KR20160005749A - 항-글루카곤 수용체 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루카곤 수용체에 결합하는 길항 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 항-글루카곤 수용체 항체는 혈액 내의 글루코스 수준을 저하시키기 위하여 치료적으로 사용될 수 있고, 글루코스-관련 질환, 예컨대 당뇨병, 고혈당증, 고인슐린혈증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증 또는 대사 증후군의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

항-글루카곤 수용체 항체 및 이의 사용 방법{ANTI-GLUCAGON RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}

본 발명은 항체, 예컨대 글루카곤 수용체에 결합하는 전장 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글루카곤 수용체에 대한 항체를 포함하는 조성물, 및 약제로서 항-글루카곤 수용체 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 항-글루카곤 수용체 항체는 혈액에서 글루코스 수준을 저하시키기 위해 치료적으로 사용될 수 있고, 글루코스-관련 질환, 예컨대 당뇨병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

서열목록에 관한 참고

본원은 EFS-Web를 통해 전자 출원되고, .txt 포맷의 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. 이러한 .txt 파일은 2014년 4월 16일자로 생성되고 크기가 72 KB인 파일명 "SequenceListing PC33992 02"의 서열 목록을 포함한다. 이러한 .txt 파일 내에 함유된 서열 목록은 본원의 일부이고, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.

당뇨병은, 이의 증가하는 유행 및 관련 건강상 위험에 기인하여, 주요한 공중 건강 관심사이다. 이러한 질병은 적절한 혈장 글루코스 수준의 유지 실패를 야기하는 탄수화물의 생산 및 이용에서의 대사적 결함에 의해 특징지어진다. 당뇨병의 2개의 주요 형태가 인정된다. 1형 당뇨병(T1D)(또는 인슐린-의존성 진성 당뇨병)은 인슐린의 절대 결핍의 결과이다. II형 당뇨병(T2D)(또는 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병)은 종종 정상 또는 심지어 증가된 수준의 인슐린과 함께 발생하고, 인슐린에 적절히 반응하는 조직 및 세포의 불능의 결과인 것으로 나타났다. 약물 치료에 의한 T2D의 공격적인 조절이 필수적이고, 그렇지 않으면 β-세포 파괴 및 인슐린 의존으로 진행될 수 있다.

글루카곤은 췌장의 α-세포로부터 간문맥으로 분비되고, 이에 의해 간을 비-간 조직보다 높은 수준의 이러한 호르몬에 노출하도록 하는 29개 아미노산 펩티드이다. 혈장 글루카곤 수준은 고혈당증, 고인슐린혈증, 증가된 혈장 비-에스터화된 지방산 수준 및 소마토스타틴에 응답하여 감소하는 반면, 글루카곤 분비는 저혈당증 및 증가된 혈장 아미노산 수준에 응답하여 증가한다. 글루카곤은, 이의 수용체의 활성화를 통해, 당분해 및 당신생을 활성화시킴으로써, 간 글루코스 생산의 강력한 활성화제이다. T2D 개체에서, 기초 글루카곤 수준은 높고, 고혈당증 및 고인슐린혈증에 의해 부적절하게 억제된다.

글루카곤 수용체는, 글루카곤에 의해 활성화되고 부류 B G-단백질 커플링된 계열의 수용체의 일원인 62 kDa 단백질이다. 글루카곤 수용체는 인간에서 GCGR 유전자에 의해 코딩되고, 이러한 수용체는 주로 간에서 발현되고, 보다 적은 양이 신장, 심장, 지방 조직, 비장, 흉선, 부신, 췌장, 대뇌 피질 및 위장관에서 발견된다. 글루카곤 수용체의 자극은 아데닐레이트 사이클라제 및 증가된 수준의 세포내 cAMP를 야기한다.

마우스(Gcgr-/-)의 글루카곤 수용체 발현의 유전적 혼란은 단식 및 공급된 글루코스 수준을 저하시키고, 혈당 조절을 개선한다. 그러나, Gcgr-/- 마우스는 글루카곤과잉혈증, 췌장 α-세포 과형성 및 췌장 신경내분비 종양이 발병한다(문헌[Gelling, R.W. et al., 2003, "Lower plasma glucose, hyperglucagonemia, and pancreatic alpha cell hyperplasia in glucagon receptor knockout mice" Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A . 100: 1438-1443]; [Yu, R. et al., 2011, "Pancreatic neuroendocrine tumors in glucagon receptor-deficient mice" Plos ONE 6(8): e23397]). 유사하게, 동형접합 불활성화 GCGR 돌연변이(P86S)를 갖는 인간 환자는 췌장 신경내분비 종양이 발병하고, 글루카곤과잉혈증 및 췌장 α-세포 과형성을 나타낸다(문헌[Yu,R. etal., 2008, "Nesidioblastosis and hyperplasia of alpha cells, microglucagonoma, and nonfunctioning islet cell tumor of the pancreas" Pancreas 36: 428-431]).

각각 상이한 기전으로 작용하는 4개의 주요 카테고리 내의 다수의 약물이 고혈당증 및 이어서 T2D의 치료에 이용가능하다(문헌[Moller, D. E., 2011, "New drug targets for Type 2 diabetes and the metabolic syndrome" Nature 414: 821-827]): (A) 인슐린 세크레토고그, 예컨대 설포닐-우레아(예컨대, 글리피자이드, 글리메피라이드, 글리부라이드) 및 메글리티나이드(예컨대, 나테글리딘 및 레파글리나이드)는 췌장 베타-세포에 작용함으로써, 인슐린의 분비를 강화시킨다. 이러한 치료법이 혈장 글루코스 수준을 감소시킬 수 있지만, 제한된 효능 및 내성을 가지고, 체중 증가를 야기하고, 종종 저혈당증을 유도한다. (B) 바이구아니드(예컨대, 메트포민)는 주로 간 글루코스 생산을 감소시킴으로써 작용하는 것으로 생각된다. 바이구아니드는 종종 위장관 장애 및 유산산증을 야기하고, 추가로 이들의 용도를 제한한다. (C) 알파-글루코시다제의 억제제(예컨대, 아카르보스)는 장 글루코스 흡수를 감소시킨다. 이들 약품은 종종 위장관 장애를 야기한다. (D) 티아졸리딘다이온(예컨대, 피오글리타존, 로시글리타존)은 간, 근육 및 지방 조직에서 특정 수용체(퍼옥시좀 증식체-활성화된 수용체-감마)에 작용한다. 이들은 지질 대사를 조절하고, 이어서 인슐린의 작용에 대한 이들 조직의 응답을 강화시킨다. 이러한 약물의 빈번한 사용은 체중 증가를 야기할 수 있고, 부종 및 빈혈을 유발할 수 있다. (E) 인슐린은 보다 심각한 경우에 단독으로 또는 상기 약품과 병용으로 사용된다.

당업계에서 이용가능하고 본 발명보다 선행인 정보로부터, 글루카곤 수용체를 선택적으로 길항하기 위한 혈액 순환으로의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 도입이 혈장 글루코스 수준을 저하시키고 당뇨병을 예방하고/하거나 치료하는지 여부, 및 이러한 경우 항-글루카곤 수용체 항체의 어떠한 특성이 생체내 안전 및 효능을 위해 요구되는지는 여전히 불명확하다.

글루카곤 수용체와 선택적으로 상호작용하는 항체가 제공된다. 특정 항-글루카곤 수용체 항체가 생체 내에서 당뇨병을 예방하고/하거나 치료하는데 효과적임이 증명되었다. 이롭게도, 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 항체는 간 기능 또는 혈장 지질에 불리한 영향을 주지 않는다. 또한, 이롭게도, 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 항체는 생체 내에서 혈액내 C-펩티드 수준을 감소시키는데 효과적이다.

글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하고, 글루카곤 수용체의 생물학적 효과를 예방하거나 감소시키는 단리된 길항제 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 길항제 항체는, 예를 들어, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체이다.

일부 양태에서, 단리된 길항제 항체는, 예를 들어, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함할 수 있다. 상기 항체의 각각의 CDR은, 예를 들어, CDR의 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 카바트 정의 및 코티아 정의의 조합, AbM 정의 및/또는 콘택트(contact) 정의에 따라 정의될 수 있다.

일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (e) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH; 및 (f) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL; (g) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL; (h) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL; (i) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL; 및 (j) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, 서열번호 24, 서열번호 16 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 18 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및/또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 VH를 포함하고, CDR 내에 존재하지 않는 잔기에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하고, CDR에 존재하지 않는 잔기에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다.

일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및/또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, 서열번호 87 또는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 항체는 면역학적 불활성 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은, 예를 들어, 비당화(aglycosylating)된 Fc일 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 IgG₂, IgG_2Δa, IgG₄, IgG_4Δb, IgG_4Δc, IgG₄ S228P, IgG_4Δb S228P 및 IgG_4Δc S228P로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소타입을 포함할 수 있다.

또한, 단클론성 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4 또는 mAb5에 의해 인식되는 글루카곤 수용체와 동일하거나 중첩되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및/또는 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 에피토프는 구조적 에피토프이다. 일부 양태에서, 에피토프는 서열번호 1의 글루카곤 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 31, 33 내지 38, 40 내지 42, 44, 45, 48, 62 및 64를 포함한다. 일부 양태에서, 에피토프는 기능성 에피토프이다. 일부 양태에서, 기능성 에피토프는 서열번호 1의 글루카곤 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 33, 36, 38, 41, 44 및 45를 포함한다. 일부 양태에서, 기능성 에피토프는 서열번호 1의 글루카곤 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 33, 36, 38, 41, 44, 45 및 60을 포함한다.

또한, 하나 이상의 본원에 제공된 항체를 생산하는 세포주가 제공된다.

또한, 본원에 제공된 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 양태에서, 단리된 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 단리된 핵산은 본원에 제공된 항체의 경쇄 가변 도메인, 중쇄 가변 도메인 또는 둘 다를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본원에 제공된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 또한, 본원에 제공된 임의의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본원에 제공된 임의의 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마가 제공된다.

또한, 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 생산 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 항체를 생산하는 세포주를 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열번호 87 또는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포주를 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계; 및 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 중쇄 및 경쇄는 별개의 벡터 상에 코딩된다. 다른 양태에서, 중쇄 및 경쇄는 동일한 벡터 상에 코딩된다.

또한, 본원에 제공된 하나 이상의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 또한, 본원에 제공된 하나 이상의 항체를 포함하는, 글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태의 치료를 위한 키트가 제공된다.

또한, 이를 필요로 하는 개체에서 혈당을 저하시키고/시키거나, 내당능을 저하시키고/시키거나, C-펩티드 수준을 저하시키고/시키거나, C-펩티드의 혈액 수준의 상당한 증가를 예방하고/하거나 글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 개체에서 혈당 수준이 저화되고/되거나, 내당능이 개선되고/되거나 병태와 관련된 하나 이상의 증상이 개선되는 효과량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 개체에게 투여함을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 개체에서 C-펩티드 수준이 저하되는 효과량의 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 개체에게 투여함을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 혈당 수준이 저하되고/되거나, 내당능이 개선되고/되거나, 병태와 관련된 하나 이상의 증상이 개선되는 효과량의 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체, 및 mTor 억제제를 개체에게 투여함을 포함한다. 상기 개체는, 예를 들어 비제한적으로 포유동물이다. 일부 양태에서, 상기 개체는 인간이다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 개체의 체중 증가를 감소시킨다.

일부 양태에서, 상기 병태는, 예를 들어, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 고혈당증, 고인슐린혈증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증, 당뇨병성 케톤산증, 당뇨병과 관련된 장기 합병증, 대사 증후군 또는 부분적으로 증가된 혈당 수준에 의해 특징지어지는 다른 대사 질환이다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 치료 후 췌장 섬의 알파 세포에서의 변화는, 개체에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 수준이 최소 효능의 역치 미만으로 떨어진 후, 역전된다

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 치료 후 간세포의 글리코겐 누적에서의 변화는, 개체에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 수준이 최소 효능의 역치 미만으로 떨어진 후, 역전된다.

일부 양태에서, 상기 방법은 효과량의 제2 치료제를 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 치료제는, 예를 들어, 인슐린, mTor 억제제, 바이구아니드, 설포닐우레아, PPAR 감마 작용제, 알파 글루코시다제 억제제, 엑세나티드(EXENATIDE, 등록상표), 심린(SYMLIN, 등록상표), 글루카곤 길항제 또는 제2 글루카곤 수용체 길항제이다. 일부 양태에서, 바이구아니드는, 예를 들어, 메트포민이다. 일부 양태에서, mTor 억제제는, 예를 들어, 라파마이신, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스 또는 ATP-경쟁적 mTOR 키나제 억제제(TKI)이다. 일부 양태에서, TKI는, 예를 들어, 토린 1, 토린 2, PP242, PP30, KU0063794, WAY-600, WYE-687, WYE-354, OSI-027, AZD-8055, KU-BMCL-200908069-1, 와이어쓰-BMCL-200908069-2, XL-388, INK-128 및 AZD-2014이다. 일부 양태에서, mTOR 억제제와의 병용 치료는 글루카곤 수용체 활성을 차단함으로써 도출된 비대 및/또는 과형성을 감소시킨다.

또한, 인간에서 1형 또는 2형 당뇨병의 치료 또는 예방, 또는 체중 감소의 달성을 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 제공된 임의의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 용도가 제공된다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 개체에서 체중 증가를 감소시킨다.

또한, 글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태의 치료에 사용하기 위한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 상기 병태는, 예를 들어, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 고혈당증, 고인슐린혈증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증 또는 대사 증후군이다.

도 1은 cAMP 분석의 결과를 요약하는 그래프이다.
도 2a는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 알라닌 아미노전이효소(ALT) 시험의 결과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 2b는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 시험의 결과를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 3a는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 알칼리성 포스파타제(ALP) 시험의 결과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 3b는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 감마-글루타밀전이효소(GGT) 시험의 결과를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 4a는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 총 콜레스테롤 수준을 요약하는 그래프를 도시한다. 도 4b는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 LDL-C 수준을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 5a는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 HDL-C 수준을 요약하는 그래프를 도시한다. 도 5b는 mAb5(속이 빈 원) 또는 PBS(속이 찬 원)가 투여된 동물에서의 트라이글리세라이드 수준을 요약하는 그래프를 도시한다.

글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하는 항체가 본원에 개시된다. 항-글루카곤 수용체 항체의 제조 방법, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 약제로서 이러한 항체의 사용 방법이 제공된다. 항-글루카곤 수용체 항체는 혈장 글루코스 수준을 저하시키는데 사용될 수 있고, T1D, T2D, 또는 관련 질환, 예컨대 고혈당증, 고인슐린혈증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증, 비만, 신증, 망막증, 백내장, 뇌졸중, 죽상경화증, 손상된 상처 치유, 당뇨병성 케톤산증, 고혈당성 고삼투압 증후군, 수술 전후 고혈당증, 집중 관리 단위 환자에서의 고혈당증, 인슐린 저항성 증후군 및 대사 증후군의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

일반적인 기술

본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 통상적인 지식에 속하는 분자생물학(예컨대, 재조합 기술), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학 분야에서 사용되는 통상적인 기술들을 이용할 것이다. 이러한 기술들이 참고문헌, 예컨대, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 상세히 기술되어 있다.

정의

달리 지시되지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다: 용어 "단리된 분자"는 이의 유래의 기원 또는 근원에 기인하여, (i) 이의 천연 상태에서 수반하는 천연적으로 관련된 성분과 결합되지 않거나, (2) 동일한 근원, 예컨대 종, 이를 발현하는 세포, 라이브러리 등으로부터의 다른 분자가 실질적으로 존재하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 천연적으로 발생하지 않는 분자(이때, 분자는, 예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체)를 지칭한다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 천연적으로 생성하는 시스템과는 상이한 세포 시스템에서 발현되는 분자는 이의 천연적으로 결합된 성분으로부터 "단리"될 수 있다. 분자는 또한 당업계에 널리 공지된 정제 기술을 사용함으로써, 천연적으로 결합된 성분이 실질적으로 존재하지 않도록 할 수 있다. 분자 순도 또는 동종성은 당업계에 널리 공지된 다수의 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는, 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 폴리펩티드를 시각화시키기 위한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 염색에 의해 분석될 수 있다. 특정 목적을 위하여, 보다 높은 분석이, HPLC 또는 정제 분야에 널리 공지된 다른 수단을 사용함으로써, 제공될 수 있다.

"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 완전한 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 달리 특정되지 않는 한, 특이적 결합을 위해 완전한 항체과 경쟁하는 이의 임의의 항원 결합 부분, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글루불린 분자의 임의의 개질된 형태를 포괄한다. 항원 결합 부분는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, 도메인 항체(dAbs, 예컨대, 상어 및 낙타 항체), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체(scFv), 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 임의의 클래스의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위 클래스)가 포함되고, 항체는 임의의 특정 클래스의 것일 필요가 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 할당될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 면역글로불린 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 하위 클래스(이소타입), 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 면역글로불린 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 칭해진다. 상이한 면역글로불린 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원 형상이 주지되어 있다.

항체의 "가변 영역"은 단독의 또는 조합되는 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 골격 영역(FR)으로 이루어지고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 공헌한다. 특히 CDR 영역의 외부(즉, 골격 영역 내부)의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 대상 가변 영역의 변이체가 요구되는 경우, 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 대상 가변 영역과 동일한 규범적 분류 내의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역과 비교함으로써 동정될 수 있다(문헌[Chotia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987]).

특정 양태에서, CDR의 정의적인 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 동정은 항체의 구조를 풀거나/고 항체-리간드 복합체의 구조를 풀어서 달성된다. 특정 양태에서, 이는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술, 예컨대 X-선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정 양태에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 동정하거나 어림하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 동정하거나 어림하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는, 비제한적으로, 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chotia) 정의, AbM 정의, 콘택트(contact) 정의 및 구조적(conformational) 정의를 포함한다.

카바트 정의는 항체 내의 잔기를 번호매기는 표준이고, 전형적으로 CDR 영역을 동정하는데 사용된다(예컨대, 문헌[Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8) 참고). 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정한 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다(문헌[Chotia, et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17]; [Chotia, et al., 1989, Nature, 342: 877-83] 참고). AbM 정의는, 항체 모형을 만드는, 옥스포드 몰리큘러 그룹(Oxford Molecular Group)에 의해 제조된 컴퓨터 프로그램의 통합 도구를 사용한다(예컨대, 문헌[Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272]; ["AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.]). AbM 정의는 지식 데이터베이스 및 초기 방법, 예컨대 문헌[Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198]에 기술된 방법의 조합을 사용하여 1차 서열로부터의 항체의 3차 구조를 모델로 한다. 콘택트 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다(예컨대, 문헌[MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45] 참고). CDR의 "구조적 정의"로서 본원에 언급된 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원에 대한 엔탈피 공헌을 수행하는 잔기로서 동정될 수 있다(예컨대, 문헌[Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참고). 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 특정 잔기 또는 잔기의 군이 항원 결합에 상당한 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적인 발견에 기초하여 짧아지거나 길어질 수 있더라도, 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR은, 접근법의 조합을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 이러한 임의의 접근법에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 소정 양태의 경우, CDR은 임의의 카바트, 코티아, 연장된, AbM, 콘택트 및/또는 구조적 정의에 따라 정의될 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 단독으로 또는 조합으로 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "단클론성 항체"는 실질적인 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다(즉, 집단을 구성하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 천연-발생가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다). 단클론성 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위를 지향한다. 또한, 상이한 결정 인자(에피토프)를 지향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정 인자를 지향한다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적인 동종 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 집단을 요구하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 생성될 수 있거나, 미국특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다. 단클론성 항체는 또한, 예를 들어 문헌[McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "인간화된" 항체는 비-인간(예컨대, 뮤린) 항체, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소한의 서열을 함유하는 이의 단편[예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열(subsequence)]의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가, 목적 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 인간화된 항체는 수용자 항체, 또는 수입된 CDR 또는 골격 서열에서 전혀 발견되지 않지만, 항체 성능을 더욱 정련하고 최적화시키기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/거나 본원에 개시된 인간 항체의 생성을 위한 임의의 기술을 사용하여 생성된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특이적으로 제외한다.

용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래하고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래하는 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래하고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.

용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 기로 이루어지고, 특정 전하 특징뿐만 아니라 특이적인 3-차원 구조적 특징을 갖는다. 일부 양태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형 또는 구조적일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용하는 분자(예컨대, 항체) 사이의 상호작용의 모든 부분은 단백질의 1차 아미노산 서열에 따라 선형으로 발생한다. "비-선형 에피토프" 또는 "구조적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내에 비-인접 폴리펩티드(또는 아미노산)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항원성 에피토프"는, 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 면역분석에 의해 측정된, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분으로서 정의된다. 일단 항원 상의 목적 에피토프가 결정되면, 예컨대 본원에 기술된 기술을 사용하여, 상기 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 다르게는, 발견 과정 중에, 항체의 생성 및 특징규명은 바람직한 에피토프에 관한 정보를 명료하게 할 수 있다. 이때, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 선별하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하여 글루카곤 수용체에 결합하기 위해 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체, 예컨대 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 찾는 것이다. "기능성 에피토프"는 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루카곤 수용체"는 글루카곤 수용체의 활성의 적어도 일부분을 유지하는 임의 형태의 글루카곤 수용체 및 이의 변이체를 지칭한다. 인간 글루카곤 수용체에 대한 구체적인 언급과 같이 달리 지시되지 않는 한, 글루카곤 수용체는 천연 서열 글루카곤 수용체의 모든 포유동물 종, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 말 및 소를 지칭한다. 하나의 예시적인 인간 글루카곤 수용체는 유니프롯 기탁번호 P47871(서열번호 1)로서 발견된다.

용어 "길항제 항체"는 표적에 결합하고 표적의 생물학적 효과를 방해하거나 감소시키는 항체를 지칭한다. 일부 양태에서, 이러한 용어는 결합하는 표적(예컨대, 글루카곤 수용체)이 생물학적 기능을 수행하는 것을 방해하는 항체를 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "항-글루카곤 수용체 길항제 항체"는 글루카곤 수용체 생물학적 활성 및/또는 글루카곤 수용체에 의해 매개된 다운스트림 이벤트를 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 글루카곤 수용체 생물학적 활성, 예컨대 글루카곤 수용체에 의해 매개된 다운스트림 이벤트, 이러한 글루카곤 결합 및 다운스트림 신호전달, 아데닐레이트 사이클라제 활성화, 세포내 cAMP의 증가된 수준, 당분해 자극, 당신생 활성화, 글리코겐합성 억제, 해당 억제 및 간 글루코스 생산을 (상당한 정도를 비롯한 임의의 정도까지) 차단하거나 길항하거나 제한하거나 감소시키는 항체를 포괄한다. 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "항-글루카곤 수용체 길항제 항체"(상호교환적으로 "길항제 글루카곤 수용체 항체", "길항제 항-글루카곤 수용체 항체" 또는 "글루카곤 수용체 길항제 항체"로 지칭됨)가 모든 종래 확인된 용어, 표제, 기능적 상태 및 특징을 포괄하고, 이에 의해 글루카곤 수용체 자체, 글루카곤 수용체 생물학적 활성(예컨대, 비제한적으로, 글루카곤에 결합하고, 세포내 cAMP를 증가시키고, 당분해를 자극하고, 당신생을 활성화시키고, 간 글루코스의 방출을 촉진하는 능력), 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 의미 있는 정도로 실질적으로 무효화되거나, 감소되거나, 중화되는 것이 명백히 이해될 수 있다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 글루카곤 수용체에 결합하고, 혈장 글루코스 수준을 저하시킨다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 예가 본원에 제공된다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 쇄를 지칭하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고/있거나, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/있거나, 비-아미노산으로 중단될 수 있다. 이러한 용어들은 천연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 쇄를 또한 포함하고; 예를 들어, 다이설피드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분의 접합을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비-천연 아미노산 등을 포함), 및 당업계에 공지된 기타 변형을 함유하는 폴리펩티드가 이러한 정의 내에 또한 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.

당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 쇄를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 사슬 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 쇄의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드들의 서열이 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 중합 후에, 예컨대 표지 성분의 접합에 의해, 폴리뉴클레오티드가 추가로 변형될 수 있다. 기타 유형의 변형에는, 예를 들어, "캡(cap)", 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 전하를 띠지 않는 연결(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하를 띠는 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)이 있는 것, 팬던트 부분, 예를 들어 단백질(예를 들어, 뉴클레아제(nuclease), 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결이 있는 것(예를 들어, 알파 아노머형(anomeric) 핵산 등), 및 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 하이드록실 기 중 임의의 것이, 예를 들어, 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 교체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 추가적인 뉴클레오티드로의 추가적인 연결이 제조되도록 활성화될 수 있거나, 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나 탄소수 1 내지 20의 아민 또는 유기 캡핑(capping) 기 부분으로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실이 표준 보호기로 또한 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환식 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머형 당, 에피머형(epimeric) 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환형 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드가 포함되는, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 또한 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결이 다른 연결 기로 교체될 수 있다. 이러한 다른 연결 기는, 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("폼아세탈")[이때, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에터(-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬(탄소수 1 내지 20), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬이다]로 교체된 양태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기술은 RNA 및 DNA를 비롯한 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에 사용된 항체는, 본원에 개시된 실시예 1의 방법에 의해 측정된 바와 같이, 평형 해리 상수가 20 nM 이하, 바람직하게는 약 6 nM 미만, 더욱 바람직하게는 약 1 nM 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2 nM 미만인 경우, 글루카곤 수용체"와 상호작용한다".

에피토프에 "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"(본원에서 상호교환적으로 사용됨) 항체는 당업계에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법이 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 분자가 대안적인 세포 또는 물질에 비해 특정 세포 또는 물질에 더욱 빈번하게, 더욱 신속하게, 더 긴 기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 경우, 이러한 분자는 "특이적인 결합" 또는 "우선적인 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 선호도로, 더욱 용이하게 및/또는 더 긴 시간 동안 결합하는 경우, 이러한 항체는 표적에 "특이적으로 결합하거나" "우선적으로 결합한다". 예를 들어, 글루카곤 수용체 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 글루카곤 수용체 에피토프 또는 비-글루카곤 수용체 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 선호도로 더욱 용이하게 및/또는 더 큰 기간으로 상기 에피토프에 결합하는 항체이다. 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)가 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없음이 이해된다. 따라서, "특이적인 결합" 또는 "우선적인 결합"은 (비록 포함할 수 있더라도) 독점적인 결합을 필수적으로 요구하지 않는다. 일반적으로, 비제한적으로, 결합에 대한 언급은 우선적인 결합을 의미한다.

본원에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 50% 이상 순수한(즉, 오염물이 없는), 더욱 바람직하게는 90% 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 95% 이상 순수한, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상 순수한, 가장 바람직하게는 99% 이상 순수한 물질을 지칭한다.

"숙주 세포"는 폴리펩티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터의 수용체일 수 있거나 이러한 수용체인 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 이러한 자손은 천연적인 돌연변이, 우발적인 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모 세포와 반드시 완전히 동일할 필요가 없을 수 있다(형태 또는 게놈 DNA 상보성 면에서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.

당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 비록 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 이의 카복실-말단으로 뻗는 것으로 통상적으로 정의된다. Fc 영역의 잔기의 번호매김은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 번호매김이다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). 면역글로불린의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인 CH2 및 CH3을 일반적으로 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.

당업계에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체, 예컨대 대립형질 변이체 및, 다르게는, 이들 수용체의 스플라이싱(splicing)된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는, 세포질 도메인에서 근본적으로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34]; 및 문헌[de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-4]에서 검토된다. "FcR"은 또한 임신부 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다(문헌[Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587]; 및 [Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).

용어 "경쟁하다"는, 항체에 관해 본원에 사용된 바와 같이, 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합의 결과가, 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합에 비해, 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되도록, 제1 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 제2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합함을 의미한다. 대안은 이의 에피토프로의 제2 항체의 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 경우일 수 있지만, 꼭 그럴 필요는 없다. 즉, 제1 항체는 에피토프로의 제2 항체의 결합을 억제할 수 있고, 제2 항체는 개별적인 에피토프로의 제1 항체의 결합을 억제하지 않는다. 그러나, 각각의 항체가 동족 에피토프 또는 리간드와의 다른 항체의 결합을 동일한, 보다 큰 또는 보다 적은 정도까지 검출가능하게 억제하는 경우, 항체는 이의 개별적인 에피토프의 결합을 위해 서로 "교차-결합하는" 것으로 지칭된다. 항체의 경쟁 및 교차-경쟁은 둘다 본 발명에 의해 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 기전(에컨대, 입체 장애, 구조적 변화 또는 공통 에피토프 또는 이의 부분으로의 결합)에 관계 없이, 당업자는, 본원에 제공된 기술에 기초하여, 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 인정할 것이다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성; 식작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향-조절(down-regulation) 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 조합되는 Fc 영역을 요구하고, 이러한 항체 효과기 기능의 평가에 관해 당업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 효과기 기능을 보유하고 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 약 1 내지 약 10개 아미노산 치환, 바람직하게는, 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는, 약 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 서열 동일성을 가질 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 이로운 또는 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이로운 또는 목적하는 임상 결과는, 비제한적으로, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 저하된 혈당 수준, 개선된 글루코스 제거(개선된 내당능), 및 T1D, T2D, 고혈당증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증, 비만, 신증, 망막증, 백내장, 뇌졸중, 죽상경화증, 손상된 상처 치유, 당뇨병성 케톤산증, 고혈당성 고삼투압 증후군, 수술 전후 고혈당증, 집중 관리 단위 환자에서의 고혈당증, 인슐린 저항성 증후군, 및 대사 증후군으로부터 유발되는 비정상 혈장 글루코스 수준의 감소된 발병률 또는 개선.

"개선"은 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 투여하지 않는 것과 비교하여 하나 이상의 증상의 감소 또는 개선을 의미한다. "개선"은 증상 기간의 단축 또는 감소를 또한 포함한다.

본원에서 사용된, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 "효과 투여량" 또는 "효과량"은 임의의 하나 이상의 이롭거나 바람직한 결과를 일으키는데 충분한 양이다. 보다 구체적인 양상에서, 효과량은 질병의 증상을 예방하거나 완화시키거나 개선하거나/하고 치료되는 대상의 생존을 연장한다. 예방적 용도를 위해, 이롭거나 바람직한 결과는 위험을 제거하거나 감소시키는 것, 중증도를 감소시키는 것, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증 및 질환 발달 동안 나타나는 중간의 병리학적 표현형을 포함하여, 질환의 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 용도를 위해, 이롭거나 바람직한 결과는, 예를 들어, T1D, T2D, 고혈당증, 고인슐린혈증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증 또는 대사 증후군의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것, 질환을 치료하는데 필요한 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 또 다른 의약의 효과를 강화시키는 것, 및/또는 환자의 질환의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 효과 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 효과 투여량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하는데 충분한 양이다. 임상 상황에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 효과 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "효과 투여량"이 하나 이상의 치료제를 투여하는 상황에서 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우 단일 작용제가 효과량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.

"개체" 또는 "대상"은 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예컨대, 소, 돼지, 말, 닭 등), 경주용 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 또한 포함한다.

본원에서 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자 또는 서열을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵생물 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함한다.

본원에서 사용된 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.

본원에서 사용된 "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "약학적으로 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우 이러한 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 하고 대상의 면역계와 반응성이지 않은 임의의 물질을 포함한다. 예는 임의의 표준 약학 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤화제를 포함한다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수(PBS) 또는 일반적인 염수(0.9% )이다. 이같은 담체를 포함하는 조성물이 주지된 통상적인 방법에 의해 제형화된다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).

용어 "k_on"은, 본원에 사용된 바와 같이, 항원으로의 항체의 결합에 관한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수(k_on 및 k_off) 및 평형 해리 상수는 전장 항체 및/또는 Fab 항체 단편(즉, 1가) 및 글루카곤 수용체를 사용하여 측정된다.

용어 "k_off"는, 본원에 사용된 바와 같이, 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 관한 속도 상수를 지칭한다.

용어 "K_D"는, 본원에 사용된 바와 같이, 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.

"약"에 관하여, 본원의 소정 값 또는 변수는 이러한 값 또는 변수 자체를 나타내는 양태를 포함한다(및 기술한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 기술은 "X"의 기술을 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수를 포함한다.

양태가 언어 "포함하는"이라는 언어와 함께 본원에 기술되는 모든 경우에, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"이라는 용어로 기술되는 다른 유사한 양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.

본 발명의 양상 또는 양태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안 군에 관하여 기술되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 완전한 군, 개별적으로 이러한 군의 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 및 하나 이상의 군 구성원이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명 내의 하나 이상의 임의의 군 구성원의 명백한 배제도 구상한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙력자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 비롯해 본 명세서가 지배할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은, 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군을 배제하지 않으면서, 언급된 완전체 또는 완전체의 군을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수형 용어는 단수를 포함하여야 한다. 용어 "예컨대" 또는 "예를 들어" 뒤의 임의의 예는 철저한 또는 제한적인 예를 의미하지 않는다.

예시적인 방법 및 물질이 본원에 기술되지만, 본원에 기술된 바와 동등하거나 유사한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상기 물질, 방법 및 예는 단지 설명적인 것이고 제한적인 것을 의미하지 않는다.

글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태의 예방 또는 치료 방법

치료 효과량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 혈당을 저하시키는 방법이 본원에 제공된다.

또한, 치료 효과량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 내당능을 개선하는 방법이 제공된다.

또한, 효과량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태를 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 병태는 T1D이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 T2D이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 고혈당증이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 고인슐린혈증이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 공복혈당장애이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 내당능장애이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 이상지질혈증이다. 다른 양태에서, 상기 병태는 대사 증후군이다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 치료적 투여는 이롭게도 보다 낮은 혈청 글루코스를 야기한다. 바람직하게는, 혈청 글루코스는 투여 전보다 약 10% 또는 15% 이상 적다. 더욱 바람직하게는, 혈청 글루코스는 항체의 투여 전보다 약 20% 이상 적다. 더욱 더 바람직하게는, 혈청 글루코스는 항체의 투여 전보다 30% 이상 적다. 이롭게는, 혈청 글루코스는 항체의 투여 전보다 40% 이상 적다. 더욱 이롭게는, 혈청 글루코스는 항체의 투여 전보다 50% 이상 적다. 매우 바람직하게는, 혈청 글루코스는 항체의 투여 전보다 60% 이상 적다. 가장 바람직하게는, 혈청 글루코스는 항체의 투여 전보다 70% 이상 적다.

T2D를 앓거나 앓을 위험이 있는 개체는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체로 치료될 수 있다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 T2D의 예후 지표 및 임상 기준을 사용하여 선택된다. T2D 중증도의 평가는 당업계에 공지된 시험, 예를 들어, 단식 혈장 글루코스 시험, 평상 혈장 글루코스 시험, 경구 내당능 시험, 식후 2시간의 시험, 랜덤 혈당, 당화 헤모글로빈(A1C) 시험, 소변 시험, 확장 눈 시험 및 발 시험에 기초하여 수행될 수 있다. 일부 양태에서, T2D 및/또는 T2D 증상의 개선, 제어, 발병률의 감소, 또는 발병 또는 진행의 지연은 단식 혈장 글루코스 시험에 의해 측정된다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 치료적 투여는 이롭게도 T2D의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 고혈당증, 증가된 갈증, 증가된 배고픔, 건조한 구강, 빈뇨, 불명한 체중 감소, 피로, 희미한 시야, 두통, 지각 손실, 망막증, 신장 손상, 불량한 혈액 순환, 신경 손상, 증가된 감염, 궤양, 오심, 구토 및 설사의 감소된 발생 및/또는 개선을 야기한다.

T1D를 앓거나 앓을 위험이 있는 개체는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체로 치료될 수 있다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 T1D의 예후 지표 및 임상 기준을 사용하여 선택된다. T2D 중증도의 평가는 당업계에 공지된 시험, 예를 들어, A1C 시험, 단식 혈장 글루코스 시험, 경구 내당능 시험, 랜덤 혈장 글루코스 시험, 프룩토사민 시험, 케톤에 대한 시험 및 소변 시험에 기초하여 수행될 수 있다. 일부 양태에서, T1D 및/또는 T1D 증상의 개선, 제어, 발병률의 감소, 또는 발병 또는 진행의 지연은 단식 혈장 글루코스 시험에 의해 측정된다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 치료적 투여는 이롭게도 T1D의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 고혈당증, 증가된 갈증, 증가된 배고픔, 건조한 구강, 빈뇨, 불명한 체중 감소, 피로, 희미한 시야, 두통, 지각 손실, 망막증, 신장 손상, 불량한 혈액 순환, 신경 손상, 증가된 감염, 궤양, 오심, 구토, 설사, 얼얼함, 저림, 손 또는 발의 통증, 건조한 피부, 가려운 피부 및 느린 아픔 치유의 감소된 발생 및/또는 개선을 야기한다.

본원에 기술된 모든 방법에 관하여, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 대한 언급은 또한 하나 이상의 추가적인 약품을 포함하는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 적합한 부형제, 예컨대 당업계에 널리 공지된 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 치료 방법과 병용으로 사용될 수 있다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 임의의 적합한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 기술된 예가 제한적으로 의도되지 않고 이용가능한 기술의 예시로 의도되는 것은 당업자에게 명백하여야 한다. 따라서, 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 공지된 방법, 예컨대 정맥내 투여(예컨대, 소정 기간의 시간에 걸친 볼루스 또는 연속 주입)에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 경피, 피하, 관절내, 설하, 활액내 투여에 의해, 흡입을 통해, 척추강내, 경구, 통기 또는 국소 경로 투여에 의해 개체에게 투여된다. 투여는 전신 투여, 예컨대 정맥내 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 액체 제형을 위한 시판 중인 분무기, 예컨대 제트 분무기 및 초음파 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접 분무될 수 있고, 동결건조된 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 다르게는, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 플루오로카본 제형 및 칭량된 복용양 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나, 동결되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 다양한 이식가능한 저상소 공급원 또는 국소 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 내재 카테터 또는 침 카테터, 합성 그래프트, 외막 랩, 션트 및 스텐트, 또는 다른 이식가능한 장치, 부위-특이적 캐리어, 직접 주사 또는 간접 적용을 포함한다(예컨대, 국제특허출원공개 제00/53211호 및 미국특허 제5,981,568호 참고).

항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 다양한 제형은 투여에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 순수하게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제는 다양한 제형에 존재할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 제공하거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 안정화제, 습윤 및 에멀젼화 제제, 삼투압을 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 침투 강화제를 포함한다. 비경구 및 비경구 약물 전달을 위한 부형제 및 제형은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 기술되어 있다.

일부 양태에서, 이러한 제제는 주사에 의한 투여(예컨대, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)를 위해 제형화된다. 따라서, 이들 제제는 약학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 구체적인 투여 섭생(즉, 복용량, 시점 및 반복)은 구체적인 개체 및 개체의 병력에 의존할 것이다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 임의의 적합한 방법, 예컨대 주사(예컨대, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내)에 의해 투여될 수 있다. 항-글루카곤 수용체 항체는 또한 본원에 기술된 바와 같이 국소적으로 또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-글루카곤 수용체 항체의 투여를 위하여, 초기 후보 복용량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 전형적인 일일 복용량은 상기 언급된 인자에 따라서, 대략 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상 중 어느 하나의 범위일 수 있다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg 및 약 25 mg/kg의 복용량이 사용될 수 있다. 병태에 따라서 수일 또는 그 이상에 걸친 반복적인 투여를 위하여, 치료는 증상의 바람직한 억제가 발생할 때까지, 또는 충분한 치료적 수준이 달성될 때까지, 예를 들어 지속된다. 예를 들어, 글루카곤-관련 질환과 연관된 증상이 감소될 때까지 지속된다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 섭생(예컨대, 사용된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체)은 시간에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 적절한 복용량은 사용된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체(또는 이의 조성물), 치료될 증상의 유형 및 중증도, 제제가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 종래 치료법, 환자의 임상적 병력 및 제제에 대한 반응, 환자의 혈당 수준, 글루코스에 대한 환자의 합성 및 제거율, 및 주치의의 재량에 따라 변할 것이다. 전형적으로, 임상의는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를, 목적 결과를 달성하는 복용량에 도달할 때까지 투여할 것이다. 복용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 따라 변할 수 있다. 경험적인 고려, 예컨대 반감기는, 일반적으로 복용량의 결정에 영향을 줄 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체는 항체의 반감기를 연장하고 숙주의 면역계에 의해 공격되는 항체를 예방하는데 사용될 수 있다. 투여 빈도는 일반적으로, 필수적이지는 않지만, 증상의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기초하여, 치료법의 과정에 따라 결정되고 조정될 수 있다. 다르게는, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속된 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.

하나의 양태에서, 길항제 항체의 복용량은 길항제 항체의 1회 이상의 투여를 제공받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 점증하는 복용량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 제공받는다. 효능을 평가하기 위하여, 질병의 지시자가 뒤따를 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지 여무, 및 숙련된 실무진에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 투여는 미러 선택된 기간의 시간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 일정한 간격을 둔 일련의 투여일 수 있다.

일부 양태에서, 1개 초과의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 존재할 수 있다. 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 그 이상의 상이한 길항제 항체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이러한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 서로 불리한 영향을 주지 않는 보존적인 활성을 가질 수 있다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 또한 다른 항체 및/또는 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 또한 제제의 효능을 강화시키고/시키거나 보충하는 역할을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 하나 이상의 부가적인 치료제와 병용으로 투여될 수 있다. 이들은, 비제한적으로, mTOR 억제제, 메글리티나이드(예컨대, 레파글리나이드, 나테글리나이드 등), 설포닐우레아(예컨대, 글리피자이드, 글리메피라이드, 글리부라이드 등), 다이펩티딜 펩티다제-4(DPP-4) 억제제(예컨대, 삭사글립틴, 시타글립틴, 리나글립틴 등), 바이구아니드(예컨대, 메트포민 등), 티아졸리딘다이온(예컨대, 로시글리타존, 피오글리타존 등), 알파-글루코시다제 억제제(예컨대, 아카르보스, 보글리보스, 미글리톨 등), 아밀린 모방제(예컨대, 심린) 및 인크레틱 모방제(예컨대, 엑세나티드(등록상표), 리라글루타이드 등)의 투여를 포함한다. 추가적인 치료는 주사가능한 치료, 예컨대 심린(등록상표)(프람린타이드)을 포함한다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 하나 이상의 mTOR 억제제, 예를 들어, 비제한적으로 라파마이신, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, 및/또는 ATP-경쟁적 mTOR 키나제 억제제(TKI)와 함께 사용된다. 일부 양태에서, TKI는 토린 1, 토린 2, PP242, PP30, KU0063794, WAY-600, WYE-687, WYE-354, OSI-027, AZD-8055, KU-BMCL-200908069-1, 와이어쓰-BMCL-200908069-2, XL-388, INK-128 및/또는 AZD-2014이다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 메트포민, 티아졸리딘다이온, 설포닐우레아 및/또는 다이사카라이드 억제제와 함께 사용된다. 다르게는, 상기 치료는 선행하거나 수분 내지 수주의 간격으로 다른 제제 치료를 뒤따른다. 다른 제제 및/또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 개별적으로 투여되는 양태에서, 본 발명의 제제 및 조성물이 대상에게 조합된 이로운 효과를 여전히 발휘할 수 있도록 각각의 전달 사이에 충분한 시간이 걸리지 않도록 보장되어야 한다. 이러한 경우에, 서로 약 12 내지 24시간, 더욱 바람직하게는, 서로 약 6 내지 12시간 내에 2개의 치료법이 모두 투여될 수 있음이 고려된다. 그러나, 일부 상황에서, 투여를 위한 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있고, 이때 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 경과한다.

일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 조성물은 비-설포닐우레아 분비촉진제, 인슐린, 인슐린 유사체, 엑센딘-4 폴리펩티드, 베타 3 아드레노셉터 작용제, PPAR 작용제, 다이펩티딜 펩티다제 IV 억제제, 스타틴 및 스타틴-함유 조합, 콜레스테롤 흡수 및/또는 담즙산 재흡수의 억제제, LDL-콜레스테롤 길항제, 콜레스테릴 에스터 전이 단백질 길항제, 엔도텔린 수용체 길항제, 성장 호르몬 길항제, 인슐린 감작제, 아밀린 모방제 또는 작용제, 카나비노이드 수용체 길항제, 글루카곤-유사 펩티드-1 작용제, 멜라노코르틴 및 멜라닌-농축 호르몬 수용체 작용제를 포함한다.

본 발명에 따라 사용된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 치료적 제형은 목적 순도를 갖는 항체를 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000])와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 복용량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 염, 예컨대 나트륨 클로라이드; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저 분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 소수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 상대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN, 상표), 플루로닉스(PLURONICS, 상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기술된 방법에 의해 제조된다. 강화된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국특허 제5,013,556호에 개시된다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물에 의한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 목적 직경을 갖는 리포좀을 제공한다.

활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들어, 코나세르베이션 기술, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시된다.

서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이때 매트릭스는 형상화된 제품, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로젤(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트공중합체, 비-열화성 에틸렌-비닐 아세테이트, 열화성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT, 상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 정맥내 용액 백 또는 피하 주사침에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알에 위치된다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 통기를 위한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액, 현탁액 또는 좌제일 수 있다.

정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위하여, 주요 활성 성분은 약학 담체, 예컨대 통상적인 정제 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 이칼슘 포스페이트 또는 검, 및 다른 약학 희석제, 예컨대 물과 혼합되어 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 비-독성 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 사전제형 조성물을 형성한다. 이러한 사전제형 조성물이 균질한 것으로 언급되는 경우, 이는 조성물이 정제, 환제 및 캡슐과 같은 균등하게 효과적인 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전체에 균등하게 분산되는 것을 의미한다. 이때, 이러한 고체 사전제형 조성물은 약 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는, 상기 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나 달리 화합되어 연장된 작용의 이점을 부여하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 복용량 및 외부 복용 성분을 포함하고, 환제는 정제 위의 외피의 형태이다. 2개의 성분은 위에서 분해에 저항하고 내부 성분이 완전하게 십이지장에 도달하도록 하거나 방출을 지연시키는 역할을 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산, 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면-활성제는, 특히 비-이온성 제제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄(예컨대, 트윈(상표) 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예컨대, 스팬(Span, 상표) 20, 40, 60, 80 또는 85)과 같은 제제를 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 0.05 내지 5%의 표면활성제를 적절히 포함할 것이고, 이는 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 만니톨, 또는, 필요에 따라 다른 약학적으로 허용되는 비히클이 첨가될 수 있음이 인정될 것이다.

적합한 에멀젼은 시판 중인 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid, 상표), 리포신(Liposyn, 상표), 인포뉴트롤(Infonutrol, 상표), 리포푼딘(Lipofundin, 상표) 및 리피피산(Lipiphysan, 상표)을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나, 다르게는 오일(예컨대, 대두 오일, 잇꽃 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 및 인지질과의 혼합 시 형성된 에멀젼(예컨대, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물에 용해될 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가되어, 에멀젼의 등장성을 조정할 수 있음이 인정될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 20% 이하, 예를 들어, 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 점적을 포함하고, 5.5 내지 8.0의 pH를 가질 수 있다.

에멀젼 조성물은 항-글루카곤 수용체 길항제 항체와 인트라리피드(상표) 또는 이들의 성분(대두 오일, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)을 혼합함으로써 제조되는 조성물일 수 있다.

흡입 또는 통기용 조성물은 약학적으로 허용되는 수성 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물 중 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 설명된 적합한 약학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 국소 또는 전시 효과를 위한 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 약학적으로 허용되는 멸균 용매 중 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 분무 장치는 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적인 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터, 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체

본 발명의 방법은 글루카곤 수용체 생물학적 활성, 예컨대 글루카곤 수용체에 의해 매개된 다운스트림 이벤트를 차단하거나 억제하거나 감소시키는(상당히 감소시킴을 포함함) 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 사용한다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 하기 특징 중 하나 이상을 나타내야 한다: (a) 글루카곤 수용체에 결합하고 다운스트림 신호전달 이벤트를 차단함; (b) 글루카곤 수용체로의 글루카곤 결합을 차단함; (c) 아데닐레이트 사이클라제 활성화를 차단함; (d) 세포 내 cAMP의 증가를 차단함; (e) 당분해를 차단함; (f) 당신생을 차단함; 및 (g) 간 글루코스 생산을 차단함.

본 발명의 목적을 위하여, 항체는 바람직하게는 글루카곤 수용체와 글루카곤 수용체 신호전달 기능을 억제하는 방식으로 반응한다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 구체적으로 영장류 글루카곤 수용체를 인식한다.

본 발명에 유용한 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합 항체, 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질(예컨대, 도메인 항체), 인간화된 항체, 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 개질된 구조, 예컨대 항체의 당화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 개질된 항체를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간 또는 임의의 다른 유래(예컨대, 키메라 또는 인간화된 항체)일 수 있다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 단클론성 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당업계에 공지되어 있고/거나 본원에 기술되어 있다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 동정되거나 특징규명될 수 있고, 이에 의해 글루카곤 수용체 생물학적 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출되고/되거나 측정된다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 후보 제제를 글루카곤 수용체와 함께 항온처리하고, 글루카곤 수용체의 생물학적 활성의 결합 및/또는 수반 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 동정된다. 결합 분석은, 예컨대 정제된 글루카곤 수용체 폴리펩티드, 또는 글루카곤 수용체 폴리펩티드를 천연 발현하거나(예컨대, 다양한 균주), 형질감염되어 발현하는 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 양태에서, 결합 분석은 경쟁적 결합 분석이고, 이때 글루카곤 수용체 결합에 대해 공지된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체와 경쟁하는 후보 항체의 능력이 평가된다. 분석은 ELISA 포맷을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 후보 항체를 글루카곤 수용체와 함께 항온처리하고, 결합을 모니터링함으로써 동정된다.

초기 동정에 따라서, 후보 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 활성은 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생분석에 의해 더욱 확인되고 다듬어질 수 있다. 일부 양태에서, 시험관내 세포 또는 세포독성 분석이 후보 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 추가로 특징규명하는데 사용된다. 예를 들어, 후보 항체는 글루카곤 수용체를 발현하는 CHO 세포와 함께 항온처리되고, 글루카곤이 첨가되고, 세포내 cAMP 수준이 모니터링된다. 다르게는, 생분석이 후보군을 직접 선별하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 하나 이상의 하기 특징을 나타낸다: (a) 글루카곤 수용체를 결합하고 다운스트림 신호전달 이벤트를 차단함; (b) 글루카곤 수용체에 결합하는 글루카곤을 차단함; (c) 아데닐레이트 사이클라제 활성화를 차단함; (d) 세포내 cAMP의 증가를 차단함; (e) 당분해를 차단함; (f) 당신생을 차단함; 및 (g) 간 글루코스 생산을 차단함. 바람직하게는, 항-글루카곤 수용체 항체는 2개 이상의 상기 특징을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 항체는 3개 이상의 특징을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 항체는 4개 이상의 특징을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 항체는 4개 이상의 특징을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 항체는 6개 이상의 특징을 갖는다. 가장 바람직하게는, 항체는 7개의 모든 특징을 갖는다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용함을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항체가 결합하는 에피토프를 동정하는 방법 또는 "에피토프 매핑(mapping)"이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 매핑하고 특징규명하는 것으로 공지된 많은 방법, 예컨대 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 챕터 11에 기술된 바와 같은 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해결, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석, 및 합성 펩티드-기재 분석이 존재한다. 추가적인 예에서, 에피토프 매핑은 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 에피토프 매핑은 다양한 공급원, 예를 들어, 펩스캔 시스템스(Pepscan Systems, 네덜란드 8219 피에이치 렐리스타드 에델헤르트베크 15 소재)에서 시판 중이다. 에피토프는 선형 에피토프(즉, 아미노산의 단일 스트레치에 함유된 것), 또는 단일 스트레치에 필수적으로 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해 형성된 구조적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드(예컨대, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)가 단리되거나 합성(예컨대, 재조합적으로)될 수 있고, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체와의 결합 분석에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 결합하는 에피토프는 글루카곤 수용체 서열로부터 유래하는 중첩 펩티드를 사용하고 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 결합을 측정함으로써, 시스템 선별에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 분석에 따라서, 글루카곤 수용체를 코딩하는 개방 판독 프레임은 선택적으로 또는 특이적 유전적 구축물에 의해 단편화되고, 시험되는 항체와의 글루카곤 수용체의 발현된 단편의 반응성이 측정된다. 유전자 단편은, 예를 들어, 방사성 아미노산의 존재 하에 PCR에 의해 생산되고, 이어서 시험관 내에서 전사되고 단백질로 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 글루카곤 수용체 단편으로의 항체의 결합은 면역침강 및 겔 전기영동에 의해 측정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자(파지 라이브러리) 또는 효모(효모 디스플레이)의 표면 상에 나타난 임의의 펩티드 서열의 큰 라이브러리를 사용함으로써 동정될 수 있다. 다르게는, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리는 샘플 결합 분석에서 시험 항체로의 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예에서, 항원의 돌연변이 유발, 도메인 교체 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행되어 에피토프 결합에 요구되고/되거나 충분하고/하거나 필수적인 잔기를 동정할 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험은 글루카곤 수용체 폴리펩티드의 다양한 잔기가 알라닌과 대체된 돌연변이 글루카곤 수용체를 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이 글루카곤 수용체로의 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 글루카곤 수용체 잔기의 중요성이 평가될 수 있다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 특징규명하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 측정하기 위하여 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체, 즉, 글루카곤 수용체의 다양한 단편과의 경쟁 분석을 사용하는 것이다.

글루카곤 수용체에 대한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 결합 친화도(K_D)는 약 0.001 내지 약 200 nM일 수 있다. 일부 양태에서, 결합 친화도는 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 2 pM 및 약 1 pM 중 어느 하나이다. 일부 양태에서, 결합 친화도는 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM 및 약 2 pM 중 어느 하나보다 작다.

따라서, 본 발명은 다음 중 어느 하나, 또는 표 1A 또는 1B에서 발견되는 부분 경쇄 서열 및 부분 중쇄 서열을 갖는 항체 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물(예컨대, 약학 조성물)을 제공한다. 표 1A 및 1B에서, 밑줄 친 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고, 굵은 글씨체의 서열은 코티아에 따른 CDR 서열이다.

[표 1A]

[표 1B]

본 발명은 또한 글루카곤 수용체에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다. CDR 영역의 결정은 당업계의 통상적인 기술에 속한다. 일부 양태에서, CDR이 카바트 및 코티아 CDR의 조합(또한 "조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR")일 수 있음이 이해된다. CDR의 "구조적 정의"로서 본원에 언급된 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피적 공헌을 하는 잔기로서 동정될 수 있다(예컨대, 문헌[Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참고). 일반적으로, "구조적 CDR"은 항체가 특정 항원에 결합하도록 적절한 루프 구조를 유지하기 위하여 강제된 카바트 CDR 및 베르니에(Vernier) 대역에서의 잔기 위치를 포함한다. 구조적 CDR의 측정은 당업계의 통상적인 기술에 속한다. 일부 양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다른 양태에서, CDR은 연장된, AbM, 구조적 또는 콘택트 CDR이다. 즉, 1개 초과의 CDR을 갖는 양태에서, CDR은 카바트, 코티아, 연장된, AbM, 구조적, 콘택트 CDR 및 이들의 조합 중 어느 하나일 수 있다.

일부 양태에서, 항체는 표 1A 또는 1B에 제시된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 표 1A 또는 1B에 제시된 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 표 1A 또는 1B에 제시된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR, 및 표 1A 또는 1B에 제시된 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다.

표 2A 및 2B는 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 CDR 서열의 예를 제공한다.

[표 2A]

[표 2B]

일부 양태에서, 항체는 표 2B로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함한다. 표 2B에 제시된 변이체로부터의 공통 서열은 다음과 같다: 경쇄 가변 영역 CDR1: X₁ASQNX₂rX₃AX₄X₅, 이때 X₁은 K 또는 R이고, X₂는 V 또는 I이고, X₃은 T 또는 S이고, X₄는 V 또는 L이고, X₅는 V 또는 N이다(서열번호 90); 경쇄 가변 영역 CDR2: LAX₁NRHX₂, 이때 X₁은 S 또는 T이고, X₂는 S 또는 G이다(서열번호 91); 경쇄 가변 영역 CDR3: X₁QHWX₂YPFX₃, 이때 X₁은 L 또는 Q이고, X₂는 T 또는 S이고, X₃은 T 또는 S이다(서열번호 92); 중쇄 가변 영역 CDR2: WINX₁EX₂DEX₃X₄YAX₅X₆FX₇G, 이때 X₁은 T 또는 S이고, X₂는 T 또는 S이고, X₃은 T 또는 S이고, X₄는 S 또는 T이고, X₅는 D 또는 Q이고, X₆은 D 또는 N이고, X₇은 K 또는 Q이다(서열번호 93); 중쇄 가변 영역 CDR3: SRGWX₁YGPPDX₂, 이때 X₁은 T 또는 S이고, X₂는 Y 또는 V이다(서열번호 94).

일부 양태에서, 항체는 C-말단 리신이 존재하거나 부재하는 전장 중쇄, 및/또는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5의 전장 경쇄를 포함한다. mAb5 전장 중쇄(서열번호 87)의 아미노산 서열은 하기 제시된다:

C-말단 리신이 부재하는 mAb5 전장 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 88)이 하기 제시된다:

mAb5 전장 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 89)이 하기 제시된다:

본 발명은 또한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 생성하고, 선택하고, 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합적으로 제조되고 발현될 수 있다.

일부 양태에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 제조되고 선택될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제5,565,332호, 제5,580,717호, 제5,733,743호 및 제6,265,150호, 및 문헌[Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994] 참고). 다르게는, 파지 디스플레이 기술(문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])이 사용되어 면역화되지 않은 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 다수 또는 소수 코트 단백질 유전자로의 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편을 나타낸다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하므로, 항체의 기능성 특성을 기준으로 하는 선택이 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 야기한다. 따라서, 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다(예컨대, 검토를 위해서, 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993] 참고). V-유전자 분자의 다수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래하는 V 유전자의 작은 임의 조합 라이브러리로부터 단리하였다. 인간 공여자체로부터의 V 유전자의 레퍼토리는 구축될 수 있고, 다양한 배열의 항원(예컨대, 자가-항원)으로의 항체가 본질적으로 문헌[Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991] 또는 문헌[Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993]에 기술된 기술에 따라 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 고속으로 돌연변위를 축적한다(체세포 과돌연변이). 도입된 변화 중 일부가 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고-친화도 표면 면역글로불린을 나타내는 B 세포는 후속 항원 챌린지 중에 우선적으로 복제되고 분화된다. 이러한 천연 과정은 "쇄 셔플링"으로 공지된 기술을 사용함으로써 모방될 수 있다(문헌[Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992]). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 비면역화된 공여체로부터 수득된 V 도메인 유전자의 천연 발생 변이체(레퍼토리)의 레퍼토리로 순차적으로 대체함으로써 개선될 수 있다. 이러한 기술은 pM 내지 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리("모든 라이브러리의 어머니"로도 공지됨)를 제조하기 위한 전략은 문헌[Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기술되어 있다. 유전자 셔플링이 또한 인간 항체를 설치류 항체로부터 유도하기 위해 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인(epitope imprinting)"으로도 지칭되는 본 방법에 따라서, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리에 의해 대체되어, 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원에 대한 선택은 기능성 항원-결합 부위를 회복할 수 있는 인간 가변 영역의 단리를 야기하고, 즉, 에피토프는 파트너의 선택을 통제한다(각인한다). 이러한 과정이 잔류하는 설치류 V 도메인을 대체하기 위하여 반복되는 경우, 인간 항체가 수득된다(국제특허출원공개 제93/06213호 참고). CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이러한 기술은 설치류 유래의 골격 또는 CDR 잔기가 전혀 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.

일부 양태에서, 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간을 비롯한 임의의 포유동물 대상 또는 이로부터의 항체 생산 세포가 조작되어 인간을 비롯한 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로서 역할을 할 수 있다. 숙주 동물의 면역화의 경로 및 계획은, 본원에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 항체 자극 및 생산에 대한 확립된 통상적인 기술과 일반적으로 일치한다. 전형적으로, 숙주 동물은 복강내로, 근육내로, 경구적으로, 피하로, 족부내로 및/또는 피내로, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 양의 면역원이 접종된다.

하이브리도마는 문헌[Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497]의 일반적인 체세포 하이브리드화 기술 또는 문헌[Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의해 변형된 기술을 사용하여 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. 이용가능한 골수종 라인, 예컨대 비제한적으로 X63-Ag8.653, 및 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터의 라인이 하이브리드화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 융합원을 사용하거나, 당업자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프 세포를 융합함을 포함한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선택적인 성장 배지, 예컨대 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지에서 성장시켜 하이브리드화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은, 본원에 기술된 임의의 배지가 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 다른 대안으로서, EBV 불멸화된 B 세포가 본 발명의 글루카곤 수용체 단클론성 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 하이브리도마 또는 다른 불멸화된 B-세포가, 필요에 따라 확장되고 서브클로닝되고, 상청액이 통상적인 면역분석 과정(예컨대, 방사선 면역분석, 효소 면역분석 또는 형광 면역분석)에 의해 항-면역원 활성에 대해 분석된다.

항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 글루카곤 수용체에 특이적인 단클론성 항체 또는 이의 부분을 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포괄한다.

이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 과정을 사용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서 성장할 수 있다. 단클론성 항체는 필요에 따라, 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예컨대 암모늄 설페이트 침전, 젤 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 존재하는 경우, 원치 않은 활성은, 예를 들어, 고체 상에 부착된 면역원으로 생성된 흡착제 상에 제제를 흘려보내고, 면역원으로부터 목적 항체를 용리하거나 방출함으로써, 제거될 수 있다. 이작용성 또는 유도체화 제제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 석신 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR(이때, R 및 R¹은 상이한 알킬 기이다)을 사용하는, 면역화될 종 내에서 면역원성인 단백질, 예컨대, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모사이아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합하는 표적 아미노산 서열을 함유하는 글루카곤 수용체 폴리펩티드 또는 단편에 의한 숙주 동물의 면역화는, 항체(예컨대, 단클론성 항체)의 집단을 생산할 수 있다.

필요에 따라, 관심 있는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체(단클론성 또는 다클론성)는 서열화될 수 있고, 이때 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 또는 증식을 위한 벡터로 클로닝될 수 있다. 관심 있는 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터에서 유지될 수 있고, 이때 상기 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 확장되고 동결될 수 있다. 세포 배양물에서 재조합 단클론성 항체의 생산은 당업계에 공지된 수단에 의해, B 세포로부터의 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; 미국특허 제7,314,622호 참고).

일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화시키거나" 항체의 친화도 또는 다른 특징을 개선하기 위한 유전학적 조작에 사용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어, 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서의 사용을 위해 주문 제작될 수 있다.

일부 양태에서, 완전한 인간 항체는, 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 시판 중인 마우스를 사용함으로써 수득될 수 있다. 보다 바람직한(예컨대, 완전한 인간 항체) 또는 더욱 튼튼한 면역 반응을 생산하도록 고안된 유전자이식 동물이 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 압게닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc., 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)로부터의 제노마우스(Xenomouse, 상표) 및 메다렉스 인코포레이티드(미국 뉴저지주 프린스턴 소재)로부터의 HuMAb-마우스(Mouse)(등록상표) 및 TC 마우스(상표)이다.

항체는 먼저 항체 및 항체 생산 세포를 숙주 동물로부터 단리하고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예컨대, CHO 세포)에서 항체를 재조합적으로 발현함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 항체 서열을 식물(예컨대, 담배) 또는 유전자이식 유제에서 발현하는 것이다. 식물 또는 유제에서 항체를 재조합적으로 발현하는 방법은 개시되어 있다(예를 들어, 문헌[Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001]; [Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999] 참고). 항체의 유도체, 예컨대 도메인, 단일 쇄 등의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.

면역분석 및 유세포분석 분류 기술, 예컨대 형광 활성화된 세포 분류(FACS)가 또한 사용되어 글루카곤 수용체에 특이적인 항체를 단리할 수 있다.

단클론성 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여(예컨대, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터(예컨대, 국제특허출원공개 제87/04462호에 개시된 발현 벡터) 내로 위치될 수 있고, 이어서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득할 수 있다(예컨대, 국제특허출원공개 제87/04462호 참고). DNA는 또한, 예를 들어, 동족 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 위한 코딩 서열을 치환함으로써(문헌[Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]), 또한 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드를 위한 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 공유 접합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원의 글루카곤 수용체 단클론성 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.

항체 단편은 항체의 단백질분해적 또는 다른 분해에 의해, 상기 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 적절히 제조된다. 화학적 합성의 방법은 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 사용하는 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다(또한, 미국특허 제5,807,715호, 제4,816,567호 및 제6,331,415호 참고).

일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, LM1, LM2, LM3, LM4, LM6, LM7, LM8, LM9, LM11, HM4, HM6, HM7, HM8, HM11 또는 HM12의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터에서 유지될 수 있고, 이어서, 숙주 세포는 미래 사용을 위해 확장되고 동결될 수 있다. 벡터(예컨대, 발현 벡터) 및 숙주 세포가 본원에 더욱 상세히 기술된다.

본 발명은 친화도 발달된(affinity matured) 양태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 발달된 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다(문헌[Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783]; [Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; [Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155]; [Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004]; [Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9]; [Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896]; 및 국제특허출원공개 제2004/058184호).

하기 방법이 항체의 친화도를 조정하고 CDR을 특징규명하는데 사용될 수 있다. 항체의 CDR을 특징규명하고/하거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경시키는(예컨대, 개선하는) 하나의 방식은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 하기와 같이 작동한다. CDR 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 당업계에 인정된 방법에 의해 2개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이는 클론의 작은 라이브러리(일부 양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 1개)를 생성하고, 각각의 2개 이상의 구성원의 복합성을 갖는다(2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우). 일반적으로, 이러한 라이브러리는 또한 천연(비치환된) 아미노산을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 소수의 클론, 예컨대 약 20 내지 80개의 클론(라이브러리의 복합성에 따라 변함)이 표적 폴리펩티드(또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 관해 선별되고, 증가되거나 동일하거나 감소된 결합을 갖거나, 결합을 갖지 않는 후보군이 동정된다. 결합 친화도를 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 결합 친화도는, 예를 들어, 2배 이상의 결합 친화도가 상이함을 검출하는 바이아코어(Biacore, 상표) 표면 플라즈몬 공명 분석, 키넥사(Kinexa, 등록상표) 바이오센서, 섬광 근접 분석, ELISA, 오리겐(ORIGEN, 등록상표) 면역분석, 형광 켄칭, 형광 전이 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 측정될 수 있다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물학적 분석을 사용하여 선별될 수 있다. 바이아코어(상표)는 출발 항체가 비교적 높은 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 K_D로 이미 결합하는 경우, 특히 유용하다.

일부 양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치는 당업계에 인지된 돌연변이유발 방법(이들 중 일부는 본원에 기술됨)을 사용하여 모든 20개의 천연 아미노산으로 대체된다(일부 양태에서, 1회에 1개). 이는 각각 20개 구성원이 복합성을 갖는(모든 20개 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우) 클론의 작은 라이브러리(일부 양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 1개)를 생성한다.

일부 양태에서, 선별되는 라이브러리는 2개 이상의 위치(동일한 CDR 내 또는 2개 이상의 CDR 내에 존재할 수 있음)에서 치환을 포함한다. 따라서,라이브러리는 하나의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 3, 4, 5개 또는 그 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있고, 상기 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견된다. 치환은 저 잉여 코돈을 사용하여 준비될 수 있다(예컨대, 문헌[Balint et al., 1993, Gene 137(1):109-18]의 표 2 참고).

CDR은 중쇄 가변 영역(VH) CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3일 수 있다. CDR은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 연장된 CDR, AbM CDR, 콘택트 CDR, 또는 구조적 CDR일 수 있다.

개선된 결합을 갖는 후보군이 서열화될 수 있고, 이에 의해 개선된 친화도(또한, "개선된" 치환으로 지칭됨)를 야기하는 CDR 치환 돌연변이체를 동정한다. 결합하는 후보군이 또한 서열화될 수 있고, 이에 의해 결합을 보유하는 CDR 치환을 동정한다.

다수회의 선별이 수행될 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 갖는 후보군(각각 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함함)이 또한 각각의 개선된 CDR 위치(즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타낸 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 원래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리의 고안에 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 선별 또는 선택이 하기에서 추가로 논의된다.

라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 또한 개선된 결합, 동일한 결합 또는 감소된 결합을 갖거나, 결합을 갖지 않는 클론의 빈도가 또한 항체-항원 복합체의 안정성을 위한 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관한 정보를 제공하는 한, CDR을 특징규명하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 위치가 모든 20개 아미노산으로 치환될 때 결합을 보유하는 경우, 이러한 위치는 항원 결합에 요구될 것 같지 않은 위치로서 확인된다. 역으로, CDR의 위치가 단지 작은 백분율의 치환으로 결합을 보유하는 경우, 이러한 위치는 CDR 기능을 위해 중요한 위치로서 동정된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은 많은 상이한 아미노산(모든 20개의 아미노산을 포함함)으로 변할 수 있는 CDR 내의 위치, 및 단지 소수의 아미노산으로 변할 수 있거나 변할 수 없는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 생성한다.

개선된 친화도를 갖는 후보군은 개선된 아미노산, 그 위치에서의 원래 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 내에 조합될 수 있고, 요구되거나, 바람직한 선별 또는 선택 방법을 사용하여 허용되는 라이브러리의 복합성에 따라서, 그 위치에서 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 인접한 아미노산 위치는 적어도 2개 이상의 아미노산으로 랜덤화될 수 있다. 인접한 아미노산의 랜덤화는 돌연변이체 CDR 내의 추가적인 구조적 가요성을 허용할 수 있고, 이는 다시 다수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 촉진할 수 있다. 라이브러리는 또한 제1회의 선별에서 개선된 친화도를 나타내지 않은 위치에서 치환을 포함할 수 있다.

제2 라이브러리가, 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 키넥사(상표) 바이오센서 분석을 사용하는 선별, 및 선택에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리포좀 디스플레이를 사용하는 선택을 사용하여, 개선되고/되거나 변경된 결합 친화도를 갖는 라이브러리에 대해 선별하거나 선택한다.

본 발명의 항-글루카곤 수용체 항체를 발현하기 위하여, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편이 먼저 상기 임의의 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 다양한 변형, 예컨대 돌연변이, 결실 및/또는 첨가가 또한 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 DNA 서열 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발은 표준 방법, 예컨대 PCR-매개된 돌연변이유발(이때, 돌연변이된 뉴클레오티드는 PCR 생성물이 목적 돌연변이 또는 부위-지향된 돌연변이유발을 함유하도록 PCR 프라이머 내로 혼입됨)을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명은 표 1에 도시된 가변 영역 및 표 2A 또는 2B에 도시된 CDR로의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 본 발명은 이들의 특성에 유의하게 영향을 주지 않는 기능적으로 등가의 가변 영역 및 CDR을 포함하는 항체, 및 강화되거나 감소된 활성 및/또는 친화도를 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열이 돌연변이되어 글루카곤 수용체로의 목적 결합 친화도를 갖는 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당업계의 일상적인 실시이고, 본원에 상세히 기술될 필요가 없다. 변형된 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 상당히 불리하게 변화시키지 않거나, 이의 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도 또는 화학적 유사체의 용도를 발달(강화)시키는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가를 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이의 범위를 갖는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티온일 잔기를 갖는 항체, 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입성 변이체는 혈액 순환 중 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.

치환 변이체는 제거된 항체 분자 내의 하나 이상의 아미노산 잔사 및 이의 위치에 삽입된 상이한 잔사를 갖는다. 치환성 돌연변이유발에 대한 가장 큰 관심의 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 골격 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 표제 하에 표 3에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 야기하는 경우, 표 3에 "예시적 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 관해 하기에 추가로 기술된 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 선별된다.

[표 3]

항체의 생물학적 특성에서의 실질적인 변형이 (a) 치환 구역에서의 폴리펩티드 골격의 구조를, 예를 들어, 시트 또는 나선 형상으로 유지시키거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키거나, (c) 측쇄의 부피를 유지시키는데 있어서 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기의 군으로 분류될 수 있다:

(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 전하 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성(음으로 하전됨): Asp, Glu;

(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원으로 다른 부류를 교환함으로써 수행된다.

예를 들어, 수행될 수 있는 하나의 유형의 치환은 항체 내의 하나 이상의 시스테인(화학적으로 반응성일 수 있음)을 다른 잔기, 예컨대 비제한적으로, 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-표준형 시스테인의 치환이 존재할 수 있다. 치환은 가변 도메인의 CDR 또는 골격 영역 또는 항체의 불변 영역에서 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 시스테인은 표준형이다. 항체의 적합한 형상을 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기가, 일반적으로 세린으로, 또한 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 특히 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편일 때, 시스테인 결합이 항체에 부가되어 이의 안정성을 개선할 수 있다.

항체는 또한, 예컨대 항체의 결합 특성을 변경하기 위하여, 예컨대 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 변형될 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 일부 양태에서, 단지 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 수행된다. 다른 양태에서, 단지 1 내지 3개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 수행된다. 예를 들어, 돌연변이가 하나 이상의 CDR 영역에서 수행되어 글루카곤 수용체에 대한 항체의 K_D를 증가시키거나 감소시키거나, k_off를 증가시키거나 감소시키거나, 항체의 결합 특이성을 변경시킬 수 있다. 부위-지향된 돌연변이유발에서의 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다(예컨대, 샘브룩(Sambrook) 등 및 오수벨(Ausubel) 등의 상기 문헌 참고).

변형 또는 돌연변이가 또한 골격 영역 또는 불변 영역에서 수행되어 항-글루카곤 수용체 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다(예컨대, 국제특허출원공개 제00/09560호 참고). 골격 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이가 또한 수행되어 항체의 면역원성을 변경시키거나, 다른 분자로의 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하거나, 보체 결합, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성과 같은 특성을 변형시킬 수 있다. 일부 양태에서, 단지 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환이 골격 영역 또는 불변 영역에서 수행된다. 다른 양태에서, 단지 1 내지 3개의 보존적 아미노산 치환이 골격 영역 또는 불변 영역에서 수행된다. 본 발명에 따라서, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 및 골격 영역 중 임의의 하나 이상 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.

변형은 또한 당화된 및 비당화된 폴리펩티드, 및 다른 번역 후 변형, 예를 들어, 상이한 당에 의한 당화, 아세틸화 및 인화를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 이의 불변 영역의 보존된 위치에서 당화된다(문헌[Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128]; [Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32]). 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질 기능(문헌[Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318]; [Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180]), 및 당단백질의 구조 및 제공된 3-차원 표면에 영향을 줄 수 있는 당단백질 부분 사이의 분자 내 상호작용(상기 문헌[Jefferis and Lund]; [Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416])에 영향을 준다. 올리고사카라이드는 또한 특이적 인식 구조를 기준으로 특정 분자에 대해 소정 당단백질을 표적화시키는 역할을 한다. 항체의 당화는 또한 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 특히, β(1,4)-N-아세틸글루코사민일전이효소 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현, 바이섹팅(bisecting) GlcNAc의 글리코실전이효소 촉매화 형성을 사용하여 CHO 세포에 의해 생산된 항체는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(문단[Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180]).

항체의 당화는 전형적으로 N-연결된 또는 O-연결된 것을 지칭한다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인(이때, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트라이펩티드 서열의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성한다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 및 자일로스 중 하나의 하이드록시아미노산(5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 사용될 수도 있지만, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌)으로의 부착을 지칭한다.

항체로의 당화 부위의 추가는 아미노산 서열이 상기 트라이펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 적절히 달성될 수 있다(N-연결된 당화 부위의 경우). 이러한 변경은 또한 원래 항체의 서열로의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 이에 의한 치환에 의해 수행될 수 있다(O-연결된 당화 부위의 경우).

항체의 당화 패턴은 또한 근원적인 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수 있다. 당화는 항체를 발현하는데 사용된 숙주 세포에 크게 의존한다. 잠재적인 치료제로서 재조합 당단백질, 예컨대 항체의 발현에 사용된 세포 유형이 거의 천연 세포가 아니므로, 항체의 당화 패턴 내의 변이가 기대될 수 있다(예컨대, 문헌[Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참고).

숙주 세포의 선택 이외에, 항체의 재조합 생산 중에 당화에 영향을 주는 인자는 성장 방식, 배지 제형, 배양균 밀도, 산화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생산에 관여된 특정 효소의 도입 또는 과발현을 비롯한 다양한 방법이 구체적인 숙주 유기체에서 달성된 당화 패턴을 변경하기 위하여 제안되었다(미국특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 당화 또는 특정 유형의 당화는, 예를 들어, 엔도글리코시다제 H(엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드를 처리하는데 결함이 있도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이러한 기술 및 유사한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

변형의 다른 방법은 당업계에 공지된 커플링 기술, 예컨대, 비제한적으로, 효소적 수단, 산화성 치환 및 킬레이트화를 사용함을 포함한다. 변형은, 예를 들어, 면역분석을 위한 표지의 부착에 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 당업계에 확립된 과정에 의해 생성되고, 당업계에 공지된 표준 분석(이들 중 일부는 하기 명세서 및 실시예에 기술됨)에 의해 선별될 수 있다.

일부 양태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대한 증가되거나 감소된 결합 친화도를 갖는 변형된 불변 영역을 포함하거나, 면역학적 불활성 또는 부분적 불활성이거나, 예컨대 보체 매개된 용해를 유발하지 않거나, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 미세아교세포를 활성화시키지 않거나; 다음 중 하나 이상의 면에서 감소된 활성(변형되지 않은 항체와 비교됨)을 갖는다: 보체 매개된 용해의 유발, ADCC의 자극, 및 미세아교세포의 활성화. 불변 영역의 상이한 변형은 최적 수준 및/또는 효과기 기능의 조합을 달성하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참고). 일부 양태에서, 불변 영역은 문헌[Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; 국제특허출원 제PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국특허출원 제9809951.8호에 기술된 바와 같이 변형된다.

일부 양태에서, 항체 불변 영역은 Fc 감마 수용체 및 보체 및 면역계와의 상호작용을 피하도록 변형될 수 있다. 이러한 항체의 제조를 위한 기술은 국제특허출원공개 제99/58572호에 기술되어 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우, 면역 반응을 피하기 위하여 인간 불변 영역을 더욱 닮도록 조작될 수 있다(예컨대, 미국특허 제5,997,867호 및 제5,866,692호 참고).

일부 양태에서, Fc는 인간 IgG₂ 또는 인간 IgG₄일 수 있다. Fc는 아미노산 잔기가 야생형 IgG₂ 서열을 기준으로 번호매겨진 돌연변이 A330P331 내지 S330S331(IgG_2Δa)을 함유하는 인간 IgG₂일 수 있다(문헌[Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]). 일부 양태에서, 항체는 하기 돌연변이를 포함하는 IgG₄의 불변 영역을 포함한다(문헌[Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593]): 야생형 IgG₄를 기준으로 번호매겨진 E233F234L235 내지 P233V234A235(IgG_4Δc). 또 다른 양태에서, Fc는 결실 G236을 갖는 인간 IgG₄ E233F234L235 내지 P233V234A235(IgG_4Δb)이다. 다른 양태에서, Fc는 힌지 안정화 돌연변이 S228 내지 P228을 함유하는 임의의 인간 IgG₄ Fc(IgG₄, IgG_4Δb 또는 IgG_4Δc)이다(문헌[Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19]).

또 다른 양태에서, 불변 영역은 N-연결된 당화를 위해 비당화된다. 일부 양태에서, 불변 영역은 불변 영역의 N-당화 인식 서열의 부분인 올리고사카라이드 부착 잔기 및/또는 인접(flanking) 잔기의 돌연변이에 의한 N-연결된 당화를 위해 비당화된다. 예를 들어, N-당화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다(문헌[Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참고). 일부 양태에서, 불변 영역은 N-연결된 당화를 위해 불변화된다. 불변 영역은 N-연결된 당화를 위해 효소적으로(예컨대, 효소 PNGase에 의한 탄수화물의 제거), 또는 당화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 비당화된다.

다른 항체 변형은 국제특허출원공개 제99/58572호에 기술된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이러한 항체는, 표적 분자를 지향하는 결합 도메인 이외에, 인간 면역글로불린 중쇄의 모든 또는 일부 불변 영역과 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 효과기 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 표적의 유의한 보체 의존성 용해, 또는 세포-매개된 파괴를 유발하지 않고, 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 효과기 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래하는 키메라 도메인을 기제로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 치료법에 대한 염증성 및 다른 불리한 반응을 피하기 위하여, 만성 항체 치료법에 사용하기에 특히 적합하다.

일부 양태에서, 항체는 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 비변형된 항체에 비해 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 불변 영역을 포함한다.

"생식계열화(germlining)"로서 공지된 방법에서, VH 및 VL 서열 내의 특정 아미노산은 생식계열 VH 및 VL 서열에서 천연적으로 발견되는 것들과 부합하도록 돌연변이될 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열 내의 골격 영역의 아미노산 서열은 생식계열 서열에 부합되도록 돌연변이되어 항체가 투여되는 경우의 면역원성의 위험을 감소시킬 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, "Vbase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 참고; 또한, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836] 참고).

수행될 수 있는 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적인 단백질분해 부위를 제거하는 것이다. 이러한 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 골격 영역, 또는 항체의 불변 영역에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 부위의 제거는 항체 생성물의 이질성의 위험을 감소시킬 수 있고, 이에 따라 동종성을 증가시킬 수 있다. 다른 유형의 아미노산 치환은 잔기 중 하나 또는 둘 다를 변경시킴으로써, 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 다른 예에서, 본 발명의 항-글루카곤 수용체 항체의 중쇄의 C-말단 리신은 분열될 수 있다. 본 발명의 다양한 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄는 신호 서열을 선택적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 VH 및 VL 분절을 코딩하는 DNA 단편이 일단 수득되면, 이러한 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더욱 조작되어, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 연결기를 코딩하는 다른 DNA 단편에 작동적으로 연결된다. 이러한 맥락에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 2개의 DNA 단편이 접합되어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 뼈대에 남도록 함을 의미하도록 의도된다.

VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써, 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고(예컨대, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]), 이러한 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG₁ 또는 IgG₂ 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체 중에서 발생하는 것으로 공지된 임의의 다양한 대립유전자 또는 알로타입(allotype), 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3) 및 Gm(17)일 수 있다. 이러한 알로타입은 IgG1 불변 영역에서 천연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유래할 수 있다.

VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역(CL)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써, 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고(예컨대, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]), 이러한 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체 중에 발생하는 임의의 다양한 대립유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2) 및 Inv(3)일 수 있다. 람다 불변 영역은 임의의 3개의 람다 유전자로부터 유래할 수 있다.

scFv 유전자를 생성하기 위하여, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 VH 및 VL 서열이 가요성 연결기에 의해 접합된 VL 및 VH 영역을 갖는 인접한 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 가요성 연결기를 코딩하는 다른 단편에 작동적으로 연결된다(예컨대, 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554] 참고). 연결 펩티드의 예는 (GGGGS)₃(서열번호 18)이고, 하나의 가변 영역의 카복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5 nm를 가교한다. 다른 서열의 연결기가 고안되고 사용되었다(상기 문헌[Bird et al., 1988]). 연결기는 다시 추가 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 항체는 1가(단지 단일 VH 및 VL이 사용되는 경우), 2가(2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우), 또는 다가(2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우)일 수 있다. 글루카곤 수용체 및 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산의 경우, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산의 경우, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 예컨대 진핵생물, 예컨대 효모, 식물, 공충 또는 포유동물 세포, 또는 원핵생물, 에스케리키아 콜라이에 도입될 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 통상적인 조작에 의해 생성될 수 있다. 생성된 scFv는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.

단일 쇄 항체의 다른 형태(예컨대, 다이아바디)가 또한 포괄된다. 다이아바디는 VH 및 VL이 너무 짧아 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 쌍을 이룰 수는 없지만, 도메인이 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 강제하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 연결기를 사용하여, 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현된 2가 이중특이적 항체이다(예컨대, 문헌[Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참고).

2개의 공유 접합된 항체를 포함하는 이종접합 항체가 또한 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 항체는 원치 않는 세포에 면역계 세포를 표적화시키는데 사용되었고(미국특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료에 사용되었다(국제특허출원공개 제91/00360호 및 제92/200373호; 유럽특허 제03089호). 이종접합 항체는 통상적인 가교결합 방법에 의해 생성될 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 미국특허 제4,676,980호에 기술된다.

키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 합성 단백질 화학의 공지된 방법, 예컨대 가교결합제를 포함하는 방법에 의해 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 다이설파이드 교환 반응을 사용하거나, 티오에터 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캡토부티르이미데이트를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 일부 양태에서, 다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 항-글루카곤 수용체 항체의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 항체가 제조될 수 있다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체의 VH 도메인이 제1 폴리펩티드에 연결되는 반면, 항-글루카곤 수용체 항체의 VL 도메인은, VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 회합하는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 다른 바람직한 양태에서, VH 도메인은 연결기에 의해 VL 도메인으로부터 분리되어, VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 한다. 이어서, VH-연결기-VL 항체는 관심 폴리펩티드에 연결된다. 또한, 2개(또는 그 이상)의 단일-쇄 항체가 서로 연결되는 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는, 단일 폴리펩티드 쇄 상의 2가 또는 다가 항체의 생성이 요구되는 경우, 또는 이중특이적 항체의 생성이 요구되는 경우 유용하다.

일부 양태에서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 42에 제시된 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11 또는 43에 제시된 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 양태에서, 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 2 및 3, 4 및 5, 6 및 7, 8 및 9, 10 및 11, 및 42 및 43으로부터 선택되는 임의의 서열 쌍으로 제시된 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 융합 폴리펩티드는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 천연 분자에 부착되지 않은 다른 아미노산 서열, 예를 들어, 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 동종 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은, 비제한적으로 "태그", 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함한다. 태그는 당업계에 널리 공지되어 있다.

융합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기술된 재조합 방법을 사용하여, 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고 발현시킴으로써 제조되지만, 이들은 또한 당업계에 공지된 다른 수단, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

다른 양태에서, 다른 변형된 항체는 핵산 분자를 코딩하는 항-글루카곤 수용체 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디"(문헌[Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57]), "미니바디"(문헌[Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9]), "다이아바디"(홀리거(Holliger) 등의 상기 문헌), 또는 "자누신(Janusin)"(문헌[Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659] 및 [Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52])은 본 명세서의 교시에 따라서 표준 분자생물학적 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

예를 들어, 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체인 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참고). 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결에 의해 생산될 수 있다(예컨대, 문헌[Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321], [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553] 참고). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하고, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(문헌[Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539]). 또한, 이중특이적 항체는 "다이아바디" 또는 "자누신"으로서 형성될 수 있다. 일부 양태에서, 이중특이적 항체는 글루카곤 수용체의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 양태에서, 상기 변형된 항체는 본원에 제공된 항-글루카곤 수용체 항체로부터의 하나 이상의 가변 도메인 또는 CDR 영역을 사용하여 제조된다.

이중특이적 항체를 제조하기 위한 하나의 접근법에 따라서, 목적 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)이 면역글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 의해 수행된다. 적어도 하나의 융합에 존재하고 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합, 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄을 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체로 공동-형질감염된다. 이는 구축에 사용된 동등한 비의 3개의 폴리펩티드 쇄가 되는 양태가 최적 수율을 제공하는 경우, 양태의 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 양호한 가요성을 제공하기 위해 사용된다. 그러나, 동등한 비의 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 야기하거나, 이러한 비가 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 하나의 발현 벡터 내의 3개의 폴리펩티드 쇄 중 2개 또는 3개를 위한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 가지에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 가지에서의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 절반에서 면역글로불린 경쇄를 갖는 이러한 대칭 구조는 원치 않는 쇄 조합으로부터의 목적 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하다. 이러한 접근법은 국제특허출원공개 제94/04690호에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 고체 지지체(예컨대, 바이오틴 또는 아비딘)로의 커플링을 촉진하는 제제에 접합된(예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 간략하게, 이러한 방법이 본원에 기술된 임의의 글루카곤 수용체 결합 및/또는 길항제 양태에 적용됨을 고려하면서 항체에 대한 언급이 일반적으로 수행될 것이다. 접합은 일반적으로 본원에 기술된 성분을 연결함을 지칭한다. 연결(일반적으로 적어도 투여를 위해 성분을 가까이 결합함)은 임의의 수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 제제와 항체의 직접 반응은 각각이 서로 반응할 수 있는 치환기를 갖는 경우에 가능하다. 예를 들어, 하나에 대한 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 설피드릴 기는 카보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드 또는 다른 것에 대한 양호한 이탈기(예컨대, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.

항체는 많은 상이한 담체에 결합할 수 있다. 담체는 작용성이고/이거나 불활성일 수 있다. 공지된 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성이거나 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합하는데 적합한 다른 담체를 알 것이고, 일상적인 실험에 의해 이를 확인할 수 있을 것이다. 일부 양태에서, 담체는 폐, 심장 또는 심장 판막을 표적화시키는 모이어티를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지제, 예컨대 형광 분자, 방사성 분자 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 일반적으로(직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 표지는 당업계에 공지되어 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 임의의 항체, 예컨대 본원에 기술된 항체 단편 및 변형된 항체, 예컨대 손상된 효과기 기능을 갖는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조되고 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 예컨대 약학 조성물을 제공한다: 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, LM1, LM2, LM3, LM4, LM6, LM7, LM8, LM9, LM11, HM4, HM6, HM7, HM8, HM11 및 HM12, 또는 글루카곤 수용체를 길항하는 능력을 갖는 임의의 단편 또는 부분.

임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 또한 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자에는 인트론을 함유하고 1-대-1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자가 포함된다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드가 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자와 비교하여 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 바람직하게는 약 70% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 나타낸다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 하기 기술되는 바와 같이 최대로 상응하도록 정렬될 때 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일한 경우에 "동일"한 것으로 일컬어진다. 2개의 서열 간의 비교는 서열을 비교 창(window)에 걸쳐 비교하여 국소적인 서열 유사성 영역을 확인하고 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 창"은 약 20개 이상의 인접한 위치, 일반적으로는 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개의 절편을 지칭하고, 이때 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 하나의 서열이 인접한 위치의 개수가 동일한 기준 서열과 비교될 수 있다.

비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 디폴트 변수를 사용하여, 레이저진(Lasergene) 생물정보학 소프트웨어 스위트(디엔에이스타 인코포레이티드(DNASTAR, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 내의 메갈린(Megalign, 등록상표) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기의 참고문헌에 기술된 여러 정렬 기법을 구현한다: 문헌[Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; [Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153]; [Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17]; [Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105]; [Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; [Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; [Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].

바람직하게는, "서열 동일성 %"는 2개의 최적으로 정렬된 서열을 위치 20개 이상의 비교 창에 걸쳐 비교함으로써 결정되고, 이때 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 일반적으로는 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하는 위치의 개수를 결정하여 부합되는 위치의 개수를 산출하고, 부합되는 위치의 개수를 기준 서열 내의 위치의 전체 개수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 산출함으로써 백분율이 계산된다.

또한 또는 다르게는, 변이체는 천연 유전자, 또는 이의 일부분 또는 보체에 대해 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 중등도로 엄격한 조건 하에 천연 항체를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열(또는 상보적인 서열)에 하이브리드화될 수 있다.

적절한 "중등도로 엄격한 조건"은 5x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비세정하고, 50℃ 내지 65℃, 5x SSC에서 하룻밤 동안 하이브리드화시킨 후, 65℃에서 20분 동안 0.1% SDS를 함유하는 2x, 0.5x 및 0.2x SSC 각각으로 2회 세정하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고-엄격성 조건"은 (1) 세정을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하는 것, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 나트륨 클로라이드/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 사용하는 것; (2) 하이브리드화 동안 변성제, 예컨대 폼아미드를 사용하는 것, 예를 들어, 42℃에서 50%(v/v) 폼아미드 + 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH 6.5) + 750 mM 나트륨 클로라이드, 75 mM 나트륨 시트레이트를 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50% 폼아미드, 5x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 5x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA(50 ㎍/mL), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2x SSC(나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트), 55℃에서 50% 폼아미드로 세정한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1x SSC로 구성된 고-엄격성 세정이 이어지는 것이다. 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요하다면, 당업자는 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지할 것이다.

당업자는, 유전자 코드 축중성(degeneracy)의 결과로서, 본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 지닌다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 명확하게 포함된다. 추가로, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질의 구조 또는 기능이 변경될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 표준 기술(예컨대, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 대립유전자를 확인할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법이 당업계에 주지되어 있고, 본원에 상세하게 기술될 필요가 없다. 당업자는 본원에서 제공된 서열 및 시판 중인 DNA 합성기를 사용하여 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.

재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해, 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 차례로 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 직접적인 흡수, 세포내 이입, 형질감염, F-메이팅(mating) 또는 전기천공에 의해 도입함으로써 세포가 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에서 유지될 수 있거나, 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드를 당업계에 주지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리할 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]] 참고).

다르게는, PCR이 DNA 서열의 재생산을 허용한다. PCR 기술은 당업계에 주지되어 있고, 미국특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호, 및 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994)]에 기술되어 있다.

적합한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하고 이를 적절한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 RNA를 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에 기재된 바와 같이, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.

적절한 클로닝 벡터가 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택되는 클로닝 벡터는 사용하려는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가 복제 능력이 있을 것이고/이거나, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적이 있을 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적절한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들어, pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이러한 클로닝 벡터 및 다수의 기타 클로닝 벡터가 바이오래드(BioRad), 스트라타진(Stratagene) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 시판 중이다.

발현 벡터가 추가로 제공된다. 일반적으로 발현 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것이 암시된다. 적절한 발현 벡터는, 비제한적으로, 플라스미드, 바이러스 벡터(아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 국제특허출원공개 제87/04462호에 개시된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다. 벡터 성분은, 비제한적으로, 하기의 것들 중 하나 이상을 일반적으로 포함할 수 있다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 적절한 전사 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결 인자). 발현(즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보좀 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 통상적으로 요구된다.

관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 전기천공, 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용하는 형질감염, 미세발사체(microprojectile) 포격, 리포펙션(lipofection), 및 감염(예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염성 작용제인 경우)을 비롯한 다수의 적합한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 숙주 세포의 특색에 종종 좌우될 것이다.

본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다. 이종성 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 목적에 사용될 수 있다. 포유류 숙주 세포의 비제한적인 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함한다(또한 국제특허출원공개 제87/04462호 참고). 적절한 비-포유동물 숙주 세포에는 원핵생물(예컨대, 에스케리키아 콜라이 또는 바실루스 서브틸리스(Basilus subtillis)) 및 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluimyces lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내의 상응하는 내인성 항체 또는 관심 단백질(존재하는 경우)의 수준보다 약 5배, 더욱 바람직하게는 10배, 더욱 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 도메인에 대한 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 선별이 면역분석법 또는 FACS에 의해 실행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.

발현 벡터는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 직접 발현에 사용될 수 있다. 당업자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다(예컨대, 미국특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호 참고). 발현 벡터의 투여는 국소 및 전신 투여, 예컨대, 주사, 경구 투여, 입자 건 또는 카테터 투여 및 국소 투여를 포함한다. 다른 양태에서, 발현 벡터는 교감신경간 또는 신경절에 직접 투여되거나, 관상 동맥, 심방, 심실 또는 심낭에 직접 투여된다.

발현 벡터 또는 하위 게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개된 DNA 전달 기술은, 예를 들어, 문헌[Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202]; [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338]에 기술되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 치료 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA로 투여된다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 약 20 μg 내지 약 100 μg의 농도 범위의 DNA가 또한 유전자 치료 프로토콜 중에 사용될 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 유래 또는 비-바이러스 유래일 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148] 참고). 이러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 본질적이거나 조절될 수 있다.

목적 폴리뉴클레오티드의 전달 및 목적 세포에서의 발현을 위한 바이러스-계 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-계 비히클은, 비제한적으로, 재조합 레트로바이러스(예컨대, 국제특허출원공개 제90/07936호; 제94/03622호; 제93/25698호; 제93/25234호; 제93/11230호; 제93/10218호; 제91/02805호; 미국특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국특허 제2,200,651호; 및 유럽특허 제0 345 242호 참고), 알파바이러스-계 벡터[예컨대, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)], 및-아데노-결합된 바이러스(AAV) 벡터(예컨대, 국제특허출원공개 제94/12649호, 제93/03769호, 제93/19191호, 제94/28938호, 제95/11984호 및 제95/00655호 참고)를 포함한다. 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기술된 살해된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.

비-바이러스성 전달 비히클 및 방법, 예컨대, 비제한적으로, 살해된 아데노바이스로 단독에 연결되거나 비연결된 다가양이온성 응축된 DNA(예컨대, 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참고); 리간드-연결된 DNA(예컨대, 문헌[Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985] 참고); 진핵세포 전달 비히클 세포(예컨대, 미국특허 제5,814,482호; 국제특허출원공개 제95/07994호; 제96/17072호; 제95/30763호; 및 제97/42338호) 및 핵 전하 중화 또는 세포 막과의 융합이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 국제특허출원공개 제90/11092호 및 미국특허 제5,580,859호에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국특허 제5,422,120호; 국제특허출원공개 제95/13796호; 제94/23697호; 제91/14445호; 및 유럽특허 제0524968호에 기술되어 있다. 추가적인 접근법은 문헌[Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581]에 기술되어 있다.

조성물

본 발명은 또한 본원에 기술된 효과량의 항-글루카곤 수용체 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물, 및 제형화 방법이 또한 본원에 기술된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 글루카곤 수용체 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체는 글루카곤 수용체를 인식한다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체는 인간 항체이다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체는 인간화된 항체이다. 일부 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체는 목적 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 유발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체는 원치 않거나 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 유발하지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 항-글루카곤 수용체 항체는 항체의 하나 이상의 CDR(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 양태에서, 6개의 모든 CDR)을 포함한다.

조성물이 1개 초과의 항-글루카곤 수용체 항체(예컨대, 글루카곤 수용체의 상이한 에피토프를 인식하는 글루카곤 수용체 항체의 혼합물)를 포함함이 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프를 인식하는 1개 초과의 항-글루카곤 수용체 항체, 또는 글루카곤 수용체의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 항-글루카곤 수용체 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 글루카곤 수용체의 상이한 변이체를 인식하는 항-글루카곤 수용체 항체의 혼합물을 포함한다.

본 발명에 사용되는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제(문헌[Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover])를 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 복용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 소수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 상대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(상표), 플루로닉스(상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기술된다.

항-글루카곤 수용체 항체 및 이의 조성물이 또한 제제의 효능을 강화시키고/시키거나 보충하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 예컨대 약학 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 조성물은 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 본원에 기술된 항체를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

키트

본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 또는 모든 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기술된 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 포함하는 하나 이상의 용기, 및 본원에 기술된 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일반적으로, 이들 설명서는 상기 치료적 처리를 위한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 투여에 대한 기술을 포함한다. 일부 양태에서, 단일-복용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트가 제공된다. 특정 양태에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기를 둘 다 함유할 수 있다. 특정 양태에서, 단일 및 다중-챔버의 사전-충전된 주사기(예컨대, 액체 주사기 및 리오시린지(lyosyringe))를 함유하는 키트가 포함된다.

일부 양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 단클론성 항체이다. 항-글루카곤 수용체 항체의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 복용량, 투여 계획 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 포장(예를 들어, 다중 용량 포장), 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에서 제공되는 설명서는 전형적으로는 라벨 또는 포장 삽입물(예를 들어, 키트 내에 포함된 종이 시트) 상의 서면 설명서이지만, 기계에서 판독가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상의 설명서)가 또한 허용된다.

본 발명의 키트는 적절한 포장재 내에 존재한다. 적절한 포장재는, 비제한적으로, 바이알, 병, 단지, 가요성 포장재(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장재가 또한 고려된다. 키트에 무균성 접근 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기가 정맥내 용액 백 또는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 용기에 또한 무균성 접근 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기가 정맥내 용액 백 또는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 하나 이상의 작용제는 항-글루카곤 수용체 항체이다. 용기는 제2 약학 작용제를 추가로 포함할 수 있다.

키트는 추가적인 성분, 예컨대 완충제 및 설명 정보를 선택적으로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.

생물학적 기탁

본 발명의 대표적인 물질은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러버드 10810 소재)에 2013년 1월 29일자로 기탁되었다. ATCC 기탁 번호 PTA-120164를 갖는 벡터 mAb5-LC는 mAb5 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 기탁 번호 PTA-120165를 갖는 벡터는 mAb5 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 기탁은 특허 절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약) 하에 수행되었다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양균을 유지함을 보증한다. 기탁은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC에 의해 이용가능하게 수행될 것이고, 리나트 뉴로사이언스 코프.(Riant Neuroscince Corp.)와 ATCC와의 계약에 의해 수행될 것이고, 이는 적절한 미국특허의 허여 시 또는 미국 또는 외국 특허출원의 최초 공개 시 기탁 배양균의 자손의 공중에의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 이에 대한 시행규칙(예컨대, 886 OG 638을 구체적으로 참고하는 37 C.F.R. 섹션 1.14)에 의해 결정된 자에게 자손의 이용가능성을 보장할 것이다.

본원의 양도인은, 기탁된 물질의 배양균이 적합한 조건 하에 배양되는 중에 죽거나 유실되거나 파괴되는 경우, 동일한 물질의 다른 것으로 통지 시 즉시 대체함에 동의하였다. 기탁된 물질의 이용가능성은 특허법에 따른 어떠한 정부의 권한 하에 허여된 권리에 위반하여, 본 발명을 실시하는 면허로 간주되어서는 안된다.

하기의 실시예는 설명의 목적을 위해서만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다. 실제로, 본원에서 제시되고 설명된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고, 첨부된 청구범위의 범주 내에 속할 것이다.

실시예

실시예 1: 항체 동역학 및 결합 친화도의 측정

본 실시예는 인간 및 사이노몰구스 원숭이(cyno) 글루카곤 수용체에 대한 항-글루카곤 수용체 항체의 항체 동역학 및 결합 친화도의 측정을 설명한다.

항-인간 Fc 센서 칩을, 바이아코어 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포를 400 mM EDC 및 100 mM NHS의 1:1(v/v) 혼합물로 10 μL/분의 유량에서 7분 동안 활성화시킴으로써 제조하였다. 염소 항-인간 Fc 항체[서던 바이오텍(Southern Biotech)]를 10 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0 중에서 50 μg/mL까지 희석시키고, 20 μL/분으로 7분 동안 모든 유동 세포 상에 주사하였다. 모든 유동 세포를 150 mM 보레이트 완충제 pH 8.5 중 100 mM 에틸렌다이아민으로 10 μL/분에서 7분 동안 차단하였다. 이러한 과정을 위해 진행하는 완충제는 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈(등록상표) 20, pH 7.4이었다.

하기 동력학 실험을 25℃ 및 37℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈(등록상표) 20, pH 7.4, 1 mg/mL BSA의 진행하는 완충제에 의해 수행하였다.

모든 실험을 바이아코어(상표) T200 표면 플라즈몬 공명 바이오센서[지이 라이프사이언시스(GE Lifesciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재] 상에서 수행하였다. 인간 및 사이노몰구스 원숭이(cyno) 글루카곤 수용체 세포외 도메인 인간 Fc 융합 단백질을 10 μL/분의 유량에서 3분 동안 2 μg/mL로 다운스트림 유동 세포(각각 유동 세포 2, 3) 상에 포획하였다. 유동 세포 1을 블랭크 기준 표면으로서 사용하였다. 글루카곤 수용체 Fc 융합 단백질의 포획에 이어서, 분석물(완충제 또는 mAb5 Fab)을 30 μL/분으로 모든 유동 세포 상에 2분 동안 주사하였다. 다수의 mAb5 Fab 분석물 농도를 시험하였다. mAb5 Fab 분석물 농도는 0.16, 0.8, 4, 20 및 100 nM이었다. 분석물 주사 후, 해리를 10분(20 nM 및 100 nM mAb5 Fab 분석물 샘플의 경우) 또는 30초(0.16, 0.8 및 4 nM mAb5 Fab 분석물 샘플의 경우) 동안 모니터링하였다. 해리를 완충제 분석물 사이클에 대한 30초 및 10분 동안 모니터링하였다. 분석물 결합 및 해리에 이어서, 모든 유동 세포를 75 mM 인산의 4회 1-분 주사에 의해 재생하였다. 센서그램 데이터를 곡선 정합 전에 이중 참고하였다(문헌[Myszka, D.G., 1999, J. Mol . Recognit ., 12:279-284]에 기술된 이중 참고). 이중 참고된 센서그램을 바이아코어(상표) T200 평가 소프트웨어를 사용하는 질량 수송 결합 모델에 의한 샘플 1:1 랭뮤어(Langmuir)에 전반적으로 정합시켰다. 인간 및 사이노몰구스 글루카곤 수용체에 결합하는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5에 대한 결합 친화도 데이터는 하기 표 4에 제시된다.

[표 4]

실시예 2: 세포 기반 기능 분석

본 실시예는 인간 글루카곤 수용체를 발현하는 세포에서의 글루카곤 신호전달에 대한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5의 효과를 설명한다.

본 연구를 위하여, cAMP 신호전달을 LANCE(등록상표) cAMP 키트(카탈로그 번호 AD0262E, 퍼킨 엘머 인코포레이티드(Perkin Elmer Inc.))를 사용하여, 인간 글루카곤 수용체로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주에서 측정하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 연속적으로 희석된 mAb5와 함께 항온처리하였다. 이어서, 세포를 200 pM 글루카곤(카탈로그 번호 22456, 아나스펙 인코포레이티드(AnaSpec, Inc.))으로 실온에서 30분 동안 자극하였다. 이어서, 검출 항체를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 공급된 검출 완충제로 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 암 조건 하에 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 VICTOR3(상표) 플레이트 판독기(퍼킨 엘머 인코포레이티드)에서 판독하였다. 결과를 도 1에 도시한다. 이러한 분석의 판독치가 표지된 외래 cAMP(665 nm에서 측정된)와 비표지된 외래 생성된 cAMP와의 경쟁에 기초하므로, 보다 높은 신호는 세포에 의해 생성된 보다 적은 cAMP를 나타낸다. mAb5는 복용량-의존 방식으로 cAMP 생성을 억제한다(도 1).

이러한 결과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5가 글루카곤 자극 후 글루카곤 수용체-매개된 cAMP 증가를 억제함을 증명한다.

실시예 3: 사이노몰구스 원숭이에서의 시험관내 효능

본 실시예는 사이노몰구스 원숭이에서 글루카곤 챌린지 후 혈장 글루코스 수준에 대한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 효과를 설명한다.

동물로의 글루카곤의 정맥내 볼루스 투여는 간에서의 글루카곤 신호전달의 결과로서 혈장 글루코스의 증가를 야기한다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 혈장 글루코스에서의 상승을 억제하는지 여부를 측정하기 위하여, 글루카곤 챌린지를 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 또는 PBS가 제공된 순결한 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 글루카곤 챌린지를 2개의 별개의 경우에 대해 원숭이에서 수행하였다: 하나의 글루카곤 챌린지를 원숭이가 3 mg/kg 또는 PBS(기준선)와 동 부피의 mAb5의 단일 정맥내 복용량을 수용하기 전 5일에 수행하였고, 제2 글루카곤 챌린지를 원숭이가 상기 mAb5 복용량 또는 PBS를 수용한 후 1시간에 수행하였다.

각각의 글루카곤 챌린지의 경우, 20 μg/kg 글루카곤[글루카겐(GlucaGen, 등록상표) 하이포키츠(Hypokits, 등록상표)]의 정맥내 볼루스를 시간 0에 투여하였다. 혈액 샘플을 하기 시점에서 모든 동물로부터 채취하였다: 챌린지 전, 및 챌린지 후 5, 15, 30, 45, 60 및 120분. 혈장 샘플을 임상 화학 분석기를 사용하여 혈장 글루코스 농도에 대해 분석하였다. 평균 절대 글루코스 값(mg/dL) +/- SEM 및 AUC(시간에 걸친 혈장 글루코스 내의 변동폭(excursion)을 반영하는 곡선 하 면적)는 표 5에 제시된다.

[표 5]

글루카곤 챌린지 1시간 전에 3 mg/kg mAb5로 처리된 동물은 78.83 +/- 5.44 챌린지 전, 92.00 +/- 4.88 mg/dL 챌린지 후 5분, 81.33 +/- 5.54 mg/dL 챌린지 후 15분, 69.00 +/- 4.66 mg/dL 챌린지 후 30분, 63.83 +/- 2.36 mg/dL 챌린지 후 45분, 및 63.17 +/- 3.15 mg/dL 챌린지 후 60분의 평균 혈장 글루코스 농도를 가졌다(표 5). 대조적으로, 글루카곤 챌린지 1시간 후 PBS 투여된 동물은 84.5 +/- 4.36 챌린지 전, 109.0 +/- 6.98 mg/dL 챌린지 후 5분, 118.5 +/- 9.79 mg/dL 챌린지 후 15분, 107.17 +/- 12.30 mg/dL 챌린지 후 30분, 98.33 +/- 12.08 mg/dL 챌린지 후 45분, 및 92.67 +/- 12.64 mg/dL 챌린지 후 60분의 평균 혈장 글루코스 농도를 가졌다(표 5). 따라서, 글루카곤 챌린지 후, 혈장 글루코스 수준은 PBS 대조군에 비해 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5로 처리된 동물에서 보다 적었다.

이러한 결과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 글루카곤 챌린지 후 글루코스 변동폭을 효과적으로 차단함을 증명한다.

실시예 4: 처리 후 간 기능 분석

본 실시예는 mAb5 글루카곤 수용체 차단 mAb를 높은 복용량으로 사용하는 만성 치료의 효과를 설명한다.

인간에서의 종전 임상 데이터는 글루카곤 수용체 소분자 길항제에 의한 4-주 치료가 특정 간 기능 시험(LFT), 구체적으로 알라닌 아미노전이효소(ALT) 및 아스파르테이트 아미노전이효소(AST)(LY 및 MK)에서의 상승을 야기할 수 있음을 증명하였다(예컨대, 문헌[Engel, S., et al., 2011, "Efficacy and tolerability of MK0893, a glucagon receptor antagonist, in patients with type 2 diabetes," ADA Symposium] 참고). 이러한 변화가 글루카곤 수용체가 소분자보다는 단클론성 항체에 의해 차단되는 장기 치료에 따라서 명백한지 여부를 처리하기 위하여, 4주에 걸친 사이노몰구스 원숭이에서의 mAb5의 매주 정맥내 볼루스 투여의 LFT 변수에 대한 효과를 평가하기 위한 연구를 수행하였다.

상기 실시예 3에 제시된 바와 같이, 단일 복용량의 3 mg/kg mAb5는 사이노몰구스 원숭이에서의 글루카곤 챌린지 후 글루코스 변동폭을 효과적으로 억제한다. 간 기능 연구의 경우, 100 mg/kg의 복용량이 항상 완전한 차단을 보장하기 위하여 선택되었다. 3마리의 마르고 순결한 암컷 원숭이는 1, 8, 15 및 22일에 100 mg/kg mAb5를 수용하였다. 대조군으로서, 3마리의 마르고 순결한 암컷 원숭이는 1, 8, 15 및 22일에에 PBS 대조군의 IV 볼루스를 수용하였다. 단식 혈청 샘플을 7, 14, 21 및 29일에 2개의 군으로부터의 모든 동물로부터 수집하고, 연구 개시 전에 동일한 동물로부터 채취한 처리 전 샘플(-6일)인 기준선과 비교하였다. ALT 및 AST 이외에, 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 감마-글루타밀전이효소(GGT)를 또한 임상 화학 분석기에 의해 측정하였다. ALT, AST ALP 및 GGT 시험 결과를 도 2 및 3에 제시하고, 하기 표 6에 요약한다.

[표 6]

표 6은 기준선(-6일) 및 연구 종료 시(29일)의 변수에 대한 평균(+/-SEM) 값을 나타낸다. 표 6에 보이는 바와 같이, PBS 대조군 동물 및 기준선 군 동물과 비교하여, mAb5로 처리된 동물(마지막 컬럼)에서 측정된 어떠한 LFT 변수에서도 유의한 변화가 존재하지 않았다.

이러한 결과는 높은 복용량의 mAb5 글루카곤 수용체 차단 항체에 의한 만성 치료가 간 기능에 해롭지 않음을 증명한다.

실시예 5: 치료 후 순환 지질 수준 분석

본 실시예는 높은 복용량의 mAb5 글루카곤 수용체 차단 mAb에 의한 만성 치료가 사이노몰구스 원숭이의 혈장 지질에서의 변화를 야기하지 않음을 설명한다.

인간의 종전 임상 데이터는 글루카곤 수용체 소분자 길항제에 의한 4주 치료가 LDL-콜레스테롤 수준에서의 복용량-의존성 10 내지 17% 평가(MK)와 관련 없음을 증명하였다(에컨대, 문헌[Ruddy, M. et al., 2011, "Inhibition of glucagon-induced hyperglycemia predicts glucose-lowering efficacy of the glucagon receptor antagonist, MK0893, in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM)," ADA Symposium] 참고). 이러한 변화가 글루카곤 수용체가 소분자보다는 단클론성 항체에 의해 차단되는 장기 처리에 따라서 명백한지 여부를 처리하기 위하여, 4주에 걸친 사이노몰구스 원숭이에서의 mAb5의 매주 정맥내 볼루스 투여 후 LDL-C 및 다른 순환 지질(총 콜레스테롤, HDL-C 및 트라이글리세라이드)에 대한 효과를 평가하기 위한 연구를 수행하였다.

3마리의 마르고 순결한 암컷 원숭이는 1, 8, 15 및 22일에 100 mg/kg mAb5를 수용하였다. 대조군의 경우, 3마리의 마르고 순결한 암컷 원숭이는 동일한 시점에 PBS 대조군의 IV 볼루스를 수용하였다. 단식 혈청 샘플을 7, 14, 21 및 29일에 2개의 군으로부터의 모든 동물로부터 수집하고, 연구 개시 전에 동일한 동물로부터 채취한 처리 전 샘플(-6일)인 기준선과 비교하고, 지질은 임상 화학 분석기에 의해 측정하였다. 본 연구로부터의 데이터를 표 7에 요약하고, 도 4 및 5에 제시한다.

[표 7]

표 7은 기준선(-6일) 및 연구 종료 시(29일)의 변수에 대한 평균(+/-SEM) 값을 나타낸다. 표 4 및 5는 -6, 7, 14, 21 및 29일에 대조군 및 mAb5-처리된 동물에서의 혈장 지질 수준을 나타낸다. PBS 대조군 동물 및 기준선 군 동물과 비교될 때, 어떠한 변화도 mAb5 처리된 동물에서 측정된 어떠한 순환 지질 변수에서 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 높은 복용량의 mAb5 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 만성 처리가 증가된 LDL-콜레스테롤과 관련 없음을 증명한다.

실시예 6: 2형 당뇨병의 마우스 모델에서의 생체내 효능

본 실시예는 2형 당뇨병의 마우스 모델에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 치료를 설명한다.

단식 마우스에서의 글루코스의 복강내 볼루스의 투여(글루코스 챌린지) 및 이어지는 클리어런스(clearance) 기간은 혈장 글루코스의 현저한 증가를 야기한다. 혈장 글루코스 수준(즉, 챌린지 직전) 및 투여된 글루코스 로드(load)를 취급하는 능력은 둘 다 고 지방 식이-공급 DIO(식이-유발 비만) 마우스에서 손상되었다. 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3에 의한 이들 동물의 사전-치료는 다음과 같이 수행되었다: 6주령부터 시작하여 C57Bl/6J 마우스(n = 5/군)에 고 지방 식이("HFD", 40 kcal % 지방)를 공급하였다. 12주령으로부터, 마우스를 HFD로 유지하였고, 하나의 군은 매주 1회 3 mg/kg mAb3의 복강내 주사를 수용한 반면, 제2 군은 유사한 부피의 PBS 비히클을 수용하였다. 3주의 치료 및 이어지는 18시간 밤새 단식 후, 글루코스(2 g/kg)의 복강내 볼루스를 모든 동물에 투여하였다(시간 = 0). 혈액 샘플을 하기 시점에서 모든 동물로부터 채취하였다: 챌린지 전, 및 챌린지 후 15, 30, 45, 60, 90 및 120분, 전혈 샘플을 핸드-헬드 원 터치(hand-held One Touch, 등록상표) 혈당측정기를 사용하여 혈장 글루코스 농도에 대해 분석하였다. 평균 절대 글루코스 값(mg/dL) +/- SEM 및 AUC(시간에 걸친 혈장 글루코스 내의 변동폭을 반영하는 곡선 하 면적)는 표 8에 제시된다.

[표 8]

항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3으로 치료된 동물은 PBS가 제공된 대조군 동물의 단식 혈당 수준인 156.80 +/- 11.41 mg/dL보다 상당히 낮은 128.80 +/- 12.92 mg/dL의 단식 혈당 수준을 가졌다(표 8, 컬럼 2). 또한, mAb3으로 처리된 동물은 PBS가 제공된 동물에 비해 글루코스 챌린지 후 보다 낮은 혈당 수준을 가졌다(표 8, 컬럼 3 내지 9). 이러한 값은 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 2형 당뇨병의 마우스 모델에서 글루코스 챌린지 시 유발된 혈장 글루코스의 변동폭 및 단식 혈당을 감소시킴을 증명한다.

실시예 7: 병용 치료

본 실시예는 마우스에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 및 mTOR 억제제에 의한 병용 치료를 설명한다.

설치류에서의 글루카곤 신호전달 차단은 췌장 알파(즉, 글루카곤-생산) 세포의 수 및/또는 크기에서의 결과적인 증가를 유발하는 것으로 종래 증명되었다(예를 들어, 문헌[Gelling et al., 2003, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100(3):1438-1443 (GCGR null mice)]; [Sloop et al., 2004, J. Clin . Invest. 113(11): 1571-1581 (antisense oligonucleotids)] 참고). 마우스에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3(매주 1회 복강내)은 유사하게 섬 당 알파 세포의 면적을 증가시키는 것으로 나타났고, 이는 알파 세포 수의 증가 및 평균 알파 세포 크기의 증가를 반영한다.

본 연구는 mAb3과의 병용-치료법으로서 mTOR 억제제 라파마이신의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 이러한 연구에서, 수컷 14주령 C57Bl/6J 마우스(n = 10/군)는 매주 1회 3 mg/kg mAb3의 복강내 주사, 또는 매일 10 mg/kg 라파마이신(물 중 5% 에탄올, 5.2% 트윈-80, 5.2% PEG 400에서 제형화됨)의 복강내 투여를 매주 1회 mAb3의 3 mg/kg 투여와 조합으로 수용하였다. 제3군은 대조군으로서 비히클을 수용하였다. 3주 치료 후, 동물을 희생시키고, 이의 췌장을 수집하고, 10% 중성 완충된 포르말린에 24시간 동안 고정시키고, 이어서, 파라핀 왁스에서 처리하고, 표준 과정에 따라 매립하였다. 섹션을 4 μm로 절단하고, 플러스 슬라이드에 장착하고, 37℃에서 밤새 건조하였다. 글루카곤(섬 알파 세포를 동정하기 위함) 및 인슐린(섬 베타 세포를 동정하기 위함)을 라이카 본드(Leica Bond, 상표) 자동화된 면역염색기[라이카 마이크로시스템스(Leica Microsystems), 미국 일리노이주 소재] 상에서의 순차적인 이중 표지 프로토콜을 사용하는 면역조직화학에 의해 췌장에서 검출하였다. 내인성 단백질을 사이토-Q 백그라운드 부스터[Cyto-Q Background Buster, 이노벡스 바이오사이언시스(Innovex Biosciences), 미국 캘리포니아주 소재]로 차단하였다. 항원 검색을 pH 6.0의 열 유도된 에피토프 검색(HIER) 완충제(라이카 마이크로시스템스, 미국 일리노이주 소재)를 20분 동안 사용하여 항-글루카곤 면역조직화학에 대해 수행하였다. 항-인슐린(다코(Dako), 미국 캘리포니아주 소재)을 본드(Bond, 상표) 인텐스 R 디텍션(Intense R Detection, 라이카 마이크로시스템스)과 함께 바이오티닐화된 염소 항-기니아 피그 IgG(다코, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 검출하고, 항-글루카곤(압캄(Abcam), 미국 매사추세츠주 소재)을 본드(상표) 폴리머 리파인 레드 키트(Polymer Refine Red Kit, 라이카 마이크로시스템스, 미국 일리노이주 소재)를 사용하여 검출하였다. 조직을 헤마톡실린(라이카 마이크로시스템스, 미국 일리노이주 소재)으로 대비염색시키고, 탈수시키고, 현미경 평가 전에 자일렌에 장착하였다. 항-글루카곤(벡터 레드) 및 항-인슐린(DAB)에 대해 염색된 췌장 IHC의 섹션을 함유하는 슬라이드를 다스펙트럼 카메라가 장착된 퍼킨 엘머 벡트라 자동화된 영상 시스템을 사용하여 저배율(4X) 및 고배율(20X)로 영상화시켰다. 저배율 및 고배율 이미지를 둘다 퍼킨 엘머(등록상표)의 임폼(InForm, 등록상표) 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 개별적인 섬의 상세한 분석을 고배율 다스펙트럼 이미지를 사용하여 수행하였다. 췌장 섹션 내의 각각의 섬의 이미지를 자동화된 방식으로 획득하고 분광 불혼화에 따라서 퍼킨 엘머(등록상표)의 인폼(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 조직의 모든 부적절한 영역을 제외하면서, 각각 항-글루카곤 또는 항-인슐린 염색을 사용하여 알파 또는 베타 세포의 영역을 정량하고 특징화시키는 알고리즘을 생성하였다. 각각의 영역 내의 핵의 수를 또한 헤마톡실린 대비염색을 사용하여 측정하고, 각각의 섬의 영역(알파/베타)에 대한 평균 세포 수 및 평균 세포 크기를 계산하는데 사용하였다.

연구 데이터는 하기 표 9에 요약된다. 알파 세포의 수(% 알파 세포 수/섬 +/- SEM으로서 정량화됨), 알파 세포가 차지하는 전체 면적(% 알파 세포 수/섬 +/- SEM으로서 정량화됨), 및 평균 알파 세포 크기(픽셀로서 측정됨)가 표에 제공된다.

[표 9]

비히클만이 투여된 마우스에 비해 증가된 알파 세포 수 및 알파 세포 크기가 mAb3으로 처리된 마우스에서 관찰되었다(표 9). 증가된 알파 세포 수 및 크기의 이러한 측정은 mAb3이 라파마이신 치료와 공동-투여되는 경우에는 부재하였다(표 9). 이러한 데이터는 mTOR 신호전달이 알파 세포 과형성을 매개하는 역할을 할 수 있음을 증명한다. 이러한 데이터는 또한 mTOR 억제제와의 공동-치료가 글루카곤 수용체 활성을 차단함으로써 유발된 비대 및 과형성을 감소시킴을 증명한다.

실시예 8: 간 기능 분석

본 실시예는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 사용하는 4주 치료의 간 기능에 대한 효과를 설명한다.

글루카곤 수용체 소분자 길항제를 사용하는 4주 치료가 특정 간 기능 시험(LFT), 구체적으로 알라닌 아미노전이효소(ALT) 및 아스파르테이트 아미노전이효소(AST)(LY 및 MK)의 증가를 야기할 수 있음이 종래 나타났다(예컨대, 문헌[Engel, S., et al., 2011, "Efficacy and tolerability of MK0893, a glucagon receptor antagonist, in patients with type 2 diabetes" ADA Symposium] 참고). 이러한 변화가 글루카곤 수용체가 소분자보다는 단클론성 항체에 의해 차단되는 장기 치료에 따라서 명백한지 여부를 처리하기 위하여, 4주에 걸친 야생형 및 고 지방 식이-공급(HFD), DIO(식이-유발 비만) 마우스에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 매주 복강내 투여의 LFT 변수에 대한 효과를 평가하기 위한 연구를 수행하였다.

본 연구에서, 야생형 및 HFD-DIO 마우스에 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3 또는 PBS 비히클(대조군)을 매주 10 mg/kg i.p.의 복용량으로 투여하였다. 사용된 10 mg/kg 복용량은 7일 이상의 기간(즉, 투여 간격) 동안 최대 글루코스 저하 효과를 발휘하는 것으로 나타났고, 이는 글루카곤 수용체가 본 연구에서 완전히 차단됨을 시사한다. 4주의 mAb3 치료 후, 단식 혈청 샘플을 수집하고, 하기 간 효소의 수준을 측정하였다: ALT, AST 및 ALP. 결과(군 당 평균 및 표준 오차(n = 10/군/마우스 모델))는 하기 표 10에 요약된다.

[표 10]

PBS 비히클 대조군 동물에서 측정된 LFT 변수와 비교하여, mAb3으로 치료된 동물에서 측정된 어떠한 LFT 변수(즉, ALT, ALP 및 AST 수준)에서도 유의한 변화가 존재하지 않았다(표 10).

이러한 결과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 사용하는 4주 치료가 간 기능에 해롭지 않음을 증명한다.

실시예 9: 간 기능 분석

본 실시예는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체를 사용하는 43주 치료의 간 기능에 대한 효과를 설명한다.

본 연구에서, 야생형 C57Bl/6 수컷 마우스를, 9주령에서 시작하여 52주령까지 43주 동안 계속되는, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3에 의한 장기 치료에 노출하였다(n = 9). 3 mg/kg 복용량의 mAb3을 매주 복강내 투여하였다. PBS 비히클을 대조 동물의 군에 투여하였다(n = 6). 연구의 종료 시, 단식 혈청 샘플을 수집하고, 하기 간 효소의 수준을 측정하였다: ALT, AST 및 ALP. 결과(군 당 평균 및 표준 오차)는 표 11에 요약된다.

[표 11]

동일한 기간에 걸쳐 PBS가 투여된 대조군 마우스에서 측정된 LFT 변수(즉, ALT, ALP 및 AST 수준)와 비교되는 경우, mAb3으로 치료된 마우스에서 측정된 어떠한 LFT 변수에서도 유의한 변화가 존재하지 않았다(표 11). 따라서, 동물의 총 수명의 상당한 부분을 나타내는 약 11개월의 기간 동안의 mAb3 글루카곤 수용체 차단 항체에 의한 치료는 간 기능의 효소 마커에 대한 어떠한 해로운 효과와도 관련되지 않았다.

이러한 효과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 장기 치료가 간 기능에 해롭지 않음을 증명한다.

실시예 10: 간 기능 분석

본 실시예는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 만성 치료의 효과를 설명한다.

항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5에 의한 13주 치료의 간 기능에 대한 효과를 처리하기 위한 연구를 수행하였다. 이러한 연구에서, 수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이에 mAb5를 13주에 걸쳐 피하(SC) 또는 정맥내(IV) 투여하였다.

3 mg/kg mAb5의 단일 복용량은 사이노몰구스 원숭이에서의 글루카곤 챌린지 후 글루코스 변동폭을 효과적으로 억제한다(상기 실시예 3 참고). 본 만성 연구를 위해 선택된 복용량은 10, 50 및 200 mg/kg이었고, 이들 각각은 글루카곤 신호의 완전한 차단를 제공할 것으로 기대된다.

4개 코호트의 마르고 순결한 원숭이(각각 성별에 따라 n = 3)는 총 13주 동안 매주 10 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 추가로 성별에 따라 5마리의 마르고 순결한 원숭이로 이루어진 6개 코호트는 각각 총 13주 동안 매주 50 mg/kg mAb5 IV 주사 또는 매주 200 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 대조군으로서, 성별에 따라 5마리의 마르고 순결한 원숭이는 13주 동안 IV 또는 SC 주사 경로에 의해 매주 비히클 주사를 수용하였다.

단식 혈청 샘플을 29, 57 및 93일에 모든 동물로부터 수집하고, 연구 개시 전(즉, -43 및 -8일)에 동일한 동물로부터 채취된 2개의 기준 치료 전 샘플과 비교하였다. ALT 및 AST 이외에, 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 감마-글루타밀전이효소(GGT)를 또한 임상 화학 분석기를 사용하여 측정하였다. ALT, AST, ALP 및 GGT 시험 결과(평균 +/- SEM)는 하기 표 12에 요약된다.

[표 12]

표 12는 기준선(-43 및 -8일) 및 투여 계획 전반에 걸친 월 간격(29, 57 및 93일)에서의 ALT, AST, ALP 및 GGT 수준에 대한 평균(+/-SEM) 값을 나타낸다. 비히클-치료된 대조군 동물 및 각각의 군의 자체 기준선 값과 비교하여, mAb5로 치료된 동물에서 측정된 어떠한 LFT 변수에서의 유의한 변화가 어떠한 복용량 수준/투여 경로에서도 존재하지 않았다(표 12).

이러한 결과는 고 복용량 mAb5 글루카곤 수용체 차단 항체에 의한 만성 치료가 간 기능에 해롭지 않음을 증명한다.

실시예 11: 순환 지질 수준 분석

본 실시예는 mAb5 글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 만성 장기 치료의 효과를 설명한다.

단클론성 항체에 의해 글루카곤 수용체를 차단하는 효과를 평가하기 위하여, 수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이에 13주 동안 주간 복용량의 mAb5를 투여하고, 순환 지질(총 콜레스테롤, LDL-C, HDL-C 및 트라이글리세라이드)에 대한 효과를 평가하였다.

각각 성별에 따라 3마리 동물을 포함하는 4개의 마르고 순결한 원숭이 코호트는 총 13주 동안 매주 10 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 추가로 성별에 따라 5마리의 마르고 순결한 원숭이로 이루어진 6개의 코호트는 각각 총 13주 동안 매주 50 mg/kg mAb5 IV 주사 또는 매주 200 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 대조군으로서, 성별에 따라 5마리의 마르고 순결한 원숭이는 13주 동안 매주 비히클 주사(IV 및 SC 경로 둘 다에 의함)를 수용하였다.

단식 혈청 샘플을 29, 57 및 93일에 모든 동물로부터 수집하고(대략 매달), 연구 개시 전(-43 및 -8일)에 동일한 동물로부터 채취된 2개의 기준 치료 전 샘플과 비교하였다. ALT 및 AST 이외에, 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 감마-글루타밀전이효소(GGT)를 또한 임상 화학 분석기에 의해 측정하였다. 본 연구로부터의 데이터(평균 +/- SEM)는 표 13에 요약된다.

[표 13]

표 13은 기준선(-43 및 -8일) 및 투여 계획 전반에 걸친 월 간격(29, 57 및 93일)에서 이들 변수에 대한 평균(+/-SEM) 값을 나타낸다. 비히클-치료된 대조군 동물 및 각각의 군의 자체 기준선 값과 비교하여, mAb5로 치료된 동물에서 측정된 어떠한 순환 지질 변수에서의 유의한 변화가 어떠한 복용량 수준/투여 경로에서도 존재하지 않았다(표 13).

이러한 결과는 고 복용량 mAb5 글루카곤 수용체 차단 항체에 의한 만성 치료가 LDL-C 또는 트라이글리세라이드의 해로운 증가를 야기하지 않음을 증명한다.

실시예 12: 알파 세포 과형성의 반전

본 실시예는 고 복용량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의해 치료된 대상에서 비대가 존재하거나 부재하는 췌장 알파 세포 과형성의 반전을 설명한다.

마우스 및/또는 래트에서의 글루카곤 신호전달의 차단이 순환 글루카곤 수준의 보충적인 증가(글루카곤과잉혈증) 및 췌장 알파 세포 수 및/또는 세포 크기의 증가를 야기하는 것으로 나타났다(예컨대, 문헌[Gelling et al., 2003, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 100(3):1438-1443 (GCGR null mice)]; [Sloop et al., 2004, J. Clin . Invest. 113(11): 1571-1581 (antisense oligonucleotides)]; [Gu et al., 2009, J. Pharmacol . Exp . Ther. 331(3): 871-881 (monoclonal antibody)] 참고). 상기 실시예 3에 제시된 바와 같이, 단일 복용량의 3 mg/kg mAb5는 사이노몰구스 원숭이에서의 글루카곤 챌린지 후 글루코스 변동폭을 효과적으로 억제하고, 이에 따라, 본 만성 연구를 위해 선택된 복용량(10, 50 및 200 mg/kg)은 글루카곤 신호의 완전한 차단을 생성하는 것으로 기대될 것이다.

이러한 연구에서, 각각의 성의 3마리 동물을 각각 포함하는 4개의 마르고 순결한 원숭이 코호트는 총 13주 동안 매주 10 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 각각의 성의 5마리의 마르고 순결한 원숭이로 이루어진 추가 6개 코호트는 각각 총 13주 동안 매주 50 mg/kg mAb5 IV 주사 또는 매주 200 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 대조군으로서, 각각의 성의 5마리의 마르고 순결한 원숭이는 13주 동안 매주 비히클 주사를 수용하였다(IV 및 SC 경로 둘 다에 의함).

투여 기간의 종료 시, 코호트 당 3개의 동물로부터의 췌장을 수집하고, 절개하고, 표준 H&E 및 항-글루카곤/항-인슐린 IHC 기술을 사용하여 염색하였다. 섬 알파 세포 과형성 및 비대에 대해 췌장을 검사하고 점수매겼다. 이어서, 선택된 코호트로부터의 각각의 성의 2마리 동물(대조군; 50 mg/kg IV; 200 mg/kg IV; 200 mg/kg SC)에 대해 항체 수준이 효능 있는 역치 미만으로 떨어지도록 하는 24주의 회수 기간(즉, mAb5 투여의 중단 후) 동안 수행하였다("항체 세척(washout)"). 이러한 항체 세척 기간의 종료 시, 이들 동물로부터의 췌장을 과형성 및 비대에 대해 유사하게 분석하였다. 본 연구로부터의 데이터는 표 14에 요약된다.

[표 14]

13주 시점에서 일부 동물에서 알파 세포 과형성 및/또는 비대의 증거가 존재한다(표 13, 첫 번째 8개 컬럼). 그러나, 알파 세포 과형성 및 비대 중 어느 것도 24주 항체 세척 기간의 종료 시 임의의 투여군으로부터의 임의의 동물에서 명백하지 않다(표 13, 마지막 4개 컬럼). 따라서, 고 복용량의 mAb5에 의한 만성 장기 치료가 비대가 존재하거나 부재하는 췌장 알파 세포 과형성을 야기할 수 있지만, 이러한 특징은 항체 세척에 따라서 완전히 가역적이다.

이러한 결과는, 치료 항체의 수준이 최소 효능 역치 미만으로 떨어지고 글루카곤 신호전달이 완화될 때, 사이노몰구스 원숭이에서의 mAb5 후 췌장 점의 알파 세포에서의 변화가 완전히 가역적임을 증명한다.

실시예 13: 간세포 글리코겐 침착의 반전

본 실시예는 고 복용량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의해 치료된 대상에서의 간세포 글리코겐 침착의 반전을 설명한다.

단일 복용량의 3 mg/kg mAb5는 사이노몰구스 원숭이에서의 글루카곤 챌린지 후 글루코스 변동폭을 효과적으로 억제한다(상기 실시예 3 참고). 이러한 만성 연구를 위해 선택된 복용량(10, 50 및 200 mg/kg)은 글루카곤 신호의 완전한 차단을 제공하는 것으로 기대될 것이다. 각각의 성의 3마리 동물을 각각 포함하는 4개 코호트의 마르고 순결한 원숭이는 총 13주 동안 매주 10 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 각각의 성의 4마리 마르고 순결한 원숭이의 추가 6개 코호트는 총 13주 동안 매주 50 mg/kg mAb5 IV 주사 또는 매주 200 mg/kg mAb5 IV 또는 SC 주사를 수용하였다. 대조군으로서, 각각의 성의 5마리 마르고 순결한 원숭이는 13주 동안 매주 비히클 주사를 수용하였다(IV 및 SC 경로 둘 다에 의함).

투여 기간의 종료 시, 코호트 당 3마리 동물로부터의 간이 수집되고, 고정되고, 절개되고, 표준 H&E 및 PAS 염색 기술에 의해 염색되었다. 간을 검사하고, 증가된 간세포 글리코겐 침착에 대해 점수매겼다. 이어서, 선택된 코호트로부터의 각각의 성의 2마리 동물(대조군; 50 mg/kg IV; 200 mg/kg IV; 200 mg/kg SC)에 대해 항체 수준이 효능 있는 역치 미만으로 떨어지도록 하는 mAb5 투여의 중단 후 24주의 회수 기간 동안 수행하였다("항체 세척"). 이러한 기간의 종료 시, 이들 동물로부터의 간을 유사하게 분석하였다. 본 연구로부터의 데이터는 표 15에 요약된다.

[표 15]

증가된 간세포 글리코겐이 13주 mAb5 처리 후 일부 동물에서 관찰되었다(표 15). 예를 들어, 10 mg/kg SC mAb5가 투여된 2마리 수컷, 50 mg/kg IV mAb5가 투여된 1마리 암컷, 200 mg/kg IV mAb가 투여된 3마리 수컷 및 2마리 암컷, 및 200 mg/kg SC mAb5가 투여된 2마리 수컷은 증가된 간세포 글리코겐에 대해 긍정적인 점수를 얻었다(표 15, 첫 번째 7개 컬럼). 그러나, 증가된 간세포 글리코겐의 어떠한 증거도 mAb5 세척 시간 후 임의의 투여군으로부터의 임의의 동물에서 관찰되지 않았다(표 15, 마지막 4개 컬럼). 따라서, 고 복용량의 mAb5에 의한 만성 장기 치료가 간세포 글리코겐 침착을 야기할 수 있지만, 이러한 변화는 항체 세척에 따라서 완전히 가역적이다.

이러한 결과는 치료 항체의 수준이 최소 효능 역치 미만으로 떨어지고 글루카곤 신호전달이 완화될 때, 사이노몰구스 원숭이에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 치료 후 간세포에서의 글리코겐 누적의 변화가 완전히 가역적임을 증명한다.

실시예 14: 2형 당뇨병의 마우스 모델에서의 생체내 효능

본 실시예는 2형 당뇨병의 마우스 모델에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 치료를 설명한다.

렙틴-결핍 수컷 ob/ob 마우스는 고혈당증, 고인슐린혈증 및 비만을 야기하는 현저한 과식증을 나타냈다. 이러한 연구에서, 수컷 ob/ob 마우스에 하기 복용량으로 단일 복용량의 mAb3을 투여하였다: 10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg(각각의 투여군 당 n = 5). 대조군 동물에 mAb3 대신에 PBS를 투여하였다. 혈액 샘플을 하기 시점에서 모든 동물로부터 채취하였다(공급된 상태에서): 투여 전, 및 투여 후 1, 2, 5, 6, 7, 9, 12, 13 및 20일. 전혈 샘플을 핸드-헬드 원 터치(등록상표) 혈당측정기를 사용하여 혈장 글루코스 농도에 대해 분석하였다. 평균 절대 글루코스 값 +/- SEM은 표 16에 제시된다.

[표 16]

표 16에 제시된 바와 같이, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3의 단일 복강내 주사의 투여는 처리 전 기준선 또는 비히클-처리된 군과 비교하여, 이들 마우스의 공급 혈당 수준에서 현저하고 지속적인 감소를 제공한다. 효과의 지속기간은 투여 반응을 나타냈고, 10 mg/kg 복용량은 가장 긴 효과 지속시간을 가지고, 1 mg/kg 복용량은 가장 짧은 효과 지속시간을 가졌다(표 16). 10, 3 또는 1 mg/kg의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3으로 처리된 동물은 mAb3 투여 1 및 2일 후 상당히 개선된 공급 글루코스 수준을 가졌다(표 16, 제2행 및 제3행).

단일 복용량의 10 또는 3 mg/kg mAb3은 글루코스 저하에서 상당한 최대 효과를 제공하였다. 예를 들어, 10 mg/kg mAb3에 의한 처리 6일 후, 마우스는 75.60 ± 7.71 mg/dL의 공급 혈당 수준을 가졌고, 3 mg/kg mAb3에 의한 치료 2일 후, 마우스는 79.20 ± 3.62 mg/dL의 공급 혈당 수준을 가졌다. 대조적으로, mAb3 대신에 PBS가 제공된 대조군 동물은 훨씬 큰 공급 혈당 수준을 가졌다: 투여 2일 후 261.80 ± 28.13 mg/dL, 및 투여 6일 후 241.20 ± 43.40 mg/dL. 1 mg/kg의 복용량은 보다 적은 효과를 제공하였다: 1 mg/kg mAb3에 의한 치료 2일 후, 마우스는 124.00 ± 8.79 mg/dL의 공급 혈당 수준을 가졌다. 0.3 mg/kg 복용량의 경우 어떠한 측정가능한 효과도 관찰되지 않았다.

5일까지, 1 mg/kg mAb3으로 처리된 동물의 글루코스 수준은 투여 전 수준으로 돌아갔다. 그러나, 3 또는 10 mg/kg mAb3으로 처리된 동물은 각각 투여 후 7일 및 12일까지 개선된 공급 글루코스 수준을 유지하였다(표 16, 제4행, 제6행 및 제8행).

이러한 결과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3이 2형 당뇨병의 마우스 모델에서의 공급 혈당 수준을 효과적으로 감소시킴을 증명한다.

실시예 15: 2형 당뇨병의 마우스 모델에서의 생체내 효능

본 실시예는 당뇨병의 마우스 모델에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체에 의한 치료의 생체내 효능을 설명한다.

HFD-DIO 및 ob/ob 마우스가 2형 당뇨병의 모든 요소가 아닌 경우 일부를 수용한 모델이다. 이러한 모델 둘 다 명백한 비만을 나타낸다. 2개의 모델 유형의 3개월령 수컷 마우스에 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3 또는 PBS를 투여하였다(n = 10/군/마우스 모델). mAb3을 4주에 걸쳐 매주 복강내 주사에 의해 10 mg/kg으로 투여하였고; PBS를 대조군 동물에게 유사한 방식으로 투여하였다. 각각의 마우스의 체중을 1, 2 및 3주의 치료 종료 시 측정하였다. 각각의 시점에서, 각각의 개별 마우스의 체중을 이의 투여 전 출발 체중의 %로서 표시하였다. 각각의 군에 대한 평균 체중 ± SEM을 측정하였다. 결과는 표 17에 요약된다.

[표 17]

10 mg/kg의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3으로 처리된 HFD-DIO 및 ob/ob 마우스는 둘 다, PBS로 처리된 마우스와 비교하여, 4주의 연구 지속기간에 걸쳐 상당히 적은 체중 증가를 가졌다(표 17). 예를 들어, HFD-DIO 마우스에서, mAb3으로 처리된 동물은 기준선의 114.99 ± 1.23%의 평균 체중을 가졌고, 기준선의 119.42 ± 1.41%의 평균 체중을 갖는, PBS가 제공된 동물과 비교되었다. 요약하면, mAb3에 의한 처리는 PBS-처리된 마우스에 비해 HFD-DIO 마우스 및 ob/ob 마우스 둘 다에서 체중 증가를 상당히 감소시켰다.

이러한 결과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 2형 당뇨병의 2개의 상이한 마우스 모델에서 체중 증가를 감소시킬 수 있음을 증명한다.

실시예 16: 병용 치료

본 실시예는 마우스에서 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 및 mTOR 억제제에 의한 병용 치료를 설명한다.

설치류에서의 글루카곤 신호전달의 차단은 췌장 알파(즉, 글루카곤-생산) 세포의 수 및/또는 크기에서의 결과적인 증가를 야기하는 것으로 종래 증명되었다(예컨대, 문헌[Gelling et al., 2003, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100(3):1438-1443 (GCGR null mice)]; [Sloop et al., 2004, J. Clin . Invest. 113(11): 1571-1581 (antisense oligonucleotides)]; [Gu et al., 2009, J. Pharmacol . Exp . Ther. 331(3): 871-881 (monoclonal antibody)] 참고). 마우스에서의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3(매주 1회 i.p.)의 투여는 유사하게 섬 당 알파 세포의 수 및 총 면적을 증가시키는 것으로 나타났고, 이는 알파 세포 수의 증가 및 평균 알파 세포 크기의 증가를 나타낸다.

본 연구에서, 12주령의 수컷 HFD-DIO 마우스(군 당 n = 5)는 매주 1회 3 mg/kg mAb3의 복강내 주사, 또는 매일 10 mg/kg 라파마이신(5% 에탄올, 5.2% 트윈-80, 물 중 5.2% PEG 400)의 복강내 투여를 매주 1회 3 mg/kg 복용량의 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb3과 조합으로 수용하였다. 제3군은 대조군으로서 PBS를 수용하였다.

3주 치료 후, 상기된 바와 같이, 동물을 희생시키고, 이의 췌장을 수집하고, 고정하고, 절개하고, 글루카곤(섬 알파 세포를 동정하기 위함) 및 인슐린(섬 베터 세포를 동정하기 위함)에 대해 염색하였다. 조직의 모든 부적절한 영역을 제외하면서, 각각 항-글루카곤 또는 항-인슐린 염색을 사용하여 알파 또는 베타 세포의 영역을 정량하고 특징화시키는 알고리즘을 생성하였다. 각각의 영역 내의 핵의 수를 또한 헤마톡실린 대비염색을 사용하여 측정하고, 각각의 섬의 영역(알파/베타)에 대한 평균 세포 수 및 평균 세포 크기를 계산하는데 사용하였다.

연구 데이터는 하기 표 18에 요약된다. 표 18은 % 알파 세포 수/섬 +/- SEM으로서 정량화된 알파 세포의 수, (b) % 알파 세포 면적/섬 +/- SEM으로서 정량화된 알파 세포가 차지하는 전체 면적, 및 (c) 픽셀로서 측정된 평균 알파 세포 크기를 제공한다.

[표 18]

비히클만이 투여된 마우스에 비해 증가된 알파 세포 수(알파 세포 과형성) 및 알파 세포 크기(알파 세포 비대)가 mAb3으로 치료된 HFD-DIO 마우스에서 관찰되었다(표 18). 그러나, 증가된 알파 세포 수 및 크기의 측정은 mAb3이 라파마이신 치료와 공동-투여되는 경우 HFD-DIO 마우스에서 부재하였다(표 18, 마지막 행).

이러한 데이터는 mTOR 신호전달이 알파 세포 과형성을 매개하는데 역할을 할 수 있음을 증명한다. 이러한 데이터는 또한 mTOR 억제제에 의한 공동-치료가 글루카곤 수용체 활성을 차단함으로써 유발된 비대 및 과형성을 감소시킴을 증명한다.

실시예 17: 사이노몰구스 원숭이의 생체내 효능

본 실시예는 사이노몰구스 원숭이에서의 글루카곤 챌린지 후 혈장 글루코스 수준에 대한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 효과를 설명한다.

동물에 대한 글루카곤의 정맥내 볼루스의 투여는 간에서의 글루카곤 신호전달의 결과로서 혈장 글루코스의 증가를 야기한다(글루카곤 챌린지). 생체내 급성 글루카곤 신호전달의 차단에 효과적인 mAb5의 복용량을 측정하기 위하여, 글루카곤 챌린지 패러다임을 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5가 1, 3 또는 30 mg/kg으로 글루카곤 챌린지가 수행되기 1시간 전에 제공된 마르고 순결한 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 동물의 각각의 코호트에 대해, 글루카곤 챌린지를 2개의 별개의 경우에 대해 수행하였다: 투여 후 반응이 비교되는 각각의 동물에 대한 투여 전 기준선을 확립하기 위해 원숭이가 mAb5를 수용하기 전 5일에서의 제1 챌린지, 및 원숭이가 mAb5 복용량을 수용한 후 1시간에서의 제2 챌린지.

각각의 글루카곤 챌린지를 위해, 20 μg/kg 글루카곤(글루카겐(등록상표) 하이포키츠(등록상표))의 IV 볼루스를 시간 0에서 투여하였다. 혈액 샘플을 하기 시점에서 모든 동물로부터 채취하였다: 챌린지 직전, 및 챌린지 후 5, 15, 30, 45, 60 및 120분. 혈장 샘플을 임상 화학 분석기에 의해 혈장 글루코스 농도에 대해 분석하였다. 결과(글루코스 수준의 평균 변화 +/- SEM, mg/dL)는 표 19에 요약된다. 이의 출발 혈당 수준에서의 동물간(inter-animal) 변이성에 기인하여, 데이터는 챌린지 전 값으로부터의 절대 글루코스 값의 변화로서 제시된다.

[표 19]

각각의 군에서, -5일에, 사전 mAb5 치료가 없는 글루카곤 챌린지는 혈장 글루코스 수준의 증가를 야기하였고, 이는 글루카곤 자극(기준선)의 결과로서 글루코스 생산 및 산출을 증가시키는 간의 생리학적 반응을 나타낸다(표 19, "기준선에서의 GC "로 표시된 행). 글루코스 수준은 글루카곤 챌린지 후 15분에서 가장 높고, 일반적으로 챌린지 전으로 돌아가거나, 심지어 챌린지 후 60 내지 120분에 보다 적은 수준으로 돌아간다.

글루카곤 챌린지 전 1시간에서의 mAb5에 의한 치료는 글루카곤 챌린지에 대하여, 기준선 반응에 비해 현저한 글루코스 반응의 억제를 야기하였다(표 19, "GC mAb5 후 1시간"으로 표시된 행). 이러한 군에서의 피크 글루코스 변동폭은 최소이고, 일부 경우에, 부정적이고, 일반적으로 보다 이른 시점에서 관찰되고, 챌린지 전 수준보다 실제로 낮거나 통상적이도록 더욱 신속하게 돌아간다. 예를 들어, GC 후 15분(글루코스 수준이 기준선 챌린지 동안 가장 높은 시간)에서 30 mg/kg mAb5로 처리된 동물의 혈당 수준은 챌린지 전보다 낮은 16.67 ± 14.17 mg/dL이었다. 그러나, mAb5 치료가 없는 GC 후 15분에서, 이러한 동일한 동물의 혈당 수준은 챌리지 전보다 높은 45.67 ± 6.84 mg/dL이었다. GC 후 10분에서, 3 mg/kg mAb5로 치료된 동물의 혈당 수준은 챌리지 전보다 높은 16.25 ± 22.45 mg/dL이었다. 대조적으로, mAb5 치료가 없는 GC 후 15분에서, 이러한 동일한 동물의 혈당 수준은 챌린지 전보다 높은 56.75 ± 26.52 mg/dL이었다. GC 후 15분에서, 1 mg/kg mAb5로 치료된 동물의 혈당 수준은 챌린지 전보다 높은 1.00 ± 14.73 mg/dL이었다. 대조적으로, mAb5 치료가 없는 GC 후 15분에서, 이러한 동일한 동물의 혈당 수준은 챌린지 전보다 높은 52.00 ± 14.19 mg/dL이었다. 30, 3 또는 1 mg/kg mAb5의 투여는 어떠한 투여 반응도 없는 본 패러다임에서의 유사한 효능을 나타냈다.

이러한 결과는 mAb5가 생체내 글루카곤 신호전달을 차단하는 효능이 있고, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 글루카곤 챌린지 후 글루코스 변동폭을 효과적으로 차단함을 증명한다.

실시예 18: 사이노몰구스 원숭이의 생체내 효능

본 실시예는 사이노몰구스 원숭이에서의 글루카곤 챌린지 후 혈장 글루코스 수준에 대한 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 효과를 설명한다.

동물에 대한 글루카곤의 정맥내 볼루스의 투여는 간에서의 글루카곤 신호전달(글루카곤 챌린지)의 결과로서 혈장 글루코스의 증가를 야기한다. 생체내 급성 글루카곤 신호전달을 차단하는데 효과적일 수 있는 mAb5의 다른 복용량을 결정하기 위하여, 글루카곤 챌린지 패러다임을 항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5가 1.78, 0.24 또는 0.026 mg/kg으로 글루카곤 챌린지가 수행되기 1시간 전에 제공된 마르고 순결한 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 동물의 추가 코호트는 PBS 비히클만을 수용하였다(n = 4/군). 동물의 각각의 코호트를 위하여, 글루카곤 챌린지를 3개의 별개의 경우에 대해 수행하였다: 원숭이가 각각의 동물에 대한 투여 전 기준선을 확립하고 모든 동물이 글루카곤-반응성임을 보장하기 위해 mAb5를 수용하기 전 3일에서의 제1 챌린지; 원숭이가 mAb5 복용량을 수용한 후 1시간에서의 제2 챌린지; 및 원숭이가 mAb5 복용량을 수용한 후 1주에서의 제3 챌린지.

각각의 글루카곤 챌린지를 위하여, 20 μg/kg 글루카곤(글루카겐(등록상표) 하이포키츠(등록상표))의 IV 볼루스를 시간 0에 투여하였다. 혈액 샘플을 하기 시점에서 모든 동물로부터 채취하였다: 챌린지 전, 및 챌린지 후 5, 15, 30, 45, 60 및 120분. 혈장 샘플을 임상 화학 분석기를 사용하여 혈장 글루코스 농도에 대해 분석하였다. 제2 및 제3 챌린지로부터의 결과(글루코스 수준에서의 평균 변화 +/- SEM, mg/dL)는 표 20에 요약된다. 이들 출발 혈당 수준에서의 동물간 변이성에 기인하여, 데이터는 상기 날짜에 채취된 챌린지 전 값으로부터의 절대 글루코스 값의 변화로서 제시된다.

[표 20]

mAb5로 치료된 동물의 혈당 수준에서의 글루카곤 챌린지(GC) 후 변화를 동일한 날짜에 GC를 수용하는 PBS로 사전-처리된 동물의 혈당 수준에서의 변화와 비교할 수 있다(표 20). 피크 글루코스 수준을 일반적으로 5분 시점에서 관찰하였다. GC 동안 0.026 및 0.24 mg/kg의 mAb5 투여 후 1시간에서, 있더라도 단지 매우 적은 글루코스 반응 감소가 관찰되었다. 예를 들어, 0.026 및 0.24 mg/kg mAb5에 의한 치료 후 1시간에서 챌린징된 동물에서, 각각 30.25 ± 6.65 mg/dL 및 44.25 ± 6.21 mg/dL의 혈당 수준의 증가가 피크 글루코스 수준에서 관찰되었고, 이는 mAb5 대신에 PBS가 제공된 동물에서의 34.75 ± 5.57 mg/dL의 증가와 비교된다(표 20). 8일까지, 0.026 및 0.24 mg/kg mAb5 투여군에서의 반응은 대조군 동물과 유사하였다.

그러나, 1.78 mg/kg mAb5 치료군에서, 투여 후 1시간에서의 글루카곤 반응의 중간 억제가 관찰되었다. 1.78 mg/kg mAb5에 의해 치료된 동물에서, 혈장 글루코스 수준은 다른 군보다 낮고, 5분에서 가장 높고(22.25 ± 1.49 mg/dL), 챌린지 후 30 내지 45분까지 기준선으로 회복되거나 이보다 낮았다(표 20). 글루카곤 반응의 이러한 억제는, 심지어 반복적인 글루카곤 챌린지가 mAb5의 투여 후 7일에 수행되는 경우에도 관찰되었다(표 20). 1.78 mg/kg mAb5의 상당한 치료 효과가 또한 비히클 처리된 군의 혈장 글루코스 수준(85.50 ± 8.17 mg/dL)에 비해 사전-챌린지(즉, 단식) 혈장 글루코스 수준을 감소시키는 것이 명백하였다(60.0 ± 3.79 mg/dL).

이러한 결과는 항-글루카곤 수용체 길항제 항체가 글루카곤 챌린지 후의 글루코스 변동폭을 효과적으로 차단함을 증명한다.

실시예 19: 에피토프 매핑

항-글루카곤 수용체 길항제 항체 mAb5의 결정 구조 및 mAb5:글루카곤 수용체 복합체의 결정 구조가 사용되어 mAb5에 의해 인식된 인간 글루카곤 수용체 상의 에피토프를 특징화시켰다. 결합에 관여하는 글루카곤 수용체 잔기는 mAb5:글루카곤 수용체 결정 구조와 글루카곤 수용체 구조 단독 사이의 접근성 표면적의 차이를 계산함으로써 동정되었다. mAb5 항체와의 복합체 형성 시 파묻힌 표면적을 나타내는 글루카곤 수용체 잔기는 에피토프의 부분으로서 포함되었다. 단백질의 용매 접근성 표면을, 단백질의 반 데르 발스(Van der Waals) 표면 상에서 회전하므로, 프로브 구체(1.4A 반지름의 용매 분자를 나타냄)의 중심의 자리로서 정의하였다. 용매 접근성 표면적을 각각의 원자 주위의 연장된 구체 상에 (원자 및 프로브 반지름의 합계와 동등한 원자 중심으로부터의 거리에서) 표면 점을 생성하고, 프로그램 모델러(MODELLER)에서 실행된 이웃 원자와 결합하는 등가 구체 내에 위치하는 것을 제거함으로써, 계산하였다(문헌[A. Sali & T.L. Blundell. J. Mol. Biol. 234, 779-815, 1993] 참고). 결정 구조 분석에 기초하여, mAb5에 의해 인식된 글루카곤 수용체 상의 구조적 에피토프는 인간 글루카곤 수용체(서열번호 1)의 위치 31, 33 내지 38, 40 내지 42, 44, 45, 48, 62 및 64에서 아미노산 잔기를 포함한다.

큰 단백질-단백질 계면의 결합 에너지를 억제하는 잔기의 주체성은 "기능성 에피토프"로 지칭된다(문헌[Cunningham, B. C. and Wells, J. A., 1993, J. Mol. Biol., 234, 554-563]). 상호작용의 친화도(및, 이에 따라, 생물학적 특이성)는 결과적으로 리간드 및 수용체의 기능성 에피토프의 구조적인 상보성에 의해 정의된다. 상세한 돌연변이유발 연구는 사이토카인 및 수용체의 기능성 에피토프를 구성하는 가장 중요한 잔기가 비-극성 측쇄, 예컨대 트립토판, 비-극성 측쇄 또는 폴리펩티드 골격의 지방족 성분을 포함하는 소수성 접촉부임을 나타냈다. 상기 비-극성 "코어"는 결합 에너지에 대해 보다 덜 중요한 극성 잔기의 할로로 둘러싸인다. 동역학 연구는 기능성 에피토프의 주요 역할이 복합체의 해리 속도를 감소시킴으로써 단백질-단백질 상호작용을 안정화시키는 것임을 나타낸다. 사이토카인과 수용체 사이의 초기 접촉이, 많은 불안정한 접촉을 생성하는 단백질 표면의 임의 확산 또는 "롤링(rolling)"에 의해 지배됨을 시사하였다. 이때, 상기 복합체는 수용체 및 리간드의 기능성 에피토프가 관여하는 경우 안정화된다(예컨대, 문헌[Bravo and Heath, 2000, EMBO J. 19:2399-2411] 참고).

효모 디스플레이가 mAb5에 의해 인식된 글루카곤 수용체 상의 기능성 에피토프에 포함된 아미노산 잔기를 결정하는데 사용되었다. 글루카곤 수용체 세포외 도메인(GCGR-ECD)의 단일 점 돌연변이체의 라이브러리가 효모 세포 상에 표시되었다. 이어서, GCGR-ECD-발현 효모 세포("원래 라이브러리")가 형광-표지된 mAb5, 또는 형광-표지된 비-mAb5 항-글루카곤 수용체 항체의 풀과 함께 항온처리되었다. 야생형 글루카곤 수용체가 양성 대조군으로서 사용되었다. 야생형 GCGR-ECD에 비해 감소된 항체 결합을 갖는 GCGR-ECD 돌연변이체를 표시하는 효모 세포는 FACS에 의해 단리되었다. 이러한 세포 집단("강화된 라이브러리")은 강하게 서열화되었고, 데이터가 각각의 돌연변이체의 강화를 측정하기 위해 분석되었다. 강화는 원래 라이브러리에서의 발생을 기준으로 하는 강화된 라이브러리(FACS 단리 후)에서의 특정 돌연변이체의 발생으로서 정의되고, 예컨대 4.0의 강화는 돌연변이체가 원래 라이브러리에서 발견되는 빈도의 4배의 빈도로 강화된 라이브러리에 존재함을 의미한다. 보다 큰 강화는 보다 작은 결합 친화도를 갖는 GCGR-ECD 돌연변이체에 상응한다. 3개의 상이한 라운드 사이에 일관성을 갖는 3개의 라운드의 패닝(panning)이 수행되었다. 표 21은 효모 디스플레이 분석의 결과를 요약한다.

[표 21]

임의의 라운드에서 3보다 큰 강화를 갖는 돌연변이된 위치가 mAb5에 의해 인식된 글루카곤 수용체 상의 기능성 에피토프인 것으로 간주된다. 효모 디스플레이 분석에 기초하여, BmAb5에 의해 인식된 글루카곤 수용체 상의 기능성 에피토프는 서열번호 1의 위치 33, 36, 38, 41, 44, 45 및 60에서 아미노산 잔기를 포함한다(표 21, 굵은 글씨체의 위치). 위치 60은 구조적 에피토프에서 또한 발견되지 않는 유일한 강화된 잔기이고; 이는 또한 비-mAb5 항체의 풀에서 강화되고, 이러한 위치에서의 잔기가 단백질 폴딩을 교란함을 증명하는 것을 나타낸다.

분석을 수행하여 돌연변이체 라이브러리 및 구조적 에피토프에서의 어떠한 위치가 강화되지 않았는지 측정하였다. 구조적 에피토프 내의 15개 위치 중 11개의 위치가 또한 돌연변이체 라이브러리에 존재한다. 이러한 11개의 위치 중 6개의 위치가 강화된다. 기능성 에피토프 내의 5개의 비-강화된 위치는 31, 34, 42, 48 및 64이다. 모든 비-강화된 위치는 구조적 에피토프의 주변부에 위치한다.

개시된 교시내용이 다양한 용도, 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 기술되었지만, 본원의 교시내용 및 하기 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기의 예는 개시된 교시내용을 더 잘 설명하기 위해 제공되고, 본원에 제시된 교시내용의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 교시내용이 이러한 예시적인 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 이러한 예시적인 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 이러한 모든 변경 및 변형이 본 교시내용의 범주 내에 속한다.

특허, 특허 출원, 논문, 교재 등이 포함되는 본원에서 인용된 모든 참고문헌 및 이에 인용된 참고문헌은, 이들이 이미 혼입되어 있는 정도까지, 참고로 전체 내용이 본원에 혼입된다. 비제한적으로 정의된 용어, 용어 용법, 기술된 기술 등을 비롯한 하나 이상의 혼입된 문헌 및 유사한 자료가 본원과 다르거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.

상기의 설명 및 실시예는 본 발명의 특정한 구체적인 양태를 상술하고, 본 발명가들에 의해 구현된 최적의 양식을 기술한다. 그러나, 이들이 명세서에서 아무리 상세하게 나타날 수 있을지라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실행될 수 있고, 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라 본 발명이 해석되어야 함이 이해될 것이다.

ATCC PTA-120164 20130129 ATCC PTA-120165 20130129

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Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Tyr Asp Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Arg Gly Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Asp 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Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Tyr Asp Phe Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Leu Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 83 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Asp Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Leu Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 84 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Leu Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Tyr Asp Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Arg Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 86 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Asp Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Arg Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 87 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Asp Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Arg Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 88 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 88 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Asp Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Ser Arg Tyr Trp Ser Tyr Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 89 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Arg Thr Ala 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Trp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa can be K or R <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa can be V or I <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa can be T or S <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa can be V or L <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa can be V or N <400> 90 Xaa Ala Ser Gln Asn Xaa Arg Xaa Ala Xaa Xaa 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa can be S or T <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa can be S or G <400> 91 Leu Ala Xaa Asn Arg His Xaa 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa can be L or Q <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa can be T or S <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa can be T or S <400> 92 Xaa Gln His Trp Xaa Tyr Pro Phe Xaa 1 5 <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa can be T or S <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa can be T or S <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa can be T or S <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa can be S or T <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa can be D or Q <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa can be D or N <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa can be K or Q <400> 93 Trp Ile Asn Xaa Glu Xaa Asp Glu Xaa Xaa Tyr Ala Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa can be T or S <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa can be Y or V <400> 94 Ser Arg Gly Trp Xaa Tyr Gly Pro Pro Asp Xaa 1 5 10

Claims (34)

1. 글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하는 단리된 길항제 항체로서,
   서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및
   서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL
   을 포함하는 단리된 길항제 항체.
2. 제1항에 있어서,
   서열번호 24, 서열번호 16 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 18 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 길항제 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 VH를 포함하되, CDR에 존재하지 않는 잔기에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 단리된 길항제 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하되, CDR에 존재하지 않는 아미노산에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 단리된 길항제 항체.
5. 제1항에 있어서,
   서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 길항제 항체.
6. 제5항에 있어서,
   서열번호 87 또는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 길항제 항체.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   면역학적 불활성 불변 영역을 추가로 포함하는 단리된 길항제 항체.
8. 제7항에 있어서,
   IgG₂, IgG_2Δa, IgG₄, IgG_4Δb, IgG_4Δc, IgG₄ S228P, IgG_4Δb S228P 및 IgG_4Δc S228P로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소타입을 갖는 단리된 길항제 항체.
9. 제7항에 있어서,
   불변 영역이 비당화(aglycosylating)된 Fc인, 단리된 길항제 항체.
10. 제1항에 있어서,
    항체의 각각의 CDR이 CDR의 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 카바트 정의 및 코티아 정의의 조합, AbM 정의 또는 콘택트(contact) 정의에 따라 정의되는, 단리된 길항제 항체.
11. 글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하고, 제1항에 따른 단리된 길항제 항체에 의해 인식되는 글루카곤 수용체 상의 에피토프와 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합하는 단리된 길항제 항체.
12. 제11항에 있어서,
    서열번호 1의 글루카곤 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 31, 33 내지 38, 40 내지 42, 44, 45, 48, 62 및 64를 포함하는 인간 글루카곤 수용체 상의 에피토프를 인식하는 단리된 길항제 항체.
13. 제11항에 있어서,
    서열번호 1의 글루카곤 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 33, 36, 38, 41, 44 및 45를 포함하는 인간 글루카곤 수용체 상의 기능성 에피토프를 인식하는 단리된 길항제 항체.
14. 제11항에 있어서,
    서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 길항제 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 단리된 세포주.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
17. 제16항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
18. 제17항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주를 상기 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 생산 방법.
21. 서열번호 87 또는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포주를 상기 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 항-글루카곤 수용체 길항제 항체의 생산 방법.
22. 제21항에 있어서,
    중쇄 및 경쇄가 별개의 벡터 상에서 코딩되는, 생산 방법.
23. 제21항에 있어서,
    중쇄 및 경쇄가 동일한 벡터 상에서 코딩되는, 생산 방법.
24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
25. 제24항에 따른 약학 조성물을 포함하는, 비정상 혈당 수준과 관련된 병태의 치료를 위한 키트.
26. 개체에서 혈당 수준이 저하되고/되거나 내당능이 개선되고/되거나 글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태와 관련된 하나 이상의 증상이 개선되도록 효과량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 혈당을 저하시키고/시키거나 내당능을 개선하고/하거나 상기 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
27. 제26항에 있어서,
    병태가 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 고혈당증, 고인슐린혈증, 공복혈당장애, 내당능장애, 이상지질혈증 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    효과량의 제2 치료제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
29. 제28항에 있어서,
    제2 치료제가 인슐린, mTor 억제제, 바이구아니드, 설포닐우레아, PPAR 감마 작용제, 알파 글루코시다제 억제제, 엑세나티드, 심린, 글루카곤 길항제 및 제2 글루카곤 수용체 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
30. 제29항에 있어서,
    바이구아니드가 메트포민인 방법.
31. 제29항에 있어서,
    mTor 억제제가 라파마이신, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스 및 ATP-경쟁적 mTOR 키나제 억제제(TKI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
32. 제31항에 있어서,
    TKI가 토린 1, 토린 2, PP242, PP30, KU0063794, WAY-600, WYE-687, WYE-354, OSI-027, AZD-8055, KU-BMCL-200908069-1, 와이어쓰-BMCL-200908069-2, XL-388, INK-128 및 AZD-2014로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
33. 인간에서 1형 또는 2형 당뇨병의 치료 또는 예방 또는 체중 감량의 달성을 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
34. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    글루카곤 수용체에 의해 매개된 병태의 치료에 사용하기 위한 단리된 길항제 항체.

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