoff
vorgeschlagen worden.
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In WO 92/05800 sind Peptide, welche
Epitopen des HIV-1-gp120-Proteins mit den Aminosäurekoordinaten 151–176, 192–218 und
205–230
entsprechen, zur Verwendung bei der Impfung und Induktion neutralisierender
Antikörper
gegen HIV beschrieben. Weitere Peptide, welche Regionen des HIV-Proteins
gp120 entsprechen, zur Verwendung bei der Induktion einer T-Zell-Aktivierung
gegen HIV-1 sind in WO 92/21377 beschrieben. Synthetische Peptide
mit Sequenzen, abgeleitet aus diesem HIV-1-gp120-Protein, welche
die Produktion neutralisierender Antikörper in unter dem Menschen
stehenden Primaten induzieren können,
sind beschrieben worden bei Vahlne et al., "Immunizations of Monkeys With Synthetic
Peptides Disclose Conserved Areas on gp120 of Human Immunodeficiency
Virus Type 1 Associated With Cross-Neutralizing Antibodies and T-Cell
Recognition", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10744–10748 (1981).
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In antigenen Proteinen von HIV-1
gibt es antigene Epitope, die durch Antikörper, cytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen
und auch bei der Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizität (ADCC)
erkannt werden. Traditionell werden neutralisierende Antikörper als
wesentlich bei der Verhinderung einer Virusinfektion angesehen.
Ein neutralisierender Anti körper
bindet an ein infektiöses
Viruspartikel, und bei diesem Prozeß wird die Infektiosität des Viruspartikels
aufgehoben.
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Zelluläre Mechanismen zur Eliminierung
virusinfizierter Zellen schließen
cytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen und ADCC ein. Die an der Neutralisierung
und an den verschiedenen zellulären
Immunmechanismen beteiligten Epitope müssen nicht notwendigerweise
die gleichen sein.
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Es ist bereits festgestellt worden,
daß die
ADCC ein immunologischer Abwehrmechanismus ist, der bei Virusinfektionen
wirksam ist. Bei dieser Reaktion binden antigenspezifische Antikörper an
Oberflächenstrukturen
auf der Zielzelle und induzieren auf diese Weise deren Abtötung, welche
durch Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC)-uneingeschränkte
CD16+-Effektorzellen, die den Fc-Rezeptor tragen, vermittelt wird. Eine
HIV-spezifische
Cytotoxizität
im peripheren Blut der meisten seropositiven Individuen wird auch
durch MHC-uneingeschränkte
ADCC-Effektorzellen vermittelt, die mit env-spezifischen IgG-Antikörpern bewaffnet sind.
Tyler et al., J. Immunol. 142 (1989), 1177; Tanneau et al., J. Infect.
Dis. 162 (1990), 837; Riviere et al., J. Virol. 63 (1989), 2270.
Eine HIV-spezifische ADCC-Aktivität ist in der Mehrzahl von Seren
aus HIV-1-infizierten Individuen nachgewiesen worden. Ljunggren
et al., J. Immunol. 139 (1987), 2263; Lyerly et al., AIDS Res. Hum.
Retroviruses 3 (1987), 409. Es ist sowohl eine Typ- als auch eine
Stamm-spezifische ADCC beobachtet worden, und die Antikörper in
einigen Seren vermittelten eine ADCC gegen alle Stämme, während andere
Seren überhaupt
keine ADCC-Aktivität
zeigten. Ljunggren et al., 63 (1989), 3376. Bei einer pädiatrischen HIV-1-Infektion
korreliert das Vorhandensein von ADCC-vermittelnden Antikörpern signifikant
mit einem besseren klinischen Stadium. Ljunggren et al., 161 (1990),
198. Die ADCC-Reaktion tritt früh
nach einer HIV-Infektion auf, und eine weitreichende ADCC-Reaktion
gegen HIV-1HTLVIIB-infizierte Zielzellen
tritt zwischen 2 und 12 Monaten nach einer Serokonversion auf.
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Aktivierte Zellen, die HIV-Antigene
auf ihrer Oberfläche
exprimieren, sind mögliche
Ziele einer ADCC. Für
HIV-infizierte, autologe CD4+-T-Zell-Blasten ist vor kurzem gezeigt
worden, daß sie
als Zielzellen für
eine Lyse durch ADCC dienen. Tanneau et al., J. Infect. Dis. 162
(1990), 837. Die Hüllglykoproteine
von HIV sind in einer Reihe von Studien als Ziel-Epitope vorgeschlagen
worden. Evans et al., AIDS 3 (1989), 273, verwendeten affinitätsgereinigtes
menschliches Ig oder polyclonale Kaninchenseren gegen env-Proteine von HIV-1 und
wiesen Antikörper
nach, die eine ADCC gegen gp120 und gp41 vermittelten. Koup et al.,
J. Virol. 63 (1989), 584, haben Vacciniavirus-Vektoren verwendet, die
Hüllglycoproteine
(gp160, gp120 und gp41) oder gag-Proteine (p55, p40, p24 und p17)
in lymphoblastoiden Zelllinien exprimieren. Es wurde festgestellt,
daß nur
der Hüllglycoprotein-Komplex gp 120/gp41
das Zielantigen für
eine HIV-spezifische ADCC ist, was auch in einer anderen Studie
unter Verwendung eines ähnlichen
Systems bestätigt
wurde. Tanneau et al., J. Infect. Dis. 162 (1990), 837.
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In einer Reihe von Studien sind auch
stärker
abgegrenzte Regionen nachgewiesen worden. Ein muriner monoclonaler
Antikörper,
der gegen die V3-Region von gp120 gerichtet ist (As, 309–318), vermittelte
sowohl eine Neutralisierung, Titer 1: 500, als auch eine ADCC, Titer
1: 800, gegen HTLVIIIB. Broliden et al., J. Virol. 64 (1990), 936.
Auch ein chimärer
Maus-Mensch-Antikörper,
der gegen die V3-Region gerichtet ist (As, 308–322), induzierte eine ADCC
sowie eine Neutralisierung und Fusionsinhibierung. Liou et al.,
J. Immunol. 143 (1989), 3967. Lyerly et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses
3 (1987), 409, haben ein ADCC-Epitop
im C-terminalen Teil von gp120 lokalisiert (As, 467–511).
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Eine Zusammenfassung bekannter Epitope
aus HIV-1 und -2 sowie SIV für
Antikörper,
ADCC, cytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen ist angegeben bei
Nixon et al., "Cellular
and Humoral Antigenic Epitopes in HIV and SIV", Immunology 76 (1992), 515– 534.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
werden neue Peptide offenbart und beschrieben, die Epitopen des HIV-1-gp120-Proteins
entsprechen. Jedes Peptid umfaßt
eine epitopische Aminosäuresequenz
aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein,
wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und
wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz
einen spezifischen Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert
von größer als
0,5 bei einer Verdünnung
von größer als
1 : 30 haben.
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In einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung besitzt jedes Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen aus SEQ ID Nr.: 41 besteht.
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In Übereinstimmung mit einem anderen
erfindungsgemäßen Gesichtspunkt
werden die neuen Peptide zur Formulierung einer Impfstoffzusammensetzung
verwendet. Die Impfstoffzusammensetzung umfaßt eine epitopische Aminosäuresequenz
aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein,
wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und
wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz
einen spezifischen Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert
von größer als
0,5 bei einer Verdünnung
von größer als
1 : 30 haben, in einer wirksamen Menge, um eine Immunantwort in
einem Säuger
zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
die Impfstoffzusammensetzung ferner ein Adjuvans wie komplettes
Freundsches Adjuvans, inkomplettes Freundsches Adjuvans, Muramyldipeptid,
Levamisol, Isoprinosin oder Tuftsin.
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In Übereinstimmung mit einem weiteren
erfindungsgemäßen Gesichtspunkt
werden mindestens zwei Peptide in der Impfstoffzusammensetzung verwendet,
wobei jedes Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz aus dem menschlichen
Immunschwächevirus-gp120-Protein umfaßt, wobei
das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.:
6, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID Nr.: 12, SEQ ID Nr.: 14, SEQ
ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 36 oder
SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte Antiseren
gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörperabhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert
von größer als
0,5 bei einer Verdünnung
von größer als
1 : 30 haben. Die Peptide liegen in einer wirksamen Menge vor, um
eine Immunantwort in einem Säuger
zu induzieren und sind mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
kombiniert.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
diese Impfstoffzusammensetzung ferner ein Adjuvans wie komplettes
Freundsches Adjuvans, inkomplettes Freundsches Adjuvans, Muramyldipeptid,
Levamisol, Isoprinosin oder Tuftsin.
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Die vorliegende Erfindung ist nützlich,
um ein Verfahren zum Schutz eines Säugers vor einer Infektion mit
dem menschlichen Immunschwächevirus
durchzuführen,
welches die Verabreichung einer der hierin beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen
an den Säuger
umfaßt.
Die Verabreichung kann durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane
oder intraperitoneale Injektion erfolgen.
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Die vorliegende Erfindung ist auch
nützlich,
um ein Verfahren zur Induktion neutralisierender anti-HIV-Antikörper in
einem Säuger
durchzuführen,
umfassend den Schritt des Verabreichens einer wirksamen, Antikörper induzierenden
Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine epitopische Aminosäuresequenz aus
dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein,
wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und
wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz
einen spezifischen Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert
von größer als
0,5 bei einer Verdünnung
von größer als
1 : 30 haben, in einer wirksamen Menge, um eine Immunantwort in
einem Säuger
zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
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In einer anderen Ausführungsform
der Erfindung umfaßt
die Impfstoffzusammensetzung mindestens zwei Peptide, wobei jedes
Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz
aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein
umfaßt,
wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 5, SEQ
ID Nr.: 6, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID Nr.: 12, SEQ ID
Nr.: 14, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID
Nr.: 36 oder SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte
Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörper abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert
von größer als 0,5
bei einer Verdünnung
von größer als
1 : 30 haben. Die Peptide liegen in einer wirksamen Menge vor, um eine
Immunantwort in einem Säuger
zu induzieren, und sind mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger kombiniert.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
Peptide bereit, für
die gezeigt worden ist, daß sie
die Produktion von HIV-neutralisierenden Antikörpern durch Primaten induzieren.
Die Peptide entsprechen Regionen des gp120-Proteins mit Koordinaten,
wie durch Kennedy et al. definiert. Die erfindungsgemäßen Peptide
werden als gp120-12 (Aminosäurekoordinaten
159– 183),
gp120-15 (Aminosäurekoordinaten
200–225),
gp120-16 (Aminosäurekoordinaten
213– 237)
und gp120-19 (Aminosäurekoordinaten
255–276)
bezeichnet. Obwohl das Peptid gp120-19 einem Peptid ähnlich ist, das beschrieben
worden ist (Ho et al., Science 239 (1988), 1021– 1023), ist nun gezeigt worden,
daß gp120-19
neutralisierende Antikörper
in Primaten induziert. Die erfindungsgemäßen Peptide können als
Immunogene in Impfstoffzusammensetzungen und zur Induktion der Produktion von
polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern verwendet werden; besonders
wichtig sind HIV neutralisierende Antikörper.
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Proteine enthalten eine Reihe von
antigenen Determinanten oder Epitopen, welche die Regionen der Proteine
sind, die die Erkennungs- und Bindungsstellen für spezifische Antikörper umfassen.
Im allgemeinen enthalten Proteine zwischen 5 bis 10 Epitope, wobei
jedes davon eine Sequenz von 6 bis 8 Aminosäuren enthält. Epitope können entweder
zusammenhängend
sein, wobei die 6 bis 8 Aminosäuren
in einer linearen Abfolge vorliegen, oder unzusammenhängend, wobei
die das Epitop bildenden Aminosäuren
durch die dreidimensionale Faltung des Proteins zusammengebracht
werden. Selbst wenn ein Epitop nur aus relativ wenigen Aminosäuren besteht,
kann dessen Reaktivität
mit einem Antikörper
durch die Aminosäuren
in dem Protein beeinflußt
werden, welche das Epitop umgeben.
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Studien mit dem Ziel, antigene Stellen
oder Epitope von Proteinen zu kartieren, sind durch die Verwendung
von synthetischen Peptiden, welche verschiedenen Regionen der Proteine
von Interesse entsprechen, unterstützt worden. Lerner et al.,
in The Biology of Immunological Disease: A Hospital Practice Book
(Dixon und Fisher, Hrsg.), S. 331–338 (1983); und Lerner, Adv.
Immunol. 36 (1984), 1. Zusätzlich
zu ihrer Nützlichkeit in
Epitop-Katierungsstudien
sind synthetische Peptide als Impfstoffe und diagnostische Reagenzien
geeignet, falls sie wichtige antigene Determinanten eines Proteins
umfassen. Van Regenmortel, Ann. Inst. Pasteur/Virol. 137E (1986),
497–528;
und Van Regenmortel, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, Buroden und Van Knippenburg, Hrsg., Bd. 19, Synthetic Peptides
as Antigens, Elsevier ISBN 0-444-80974-0 (1988).
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Synthetische Peptide weisen im Hinblick
auf eine spezifische Antikörperproduktion
und Reaktivität mehrere
Vorteile auf. Die genaue Sequenz des synthetisierten Peptids kann
aus der Aminosäuresequenz
des Proteins, wie durch Aminosäuresequenzierung
des Proteins bestimmt, oder aus der vorhergesagten Aminosäuresequenz,
bestimmt anhand der das Protein codierenden DNA-Sequenz, ausgewählt sein.
Die Verwendung von spezifischen synthetischen Peptiden erübrigt die
Notwendigkeit für
ein Protein vollständiger
Länge bei
der Impfung und die Erzeugung von Antikörpern oder einen Test dafür. Außerdem ermöglichen
die Festphasen-Peptidsynthesetechniken von Merrifield und Mitarbeitern
die chemische Herstellung von im Wesentlichen unbegrenzten Mengen
des synthetisierten Peptids von Interesse. Erickson und Merrifield,
in The Proteins, 3. Auflage, Bd. 2, Academic Press, New York, Kapitel
3 (1976). Die Verfügbarkeit
automatischer Peptidsynthesegeräte
hat solche Techniken weiter verbessert.
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Obwohl eine Vielzahl von Kriterien
verwendet werden kann, um antigene Regionen von Proteinen vorherzusagen,
können
Peptide, die solchen Regionen entsprechen, nicht immer als Impfstoffe
nützlich
sein. Zum Beispiel kann die Antigenität verloren gehen, da das Peptid
nicht in der richtigen räumlichen
Orientierung vorliegt, um durch Antikörper erkannt zu werden, die
mit dem Protein reagieren. Es ist auch gezeigt worden, daß bestimmte
Peptide, die aus Typ-C-Retroviren und HIV abgeleitet wurden, als
immunsuppressive Agenzien wirksam sind, so wie HIV selbst. Cianciolo
et al., J. Immunol. 124 (1980), 2900–2905; und Cianciolo et al.,
Science 230 (1985), 453–455.
Peptide wie diese, die eine nachteilige Wirkung auf den Patienten
haben, wären zur
Verwendung als Impfstoffe nicht geeignet.
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Außerdem, wie es bei HIV-1 und
HIV-2 besonders offensichtlich ist, gibt es eine erhebliche genetische Variabilität innerhalb
jeder dieser zwei Virusgruppen, was viele Sero typen oder Isolate
der Viren zur Folge hat. Daher mußte zwingend eine Region eines
Proteins ausgewählt
werden, aus der ein Peptid zur Verwendung bei der Formulierung von
Immunogenen abgeleitet werden konnte. Jedoch ist für bestimmte
immundominante Teile von HIV-1- und
HIV-2-Proteinen gezeigt worden, daß sie relativ invariant sind.
Synthetische Peptide können
auch der Schlüssel
zu viralen Impfstoffen sein, insofern als sie eine Immunantwort
gegen Sequenzen gleichen Typs induzieren, die normalerweise in dem
nativen Molekül
nicht immunogen sind. Die sonst stummen Epitope können eine
weitreichende schutzgewährende
Spezifität
besitzen. Steward et al., Immunol. Today 8 (1987), 51–58. Mehrere
experimentelle Impfstoffe sind mit dem Ziel formuliert worden, eine
Infektion in solchen Menschen zu verhindern, die wahrscheinlich
dem Virus ausgesetzt sind. Berman et al., "Protection of Chimpanzees from Infection
by HIV-2 After Vaccination With Recombinant Glycoprotein gp120 But
Not gp160", Nature
345 (1990), 622–625.
Synthetische Peptide, die Regionen von immunologisch wichtigen HIV-Proteinen entsprechen,
haben nun direkt Anwendung in diagnostischen Verfahren zum Nachweis
von HIV, als potentielle Impfstoffe gegen HIV und bei der Herstellung
von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gefunden.
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Eine Reihe von Neutralisierungs-Epitopen
auf gp120 ist durch mehrere Forscher identifiziert und definiert
worden; für
einen Überblick
vgl. Bolognesi, AIDS 3 (1989) (Suppl. 1), 5111–5118. In diesem Überblick
erwähnt
Bolognesi vier verschiedene virale Neutralisierungs-Epitope mit
den folgenden Aminosäurekoordinaten: 254–274, 303–337, 458–484 und
491–523.
Das Peptid mit den Aminosäurekoordinaten
254–274
wurde zur Immunisierung von Kaninchen verwendet, und für das erhaltene
Antiserum wurde gezeigt, daß es
HIV-1 neutralisiert, wie vorstehend beschrieben. Ho et al.
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Die erfindungsgemäß eingeschlossenen Peptide
umfassen Aminosäuresequenzen,
die jeweils mindestens ein zusammenhängendes (lineares) Epitop enthalten,
welches die Produktion von HIV-spezifischen Antikörpern in
dem immunisierten Wirt induziert.
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Die Erfindung umfaßt folglich
immunogene Peptide, die den Regionen des HIV- gp120-Proteins entsprechen, welche
durch das "Hüll"-Gen von HIV-1-HTLVIIIB
codiert werden; beschrieben durch Muesing et al., "Nucleic Acid Structure
and Expression of the Human AIDS/Lymphadenopathy Retrovirus", Nature 313 (1985), 450–458. Die
Nucleotidsequenz ist in Genbank Release 63 unter der Bezeichnung
HIVPV22 angegeben. Die Erfindung umfaßt ferner funktionell äquivalente
Varianten der Peptide, welche die immunogenen Eigenschaften der
Peptide nicht wesentlich beeinflussen. Zum Beispiel ist die konservative Substitution
von Aminosäureresten
von einem oder einigen wenigen Aminosäureresten durch Aminosäureanaloge
im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.
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Homologe sind Peptide, die konservativ
substituierte Aminosäurereste
aufweisen. Aminosäuren,
die für
eine andere konservativ substituiert werden können, umfassen, aber sind nicht
begrenzt auf: Glycin/Alanin; Valin/Isoleucin/Leucin; Asparagin/Glutamin;
Asparaginsäure/Glutaminsäure; Serin/Threonin;
Lysin/Arginin; und Phenylalanin/Tyrosin. Homologe Peptide sind im
Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen, falls sie durch Antikörper erkannt
werden, welche die als gp120-12, gp120-15, gp120-16 und gp120-19
bezeichneten Peptide erkennen, deren Sequenzen nachstehend gezeigt
sind. Ferner sind alle homologen Peptide, die den erfindungsgemäßen Peptiden
entsprechen, aber aus verschiedenen HIV-Isolaten abgeleitet sind, auch im Schutzumfang
dieser Erfindung eingeschlossen.
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Analoge sind definiert als Peptide,
die funktionell äquivalent
sind zu den erfindungsgemäßen Peptiden, aber
die bestimmte nicht natürlich
vorkommende oder modifizierte Aminosäurereste enthalten. Zusätzlich sind Polymere
von einem oder mehreren der Peptide und Peptidanaloge oder -homologe
im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen. Im Schutzumfang dieser
Erfindung eingeschlossen sind auch Peptide mit weniger Aminosäureresten
als gp120-12, gp120-15, gp120-16 bzw. gp120-19, welche aber ein
oder mehrere immunogene Epitope umfassen, die in irgendeinem der
Peptide vorhanden sind und folglich die immunogenen Eigenschaften
des Ausgangspeptids beibehalten. Analysenverfahren zur Bestimmung
des Ausmaßes,
in dem die fraglichen Peptide an jedem Ende verkürzt werden können, während sie
noch das immunogene Epitop der längeren
Sequenz beibehalten, werden nachstehend beschrieben.
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Die Addition von Aminosäuren an
jedes Ende der hierin spezifisch offenbarten Peptide ist auch im Schutzumfang
der Erfindung eingeschlossen, solange eine solche Addition die immunologischen
Eigenschaften dieses Peptids nicht wesentlich nachteilig beeinflußt. Mittels üblichem
Testen kann bestimmt werden, ob die gewünschten immunologischen Eigenschaften
durch solche ergänzten
oder verkürzten
Peptide beibehalten werden. Falls Aminosäuren angehängt werden, wird bevorzugt,
daß die
erhaltenen Peptide noch relativ kurz sind, z. B. nicht mehr als
etwa 50 Aminosäuren
lang, vorzugsweise nicht mehr als etwa 40 oder 45 Aminosäuren lang
und am meisten bevorzugt nicht mehr als etwa 25, 30 oder 35 Aminosäuren lang.
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Die erfindungsgemäßen Peptide wurden durch bekannte
Festphasen-Peptidsynthesetechniken synthetisiert. Barany und Merrifield,
The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 1, Gross und Meinenhofer, Hrsg.,
Academic Press, New York, Kap. 1 (1980). Die Synthese ermöglicht auch,
daß eine
oder mehrere Aminosäuren,
die nicht der ursprünglichen
Proteinsequenz entsprechen, an den Amino- oder Carboxylterminus des
Peptids angehängt
werden können.
Solche zusätzlichen
Aminosäuren
sind nützlich,
um die Peptide an ein anderes Peptid, an ein großes Trägerprotein oder an einen festen
Träger
zu koppeln. Die für
diese Zwecke nützlichen
Aminosäuren
schließen
ein, aber sind nicht begrenzt auf, Tyrosin, Lysin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Cystein
und Derivate davon. Zusätzliche
Proteinmodifikationstechniken können
angewendet werden, z. B. die NH2-Acetylierung
oder die COOH-terminale Amidierung, um ein zusätzliche Hilfsmittel für die Kopplung der
Peptide an ein anderes Protein- oder Peptidmolekül oder an einen Träger bereitzustellen.
Verfahren zur Kopplung von Peptiden aneinander, an Trägerproteine
und an feste Träger
sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Peptide mit den vorstehend
erwähnten
zusätzlichen
Aminosäureresten,
entweder am Carboxy- oder Aminoterminus, nicht gekoppelt oder gekoppelt
an einen Träger
oder ein festes Trägermaterial,
sind folglich im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen. Die
Bezugnahme auf die erfindungsgemäßen Peptide
schließt alle
der hierin besprochenen Ausführungsformen
ein.
-
Ein anderes Verfahren zur Impfstoffherstellung
ist die Anwendung von molekularbiologischen Techniken, um ein Fusionsprotein
herzustellen, das eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide
und ein stark immunogenes Protein enthält. Zum Beispiel ist gezeigt
worden, daß Fusionsproteine,
enthaltend das Antigen von Interesse und die B-Untereinheit des
Choleratoxins, eine Immunantwort auf das Antigen von Interesse induzieren.
Vgl. Sanchez et al., "Recombinant
System for Overexpression of Cholera Toxin B Subunit in Vibrio cholerae
as a Basis for Vaccine Development", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989),
481–485.
Solche chimären
Peptide können
oral verabreicht werden.
-
Die erfindungsgemäß verwendbaren Peptidsequenzen
sind nachstehend angegeben. Die Aminosäurereste sind aus der Nucleotidsequenz
abgeleitet, die bereits durch Muesing et al., "Nucleic Acid Structure and Expression
of the Human AIDS/Lymphadenopathy Retrovirus", Nature 313 (1985), 450–458, beschrieben
wurde. Es wird bevorzugt, daß die
Peptide eine Amidogruppe an ihren Carboxytermini anstatt einer Carboxylgruppe
besitzen. Der Carboxyterminus kann auch eine Carboxylgruppe sowie
eine nachstehend beschriebene Einheit sein.
worin X entweder ein Wasserstoffatom
der aminoterminalen NH
2-Gruppe des Peptids
ist oder eine zusätzliche Aminosäure, welche
so gewählt
ist, daß die
Kopplung des Peptids an einen Träger
ermöglicht
wird; Y nicht vorkommt oder Cys ist; und Z die Carboxylgruppe der
carboxyterminalen Aminosäure
oder eine Amidogruppe ist. Die verwendeten Aminosäureabkürzungen
sind in Tabelle 2 definiert.
-
Die Peptide sind als Impfstoffe nützlich,
um vor einer künftigen
Infektion mit HIV zu schützen
oder die Immunantwort gegen HIV in Individuen zu verstärken, die
bereits mit HIV infiziert sind. Obwohl jeder Primat oder vorzugsweise
ein Mensch mit den Peptiden geimpft werden kann, sind die geeignetsten
Individuen Menschen, für
die ein Risiko einer HIV-Infektion besteht. Solche Individuen schließen, aber
sind nicht begrenzt auf, Homosexuelle, Prostituierte, intravenös spritzende
Drogenabhängige
und in medizinischen Berufen Beschäftige, die mit Patienten oder
biologischen Proben Kontakt haben, ein. Die Erfindung stellt auch
monoclonale und polyclonale Antikörper bereit, welche die Peptide
spezifisch erkennen. Die Erfindung stellt ferner Antikörper bereit,
die HIV neutralisieren.
-
In der bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die Peptide in Zusammensetzungen
zur Verwendung als Immunogene formuliert. Diese Immunogene können als
Impfstoffe in Säugern, einschließlich Primaten
und Menschen, oder zur Induktion der Produktion polyclonaler und
monoclonaler Antikörper
in Tieren verwendet werden. Zur Formulierung solcher Zusammensetzungen
wird eine immunogen wirksame Menge von mindestens einem der Peptide
mit einem physiologisch verträglichen
Träger
vermischt, der zur Verabreichung an Säugern, einschließlich Menschen,
geeignet ist. Die Peptide können
kovalent aneinander, an andere Peptide, an einen Proteinträger oder
an andere Träger
gebunden, in Liposomen oder andere solche Vesikel eingeschlossen
und/oder mit einem Adjuvans oder einem Absorbens, so wie auf dem
Impfstoff-Fachgebiet bekannt, vermischt werden. Zum Beispiel kann
das Peptid oder können
die Peptide mit immunstimulierenden Komplexen vermischt werden,
wie beschrieben durch Takahashi et al., "Induction of CD8+ Cytotoxic T-Cells
by Immunization With Purified HIV-1 Envelope Protein and ISCOMS", Nature 344 (1990), 873–875. In
einer anderen Ausführungsform
sind die Peptide nicht gekoppelt und lediglich mit einem physiologisch
verträglichen
Träger
wie normale Salzlösung
oder einer Pufferungsverbindung, die zur Verabreichung an Säuger, einschließlich Menschen,
geeignet ist, gemischt.
-
Die Immunantwort auf die erfindungsgemäßen Peptide
kann durch eine große
Vielzahl von Agenzien verstärkt
werden. Die Liste der verfügbaren
Adjuvanzien ist lang und wächst
schnell. In einer bevorzugten Ausführungsform wird komplettes
Freundsches Adjuvans verwendet, um die Immunantwort des Säugers zu
verstärken,
welcher das Peptid als Impfstoff erhält.
-
Wie bei allen immunogenen Zusammensetzungen
zur Induktion von Antikörpern
müssen
die immunogen wirksamen Mengen der erfindungsgemäßen Peptide empirisch bestimmt
werden. Die zu berücksichtigen Faktoren
schließen
die Immunogenität
des nativen Peptids, ob das Peptid komplexiert wird mit einem oder
kovalent gebunden wird an ein Adjuvans oder ein Trägerprotein
oder einen anderen Träger
oder nicht, die Verabreichungsweise für die Zusammensetzung, d. h.
intravenös,
intramuskulär,
subkutan etc., und die Anzahl der zu verabreichenden Immunisierungsdosen
ein. Solche Faktoren sind auf dem Impfstoff-Fachgebiet bekannt, und erfahrene Immunologen
sind hinreichend darin geübt,
solche Bestimmungen ohne übermäßiges Experimentieren
durchzuführen.
-
Die Erfindung wird durch die folgenden
spezifischen Beispiele weiter veranschaulicht, die den Schutzumfang
der Erfindung in keiner Weise begrenzen sollen.
-
Beispiel 1
-
Peptidsynthese
-
Ein Peptidsynthesegerät von Applied
Biosystems, Modell 430 A, wurde für die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide
verwendet. Jede Synthese verwendete ein p-Methylbenzylhydrylamin-Festphasen-Trägerharz
(Peptides International, Louisville, KY). Die Pepti de wurden gemäß dem Benutzerhandbuch für Peptidsynthesegerät Model
430 A, Applied Biosystems, 1986, synthetisiert.
-
Alle Aminosäuren zur Verwendung bei der
Synthese enthielten t-Butylcarbonylgruppen (t-Boc) zum Schutz der α-NH2-Gruppe und wurden von der Novabiochem AG,
Schweiz, bezogen. Aminosäuren
mit reaktiven Seitenkettengruppen enthielten zusätzliche Schutzgruppen, um unerwünschte und
ungünstige
Seitenkettenreaktionen zu verhindern. Die einzelnen geschützten Aminosäuren, die
bei der Synthese aller Peptide verwendet wurden, sind in Tabelle
1 angegeben.
-
Tabelle 1
-
Bei der Peptidsynthese
verwendete Aminosäuren
-
- Boc-Ala-OH
- Boc-Arg (Tos)-OH
- Boc-Asn-OH
- Boc-Asp (Obzl)-OH
- Boc-Cys (Pmeobzl)-Oh
- Boc-Glu (Obzl)-OH
- Boc-Gln-OH
- Boc-Gly-OH
- Boc-His-(Tos)-OH
- Boc-Ile-OH^1/2 H2O
- Box-Leu-OH^H2O
- Box-Lys (2-CI-Z)-OH ( kristal.)
- Box-Met-OH
- Boc-Phe-OH
- Boc-Pro-OH
- Boc-Ser (Bzl)-OH^DCHA
- Boc-Thr (bzl)-OH
- Boc-Trp (Formyl)-OH
- Boc-Tyr (2-Br-Z)-OH
- Boc-Val-OH
- Tos: Tosyl oder p-Toluolsulfonsäure
- Obzl = Benzyloxy
- Pmeobzl = p-Methylbenzyloxy
- 2-CL-Z = Carbobenzoxychlorid
- 2-Br-Z = Carbobenzoxybromid
-
Nach Beendigung einer bestimmten
Synthese wurden die Schutzgruppen aus dem synthetisierten Peptid
entfernt, und das Peptid wurde von dem festen Trägerharz durch Behandlung mit
Trifluormethansulfonsäure
(TFMSA) gemäß dem Verfahren
abgespalten, das durch Bergot et al., "Utility of Trifluoromethane Sulfonic
Acid as a Cleavage Reagent in Solid Phase Peptide Synthesis", Applied Biosystems
User Bulletin, Peptide Synthesizer, Ausgabe Nr. 16, 2. September
1986, beschrieben wurde. Nachstehend wird das verwendete ausführliche
Protokoll angegeben.
- 1. Für 1 Gramm Peptidharz wurden
3 ml Thioanisol-1,2-Ethandithiol (2 : 1) als Fänger zugegeben, und das Gemisch
wurde unter fortgesetztem Rühren
für 10
min bei Raumtemperatur inkubiert.
- 2. Trifluoressigsäure
(TFA), 10 ml, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 min
bei Raumtemperatur fortgesetzt gerührt.
- 3. TFMSA, 1 ml, wurde unter starkem Rühren zugetropft und für 25 min
bei Raumtemperatur umgesetzt.
- 4. Nach der Abspaltung wurden die Peptide mit wasserfreiem Ether
ausgefällt
und gewaschen.
- 5. Die gefällten
und gewaschenen Peptide wurden in einem kleinen Volumenteil von
TFA (etwa 5 ml) gelöst.
- 6. Die gelösten
Peptide wurden abermals ausgefällt
und gewaschen, wie vorstehend in Schritt 4, und der Niederschlag
wurde unter einem N2-Strom getrocknet.
-
Vor der Verwendung in spezifischen
Tests können
die Peptide gegebenenfalls durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) weiter gereinigt werden. Eine besonders geeignete Säule für eine solche
Reinigung ist die Umkehrphasen-VydakTM C-18-Säule
unter Verwendung eines Wasser (TFA)-Acetonitril (TFA)-Gradienten
zum Eluieren der Peptide. 40 Peptide mit den in Tabelle 2 gezeigten
Aminosäuresequenzen,
welche die gesamte Sequenz von HIV-1-gp120 abdecken, wurden synthetisiert.
Ein verkürztes
Peptid, gp120-16B,
mit den Aminosäurekoordinaten
213–224
wurde auch synthetisiert.
-
-
-
Beispiel 2
-
Zellen und
Virusstammlösungen
-
Alle Neutralisierungstests wurden
unter Verwendung von H-9-Zellen und dem HTLV-111B-Virus (zurückgehend
auf R. C. Gallo und bereitgestellt durch Dr. William Hall, North
Shore Hospital, Manhasset, New York) durchgeführt. Die H-9-Zellen (bezeichnet
als H9-NY) wurden in RPMI-Medium (Gibco), supplementiert mit 20%
fötalem
Kälberserum
(FSC), Penicillin/Streptomycin (PEN/STREP, jeweils 50 μg/ml, und
ohne irgendwelche Fungizide), aufrechterhalten. Die Zellen wurden
bei einer Verdünnung
von 1 : 3 an jeden 4. Tag subkultiviert.
-
Die Zellen wurden von den Platten
abgeschabt und durch Zentrifugation bei 325 × g pelletiert. Die pelletierten
Zellen wurden in 1 ml Virusstammlösung, vorher 1/10 verdünnt, resuspendiert,
und man ließ sie
für 60
min bei 37°C
unter häufigem
Rühren
adsorbieren. Nach der Adsorption des Virus wurden die Zellen erneut zentrifugiert
und in 10 ml RPMI mit 20% FCS und Polybrene (2 μg/ml) resuspendiert (wobei eine
Endkonzentration von 5 × 105 Zellen/ml erhalten wurde) und bei 37°C in 5% CO2 inkubiert.
-
Für
infizierte Zellen wurde gezeigt, daß sie 4–5 Tage nach der Infektion
(p. i.) durch Überwachung
der Syncytienbildung, der positiven Zellen mittels Immunfluoreszenz
und der p24-Produktion (getestet durch den p24-Antigentest von Abbott)
nachweisbar sind. Der Peak einer HIV-Produktion wurde 10–15 Tage
p. i. beobachtet; zu diesem Zeitpunkt wurde das Virus gewonnen.
Nach Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit, um Zelltrümmer zu
entfernen, wurden virushaltige Überstände, die
aus infizierten Zellen gewonnen worden waren, in Stammlösungen bei –90°C eingefroren.
Eine Virusstammlösung
mit einem Endpunkttiter von 40.000 Gewebekultur-Infektionsdosen
von 50% (TCID50) wurde in den ganzen Studien
verwendet (bezeichnet als NT3-NT19).
-
Beispiel 3
-
Herstellung von Peptiden
zur Immunisierung
-
Erfindungsgemäße Peptide wurden kovalent
an Ovalbumin, Grad V (Sigma, St. Louis, MO, USA) in einem Molverhältnis von
etwa 10 : 1 (Peptid : Ovalbumin) unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat
(SPDP) (Pharmacia, Uppsala, Schweden) als bifunktionelle Verbindungsgruppe
gemäß den Anweisungen
des Herstellers (Pharmacia) gekoppelt, d. h. kurz zusammengefaßt wie folgt: Ovalbumin
wurde in Kupplungspuffer (0,2 M NaHP2O4, pH 8,5) gelöst. Das gelöste Ovalbumin wurde dann unter
Verwendung des gleichen Puffers über
eine Sephadex G-25M-Säule (Pharmacia,
Schweden) geleitet. Die Proteinkonzentration wurde bei 280 nm gemessen,
und die Rückgewinnung
wurde bestimmt. SPDP wurde in 99,5% Ethanol in einer Endkonzentration
von 40 mM gelöst.
SPDP wurde dann zu der Ovalbuminlösung unter Rühren zugetropft.
Das SPDP-Ovalbumin-Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für etwa 30
Minuten stehengelassen. Das Ovalbumin-SPDP-Konjugat wurde von dem
unkonjugierten SPDP getrennt, indem das Gemisch unter Verwendung
von Wasser als Eluent über
eine Sephadex G-25M-Säule
geleitet wurde. Der Substitutionsgrad für das Ovalbumin-SPDP-Konjugat
wurde bestimmt nach Verdünnen
von 50 μl
Konjugat in 2 ml Wasser durch Messen des verdünnten Konjugats bei 280 nm
und des verdünnten
Konjugats plus 100 μl
Dithiothreit (DDT) (Sigma) bei 343 nm, um die Menge zu bestimmen,
die zu der Peptidlösung
zugegeben werden kann.
-
Schließlich wurde das synthetische
Peptid, welches an das Ovalbumin-SPDP-Konjugat gekoppelt werden
soll, in 10% Essigsäure
in einer Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst, und eine geeignete Menge
des Ovalbumin-SPDP-Konjugats (wie durch den vorstehenden Substitutionsgrad
bestimmt) wurde zugegeben und über
Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.
-
Beispiel 4
-
Immunisierungsprotokolle
-
Maccaca fascicularis-Spezies wurden
verwendet, um Antikörper
zu erzeugen. Vor der ersten Peptidinjektion wurden den Affen eine
Blutprobe entnommen. Diese erste Blutprobe wird als "Präimmun" bezeichnet (Tabellen
3–6) und
wird als interne Kontrolle verwendet und gleichzeitig mit dem jeweiligen
Immunserum analysiert.
-
Den Affen wurden 100 μg Peptid-SPDP-Ovalbumin,
suspendiert in 0,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), injiziert. Die
Affen wurden dreimal intramuskulär
in Abständen
von drei Wochen immunisiert. Als Adjuvans wurden 0,5 ml komplettes
Freundsches Adjuvans für
alle Immunisierungen verwendet. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung
wurde den Affen Blut entnommen, und Präimmun- und Hyperimmunseren
wurden Neutralisierungstests unterzogen, wie in Beispiel 5 beschrieben.
-
Beispiel 5
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HIV-1-Neutralisierungstest
-
Seren, enthaltend Antikörper, die
eine HTLV-11B-Infektiosität
neutralisieren, wurden durch ihre Fähigkeit zur Verhinderung einer
HIV-1-Syncytiumbildung, einer p24-Antigenproduktion und eine verringerte
Anzahl von infizierten Zellen, wie durch Immunfluoreszenzmarker
bestimmt, im Vergleich zu Kontrollinfektionen ohne Peptid-spezifische
Antiseren nachgewiesen. Die in Beispiel 2 beschriebene Virusstammlösung wurde
auf 100 TCID50 verdünnt und mit Vierfach-Verdünnungsreihen
(1/5, 1/20 und 1/80) von Komplement-inaktivierten Immunseren gemischt,
welche, aus den Affen erhalten wurden, die immunisiert worden waren,
wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Als positive Kontrolle wurde
ein Meerschweinchen-Hyperimmunserum (bezeichnet als MSV) mit einem
bekannten HIV-Neutralisierungstiter
von 1/40–1/160
in allen Experimenten eingeschlossen (freundlicherweise bereitgestellt
durch Prof. B. Morein, Dept. Veterinary Virology, BMC, Uppsala,
Schweden). Nach Inkubation für
60 min bei 37°C
oder 16 Stunden bei 4°C
wurde das Serum-Virus-Gemisch
zu 1 × 106 H-9-Zellen zugegeben und weitere 60 min
bei 37°C
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen einmal gewaschen und
in Platten mit 24 Vertiefungen zusammen mit 2 ml Wachstumsmedium
(RPMI, 10% FCS, 2 μg
Polybrene/ml) pro Vertiefung eingebracht.
-
Die Zellen wurden unter dem Mikroskop
(Vergrößerung × 200) auf
das Vorhandensein von Syncytien an den Tagen 5–12 p. i. untersucht. Überstände von
infizierten Zellen wurden auf die Anwesenheit des p24-Antigens gemäß den Anweisungen
des Herstellers (ag-Test
HIVAG-1® von
Abbott, Enzyme Immunoassay for the Detection of Human Immunodeficiency
Virus Type I (HIV-1) Antigen(s) in Human Serum or Plasma) in Zehnfach-Verdünnungsreihen
(1/10–1/1000)
am Tag 10 p. i. getestet. Die Ergebnisse sind als Extinktionswerte
bei 454 nm dargestellt, wobei höhere
Extinktionswerte eine höhere
Proteinkonzentration und daher eine HIV-Infektion anzeigen. Verdünnungsreihen
der Überstände wurden
hergestellt, um die p24-Konzentrationen im genauesten Bereich nachzuweisen
(< 2,0 Extinktionseinheiten).
-
Die Anzahl der infizierten Zellen
wurde am Ende des Experiments (üblicherweise
am Tag 15 p. i.) mittels Acetonfixierung der Zellen auf Objektträgern bestimmt,
die für
die Immunfluoreszenz (IF) angepaßt sind. Ein indirekter IF-Test
wurde gemäß den bei
Jeansson et al., "Elimination
of Mycoplasmas from Cell Cultures Utilizing Hyperimmune Sera", Ex. Cell Res. 161
(1985), 181–188,
beschriebenen Standardverfahren mit Hyperimmunseren in einer 1/400-Verdünnung aus
HIV infizierten Individiuen und einem Fluorescein-Isothiocyanat
(FITC)-markierten anti-Mensch-IgG-Antikörper (Bio-Merieux, Frankreich),
1/100 verdünnt,
verwendet. Die Tabellen 3–6
zeigen die Ergebnisse, welche aus der Durchmusterung von Hyperimmunseren
aus Affen, die mit den Peptiden 1–40 immunisiert worden waren,
erhalten wurden.
-
In den Tabellen 3(A-D)-6 wurde der
p24-Antigengehalt der Überstände durch
einen ELISA analysiert, wie vorstehend beschrieben. Die relative
Menge der Antigen-positiven Zellen ist als AG-pos. Zellen angegeben,
wobei die Prozentsätze
wiedergegeben werden durch: – =
0%; + = >0–2%; ++
= 3–10%;
und +++ = 11–20%,
wobei das Prozentsatzintervall die Anzahl der Antigen-positiven
Zellen angibt.
-
Tabelle 3A (HIVNT3P1.XLS) veranschaulicht
die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die
mit den Peptiden gp120-1-gp120-10 immunisiert worden waren. Die
verwendeten Zellen waren H9-NY-Zellen, und das verwendete Virus
war HTLV-IIIB, Charge
18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine
Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.
-
Tabelle 3B (HIVNT4P1.XLS) veranschaulicht
die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die
mit den Peptiden gp120-11-gp120-20 immunisiert worden waren. Die
verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en, und das verwendete Virus
war HTLV-IIIB, Charge
18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine
Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.
-
Tabelle 3C (HIVNT5P1.XLS) veranschaulicht
die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die
mit den Peptiden gp120-21-gp120-30 immunisiert worden waren. Die
verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en, und das verwendete Virus
war HTLV-IIIB, Charge
18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine
Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.
-
Tabelle 3D (HIVNT6P1.XLS) veranschaulicht
die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die
mit den Peptiden gp120-31-gp120-40 immunisiert worden waren. Die
verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en, und das verwendete Virus
war HTLV-IIIB, Charge
18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine
Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.
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Tabelle 4 (HIVTAB4.XLS) veranschaulicht
die Ergebnisse der ersten Wiederholungsprüfung auf mutmaßliche neutralisierende
Antikörper,
wie durch den ersten Test bestimmt wurde (Tabellen 3A–D). In
jedem Test war das verwendete Virus HTLV-IIIB, Charge 18, und die
verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en. Die Ergebnisse der Ersten
Wiederholungsprüfung
in den Reihen 1–19
sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 5. Das Inkubationsprotokoll
umfaßte
eine Inkubation bei 37°C
für eine
Stunde. Die Ergebnisse der Ersten Wiederholungsprüfung in
den Reihen 20–32
sind die Ergebnisse von Neutralisierungstests Nr. 7. Das Inkubationsprotokoll
umfaßte
eine Inkubation bei 37°C
für eine
Stunde.
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Tabelle 5 (HIVTAB5.XLS) zeigt die
Ergebnisse der zweiten, dritten und vierten Wiederholungsprüfung auf
die positiven Peptide. In jedem Test war das verwendete Virus HTLV-IIIB,
Charge 18, und die verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en. Die Ergebnisse
der Zweiten Wiederholungsprüfung
in den Reihen 1–4
sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 7. Das Inkubationsprotokoll
umfaßte
eine Inkubation bei 37°C
für eine Stunde.
Die Ergebnisse der Zweiten Wiederholungsprüfung in den Reihen 5–13 sind
die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 12. Die Ergebnisse der
Dritten Wiederholungsprüfung
in den Reihen 14–16
sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 12. Das Inkubationsprotokoll
umfaßte
eine Inkubation bei 37°C
für eine Stunde.
Die Ergebnisse der Vierten Wiederholungsprüfung in den Reihen 17–39 sind
die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 16. Das Inkubationsprotokoll
umfaßte
eine Inkubation bei 4°C
für 16
Stunden. Die Ergebnisse der Zweiten Wiederholungsprüfung in
den Reihen 40–53
sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 19. Das Inkubationsprotokoll
umfaßte
eine Inkubation (Zellen plus Virus) bei 4°C für 16 Stunden.
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Tabelle 6 (HIVKOMBP.XLS) zeigt die
Ergebnisse des Neutralisierungstests mit kombinierten Hyperimmunseren.
Anmerkung: die Inkubation von Virus und Zellen erfolgte bei 4°C für 16 Stunden.
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Die in den Tabellen 3(A-D)-6 veranschaulichten
Ergebnisse zeigen, daß die
erfindungsgemäßen Peptide
die Produktion von HIV neutralisierenden Antikörpern in Primaten induzieren.
Die Verwendung der Peptide bei der Impfung von Menschen ist daher
geeignet, um eine Infektion mit HIV zu verhindern oder um eine verstärkte Immunantwort
in Individuen hervorzurufen, die bereits mit HIV infiziert sind.
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Beispiel 6
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ADCC-Test
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Das zur Bestimmung einer HIV-spezifischen
ADCC angewendete Verfahren ist beschrieben worden durch Ljunggren
et al., J. Immunol. Meth. 104 (1987), 7; und J. Immunol. 139 (1987),
2263. Kurz zusammengefaßt
wurde die Zelllinie U937, Clon 2, fortgesetzt infiziert mit HIV-1HTLVIIIB, als Zielzelle verwendet. Einkernige Zellen
aus peripherem Blut (PBMC), erhalten aus HIV-Antikörper-negativen
Blutspendern, wurden als Effektorzellen verwendet. Die PBMCs wurden
mittels Dichtezentrifugation auf Lymphoprep (Nykomed Pharma AS, Oslo,
Norwegen) gewonnen, und anhaftende Zellen wurden durch die Nylonwolle-Scheuertechnik
entfernt. Merril et al., Eur. J. Immunol. 11 (1981), 536. 51Cr-markierte Zielzellen, 1 × 104, und Lymphocyten als Effektorzellen, 2 × 105, wurden mit Serumverdünnungen, sechs Verdünnungsschritte
in Dreifach-Verdünnungsreihen,
beginnend bei 1 : 30, gemischt. Die Überstände wurden nach drei Stunden
geerntet, und die freigesetzte Radioaktivität wurde berechnet. Die spontane
Freisetzung überschritt
nie 10%.
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Die HIV-spezifische ADCC wurde wie
folgt bestimmt: spezifische 51Cr-Freisetzung
mit HIV-positiven Seren minus der spezifischen 51Cr-Freisetzung
mit HIV-negativen Seren. Seren mit einem Spezifischen ADDC-Index
(SAI)-Wert von > 0,5
bei 1 : 30 wurden als positiv für
eine HIV-spezifische ADCC angesehen. Ljunggren et al., J. Immunol.
139 (1987), 2263. Dieser Wert liegt mehr als 3 SD oberhalb der spezifischen 51Cr-Freisetzung, die durch HIV-Antikörper-negative
Seren erhalten wird. HIV-Antikörper-positive
Seren mit einem bekannten ADCC-Titer waren in jedem Test eingeschlossen.
Der reziproke Wert des letzten Verdünnungschritts mit einem SAI-Wert
von > 0,5 wurde als
ADCC-Titer angenommen. Keine ADCC-Aktivität konnte in Seren gegen nicht
infizierte Zielzellen oder in HIV-Antikörpernegativen Seren nachgewiesen
werden.
-
Die gemäß dem vorstehenden Beispiel
5 bestimmten Hyperimmunseren wurden in einem ADCC-Test getestet,
wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse für ADCC-positive Seren allein
sind nachstehend in Tabelle 7 dargestellt. Alle anderen Seren in
der Gruppe waren ADCC-negativ. Alle Präimmunseren von den Affen 1–40 waren
negativ gegen infizierte Zielzellen, ausgenommen Serum Nr. 36, das
einen Titer von 1 : 30 aufwies. Alle Präimmun- und Hyperimmunseren
waren ADCC-negativ gegen nicht infizierte Zielzellen.
-
-
Die in Tabelle 7 angegebenen Ergebnisse
zeigen, daß die
erfindungsgemäßen Peptide
lineare ADCC-Epitope einschließen,
die für
HIV-1HTLVIIB-gP120 spezifisch sind. Folglich
können
die erfindungsgemäßen Peptide
zur Induktion einer Antikörper
abhängigen
zellulären
Cytotoxizität
verwendet werden, um die Verhinderung einer Infektion mit HIV zu
unterstützen
oder um eine verstärkte
Immunantwort in Individuen hervorzurufen, die bereits mit HIV infiziert
sind.
-
Zur Bestimmung der richtigen Aminosäuren, die
für das
aktive Epitop eines jeden der neuen erfindungsgemäßen Peptide
notwendig sind, kann eine Deletionsanalyse durchgeführt werden,
wie im folgenden Beispiel beschrieben ist.
-
Beispiel 7
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Deletionsanalyse der Peptide
-
Die erfindungsgemäßen Peptide können genau
in der hierin beschriebenen Form verwendet werden oder können in
einer ergänzten
oder verkürzten
aktiven Form verwendet werden. Um zu bestimmen, ob die Entfernung
oder Addition von Aminosäuren
aus oder an die Sequenz die vorteilhaften Eigenschaften der Sequenz
beeinflußt,
wie vorstehend beschrieben, können
Routineexperimente durchgeführt
werden, um den Teil der Sequenz zu identifizieren, der das aktive
Epitop enthält.
Zum Beispiel wird eine Deletionsanalyse bei gp120-1 durchgeführt, indem
Peptide synthetisiert werden, denen eine, zwei, drei oder mehr Aminosäuren aus dem
Carboxyterminus, aus dem Aminoterminus oder beiden fehlen, und diese
Peptide systematisch gemäß den Beispielen
4–6 getestet
werden. Falls das erhaltene verkürzte
Peptid immunologisch äquivalent
ist zu der nicht verkürzten
Form bezüglich
der Erzeugung von protektiven oder neutralisierenden Antikörpern, dann
kann man daraus schließen,
daß das
Epitop, welches für
die fraglichen Eigenschaften verantwortlich ist, innerhalb der verkürzten Sequenz
vorhanden ist. In ähnlicher
Weise können
die Sequenzen nach der Addition von einer, zwei, drei oder mehren
Aminosäuren
(gewählt
aus einer beliebigen gewünschten
Aminosäure)
an jedes Ende des Peptids getestet werden. Falls das erhaltene Peptid
im Wesentlichen die Eigenschaften beibehält, die in den Beispielen 4–6 für das unmodifizierte
Peptid identifiziert wurden, wird das modifizierte Peptid für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung als immunologisch äquivalent angesehen.
-
Zusätzlich zur Synthese der zu
testenden Peptide de novo können
Aminosäuren
aus den Peptiden mit irgendeiner der hierin offenbarten SEQ ID Nrn.
chemisch entfernt werden. Zum Beispiel können Aminosäuren unter Anwendung des Verfahrens
entfernt werden, das bei Morrison und Boyd, Organic Chemistry, 3.
Auflage (1976), S. 1145–1146,
offenbart ist. Kurz zusammengefaßt wird Phenylisothiocyanat
verwendet, um einen substituierten Thioharnstoff an dem N-terminalen
Rest des Peptids zu bilden. Ein milde Hydrolyse mit Salzsäure entfernt
selektiv den N-terminalen Rest als das Phenylthiohydantoin. Die
restliche Peptidkette bleibt in einem intakten Zustand zurück und wird
auf eine immunologische Aktivität
gemäß den Verfahren
getestet, die in den vorstehend beschriebenen Beispielen 4–6 offenbart
sind. Das Verfahren wird dann wiederholt, wobei aufeinanderfolgend
der N-terminale Rest aus der restlichen Peptidkette entfernt wird
und das erhaltene Peptid auf seine Fähigkeit getestet wird, eine
HIV-spezifische ADCC zu induzieren, bis diese Fähigkeit verlorengeht. Auf diese
Weise wird die Aminosäuresequenz
des aktiven Epitops bestimmt.
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Alternativ wird die C-terminale Aminosäure unter
Verwendung des Enzyms Carboxypeptidase selektiv entfernt, um nur
die Peptidbindungen direkt neben der freien alpha-Carboxylgruppe
zu spalten. Zusätzlich
können
Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin verwendet werden, um
die erfindungsgemäßen Peptide
in kleinere Fragmente zu zerkleinern, die dann gemäß den Verfahren
analysiert werden, welche vorstehend in den Beispielen 4–6 beschrieben
sind.
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Obwohl besondere Ausführungsformen
der Erfindung ausführlich
beschrieben worden sind, ist für
die Fachleute ersichtlich, daß diese
Ausführungsformen
beispielhaft anstatt begrenzend sind, und der wirkliche Schutzumfang
der Endung ist derjenige, welcher durch die folgenden Patentansprüche definiert
wird.
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