KR101508397B1 - 염증성 장 질환의 검출 방법 - Google Patents

염증성 장 질환의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대조군과 비교하여 포유동물의 조직 또는 세포에서 LY6 유전자의 증가된 발현을 검출함으로써 포유동물의 위장관 조직 또는 세포에서 염증성 장 질환의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
LY6 유전자 발현, 유전자 발현 프로파일, 염증성 장 질환

Description

염증성 장 질환의 검출 방법{METHODS FOR DETECTING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE}
본 발명은 염증성 장 질환 발병기전에서의 유전자 발현 프로파일에 관한 것이다. 이러한 발견은 염증성 장 질환의 검출 및 진단에서 용도가 발견된다.
미국에서 약 100만명의 환자가 앓고 있는 위장관의 만성 염증성 장애인 염증성 장 질환 (IBD)은 2가지 주요 군으로 구성된다: 궤양성 대장염 (UC) 및 크론병 (CD). IBD의 양쪽 형태 모두에서, 장의 미생물이 유전학적으로 감수성인 개체에서 질환을 개시시킬 수 있다. UC는 종종 결장에 한정되는 한편, CD는 소장의 회장 및 결장에서 전형적으로 발생한다 ([Podolsky, D.K., N. Engl. J. Med. 347:417-429 (2002)]). IBD 환자로부터의 조직의 유전자 발현 프로파일링(profiling)은 치료법 및/또는 진단에 대한 가능한 표적에 대한 약간의 식견을 제공하였다 (예를 들어, [Dieckgraefe, B.K. et al., Physiol. Genomics 4:1-11 (2000)]; [Lawrance I.C. et al., Hum Mol Genet. 10:445-456 (2001)]; [Dooley T.P. et al., Inflamm. Bowel Dis. 10:1-14 (2004)]; 및 [Uthoff S.M., Int J Oncol. 19:803-810 (2001)] 참조). 염증성 장 질환을 앓고 있는 환자에서의 유전자 조절곤란의 추가적인 연구에는, 예를 들어, UC 및 CD에서의 여러 유전자에 대한 특색있는 유전자 발현 프로 파일들이 개시된 Lawrance, I.C. 등의 연구가 포함된다 ([Lawrance, I.C. et al., Human Mol. Genetics 10(5):445-456 (2001)]). Uthoff, S.M.S. 등은 마이크로어레이 분석을 사용한 UC 및 CD에 대한 후보 유전자의 확인을 개시하였다 ([Uthoff, S.M.S. et al., Int'l. J. Oncology 19:803-810 (2001)]). Dooley, T.P. 등은 IBD에서의 유전자 발현과 이러한 장애에 대한 약물 치료의 상관관계를 개시하였다 ([Dooley, T.P. et al., Inflamm. Bowel Dis. 10(1): 1-14 (2004)]).
염증성 장 질환의 추가적인 생물학적 마커의 확인이 이러한 만성 질환의 진단에서 사용하기 위해 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
본원에서 언급된 모든 참고문헌의 전체 내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
발명의 개요
LY6 수퍼패밀리의 유전자의 구성원들이 뮤린(murine) 대장염 모델 및 IBD를 앓고 있는 인간 환자의 장 조직 내의 장 상피 세포 (IEC)의 표면 상에서 상향조절되고, 이러한 유전자가 건강한 IEC 상에서는 발현되지 않는다는 독특한 발견이 본원에서 개시된다. LY6 패밀리 구성원의 대다수는 조혈 기원의 세포 상에 광범위하게 분포되고 비-조혈 세포 상에서는 더 한정되어 발현되는 GPI-앵커형(anchored) 세포 표면 당단백질이다. 면역 세포의 분화의 마커로서 광범위하게 사용되지만 ([Sunderkotter, C. et al., J. Immunol. 172:4410-4417 (2004)]), LY6 패밀리가 지니는 기능은 판명하기가 어려웠다 ([Shevach, E. M. and P.E. Korty, Immunol. Today 10: 195-200 (1989)]). LY6 분자가 T 세포 활성화 ([Zhang, Z.X. et al., Eur. J. Immunol. 32: 1584-1592 (2002)] 및 [Henderson, S.C. et al., J. Immunol. 168: 118-126 (2002)]), 후각 ([Chou, J.H. et al., Genetics 157:211-224 (2001)]) 및 세포 부착 ([Jaakkola, I. et al., J. Immunol. 170: 1283-1290 (2003)])을 포함하는 다양한 기능에서 수반되는 것으로 리포트들에서 나타났다.
가장 넓은 의미에서, 본 발명은 대조군 포유동물과 비교하여 장 장애를 앓고 있는 1차 포유동물로부터의 장 조직에서 인간 LY6 유전자 패밀리의 유전자의 증가된 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 더욱 제한적인 의미에서, 상기 방법은 인간 LY6H, LYPD1, LYPD3, 및 LYPD5 발현과 관련된 장 장애에 관련된 장애의 진단에 적용가능할 것으로 예상되고, 상기 장애에는 염증성 장 질환 (IBD), 예컨대 궤양성 대장염 (UC) 및 크론병 (CD)이 비제한적으로 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 IBD 치료 처치의 응답자 및 비응답자를 검출하는데 유용하다. 한 실시양태에서, IBD는 궤양성 대장염 (UC)이다. 한 실시양태에서, IBD는 크론병 (CD)이다. 한 실시양태에서, 장 조직은 결장 조직이다. 한 실시양태에서, 결장 조직은 S자 결장이다. 한 실시양태에서, LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 유전자 발현이 IBD, CD 또는 UC를 앓고 있지 않은 포유동물의 정상적인 장 조직 (예컨대 정상적인 결장 조직)과 비교하여 IBD, UC 또는 CD 포유동물의 장 조직 (예컨대 결장 조직)에서 증가된다. 한 실시양태에서, LY6H 유전자는 서열 1의 핵산을 포함하고. 서열 2를 포함하는 LY6H 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, LYPD1 유전자는 서열 3 또는 4의 핵산을 포함하고, 서열 5를 포함하는 LYPD1 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, LYPD3 유전자는 서열 6의 핵산을 포함하고, 서열 7의 LYPD3 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, LYPD5 유전자는 서열 8 또는 9의 핵산을 포함하고, 서열 10의 LYPD5 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 장 장애를 앓고 있을 것으로 추측되는 시험 포유동물로부터 조직 샘플을 수득하는 단계, 조직을 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 단백질 또는 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5를 코딩하는 핵산과 상호작용하는 검출가능 제제와 접촉시키는 단계, 및 대조군 조직과 비교하여 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 대조군과 비교하여 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5의 증가된 발현은 시험 포유동물에 IBD가 존재함을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대조군 장 조직과 비교하여 시험 장 조직에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5의 증가된 발현은 시험 포유동물에 UC가 존재함을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대조군 장 조직과 비교하여 시험 장 조직에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5의 증가된 발현은 시험 포유동물에 CD가 존재함을 나타낸다. 한 실시양태에서, 시험 및 대조군 포유동물로부터의 조직 또는 세포는 결장으로부터의 것이다.
한 실시양태에서, LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 발현은 유전자 발현의 검출에 의해, 예컨대 조직 샘플 또는 세포 내의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5를 코딩하는 mRNA의 검출에 의해 결정된다. 한 실시양태에서, 대조군 샘플은 위장 장애, 예컨대 IBD, UC 또는 CD를 앓고 있지 않은 것으로 공지된 포유동물로부터 수득한 동일한 조직 또는 세포 유형의 조직 또는 세포의 샘플이다. 한 실시양태에서, 대조군 샘플은 여러 정상 조직으로부터의 또는 다중 세포주로부터의 RNA를 포 함하는 보편적 표준물이다. 마이크로어레이 분석에서, 이같은 보편적 표준물은 실험내 및 실험간 변이를 모니터링 및 제어하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 보편적 표준물 (또는 보편적 기준(Universal Reference) RNA (URR))은 [Novoradovskaya, N. et al., (2004) BMC Genomics 5:20]에서 제공된 바와 같이 제조되고, 상기 참고문헌은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다. 한 실시양태에서, 마우스 RNA의 마이크로어레이 분석에서 대조군으로 사용하기 위해, URR은 Stratagene®로부터의 보편적 마우스 기준 RNA (카탈로그 #740100, Stratagene® (La Jolla, CA))이다. 한 실시양태에서, 인간 RNA의 마이크로어레이 분석에서 대조군으로 사용하기 위해, URR은 Stratagene®로부터의 보편적 인간 기준 RNA (카탈로그 #740000)이다. 한 실시양태에서, 래트 RNA의 마이크로어레이 분석에서 대조군으로 사용하기 위해, URR은 Stratagene®로부터의 보편적 래트 기준 RNA (카탈로그 #740200)이다. RNA가 마우스 RNA인 한 실시양태에서, 전체 RNA가 추출되는 세포주는 배아, 배아 섬유모세포, 신장, 간의 간세포, 폐의 폐포 대식세포, B-림프구, T-림프구 (흉선), 유선, 근육의 근육모세포, 피부, 및 고환으로부터 유래된 세포주를 포함한다. RNA가 인간 RNA인 한 실시양태에서, 전체 RNA가 추출되는 세포주는 유선 선암종, 간의 간모세포종, 경부 선암종, 배아 암종 또는 고환, 뇌의 아교모세포종, 흑색종, 지방육종, 조직구 림프종 (대식세포, 조직구), T 림프모구의 림프모구성 백혈병, B 림프구 형질세포종 흑색종으로부터 유래된 세포주를 포함한다. RNA가 래트 RNA인 한 실시양태에서, 전체 RNA가 추출되는 세포주는 혈액 호염기구성 백혈병, 혈액 T-림프구 림프종, 혈액 B-림프모구 하이브리도마, 뇌의 신경 아교종, 배아 난황 암종, 배아의 정상적인 섬유모세포, 정상적인 신장, 간의 간암, 폐의 정상적인 폐포 대식세포, 폐의 정상적인 제II형 폐포, 유선 선암종, 근육의 근육모세포, 정상적인 피부, 및 고환 라이디히 세포 종양으로부터 유래된 세포주를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 용기, 및 용기 내에 함유된 당해 조성물을 포함하는 제조품을 제공하고, 이때 당해 조성물은 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 또는 이의 상보체를 코딩하는 핵산, 및/또는 항-LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 항체 또는 항체들, 또는 이의 항-LY6H-, LYPD1-, LYPD3- 및/또는 LYPD5-결합 단편을 포함하고, 상기 핵산 및/또는 항체는 검출가능하다. 한 실시양태에서, 당해 조성물은 장 장애를 앓고 있는 것으로 추측되는 시험 포유동물의 조직 샘플 내의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 핵산에 결합하는 핵산, 예컨대 비제한적으로 LY6H-, LYPD1-, LYPD3- 및/또는 LYPD5-코딩 핵산 또는 이의 상보체를 검출하기 위한 검출가능 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 당해 조성물은 장 장애를 앓고 있는 것으로 추측되는 시험 포유동물의 조직 샘플 내의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5에 예를 들어 결합하는 항체를 검출하기 위한 검출가능 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물의 항체는 검출가능하게 표지된다. 한 실시양태에서, 조성물의 항체는 제2 항체에 의해 검출가능하고, 이러한 제2 항체가 검출가능하거나 또는 검출가능하게 표지된다. 제조품은 용기에 고정된 표지, 또는 용기 내에 포함된 포장 삽입물을 추가로 임의적으로 포함할 수 있고, 이는 장 조직 (비제한적으로 결장 조직을 포함함)에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5의 증가된 발현의 검출에서 의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 핵산 또는 이의 상보체 및/또는 항-LY6H, 항-LYPD1, 항-LYPD3 및/또는 항-LYPD5 항체 또는 이의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 결합 단편의 용도를 지시한다. 한 실시양태에서, 장 장애는 IBD이다. 한 실시양태에서, 장 장애는 UC 또는 CD이다. 한 실시양태에서, LYPD1 폴리펩티드 및 항-LYPD1 항체는 각각 US7,157,558 및 US7,144,990에 개시된 항체이다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 수득한 조직 또는 세포의 시험 샘플, 및 (b) 동일한 조직 기원 또는 유형의 장 장애를 앓고 있지 않은 포유동물로부터의 공지된 정상 세포의 대조군 샘플 내의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 이때 대조군 샘플과 비교하여, 시험 샘플에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드의 더 높은 수준의 발현은 시험 샘플을 수득한 포유동물에 장 장애가 존재함을 나타내는 것인, 포유동물에서 장 장애의 존재를 진단하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 장 장애는 IBD이다. 한 실시양태에서, IBD는 UC이다. 한 실시양태에서, IBD는 CD이다. 한 실시양태에서, LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드에 대한 항체, 또는 항체의 결합 단편을 시험 및 대조군 샘플과 접촉시키고, 항체-폴리펩티드 복합체 형성의 상대적인 양을 결정함으로써 검출된다. 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 더 높은 수준의 항체-폴리펩티드 복합체 형성은 시험 포유동물에 장 장애, 예컨대 IBD, UC 또는 CD가 존재함을 나타낸다. 본 발명의 항체가 검출가능하게 표지되거나, 또는 별법적으로, 검출가능한 제2 항체의 후속 결합에 의해 항체가 검출된다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 (a) 시험 포유동물로부터 수득한 조직 또는 세포를 포함하는 시험 샘플을 높은 엄격도에서 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 핵산 (또는 이의 상보체)에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 또는 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험 샘플 내에서의 올리고뉴클레오티드 또는 항체와 각각 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 핵산 (또는 이의 상보체) 또는 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드 간의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이때, 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 더 많은 이같은 복합체의 형성은 시험 포유동물 내의 장 장애 (예컨대 IBD, UC 또는 CD)의 존재를 나타내는 것인, 포유동물에서 장 장애의 존재를 진단하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 장 장애는 IBD이다. 한 실시양태에서, 장애는 UC이다. 한 실시양태에서, 장애는 CD이다. 한 실시양태에서, 시험 및 대조군 포유동물의 조직은 결장 조직이다. 임의적으로, 본 발명의 방법에 의해 사용된, LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 유전자에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 항체 또는 올리고뉴클레오티드, 검출가능하게 표지된 항체 또는 올리고뉴클레오티드, 고체 지지체에 부착된 항체 또는 올리고뉴클레오티드 등이고/이거나, 조직 또는 세포의 시험 샘플은 장 장애를 앓고 있는 것으로 추측되는 개체로부터 수득되고, 이때 상기 장애는 IBD이고, 예컨대 비제한적으로 UC 또는 CD이다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 결장 조직이 비제한적으로 포함되는 포유 동물의 장 조직에서의 IBD, CD 또는 UC가 비제한적으로 포함되는 장 장애의 진단 검출에 유용한 의약의 제조에서의, (a) LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드, (b) LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (a)의 핵산을 포함하는 벡터 또는 숙주 세포, (c) 항-LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 폴리펩티드 항체, 또는 (d) LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5-결합 올리고펩티드의 용도에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 대조군 포유동물의 대조군 위장 조직과 비교하여 시험 포유동물의 위장 조직에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 발현을 결정하는 것을 포함하며, 이때 대조군 조직과 비교하여 시험 조직에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5의 더 높은 수준의 발현은 질환 상태 또는 질환 상태의 지속을 나타내는 것인, IBD 치료제로 치료된 포유동물에서 치료 약물 응답을 검출하는 방법을 포함한다. 정상적인 대조군 발현 수준보다 현저하게 높지 않거나 포유동물 집단에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5에 대한 정상적인 발현 수준의 범위 내인 시험 조직에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 발현에서의 차이는 장 장애의 개선 또는 해소를 나타내고, 이러한 개선 또는 해소는 치료제로 인한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료제로 치료된 포유동물의 위장 또는 결장 조직 또는 세포에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5의 발현 수준이 상이할 때 (발현이 정상 대조군에 더욱 유사할 때, 즉, LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 수준이 치료 전의 포유동물에서의 LY6H, LYPD1, LYPD3 및/또는 LYPD5 발현 수준보다 낮을 때) 치료적 응답이 결정된다.
본 발명의 추가적인 실시양태들이 본 명세서를 읽음으로써 당업자에게 명백할 것이다.
도 1A 및 1B는 인간 LY6H 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 1) 및 인간 LY6H 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 2)을 도해한다.
도 2A 및 2B는 인간 LYPD1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 3 및 4)을 도해하고, 도 2C에서는 인간 LYPD1 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 5)이 제시된다.
도 3A 및 3B는 인간 LYPD3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 6) 및 인간 LYPD3 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도해한다 (서열 7).
도 4A 및 4B는 인간 LYPD5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 8 및 9)을 도해하고, 도 4C에서는 인간 LYPD5 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 10)이 제시된다.
도 5A 및 5B는 인간 LY6D 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 11) 및 인간 LY6D 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 12)을 도해한다.
도 6A 및 6B는 인간 LY6E 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 13) 및 인간 LY6E 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 14)을 도해한다.
도 7A 및 7B는 인간 LYPD2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 15) 및 인간 LYPD2 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 16)을 도해한다.
도 8A-8H는 GLG-1 (ESL-1) 분자의 서열을 도해한다: (A-B) 기탁 번호 U64791, 인간 GLG-1 (ESL-1) 폴리펩티드 (서열 18)를 코딩하는 핵산 서열 (서열 17); (C-D) 기탁 번호 NM_012201, 인간 GLG-1 (ESL-1) 폴리펩티드 (서열 20)를 코딩하는 핵산 서열 (서열 19); (E-F) 기탁 번호 AK172806, 인간 GLG-1 (ESL-1) 폴리펩티드 (서열 22)를 코딩하는 핵산 서열 (서열 21); 및 기탁 번호 AK131501, 인간 GLG-1 (ESL-1) 폴리펩티드 (서열 24)를 코딩하는 핵산 서열 (서열 23).
도 9A 및 9B는 뮤린 LY6A 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 25) 및 뮤린 LY6A 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 26)을 도해한다.
도 10A 및 10B는 뮤린 LY6C 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 27) 및 뮤린 LY6C 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 28)을 도해한다.
도 11A 및 11B는 뮤린 LY6D 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 29) 및 뮤린 LY6D 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 30)을 도해한다.
도 12A 및 12B는 뮤린 LY6E 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 31) 및 뮤린 LY6E 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 32)을 도해한다.
도 13A 및 13B는 뮤린 LY6F 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 33) 및뮤린 LY6F 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 34)을 도해한다.
도 14A 및 14B는 뮤린 LY6I 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 35) 및 뮤린 LY6I 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 36)을 도해한다.
도 15A 및 15B는 뮤린 LY6K 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 37) 및 뮤린 LY6K 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 38)을 도해한다.
도 16A 및 16B는 뮤린 LYPD3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 45) 및 뮤린 LYPD3 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 46)을 도해한다.
도 17A 및 17B는 뮤린 LY6H 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 47) 및 뮤린 LY6H 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 48)을 도해한다.
도 18A 및 18B는 뮤린 LYPD1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 49) 및 뮤린 LYPD1 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 50)을 도해한다.
도 19A 및 19B는 뮤린 LYPD2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 51) 및 뮤린 LYPD2 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 52)을 도해한다.
도 20A 및 20B는 뮤린 LY6g5c 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 53) 및 뮤린 LY6g5c 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 54)을 도해한다.
도 21A 및 22B는 뮤린 LY6g6c 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 55) 및 뮤린 LY6g6c 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 56)을 도해한다.
도 22A 및 22B는 뮤린 SLURP2/LYNX1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열 57) 및 뮤린 SLURP2/LYNX1 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 58)을 도해한다.
도 23은 LY6 패밀리 구성원이 대장염의 뮤린 모델에서의 IEC에서 상향조절된다는 것을 나타낸다. IL10-/- (도 23A) 및 CD45RBHi 전이 대장염 모델 (도 23B) 양쪽 모두에서의 IEC를 LCM에 의해 단리하고, RNA를 정제하였다. 실시예에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 분석을 수행하고 분석하였다. 숫자는 건강한 마우스에 대한 대장염 마우스의 보편적 표준물 RNA에 비한 배수 변화의 평균을 나타낸다. 열 지도(heatmap) 아래의 숫자는 개개의 마우스의 염증 점수를 가리킨다.
도 24A-24D는 LY6 분자의 표면 발현이 대장염의 IL10-/- 모델에서 IEC 상에서 상향조절된다는 것을 나타낸다. 야생형 (도 24A) 또는 IL10 -/- 마우스 (도 24B)를 LY6A의 표면 발현에 대해 염색하였다 (녹색 + DAPI 대조염색). 유사하게, 야생형 (도 24C) 또는 IL10 -/- 마우스 (도 24D)를 LY6C의 표면 발현에 대해 염색하였다.
도 25A-25I는 LY6A 및 LY6C의 표면 발현이 염증성 사이토카인, 특히 IFNγ에 응답하여 상향조절된다는 것을 나타낸다. YAMC 세포를 지시된 사이토카인으로 15시간 동안 처리하고, LY6C (도 25 A) 및 LY6A (도 25B)의 표면 발현에 대해 염색하였다. YAMC 세포를 증가하는 용량의 IFNγ의 존재 하에 15시간 동안 배양하고, LY6C (도 25C) 및 LY6A (도 25D)의 발현에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. IFNγ로 자극된 YAMC 세포를 지시된 바와 같은 다양한 시점에 수집하고, LY6C (도 25E) 및 LY6A (도 25F)의 발현에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. IL-22는 LY6C (도 25G) 및 LY6A (도 25H) 양쪽 모두의 발현을 상향조절시켰다. LY6A 및 LY6C 양쪽 모두의 수준이 뮤린 IEC 세포주 CMT93에서 IFNγ에 응답하여 상향조절되었다 (도 25I).
도 26A-26E: 지질 래프트(raft) 결핍이 LY6C-매개 케모카인 생산의 억제를 초래하였다. 콜레스테롤이 결핍된 YAMC 세포 (흑색 막대) 또는 결핍되지 않은 YAMC 세포 (백색 막대)를 지시된 바와 같이 플레이트에 결합된 항-KLH 또는 항-LY6C와 함께 15시간 동안 인큐베이션하였다. RNA를 수집하고, CXCL2, CXCL5, 및 CCL7의 발현 수준을 결정하였다 (도 26A-26C). LY6A (도 26D) 및 LY6C (도 26E)의 표면 수준이 콜레스테롤 결핍에 응답하여 감소되었다.
도 27A-27D는 LY6C의 가교가 LY6A 및 LY6C의 표면 발현의 상향조절을 유도하지만 LY6A는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. YAMC 세포를 항-KLH 대조군, 항-LY6A 또는 항-LY6C로 코팅된 플레이트 상에서 24시간 동안 인큐베이션하고, LY6C (도 27A) 또는 LY6A (도 27B)의 발현에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 세포를 12시간 동안 100 U/㎖의 IFNγ로 예비처리하였고, 유사하게 항체가 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하여, LY6C (도 27C) 또는 LY6A (도 27D)의 발현에 대해 분석하였다.
도 28A-28C는 LY6C의 가교가 케모카인의 분비를 유도하지만 LY6A는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 도 28A: YAMC 세포를 지시된 바와 같이 100 U/㎖의 IFNγ와 함께 15시간 동안 예비-인큐베이션하거나 예비-인큐베이션하지 않고, 10 ㎍/㎖의 항-LY6A (흑색 막대) 또는 항-LY6C (빗금 막대) 또는 항-KLH 대조군 (백색 막대)으로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. RNA를 24시 (왼쪽), 48시 (중앙) 및 72시 (오른쪽)에 단리하고, CXCL5 또는 CCL7의 발현에 대해 분석하였다 (A). 데이터는 미처리된, 이소타입이 가교된 세포와 비교된 배수 변화 (2-ΔΔ Ct 방법에 의해 결정됨)의 평균 ± SD를 가리킨다. 도 28B: 상기와 같이 1, 5 또는 10 ㎍/㎖ (지시된 바와 같음)의 항체와 가교된 세포에서 상등액을 48시에 수집하고, 상등액 내로의 CXCL5 분비를 ELISA에 의해 결정하였다. *<0.05. 도 28C: LY6C 가교에 응답한 CXCL5 및 CXCL2 양쪽 모두의 수준이 LY6C 수준이 siRNA로 녹다운(knockdown)되 었을 때 감소되었다.
도 29A-29B는 대장염에서의 IEC가 유사한 케모카인 유전자 발현 패턴을 지닌다는 것을 나타낸다. IL10-/- (도 29A) 및 CD45RBHi 전이 대장염 모델 (도 29B) 양쪽 모두에서의 IEC를 LCM에 의해 단리하고, RNA를 정제하였다. 실시예에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 분석을 수행하고 분석하였다. 숫자는 건강한 마우스에 대한 대장염 마우스의 보편적 표준물 RNA에 비교된 배수 변화의 평균을 나타낸다. 열 지도 아래의 숫자는 개개의 마우스의 염증 점수를 가리킨다.
도 30A-30C는 인간 LY6 패밀리 유전자의 발현이 사이토카인으로 처리된 결장 세포에서 상향조절된다는 것을 나타낸다. 인간 Colo-205 세포를 지시된 사이토카인, 또는 사이토카인들의 조합물로 18시간 또는 24시간 동안 처리하였다. 인간 LY6H (도 30A), 인간 LYPD3 (도 30B), 및 인간 LYPD5 (도 30C)의 발현에서의 배수 증가가 인간 β-액틴 대조군과 비교되어 제시된다.
도 31A-31B는 크론병 환자에서 결장 내의 LYPD1 (도 31A) 및 LYPD5 (도 31B) 수준이 상승되었음을 나타낸다. 인간 IBD 환자로부터의 조직 샘플을 수득하고, LYPD1 및 LYPD5 유전자 발현을 결정하였다. LYPD1 및 LYPD5의 발현에서의 통계적으로 유의한 증가가 CD 환자의 염증이 있는 조직에서 관찰되었다. LYPD5의 발현에서의 통계적으로 유의한 증가가 UC 환자의 염증이 있는 조직에서 또한 관찰되었다. Y축의 값은 보편적 RNA 표준물에 비교된 유전자 발현을 반영한다.
도 32A 및 32B는 (A) 형질감염되지 않은 COS 세포, 및 (B) GLG-1 (ESL-1) 폴 리펩티드로 형질감염되고 LYPD5-Fc 단백질로 염색된 COS 세포를 나타낸다.
도 33A는 LYPD5의 결합을 특성화하는데 적절한 GLG-1 또는 ESL-1 및 각종 단편의 구조를 도해하고, 도 33B는 LYPD5 리간드 및 LYPD5의 결합을 특성화하는 공동-면역침전 연구의 결과를 나타낸다.
도 34A는 LYPD5의 결합을 특성화하는데 적절한 GLG-1 또는 ESL-1 및 각종 단편의 구조를 도해하고, 도 34B는 LYPD5 리간드 및 LYPD5의 결합을 특성화하는 공동-면역침전 연구의 결과를 나타낸다.
도 35A는 LYPD5의 결합을 특성화하는데 적절한 GLG-1 또는 ESL-1 및 각종 단편의 구조를 도해하고, 도 35B는 LYPD5 리간드 및 LYPD5의 결합을 특성화하는 공동-면역침전 연구의 결과를 나타낸다.
도 36A 및 36B는 인간 인테그린, 베타 7을 코딩하는 핵산 서열 (서열 68), 및 인간 인테그린, 베타 7 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 69)을 도해한다.
정의
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 염증 및/또는 궤양형성을 야기하는 장의 질환을 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 크론병 및 궤양성 대장염을 비제한적으로 포함한다.
"크론병 (CD)" 또는 "궤양성 대장염 (UC)"은 병인이 알려지지 않은 만성 염증성 장 질환이다. 크론병은, 궤양성 대장염과 달리, 장의 모든 부분에 영향을 미칠 수 있다. 크론병의 가장 우세한 양상은 장 벽의 과립형 적자색 부종성 비후화이다. 염증이 발달되면서, 이러한 육아종은 종종 이의 국한성 경계를 상실하고, 주위의 조직과 통합된다. 설사 및 장의 폐쇄가 우세한 임상 양상이다. 궤양성 대장염과 같이, 크론병의 과정은 연속적 또는 재발성, 경증 또는 중증일 수 있지만, 궤양성 대장염과 달리, 크론병은 장의 관련된 절편의 절제에 의해 치유가능하지 않다. 대부분의 크론병 환자들은 일부 지점에서의 수술을 필요로 하지만, 이어지는 재발이 통상적이고, 지속적인 의학적 처치가 일반적이다.
크론병은 입에서 항문까지의 소화관의 임의의 부분을 수반할 수 있지만, 전형적으로는 회결장, 소장 또는 결장-항문 영역에서 나타난다. 조직병리학적으로, 크론병은 불연속성 육아종, 움 농양, 열창 및 아프타 궤양으로 나타난다. 림프구 (T 및 B 세포 양쪽 모두), 혈장 세포, 대식세포, 및 중성구로 구성된 염증성 침윤물이 혼합된다. IgM- 및 IgG-분비 혈장 세포, 대식세포 및 중성구에서의 불균형한 증가가 있다.
항-염증성 약물인 술파살라진 및 5-아미노살리실산 (5-ASA)은 경증 활성의 결장성 크론병을 치료하는데 유용하고, 이의 완화를 유지시키기 위해 통상적으로 처방된다. 메트로이다졸 및 시프로플록사신은 술파살라진과 효능이 유사하고, 항문주위 질환을 치료하는데 특히 유용한 것으로 보인다. 더욱 중증인 경우에, 코르티코스테로이드가 활성 악화를 치료하는데 효과적이며, 심지어 완화를 유지시킬 수 있다. 아자티오프린 및 6-메르캅토퓨린이 코르티코스테로이드의 만성 투여를 필요로 하는 환자에서 성공적인 것으로 또한 나타났다. 이러한 약물들이 장기 예방에서 역할을 할 수 있는 것이 또한 가능하다. 불행하게도, 일부 환자에서 작용의 개시 전에 매우 긴 지연 (6개월까지)이 있을 수 있다.
지사제 약물이 일부 환자에서 증상 경감을 또한 제공할 수 있다. 영양 요법 또는 기본식이 환자의 영양 상태를 개선하고 급성 질환의 증상 개선을 유도할 수 있지만, 이는 지속적인 임상 완화를 유도하지 않는다. 항생제가 2차 소장 박테리아 과잉성장의 치료 및 화농성 합병증의 치료에 사용된다.
"궤양성 대장염 (UC)"은 대장을 괴롭힌다. 질환의 과정은 연속적 또는 재발성, 경증 또는 중증일 수 있다. 가장 초기의 병변은 리버쿤와(crypt of Lieberkuhn)의 기부에서의 농양 형성이 있는 염증성 침윤이다. 이러한 팽창되고 파열된 리버쿤와의 유착은 위에 놓인 점막을 혈액 공급으로부터 분리시키는 경향이 있어, 궤양형성에 이른다. 질환의 증상은 경련, 하복부 통증, 직장 출혈, 및 약간의 대변 입자와 함께 혈액, 고름 및 점액으로 주로 구성된 빈번한 설사 배설물을 포함한다. 급성, 중증 또는 만성의 끊임없는 궤양성 대장염에서 전체 결장절제술이 요구될 수 있다.
UC의 임상 양상은 고도로 가변성이고, 개시가 잠행성이거나 갑작스러울 수 있으며, 설사, 뒤무직 및 재발성 직장 출혈을 포함할 수 있다. 전체 결장이 전격성으로 관련되면서, 생명을 위협하는 응급상황인 독성 거대결장증이 일어날 수 있다. 장외 소견에는 관절염, 괴저성 농피증, 포도막염 및 결절 홍반이 포함된다.
UC에 대한 치료에는 경증 사례에 대한 술파살라진 및 관련된 살리실레이트-함유 약물, 및 중증 사례에서의 코르티코스테로이드 약물이 포함된다. 살리실레이트 또는 코르티코스테로이드의 국소 투여는 때때로 효과적고, 특히 질환이 원위부 장에 제한되는 경우에 그러하며, 전신 사용에 비해 감소된 부작용과 관련된다. 철 및 지사제의 투여와 같은 보조적인 조치가 때때로 지시된다. 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트가 난치성 코르티코스테로이드-의존적 사례에서의 사용에 대해 또한 때때로 처방된다.
본원에서 사용된 "LY6 유전자 패밀리 구성원" 또는 "LY6 유전자 수퍼패밀리 구성원"은 LY6 유전자 패밀리의 구성원에 대한 상동성이 있는 유전자를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 상기 유전자 패밀리 구성원의 대다수는 조혈 기원의 세포 상에 광범위하게 분포되고 비-조혈 세포 상에서는 더 한정되어 발현되는 GPI-앵커형 세포 표면 당단백질이다. 이러한 유전자 패밀리의 구성원은 면역 세포 분화의 마커로 사용된다 ([Sunderkotter, C. et al., J. Immunol. 172:4410-4417 (2004)]). LY6 패밀리의 유전자들이 시험되었고 ([Shevach, E.M. and P. E. Korty, Immunol. Today 10: 195-200 (1989)]), 기능에는 T 세포 활성화 ([Zhang, Z.X. et al., Eur. J. Immunol. 32: 1584-1592 (2002)] 및 [Henderson, S.C. et al., J. Immunol. 168:118-126 (2002)]), 후각 ([Chou, J.H. et al., Genetics 157:211-224 (2001)]) 및 세포 부착 ([Jaakkola, I. et al., J. Immunol. 170:1283-1290 (2003)])이 포함된다. LY6 유전자 패밀리의 구성원에는 포유류 LY6 유전자 패밀리의 구성원, 예컨대 마우스 또는 인간의 LY6 패밀리 유전자가 비제한적으로 포함된다. 본원에서 사용된 "LY6 유전자"는 LY6 유전자 패밀리 구성원을 지칭하고, "LY6 폴리펩티드"는 LY6 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 뮤린 LY6 유전자 패밀리 구성원에는 LY6A (NM_10738, 폴리펩티드 서열 26을 코딩하는 핵산 서열 25), LY6C (NM_010741, 폴리펩티드 서열 28을 코딩하는 핵산 서열 27), LY6D (NM_003695, 폴리펩티드 서열 30을 코딩하는 핵산 서열 29), LY6E (NM_002346, 폴리펩티드 서열 32를 코딩하는 핵산 서열 31), LY6F (NM_008530, 폴리펩티드 서열 34를 코딩하는 핵산 서열 33), LY6I (NM_020498, 폴리펩티드 서열 36을 코딩하는 핵산 서열 35), 및 LY6K (NM_017527, 폴리펩티드 서열 38을 코딩하는 핵산 서열 37)이 비제한적으로 포함된다. 인간 LY6 유전자 패밀리 구성원에는 LY6H (NM_002347, 폴리펩티드 서열 2를 코딩하는 핵산 서열 1), LYPD1 (NMJ44586, 폴리펩티드 서열 5를 코딩하는 핵산 서열 3 또는 4), LYPD3 (NM_014400, 폴리펩티드 서열 7을 코딩하는 핵산 서열 6), LYPD5 (NM_182573, 폴리펩티드 서열 10을 코딩하는 핵산 서열 8 또는 9), LY6D (NM_003695, 폴리펩티드 서열 12를 코딩하는 핵산 서열 11), LY6E (NMNM_002346, 폴리펩티드 서열 14를 코딩하는 핵산 서열 13), LYPD2 (NM_205545, 폴리펩티드 서열 16을 코딩하는 핵산 서열 15)가 비제한적으로 포함된다. 실시양태들에서, 본원에 개시된 각각의 LY6 유전자 패밀리 구성원의 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 또는 57의 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 500개 이상, 750개 이상, 1000개 이상, 1250개 이상, 1500개 이상, 1750개 이상, 2000개 이상, 2040개 이상의 인접한 뉴클레오티드들을 포함하거나, 또는 LY6 유전자 패밀리 구성원 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 또는 57을 포함한다. 한 실시양태에서, LY6 유전자 패밀리 구성원 폴리뉴클레오티드 (서열 1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 또는 57)에 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 단편은 LY6 폴리펩티드 또는 이의 단편과의 서열 동일성이 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 99％ 이상 또는 100％이다. 한 실시양태에서, LY6 유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 서열 2, 5, 7, 10, 12, 14, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58의 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 225개 이상, 250개 이상, 275개 이상, 300개 이상, 또는 325개 이상의 적어도 인접한 아미노산들을 포함하거나, 또는 LY6 유전자 패밀리 폴리펩티드는 서열 2, 5, 7, 10, 12, 14, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58을 포함한다.
임의의 LY6 유전자 패밀리 구성원의 "천연 서열 폴리펩티드"는 천연에서 유래된 상응하는 LY6 유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드와 아미노산 서열이 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 이같은 천연 서열 LY6 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 LY6 폴리펩티드"는 천연-발생 말단절단 또는 분비형 형태의 특정 LY6 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱(splicing)된 형태) 및 폴리펩티드의 천연발생 대립유전자 변이체를 명확하게 포함한다. 한 특정 양상에서, 본원에 개시된 천연 서열 LY6 폴리펩티드는 도 1-7 및 서열 2, 5, 7, 10, 12, 14, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58에 상응하는 성숙형 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 "LY6 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 LY6 폴리펩티드 서열, 및 신호 펩티드가 없는 이의 변이체 형태, 세포외 도메인, 또는 전장 천연 서열 LY6 폴리펩티드의 임의의 기타 단편 예컨대 본원에 언급된 것들과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 80％인, LY6 폴리펩티드, 바람직하게는 이의 생물학적으로 활성인 형태 (본원에서 정의된 바와 같음)를 의미한다. 이같은 변이체 폴리펩티드는, 예를 들어, 전장 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 특정 양상에서, 이같은 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 LY6 폴리펩티드 서열, 및 신호 펩티드가 없는 이의 변이체 형태, 세포외 도메인, 또는 전장 천연 서열 LY6 폴리펩티드의 임의의 기타 단편 예컨대 본원에 언급된 것들과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 80％, 별법적으로는 적어도 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％일 것이다.
본원에서 확인된 LY6 폴리펩티드 서열에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 특정 LY6 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성되고, ALIGN-2 프로그램을 위한 완전한 소스(source) 코드가 하기 표 1에서 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 하기 표 1에 제시된 소스 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작권청(U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 또는 하기 표 1에서 제공된 소스 코드로부터 컴파일링(compiling)될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
본원에서 사용된 "LY6 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "LY6 변이체 핵산 서열", 또는 "LY6 유전자"는 LY6 유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드, 바람직하게는 이의 생물학적으로 활성인 형태 (본원에서 정의된 바와 같음)을 코딩하고, 본원에서 확인된 전장 천연 서열 LY6 폴리펩티드 서열, 또는 본원에서 확인된 바와 같은 각각의 전장 LY6 폴리펩티드 서열의 임의의 기타 단편 (예컨대 전장 LY6 폴리펩티드에 대한 완전한 코딩 서열의 일부만을 나타내는 핵산에 의해 코딩되는 것)을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 적어도 약 80％인 핵산 분자를 지칭한다. 통상적으로, 이같은 변이체 폴리뉴클레오티드는 각각의 전장 천연 서열 LY6 폴리펩티드 서열 또는 본원에서 확인된 각각의 전장 LY6 폴리펩티드 서열의 임의의 기타 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 적어도 약 80％, 별법적으로는 적어도 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％일 것이다. 이같은 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, 이같은 변이체 폴리뉴클레오티드는 길이가 천연 서열 폴리펩티드로부터 적어도 약 50개의 뉴클레오티드만큼 다르고, 별법적으로, 변이는 길이에서 적어도 약 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개, 810개, 820개, 830개, 840개, 850개, 860개, 870개, 880개, 890개, 900개, 910개, 920개, 930개, 940개, 950개, 960개, 970개, 980개, 990개, 또는 1000개의 뉴클레오티드일 수 있으며, 이러한 정황에서의 용어 "약"은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 언급된 길이의 10％를 의미한다.
본원에서 확인된 LY6 유전자 폴리펩티드-코딩 핵산 서열과 관련된 "백분율 (％) 핵산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 당해 LY6 유전자 핵산 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율로 정의된다. 백분율 핵산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 핵산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성되고, ALIGN-2 프로그램을 위한 완전한 소스 코드가 하기 표 1에서 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 하기 표 1에 제시된 소스 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 또는 하기 표 1에서 제공된 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 소정의 핵산 서열 C의 소정의 핵산 서열 D에 대한, D와의 또는 D와 대조된 ％ 핵산 서열 동일성 (소정의 핵산 서열 D에 대한, D와의 또는 D와 대조된 특정 ％ 핵산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소정의 핵산 서열 C로 별법적으로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 W/Z
[식중, W는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 이러한 프로그램의 C와 D의 정렬에서 동일한 매치로 점수가 매겨진 뉴클레오티드의 개수이고, Z는 D 내의 뉴클레오티드의 전체 개수이다]. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, C의 D에 대한 ％ 핵산 서열 동일성은 D의 C에 대한 ％ 핵산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. ％ 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 4 및 5는 "비교 DNA"로 지시된 핵산 서열의 "기준-DNA"로 지시된 핵산 서열에 대한 ％ 핵산 서열 동일성을 계산하는 방법을 실연하고, 이때 "기준-DNA"는 가상의 당해 LY6 유전자-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 당해 "기준-DNA" 핵산 분자가 비교될 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 상이한 가상 뉴클레오티드들을 각각 나타낸다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 ％ 핵산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
또다른 실시양태에서, LY6 유전자 변이체 폴리뉴클레오티드는 각각 LY6 폴리펩티드를 코딩하고, 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세정 조건 하에, 본원에 개시된 바와 같은 전장 LY6 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자이다. 변이체 폴리펩티드는 이같은 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
"단리된"은, 본원에 개시된 다양한 LY6 폴리펩티드를 기술하도록 사용되는 경우, 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이같은 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 이같은 단리된 폴리펩티드에는 재조합 세포 내의 상응하는 계내 폴리펩티드가 포함되는데, 이는 LY6 폴리펩티드의 천연 환경으로부터의 이러한 폴리펩티드의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 이같은 단리된 폴리펩티드는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" LY6 폴리펩티드-코딩 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 회합되는 1가지 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 임의의 상기의 이같은 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과 상이하다. 따라서, 임의의 이같은 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 특정 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 구별된다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생물 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적절한 제어 서열은 프로모터, 임의적으로는 오퍼레이터(operator) 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서(enhancer)를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리(pre)-서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독 상 내인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본원에서 사용된, 유전자 발현에 적용된 "발현"은 단백질을 코딩하는 유전자가 전사되어 mRNA가 생산되는 것, 뿐만 아니라 mRNA가 번역되어 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 것을 지칭한다. 따라서, 증가된 또는 감소된 발현은 유전자의 증가된 또는 감소된 전사 및/또는 전사로부터 생성된 mRNA의 증가된 또는 감소된 번역을 지칭한다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세정 온도, 및 염 농도에 좌우되는 실험적인 계산값이다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적합한 어닐링(annealing)을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧을수록 더 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 상보적인 가닥이 이의 용융 온도 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 다시 어닐링하는 능력에 일반적으로 좌우된다. 프로브와 혼성화가능한 서열 간의 원하는 동일성 정도가 높을수록, 사용될 수 있는 상대적인 온도가 더 높다. 결과적으로, 상대적인 온도가 높을수록 반응 조건을 더욱 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 온도가 낮을수록 덜 엄격해진다는 것을 따른다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가적인 상세사항 및 설명에 대해서는, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의된 "엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격성 조건"은 (1) 세정을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하는 것, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 것; (2) 혼성화 동안에 변성제, 예컨대 포름아미드를 사용하는 것, 예를 들어, 42℃에서 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5× 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하는 용액에서 하룻밤 동안 혼성화시키고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)에서 10분 세정한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 고도 엄격성 세정이 이어지는 것에 의해 확인될 수 있다.
"중등도로 엄격한 조건"은 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 같이 확인될 수 있고, 상기 기술된 것들보다 덜 엄격한 세정 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 ％SDS)의 사용을 포함한다. 중등도로 엄격한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5× SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5× 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎎/㎖의 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시킨 후, 필터를 1× SSC에서 약 37-50℃에서 세척하는 것을 포함한다. 당업자는, 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요하다면, 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프 태그(tag)가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된, LY6 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드, 또는 LY6 폴리펩티드 결합제를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 에피토프에 대해 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 자신이 융합된 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않도록 하기에 충분히 짧다. 또한 바람직하게는 태그 폴리펩티드는 이같은 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않도록 상당히 독특하다. 적절한 태그 폴리펩티드에는 6개 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로 약 8개 내지 50개 사이의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10개 내지 20개 사이의 아미노산 잔기)가 있다.
본원에서의 목적을 위한 "활성인" 또는 "활성"은 천연 또는 천연-발생 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 유지하는 폴리펩티드의 형태(들)을 지칭하고, 이때 "생물학적" 활성은 천연 또는 천연-발생 폴리펩티드가 지니는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력을 제외한, 천연 또는 천연-발생 폴리펩티드에 의해 야기된 생물학적 기능 (억제성 또는 자극성)을 지칭하고, "면역학적" 활성은 천연 또는 천연-발생 폴리펩티드가 지니는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력을 지칭한다. 본원에서 사용된 활성 폴리펩티드는 IBD에 걸리지 않은 유사한 조직 상에서의 발현에 비해 IBD 조직에서, 정성적 또는 정량적인 관점에서, 차별적으로 발현되는 항원이다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 본원에 개시된 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 적절한 길항제 분자에는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등이 구체적으로 포함된다. 길항제를 확인하는 방법은 이같은 폴리펩티드 (이를 발현하는 세포 포함)를 후보 작동제 또는 길항제 분자와 접촉시키는 단계, 및 이같은 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 치료용 처치 및 예방용 또는 방지용 조치 모두를 지칭하고, 이때 목표는 질환의 진행을 방지하거나 늦추는 (줄이는) 것이다. 치료는 IBD의 진행의 변형을 또한 지칭할 수 있다.
"진단"은 IBD, UC 및/또는 크론병이 비제한적으로 포함되는 질환의 특색있는 특징을 확인 또는 결정하는 과정을 지칭한다. 진단 과정은 중증도 또는 질환 진행, 뿐만 아니라 위치 (예를 들어, 염증 및/또는 변경된 유전자 발현이 발견되는 위장관 내의 또는 위장관을 따라서 있는 위치)를 기초로 하는 병기 결정 또는 질환 분류로 또한 종종 표현된다.
진단을 필요로 하는 대상에는 비정상적인 LY6 발현을 이미 앓고 있는 이들, 뿐만 아니라 LY6 발현이 비정상적인 경향이 있는 이들 또는 비정상적인 LY6 발현을 방지하려는 이들이 포함된다. 따라서, 본 발명의 한 양상은 대조군과 비교하여 시험 포유동물의 위장 조직에서의 LY6 발현을 결정하는 단계, 및 LY6 발현 수준이 정상적인 대조군 발현 수준과 유의하게 상이하지 않다는 것을 결정하는 단계를 포함하는, IBD의 치료를 위한 치료제로 치료된 포유동물에서 치료 약물 응답을 검출하는 것이다. 한 실시양태에서, 치료제로 치료된 포유동물의 LY6의 발현 수준이 상이한 경우에 (발현이 정상적인 대조군에 더욱 유사하고, 즉 LY6 발현 수준이 치료 전의 포유동물에서의 LY6 발현 수준보다 낮은 경우에), 치료 응답이 결정된다.
질환에서의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기의 파라메터들은 의사에게 익숙한 일상적인 절차에 의해 용이하게 측정가능하다. IBD 치료법의 경우, 예를 들어, 질환 진행까지의 시간 (TDP)을 평가하고/하거나 응답률 (RR)을 측정함으로써, 효능을 결정할 수 있다. 유전자 발현을 평가하고 환자로부터의 위장 조직의 조직병리학을 관찰하기 위해 생검물을 취할 수 있다. 예휴 및/또는 진단 방법에 관한 본원에 기술된 발명은 LY6 유전자 발현 상향조절의 결정 및 평가를 수반한다.
IBD의 치료, 이의 증상 완화 또는 이의 진단을 위한 "포유동물" 또는 "포유류 대상"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 운동 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼, 흰족제비 등을 포함하는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 추가적인 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예로는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 아스코르브산이 포함되는 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™이 포함된다.
"고상" 또는 "고체 지지체"는 폴리펩티드, 핵산, 항체 또는 LY6 결합제가 부착 또는 접착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본원에서 포함되는 고상의 예로는 유리 (예를 들어, 제어형 다공성 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 부분적으로 또는 전체적으로 형성된 것들이 포함된다. 특정 실시양태에서, 환경에 따라, 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있고, 또한 다르게는 정제 컬럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이러한 용어는 개별적인 입자들의 불연속 고상, 예컨대 미국 특허 번호 4,275,149에 기술된 것들을 또한 포함한다.
"리포솜"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한, 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소포이다. 리포솜의 성분은, 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게, 이층 형성으로 일반적으로 배열된다.
"소분자" 또는 "유기 소분자"는 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 본원에서 정의된다.
길항제의 "유효량"은 생리학적 효과를 일으키는데, 예컨대, 비제한적으로, 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 기능을 부분적으로 또는 전체적으로 억제하는데 충분한 양이다. "유효량"은 이러한 목적과 관련되어, 경험적으로, 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "치료상 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 길항제 또는 기타 약물을 지칭한다. IBD의 경우에, 치료상 유효량의 약물은 비정상적인 LY6 발현을 정상적인 생리학적 수준으로 복구시키고/시키거나, 위장 염증을 감소시키고/시키거나, 위장 병변의 개수를 감소시키고/시키거나, IBD, UC 및/또는 CD와 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 것이다. "치료"의 본원에서의 정의를 참조한다.
길항제의 "성장 억제량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하는 목적을 위해, 이같은 양은 경험적으로, 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
길항제의 "세포독성량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 증식하고 있는 세포, 예를 들어, 암 세포의 파괴를 야기할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하는 목적을 위해, 경험적으로, 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 예를 들어, 항-LY6 모노클로날 항체 (길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-LY6 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-LY6 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적), 및 원하는 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 경우에 한하여, 상기 열거된 항체들 모두의 항원 결합 단편 (하기 참조)을 명확하게 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 상호교환가능하게 사용된다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 95 중량％의 항체를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체성(heterotetrameric) 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 칭해지는 추가적인 폴리펩티드와 함께 기본적인 이종사량체 단위 5개로 구성되는 항체이고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 한편, 분비형 IgA 항체는 J 사슬과 함께 기본적인 4쇄 단위 2-5개를 포함하는 다가의 조립체(assemblage)를 형성하도록 중합될 수 있다). IgG의 경우에, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 한편, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소타입(isotype)에 따라 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적인 간격의 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VH)이 있고, 여기에 α 및 γ 사슬 각각에 대해서는 3개의 불변 도메인 (CH)이, μ 및 ε 이소타입에 대해서는 4개의 CH 도메인이 이어진다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VL)이 있고, 여기에 불변 도메인 (CL)이 다른쪽 말단에서 이어진다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 첫번째 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL이 함께 쌍을 이루는 것으로 단일 항원-결합 부위가 형성된다. 상이한 클래스의 항체들의 구조 및 성질에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994]의 71면 및 제6장을 참조한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로, 카파 및 람다로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 여러 클래스 또는 이소타입으로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지 부류가 있다: 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서의 비교적 작은 차이를 기초로 서브클래스로 추가로 분류되고, 예를 들어, 인간은 하기의 서브클래스를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 서열 면에서 항체들 간에 크게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 아미노산 약 110개 길이에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 길이가 각각 아미노산 9-12개인 "초가변 영역"으로 칭해지는 극도의 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리되는 아미노산 15-30개의 프레임워크(framework) 영역 (FR)으로 칭해지는 비교적 불변성인 신축물로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 채택한 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 초가변 영역들과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체 의존적 세포형 세포 독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 내의 대략적인 카밧 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 주변, 및 VH 내의 대략적인 카밧(Kabat) 잔기 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 주변; [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, VL 내의 대략적인 코티아(Chothia) 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 VH 내의 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) 주변; [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 일반적으로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은, 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체들 (이같은 변이체들은 일반적으로 미량으로 존재한다)을 제외하고는, 동일하고/하거나 같은 에피토프(들)에 결합한다. 이같은 모노클로날 항체는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 전형적으로 포함하며, 이때 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 프로세스는 다수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 예를 들어, 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양에서의 이의 생산의 개선, 생체 내에서의 이의 면역원성의 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해, 선별된 표적 결합 서열이 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해하여야 한다. 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; WO 1997/17852; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)] 참조)이 예를 들어 포함되는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
"키메라" 항체 (면역글로불린)에는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 있는 한편, 사슬(들)의 나머지부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 포함된다 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 사용된 인간화 항체는 키메라 항체의 부분집합이다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종으로부터의 초가변 영역 잔기 (공여자 항체)로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 또는 어셉터 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능 예컨대 결합 친화도를 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은, 비록 FR 영역이 결합 친화도를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수는 있지만, 인간 면역글로불린 서열의 것이다. FR 내의 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 사슬 내에서 6개 이하, L 사슬 내에서 3개 이하이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 임의적으로 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체 (미국 특허 5,641,870의 실시예 2; [Zapata, et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)] 참조), 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 칭해지는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1), 및 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH) + 전체적인 L 사슬로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이고, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 2가의 항원-결합 활성을 갖는 디술피드로 연결된 2개의 Fab 단편에 대략 상응하고, 여전히 항원과 가교될 수 있는 단일한 대형 F(ab')2 단편이 산출된다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에 추가적인 몇개의 잔기들이 있다는 점에서 Fab 단편과 다르다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인이 사이에 있는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지되는 양쪽 H 사슬의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 또한 이 영역은 특정 세포 유형 상에서 발견된 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 영역 가변 도메인이 단단하게 비공유결합적으로 회합되어 있는 이량체로 구성된다. 이러한 두 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 친화도가 낮지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로 또한 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 개관을 위해서는, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Borrebaeck 1995, 하기 문헌]을 참조한다.
본원에서 사용된 "LY6 결합 폴리펩티드"는 LY6 폴리펩티드, 리간드 또는 신호전달 성분에 각각 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드, 또는 이의 LY6 결합 부분 또는 단편이다. 이같은 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 이같은 올리고펩티드는 길이가 일반적으로 아미노산 적어도 약 5개이고, 별법적으로는 길이가 아미노산 적어도 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개 또는 그 이상이다. 이같은 올리고펩티드는 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990)]; [Lowman, H.B. et al. Biochemistry. 30:10832 (1991)]; [Clackson, T. et al. Nature. 352:624 (1991)]; [Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]; [Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363 (1991)], 및 [Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991)] 참조).
당해 표적 항원, 예를 들어 LY6에 "결합하는" LY6 길항제 (예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 소분자)는 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 있어서 유용한 진단, 예후 및/또는 치료 작용제이도록 충분한 친화도로 표적에 결합하고, 다른 단백질과는 유의하게 교차-반응하지 않는 것이다. 원치 않는 마커 폴리펩티드에 결합하는 정도는, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA)과 같은 일반적인 기술에 의해 결정 시, 특정한 원하는 표적에 결합하는 것의 약 10％ 미만일 것이다.
또한, 특정 LY6 폴리펩티드 또는 특정 LY6 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 이에 "특이적으로 결합한다" 또는 이에 대해 "특이적이다"라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 분자의 결합을 결합 활성이 없는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어, 과량의 표지되지 않은 표적과의 경쟁에 의해 특이적 결합이 결정될 수 있다. 이러한 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이 지시된다. 한 실시양태에서, 이같은 용어는 분자가 어떠한 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에도 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다. 별법적으로, 이같은 용어는 표적에 대한 Kd가 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 약 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 또는 그 이상인 분자에 의해 기술될 수 있다.
동일한 조직 유형의 정상적인 위장 세포 또는 조직과 비교하여, 세포 또는 조직에서 세포 내의 LY6 코딩 핵산이 증가된 것으로 나타나는 경우 또는 세포 또는 조직이 LY6 단백질을 과다하게 생산하여 분비하는 경우 위장 세포 또는 조직은 LY6을 "과발현"한다. 이같은 과발현은 유전자 증폭으로부터 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 초래될될 수 있다. 세포 표면에서의 수준 증가 또는 감소 또는 분비형 단백질의 수준 증가 또는 감소를 초래하는 변경된 발현 수준을 측정하는 다양한 진단 또는 예후 분석법이 공지되어 있고, 비제한적으로 항-LY6 항체를 사용하는 면역조직화학 분석법, FACS 분석 등을 포함한다. 별법적으로, 예를 들어, LY6-코딩 핵산 또는 이의 상보체에 상응하는 핵산-기재 프로브를 사용하는 형광 제자리 혼성화 (FISH; WO98/45479 (1998년 10월 공개) 참조), 서던(Southern) 블롯팅(blotting), 노던(Northern) 블롯팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량 실시간 PCR (RT-PCR)을 통해, LY6 코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을 세포 내에서 측정할 수 있다, 별법적으로, 항체-기재 분석법을 예를 들어 사용하여, 혈청과 같은 생체액 내의 박리된(shed) 항원을 측정함으로써 LY6 폴리펩티드 과발현이 결정된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,933,294 (1990년 6월 12일 허여); WO91/05264 (1991년 4월 18일 공개); 미국 특허 5,401,638 (1995년 3월 28일 허여); 및 [Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)]를 또한 참조). 상기 분석법에 더하여, 다양한 생체내 분석법이 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어, 환자의 신체 내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 동위원소로 임의적으로 표지된 항체에 노출시킬 수 있고, 예를 들어, 방사성에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 치료제에 이전에 노출된 환자로부터 취해진 생검물을 분석함으로써, 환자 내의 세포에 대한 항체의 결합을 평가할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "면역어드헤신"은 이종성 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성이 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합된 항체-유사 분자를 의미한다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종성"인) 원하는 결합 특이성이 있는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 전형적으로 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 적어도 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "표지"는 "표지된" 항체, 올리고펩티드 또는 기타 유기 분자가 생성되도록 항체, 올리고펩티드 또는 기타 유기 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 효소 및 이의 단편 예컨대 뉴클레오용해성(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함) 또는 소형-분자 독소와 같은 독소, 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하도록 의도된다. 기타 세포독성제가 하기에 기술된다. 종양치사제(tumoricidal agent)는 종양 세포의 파괴를 야기한다.
"화학요법제" 또는 "치료제"는 장애 또는 질환의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. IBD의 치료를 위한 화학요법제 또는 치료제의 예로는 항-염증성 약물인 술파살라진 및 5-아미노살리실산 (5-ASA)이 비제한적으로 포함된다; 메트로이다졸 및 시프로플록사신은 술파살라진과 효능이 유사하고, 항문주위 질환을 치료하는데 특히 유용한 것으로 보인다; 더욱 중증인 경우에, 코르티코스테로이드가 활성 악화를 치료하는데 효과적이며, 심지어 완화를 유지시킬 수 있다; 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트가 코르티코스테로이드의 만성 투여를 필요로 하는 환자에서 성공적인 것으로 또한 나타났다; 지사제 약물이 일부 환자에서 증상 경감을 또한 제공할 수 있다; 영양 요법 또는 기본식이 환자의 영양 상태를 개선하고 급성 질환의 증상 개선을 유도할 수 있다; 항생제가 2차 소장 박테리아 과잉성장의 치료 및 화농성 합병증의 치료에 사용된다. IBD 화학요법제에는 하기와 같은 생물학적 작용제 및 기타 작용제가 추가로 포함된다: 항-베타7 항체 (예를 들어, WO2006026759 참조), 항-알파4 항체 (예컨대 ANTEGEN®), 항-TNF 항체 (REMICADE®), 또는 5-ASA 화합물 ASACOL®, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™이 비제한적으로 포함되는 비-단백질 화합물, 및 기타 화합물 예컨대 퓨리네톨(Purinethol) 및 스테로이드 예컨대 프레드니손. 암의 치료를 위한 화학요법제의 예로는 히드록시우레아탁산 (예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제; 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸렌라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단); 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products (Eugene, OR)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, N.J.)), ABRAXANE™ 크레모포르-프리(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners (Schaumberg, Illinois)), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer (Antony, France)); 클로란부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONVOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 2가지 이상의 상기 물질들의 배합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약자인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)으로의 치료 요법에 대한 약자인 FOLFOX가 포함된다.
용어 "사이토카인"은 또다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반명이다. 이같은 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 포함된다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 종양 괴사 인자-β; 뮬러(mullerian)-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 및 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL) 예컨대 IL-1, IL-a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)가 포함되는 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
용어 "포장 삽입물"은 치료용 제품의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하도록 사용되고, 이러한 지침서는 이같은 치료용 제품의 사용에 관련된 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다.
"상피들", "상피의" 및 "상피"는 샘 및 이로부터 유래된 기타 구조물을 포함하는 내부 및 외부 신체 표면 (피부성, 점액성 및 장액성)의 세포성 덮개, 예를 들어, 각막 상피 세포, 식도 상피 세포, 표피 상피 세포, 및 모낭 상피 세포를 지칭한다. 상피 조직의 또다른 예로는 후각 상피 (비강의 후각 영역의 내면을 이루고 후각에 대한 수용체를 함유하는 거짓중층상피); 샘 상피 (분비형 세포로 구성된 상피); 편평 상피 (하나 이상의 세포층을 포함하고, 가장 외부의 층은 비늘모양 또는 판모양의 평평한 세포로 구성된 상피)가 포함된다. 상피는 수축 및 팽창으로 인한 커다란 기계적 변화가 적용되는 중공 기관, 예를 들어, 중층 편평 상피와 원주 상피 간의 이행을 나타내는 조직의 내면을 이루면서 특징적으로 발견되는 것과 같은 이행 상피를 또한 지칭할 수 있다.
세포의 "성장 상태"는 세포의 증식 속도 및/또는 세포의 분화 상태를 지칭한다. "변경된 성장 상태"는 비정상적인 속도의 증식을 특징으로 하는 세포 상태, 예를 들어, 정상 세포에 비해 증가된 또는 감소된 속도의 증식을 나타내는 세포이다.
용어 "LY6" 또는 "LY6 폴리펩티드"는 포유류 LY6 유전자 패밀리의 포유류 상동체 중 임의의 것을 유전학적으로 지칭하도록 본원에서 사용된다. 용어 "LY6"은 단백질 또는 핵산을 기술하도록 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "과발현"은 조직에 대한 정상적인 발현 수준보다 높은 조직의 세포 유전자 발현 수준을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "저발현"은 조직에 대한 정상적인 발현 수준보다 낮은 조직의 세포 유전자 발현 수준을 지칭한다. 어느 경우든, 더 높은 발현 또는 더 낮은 발현은 제어된 연구 조건 하에서 정상적인 발현과 상당히 상이하다.
"대조군"은 IBD를 앓고 있지 않은 포유동물에서의 정상적인 발현 또는 활성 또는 기준선을 결정하는데 사용하기 위한 샘플을 포함한다. 따라서, 대조군 샘플은 염증 및/또는 IBD, UC 또는 CD에 걸리지 않은 조직 또는 세포로부터 (표준 기술에 의해 결정됨); 예를 들어, IBD를 앓고 있지 않은 대상의 세포로부터의, 비-IBD 세포 또는 조직으로부터; IBD, 크론병, 또는 궤양성 대장염 장애가 없는 대상으로부터; IBD, CD 또는 UC가 걸릴 위험이 있는 것으로 추측되지 않는 대상으로부터; 또는 이같은 대상으로부터 유래된 세포 또는 세포주로부터를 포함하는 다수의 수단에 의해 수득될 수 있다. 대조군은 이전에 확립된 표준물을 또한 포함한다. 마이크로어레이 분석법이 포함되는 mRNA 분석법과 같은 분석법을 위해, 대조군은 보편적 대조군일 수 있다. 이같은 보편적 대조군은 건강한 조직들의 혼합물로부터 또는 다양한 조직으로부터 유래된 세포주들의 혼합물로부터 단리된 RNA, 예컨대, 비제한적으로, 본원에 개시된 보편적 기준 RNA로부터 수득한 특정 LY6 유전자의 RNA 발현 정보를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따라 수행된 임의의 시험 또는 분석법이 확립된 표준물과 비교될 수 있고, 매번 비교를 위해 대조군 샘플을 수득하는 것이 필요하지 않을 수 있다.
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본 발명의 진단 방법
IBD용 치료제의 사용이 침범된 조직 및/또는 세포가 대조군에 비해 증가된 LY6 발현을 나타내는 장애에 대해 특이적으로 표적화될 수 있는 것으로 추가적으로 구현된다. 따라서, 증가된 LY6 발현의 검출이 포유동물의 위장 조직에서 IBD, 예컨대 CD 또는 UC를 검출하는데 및/또는 인간 환자에서 IBD, UC 및/또는 CD를 경감시키는데 유용한, 화학요법제를 포함하는 IBD 치료제로의 치료가 특히 이로울 조직 및 장애를 확인하는데 사용될 수 있는 것으로 구현된다.
바람직한 실시양태에서, 유전자 전사물의 직접적인 검출에 의해 또는 단백질 수준의 검출에 의해 LY6 발현 수준이 검출된다. LY6 mRNA 전사물, 이로부터 합성된 cDNA, 또는 LY6 유전자 증폭이 존재하는 DNA에 대한 프로브의 혼성화에 주로 의존하는 다양한 기술들 중 임의의 것을 사용하여 전사물을 검출할 수 있다. 주지된 기술에는 전사물 수준의 노던 블롯팅, 역전사효소 PCR 및 마이크로어레이 분석이 포함된다. LY6 단백질 수준을 검출하는 방법에는 웨스턴 블롯팅, 면역침전, 2-차원 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (2D SDS-PAGE - 바람직하게는, LY6 단백질의 위치가 결정되어 있는 표준물에 대해 비교됨), 및 질량 분광법이 포함된다. 질량 분광법은 특정 샘플 내의 다수의 상이한 단백질 수준의 고처리량 확인을 허용하도록 일련의 정제 단계와 커플링될 수 있다. 단백질분해성 이벤트, 유비퀴틴화, 인산화, 지질 변형 등이 포함되는 단백질에 대한 전사후 변형을 확인하는데 질량 분광법 및 2D SDS-PAGE이 또한 사용될 수 있다. 기질 DNA에의 결합 또는 표적 프로모터의 시험관내 전사 활성화를 분석함으로써 LY6 활성을 또한 평가할 수 있다. 젤 이동(shift) 분석법, DNA 풋프린팅(footprinting) 분석법 및 DNA-단백질 가교 분석법 모두 DNA 상의 Gli 결합 부위에 결합할 수 있는 단백질의 존재를 평가하는데 사용될 수 있는 방법이다 (문헌 [J Mol. Med 77(6):459-68 (1999)]; [Cell 100(4): 423-34 (2000)]; [Development 127(19): 4923-4301 (2000)]).
특정 실시양태에서, LY6 전사물 수준이 측정되고, 대조군과 비교하여 현저하게 상승된 LY6 수준을 나타내는, 질환 또는 장애가 있는 조직이 IBD 치료 화합물로 처치된다. 따라서, LY6 발현 수준이 환자가 IBD를 앓고 있는지 여부 및 이러한 환자에게 IBD 치료제를 제공하여야 하는지 여부를 결정하기 위한 강력한 진단 수단이다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항체 조성물
A. 항-LY6 항체
한 실시양태에서, 본 발명은 항-LY6 항체의 용도를 제공하고, 이는 염증성 장 질환 예컨대 UC의 존재, 중증도를 결정하고/하거나 이러한 질환의 질환 경과를 진단하는 것에서의 치료제, 진단제 및/또는 예후제로서 본원에서 용도가 확인될 수 있다. 이같은 목적에 사용될 수 있는 예시적인 항체로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합체 항체가 포함된다. 용어 "항체"는 때때로 항원-결합 단편을 또한 포함한다. 항-LY6 항체는 시판되고, 예를 들어, R&D Systems (Minneapolis, MN)으로부터 시판된다. 항원으로서의 LY6에 특이적으로 결합하는 항체는 상업적으로 수득될 수 있거나, 또는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항체 및 단백질 화학 분야에 공지된 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 US 7,144,990에 LYPD1에 대한 항체가 개시되어 있고, 상기 특허는 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 애주번트(adjuvant)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 상승된다. 면역화될 종에서 면역원성인 단백질에 관련 항원 (특히 합성 펩티드가 사용되는 경우)을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (식중, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 항원을 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시킬 수 있다.
예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3배 용량의 프로인트(Freund) 완전 애주번트와 합하고, 이 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물들을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 애주번트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅(boosting)시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 접합체는 재조합 세포 배양에서 단백질 융합물로서 또한 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제가 면역 응답을 강화시키기 위해 적절하게 사용된다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고 나서, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성시킨다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포 (융합 파트너로 또한 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에 파종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 선별 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 지지하며, 융합되지 않은 모 세포에 대해 선별하는 선별 배지에 대해 감수성인 골수종 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 <Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California USA)>로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어, <American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA)>으로부터 입수가능한 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장 중인 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어, [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기술된 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 예를 들어, 마우스 내로의 세포의 복강내 주사에 의해, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문에는 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]이 포함된다.
추가적인 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리가 각각 기술되어 있다. 후속 문헌들에는 사슬 셔플링(shuffling)에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 ([Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 ([Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)])이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
예를 들어, 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567 및 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드 (이종성 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부와 융합시킴으로써, 항체를 코딩하는 DNA를 변형시켜 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열이 항체의 불변 도메인을 치환할 수 있거나, 또는 이러한 서열로 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성이 있는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성이 있는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체가 생성된다.
3. 인간 및 인간화 항체
본 발명의 실행에서 유용한 항-LY6 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열(subsequence))이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력이 있는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종의 CDR로부터의 잔기 (공여자 항체)로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)를 포함한다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 임포팅된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 것이다. 최적으로는, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 취해진다. 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, Winter 및 공동 연구원의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)])에 따라 인간화를 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항체가 인간 치료 용도에 의도되는 경우 항원성 및 HAMA 응답 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 그 내부의 인간 프레임워크 영역 (FR)이 인간화 항체용으로 수용된다 ([Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)]; [Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)]).
항원에 대한 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지시키면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 임포트 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
다양한 형태의 인간화 항-LY6 항체가 구현된다. 예를 들어, 인간화 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있고, 이는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)에 임의적으로 접합될 수 있다. 별법적으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG1 항체일 수 있다.
인간화의 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시,내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉(trnasgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852를 참조한다.
별법적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여, 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 하는 선별로 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선별된다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질을 일부 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 예를 들어 리뷰되어 있다. V-유전자 절편의 다양한 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체가 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 또한 생성될 수 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).
4. 항체 단편
특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 상응하는 전장 분자의 유사한 항원 결합 특이성을 유지하는 한편 단편의 더 작은 크기는 신속한 소거를 허용하고, 고형 종양에 대한 개선된 접근에 이를 수 있다.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편이 모두 대장균에서 발현되어 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 다량의 이러한 단편들이 손쉽게 생산되도록 한다. 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편들이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또다른 기술이 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적절하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합이 산출되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다 ([Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조). 또한 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에 기술된 것과 같이, "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
5. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성이 있는 항체이다. 대표적인 이중특이적 항체는 별도의 항원들에 결합할 수 있거나, 또는 본원에 기술된 특정 LY6 폴리펩티드의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또다른 이같은 항체는 상기 LY6 결합 부위를 또다른 단백질에 대한 결합 부위와 조합시킬 수 있다. 이중특이적 항체가 본 발명의 진단 방법에서 유용한 경우, 제2 항체 암(arm)이 검출가능한 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 사슬은 특이성이 상이하다 ([Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열(assortment)로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내로 공동-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 동등하지 않은 비율이 원하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 더 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우 또는 원하는 사슬 조합의 수율에 대해 비율이 유의한 효과가 없는 경우, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 암 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 바람직하지 않은 면역글로불린 사슬 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성시키는 것의 추가적인 상세사항을 위해, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 번호 5,731,168에 기술된 또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 타이로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 바람직하지 않은 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교된 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 바람직하지 않은 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/20373 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 개선된 분석법 검출을 위해 각각의 항체 상에 다수의 (동일하거나 상이한) 검출가능한 마커를 제공함으로써 본 발명의 방법에서 이종접합체 항체의 용도가 또한 발견된다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께, 적절한 가교제가 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그후 Fab'-TNB 유도체들 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보로 대장균으로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편이 대장균으로부터 별도로 분비되었고, 시험관내에서 지향성으로 화학적 커플링되어, 이중특이적 항체가 형성되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 후, 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메커니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조).
2가를 초과하는 항체가 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 ([Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]).
6. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빨리 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위가 있는 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 구성된다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대해 아미노 말단인 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 구성된다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 사슬 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하며, 이때 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n- VD2-(X2)n-Fc [식중, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다]를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 구현된 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의적으로, CL 도메인을 추가로 포함한다.
7. 이펙터 기능 조작
이펙터 기능과 관련하여, 예를 들어, 항체의 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)가 강화되도록, 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성되도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재화 능력이 개선되고/되거나 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC)이 증가될 수 있다 (문헌 [Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조). [Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 항-종양 활성이 강화된 동종이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작함으로써 보체 용해 및 ADCC 능력을 강화시킬 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조). 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,739,277에 기재된 바와 같이 항체 (특히, 항체 단편) 내로 샐비지 수용체 결합 에피토프를 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 담당하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
8. 면역접합체
본 발명은 세포독성제 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체) 및/또는 검출가능한 표지에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 또한 관련된다.
a. 화학요법제
이같은 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 상기에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된(radioconjugated) 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re가 포함된다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체가 제조된다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 대표적인 킬레이트화제이다 (WO 94/11026 참조).
1가지 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리키아마이신, 메이탄시노이드, 트리코테센 및 CC1065 및 독소 활성이 있는 이러한 독소들의 유도체와 항체의 접합체 또한 본원에서 구현된다.
B. LY6 결합 올리고펩티드
본 발명의 LY6 결합 올리고펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 LY6 폴리펩티드에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. LY6 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. LY6 결합 올리고펩티드는 길이가 일반적으로 아미노산 적어도 약 5개이고, 별법적으로는 길이가 아미노산 적어도 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개 또는 그 이상이며, 이때 이같은 올리고펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 LY6 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. LY6 결합 올리고펩티드는 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990)]; [Lowman, H.B. et al. Biochemistry. 30:10832 (1991)]; [Clackson, T. et al. Nature. 352:624 (1991)]; [Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]; [Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363 (1991)], 및 [Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991)] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 대형 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 라이브러리의 구성원(들)을 확인하도록 하는 주지된 기술들 중 하나이다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 ([Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science. 249: 386]). 파지 디스플레이의 활용은 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체들 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA들)의 대형 라이브러리가 표적 분자에 높은 친화도로 결합하는 서열들에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 의존한다. 파지 상의 펩티드 ([Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378]) 또는 단백질 ([Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 성질이 있는 것에 대해 수백만개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다 ([Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리를 분류하는 것은 다수의 변이체를 구축하고 증식시키기 위한 전략, 표적 수용체를 사용하는 친화성 정제 절차, 및 결합 강화의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 및 5,663,143.
대부분의 파지 디스플레이 방법에서 필라멘트형 파지가 사용되어 왔지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), T4 파지 디스플레이 시스템 ([Ren et al., Gene. 215: 439 (1998)]; [Zhu et al., Cancer Research. 58(15): 3209-3214 (1998)]; [Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997)]; [Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997)]; [Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996)]; [Efimov et al., Virus Genes. 10: 173 (1995)]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 ([Smith and Scott, Methods in Enzymology. 217: 228-257 (1993)]; U.S. 5,766,905)가 또한 공지되어 있다.
기본적인 파지 디스플레이 개념의 다수의 기타 개선물 및 변형물이 현재 개발되어 있다. 이러한 개선물들은 선택된 표적 분자에의 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 디스플레이 시스템의 능력 및 원하는 성질에 대해 이러한 단백질들을 스크리닝하는 잠재력이 있는 기능성 단백질을 디스플레이하는 능력을 강화시킨다. 파지 디스플레이 반응을 위한 조합형 반응 장치가 개발되었고 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리가 2분자성 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 구속된 나선형 펩티드의 성질 (WO 98/20036)을 분석 및 제어하는데 사용되었다. WO 97/35196에는 파지 디스플레이 라이브러리를 리간드가 표적 분자에 결합할 제1 용액 및 친화성 리간드가 표적 분자에 결합하지 않을 제2 용액과 접촉시켜 결합 리간드를 선택적으로 단리하는, 친화성 리간드를 단리하는 방법이 기술되어 있다. WO 97/46251에는 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 친화성-정제된 항체로 바이오패닝(biopanning)한 후, 결합 파지를 단리하고, 이어서 마이크로플레이트 웰을 사용하는 마이크로패닝(micropanning) 프로세스로 고친화성 결합 파지를 단리하는 방법이 기술되어 있다. 친화성 태그로서의 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 용도가 또한 보고되었다 ([Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314에는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합형 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하기 위해 기질 차감 라이브러리를 사용하는 것이 기술되어 있다. 파지 디스플레이를 사용하여 세제에서 사용하기에 적절한 효소를 선별하는 방법이 WO 97/09446에 기술되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선별하는 추가적인 방법이 미국 특허 번호 5,498,538, 5,432,018, 및 WO 98/15833에 기술되어 있다.
펩티드 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, 및 5,723,323에 또한 개시되어 있다.
한 양상에서, 본 발명은 LYPD5 폴리펩티드에 대한 리간드에 관한 것이다. 도 32는 형질감염되지 않은 COS 세포 (A), 및 GLG-1으로 형질감염되고 LYPD5-Fc 단백질로 염색된 COS 세포를 나타낸다. 한 실시양태에서, LYPD5에 대한 리간드는 서열 18, 20, 22, 또는 24 (각각 서열 17, 19, 21, 또는 23으로 제시된 핵산에 의해 코딩됨)에 제시된, 골지 복합체에 위치하는 당단백질 1 (GLG-1) 또는 E-셀렉틴 1 (ESL-1) 폴리펩티드이다. 또다른 실시양태에서, GLG-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 17, 19, 21, 또는 23의 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 500개 이상, 750개 이상, 1000개 이상, 1250개 이상, 1500개 이상, 1750개 이상, 2000개 이상, 2040개 이상, 2090개 이상, 2150개 이상, 2200개 이상, 2300개 이상, 2400개 이상, 2500개 이상, 2600개 이상, 2700개 이상, 2800개 이상, 2900개 이상, 3000개 이상, 3100개 이상, 3200개 이상, 3300개 이상, 3400개 이상, 3500개 이상, 3600개 이상, 3700, 또는 3720개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 GLG-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 17, 19, 21, 또는 23을 포함한다. 한 실시양태에서, GLG-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 17, 19, 21, 또는 23) 또는 이의 단편에 결합하는 폴리뉴클레오티드는 GLG-1 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 서열 동일성이 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 99％ 이상 또는 100％이다. 한 실시양태에서, GLG-1 폴리펩티드는 서열 18, 20, 22, 또는 24의 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 225개 이상, 250개 이상, 275개 이상, 300개 이상, 325개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 500개 이상, 550개 이상, 600개 이상, 650개 이상, 700개 이상, 750개 이상, 800개 이상, 850개 이상, 900개 이상, 950개 이상, 1000개 이상, 1050개 이상, 1100개 이상, 1150개 이상, 또는 1200개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나, 또는 GLG-1 폴리펩티드는 서열 18, 20, 22, 또는 24를 포함한다. GLG-1 또는 ESL-1은 중성구 상에서 발현되고, 조직 내로의 중성구의 분출에 수반되는 것으로 여겨지며, 염증에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다 (거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된 [Hidalgo et al. (2007) Immunity, 26(4): 477-489] 참조). GLG-1 또는 ESL-1에는 14개의 시스테인 풍부 GLG1 도메인이 있다. 세포외 도메인 (ECD)이 길며, 하기에 기술된 바와 같이, GLG-1 ECD의 변이체 또는 단편이 LYPD5에 결합하는 능력이 있는 것으로 발견되었다.
또다른 실시양태에서, LYPD5 리간드는 본원에 기술된 GLG-1 또는 ESL-1 분자의 변이체 또는 단편이다. 도 33A-B에 나타난 바와 같이, GLG-1 또는 ESL-1은 단편 1, 2, 3, 및 4로 고려될 수 있고, 실시예 11에 기술된 바와 같이, 4개의 단편 중 임의의 하나가 LYPD5 결합에 충분하다.
또다른 실시양태에서, LYPD5 리간드는 단일 GLG-1 도메인인 GLG-1 또는 ESL-1의 변이체 또는 단편이다. 도 34A-B에 나타난 바와 같이, GLG-1은 다수의 GLG-1 도메인으로 구성되고, 실시예 11에 기술된 바와 같이, 단일 GLG-1 도메인이 LYPD5 결합에 충분하다.
또다른 실시양태에서, LYPD5 리간드는 LYPD5에 특이적인 GLG-1 또는 ESL-1의 변이체 또는 단편이다. 도 35A-B에 나타난 바와 같이, GLG-1은 도메인 26-114, 도메인 115, 및 도메인 150을 포함하고, 실시예 11에 기술된 바와 같이, 도메인 115는 LYPD5에 결합하지만, 도메인 26-114는 LYPD5에 결합하지 않는다.
LY6 패밀리 구성원에 대한 변이체가 본 발명에서 구현되는 것과 동일한 방식으로 GLG-1의 변이체가 본 발명에서 구현된다.
C. 폴리펩티드 변이체
본원에 기술된 폴리펩티드, 항체 및 LY6 결합 폴리펩티드에 더하여, 본원에서 본 발명과 함께 사용하기 위해 이같은 분자들의 변이체가 제조될 수 있다는 것이 구현된다. 이같은 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 코딩 DNA 내로 도입함으로써, 및/또는 원하는 항체 또는 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자는 아미노산 변화로 이러한 분자들의 번역후 프로세스가 변경될 수 있다는 것, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것 또는 막 고정 특성을 변경시키는 것을 인식할 것이다.
예를 들어, 미국 특허 번호 5,364,934에 예를 들어 기재된 보존성 및 비-보존성 돌연변이에 대한 기술 및 가이드라인 중 임의의 것을 사용하여, 아미노산 서열에서의 변이가 이루어질 수 있다. 변이는 천연 서열과 비교하여 아미노산 서열에서의 변화를 초래하는, 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실, 삽입일 수 있다. 임의적으로, 변이는 당해 아미노산의 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 치환에 의한 것이다. 원하는 활성에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 어느 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 안내는 당해 아미노산 서열의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자와 비교하고 상동성이 높은 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화시킴으로써 확인될 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 성질이 유사한 또다른 아미노산으로 교체하는 것, 예컨대 류신을 세린으로 교체하는 것, 즉 보존성 아미노산 교체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의적으로 아미노산 약 1 내지 5개의 범위 내일 수 있다. 서열에서의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고 생성된 변이체를 전장 또는 성숙형 천연 서열이 나타내는 활성에 대해 시험함으로써, 허용되는 변이가 결정될 수 있다.
다양한 폴리펩티드의 단편이 본원에서 제공된다. 이같은 단편은, 예를 들어, 전장 천연 항체 또는 단백질과 비교했을 때, N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 내부 잔기가 결여될 수 있다. 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된 이같은 단편 또한 개시된 방법에서 유용하다.
상기 폴리펩티드 단편은 다수의 통상적인 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조할 수 있다. 원하는 펩티드 단편을 화학적으로 합성할 수 있다. 별법적인 접근법에는 효소에 의한 소화에 의해, 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 의해 규정되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 공지된 효소로 단백질을 처리함으로써, 또는 DNA를 적절한 제한 효소로 절단하고 원하는 단편을 단리함으로써 이같은 단편을 생성시키는 것이 수반된다. 또다른 적절한 기술에는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 원하는 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭시키는 것이 수반된다. DNA 단편의 원하는 말단을 규정짓는 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 이같은 단편은 상응하는 전장 분자와 하나 이상의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
특정 실시양태에서, 당해 보존성 치환이 바람직한 치환이라는 표제 하에 하기 표 6에서 제시된다. 이같은 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 6에서 예시적 치환으로 명명된 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입되고, 원하는 변이체를 확인하기 위해 생성물이 스크리닝된다.
Figure 112009057712971-pct00022
LY6 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 신원에서의 실질적인 변화는 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선별함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 클래스들 중의 하나의 구성원을 또다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이같은 치환된 잔기 또한 보존성 치환 부위 내로, 더욱 바람직하게는 나머지 (보존되지 않은) 부위 내로 도입될 수 있다.
변이는 당업계에 공지된 방법 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발 ([Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이유발 ([Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선별 돌연변이유발 ([Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA. 317:415 (1986)]) 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에 수행하여, 항-LY6 분자를 생산할 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석을 또한 사용하여, 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이같은 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 베타-탄소 너머의 측쇄가 삭제되고, 변이체의 주쇄 형상을 덜 변형시킬 것 같기 때문에, 이러한 군 중에서 알라닌이 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다 ([Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]). 가장 통상적인 아미노산이기 때문에, 알라닌이 또한 전형적으로 바람직하다. 게다가, 알라닌은 매립된 위치 및 노출된 위치 양쪽 모두에서 빈번하게 발견된다 ([Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환으로 적당한 양의 변이체가 산출되지 않으면, 이소테릭(isoteric) 아미노산이 사용될 수 있다.
LY6 폴리펩티드의 적합한 형상을 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 치환되어 (일반적으로 세린으로 치환됨), 분자의 산화적 안정성이 개선되고 비정상적인 가교가 방지될 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 이같은 분자에 부가되어 이의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
특히 바람직한 유형의 치환 변이체에는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것이 수반된다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선별된 생성된 변이체(들)는 이들이 유래되는 모 항체에 비해 생물학적 성질이 개선될 것이다. 이같은 치환 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체가 각각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트형 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체가 본원에 개시된 바와 같이 이의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형에 대한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 현저하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 표적 폴리펩티드 간의 접촉 지점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이같은 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에서 상술된 기술에 따른 치환에 대한 후보물이다. 일단 이같은 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석법에서 탁월한 성질이 있는 항체를 추가적인 개발용으로 선별할 수 있다.
당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 LY6 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자가 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 천연 서열 또는 앞서 제조된 변이체의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
D. 폴리펩티드의 변형
공유결합적으로 변형된 폴리펩티드 및/또는 항체 또한 본 발명의 범주 내에서 사용하기에 적절할 수 있다. 한가지 유형의 공유결합 변형은 이같은 항체 및 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 이같은 항체 및 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 2관능성 작용제로의 유도체화가, 예를 들어, 상기의 분자를 정제에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교시키는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제에는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)가 포함되는 동종이관능성(homobifunctional) 이미도에스테르, 이관능성 말레이미드 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제가 포함된다.
기타 변형으로는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화 ([T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화가 포함된다.
폴리펩티드 또는 항체의 또다른 유형의 공유결합 변형은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 천연 서열에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 (근원적인 글리코실화 부위를 제거함으로써 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써), 및/또는 각각의 천연 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미하도록 본원에서 의도된다. 또한, 이 문구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 성질 및 비율에서의 변화가 수반되는 천연 단백질의 글리코실화에서의 질적인 변화를 포함한다.
항체 및 기타 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 이루어진다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 이같은 항체 또는 폴리펩티드의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이같은 항체 또는 폴리펩티드 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 상기 아미노산 서열들을 코딩하는 DNA를 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 임의적으로 변경될 수 있다.
탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것에 의한 것이다. 이같은 방법은 당업계에, 예를 들어, WO 87/05330 (1987년 9월 11일 공개), 및 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.
탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해, 또는 글리코실화에 대한 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이성 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기술된 바와 같은 다양한 엔도(endo)- 및 엑소(exo)-글리코시다제를 사용함으로써 달성할 수 있다.
또다른 유형의 공유결합 변형은 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로, 다양한 비-단백질성 중합체들 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시키는 것을 포함한다. 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 LY6 폴리펩티드가 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술이 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시되어 있다.
한 폴리펩티드의 또다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대한 융합물로부터 생성된 키메라 분자를 형성시키는 변형이 본 발명에서 사용하는데 또한 구현된다.
한 실시양태에서, 이같은 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합물을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 이같은 항체 또는 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 놓인다. 이같은 에피토프 태그가 부착된 형태의 이같은 항체 또는 폴리펩티드의 존재를 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하여 친화성 정제에 의해 이같은 항체 또는 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있도록 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체가 당업계에 주지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; 인플루엔자 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 ([Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 ([Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체 ([Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])가 포함된다. 기타 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 ([Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 ([Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); α-튜불린 에피토프 펩티드 ([Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 ([Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])가 포함된다.
별법적인 실시양태에서, 키메라 분자는 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합물을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자 ("면역어드헤신"으로도 지칭됨)에 대해서, 이같은 융합물은 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. 바람직하게는 Ig 융합물은 Ig 분자 내의 하나 이상의 가변 영역 대신에 가용성 (막횡단 도메인이 결실되거나 불활성화된) 형태의 상기 항체 또는 폴리펩티드의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합물은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합물의 생산을 위해서는, 미국 특허 번호 5,428,130 (1995년 6월 27일 허여)를 또한 참조한다.
E. 폴리펩티드의 제조
주로 하기의 설명은 항체, 폴리펩티드 및 올리고펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하는 것에 의한 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다. 용어 "폴리펩티드"는 항체, 폴리펩티드 및 올리고펩티드를 포함할 수 있다. 물론, 당업계에 주지된 별법적인 방법이 이같은 항체, 폴리펩티드 및 올리고펩티드를 제조하는데 사용될 수 있는 것으로 구현된다. 예를 들어, 적합한 아미노산 서열, 또는 이의 일부분을 고체-상 기술을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조). 수동 기술을 사용하여 또는 자동화에 의해 시험관내 단백질 합성을 수행할 수 있다. 예를 들어, 자동화된 합성을 Applied Biosystems (Foster City, CA)의 펩티드 합성기를 사용하여 제조사의 지시에 따라 달성할 수 있다. 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 다양한 부분들을 별도로 화학적으로 합성하고, 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합하여, 원하는 생성물을 생산할 수 있다.
1. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리
폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이같은 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드 mRNA를 지니고 이를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 이같은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터, 게놈 라이브러리로부터, 또는 공지된 합성 절차 (예를 들어, 자동화된 핵산 합성)에 의해 편리하게 수득할 수 있다.
당해 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 디자인된 프로브 (예컨대 적어도 약 20-80개 염기의 올리고뉴클레오티드)로 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선택된 프로브로 스크리닝하는 것은 예컨대 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술된 표준 절차를 사용하여 수행할 수 있다. 별법적으로, PCR 방법을 사용할 수 있다 ([Sambrook et al., 상기 문헌]; [Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).
cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있다. 프로브로 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 거짓 양성이 최소화되도록 길이가 충분하여야 하고, 충분히 명백하여야 한다. 바람직하게는, 스크리닝될 라이브러리 내의 DNA에의 혼성화 시 검출될 수 있도록 올리고뉴클레오티드가 표지된다. 표지 방법은 당업계에 주지되어 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오틴화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중등도의 엄격성 및 고도의 엄격성이 포함되는 혼성화 조건이 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 제공된다.
이같은 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열을 GenBank와 같은 공공 데이타베이스 또는 기타 사설 서열 데이타베이스에 기탁되어 입수가능한 다른 공지된 서열에 대해 비교 및 정렬할 수 있다. 분자의 한정된 영역 내의 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서의 동일성)을 당업계에 공지되고 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 최초로 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여 스크리닝하고, 필요하다면, [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기술된 통상적인 프라이머 신장 절차를 사용하여, cDNA로 역-전사되지 않았을 수 있는 mRNA의 전구체 및 프로세싱 중간체를 검출함으로써, 단백질 코딩 서열이 있는 핵산을 수득할 수 있다.
2. 숙주 세포의 선별 및 형질전환
숙주 세포를 LY6 폴리펩티드 생산을 위한 본원에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험 없이 당업자가 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜, 및 실제적인 기술을 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 발견할 수 있다.
진핵생물 세포 형질감염 및 원핵생물 세포 형질전환 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 및 전기천공이 포함된다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이같은 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기술된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공이 원핵생물에 일반적으로 사용된다. [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일 공개)에 기술된 바와 같이, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로의 감염이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이같은 세포벽이 없는 포유류 세포에 대해서는, [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 사용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 양상이 미국 특허 번호 4,399,216에 기술되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 전형적으로 수행된다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하는 기타 방법, 예컨대 핵 미세주사, 전기천공, 무손상 세포와의 박테리아 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법을 또한 사용할 수 있다. 포유류 세포의 형질전환을 위한 다양한 기술에 대해서는, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현시키는데 적절한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 또는 고급 진핵생물 세포가 포함된다. 적절한 원핵생물에는 유박테리아(eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들어, 장내세균 예컨대 대장균이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 다양한 대장균 균주, 예컨대 대장균 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 대장균 X1776 (ATCC 31,537); 대장균 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 입수가능하다. 기타 적절한 원핵생물 숙주 세포에는 장내세균 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어, 대장균, 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus) 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710 (1989년 4월 12일 공개)에 개시된 바실리 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 이러한 예들은 제한적이기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효에 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해성 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에서의 돌연변이를 일으키도록 변형될 수 있고, 이같은 숙주의 예로는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 대장균 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3를 갖는 대장균 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan r 을 갖는 대장균 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 을 갖는 대장균 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 저항성 degP 결핍 돌연변이가 있는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4; 및 미국 특허 번호 4,946,783 (1990년 8월 7일 허여)에 개시된 돌연변이 원형질막주위공간 프로테아제를 갖는 대장균 균주가 포함된다. 별법적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 기타 핵산 중합효소 반응이 적절하다.
특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우에, 예컨대 치료용 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합되고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴에서 유효성을 나타내는 경우, 전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질을 박테리아에서 생산할 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 더 길다. 대장균에서의 생산은 더 빠르고, 비용 면에서 더 효율적이다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열 및 번역 개시 영역 (TIR)이 기술되어 있는 미국 특허 5,648,237 (Carter 등), 미국 특허 5,789,199 (Joly 등), 및 미국 특허 5,840,523 (Simmons 등)을 참조한다 (상기 특허들은 거명에 의해 본원에 포함됨). 발현 후, 항체를 대장균 세포 페이스트로부터 가용성 분획 내에 단리하고, 이소타입에 따라, 예를 들어, 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 적절한 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 발현된 항체를 정제하는 프로세스와 유사하게 수행할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵생물 미생물 예컨대 필라멘트형 진균 또는 효모가 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 통상적으로 사용되는 저급 진핵생물 숙주 미생물이다. 기타 미생물에는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) ([Beach and Nurse, Nature. 290:140 [1981]]; EP 139,383 (1985년 5월 2일 공개)); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 번호 4,943,529; [Fleer et al., Bio/Technology. 9:968-975 (1991)]), 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]]), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)]), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) ([Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:5259-5263 [1979]]); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 오시덴탈리스(Schanniomyces occidentalis) (EP 394,538 (1990년 10월 31일 공개)); 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (WO 91/00357 (1991년 1월 10일 공개)), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) ([Ballance et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun., 112:284-289 [1983]]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:1470-1474 [1984]]) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger) ([Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]])가 포함된다. 메틸영양성(methylotropic) 효모가 본원에서 적절하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로엑케라(Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis), 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 클래스의 효모의 대표적인 특정 종의 목록은 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs. 269 (1982)]에서 발견할 수 있다.
글리코실화 폴리펩티드의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 곤충 세포 예컨대 초파리 S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9, 뿐만 아니라 식물 세포, 예컨대 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양물이 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 배큘로바이러스(baculoviral) 균주 및 변이체, 및 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포주 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 원하는 폴리펩티드 생산을 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
3. 복제가능한 벡터의 선별 및 사용
각각의 LY6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 입수가능하다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지의 형태일 수 있다. 다양한 절차에 의해 적합한 핵산 서열이 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입한다. 일반적으로 벡터 성분은 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적절한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 결찰 기술을 사용한다.
원하는 폴리펩티드는 재조합에 의해 직접적으로 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있고, 상기 이종성 폴리펩티드는 신호 서열, 또는 성숙형 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 절단 부위가 있는 기타 폴리펩티드일 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 성숙형 서열을 코딩하는 DNA의 일부분일 수 있다. 신호 서열은 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더로 구성된 군으로부터 예를 들어 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은, 예를 들어, 효모 인버타제(invertase) 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함, 후자는 미국 특허 번호 5,010,182에 기술되어 있음), 또는 산 포스파타제 리더, 칸디다 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (EP 362,179 (1990년 4월 4일 공개)), 또는 WO 90/13646 (1990년 11월 15일 공개)에 기술된 신호일 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열, 예컨대 동일하거나 관련된 종의 분비형 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
발현 벡터 및 클로닝 벡터 양쪽 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이같은 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원이 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적절하고, 2μ 플라스미드 기원이 효모에 적절하며, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능 마커로 또한 명명된 선별 유전자를 전형적으로 함유할 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지에서 이용가능하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어, 바실러스의 경우 D-알라닌을 코딩하는 유전자이다.
포유류 세포에 대한 적절한 선별가능 마커의 예는 바람직한 단백질을 코딩하는 핵산을 받아들이는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적합한 숙주 세포는 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기술된 바와 같이 제조 및 증식된, DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적절한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 ([Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene. 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 ([Jones, Genetics. 85:12 (1977)]).
발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하기 위해, 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되된 프로모터를 일반적으로 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터들이 주지되어 있다. 원핵생물 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 ([Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature. 281:544 (1979)]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 ([Goeddel, Nucleic acids Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터 ([deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25 (1983)])가 포함된다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 원하는 단백질 서열을 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 또한 함유할 것이다.
효모와 함께 사용하기에 적절한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 ([Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]) 또는 기타 당분해성 효소 ([Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry. 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 전사가 제어되는 추가적인 장점이 있는 유도성 프로모터인기타 효모 프로모터는 알콜 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스 활용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기 위한 적절한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다.
포유류 숙주 세포에서의 DNA 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (UK 2,211,504 (1989년 7월 5일 공개)), 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이(Simian) 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 그리고 열-충격 프로모터로부터 수득한 프로모터에 의해 제어되고, 단, 이같은 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사가 증가될 수 있다. 인핸서는 프로모터 상에 작용하여 전사를 증가시키는, DNA의 시스-작용 요소 (일반적으로 약 10 내지 300 bp)이다. 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자들로부터 현재 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예로는 복제 기원의 후기 측면의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측면의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 상기의 아미노산 서열들의 코딩 서열의 5' 또는 3'인 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'인 부위에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 생물로부터의 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 또한 함유할 것이다. 이같은 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 그리고 종종 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 입수가능하다. 이러한 영역은 이러한 섹션에서 기술된 각각의 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서의 각각의 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 합성에 대해 개조하기에 적절한 또다른 방법, 벡터 및 숙주 세포가 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058에 기술되어 있다.
4. 숙주 세포 배양
LY6 폴리펩티드를 생산하는데 사용된 숙주 세포를 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판 배지가 숙주 세포의 배양에 적절하다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 배지들 중 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 사용할 수 있다. 필요하다면 임의의 이러한 배지에 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 임의의 기타 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
5. 유전자 증폭/발현 검출
본원에서 제공된 서열을 기초로, 적합하게 표지된 프로브를 사용하여, 유전자 증폭 및/또는 발현을 샘플에서 직접적으로, 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하는 노던 블롯팅 ([Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 제자리 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 별법적으로, DNA 이합체, RNA 이합체, 및 DNA-RNA 하이브리드 이합체 또는 DNA-단백질 이합체가 포함되는 특정 이합체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 이어서, 표면 상에 이합체가 형성되면 이합체에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록, 항체를 표지시킬 수 있고, 이합체가 표면에 결합된 분석법을 수행할 수 있다.
별법적으로, 유전자 발현을 면역학적 방법, 예컨대 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의해 측정하여, 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조될 수 있다. 간편하게, 천연 서열 폴리펩티드 또는 올리고펩티드에 대해, 또는 DNA에 융합되고 이같은 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해, 본 발명의 방법에 적절한 항체를 제조할 수 있다.
6. 단백질 정제
배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 폴리펩티드를 회수할 수 있다. 막-결합된 경우, 적절한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하여 또는 효소에 의한 절단에 의해 막으로부터 이를 방출시킬 수 있다. 상기 물질의 발현에 사용된 세포를 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴시킬 수 있다.
상기 물질을 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기의 절차는 대표적인 적절한 정제 절차이다: 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; Sephadex G-75를 예를 들어 사용하는 젤 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 에피토프 태그가 부착된 형태의 Wnt 길항제의 결합을 위한 금속 킬레이팅 컬럼. 다양한 단백질 정제 방법이 이용가능하고, 이같은 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은, 예를 들어, 사용된 생산 공정의 성질, 및 청구된 방법들에 대해 생산된 특정 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드에 좌우될 것이다.
재조합 기술을 사용할 때, LY6 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 이같은 분자가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입상물질 잔해물을, 예를 들어, 원심분리 또는 초여과에 의해 제거한다. [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 대장균의 원형질막 주위공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차가 기술되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분 동안 해동시킨다. 세포 잔해물을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF가 임의의 상기 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
예를 들어, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제가 일어날 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 ([Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 ([Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 거의 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 제어형 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 유속이 더 빠르게 하고 처리 시간이 더 짧게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker (Phillipsburg, NJ))가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라 기타 단백질 정제 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 당해 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 pH 약 2.5-4.5의 용출 완충제를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시킬 수 있고, 이는 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행된다.
H. 제약 제형
본 발명에 따라 사용된 치료 제형 ("치료제")은 원하는 정도의 순도를 갖는 치료제(들)를 임의의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington; The Science of Practice of Pharmacy, 20th edition, Gennaro, A. et al., Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)])와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 보관용으로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 아세테이트, 트리스, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 등장화제 예컨대 트레할로스 및 염화나트륨; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 바람직하게는, 제형은 5-200 ㎎/㎖, 바람직하게는 10-100 ㎎/㎖의 농도로 항체를 포함한다.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요한 경우 1가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성을 갖는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기의 치료제(들)에 더하여, 추가적인 항체, 예를 들어, 제2의 이같은 치료제, 또는 신경아교종의 성장에 영향을 미치는 성장 인자와 같은 일부 다른 표적에 대한 항체를 제형 내에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토카인, 성장 억제제, 항호르몬제 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이같은 분자들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
또한 활성 성분들은 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이같은 기술이 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 상기 문헌]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
염증성 장 질환의 진단 및/또는 치료를 위한 방법
포유동물, 예컨대 IBD를 앓고 있는 포유동물의 위장 조직 또는 세포에서의 LY6 발현을 결정하기 위해, 다양한 진단 분석법이 이용가능하다. 한 실시양태에서, LY6 폴리펩티드 과발현을 RT-PCR, 제자리 혼성화, 마이크로어레이 분석, 및/또는 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석할 수 있다. 포유동물 (예컨대 비제한적으로 인간)로부터의 위장 생검물 (예컨대 결장, 더욱 구체적으로는 S자 결장)으로부터의 신선한 조직 절편, 동결 조직 절편 및/또는 파라핀에 매립된 조직 절편을 RT-PCR, 제자리 혼성화, 마이크로어레이 분석 및/또는 IHC 분석법에 적용할 수 있다.
별법적으로 또는 추가적으로, FISH 분석법 예컨대 INFORM® (Ventana (Arizona) 판매) 또는 PATHVISION® (Vysis (Illinois) 판매)를 포르말린에 고정된, 파라핀-매립 종양 조직 상에 수행하여, 조직 샘플 또는 생검물에서의 LY6 발현 및/또는 상향조절의 정도 (존재하는 경우)를 결정할 수 있다.
생체내 진단 분석법을 사용하여, 예를 들어, 검출될 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사선 동위원소 또는 형광 표지)로 태그가 부착된 분자 (예컨대 항체, 올리고펩티드 또는 소분자)를 투여하고, 표지의 국소화에 대해 환자를 외부적으로 스캐닝함으로써, LY6 발현을 평가할 수 있다.
현재, IBD의 단계에 따라, 치료에는 하기 요법들 중 하나 또는 이의 조합이 수반된다: 침범된 장 조직을 제거하기 위한 수술, 치료제의 투여 (비제한적으로 화학요법 포함); 식이 변화, 및 생활양식 관리. IBD의 치료에서 유용한 치료제 또는 화학요법제는 당업계에 공지되어 있고, 대표적인 치료제 및 화학요법제가 본원에서 개시된다.
특히, 파클리탁셀 및 변형된 유도체로의 조합 요법 (예를 들어, EP0600517 참조)이 구현된다. 상기의 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 치료적 유효 용량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 또다른 실시양태에서, 이같은 항체, 올리고펩티드 또는 소분자는 화학요법제, 예를 들어, 파클리탁셀의 활성 및 효능을 증강시키는 화학요법과 함께 투여된다. [Physicians' Desk Reference (PDR)]에는 다양한 암의 치료에서 사용된 이러한 작용제들의 투여량이 개시되어 있다. 치료적으로 효과적인 이러한 상기 언급된 화학요법 약물들의 투여 요법 및 투여량은 치료될 특정 암, 질환의 정도 및 당업계의 의사에게 친숙한 기타 요인에 따라 좌우될 것이고, 의사가 이를 결정할 수 있다.
공지된 방법, 예컨대 정맥내 투여 (예를 들어, 볼루스로서의 투여 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의한 투여)에 따라서, 두개내, 뇌척수내, 관절내, 수막강내, 정맥내, 동맥내, 피하, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 치료제 또는 화학요법제가 인간 환자에게 투여된다.
본 발명은 진단 단계 및 치료 처치 단계를 수반하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (1) (a) 대상으로부터 수득한 조직 또는 세포의 시험 샘플, 및 (b) 대조군 샘플에서 LY6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 유전자의 발현 수준을 검출하고, 이때 대조군 샘플과 비교하여, 시험 샘플에서의 LY6 핵산 또는 유전자의 더 높은 발현 수준은 시험 샘플이 수득된 대상에 IBD가 존재함을 나타내는 것인 단계; 및 (2) 대상에게 유효량의 IBD 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상에서 염증성 장 질환 (IBD)을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, IBD 치료제는 또다른 IBD-관련 분자의 길항제이다. IBD에서 차별적으로 발현되는 다양한 IBD-관련 분자들이 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, IBD-관련 분자는 IBD에서 차별적으로 발현되는 분자이다. 또다른 실시양태에서, IBD-관련 분자는 IBD에서 과발현된다. 또다른 실시양태에서, 과발현된 IBD-관련 분자는 인테그린이다. 한 실시양태에서, IBD-관련 분자는 인테그린, 베타 7 (ITGB2)이다 (거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된 WO 2006/026759 참조). 본원에서 사용된 용어 "IBD 치료제"는 IBD-관련 분자의 길항제를 지칭한다. 한 실시양태에서, IBD 치료제는 인테그린의 길항제이다. 또다른 실시양태에서, IBD 치료제는 ITGB7의 길항제이다. 또다른 실시양태에서, IBD 치료제는 서열 68로 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열 69로 제시된 폴리펩티드의 길항제이다.
J. 제조품 및 키트
진단 용도를 위해, 제조품은 용기, 및 포유동물의 위장 조직 또는 세포에서의 LY6 (예컨대, 비제한적으로 LY6, LYPD1, LYPD3, 및/또는 LYPD5)의 발현을 검출하기 위한 용도를 지시하는, 용기 상의 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 조직 또는 세포는 위장 조직 또는 세포이다. 한 실시양태에서, 검출은 대조군 샘플에 비한 정량을 포함한다. 한 실시양태에서, 위장 조직 또는 세포가 포유동물의 결장으로부터의 것임이 용기, 표지 또는 포장 삽입물에서 지시된다. 한 실시양태에서, 대조군 샘플과 비하여 증가된 LY6 발현은 포유동물에서의 IBD (비제한적으로 CD 및/또는 UC를 포함함)를 지시한다는 것이 용기, 표지 또는 포장 삽입물에서 지시된다. 적절한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 추가적으로, 제조품은 완충제 또는 검출을 수행하는데 유용한 기타 시약 (예컨대 검출가능한 표지)를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 기타 완충제, 희석제, 필터 및 염료를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
LY6 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 LY6-결합 시약을 함유할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 LY6 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 분자를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품과 같이, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명과 함께 사용가능한 하나 이상의 이같은 LY6 결합 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포함하는 조성물을 보유한다. 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 예를 들어 함유하는 추가적인 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명서, 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단 용도를 위한 지침서를 제공할 수 있다.
K. 센스 및 안티-센스 LY6-코딩 핵산
LY6 유전자를 코딩하는 핵산에 결합할 것으로 예상되는 분자에는 표적 LY6 mRNA 또는 DNA 서열에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따르면, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 LY6 DNA의 코딩 영역의 단편 또는 이의 상보체를 포함한다. 소정의 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기초로 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력이, 예를 들어, [Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988] 및 [van der Krol et al., BioTechniques, 6:958, 1988]에 기술되어 있다.
LY6 유전자에 혼성화될 수 있는 센스 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 본 발명에 따라 조직 또는 세포 샘플 포유동물의 위장 조직 또는 세포에서 LY6 DNA 또는 mRNA의 존재를 검출하는데 유용하다. 본 발명에 따라 사용되는 센스 및/또는 안티센스 화합물은 주지된 고상 합성 기술을 통해 편리하게, 그리고 일상적으로 제조될 수 있다. Applied Biosystems (Foster City, Calif.)가 예를 들어 포함되는 여러 사업자가 이같은 합성을 위한 장치를 판매한다. 당업계에 공지된 이같은 합성을 위한 임의의 기타 수단을 추가적으로 또는 별법적으로 사용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것은 주지되어 있다. 본 발명의 화합물은 섭취, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위해 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물들의 혼합물, 예를 들어, 리포솜, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제형과 부가혼합되거나, 이에 캡슐화되거나, 이와 접합되거나 또는 다른 방식으로 조합될 수 있다. 이같은 섭취, 분포 및/또는 흡수 보조 제형의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 번호 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 및 5,595,756 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 PCR, RT-PCR, 혼성화 방법, 제자리 혼성화 등에 유용한 프라이머 및 프로브가 비제한적으로 포함된다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 또다른 예에는 유기 모이어티, 예컨대 WO 90/10048에 기술된 것들, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키는 또다른 모이어티, 예컨대 폴리-(L-라이신)에 공유결합으로 연결된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 인터칼레이팅제, 예컨대 엘립티신, 및 알킬화제 또는 금속 착물이 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착되어, 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.
안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 일반적으로 적어도 약 5개의 뉴클레오티드이고, 별법적으로는, 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개의 뉴클레오티드이며, 이때 이러한 문맥에서 용어 "약"은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 이러한 언급된 길이의 10％를 의미한다.
하기의 비제한적인 예들은 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 실시예에서 언급된 시판 시약들은 달리 지시되지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용되었다. 하기의 실시예에서 및/또는 명세서 전반에 걸쳐 ATCC 기탁 번호에 의해 확인된 세포주들의 공급원은 <American Type Culture Collection> (Manassas, VA)이다.
실시예 1: 재료 및 방법
시약, 세포 및 마우스: IFNγ, TNFα, 및 IL1β를 Peprotech™ (Rocky Hill, NJ)로부터 수득하였다. IFNα를 Hycult Biotechnology™ (The Netherlands)로부터 수득하였다. 가교 실험을 위해, 항-KLH 대조군 항체, 항-LY6A (클론 E113-161.7 또는 D7)를 Pharmingen™ (San Diego, CA)로부터 수득하였다. 항-LY6C (클론 HK1.4)를 Southern Biotech™ (Birmingham, AL)으로부터 수득하였다.
만성 CD45RBhigh 전이 대장염을 Balb/c 배경 상에서 SCID 마우스에서 이전에 기술된 바와 같이 유도하였다 ([Powrie, F. et al., (1994) Immunity 1:553-562]). 자발적 대장염이 발달되는 129 배경 상의 IL10-/- 마우스 ([Kuhn, R. et al., (1993) Cell 15:263-274])를 11주령 내지 13주령 사이에 희생시켰다. 기술된 바와 같은 실험에서 사용할 때까지 결장을 OCT에서 스냅(snap) 동결시켰다. 근위부 결장, 중간 결장, 원위부 결장 및 직장을 0-5 (0 = 정상적인 장, 5 = 중증 질환)의 등급을 사용하여 채점하였다. 점수를 합산하여, 각각의 동물에 대한 전체 대장염 중증도 점수에 도달하였다.
이전에 기술된 바와 같이 ([Whitehead, R.H. et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:587-591]), 청소년 마우스 결장세포 (YAMC) 세포주 (Vanderbilt University Medical Center (Nahville, TN)의 Robert Whitehead 제공)가 인터페론-γ-의존적 프로모터의 제어 하의 온도 민감성 T-항원 (tsTag)을 함유하는 트랜스제닉 동물인 Immortomouse™으로부터 유래되었다. YAMC 세포는 5 유닛/㎖ IFN-γ (Peprotech™, New Jersey)의 존재 하에 32℃의 허용성 조건 하에 증식하지만, 37℃에서 IFN-γ의 제거 시에는 더 이상 증식하지 않는다 (비-허용성 조건).
YAMC 세포를 5％ FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 5 U/㎖ IFNγ 및 N-2 보충물을 함유하는 RPMI (Invitrogen™ (Carlsbad, CA))에서 배양하였다. 실험 전 24시간 동안, 그리고 실험 기간 동안 세포를 비-허용성 조건 하에 배양하였다.
CMT93 세포를 ATCC (ATCC Number® CCL-223™, ATCC (Manassas, VA))로부터 수득하여, 10％ FBS, 2 mM L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
레이저 포착 현미경검사 및 RNA 정제: 10-12 ㎛ 절편을 LCM 막 슬라이드 (Molecular Machines™ (Glattbrugg, Switzerland)) 상에 적용하였다. 슬라이드를 단축형 H&E 염색으로 염색한 후 (총 시간 약 5분), 움 상피 세포를 조직학적으로 확인하고, MMI Cellcut™ 현미경 (Molecular Machines (Glattbrugg, Switzerland))을 사용하여 절개하였다. 절개된 세포로부터 Arcturus™ Picopure™ RNA 정제 키트 및 제조업자의 프로토콜 (Arcturus™ (Sunnyvale, CA))을 사용하여 RNA를 정제하고, NanoDrop ND-1000™ 분광광도계 (NanoDrop Technologies™ (Wilmington, DE))를 사용하여 정량하였다.
마이크로어레이 혼성화 및 데이터 분석: 입력된 전체 RNA 샘플의 품질 및 양을 각각 ND-1000 분광광도계 (NanoDrop™ Technologies (Montchanin, DE)) 및 Bioanalyzer 2100™ (Agilent™ Technologies (Palo Alto, CA))을 사용하여 결정하였다. Cy-염료로 표지된 cRNA 및 어레이 혼성화의 제조를 위한 방법은 Agilent™ Technologies (Palo Alto, CA)에 의해 제공되었다. 간략하게, 전체 RNA 샘플을 이 중 가닥 cDNA로 전환시킨 후, Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification™ 키트 (Agilent™, 제품# 5184-3523)를 사용하여 표지된 cRNA로 전환시켰다. 표지된 cRNA를 RNeasy™ 미니 키트 (Qiagen™ (San Diego, CA))를 사용하여 정제한 후, ND-1000™ 분광광도계 (Nanodrop™ Technologies)를 사용하여 정량하였다. 표지된 cRNA를 Novex™ TBE-Urea 젤 (Invitrogen™ (Carlsbad, CA)) 상에 러닝(running)시킨 후의 Typhoon™ 스캐너 (GE Healthcare™ (Piscataway, NJ)) 상에서의 젤 스캐닝에 의해 Cy-염료 혼입을 결정하였다. Cy-염료 형광 카운트의 양을 결정하기 위해, 젤 영상을 ImageQuant™ 소프트웨어 (GE Healthcare™)를 사용하여 분석하였다. 약 500,000 카운트의 Cy-염료로 표지된 cRNA가 단편화되었고, Agilent의 제자리 혼성화 키트-플러스 (Agilent™, 제품# 5184-3568)에 기술된 바와 같이 Agilent의 전체 마우스 게놈 어레이에 혼성화되었다. LCM 샘플들을 Cy5 염료로 염색하고, Cy3 염료로 표지된 보편적 마우스 기준 (Stratagene™ (La Jolla, CA))에 대해 혼성화시켰다. 혼성화 후, 어레이를 세정하고, 아세토니트릴로 건조시키고, Agilent™ DNA 마이크로어레이 스캐너 상에서 스캐닝하였다. 어레이 영상 파일을 Agilent™의 Feature Extraction™ 소프트웨어 7.5를 사용하여 분석하였고, Resolver™ (Merck™ (Seattle, WA))을 사용하여 추가적인 데이터 분석을 수행하였다.
Rosetta Resolver™ 소프트웨어 (Rosetta Biosoftware™ (Seattle, WA))를 사용하여 데이터를 분석하였다. 간략하게, 건강한 샘플 및 대장염 샘플을 별도로 분류하고, 양쪽 꼬리 ANOVA (p<0.05)를 통과한 프로브들을 선택하였다. 이러한 프로브들을 건강한 샘플에 비해 대장염 샘플에서 2배 이상의 변화를 나타낸 프로브들 에 대해 추가로 분석하였다.
실시간 정량 RT-PCR: 추출된 RNA 상에서 Taqman™ Gold™ RT-PCR 키트 및 시약 (Applied Biosystems™ (Foster City, CA))을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 5'-FAM 및 3'-TAMRA 표지된 내부 프로브를 사용하여 유전자 특이적 프라이머로 모든 샘플을 러닝시켰다. [Livak, KJ., and T.D. Schmittgen (2001) Methods 25:402-408]에 기술된 바와 같은 2-ΔΔCt 방법에 의해 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 SPF31에 특이적인 프라이머와 비교하여 분석을 수행하였다. 프라이머 및 프로브들은 Primer3™ 소프트웨어 ([Rozen, S., and H. Skaletsky (2000) Methods Mol Biol 132:365-386])를 사용하여 디자인되었거나, 또는 시판되었다 (Applied Biosystems™). 이러한 분석법에 사용된 프라이머 및 프로브는 하기와 같고, 이는 5'-3' 방향으로 제시된다:
LY6A:
센스: CTT ACC CAT CTG CCC TCC TA (서열 39)
안티센스: CCT CCA TTG GGA ACT GCT AC (서열 40)
프로브: TCC TGT TGC CAG GAA GAC CTC TGC (서열 41)
LY6C:
센스: ACT TCC TGC CCA GCA GTT AC (서열 42)
안티센스: GGC ACT GAC GGG TCT TTA GT (서열 43)
프로브: CTG CCG CGC CTC TGA TGG AT (서열 44)
면역형광 염색: 동결된 조직을 5 ㎛ 절편으로 절단하고, 비오틴화 항-LY6C (Southern Biotech™ (Birmingham, AL)) 또는 2.5 ng/㎖의 항-SCA-1 (R&D Systems™ (Minneapolis, MN))으로 염색하였다. 슬라이드를 세정하고, Alexa Fluor™ 488에 접합된 스트렙타비딘으로 표지하고, Prolong Gold™ + DAPI (Invitrogen™ (Carlsbad, CA))로 마운팅하고, 공초점 현미경에 의해 시각화하였다.
LY6 분자 가교: YAMC 세포를 플레이트에 결합된 항-LY6C 또는 항-KLH (대조군) 항체와 함께 인큐베이션하고, 케모카인 CXCL2, CXCL5 및 CCL7의 생산을 측정함으로써, 케모카인 생산을 초래하는 가교된 LY6 폴리펩티드의 능력을 시험하였다. 가교를 위해 세포 막에서의 지질 래프트 형성이 필요하기 때문에, 정상적인 래프트 형성 조건 (콜레스테롤이 결핍되지 않음) 및 콜레스테롤이 결핍된 조건 하에 케모카인 생산을 시험하였다.
플레이트에 결합된 항체를 사용하여 가교시키기 위해, 5 ㎍/㎖ 농도의 항-LY6C 또는 항-KLH (대조군) 항체 100 ㎕를 96웰 플레이트에 첨가하거나, 2 ㎖를 60㎟ 접시에 첨가하고, 4℃에서 15시간 동안 플레이트에 결합되도록 하였다. 콜레스테롤 결핍 또는 비-결핍 조건 (하기 실시예 5에서 제공됨)에서 성장된 YAMC 세포를 플레이트에 결합된 항체와 함께 32℃에서 15시간 동안 콜레스테롤 비-결핍 조건 하에 인큐베이션하고, RNA를 수집하고, CXCL2, CXCL5, 및 CCL7의 발현 수준을 결정하였다. 본원의 실시예 5에서 이러한 분석법이 추가로 기술되고, 결과가 제시된다.
siRNA 억제: 뮤린 LY6C에 대해 지시된 개별적인 siRNA들을 Dharmacon (Lafayette, CO)로부터 수득하였다. siRNA를 리포펙타민 2000 (Invitrogen) 및 표 준 프로토콜을 사용하여 YAMC 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 세포를 수집하여, 녹다운 효율을 결정하였다. 우수한 녹다운 효율 (정량 RT-PCR에 의한 95％ 억제)을 기초로 1개의 siRNA가 가교 실험용으로 선택하였다.
CXCL5 분비: 자극된 세포로부터 지시된 시점에 상등액을 수집하고, 사이토카인 CXCL5 농도를 R&D Systems™로부터 시판되는 키트 및 제조업자의 프로토콜을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 검출 수준은 15 pg/㎖의 CXCL5였다.
콜레스테롤 결핍: YAMC 세포를 37℃에서 72시간 동안 무혈청 배지에서 4 μM 로바스타틴 및 250 μM 메발로네이트 (Sigma)의 존재 하에 배양하였다. 세포를 플레이팅하고, 실험 전반에 걸쳐 로바스타틴 및 메발로네이트에서 유지시켰다.
통계학: 군들 간의 비교를 위해 스튜던트 t 검정법을 사용하였다 (*는 p<0.05를 가리킨다).
실시예 2: IEC의 유전자 발현 패턴이 대장염 동안 변경된다
IEC의 유전자 발현 패턴이 대장염의 마우스 모델, 뿐만 아니라 인간 IBD에서 현저하게 변경된다는 것이 연구에서 지시되었다 ([Fahlgren, A., et al. (2004) Clin Exp Immunol 137:379-385]; [Brand, S. et al. (2006) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290:G827-838]; [Ruiz, P.A. et al. (2005) J Immunol 174:2990-2999]). 본 실시예에서, IBD에서 변경된 신규 유전자 및 경로를 명확히 하기 위해 건강한 마우스 및 대장염 마우스의 IEC에서의 상승된 유전자 발현 패턴을 시험하였다.
CD45RBHi T 세포 전이 대장염 마우스 모델, 뿐만 아니라 IL10-/- 마우스 모델 (양쪽 모두 Th1 조절곤란으로부터 초래되고, 인간 크론병의 다수의 양상을 공유함)로부터의 장 상피 세포 (IEC)를 평가함으로써 IBD의 면역병리학에서 수반되는 유전자의 확인이 시도되었다 ([Elson, C.O. et al. (2005) Immunol Rev 206:260-276]; [Bouma, G., and W. Strober (2003) Nat Rev Immunol 3:521-533]). 레이저 포착 미세절개 (LCM)를 사용하여, 움 IEC를 뮤린 IBD의 2가지 모델의 건강한 마우스 및 대장염 마우스의 결장으로부터 단리하였다. 이러한 샘플들로부터 RNA를 추출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같은 마이크로어레이 기술에 의해 분석하였다. 전이 대장염 모델의 대장염 마우스의 IEC의 유전자 발현 프로파일에서는 대조군 마우스와 비교하여 2배를 초과하는 발현 변화가 있는 1770개의 프로브가 확인된 한편, IL10-/- 모델에서는 1140개의 프로브가 확인되었다. 양쪽 모델에서 중복되면서 발현에서 2배를 초과하는 변화가 있는 프로브는 540개였고, 이는 약 400개의 상이한 유전자에 상응한다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 3 : 대장염 동안 IEC에서 영향을 받는 경로 및 유전자
양쪽 모델에서 영향을 받은 약 400개의 유전자 중에서, 항원 제시, TLR 신호전달 및 세포 이동에 수반된 유전자들이 과잉으로 나타났다 (표 7). 표 7에서, 숫자들은 지시된 바와 같은 대장염의 IL10-/- 모델 또는 대장염의 CD45RBHi 모델에서 건강한 마우스에 대한 대장염 마우스의 보편적 표준물 RNA에 비교된 배수 변화의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 결과는 IEC에서 발현된 일부 유전자들이 IBD의 뮤 린 모델에서 변경된 발현 패턴들을 나타낸다는 것을 가리킨다. TLR2, CCL7, CXCL5 및 ICAM-I를 포함하는 이러한 유전자들 중 다수가 대장염 동안 상피 발현이 증가가된 것으로 이전에 기술되었고 ([Breider, M.A. et al. (1997) Vet Pathol 34:598-604]; [Uguccioni, M. et al. (1999) Am J Pathol 155:331-336]; [Z'Graggen, K. et al. (1997) Gastroenterology 113:808-816]; [Singh, J.C. et al. (2005) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 288:G514-524]), 이는 이러한 마이크로어레이에서 수득된 유전자 발현 패턴이 대장염에서의 IEC의 생물학의 정확한 반영물임을 시사한다.
Figure 112009057712971-pct00023
IEC는 비-전문적인 APC로 기능할 수 있고 ([Snoeck, V. et al., (2005) Microbes Infect 7:997-1004]; 및 [Shao, L et al., (2005) Immunol Rev 206:160-176]), 이러한 마이크로어레이에서 수득된 유전자 발현 패턴은 이러한 기능이 항원 제시와 관련된 유전자, 예컨대 LMP7 및 TAP1, 뿐만 아니라 IEC의 표면 상에서의 항원 제시를 강화시키는 작용을 할 MHC 클래스 I 및 II 유전자에서의 상향조절에 의해 대장염 동안 강화된다는 것을 가리킨다.
마이크로어레이 데이터는 대장염 IEC가 변경된 케모카인 발현을 통해 면역 세포를 결장으로 유인하고, 항원 제시와 관련된 유전자의 발현을 상향조절함으로써 침윤성 T 세포에 항원을 제시할 수 있다는 개념을 지지한다.
실시예 4: LY6 패밀리 구성원의 발현이 대장염 IEC 의 표면 상에서 강력하게 상향조절된다
마우스 LY6 패밀리의 구성원인 분자들이 전이 대장염 마우스 모델 및 IL10-/- 마우스 모델 양쪽 모두에서 갯수 면에서, 뿐만 아니라 상향조절 정도 면에서 과잉으로 나타났다 (도 23A 및 23B). 전이 대장염 모델의 풀링(pooling) 및 증폭된 IEC RNA의 실시간 정량 RT-PCR에 의해 이러한 결과들이 확증되었다 (데이터는 제시되지 않음). LY6 패밀리 구성원의 발현은 질환 상태에 독특하였고, 따라서 건강한 마우스는 이러한 LY6 패밀리 구성원들 중 어느 것도 감지가능한 수준으로 발현하지 않았다.
조혈 기원 세포의 표면 상에서의 뮤린 LY6 분자의 발현이 공지되어 있는 반면, IEC 상에서의 발현은 이전에 기술되지 않았다 ([Bamezai, A. (2004) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 52:255-266]; 및 [Rock, K.L. et al. (1989) Immunol Rev 111:195-224]). 결장 내에 존재하는 다수의 비-상피 세포, 예컨대 T 세포 및 과립구 상에서 뮤린 LY6A 및 LY6C의 발현이 검출가능하였다. 건강한 결장 및 대장염 결장 상에서 뮤린 LY6A 및 LY6C 양쪽 모두에 대해 면역형광 염색을 수행하였다. 건강한 IEC의 표면 상에서 뮤린 LY6A 및 LY6C의 수준은 최소이거나 부재하였다 (각각 도 24A 및 24C). 뮤린 LY6A 및 LY6C 양쪽 모두의 발현이 대장염 마우스의 결장 전반에 걸쳐 IEC의 표면 상에서 검출가능하였다 (각각 도 24B 및 24D). LY6A 또는 LY6C의 분극화의 증거가 없었고, 첨단측 막과 기저측 막 양쪽 모두 상에 염색이 존재하여, LY6 분자가 어느 한쪽 표면 상의 리간드에 접근가능하도록 하였다. 이러한 결과들은 뮤린 대장염 모델에서 뮤린 LY6A 및 LY6C의 상향조절을 나타내는 마이크로어레이 분석 결과가 오염성 면역 세포의 유입으로 인한 것이 아니였음을 가리킨다.
실시예 4: LY6 유전자의 전사가 염증성 사이토카인에 의해 자극된다
T 세포 상에서의 LY6 발현이 제I형 및 제II형 IFN 양쪽 모두에 의해 유도 및 강화된다 ([Khodadoust, M.M., K.D. Khan, and A.L. Bothwell. 1999. Complex regulation of Ly-6E gene transcription in T cells by IFNs. J Immunol 163:811-819]). 또한, 다수의 사이토카인의 발현이 활성 대장염 동안 결장에서 상승된다 ([Niessner, M., and B.A. Volk. 1995. Altered Th1/Th2 cytokine profiles in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bowel disease as assessed by quantitative reversed transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR). Clin Exp Immunol 101:428-435]).
대장염 동안 존재하는 사이토카인이 IEC에서 LY6 패밀리 구성원의 전사에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 본 발명가들은 조건부로 불멸화된 뮤린 IEC 세포주인 YAMC 세포를 IL-1β, IFNα, TNFα, IFNγ 또는 TNF α와 IFNγ의 조합물로 처리하고, 모든 확인된 뮤린 LY6 유전자의 전사를 실시간 정량 RT-PCR (표 8)에 의해 분석하였다. 간략하게, IEC에서의 지시된 LY6 패밀리 구성원의 mRNA 수준을 지시된 사이토카인으로 처리하고 나서 15시간 후에 실시간 정량 RT-PCR에 의해 결정하였다. 숫자는 미처리된 배지 대조군과 비교된 배수 변화 (2-ΔΔ Ct 방법에 의해 결정됨)를 나타내고, *는 배지 대조군과 비교하여 P<0.05를, †는 IFNγ으로 처리된 세포와 비교하여 p<0.05를 나타낸다. 하기의 LY6 패밀리 구성원은 시험되었지만 처리와 상관 없이 샘플에서 검출되지 않았다: LY6K, Lypd3, Lypd4, Lypd5, LY6g5b, Ly6g6d, Ly6g6e, Slurp1. 결과는 IEC가 염증성 사이토카인에 응답하여 LY6 패밀리 구성원들을 상향조절한다는 것을 가리킨다.
Figure 112009057712971-pct00024
다수의 LY6 패밀리 구성원들이 염증성 사이토카인의 존재 또는 부재 하에 검출되지 않았지만, 본 발명가들은 시험된 사이토카인 대다수에 응답한 뮤린 LY6A, LY6C 및 LY6F의 전사에서의 강력한 상향조절, 뿐만 아니라 시험된 사이토카인 일부에 응답한 뮤린 LY6E, LY6H 및 LYPD1의 더욱 중등도인 상향조절을 검출하였다. 그러나, IFNγ은 LY6 상향조절을 유도하는데 있어서 단연 가장 강력한 사이토카인이었다. 또한, TNFα는 LY6A, LY6F, LY6E 및 LYPD1의 발현에 대한 IFNγ의 효과를 강화시켰다. LY6 패밀리 구성원의 유사한 상향조절이 또다른 뮤린 IEC 세포주인 CMT93에서 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
사이토카인에 응답한 LY6 패밀리 구성원의 표면 발현을 시험하기 위해, YAMC 세포를 상기 사이토카인에 노출시키고, 실시예 1에서 본원에 기술된 바와 같이, 뮤린 LY6A 및 LY6C (이들에 대한 시판 항체가 입수가능함)의 발현에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 높은 수준의 뮤린 LY6A가 사이토카인이 첨가되지 않은 경우에도 YAMC 세포 상에서 발현되었다 (도 25B, 배지). 뮤린 LY6C의 발현 (도 25A, 배지)은 LY6A의 발현보다 상당히 낮았다.
IL-1β 및 TNFα는, RNA 발현과 일치하여, 뮤린 LY6A 및 LY6C 양쪽 모두의 표면 발현에서의 약간의 증가를 유도하였다 (도 25A 및 25B). IFNα가 세포에 첨가되었을 때 발현에서의 더욱 중등도의 증가가 주지된 한편, IFNγ는 LY6A 및 LY6C 양쪽 모두의 표면 발현에서의 극적인 증가를 유도하였다 (도 25A 및 25B). 표면 단백질 발현은 RNA 발현을 밀접하게 반영하였다. Th2 사이토카인, 예컨대 IL4, IL10 또는 IL13은 LY6A 또는 LY6C의 표면 발현에 대한 효과가 없었다 (데이터는 제시되지 않음).
IFNγ에 의한 LY6A (도 25D) 및 LY6C (도 25C) 양쪽 모두의 유도는 용량 의존적이었다. 6.25 유닛/㎖만큼 낮은 IFNγ의 용량으로 유동 세포측정에 의해 양쪽 LY6 분자 모두에서 검출가능한 증가가 초래되었다. 또한, LY6A (도 25F) 및 LY6C (도 25E) 양쪽 모두의 표면 발현에서의 증가가 IFNγ 처리 후 2시간 내지 4시간 사이에 명확해졌고, IFNγ 처리 후 적어도 24시간 동안 꾸준히 증가하였다. 이러한 데이터는 비교적 낮은 농도의 IFNγ가 수시간 이내에 LY6 분자의 표면 발현을 증가시키는데 충분하다는 것을 가리킨다.
활성화된 T 세포에서 주로 분비되는 IL-22가 IEC 상에 존재하는 IL-22R 복합체를 통해 기능하여, 사이토카인 생산 및 염증성 표현형을 촉진한다는 증거가 있다 ([Brand, S. F. et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290:G827-838 (2006)]). 또한, IL-22는 크론병의 면역발병기전에 수반된다. IL-22가 뮤린 IEC 상에서의 LY6 분자 발현에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해, YAMC 세포를 IL-22의 존재 하에 배양하고, LY6C (도 25G) 및 LY6A (도 25H)의 발현에 대해 분석하였다. 양쪽 LY6 분자 모두 IL-22의 존재 하에 IFNγ로의 처리 후에 나타난 유도에 필적하는 수준으로 실질적으로 증가되었다.
LY6 분자의 상향조절이 YAMC 세포주에 특이적이지 않았음을 확실히 하기 위해, 뮤린 결장 상피 종양 세포주 CMT93에서의 뮤린 LY6A 및 LY6C의 RNA 수준을 시험하였다. 뮤린 LY6A 및 뮤린 LY6C 양쪽 모두의 수준이 IFNγ로의 처리 시 상향조절되었다 (도 25I). LY6 분자들의 상향조절 수준이 CMT93 세포에서 더욱 수수하였지만, 유동 세포측정 분석은 미처리 세포에서도 수준이 꽤 높았음을 가리켰고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 CMT93 세포의 종양 표현형의 결과일 것이다.
이러한 데이터는 IEC가 염증성 사이토카인에 응답하여 LY6 패밀리 구성원을 상향조절한다는 것을 확증하는데 있어서 실시간 정량 RT-PCR에 의해 수득된 데이터를 지지한다.
실시예 5: IEC 의 LY6 자극이 지질 래프트 형성과 관련된다
GPI-앵커형 단백질로서, LY6 패밀리 구성원은 전통적인 아웃사이드-인(outside-in) 신호전달과 관련된 독특한 세포내 도메인을 소유하지 않는다. 그보다는, 이들은 지질 래프트 마이크로도메인 내에 존재한다 ([Bohuslav, J. et al. Eur J Immunol 23:825- 831(1993)). 그러나, 세포 표면 상에서의 LY6 패밀리 구성원의 가교는 또다른 세포 표면 분자의 재분배, 뿐만 아니라 지질 래프트 구조물의 재구성을 초래한다는 것이 제안되었고, 이는 LY6 분자가 신호 전달 및 하류의 세포성 기능에 영향을 미칠 수 있는 메커니즘을 시사한다 ([Simons, K. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 1:31-39 (2000)]).
현재까지 LY6 단백질에 대한 리간드가 거의 확인되지 않았고, LY6A 또는 LY6C에 대한 리간드는 현재 공지되어 있지 않다 ([Paret, C. et al., (2005) Int J Cancer 115:724-733]; [Apostolopoulos, J. et al., (2000) Immunity 12:223-232]; 및 [Classon, B.J. (2001) Trends Immunol. 22:126-127]). 지질 래프트 통합성을 유지하는데 콜레스테롤이 요구되고 ([Simons, K., et al. J Clin Invest 110:597-603 (2002)]), 시험관 내에서 지질 래프트 생합성을 억제하는데 콜레스테롤 결핍이 종종 사용된다 ([von Tresckow, B. et al. J Immunol 172:4324-4331 (2004)]).
LY6 가교에 응답하여 IEC에서 지질 래프트 재구성이 일어나는지 여부를 분석하기 위해, YAMC 세포를 콜레스테롤 결핍 조건 (지질 래프트가 세포로부터 결핍되는 조건) 및 콜레스테롤 비-결핍 조건 (지질 래프트 형성에 대해 허용성인 조건)에서 성장시켰다. 콜레스테롤 결핍 조건에 대해, YAMC 세포를 혈청의 부재 하에, 4μM 로바스타틴 및 0.25 mM 메발로네이트 (Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO))의 존재 하에 72시간 동안 37℃에서 성장시켰다. 로바스타틴 또는 메발로네이트가 성장 배지에 첨가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 성장 조건을 콜레스테롤 비-결핍 조건 하의 YAMC 세포에 사용하였다. 그후, 세포를 리프팅(lifting)시키고, LY6C를 실시예 1에 기술된 바와 같이 가교시켰다. RNA를 수집하고, CXCL2, CXCL5, 및 CCL7의 발현 수준을 결정하였다.
이러한 연구의 결과들은 지질 래프트 결핍이 LY6C-매개 케모카인 생산의 억제를 초래한다는 것을 가리켰다. 도 26A-26C는 콜레스테롤 결핍 (흑색 막대) YAMC 세포가 콜레스테롤이 결핍되지 않은 세포 (백색 막대)보다 케모카인을 덜 생산하였음을 나타낸다. 콜레스테롤 결핍은, LY6C 자극과 상관 없이, 항-KLH로 자극된 대조군에서 케모카인 생산에 영향을 미쳤지만, 응답이 최소였고, 일관적인 방향이 아니였다. 콜레스테롤 결핍이 세포 생육력에 전반적으로 영향을 미쳤는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명가들은 7AAD 제외에 의해 세포 사망을 측정하였고, 콜레스테롤 결핍이 YAMC 세포의 생육력에 현저하게 영향을 미치지 않았음을 결정하였다 (92％ 생육력 대 콜레스테롤 결핍 세포에서의 86％; 데이터는 제시되지 않음). LY6A (도 26D) 및 LY6C (도 26E) 양쪽 모두의 표면 발현이 콜레스테롤 결핍 YAMC 세포에서 양쪽 모두 상당히 더 낮았고, 이는 형질막 콜레스테롤 수준 및 지질 래프트 통합성이 세포 표면 상에서의 LY6 발현 수준에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 이러한 데이터는 콜레스테롤 생합성에 영향을 받는 지질 래프트 통합성이 표면 상에서의 LY6 분자의 발현을 허용하고, 케모카인의 LY6C 매개 유도에서 잠재적으로 수반된다는 것을 시사한다. 따라서, 세포막 내의 LY6C 폴리펩티드들의 상호작용에 의해 매개되는 케모카인 생산의 강화는 세포 표면 상의 지질 래프트의 존재를 필요로 한다.
실시예 6: LY6C 의 가교가 LY6 분자의 증가된 표면 발현을 초래한다
T 세포의 표면 상에 LY6C를 가교시키는 것은 LY6C의 쉐딩(shedding)을 초래하는 것으로 보고되었다 ([Jaakkola, I. et al. (2003) J Immunol 170:1283-1290]). 그러나, T 세포와는 달리, 뮤린 LY6C가 IEC의 표면 상에 가교되었을 때, LY6A 또는 LY6C의 쉐딩이 일어나지 않았다 (각각 도 27A 및 27B). 반대로, IFNγ의 부재 하에, LY6A 및 LY6C 양쪽 모두의 표면 발현 수준이 LY6C가 가교된 IEC 상에서 증가되었지만, LY6A의 경우에는 그렇지 않았다. IEC가 IFNγ와 함께 예비인큐베이션되었을 때, 대부분의 이러한 효과가 폐지되었지만 (도 27C), LY6A의 약간의 상향조절이 여전히 검출되었다 (도 27D).
이러한 데이터는 IEC 상의 LY6C를 통한 자극이 LY6 분자의 증가된 표면 발현을 초래하는 양성 피드백 루프를 가리킨다.
실시예 7: LY6A 의 자극이 케모카인의 증가된 분비를 초래한다
LY6 분자에 대한 기능이 완전하게 해명되지 않았다. 대장염의 면역병리학에서의 LY6 분자의 역할을 시험하기 위해, LY6 분자의 자극을 IEC로부터의 케모카인의 전사 및 분비에 대한 효과에 대해 연구하였다.
뮤린 LY6 분자의 가교에 응답한 IEC로부터의 케모카인의 생산을 분석하기 위해, IFNγ로 예비처리된 또는 처리되지 않은 YAMC 세포를 항-KLH 대조군 항체, 항-LY6A 또는 항-LY6C로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 24시간 후, 이러한 세포들로부터의 mRNA를 수득하고, 대장염에서 연루된 케모카인들인 CCL2, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL25, CXCL1, CXCL2, CXCL5, CXCL10, CXCL12 및 CX3CL1의 발현에 대해 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다 (표 9) ([Papadakis, K.A. (2004) Curr Allergy Asthma Rep 4:83-89]; [Banks, C. et al., (2003) J Pathol 199:28-35]; 및 [Papadakis, K.A., and S.R. Targan (2000) Inflamm Bowel Dis 6:303-313]). 비-허용성 성장 조건 (37℃, IFNγ 부재) 하에서 분석법을 수행하여, IFNγ 자극에 응답하여 IEC의 증식이 증가되는 가능성을 배제시켰다.
Figure 112009057712971-pct00025
IFNγ로 예비처리된 세포들은 이러한 케모카인 유전자들 중 다수의 상향조절을 나타냈다 (표 9의 배지, 항-KLH 군 대 IFNγ, 항-KLH 군 참조). 그러나, CCL8의 상향조절 및 CXCL1의 하향조절을 제외하고, 항-LY6A로 자극된 YAMC 세포는 항-KLH로 자극된 YAMC 세포와 유사한 유전자 발현 패턴을 나타냈다. 그러나, 항-LY6C로 자극된 YAMC 세포는 실질적으로 변화되지 않고 유지된 CCL25 및 LY6C 자극에 응답하여 하향조절된 CXCL12를 제외하고는 분석된 모든 케모카인의 증가된 발현을 나타냈다. LY6C 가교에 의해 유도된 케모카인의 증가된 유전자 발현이 IFNγ에 의존적이지 않았지만, IFNγ로 예비처리된 세포는 IFNγ로 예비처리되지 않은 세포에 비해 증가된 케모카인 발현을 나타냈다.
뮤린 LY6C 자극에 의해 유도된 케모카인 유도의 동역학을 분석하기 위해, 96웰 플레이트를 항-KLH 항체 또는 항-LY6A 또는 항-LY6C 모노클로날 항체로 코팅하였다. IFNγ로 예비처리된 또는 처리되지 않은 YAMC 세포를 24시, 48시 또는 72시에 첨가하였다. 지시된 시점에, 정량 RT-PCR 분석용으로 RNA를 수집하고, ELISA용으로 상등액을 수집하였다.
24시간 이내에, CXCL5 및 CCL7 양쪽 모두의 전사에서의 급격한 상승이 LY6C가 가교된 세포 상에서 검출되었지만 LY6A에서는 그렇지 않았다 (도 28A). CXCL5 및 CCL7의 증가된 발현이 시간이 경과함에 따라 감소되었지만, 배양물에서 72시간 후에도 여전히 검출가능하였다. 케모카인 전사를 강화시키는데 IFNγ가 필수적이지는 않았지만, IFNγ는 초기 시점에 CXCL5 및 CCL7 양쪽 모두의 전사를 유도하는데 있어서 LY6C 자극과 상승적으로 작용하였다.
유전자 발현과 평행으로, LY6C이 가교된 세포의 상층액은 48시에 현저하게 더 높은 농도의 CXCL5를 함유하였지만 LY6A는 그렇지 않았다 (도 28B). 효과는 용량 의존적이었고, 1 ㎍/㎖만큼 적은 코팅된 항-LY6C로 검출가능하였다. 전사와 마찬가지로, 세포가 IFNγ로 예비처리되었을 때 CXCL5의 분비가 강화되었지만, IFNγ가 효과에 필수적이지는 않았다. 24시 및 72시 시점 양쪽 모두에서 CXCL5의 증가된 분비가 또한 주지되었다.
관찰된 케모카인 상향조절에서 LY6C가 수반되었음을 확실히 하기 위해, 본 발명가들은 siRNA를 사용하여 LY6C를 녹다운시켰다. LY6C 전사물이 실시간 정량 RT-PCR에 의해 IFNγ의 부재 하에 95％, IFNγ의 존재 하에 약 90％만큼 억제되었고, 이는 YAMC 세포의 표면 상에서의 현저하게 더 낮은 수준의 LY6C에 상응하였다 (데이터는 제시되지 않음). 표면 상의 LY6C 수준이 감소된 세포는 케모카인의 전사와 관련하여 LY6C 가교에 대한 감소된 응답을 나타냈다 (도 28C). LY6C의 녹다운에 의해 CXCL5의 분비가 또한 현저하게 억제되었다 (데이터는 제시되지 않음).
이러한 데이터들은 IEC의 표면 상에서의 LY6C의 가교가 증가된 케모카인 분비를 초래하지만 LY6A는 그렇지 않다는 것을 가리킨다.
실시예 8: 생체내 IEC 가 LY6C 로 자극된 세포에 대한 유사한 케모카인 유전자 발현을 나타낸다
뮤린 LY6C를 통해 자극된 IEC가 케모카인 유전자의 발현을 현저하게 상향조절하는 모델이 상기의 데이터에 의해 확립되었다.
대장염의 뮤린 모델에서 레이저 포착 미세절개 IEC로부터의 마이크로어레이 데이터를 분석하여, 시험관내에서 LY6C 가교에 의해 자극된 케모카인이 생체내에서 IEC에 의해 분비되는 케모카인과 상관되는지를 결정하기 위해 대장염의 2가지 뮤린 모델의 건강한 마우스 및 대장염 마우스에서의 동일한 12개의 케모카인 유전자의 발현을 시험하였다 (도 29A 및 29B). 발현 패턴이 LY6C 자극으로부터 초래된 케모카인의 상향조절과 동일하지는 않았지만, 시험관내 연구에서 가장 고도로 상향조절된 케모카인 유전자인 CXCL5의 발현이 대장염의 뮤린 모델에서 또한 가장 높게 상향조절된 케모카인이었다. 본 발명가들은 대장염의 양쪽 모델 모두에서 CXCL1, CXCL10, CCL5 및 CCL7 발현에서의 상당한 상향조절을 발견하였다. 또한, 본 발명가들은 각각 전이 대장염 모델 또는 IL10-/- 모델에서 CCL4 및 CCL8의 상향조절을 발견하였다.
흥미롭게도, 시험관 내에서 뮤린 LY6C 자극의 결과로 하향조절된 유일한 케모카인인 CXCL12가 또한 이러한 케모카인들 중에서 유일하게 생체내에서 하향조절되었다.
실시예 9: 결장 세포에서의 인간 LY6 유전자의 발현
인간 결장 세포주인 Colo 205 세포 (인간 결장 암종으로부터 유래된 세포주, ATCC™ 기탁 번호 CCL-222™)에서의 인간 LY6H, LYPD1, LYPD3, 및 LYPD5의 발현을 시험하였다. 인간 Colo 205 세포를 사이토카인 IFN-r, LPS, TNFα, IFN-r + TNFα, IFN-r + LPS, 또는 LPS + TNFα (모두 100 ng/㎖, 단 LPS는 1 ug/㎖)로 18시간 (LYPD3) 또는 24시간 (LY6H 또는 LYPD5) 동안 처리하였다. RNA를 수집 및 정제하고, 지시된 LY6 패밀리 구성원의 발현을 Applied Biosystems™으로부터의 시약을 사용하여 제조업자의 지침서에 따라 정량 RT-PCR에 의해 결정하였다. RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 및 프로브는 하기와 같았다:
LYPD1:
센스: CAT GAT CCT CCG AAT CTG GT (서열 59)
안티센스: AGC ACA GAA CAG AGG GGC TA (서열 60)
프로브: ATA CGG CCA ATG TCA CAA CA (서열 61)
LYPD3:
센스: ACT TCC TGT TCC CAC CAC TG (서열 62)
안티센스: AGA GGA CAA GCG GAG AGA CA (서열 63)
프로브: TTC TGG CAG GGG TGT TCT AG (서열 64)
LY6H:
센스: AGC AGC AGC AGG AAG GAT (서열 65)
안티센스: AAA AGT GCC GCT TAA CGA AG (서열 66)
프로브: CAA GAT GTG TGC TTC CTC CTG CGA (서열 67)
LYPD5 프라이머 및 프로브들은 Applied Biosysems™ (카탈로그 번호 HS00289062_m1)에서 구입하였다.
도 30A-30C에 도해된 결과는 인간 B-액틴 대조군과 비교된 이러한 인간 LY6 유전자들의 발현을 가리킨다. 지시된 사이토카인으로의 처리 후에 인간 LY6H, LYPD3, 및 LYPD5의 발현에서의 상당한 증가가 관찰되었다.
실시예 10: 결장 생검 조직에서의 인간 LY6 유전자의 발현
CD 및 UC 환자의 결장에서의 증가된 LYPD1 및 LYPD5 발현의 근원을 추가로 연구하기 위해, UC 환자, CD 환자 및 대조군의 생검물의 코호트를 취하였다. 결장 생검물로부터 추출된 RNA를 사용한 LYPD1 발현에 대한 마이크로어레이 분석은 CD 환자의 염증이 있는 결장 조직에서 통계적으로 증가된 발현을 나타냈다 (도 31A). 결장으로부터 취해진 UC 및 CD 생검물에서, 통계적으로 증가된 LYPD5 발현이 염증이 있는 UC 및 CD 환자에서 관찰되었다 (도 31B). 이는 염증이 없는 대조군 생검물에서는 관찰되지 않았다.
염증이 있는 IBD 조직의 말단 회장 생검물에서의 인간 LY6H의 발현을 RT-PCR (Taqman™) 분석을 사용하여 대조군 (비-IBD) 말단 회장 생검물과 비교하여 분석하였다. 인간 LY6H 발현은 대조군과 비교하여 염증이 있는 IBD 생검물에서 1.5배 이상 더 컸다.
염증이 있는 UC 결장 생검물에서의 인간 LYPD3 발현이 상향조절되었고, 대조군과 비교하여 염증이 있는 IBD 생검물에서 2배 미만으로 더 컸다.
이러한 실험들의 결과는 IEC의 표면 상에서의 LY6 분자의 발현을 실연하였고, 발현이 염증 환경 내의 IEC에 독특하다는 것을 추가로 가리켰다. 또한, LY6A 및 LY6C의 표면 발현 수준이 대장염 마우스의 IEC 상에서 높았고, 결장 전체에 걸쳐 거의 보편적이었다. 분자들이 모두 질환 상태에 특이적으로 질환 동안에 편재성으로 발현되기 때문에, 인간 LY6 유전자 또는 폴리펩티드 발현, 특히 인간 LY6H, LYPD1, LYPD3, 및 LYPD5의 검출은 인간에서 UC 및/또는 CD가 포함되는 IBD를 검출하기 위한 유용한 방법이다. 추가적으로, 인간 LY6 발현의 검출 방법은 인간에서 IBD, UC 및/또는 CD를 진단하는데, 그리고 IBD 치료제에 대한 응답을 모니터링하는데 유용하다.
본원에 개시된 실시예들에서, IEC에서의 LY6 발현의 기능적 의미가 실연되었다. YAMC 세포는 LY6A에 대해 강력하게 양성이었고, 더 낮은 수준의 LY6C를 발현하였다. 그러나, IL-1β, TNFα, IFNα, 특히 IL-22 및 IFNγ가 포함되는, 대장염 동안 결장 내에 존재하는 다수의 사이토카인으로의 자극 시, LY6 분자 양쪽 모두의 발현 수준이 크게 강화되었다. LY6 분자의 발현을 상향조절하기 위해 IFNγ로 예비처리된 YAMC 세포는 LY6 발현의 기능적 의미를 분석하기 위한 유용한 시험관내 모델이었다.
YAMC 세포의 조건부로 불멸화된 성질은 SV40 대형 T 항원의 MHC II 프로모터-구동 발현으로부터 유래된다; 낮은 수준 (2.5-5 U/㎖)의 IFNγ가 이러한 세포의 증식을 구동시키는데 사용된다 ([Whitehead, R.H. et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:587-591]; [Whitehead, R.H., and J.L. Joseph. (1994) Epithelial Cell Biol 3:119-125]). YAMC 세포는 뮤린 IEC의 사이토카인 처리를 위한 시험관내 모델로 종종 사용된다 ([Mei, J.M. et al. (2000) Faseb J 14:1188-1201]; [Yan, F., and D.B. Polk (2002) J Biol Chem 277:50959-50965]). 이러한 세포가 함유하는 SV40 대형 T 항원은 온도 민감성이고, 37℃에서 비-기능성이다. 본원에서 수행된 모든 실험은 이러한 비-허용성 조건 하에서의 IFNγ 처리를 수반하였다. 또한, 실험 전에 37℃에서 24시간 동안 YAMC 세포를 혈청 고갈시켰다 (그리고 IFNγ 고갈시켰다). 이같은 조건 하에, 잔여 T 항원 발현, 예컨대 세포의 증식을 가리키는 효과가 관찰되지 않았다. 그 결과, IFNγ 처리의 효과는 T 항원의 발현을 구동시키는 것에서 유래되는 효과보다는 IFNγ의 고유의 효과에 기인하였다. 또한, LY6 패밀리 구성원의 상향조절이 제2 뮤린 세포주인 CMT93에서 검출되었고, 이는 이러한 효과가 IEC에 광범위하게 적용가능하다는 것을 확증시킨다.
또한, TNFα, IL-1β 및 IL-22로의 처리 후에 LY6 발현의 수수한 상향조절이 주지되었기 때문에, IFNγ는 LY6 분자를 유도하는 것에 대해 사이토카인들 중에서 유일하지 않았다. IL-22에 응답한 IEC 상에서의 LY6 분자의 상향조절이 크론병에서 IL-22에 대한 잠재적인 역할을 실연하는 최근의 데이터의 견지에서 흥미로왔다 ([Wolk, K., et al. J Immunol 178:5973-5981 (2007)]). 마우스와 인간 LY6 분자 간의 상동성은 종종 복잡하지만, LY6 분자의 상향조절이 마우스에 한정되지 않는다는 것을 시사하는 증거가 있다. 래트에서의 이전의 연구는 대장염 모델의 소장에서의 LY6 분자의 상향조절을 시사하였고, 이같은 발현이 염증, 세포/세포 상호작용, 뿐만 아니라 래트 IEC 내에서의 신호전달에 수반된다는 것이 제안되었다 ([Baksheev, L. et al. J Gastroenterol 41:1041-1052 (2006)]).
상기 기술된 데이터는 지질 래프트 통합성이 IEC에서의 LY6C 매개 신호 전달에서 수반될 가능성이 있다는 것을 가리킨다. 이는 지질 래프트의 파괴가 LY6C 발현을 하향조절시키는 것 및 LY6C 신호전달의 구조적 성분을 파괴하는 것 양쪽 모두에 의해 LY6C 자극의 하류 효과를 감소시키는 역할을 할 수 있음을 암시한다. 최근, 스타틴으로의 IEC의 콜레스테롤 결핍이 NF-κB 조정을 통해 전-염증성 유전자 발현을 억제하는 것으로 결정되었다 ([Lee, J. et al., Int Immunopharmacol 7:241-248 (2007)]). 또한, 스타틴은 대장염의 뮤린 모델에서 효과적인 치료제였다 ([Naito, Y., et al. Int J Mol Med 17:997-1004 (2006)]). 지질 래프트 운동성과 NF-κB 차단을 연결하는 메커니즘은 여전히 결정되지 않았지만, 본 발명가들의 데이터는 LY6C를 통한 활성화가 작용 메커니즘을 설명하는 한가지 가설일 수 있음을 시사한다.
이러한 연구에서, 본 발명가들은 LY6 분자를 케모카인 유전자의 발현에서의 강력한 상류 스위치로서 확인하였다. LY6C 수용체와 모노클로날 항체의 가교는 CXCL5를 포함하여 분석된 거의 모든 케모카인의 극적인 상향조절을 초래하였다. LY6C가 가교된 IEC에서 CXCL5 분비가 크게 강화된다는 것이 본 발명가들에 의해 추가로 확증되었다. 비록 LY6A 및 LY6C 양쪽 모두가 GPI 모이어티에 의해 세포 표면에 앵커링(anchoring)되지만, 그리고 IEC의 표면 상에서 LY6C보다 LY6A의 더 높은 수준의 발현에로 불구하고, LY6C 가교로는 케모카인 분비에 대한 하류 효과가 나타나지만 LY6A 가교와는 일관적이지 않다는 것이 흥미롭다.
실시예 11 : LYPD5에 대한 리간드의 확인
이러한 연구에서, 당업자에게 주지된 기술을 통해, 즉 COS 세포 내로의 CMV 프로모터의 제어 하의 약 14,000개의 인간 유전자의 발현 클로닝에 의해 LYPD5의 리간드에 대한 검색을 수행하였다. 100개의 유전자의 풀을 12개의 웰 플레이트 상의 140개의 웰에서 성장된 COS 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 LYPD5-Fc 단백질로 염색하였다 (도 32 참조). 양성으로 염색된 웰을 확인하고, 개별적인 클론들을 COS 세포 내로 형질감염시켰다. 1개의 단백질 GLG-1 (ESL-1)을 발현하는 1개의 웰이 LYPD5에 대한 리간드로서 확인되었다. GLG-1은 긴 세포외 도메인 (ECD), 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 특징으로 한다. 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 일련의 공동-면역침전 연구를 수행하여, GLG-1 ECD의 다양한 영역들의 LYPD5에 결합하는 능력을 평가하였다. GLG-1 ECD의 변이체 또는 단편 (도 33-35 참조)이 LYPD5에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 것으로 발견되었다. 도 33B는 도 33A에 도해된 바와 같은 단편 1, 2, 3, 또는 4를 사용한 공동-면역침전 연구의 결과를 나타내고, 단편들 중 임의의 하나가 LYPD5 결합에 충분하다는 것을 실연한다.
또한, GLG-1 ECD 도메인 자체가 LYPD5 결합에 충분한 것으로 발견되었다. 도 33에 나타난 바와 같이, GLG-1은 다중 GLG-1 도메인으로 구성되고, 단일 GLG-1 도메인들이 LYPD5에 결합할 수 있다. 도 34B는 단편 1, 2, 3, 및 4, 뿐만 아니라 단일 GLG-1 도메인 115, 150, 215, 538, 609, 670, 729, 및 858 (도 34A에 제시됨)이 LYPD5에 결합할 수 있었음을 실연하는 공동-면역침전의 결과를 나타낸다.
또다른 공동-면역침전 연구를 통해, LYPD5의 단편들 (도 35A 참조)을 기초로 결합이 특이적인 것으로 나타났고, 이때 LYPD5는 BAP 음성 대조군에 결합하지 않는 것으로 발견되었고, FN14 음성 대조군은 GLG-1 단편 2에 결합하는 것으로 발견되는 것으로 발견되지 않았으며, 인간 GLG-1 도메인 115는 LYPD5에 결합하였고, 도메인 115는 항상 검출가능한 수준으로 발현되지는 않았지만, 여전히 LYPD5를 끌어내렸고, 도메인 115가 없는 인간 GLG-1 단편 1 (잔기 26-114)은 LYPD5에 결합하지 않았다 (도 35B).
도 34A 및 35A의 "*"은 잠재적인 푸코실화 부위를 가리킨다.
상기의 발명이 이해를 명확하게 하려는 목적으로 설명 및 예의 방식으로 약간 상세하게 기술되었지만, 설명 및 예가 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 전체적으로 거명에 의해 확실하게 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Diehl, Lauri; Flanagan, Kenneth; Mo, Lian; Genentech Inc., <120> METHODS FOR DETECTING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE <130> 39766-0296.PCT <140> Not yet Assigned <141> Herewith <150> US 60/891,196 <151> 2007-02-22 <150> US 60/987,752 <151> 2007-11-13 <150> US 61/024,170 <151> 2008-01-28 <160> 69 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 957 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cgcgtctgcg gctgcgttcc ccgaaagacg aggctgcgcc cggattccgg tccgcaggga 60 gaccgaaggg cacagctccc cgcgccgcgc acgccgcccg agcccggagt gcggacaccc 120 ccgggatgct tgcgccccag aggacccgcg ccccaagccc ccgcgccgcc cccaggccca 180 cccggagcat gctgcctgca gccatgaagg gcctcggcct ggcgctgctg gccgtcctgc 240 tgtgctcggc gcccgctcat ggcctgtggt gccaggactg caccctgacc accaactcca 300 gccattgcac cccaaagcag tgccagccgt ccgacacggt gtgtgccagt gtccgaatca 360 ccgatcccag cagcagcagg aaggatcact cggtgaacaa gatgtgtgcc tcctcctgtg 420 acttcgttaa gcgacacttt ttctcagact atctgatggg gtttattaac tctgggatct 480 taaaggtcga cgtggactgc tgcgagaagg 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Asn Ser Gly 85 90 95 Ile Leu Lys Val Asp Val Asp Cys Cys Glu Lys Asp Leu Cys Asn Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ala Gly His Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu 115 120 125 Leu Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gly Pro 130 135 140 <210> 3 <211> 2683 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 3 agggcggtgt caatgcaccc tccagcggtg cgcgcaggcg ggagaaggga gggcggcccg 60 ggcaagtgag acagttaagg cagtgtcccc accacacccc cacccagatt ggccacgccg 120 agctggttct tgacagaagg ccttcgcgga ggaagagggg gcacagctgc acaggacacc 180 ctacggagcc tgcgggcgtg gaactttgcc aggcgcacgg gaacgcgcgc ccttcctgtc 240 agcctcccgg ggcgccaggc tcccgcggcc cgcagcggga cagcctcagt tgtgtgggct 300 ggacccagtc gctggggtac cgaccagtcc tggaaggcgc agaggacgtg gagtggggag 360 gctgccttcc tatgtgcgaa gggccagccg ggcacgcagt cctcagaccc tagtccgcac 420 ccggcaggtc cccacggcac ctgctgcgcc ctcctcgccg ctcccccaac ctccccatct 480 cagaaaacta ccagttctct cccgcccccc ggcgcccctt tcccaggaac gtgcggaggc 540 gggagaagag gaagacagga agggggtggg gatgtgaagc gaccgtccca gccttccccg 600 cccgccaccc 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gaccgcctgc ttccagggca gtggcagaat 540 gacagttggc aatttctcag tccctgtgta catcagaacc tgccaccggc cctcctgcac 600 caccgagggc accaccagcc cctggacagc catcgacctc cagggctcct gctgtgaggg 660 gtacctctgc aacaggaaat ccatgaccca gcccttcacc agtgcttcag ccaccacccc 720 tccccgagca ctacaggtcc tggccctgct cctcccagtc ctcctgctgg tggggctctc 780 agcatagacc gcccctccag gatgctgggg acagggctca cacacctcat tcttgctgct 840 tcagccccta tcacatagct cactggaaaa tgatgttaaa gtaagaattg cactcctgtc 900 cctctggcct tccatctctc ctgcccttgt gccccacaac ctggccaaca gtactggaag 960 aaactggaca cagtcaccag catcccaggg gagggcaaaa cagccatgtc gtgccctgat 1020 gaagagcaat tctgatcaca gctgttactc actgagcacc agccaggcac caggcacccc 1080 ataacacggc ttcctgtgct ctccttccag agcctgtcgc agctctaggg gggagctata 1140 caatgatgtc tttattagtg tcatcatgag aagcccaata agcagtatgc cctaacagtt 1200 agtaggccag gctctggagc taagctgcat gggttcacat cccagctcca ccattcagcc 1260 tgcagagacc atgagcgagt tacttaagcc aggctctgga gctaagctgc atgggttcaa 1320 atcccagctc cagcattcag cctacagaga ccatgggtga 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cactctactc ccgggagata gtgtacccct tccaggggga ctccacggtg accaagtcct 300 gtgccagcaa gtgtaagccc tcggatgtgg atggcatcgg ccagaccctg cccgtgtcct 360 gctgcaatac tgagctgtgc aatgtagacg gggcgcccgc tctgaacagc ctccactgcg 420 gggccctcac gctcctccca ctcttgagcc tccgactgta gagtccccgc ccacccccat 480 ggccctatgc ggcccagccc cgaatgcctt gaagaagtgc cccctgcacc aggaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa 550 <210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 16 Met Arg Gly Thr Arg Leu Ala Leu Leu Ala Leu Val Leu Ala Ala Cys 1 5 10 15 Gly Glu Leu Ala Pro Ala Leu Arg Cys Tyr Val Cys Pro Glu Pro Thr 20 25 30 Gly Val Ser Asp Cys Val Thr Ile Ala Thr Cys Thr Thr Asn Glu Thr 35 40 45 Met Cys Lys Thr Thr Leu Tyr Ser Arg Glu Ile Val Tyr Pro Phe Gln 50 55 60 Gly Asp Ser Thr Val Thr Lys Ser Cys Ala Ser Lys Cys Lys Pro Ser 65 70 75 80 Asp Val Asp Gly Ile Gly Gln Thr Leu Pro Val Ser Cys Cys Asn Thr 85 90 95 Glu Leu Cys Asn Val Asp Gly Ala Pro Ala Leu Asn Ser Leu His Cys 100 105 110 Gly Ala Leu Thr Leu Leu Pro Leu Leu Ser Leu Arg Leu 115 120 125 <210> 17 <211> 3901 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 17 aagatggcgg cgtgtggacg tgtacggagg atgttccgct tgtcggcggc gctgcatctg 60 ctgctgctat tcgcggccgg ggccgagaaa ctccccggcc atggcgtcca cagccagggc 120 cagggtcccg gggccaactt tgtgtccttc gtagggcagg ccggaggcgg cggcccggcg 180 ggtcagcagc tgccccagct gcttcagtca tcgcagcttc agcagcaaca gcagcagcag 240 caacagcaac agcagcttca gccgccgcag ccgcctttcc cggcgggtgg gcctccggcc 300 cggcggggag gagcgggggc tggtgggggc tggaagctgg cggaggaaga gtcctgcagg 360 gaggacgtga cccgcgtgtg ccctaagcac acctggagca acaacctggc ggtgctcgag 420 tgcctgcagg atgtgaggga gcctgaaaat gaaatttctt cagactgcaa tcatttgttg 480 tggaattata agctgaacct aactacagat cccaaatttg aatctgtggc cagagaggtt 540 tgcaaatcta ctataacaga gattaaagaa tgtgctgatg aaccggttgg aaaaggttac 600 atggtttcct gcttagtgga tcaccgaggc aacatcactg agtatcagtg tcaccagtac 660 attaccaaga tgacggccat catttttagt gattaccgtt taatctgtgg cttcatggat 720 gactgcaaaa atgacatcaa cattctgaaa tgtggcagta ttcggcttgg agaaaaggat 780 gcacattcac aaggtgaggt ggtatcatgc ttggagaaag gcctggtgaa agaagcagaa 840 gaaagagaac ccaagattca agtttctgaa ctctgcaaga aagccattct ccgggtggct 900 gagctgtcat cggatgactt tcacttagac cggcatttat attttgcttg ccgagatgat 960 cgggagcgtt tttgtgaaaa tacacaagct ggtgagggca gagtgtataa gtgcctcttt 1020 aaccataaat ttgaagaatc catgagtgaa aagtgtcgag aagcacttac aacccgccaa 1080 aagctgattg cccaggatta taaagtcagt tattcattgg ccaaatcctg taaaagtgac 1140 ttgaagaaat accggtgcaa tgtggaaaac cttccgcgat cgcgtgaagc caggctctcc 1200 tacttgttaa tgtgcctgga gtcagctgta cacagagggc gacaagtcag cagtgagtgc 1260 cagggggaga tgctggatta ccgacgcatg ttgatggaag acttttctct gagccctgag 1320 atcatcctaa gctgtcgggg ggagattgaa caccattgtt ccggattaca tcgaaaaggg 1380 cggaccctac actgtctgat gaaagtagtt cgaggggaga aggggaacct tggaatgaac 1440 tgccagcagg cgcttcaaac actgattcag gagactgacc ctggtgcaga ttaccgcatt 1500 gatcgagctt tgaatgaagc ttgtgaatct gtaatccaga cagcctgcaa acatataaga 1560 tctggagacc caatgatctt gtcgtgcctg atggaacatt tatacacaga gaagatggta 1620 gaagactgtg aacaccgtct cttagagctg cagtatttca tctcccggga ttggaagctg 1680 gaccctgtcc tgtaccgcaa gtgccaggga gacgcttctc gtctttgcca cacccacggt 1740 tggaatgaga ccagtgaatt tatgcctcag ggagctgtgt tctcttgttt atacagacac 1800 gcctaccgca ctgaggaaca gggaaggagg ctctcacggg agtgccgagc tgaagtccaa 1860 aggatcctac accagcgtgc catggatgtc aagctggatc ctgccctcca ggataagtgc 1920 ctgattgatc tgggaaaatg gtgcagtgag aaaacagaga ctggacagga gctggagtgc 1980 cttcaggacc atctggatga cttggtggtg gagtgtagag atatagttgg caacctcact 2040 gagttagaat cagaggatat tcaaatagaa gccttgctga tgagagcctg tgagcccata 2100 attcagaact tctgccacga tgtggcagat aaccagatag actctgggga cctgatggag 2160 tgtctgatac agaacaaaca ccagaaggac atgaacgaga agtgtgccat cggagttacc 2220 cacttccagc tggtgcagat gaaggatttt cggttttctt acaagtttaa aatggcctgc 2280 aaggaggacg tgttgaagct ttgcccaaac ataaaaaaga aggtggacgt ggtgatctgc 2340 ctgagcacga ccgtgcgcaa tgacactctg caggaagcca aggagcacag ggtgtccctg 2400 aagtgccgca ggcagctccg tgtggaggag ctggagatga cggaggacat ccgcttggag 2460 ccagatctat acgaagcctg caagagtgac atcaaaaact tctgttccgc tgtgcaatat 2520 ggcaacgctc agattatcga atgtctgaaa gaaaacaaga agcagctaag cacccgctgc 2580 caccaaaaag tatttaagct gcaggagaca gagatgatgg acccagagct agactacacc 2640 ctcatgaggg tctgcaagca gatgataaag aggttctgtc cggaagcaga ttctaaaacc 2700 atgttgcagt gcttgaagca aaataaaaac agtgaattga tggatcccaa atgcaaacag 2760 atgataacca agcgccagat cacccagaac acagattacc gcttaaaccc catgttaaga 2820 aaagcctgta aagctgacat tcctaaattc tgtcacggta tcctgactaa ggccaaggat 2880 gattcagaat tagaaggaca agtcatctct tgcctgaagc tgagatatgc tgaccagcgc 2940 ctgtcttcag actgtgaaga ccagatccga atcattatcc aggagtccgc cctggactac 3000 cgcctggatc ctcagctcca gctgcactgc tcagacgaga tctccagtct atgtgctgaa 3060 gaagcagcag cccaagagca gacaggtcag gtggaggagt gcctcaaggt caacctgctc 3120 aagatcaaaa cagaattgtg taaaaaggaa gtgctaaaca tgctgaagga aagcaaagca 3180 gacatctttg ttgacccggt acttcatact gcttgtgccc tggacattaa acaccactgc 3240 gcagccatca cccctggccg cgggcgtcaa atgtcctgtc tcatggaagc actggaggat 3300 aagcgggtga ggttacagcc cgagtgcaaa aagcgcctca atgaccggat tgagatgtgg 3360 agttacgcag caaaggtggc cccagcagat ggcttctctg atcttgccat gcaagtaatg 3420 acgtctccat ctaagaacta cattctctct gtgatcagtg ggagcatctg tatattgttc 3480 ctgattggcc tgatgtgtgg acggatcacc aagcgagtga cacgagagct caaggacagg 3540 tagagccacc ttgaccacca aaggaactac ctatccagtg cccagtttgt acagccctct 3600 tgtatagcat ccccactcac ctcgctcttc tcagaagtga caccaacccc gtgttagagc 3660 attagcagat gtccactgcg ttgtcccatc cagcctccac tcgtgtccat ggtgtcctcc 3720 tcctcctcac cgtgcagcag cagcagctgg tcgctggggt tactgccttt gtttggcaaa 3780 cttgggttta cctgcctgta gacaagtctc tctcatacca acagaacttc cggtacttcc 3840 agaaccaact cacctgacct gcaactcaaa ggctttttta agaaaaccac caaaaaaaaa 3900 a 3901 <210> 18 <211> 1179 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 18 Met Ala Ala Cys Gly Arg Val Arg Arg Met Phe Arg Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Phe Ala Ala Gly Ala Glu Lys Leu Pro Gly 20 25 30 His Gly Val His Ser Gln Gly Gln Gly Pro Gly Ala Asn Phe Val Ser 35 40 45 Phe Val Gly Gln Ala Gly Gly 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agtgcctgca ggatgtgagg gagcctgaaa atgaaatttc 480 ttcagactgc aatcatttgt tgtggaatta taagctgaac ctaactacag atcccaaatt 540 tgaatctgtg gccagagagg tttgcaaatc tactataaca gagattaaag aatgtgctga 600 tgaaccggtt ggaaaaggtt acatggtttc ctgcttggtg gatcaccgag gcaacatcac 660 tgagtatcag tgtcaccagt acattaccaa gatgacggcc atcattttta gtgattaccg 720 tttaatctgt ggcttcatgg atgactgcaa aaatgacatc aacattctga aatgtggcag 780 tattcggctt ggagaaaagg atgcacattc acaaggtgag gtggtatcat gcttggagaa 840 aggcctggtg aaagaagcag aagaaagaga acccaagatt caagtttctg aactctgcaa 900 gaaagccatt ctccgggtgg ctgagctgtc atcggatgac tttcacttag accggcattt 960 atattttgct tgccgagatg atcgggagcg tttttgtgaa aatacacaag ctggtgaggg 1020 cagagtgtat aagtgcctct ttaaccataa atttgaagaa tccatgagtg aaaagtgtcg 1080 agaagcactt acaacccgcc aaaagctgat tgcccaggat tataaagtca gttattcatt 1140 ggccaaatcc tgtaaaagtg acttgaagaa ataccggtgc aatgtggaaa accttccgcg 1200 atcgcgtgaa gccaggctct cctacttgtt aatgtgcctg gagtcagctg tacacagagg 1260 gcgacaagtc agcagtgagt gccaggggga gatgctggat taccgacgca tgttgatgga 1320 agacttttct ctgagccctg agatcatcct aagctgtcgg ggggagattg aacaccattg 1380 ttccggatta catcgaaaag ggcggaccct acactgtctg atgaaagtag ttcgagggga 1440 gaaggggaac cttggaatga actgccagca ggcgcttcaa acactgattc aggagactga 1500 ccctggtgca gattaccgca ttgatcgagc tttgaatgaa gcttgtgaat ctgtaatcca 1560 gacagcctgc aaacatataa gatctggaga cccaatgatc ttgtcgtgcc tgatggaaca 1620 tttatacaca gagaagatgg tagaagactg tgaacaccgt ctcttagagc tgcagtattt 1680 catctcccgg gattggaagc tggaccctgt cctgtaccgc aagtgccagg gagacgcttc 1740 tcgtctttgc cacacccacg gttggaatga gaccagtgaa tttatgcctc agggagctgt 1800 gttctcttgt ttatacagac acgcctaccg cactgaggaa cagggaagga ggctctcacg 1860 ggagtgccga gctgaagtcc aaaggatcct acaccagcgt gccatggatg tcaagctgga 1920 tcctgccctc caggataagt gcctgattga tctgggaaaa tggtgcagtg agaaaacaga 1980 gactggacag gagctggagt gccttcagga ccatctggat gacttggtgg tggagtgtag 2040 agatatagtt ggcaacctca ctgagttaga atcagaggat attcaaatag aagccttgct 2100 gatgagagcc tgtgagccca taattcagaa cttctgccac gatgtggcag ataaccagat 2160 agactctggg gacctgatgg agtgtctgat acagaacaaa caccagaagg acatgaacga 2220 gaagtgtgcc atcggagtta cccacttcca gctggtgcag atgaaggatt ttcggttttc 2280 ttacaagttt aaaatggcct gcaaggagga cgtgttgaag ctttgcccaa acataaaaaa 2340 gaaggtggac gtggtgatct gcctgagcac gaccgtgcgc aatgacactc tgcaggaagc 2400 caaggagcac agggtgtccc tgaagtgccg caggcagctc cgtgtggagg agctggagat 2460 gacggaggac atccgcttgg agccagatct atacgaagcc tgcaagagtg acatcaaaaa 2520 cttctgttcc gctgtgcaat atggcaacgc tcagattatc gaatgtctga aagaaaacaa 2580 gaagcagcta agcacccgct gccaccaaaa agtatttaag ctgcaggaga cagagatgat 2640 ggacccagag ctagactaca ccctcatgag ggtctgcaag cagatgataa agaggttctg 2700 tccggaagca gattctaaaa ccatgttgca gtgcttgaag caaaataaaa acagtgaatt 2760 gatggatccc aaatgcaaac agatgataac caagcgccag atcacccaga acacagatta 2820 ccgcttaaac cccatgttaa gaaaagcctg taaagctgac attcctaaat tctgtcacgg 2880 tatcctgact aaggccaagg atgattcaga attagaagga caagtcatct cttgcctgaa 2940 gctgagatat gctgaccagc gcctgtcttc agactgtgaa gaccagatcc gaatcattat 3000 ccaggagtcc gccctggact accgcctgga tcctcagctc cagctgcact gctcagacga 3060 gatctccagt ctatgtgctg aagaagcagc agcccaagag cagacaggtc aggtggagga 3120 gtgcctcaag gtcaacctgc tcaagatcaa aacagaattg tgtaaaaagg aagtgctaaa 3180 catgctgaag gaaagcaaag cagacatctt tgttgacccg gtacttcata ctgcttgtgc 3240 cctggacatt aaacaccact gcgcagccat cacccctggc cgcgggcgtc aaatgtcctg 3300 tctcatggaa gcactggagg ataagcgggt gaggttacag cccgagtgca aaaagcgcct 3360 caatgaccgg attgagatgt ggagttacgc agcaaaggtg gccccagcag atggcttctc 3420 tgatcttgcc atgcaagtaa tgacgtctcc atctaagaac tacattctct ctgtgatcag 3480 tgggagcatc tgtatattgt tcctgattgg cctgatgtgt ggacggatca ccaagcgagt 3540 gacacgagag ctcaaggaca ggctacaata caggtcagag acaatggctt ataaaggttt 3600 agtgtggtct caggatgtga caggcagtcc agcctgacct ttctgcacac tccagacaaa 3660 cttcccagac aagctccttt gtgcctctac gtggagaggg tgtggaaagt tatcacatta 3720 aaagatggag gatttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagaaaaaa aaaaaaaaa 3779 <210> 20 <211> 1203 <212> PRT <213> Homo 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aggagacaga 120 gatgatggac ccagagctag actacaccct catgagggtc tgtaagcaga tgataaagag 180 gttctgtccg gaagcagatt ctaaaaccat gttgcagtgc ttgaagcaaa ataaaaacag 240 tgaattgatg gatcccaaat gcaaacagat gataaccaag cgccagatca cccagaacac 300 agattaccgc ttaaacccca tgttaagaaa agcctgtaaa gctgacattc ctaaattctg 360 tcacggtatc ctgactaagg ccaaggatga ttcagaatta gaaggacaag tcatctcttg 420 cctgaagctg agatatgctg accagcgcct gtcttcagac tgtgaagacc agatccgaat 480 cattatccag gagtccgccc tggactaccg cctggatcct cagctccagc tgcactgctc 540 agacgagatc tccagtctat gtgctgaaga agcagcagcc caagagcaga caggtcaggt 600 ggaggagtgc ctcaaggtca acctgctcaa gatcaaaaca gaattgtgta aaaaggaagt 660 gctaaacatg ctgaaggaaa gcaaagcaga catctttgtt gacccggtac ttcatactgc 720 ttgtgccctg gacattaaac accactgcgc agccatcacc cctggccgcg ggcgtcaaat 780 gtcctgtctc atggaagcac tggaggataa gcgggtgagg ttacagcccg agtgcaaaaa 840 gcgcctcaat gaccggattg agatgtggag ttacgcagca aaggtggccc cagcagatgg 900 cttctctgat cttgccatgc aagtaatgac gtctccatct aagaactaca ttctctctgt 960 gatcagtggg agcatctgta tattgttcct gattggcctg atgtgtggac ggatcaccaa 1020 gcgagtgaca cgagagctca aggacaggta gagccacctt gaccaccaaa ggaactacct 1080 atccagtgcc cagtttgtac agccctcttg tatagcatcc ccactcacct cgctcttctc 1140 agaagtgaca ccaaccccgt gttagagcat tagcagatgt ccactgcgtt gtcccatcca 1200 gcctccactc gtgtccatgg tgtcctcctc ctcctcaccg tgcagcagca gcagctggtc 1260 gctggggtta ctgcctttgt ttggcagact tggtttacct gcctgtagtc aagtctctct 1320 cataccaaca gaacttccgg tacttccaga accaactcac ctgacctgca actcaaaggc 1380 ttttttaaga aaaccaccaa aaaaaaaaat ttttttaaag aaaaaaatgt atatagtaac 1440 gcatctcctc caggcttgat ttgggcaatg gggttatgtc tttcatatga ctgtgtaaaa 1500 caaagacagg acttggaggg gaagcacacc acccagtgtg ccatgactga ggtgtctcgt 1560 tcatctctca gaagcgcctt ggggcctcgc cagggccgtg gtcttcaccg aggcgtgggt 1620 gggcagccgt tccccaggct gtgtggggtc ctgctttctt ctgctgagac agtgacgctt 1680 tccagtttcc accctaatca gccactgctg gtcacagccc cacagccatg ggtatttctg 1740 tggtctcctc gcttcattga agcaaagcat gagccttcct agacaagggc agctggggag 1800 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Gly Leu Leu Leu Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gly Pro 145 150 155 160 <210> 49 <211> 2047 <212> DNA <213> mus musculus <400> 49 agaagaggcg agactttttt gggtgctccg gatcgccagt agttcttcaa gcctcagcag 60 ccaactcctc cggaggcgct gcgctccgcc ccagggagcg cgaatccaag gagcctggga 120 ccagcctctg ggagcccccg gcgcgggcga tgcgggcgcc gcgggcgaca cctgcggctc 180 ctctcggtgg cagccgtcgc ttgggcggca gcagcgcgag cctcggcagc ctcggcagct 240 actgtcgccg cggccagaac agcctccgct gcggtcgtgg tctctgatgc tcttgcccgc 300 tcccggccct gccgatccgg gaggatgtgg gttctcggca tcgcagcaac tttttgcgga 360 ttgttctggc ttccagggct ggcgctgcaa attcagtgct accagtgtga agaattccag 420 ctgaacaacg attgctcatc ccctgagttc atcgtaaatt gcaccgtgaa cgttcaagac 480 atgtgtcaga aagaagtgat ggagcaaagt gctgggatca tgtaccggaa gtcgtgtgca 540 tcgtcagcag cctgtctcat tgcttcagct gggtaccagt ccttctgttc ccctgggaaa 600 ctgaactccg tgtgcatcag ctgctgcaac acccctcttt gcaatgggcc gaggcccaag 660 aagagaggca gctctgcctc ggccatcagg ccagggcttc tcaccactct cctgttcttc 720 cacttagccc tctgcttggc 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ggcatcgtgg cagtggggct ggggctggtc ctggcttacc ggctctcggt 2400 ggaaatctat gaccgccggg aatacagtcg ctttgagaag gagcagcaac aactcaactg 2460 gaagcaggac agtaatcctc tctacaaaag tgccatcacg accaccatca atcctcgctt 2520 tcaagaggca gacagtccca ctctctgaag gagggaggga cacttaccca aggctcttct 2580 ccttggagga cagtgggaac tggagggtga gaggaagggt gggtctgtaa gaccttggta 2640 ggggactaat tcactggcga ggtgcggcca ccaccctact tcattttcag agtgacaccc 2700 aagagggctg cttcccatgc ctgcaacctt gcatccatct gggctacccc acccaagtat 2760 acaataaagt cttacctcag aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2798 <210> 69 <211> 798 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 69 Met Val Ala Leu Pro Met Val Leu Val Leu Leu Leu Val Leu Ser Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ser Glu Leu Asp Ala Lys Ile Pro Ser Thr Gly Asp Ala Thr 20 25 30 Glu Trp Arg Asn Pro His Leu Ser Met Leu Gly Ser Cys Gln Pro Ala 35 40 45 Pro Ser Cys Gln Lys Cys Ile Leu Ser His Pro Ser Cys Ala Trp Cys 50 55 60 Lys Gln Leu Asn Phe Thr Ala Ser Gly Glu Ala Glu Ala Arg Arg Cys 65 70 75 80 Ala Arg Arg Glu Glu Leu Leu Ala Arg Gly Cys Pro Leu Glu Glu Leu 85 90 95 Glu Glu Pro Arg Gly Gln Gln Glu Val Leu Gln Asp Gln Pro Leu Ser 100 105 110 Gln Gly Ala Arg Gly Glu Gly Ala Thr Gln Leu Ala Pro Gln Arg Val 115 120 125 Arg Val Thr Leu Arg Pro Gly Glu Pro Gln Gln Leu Gln Val Arg Phe 130 135 140 Leu Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu 145 150 155 160 Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Glu Arg Val Arg Gln Leu Gly His 165 170 175 Ala Leu Leu Val Arg Leu Gln Glu Val Thr His Ser Val Arg Ile Gly 180 185 190 Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Thr Val Leu Pro Phe Val Ser Thr Val 195 200 205 Pro Ser Lys Leu Arg His Pro Cys Pro Thr Arg Leu Glu Arg Cys Gln 210 215 220 Ser Pro Phe Ser Phe His His Val Leu Ser Leu Thr Gly Asp Ala Gln 225 230 235 240 Ala Phe Glu Arg Glu Val Gly Arg Gln Ser Val Ser Gly Asn Leu Asp 245 250 255 Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Leu Gln Ala Ala Leu Cys Gln 260 265 270 Glu Gln Ile Gly Trp Arg Asn Val Ser Arg Leu Leu Val Phe Thr Ser 275 280 285 Asp Asp Thr Phe His Thr Ala Gly Asp Gly Lys Leu Gly Gly Ile Phe 290 295 300 Met Pro Ser Asp Gly His Cys His Leu Asp Ser Asn Gly Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Arg Ser Thr Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val Gly Gln Val Ala Gln Ala 325 330 335 Leu Ser Ala Ala Asn Ile Gln Pro Ile Phe Ala Val Thr Ser Ala Ala 340 345 350 Leu Pro Val Tyr Gln Glu Leu Ser Lys Leu Ile Pro Lys Ser Ala Val 355 360 365 Gly Glu Leu Ser Glu Asp Ser Ser Asn Val Val Gln Leu Ile Met Asp 370 375 380 Ala Tyr Asn Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Leu Glu His Ser Ser Leu 385 390 395 400 Pro Pro Gly Val His Ile Ser Tyr Glu Ser Gln Cys Glu Gly Pro Glu 405 410 415 Lys Arg Glu Gly Lys Ala Glu Asp Arg Gly Gln Cys Asn His Val Arg 420 425 430 Ile Asn Gln Thr Val Thr Phe Trp Val Ser Leu Gln Ala Thr His Cys 435 440 445 Leu Pro Glu Pro His Leu Leu Arg Leu Arg Ala Leu Gly Phe Ser Glu 450 455 460 Glu Leu Ile Val Glu Leu His Thr Leu Cys Asp Cys Asn Cys Ser Asp 465 470 475 480 Thr Gln Pro Gln Ala Pro His Cys Ser Asp Gly Gln Gly His Leu Gln 485 490 495 Cys Gly Val Cys Ser Cys Ala Pro Gly Arg Leu Gly Arg Leu Cys Glu 500 505 510 Cys Ser Val Ala Glu Leu Ser Ser Pro Asp Leu Glu Ser Gly Cys Arg 515 520 525 Ala Pro Asn Gly Thr Gly Pro Leu Cys Ser Gly Lys Gly His Cys Gln 530 535 540 Cys Gly Arg Cys Ser Cys Ser Gly Gln Ser Ser Gly His Leu Cys Glu 545 550 555 560 Cys Asp Asp Ala Ser Cys Glu Arg His Glu Gly Ile Leu Cys Gly Gly 565 570 575 Phe Gly Arg Cys Gln Cys Gly Val Cys His Cys His Ala Asn Arg Thr 580 585 590 Gly Arg Ala Cys Glu Cys Ser Gly Asp Met Asp Ser Cys Ile Ser Pro 595 600 605 Glu Gly Gly Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Lys Cys Asn Arg Cys 610 615 620 Gln Cys Leu Asp Gly Tyr Tyr Gly Ala Leu Cys Asp Gln Cys Pro Gly 625 630 635 640 Cys Lys Thr Pro Cys Glu Arg His Arg Asp Cys Ala Glu Cys Gly Ala 645 650 655 Phe Arg Thr Gly Pro Leu Ala Thr Asn Cys Ser Thr Ala Cys Ala His 660 665 670 Thr Asn Val Thr Leu Ala Leu Ala Pro Ile Leu Asp Asp Gly Trp Cys 675 680 685 Lys Glu Arg Thr Leu Asp Asn Gln Leu Phe Phe Phe Leu Val Glu Asp 690 695 700 Asp Ala Arg Gly Thr Val Val Leu Arg Val Arg Pro Gln Glu Lys Gly 705 710 715 720 Ala Asp His Thr Gln Ala Ile Val Leu Gly Cys Val Gly Gly Ile Val 725 730 735 Ala Val Gly Leu Gly Leu Val Leu Ala Tyr Arg Leu Ser Val Glu Ile 740 745 750 Tyr Asp Arg Arg Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Lys Glu Gln Gln Gln Leu 755 760 765 Asn Trp Lys Gln Asp Ser Asn Pro Leu Tyr Lys Ser Ala Ile Thr Thr 770 775 780 Thr Ile Asn Pro Arg Phe Gln Glu Ala Asp Ser Pro Thr Leu 785 790 795

Claims (37)

  1. (a) 포유동물의 위장관으로부터 분리한 조직 또는 세포의 시험 샘플 및 (b) 대조군 샘플 내의 LY6 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 이때 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 LY6 핵산 또는 폴리펩티드의 더 높은 수준의 발현이 시험 샘플을 분리한 포유동물에 염증성 장 질환 (IBD)이 존재함을 나타내는 것인, 포유동물에서 염증성 장 질환 (IBD)을 검출하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포가 포유동물의 결장으로부터 분리된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 대조군 샘플이 동일한 조직 기원 또는 유형의 정상적인 비-IBD 조직 또는 세포의 샘플, 또는 발현 수준이 평균된 동일한 조직 기원 또는 유형의 비-IBD 조직 또는 세포의 다중 샘플, 또는 동일한 종의 건강한 정상 조직의 다중 샘플에서의 유전자 발현을 나타내는 보편적 대조군인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포에 염증이 있는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포에 염증이 없는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 시험 또는 대조군 샘플 내의 LY6 발현 수준의 검출이 (a) 시험 샘플을 LY6 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 검출가능 제제와 접촉시키는 단계; (b) 대조군 샘플을 검출가능 제제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 검출가능 제제와 시험 샘플 및 대조군 샘플의 폴리뉴클레오티드 간의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 더 많은 복합체 형성이 포유동물에 IBD가 존재함을 나타내는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열 8, 9, 1, 3, 4, 6의 핵산 서열, 또는 서열 8, 9, 1, 3, 4, 6의 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포가 포유동물의 결장으로부터 분리된 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 대조군 샘플이 동일한 조직 기원 또는 유형의 정상적인 비-IBD 조직 또는 세포의 샘플, 또는 발현 수준이 평균된 동일한 조직 기원 또는 유형의 비-IBD 조직 또는 세포의 다중 샘플, 또는 동일한 종의 건강한 정상 조직의 다중 샘플에서의 유전자 발현을 나타내는 보편적 대조군인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포에 염증이 있는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포에 염증이 없는 것인 방법.
  12. 제6항에 있어서, 검출가능 제제가 서열 8, 9, 1, 3, 4, 6을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 혼성화되는 제2 폴리뉴클레오티드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드가 검출가능한 표지를 포함하거나 또는 고체 지지체에 부착된 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 검출가능한 표지가 직접적으로 검출가능한 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 검출가능한 표지가 간접적으로 검출가능한 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 검출가능한 표지가 형광 표지인 방법.
  17. 제6항에 있어서, 제자리(in situ) 혼성화 분석법인 방법.
  18. 제6항에 있어서, 실시간 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 분석법인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 시험 또는 대조군 샘플 내의 LY6 발현 수준의 검출이 (a) 시험 샘플을 LY6 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 검출가능 제제와 접촉시키는 단계; (b) 대조군 샘플을 검출가능 제제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 검출가능 제제와 시험 샘플 및 대조군 샘플의 폴리펩티드 간의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이때 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 더 많은 복합체 형성이 포유동물에 IBD가 존재함을 나타내는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, LY6 폴리펩티드가 서열 10, 2, 5, 7, 또는 서열 10, 2, 5, 또는 7의 10개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  21. 삭제
  22. 제19항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포가 포유동물의 결장으로부터 분리된 것인 방법.
  23. 제6항 또는 제19항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포에 염증이 있는 것인 방법.
  24. 제6항 또는 제19항에 있어서, 시험 샘플의 조직 또는 세포에 염증이 없는 것인 방법.
  25. 제19항에 있어서, 검출가능 제제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 검출가능한 표지가 직접적으로 검출가능한 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 검출가능한 표지가 간접적으로 검출가능한 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 검출가능한 표지가 형광 표지 또는 방사성표지인 방법.
  30. 제1항, 제6항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 또는 세포의 시험 샘플이 IBD를 앓는 것으로 추측되는 포유동물로부터 분리된 것인 방법.
  31. 제1항, 제6항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 또는 세포의 시험 샘플이 궤양성 대장염 (UC)을 앓는 것으로 추측되는 포유동물로부터 분리된 것인 방법.
  32. 제1항, 제6항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물로부터 분리된 조직 또는 세포를 치료제와 접촉시키며, 이때 LY6 발현 수준이 포유동물로부터 분리된 조직 또는 세포에서의 치료제에 대한 응답의 존재 또는 부재를 나타내는 것인 방법.
  33. 제1항, 제6항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물로부터 분리된 조직 또는 세포를 치료제와 접촉시키며, 이때 검출은 2차 또는 후속 검출이고, LY6 발현 수준이 포유동물로부터 분리된 조직 또는 세포에서의 치료제에 대한 응답의 존재 또는 부재를 나타내는 것인 방법.
  34. 제1항, 제6항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서의 LY6 발현의 증가가 대조군 샘플에서보다 1.5배 이상 더 큰 것인 방법.
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
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