JP5848232B2 - Ｃｄ４０に対する抗体 - Google Patents

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Description

本出願は、米国特許仮出願第60/348,980号(2001年11月9日出願)の恩典を主張する。
発明の背景
CD40抗原は、腫瘍壊死因子受容体(TNF-R)ファミリーに属する50 kDaの細胞表面糖タンパク質である(Stamenkovicら、EMBO J. 8：1403-10(1989))。CD40は、Bリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞を含む、多くの正常細胞および腫瘍細胞で発現される
Figure 0005848232
。CD40は、あらゆるBリンパ腫、およびあらゆる固形腫瘍の70％で発現される。CD40は、構成的に発現されるが、抗原提示細胞では、LPS、IL-1β、IFN-γ、およびGM-CSFなどの成熟シグナルを受けて発現が増加する。
CD40の活性化は、液性免疫応答および細胞免疫応答の調節に重要な役割を果たす。CD40の活性化を伴わない抗原提示は寛容に至る場合があり、またCD40シグナル伝達は、このような寛容を逆転させ、全ての抗原提示細胞(APC)による抗原提示を促進し、ヘルパーサイトカインおよびケモカインの分泌を誘導し、共刺激分子の発現およびシグナル伝達を上昇させ、ならびに免疫細胞の細胞溶解活性を高める場合がある。
CD40は、B細胞の増殖、成熟、およびクラススイッチに重要な役割を果たす(Foy T.M.ら、Ann. Rev. of Immunol. 14：591-617(1996))。CD40シグナル伝達経路が破壊されると、血清免疫グロブリンアイソタイプの分布の異常、CD4+ T細胞プライミングの欠損、および二次液性応答の消失に至る。例えばX連鎖高IgM症候群は、ヒトCD40L遺伝子における変異が関与する疾患であり、IgMアイソタイプ以外の抗体を患者が産生できないことを特徴とする。これはCD40とCD40Lの間における有効な相互作用が、効率的な免疫応答に必要なことを意味する。
CD40とCD40Lが結合すると、CD40の細胞質ドメインとTRAF(TNF-R結合因子)の結合が誘導される
Figure 0005848232
。TRAFとの相互作用は最終的にNF-κBおよびJun/AP1の両経路を活性化する場合がある(Tsukamoto N.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：1234-9(1999)；Sutherland C.L.ら、J. of Immunol. 162：4720-30(1999))。細胞の種類に応じて、このシグナル伝達は、IL-6(Jeppson J.D.ら、J. of Immunol. 161：1738-42(1998)；Uejima Y.ら、Int. Arch. of Allergy & Immunol. 110：225-32、(1996)、IL-8(Gruss H.J.ら、Blood 84： 2305-14(1994)；von Leoprechting A.ら、Cancer Res. 59：1287-94(1999)；Denfeld R.W.ら、Europ. J. of Immunol. 26：2329-34(1996))、IL-12
Figure 0005848232
、IL-15(Kuniyoshi J.S.ら、Cellular Immunol. 193：48-58(1999))、およびケモカイン(MIP1α、MIP1β、RANTESなど)(
Figure 0005848232
)などのサイトカインの分泌亢進を誘導し、MHCクラスIおよびIIの発現を高め(Santos-Argumedo L.ら、Cellular Immunol. 156：272-85(1994))、また接着分子(例えばICAM)
Figure 0005848232
および共刺激分子(例えばB7)
Figure 0005848232
の発現を高める。CD40結合によって誘導されるサイトカインは、T細胞の生存および活性化を促す。
細胞および免疫の機能の促進に加えて、CD40の活性化の作用には以下のような作用が含まれる：ケモカインおよびサイトカインによる細胞の動員および分化；単球の活性化；細胞溶解性Tリンパ球(CTL)、およびナチュラルキラー(NK)細胞の細胞溶解活性の上昇；CD40陽性腫瘍におけるアポトーシスの誘導；CD40陽性腫瘍の免疫原性の促進；ならびに腫瘍に特異的な抗体の産生。CD40の活性化が細胞性免疫応答に果たす役割は十分明らかにされており、総説としてGrewalら、Ann. Rev. of Immunol. 16：111-35(1998)；Mackeyら、J. of Leukocyte Biol. 63：418-28(1998)；およびNoelle R.J.、Agents & Actions 補遺 49：17-22(1998)が挙げられる。
クロスプライミングモデル系を用いた研究から、APCのCD40による活性化が、細胞溶解性Tリンパ球(CTL)を産生させるためのヘルパーT細胞の必要条件を置換可能であることがわかっている(Bennettら、Nature 393：478-480(1998))。CD40L欠損マウスから得られた証拠から、CD40シグナル伝達がヘルパーT細胞のプライミングに明らかに必要なことがわかっている(Grewal I.S.ら、Science 273：1864-7(1996)；Grewal I.S.ら、Nature 378：617-20(1995))。CD40の活性化は、これ以外では、寛容性のある抗原含有B細胞を、免疫競合力のあるAPCに変換する(Buhlmann J.E.ら、Immunity 2：645-53(1995))。CD40の活性化は、臍帯血前駆細胞の、樹状細胞への成熟および分化を誘導する(Flores-Romo L.ら、J. of Exp. Med. 185：341-9(1997)；Mackey M.F.ら、J of Immunol. 161：2094-8(1998))。CD40の活性化はまた、単球から機能性樹状細胞への分化も誘導する(Brossart P.ら、 Blood 92： 4238-47(1998))。またCD40の活性化は、NK細胞の細胞溶解活性を、APC-CD40によって誘導されるサイトカインを介して高める(Carbone E.ら、J. of Exp. Med. 185：2053-60(1997)；Martin-Fontecha A.ら、J. of Immunol. 162：5910-6(1999))。以上の結果は、APCの成熟、ヘルパーサイトカインの分泌、共刺激分子の発現上昇、ならびにエフェクター機能の促進を誘導することによって、免疫応答の開始および促進にCD40が重要な役割を果たすことを意味する。
CD40シグナル伝達が、液性および細胞毒性の免疫応答の開始および成熟に重要な役割を果たすことから、この系は、免疫促進の理想的な標的となる。このような促進は、活性化されたAPCのクロスプライミングによって、免疫系に通常提示される、腫瘍抗原に対する効率的な免疫応答の惹起に特に重要な場合がある(Huang A.Y.ら、Ciba Foundation Symp. 187：229-44(1994)；Toes R.E.M.ら、Seminars in Immunol. 10：443-8(1998)；Albert M.L.ら、Nature 392：86-9(1998)；Bennett S.R.ら、J. of Exp. Med. 186：65-70(1997))。
複数の研究グループが、CD40の活性化が抗腫瘍応答にインビトロおよびインビボで有効なことを報告している(Toes R.E.M.ら、Seminars in Immunol. 10：443-8(1998))。ウイルスで形質転換された細胞による、腎細胞癌および皮下腫瘍の肺転移モデルを用いた2つの研究グループが、CD40の活性化が、腫瘍特異的抗原に対する寛容を逆転して、効率的なT細胞の抗腫瘍プライミングを誘導可能なことを独立に報告している(Sotomayor E.M.ら、Nature Medicine 5：780-787(1999)；Diehl L.ら、Nature Medicine 5：774-9(1999))。免疫細胞の非存在下における抗腫瘍活性も、CD40Lおよび抗CD40抗体を、SCIDマウスによるヒト乳癌系列モデルに投与することで報告されている(Hirano A.ら、Blood 93：2999-3007(1999))。最近、抗CD40抗体によるCD40の活性化が、CD40+およびCD40-のリンパ腫をマウスモデルで完全に除去することが報告された(French R.R.ら、Nature Medicine 5：548-53(1999))。またGlennieらによる過去の研究で、抗CD40抗体によるシグナル伝達活性が、インビボにおける腫瘍の消失(tumor clearance)の誘導に関して、エフェクター動員能力を有する他の抗表面マーカー抗体より有効であると結論づけられている(Tutt A.L.ら、J. of Immunol. 161：3176-85(1998))。以上の結果と一致して、抗CD40抗体を、インビボにおける対CD40+腫瘍細胞活性に関して検討した場合に、全てではないが大半の殺腫瘍性活性がADCCではなくCD40シグナル伝達と関連していた(Funakoshi S.ら、J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19：93-101(1996))。別の研究では、骨髄の樹状細胞が、エキソビボでさまざまな薬剤で処理され、インビボにおける抗腫瘍活性が検討された。以上の研究から、CD40Lによって刺激されたDCが、抗腫瘍応答を惹起する、最も成熟した、かつ最も有効な細胞であることがわかる。
抗腫瘍免疫におけるCD40の本質的な役割も、腫瘍ワクチンに対する野生型マウスとCD40-/-マウスの反応の比較によって明らかにされている。このような研究から、CD40-/-マウスが、正常マウスでは認められた腫瘍免疫を獲得できないことが報告されている(Mackey M.F.ら、Cancer Research 57：2569-74(1997))。別の研究では、腫瘍のあるマウスの脾臓細胞が腫瘍細胞で刺激され、活性化抗CD40抗体でエキソビボで治療され、また腫瘍特異的CTL活性が高いことが報告されている(Donepudi M.ら、Cancer Immunol. Immunother. 48：153-164(1999))。以上の研究から、CD40陽性および陰性の腫瘍の両方において、CD40が抗腫瘍免疫の重要な位置を占めることがわかる。CD40は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、上咽頭、膀胱、卵巣、および肝臓の癌の大半、ならびに一部の乳癌および結腸直腸癌で発現されるので、CD40の活性化は広範囲の臨床応用が可能である。
抗CD40活性化モノクローナル抗体は、複数の重要な機構を介して腫瘍の根絶に寄与する場合がある。なかでも最も重要な機構は、腫瘍特異的なCD4+リンパ球およびCD8+リンパ球の活性化に至る、腫瘍抗原のプロセシングおよび提示の促進、ならびにCD40陽性腫瘍細胞そのものの抗原提示または免疫原性の促進に対する宿主樹状細胞の活性化である。別の抗腫瘍活性は、CD40シグナル伝達の他の免疫増強作用(ケモカインおよびサイトカインの産生、単球の動員および活性化、ならびにCTLおよびNK細胞溶解活性の促進)、ならびにアポトーシスの誘導、またはADCCに至る液性応答の刺激によるCD40+腫瘍の直接的な死滅を介在する場合がある。アポトーシスを起こしている腫瘍細胞、および死滅途上の腫瘍細胞が、CD40によって活性化されたAPCによる処理されて提示される、腫瘍特異的抗原の重要な供給源となる場合もある。
したがって、治療目的の臨床的に重要な抗CD40アゴニスト抗体の必要性は極めて高い。
本発明は、CD40に結合してCD40アゴニストとして作用する、単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
本発明は、抗CD40抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。この組成物は、抗腫瘍剤や造影剤などの別の成分をさらに含む場合がある。診断法および治療法も本発明で提供される。
本発明は、抗CD40抗体またはその抗原結合部分を産生するハイブリドーマなどの、単離された細胞株を提供する。
本発明はまた、抗CD40抗体の重鎖および/または軽鎖、またはこの抗原結合部分をコードする核酸分子も提供する。
本発明は、核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに核酸分子にコードされたポリペプチドを組換え的に産生させる方法を提供する。
抗CD40抗体の重鎖および/または軽鎖、またはこの抗原結合部分を発現する非ヒトトランスジェニック動物も提供する。
本発明はまた、抗CD40抗体の重鎖および/または軽鎖、またはこの抗原結合部分をコードする有効量の核酸分子を、処置を必要とする被験者に投与する方法も提供する。
単離された抗CD40モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の推定アミノ酸配列と、対応する軽鎖および重鎖の遺伝子の生殖系列におけるアミノ酸配列との配列アライメントを示す。対象クローンと生殖系列の配列にみられる差に影をつけて示す。生殖系列のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列には下線を付してある。重鎖配列アライメントでは、CDR3領域への明らかな挿入を、生殖系列の配列上にダッシュ(-)で、またCDR3領域内における明らかな欠失を、クローンの配列上にダッシュ(-)で示してある。 図1Aは、mAb 3.1.1および7.1.2のκ軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびにVκ=A3/A19およびJ=Jκ1遺伝子の生殖系列におけるアミノ酸配列。図1Bは、クローン15.1.1のκ軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(Vκ=A3/A19およびJ=Jκ2)。図1Cは、mAb 10.8.3および21.4.1のκ軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(Vκ=L5(DP5)およびJ=Jκ4)。図1Dは、mAb 3.1.1の重鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=3-30+(DP-49)、D=D4+DIR3、およびJ=JH6)。図1Eは、mAb 7.1.2の重鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=3-30+(DP-49)、D=DIR5+D1-26、およびJ=JH6)。図1Fは、mAb 10.8.3の重鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=4.35(VIV-4)、D=DIR3、およびJ=JH6)。図1Gは、mAb 15.1.1の重鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=4-59(DP-71)、D=D4-23、およびJ=JH4)、ならびに、図1Hは、mAb 21.4.1の重鎖可変領域の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=1-02(DP-75)、D=DLR1、およびJ=JH4)。 単離された抗CD40モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインと、対応する軽鎖および重鎖の遺伝子の生殖系列におけるアミノ酸配列との推定アミノ酸配列の配列アライメントを示す。対象クローンと生殖系列の配列にみられる差を太字で示す。生殖系列のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列には下線を付してある。重鎖配列アライメントでは、CDR3領域への明らかな挿入を、生殖系列の配列上にダッシュ(-)で、またCDR3領域内における明らかな欠失を、クローン配列上にダッシュ(-)で示してある。図2Aは、mAb 22.1.1、23.5.1、および23.29.1のκ軽鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(Vκ=A3/A19およびJ=Jκ1)。図2Bは、mAb 21.2.1のκ軽鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(Vκ=A3/A19およびJ=Jκ3)。図2Cは、mAb 23.28.1、23.28.1L-C92A、および24.2.1のκ軽鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(Vκ=A27およびJ=Jκ3)。図2Dは、mAb 21.2.1の重鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=3-30+、D=DIR3+D6-19、およびJ=JH4)。図2Eは、mAb 22.1.1、22.1.1H-C109Aの重鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=3-30+、D=D1-1、およびJ=JH6)。図2Fは、mAb 23.5.1の重鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=3-30+、D=D4-17、およびJ=JH6)。図2Gは、mAb 23.29.1の重鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=3-30.3、D=D4-17、およびJ=JH6)、ならびに図2Hは、mAb 23.28.1、23.28.1H-D16E、および24.2.1の重鎖の推定アミノ酸配列、ならびに生殖系列におけるアミノ酸配列(VH=4-59、D=DIR1+D4-17、およびJ=JH5)。 本発明の抗CD40抗体(21.4.1)が、ヒト樹状細胞によるIL-12p40の産生を促進する能力をもつことを示す用量反応曲線。 本発明の抗CD40抗体(21.4.1)が、ヒト樹状細胞によるIL-12p70の産生を促進する能力をもつことを示す用量反応曲線。 本発明の抗CD40抗体(21.4.1)が、Jy刺激細胞による免疫原性を高め、Jy標的細胞に対するCTL活性を高める能力をもつことを示すグラフ。 本発明の抗CD40抗体(21.4.1)で処理したSCIDベージュマウスにおけるCD40陽性Daudi腫瘍の成長が低下することを示す腫瘍成長阻害曲線。 本発明の抗CD40抗体(21.4.1)、ならびにヒトの樹状細胞およびT細胞で処理したSCIDベージュマウスにおけるCD40陰性K562腫瘍の成長が低下することを示す腫瘍成長阻害曲線。 SCIDマウスにおけるCD40陰性K562腫瘍の成長が、さまざまな濃度の抗CD40アゴニストmAb 23.29.1によって阻害されることを示す。 SCIDマウスにおけるCD40陰性K562腫瘍の成長が、さまざまな濃度の抗CD40アゴニストmAb 3.1.1によって阻害されることを示す。 SCIDマウスにおけるT細胞および樹状細胞の存在下および非存在下で、抗CD40アゴニストmAbによってCD40陽性Raji腫瘍の成長が阻害されることを示す。 SCIDマウスにおけるCD40陽性Raji腫瘍の成長が、抗CD40アゴニスト抗体によって阻害されることを示す。 SCIDベージュマウスにおけるBT 474乳癌細胞の成長が、抗CD40アゴニスト抗体によって阻害されることを示す。 SCIDベージュマウスにおけるPC-3前立腺腫瘍の成長が、抗CD40アゴニスト抗体によって阻害されることを示す。 Daudi腫瘍細胞を静脈内注射し、抗CD40アゴニスト抗体で処理したSCIDベージュマウスの生存曲線。 抗CD40アゴニスト抗体の、還元型(R)および非還元型(NR)のヒトCD40に対するウェスタンブロット解析。 マウスおよびヒトのCD40のD1〜D4ドメインのアライメント。 キメラの融合部位の位置を示す、マウスおよびヒトのCD40のアミノ酸配列のアライメントを示す。 キメラCD40構築物の一連の略図。
発明の詳細な説明
定義および一般的手法
本明細書で明確に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味をもつものとする。また文脈上で必要とされない限り、単数形は複数形を含むものとし、また複数形は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載された細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学、およびハイブリダイゼーションの手法に関連して使用される命名法は当業者に周知であり、当技術分野で一般に使用される。
本発明の方法および手法は一般に、特に明記しない限り、当技術分野で周知であって、本明細書で引用および言及されている、さまざまな一般的な参考文献、および、より専門的な参考文献に記載されている従来の方法にしたがって実施される。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられるSambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989)、およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Associates(1992)、ならびにHarlowおよびLane、「Antibodies：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、N.Y.(1990)を参照されたい。酵素反応および精製法は、当技術分野で一般的に達成される、または本明細書に記載された、製造業者の説明書にしたがって実施される。本明細書に記載された、分析化学、有機合成化学、ならびに医学および薬学化学の実験手順および手法に関連して使用される命名法は当業者に周知であり、当技術分野で一般的に使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、ならびに輸送、および患者の治療には、標準的な手法が使用される。
以下の表現は、特に明記しない限り、以下の意味をもつと理解される：
「ポリペプチド」という表現は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を意味する。ポリペプチドは単量体または多量体の場合がある。
「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離された抗体」は、起源または供給源に関して以下の性質を有するタンパク質、ポリペプチド、または抗体である：(1)天然の状態でともに存在する、天然に結合した成分に結合しないこと、(2)同じ種に由来する他のタンパク質を含まないこと、(3)異なる種に由来する細胞で発現されること、または(4)天然に存在しないこと。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、または天然の細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、天然の状態で結合した状態の成分から「単離」される。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製法で単離することで、天然の状態で結合した成分を実質的に含まないようにすることもできる。
単離された抗体の例には、CD40を用いてアフィニティ精製された抗CD40抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞株によってインビトロで合成された抗CD40抗体、およびトランスジェニックマウスに由来するヒト抗CD40抗体が含まれる。
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60〜75％が1種のポリペプチドを示す場合に「実質的に純粋であり」、「実質的に均一であり」、または「実質的に精製されている」。このようなポリペプチドまたはタンパク質は単量体または多量体の場合がある。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は通常、タンパク質試料の約50％、60％、70％、80％、または90％(重量/重量)、より一般的には約95％を含むか、また好ましくは99％以上純粋である。タンパク質の純度または均一性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続く1本のポリペプチドバンドの、当技術分野で周知の染色剤によるゲルの染色による描出などの、当技術分野で周知の複数の手段で示すことができる。目的によっては、HPLC、または精製分野で周知における他の手段を用いることで、高分解能が得られる場合がある。
本明細書で用いる「ポリペプチド断片」という表現は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は天然の配列の対応する位置と同一であるポリペプチドを意味する。いくつかの態様では、断片の長さは少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、8アミノ酸、または10アミノ酸である。他の態様では、断片の長さは少なくとも14アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、または少なくとも70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、もしくは200アミノ酸である。
本明細書で用いる「ポリペプチド類似体」という表現は、アミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有し、以下の特性の少なくとも1つを有するセグメントを含むポリペプチドを意味する：(1)適切な結合条件でCD40と特異的に結合すること、(2)CD40を活性化可能なこと、(3)ICAM、MHC-II、B7-1、B7-2、CD71、CD23、およびCD83などの細胞表面分子の発現を高められること、または(4)IFN-β1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、およびIL-23などのサイトカインの分泌を高められること。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然の配列に対して、保存的アミノ酸の置換(または挿入もしくは欠失)を含む。類似体は典型的には、少なくとも20アミノ酸もしくは25アミノ酸の長さであり、好ましくは少なくとも50アミノ酸、60アミノ酸、70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、または200アミノ酸、またはそれ以上の長さであり、また完全長の天然のポリペプチドを含む場合もある。
好ましいアミノ酸置換は以下の通りである：(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、(2)酸化に対する感受性を低下させる置換、(3)タンパク質複合体を形成する結合親和性を変化させる置換、ならびに(4)類似体の他の物理的化学的特性または機能的特性を付与したり修飾したりする置換。類似体は、天然のペプチド配列以外の配列のさまざまな突然変異を含む場合がある。例えば1つまたは複数のアミノ酸の置換(好ましくは保存的アミノ酸置換)は、天然の配列内(好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの一部)に作られる場合がある。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させないはずである(例えば、置換アミノ酸は、親配列内のらせんを壊したり、親配列を特徴づける他の種類の二次構造を壊したりする傾向がないはずである)。当技術分野で周知のポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、それぞれ参照として本明細書に組み入れられる「Proteins, Structures and Molecular Principles」(Creighton編、W.H. Freeman and Company、New York(1984))、「Introduction to Protein Structure」(C. BrandenおよびI. Tooze編、Garland Publishing、New York、N.Y.(1991))；ならびにThorntonら、Nature 354：105(1991)に記載されている。
非ペプチド類似体は一般に、テンプレートペプチドの性質に似た性質を有する薬剤として製薬業界で使用されている。このような種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体(peptide mimeticsまたはpeptidomimetics)」と呼ばれる。これについては、参照として本明細書に組み入れられるFauchere、J. Adv. Drug Res. 15：29(1986)；VeberおよびFreidinger、TINS p.392(1985)；ならびにEvansら、J. Med. Chem. 30：1229(1987)に記載されている。このような化合物は、コンピュータによる分子モデリングを援用して開発することができる。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣体は、同等の治療または予防の効果を誘導するために使用することができる。一般にペプチド模倣体は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド(所望の生化学的性質または薬学的性質を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、以下からなる群より選択される結合によって、当技術分野で周知の方法で任意に置換された1つまたは複数のペプチド結合を有する：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--(シスおよびトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、ならびに-CH2SO--。コンセンサス配列の1個または複数のアミノ酸と、同じ種類のD-アミノ酸との系統的な置換(例えばL-リシンに代えてD-リシン)を行うことで、より安定なペプチドを作製することもできる。また、コンセンサス配列、または実質的に同一なコンセンサス配列の変形形態を含む、制約を受けるペプチドを、当技術分野で周知の方法(参照として本明細書に組み入れられるRizoおよびGierasch、Ann. Rev. Biochem. 61：387(1992))で、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することで作製することができる。
「抗体」という用語は、完全な抗体を意味するか、または特異的な結合に関して完全抗体に匹敵する、この抗原結合部分を意味する。これについては一般に、「Fundamental Immunology」、第7章(Paul, W.編、第2版、Raven Press、N.Y.(1989))(全ての目的に関して全体が参照として組み入れられる)を参照されたい。抗原結合部分は、組換えDNA手法によって、または完全抗体を酵素的もしくは化学的に切断することで作製することができる。抗原結合部分は特に、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、および相補性決定領域(CDR)断片、単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、ダイアボディ(diabody)、および特異的な抗原をポリペプチドに十分付与する抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
N末端からC末端に向かって、軽鎖および重鎖の両可変領域は、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(National Institutes of Health、Bethesda, Md.(1987および1991))、またはChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. 196：901-917(1987)；Chothiaら、Nature 342：878-883(1989)に記載された定義に基づく。
本明細書では、数字を付して指定される抗体は、同じ数字を付したハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体である。例えばモノクローナル抗体3.1.1は、ハイブリドーマ3.1.1から得られる。
本明細書では、Fd断片はVHドメインおよびCH1ドメインからなる抗体断片を意味する。Fv断片は、抗体の1本の腕のVLドメインおよびVHドメインからなる。またdAb断片(Wardら、Nature 341：544-546(1989))はVHドメインからなる。
いくつかの態様では、抗体は、VLドメインとVHドメインが対を形成して、1本のタンパク質鎖の形成を可能とする合成リンカーを挟んで一価の分子を形成する単鎖抗体(scFv)である(Birdら、Science 242：423-426(1988)、およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883(1988))。いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体、すなわちVHドメインとVLドメインを1本のポリペプチド鎖上で発現させるが、非常に短いために同じ鎖上の上記2つのドメイン間で対を形成できないリンカーを用いることで、強制的にドメインを、別の鎖の相補的なドメインと対形成させることで2つの抗原結合部位を作る二価抗体である(例えばHolliger P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993)、およびPoljak R.J.ら、Structure 2：1121-1123(1994)を参照)。いくつかの態様では、本発明の抗体に由来する1つまたは複数のCDRを、分子内に共有結合的または非共有結合的に導入することで、CD40に特異的に結合する免疫接着分子(immunoadhesin)とすることができる。このような態様では、1つまたは複数のCDRを、より長いポリペプチド鎖の一部として組み入れたり、別のポリペプチド鎖に共有結合的に結合させたり、または非共有結合的に組み入れたりすることができる。
一か所または複数の箇所の結合部位を有する態様では、結合部位は相互に同一であるか、または異なる可能性がある。
本明細書で用いる「ヒト抗体」という表現は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列の全てがヒトの配列である、任意の抗体を意味する。このような抗体は、後述するさまざまな方法で調製することができる。
本明細書で用いる「キメラ抗体」という表現は、2つまたはそれ以上の異なる抗体に由来する領域を含む抗体を意味する。1つの態様では、1つまたは複数のCDRは、ヒト抗CD40抗体に由来する。別の態様では、全てのCDRがヒト抗CD40抗体に由来する。別の態様では、複数のヒト抗CD40抗体に由来するCDRが、キメラ抗体内で結合状態にある。例えばキメラ抗体は、第1のヒト抗CD40抗体の軽鎖のCDR1、第2のヒト抗CD40抗体の軽鎖のCDR2、ならびに第3のヒト抗CD40抗体の軽鎖のCDR3を含む場合があり、また重鎖のCDRは、1つもしくは複数の他の抗CD40抗体に由来する場合がある。またフレームワーク領域は、同じ抗CD40抗体の1つか、または一人または複数の異なるヒトに由来する場合がある。
本明細書で用いる「活性化抗体」(本明細書では「アゴニスト抗体」とも呼ばれる)という表現は、CD40を発現する細胞、組織、または生物体に添加した場合に、1つまたは複数のCD40活性を少なくとも約20％高める抗体を意味する。いくつかの態様では、抗体はCD40活性を少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％高める。いくつかの態様では、活性化抗体をCD40Lの存在下で添加する。いくつかの態様では、活性化抗体の活性を全血表面分子上方制御アッセイ法(upregulation assay)で測定する(実施例VII参照)。別の態様では、活性化抗体の活性を、IL-12の放出を測定する樹状細胞アッセイ法で測定する(実施例VIII参照)。別の態様では、活性化抗体の活性をインビボ腫瘍モデルで測定する(実施例X参照)。
抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体を、当業者であれば本明細書に記載した手順で容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界の近傍に存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列のデータを、公共または民間の配列データベースと比較することで同定することができる。好ましくは、コンピュータを利用した比較法で、構造および/または機能が既知の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは推定タンパク質構造ドメインを同定する。既知の3次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法は既知である(Bowieら、Science 253：164(1991)を参照)。
本明細書で用いる「表面プラズモン共鳴」という表現は、リアルタイムの生物特異的相互作用の解析を、バイオセンサーマトリックス内におけるタンパク質濃度の変化の検出によって、例えばBIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、Sweden and Piscataway、N.J.)を用いることで可能とする光学的現象を意味する。詳細についてはJonsson U.ら、Ann. Biol. Clin. 51：19-26(1993)；Jonsson U.ら、Biotechniques 11：620-627(1991)；Jonsson B.ら、J. Mol. Recognit. 8：125-131(1995)；およびJohnsson B.ら、Anal. Biochem. 198：268-277(1991)を参照されたい。
「KD」という表現は、特定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。
「エピトープ」という表現は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に対する特異的な結合を可能とする任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸や糖の側鎖などの、化学的に活性のある表面分子集団からなり、また通常、特定の3次元構造特性、ならびに特異的な電荷の特徴を有する。抗体は、平衡解離定数が≦1 μM、好ましくは≦100 nM、また最も好ましくは≦10 nMである場合に、抗原と特異的に結合すると表現される。
本明細書で用いる20種類の従来のアミノ酸、およびこれらの省略形は従来の用法にしたがう。これについては、参照として本明細書に組み入れられる「Immunology-A Synthesis」(第2版、E.S. GolubおよびD.R. Gren編、Sinauer Associates、Sunderland、Mass.(1991))を参照されたい。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という表現は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドである、長さが少なくとも10塩基の多量体の状態のヌクレオチドであるか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型を意味する。この表現は1本鎖および2本鎖の形状を含む。
本明細書で用いる「単離されたポリヌクレオチド」という表現は、起源に関して「単離されたポリヌクレオチド」が以下の性質を有するゲノム、cDNA、もしくは合成起源、またはこれらのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味する：(1)「単離されたポリヌクレオチド」が、自然界に存在するポリヌクレオチドの全体または一部に結合していないこと、(2)自然界では連結した状態にないポリヌクレオチドに機能的に連結されていること、または(3)より長い配列の一部として自然界に存在しないこと。
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という表現は、天然のヌクレオチド、および天然のオリゴヌクレオチド結合と非天然のオリゴヌクレオチド結合で連結された修飾型ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に長さが200塩基か、これより少ないポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくはオリゴヌクレオチドの長さは10〜60塩基であり、また最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20から40塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えばプライマーやプローブとしては通常1本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体の構築に使用する場合は2本鎖の場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドのいずれかの場合がある。
本明細書で用いる「天然のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で用いる「修飾型ヌクレオチド」は、修飾型または置換型の糖官能基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書では「オリゴヌクレオチド結合」という表現は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホラニラデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられる
Figure 0005848232
を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、望ましいならば、検出用の標識を含む場合がある。
「機能的に連結された」配列は、対象遺伝子と連続した発現制御配列と、トランスに(距離をおいて)作用して対象遺伝子を制御作用する発現制御配列の両方を含む。本明細書で用いる「発現制御配列」という表現は、連結した状態でコード配列の発現およびプロセシングを有効とするために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写の開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルやポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質内のmRNAを安定化させる配列；翻訳効率を促進する配列(コザック(Kozak)コンセンサス配列)；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに望ましいならば、タンパク質の分泌を高める配列を含む。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター配列、リボソーム結合部位配列、および転写終結配列を含む。また真核生物では一般に、このような制御配列は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。「制御配列」という表現は、存在することが発現およびプロセシングに不可欠な、少なくとも全ての成分を含むことを意図し、存在することが利点となる、例えばリーダー配列および融合パートナー配列などの他の成分を含む場合もある。
本明細書で用いる「ベクター」という表現は、連結された別の核酸を移す能力を有する核酸分子を意味する。いくつかの態様では、ベクターは、追加的なDNAセグメントを連結可能なプラスミド(環状の2本鎖DNAループ)である。いくつかの態様では、ベクターは、追加的なDNAセグメントをウイルスゲノムに連結可能なウイルスベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、導入された宿主細胞内で自律的に複製する能力をもつ(例えば細菌の複製起点や、エピソーム型哺乳類ベクターを有する細菌ベクター)。他の態様では、ベクター(例えば非エピソーム型哺乳類ベクター)は、宿主細胞に導入後に宿主細胞ゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムとともに複製可能である。また一部のベクターは、機能的に連結させた遺伝子の発現を誘導する能力を有する。このようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ぶ。
本明細書で用いる「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という表現は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味すると理解すべきである。変異または環境の影響を受けることで、一部の修飾は、続く世代に存在する場合があるので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、それでも本明細書で用いる「宿主細胞」という表現の範囲に含まれる。
「選択的にハイブリダイズする」という表現は、本明細書では、検出目的で、また特異的に結合させることを意味する。本発明におけるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびこれらの断片は、非特異的な核酸に対する検出可能な量の結合を最小とするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー」、または「高度にストリンジェントな」条件を、当技術分野で周知であり、本明細書に記載された選択的なハイブリダイゼーション条件を達成するために使用することができる。「高ストリンジェンシー」、または「高度にストリンジェントな」条件の一例は、ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドのインキュベーションであって、一方のポリヌクレオチドを、6×SSPE、またはSSC、50％ホルムアミド、5×デンハルト試薬、0.5％ SDS、100 μg/ml変性断片化サケ***DNAを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、42℃のハイブリダイゼーション温度で12〜16時間かけて膜などの固体表面上に結合させた後に、1×SSC、0.5％ SDSの洗浄緩衝液を用いて55℃で2回洗浄する、ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドのインキュベーションである。これについては、前出のSambrookら、pp.9.50〜9.55も参照されたい。
核酸配列に関する「配列同一性％」という表現は、最大の一致を示すようにアライメントさせたときに、2つの配列内で同じ残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約9ヌクレオチド、通常少なくとも約18ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約32ヌクレオチド、また好ましくは少なくとも約36ヌクレオチド、48ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの場合がある。ヌクレオチド配列の同一性を測定するために使用可能な、当技術分野で周知の多種多様なアルゴリズムがある。例えばポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package、バージョン10.0、Genetics Computer Group(GCG)、Madison、Wisconsinに含まれるプログラムであるFASTA、Gap、またはBestfitで比較することができる。例えばプログラムFASTA2およびFASTA3を含むFASTAは、問合わせ配列と探索配列間において最高の重複を示す領域のアライメントおよび配列同一性％を提供する(参照として本明細書に組み入れられるPearson、Methods Enzymol. 183：63-98(1990)；Pearson、Methods Mol. Biol. 132：185-219(2000)；Pearson、Methods Enzymol. 266：227-258(1996)；Pearson、J. Mol. Biol. 276：71-84(1998)を参照)。特に明記しない限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメータを使用する。例えば核酸配列間の配列同一性％は、FASTAの場合では、デフォルトパラメータ(ワードサイズ＝6、スコアリングマトリックス用にNOPAMファクターを使用)を用いることで、またはGapの場合では、参照として本明細書に組み入れられるGCGバージョン6.1で提供されるデフォルトパラメータを用いることで決定することができる。
ヌクレオチド配列に関しては、特に明記しない限り、その相補物を含む。したがって、特定の配列を有する核酸について言及する際は、その相補鎖を、その相補的配列とともに含むと理解すべきである。
分子生物学の分野では、「配列同一性％」、「配列類似性％」、および「配列相同性％」という表現が研究者によって互換的に使用される。本出願では、これらの表現は、核酸配列のみに関して同じ意味をもつものとする。
核酸、またはこれらの断片について言及する際に、「実質的な類似性」、または「実質的な配列類似性」という表現は、別の核酸(またはこの相補鎖)と、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を許容しつつ最適にアライメントする際に、ヌクレオチド配列の同一性が、上述のPASTA、BLAST、またはGapなどの配列同一性の任意の既知のアルゴリズムで測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、またより好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％であることを意味する。
ポリペプチドに関して、「実質的な同一性」という表現は、2つのペプチド配列が、GAPやBESTFITなどのプログラムで、デフォルトのギャップ重み(gap weight)を用いて最適にアライメントさせた際に、少なくとも70、75、もしくは80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90もしくは95％の配列同一性、またより好ましくは少なくとも97、98、もしくは99％の配列同一性を示すことを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学的性質(例えば電荷や疎水性)を有する側鎖R基を有する別のアミノ酸残基と置換されている置換である。一般に保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えない。2つもしくはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、配列同一性％、または類似性の程度は、置換の保存的性質を正すために上方に調整することができる。このような調整を行う手段は当技術分野で周知である(Pearson、Methods Mol. Biol. 243：307-31(1994)参照)。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例には、1)脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；3)アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；4)芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；5)塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；6)酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに7)硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンなどがある。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
または、保存的置換は、参照として本明細書に組み入れられるGonnetら、Science 256：1443-45(1992)に記載されたPAM250の対数確率行列で正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、PAM250対数確率行列で負でない値を有する任意の変化である。
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は通常、配列解析ソフトウェアで測定される。タンパク質解析ソフトウェアで、保存的アミノ酸置換を含む、さまざまな置換、欠失、および他の修飾に割り当てる類似性の尺度を用いて類似の配列とマッチさせる。例えばGCGは、デフォルトのパラメータを使用して、異種の生物に由来する相同ポリペプチドなどの、密接に関連したポリペプチド間における、または野生型タンパク質とこの変異体との間における、配列相同性もしくは配列同一性を決定することが可能な「Gap」や「Bestfit」などのプログラムを含む(GCGバージョン6.1を参照)。ポリペプチド配列は、GCGバージョン6.1に含まれるプログラムであるFASTAで、デフォルトのパラメータまたは推奨パラメータを用いて比較することもできる。FASTA(例えばFASTA2およびFASTA3)は、問合わせ配列と探索配列間において最高の重複を示す領域のアライメントおよび配列同一性％を提供する(Pearson、Methods Enzymol. 183：63-98(1990)；Pearson、Methods Mol. Biol. 132：185-219(2000))。本発明の配列を、異なる生物の大量の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムが、デフォルトのパラメータを用いるコンピュータプログラムBLAST(特にblastpまたはtblastn)である。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられるAltschulら、J. Mol. Biol. 215：403-410(1990)；Altschulら、Nucleic Acids Res. 25：3389-402(1997)を参照されたい。
相同性を比較する対象のポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸残基であり、通常少なくとも約20残基であり、より一般的には少なくとも約24残基であり、典型的には少なくとも約28残基であり、また好ましくは約35残基を上回る。多種多様な生物の配列を含むデータベースを検索する際は、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
本明細書で用いる「標識」または「標識された」という表現は、別の分子を抗体に導入することを意味する。1つの態様では、標識は検出マーカーであり、例えば放射標識アミノ酸を導入したり、マークのつけられたアビジン(例えば光学的方法または熱量測定法で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン)で検出可能なビオチン部分のポリペプチドに結合させたりする。別の態様では、標識またはマーカーは、治療目的のもの(例えば薬剤コンジュゲートや毒素)とすることができる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識するさまざまな方法は当技術分野で周知であり、使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、以下のようなものがあるがこれらに限定されない：放射性同位元素または放射性核種(例えば3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光標識(例えばFITC、ローダミン、ランタニド蛍光体(lanthanide phosphor))、酵素標識(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチニル基、2次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、ガドリニウムキレート剤などの磁気薬剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同物。いくつかの態様では標識を、潜在的な立体障害を小さくするために、さまざまな長さのスペーサーアームによって結合させる。
「患者」という表現は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
本明細書および請求項の全体において、「〜を含む(comprise)」という表現、または「〜を含む(comprises、comprising)」などの変形例は、記載された整数値、または記載された整数値群を含むが、他の任意の整数値または整数値群を除外しないように理解される。
ヒト抗CD40抗体およびその特徴
ヒト抗体は、非ヒト(例えば齧歯類)の可変領域および/または定常領域を有する抗体に関連する一部の問題を回避する。このような問題には、抗体に対する抗体または免疫応答の迅速な消失(clearance)などが含まれる。したがって1つの態様では、本発明は、ヒト化抗CD40抗体を提供する。別の態様では、本発明はヒト抗CD40抗体を提供する。いくつかの態様では、ヒト抗CD40抗体は、ゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を含むことでヒト抗体を産生する齧歯類を免疫化することで産生される。ヒト抗CD40抗体は、非ヒトまたは非ヒト由来のモノクローナル抗体(Mab)に内在する免疫原性応答およびアレルギー応答を最小化することで、投与抗体の有効性および安定性を高めると予想される。完全ヒト抗体を用いることで、抗体の反復投与を必要とする場合がある、炎症や癌といった慢性および再発性のヒト疾患の治療に、実質的な利点がもたらされると期待できる。
本発明は、11種類の活性化ヒト抗CD40モノクローナル抗体(mAb)、およびこれらを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。表Aは、完全長の重鎖および軽鎖をコードする核酸(リーダー配列を含む)、対応する完全長の推定アミノ酸配列、およびヌクレオチド、ならびに重鎖および軽鎖の可変領域の推定アミノ酸配列の配列識別子(sequence identifier)(配列番号：)を示す。
(表Ａ)
Figure 0005848232
本発明はさらに、ヒト抗CD40 mAb 23.25.1、およびこれを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明はさらに、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、上述のヒト抗CD40 mAbの重鎖および/または軽鎖のバリアントを提供する。本発明は、mAb 3.1.1の2つのバリアント重鎖を提供する。その1つでは、残基78位のアラニンがスレオニンに変更されている。もう1つでは残基78のアラニンがスレオニンに変更されており、残基88位および残基97位のバリンがアラニンに変更されている。本発明はまた、残基4のロイシン、および残基83位のロイシンがそれぞれメチオニンとバリンに変更されたmAb 3.1.1のバリアント軽鎖も提供する。バリアントの重鎖および軽鎖と、それぞれ野生型の軽鎖または重鎖の組み合わせは、変異鎖によって指定される。したがって、残基78におけるアラニンからスレオニンへの変異を含む野生型の軽鎖および重鎖を含む抗体は3.1.1H-A78Tと命名される。しかし本発明の他の態様では、3.1.1のバリアント重鎖およびバリアント軽鎖の任意の組み合わせを含む抗体が含まれる。
また本発明は、残基109位のシステインをアラニンに変えたmAb 22.1.1の重鎖のバリアントを提供する。バリアント重鎖および22.1.1軽鎖を含むモノクローナル抗体はmAb 22.1.1H-C109Aと呼ばれる。本発明はさらに、mAb 23.28.1の2つのバリアント重鎖およびバリアント軽鎖を提供する。1つの重鎖バリアントでは、残基16位のアスパラギン酸がグルタミン酸に変えられている。バリアント重鎖のバリアント、および23.28.1の軽鎖を含むmAbは23.28.1H-D16Eと呼ばれる。本発明はまた、残基92位のシステインがアラニンに変化された23.28.1軽鎖バリアントも含む。23.28.1の重鎖およびバリアント軽鎖を含むmAbは23.28.1L-C92Aと呼ばれる。本発明はまた、23.28.1の重鎖のバリアントか、23.28.1の軽鎖のバリアントのいずれか一方を含むmAbも提供する。
ハイブリドーマ23.29.1によって産生される軽鎖は、定常領域の残基174位に変異を含む。このハイブリドーマによって産生される軽鎖は、この位置に、標準的なリシンではなくアルギニンを有する。したがって本発明はまた、残基174位に標準的なリシンを有する23.29.1の軽鎖、および23.29.1の重鎖およびバリアント軽鎖を含む23.29.1L-R174Kと命名されたmAbも提供する。
好ましい態様では、抗CD40抗体は
Figure 0005848232
である。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、配列番号：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、94、100、もしくは102からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、もしくはこれらに由来する可変領域、または配列番号：7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、93、99、もしくは101からなる核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、列挙された抗体の1つに由来するCDR2を少なくとも含む軽鎖、上記のアミノ酸配列(図1A〜1Cおよび図2A〜2Cに示す配列)の1つ、または上記の核酸配列の1つにコードされたアミノ酸配列を含む。別の態様では、軽鎖は、生殖系列のVκ A3/A19、L5、もしくはA27の遺伝子にコードされたアミノ酸配列に由来するわずか10種類のアミノ酸を含む軽鎖可変領域から独立に選択されるCDR1およびCDR3をさらに含むか、または(1)
Figure 0005848232
から選択される抗体；(2)配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、もしくは102のアミノ酸配列、または(3)配列番号：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、99、もしくは101の核酸配列にコードされたアミノ酸配列のCDR1およびCDR3の1つから独立に選択されるCDR1およびCDR3を含む。
別の好ましい態様では、抗CD40抗体は、配列番号：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、もしくは86から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、またはこれらに由来する可変領域、または配列番号：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、もしくは85から選択される核酸配列にコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、列挙された抗体の1つに由来するCDR3を少なくとも含む重鎖、上記のアミノ酸配列(図1A〜1Cおよび図2A〜2Cに示す配列)の1つ、または上記の核酸配列の1つにコードされたアミノ酸配列を含む。別の態様では、重鎖は、生殖系列のVH 3-30+、4-59、1-02、4.35、もしくは3-30.3の遺伝子にコードされたアミノ酸配列に由来するわずか18種類のアミノ酸を含む重鎖可変領域から独立に選択されるCDR1およびCDR2をさらに含むか、または(1)
Figure 0005848232
から選択される抗体；(2)配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列、または(3)配列番号：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、もしくは97の核酸配列にコードされたアミノ酸配列のCDR1およびCDR2の1つから独立に選択されるCDR1およびCDR2を含む。別の態様では、抗CD40抗体は、上記の重鎖および軽鎖を含む。
本明細書で用いる抗体3.1.1H-A78Tは、重鎖の残基78位がアラニンではなくスレオニンである点を除いて3.1.1と同一である。同様に、抗体3.1.1H-A78T-V88A-V97Aでは、重鎖の残基78位がAに変換され、また残基88位と97位がバリンからアラニンに変換されている。抗体3.1.1L-L4M-L83Vは、軽鎖の残基4位がロイシンではなくメチオニンであり、また残基83位がロイシンではなくバリンである点を除いて3.1.1と同一である。抗体22.1.1H-C109Aは、重鎖の残基109位がシステインからアラニンに変換されている点を除いて22.1.1と同一である。抗体23.28.1H-D16Eおよび23.28.1L-C92Aは、重鎖の残基16位がアスパラギン酸からグルタミン酸に、また軽鎖の残基92位がシステインからアラニンにそれぞれ変換されている点を除いて23.28.1と同一である。抗体23.29.1L-R174Kは、軽鎖の残基174位がアルギニンからリシンに変換されている点を除いて23.29.1と同一である。
抗CD40抗体のクラスおよびサブクラス
抗CD40抗体のクラスおよびサブクラスは、当技術分野で周知の任意の方法で決定することができる。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、特定の抗体のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定することができる。このような抗体は市販されている。クラスおよびサブクラスは、ELISA、またはウェスタンブロット、ならびに他の手法で決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および/または軽鎖の定常ドメインの全体または一部の配列を決定し、それらのアミノ酸配列を、さまざまなクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの既知のアミノ酸配列と比較し、ならびに抗体のクラスおよびサブクラスを決定することで決定することができる。
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体はモノクローナル抗体である。抗CD40抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgDの分子の場合がある。好ましい態様では、抗CD40抗体はIgGであり、またIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のサブクラスである。別の好ましい態様では、抗CD40抗体のサブクラスはIgG2である。
種および分子の選択性
本発明の別の局面では、抗CD40抗体は、種選択性および分子選択性の両方を示す。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、霊長類およびヒトのCD40に結合する。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、ヒト、カニクイザル、またはアカゲザルのCD40に結合する。他の態様では、抗CD40抗体は、マウス、ラット、イヌ、またはウサギのCD40に結合しない。本明細書の開示により、抗CD40抗体の種選択性を当技術分野で周知の方法で決定することができる。例えばウェスタンブロット、FACS、ELISA、またはRIA(例えば実施例IVを参照)で種選択性を決定することができる。
いくつかの態様では、抗CD40抗体は、RANK(核因子-κBの受容体活性化因子)、4-1BB(CD137)、TNFR-1(腫瘍壊死因子受容体-1)、およびTNFR-2(腫瘍壊死因子受容体-2)に対する選択性と比較して100倍を上回るCD40に対する選択性を有する。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、CD40以外の他の任意のタンパク質に対する任意の感知可能な特異的な結合を示さない。本明細書の開示により、当技術分野で周知の方法で、CD40に対する抗CD40抗体の選択性を決定することができる。例えばウェスタンブロット、FACS、ELISA、またはRIA(例えば実施例Vを参照)で選択性を決定することができる。
抗CD40抗体によって認識されるCD40のエピトープの同定
また本発明は、CD40に結合し、また同じエピトープと交差競合(cross-compete)および/または結合し、および/またはCD40と、抗体
Figure 0005848232
から選択されるヒト抗CD40抗体の場合と同じKDで結合するヒト抗CD40モノクローナル抗体；または、配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むヒト抗CD40抗体、または配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、または102のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト抗CD40抗体を提供する。
ある抗体が、抗CD40抗体と同じエピトープに結合するか、または抗CD40抗体との結合をめぐって交差競合するか否かということを当技術分野で周知の任意の方法で判定することができる。1つの態様では、本発明の抗CD40抗体を飽和条件でCD40に結合させた後に、試験抗体のもつCD40に対する結合能力を測定することができる。仮に試験抗体が、抗CD40抗体と同じ時間でCD40に結合可能であれば、試験抗体は、抗CD40抗体と同様に、さまざまなエピトープに結合する。しかし仮に試験抗体が、同じ時間でCD40に結合できないならば、試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、またはヒト抗CD40抗体に結合した状態のエピトープに近接するエピトープに結合する。この実験は、ELISA、RIA、FACS、または表面プラズモン共鳴(例えば実施例VIを参照)で実施することができる。好ましい態様では、この実験を表面プラズモン共鳴で実施する。より好ましい態様では、BIAcoreを使用する。
CD40に対する抗CD40抗体の結合親和性
本発明のいくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体は、高い親和性でCD40に結合する。いくつかの態様では、抗CD40抗体は2×10-8 Mまたはそれ未満のKDでCD40に結合する。別の好ましい態様では、同抗体は2×10-9、2×10-10、4.0×10-11 Mまたはそれ未満のKDでCD40に結合する。さらにより好ましい態様では、同抗体は2.5×10-12 Mまたはそれ未満のKDでCD40に結合する。いくつかの態様では、同抗体は、
Figure 0005848232
から選択される抗体の場合と実質的に同じKDでCD40に結合する。別の好ましい態様では、同抗体は、
Figure 0005848232
から選択される抗体の軽鎖のCDR2、および/または重鎖のCDR3を含む抗体の場合と実質的に同じKDでCD40に結合する。さらに別の好ましい態様では、同抗体は、配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、または配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、もしくは102のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体の場合と実質的に同じKDでCD40に結合する。別の好ましい態様では、同抗体は、配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、もしくは102のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のCDR2、または配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列を有する重鎖か辺領域のCDR3を含む抗体の場合と実質的に同じKDでCD40に結合する。
いくつかの態様では、抗CD40抗体の解離速度は遅い。いくつかの態様では、抗CD40抗体のKoffは2.0×10-4またはそれ未満である。いくつかの態様では、Koffは2.0×10-7またはそれ未満である。いくつかの態様では、Koffは、
Figure 0005848232
から選択される抗体を含む、本明細書に記載された抗体の場合と実質的に同じである。いくつかの態様では、同抗体は、
Figure 0005848232
から選択される抗体の重鎖のCDR3、または軽鎖のCDR2を含む抗体の場合と実質的に同じKoffでCD40に結合する。いくつかの態様では、同抗体は、配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、または配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、もしくは102のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体の場合と実質的に同じKoffでCD40に結合する。別の好ましい態様では、同抗体は、配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、もしくは102のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のCDR2、または配列番号：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のCDR3を含む抗体の場合と実質的に同じKoffでCD40に結合する。
CD40に対する抗CD40抗体の結合親和性および解離速度は、当技術分野で周知の任意の方法で決定することができる。結合親和性は、競合的ELISA、RIA、または表面プラズモン共鳴(BIAcoreなど)で測定することができる。解離速度も、表面プラズモン共鳴で測定することができる。好ましくは、結合親和性および解離速度を表面プラズモン共鳴で測定する。より好ましくは、結合親和性および解離速度をBIAcore(商標)で測定する(実施例XIVを参照)。
軽鎖および重鎖の遺伝子の用途
本発明の抗CD40抗体は、ヒトκ軽鎖もしくはヒトλ軽鎖、またはこれらに由来するアミノ酸配列を含む場合がある。κ軽鎖を含むいくつかの態様では、軽鎖可変ドメイン(VL)は、部分的にはヒトA3/A19(DPK-15)、L5(DP5)、またはA27(DPK-22)Vκの遺伝子にコードされる。
いくつかの態様では、抗CD40抗体のVLは、生殖系列のアミノ酸配列に対して1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、抗CD40抗体のVLは、生殖系列のアミノ酸配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、生殖系列に由来する、これらの1つまたは複数の置換は、軽鎖のCDR領域内に位置する。いくつかの態様では、生殖系列に対する、このようなアミノ酸置換は、抗体
Figure 0005848232
の任意の1つまたは複数のVLにおける、生殖系列に対する置換と同様に、1つまたは複数の位置に存在する。例えば抗CD40抗体のVLは、抗体21.4.1に存在する、生殖系列と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換、および抗体21.4.1と同じVκ遺伝子を使用する抗体10.8.3に存在する、生殖系列と比較して他のアミノ酸置換を含む場合がある。いくつかの態様では、このようなアミノ酸変化は、同じ位置の1つまたは複数に存在するが、標準抗体とは異なる変異を含む。
いくつかの態様では、生殖系列に対するアミノ酸変化は、抗体
Figure 0005848232
の任意のVLと同じ位置の1か所または複数に存在するが、このような変化は、標準抗体におけるアミノ酸に対する、このような位置(群)における保存的アミノ酸置換の場合がある。例えば、これらの抗体の1つの特定の位置が、生殖系列に対して変更され、これがグルタミン酸であれば、同位置におけるアスパラギン酸を保存的に置換することができる。同様に、仮に生殖系列と比較してアミノ酸置換がセリンであれば、同位置におけるセリンに代えてスレオニンに保存的に置換することができる。保存的アミノ酸置換については既に述べた。
いくつかの態様では、ヒト抗CD40抗体の軽鎖は、抗体
Figure 0005848232
のVLのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列、または最大1、2、3、4、6、8、または10個の保存的アミノ酸置換を有する、および/または全体で最大3個の非保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、抗CD40抗体の軽鎖は少なくとも軽鎖のCDR2を含み、また本明細書に記載したように、生殖系列配列のCDR1領域およびCDR3領域を含む場合もある。別の態様では、軽鎖は、
Figure 0005848232
から独立に選択される抗体のCDR1およびCDR2、または8個未満、6個未満、4個未満、または3個未満の保存的アミノ酸置換、および/または全体で3個もしくはそれ未満の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有するCDR領域を含む場合がある。他の態様では、抗CD40抗体の軽鎖は少なくとも軽鎖のCDR2を含み、また配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、もしくは100から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、もしくは99から選択される核酸分子にコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体のCDR1領域およびCDR3領域から、それぞれ独立に選択される、CDR1領域およびCDR3領域を含む場合もある。
重鎖に関しては、いくつかの態様では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、部分的には、ヒトVH 3-30+、VH 4-59、VH 1-02、VH 4.35、またはVH 3-30.3の遺伝子にコードされる。いくつかの態様では、抗CD40抗体のVHは、生殖系列のアミノ酸配列に対して、1つまたは複数アミノ酸の置換、欠失、または挿入(付加)を含む。いくつかの態様では、重鎖の可変ドメインは、生殖系列のアミノ酸配列に由来する1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、もしくは18個の変異を含む。いくつかの態様では、これらの変異は、生殖系列のアミノ酸配列と比較して非保存的置換である。いくつかの態様では、変異は重鎖のCDR領域内に位置する。いくつかの態様では、アミノ酸の変化は、抗体
Figure 0005848232
の任意の1つもしくは複数のVHにおいて、生殖系列に由来する変異の場合と同じ位置の1か所または複数の箇所に作られる。他の態様では、アミノ酸変化は、同じ位置の1か所または複数の箇所に位置するが、標準抗体とは異なる変異を含む。
いくつかの態様では、重鎖は、抗体
Figure 0005848232
の可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列、または最大1個、2個、3個、4個、6個、8個、もしくは10個の保存的アミノ酸置換、および/または全体で最大3個の非保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、重鎖は、抗体
Figure 0005848232
の重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域(図1D〜1Hまたは2D〜2Hに記載)、または8個未満、6個未満、4個未満、または3個未満の保存的アミノ酸置換、および/または全体で3個もしくはそれ未満の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有するCDR領域を含む。
いくつかの態様では、重鎖はCDR3を含み、また上述したように生殖系列の配列のCDR1領域およびCDR2領域を含む場合もあるほか、
Figure 0005848232
から選択される抗体の重鎖を含む抗体からそれぞれ独立に選択される、抗体のCDR1およびCDR2を含む場合がある。別の態様では、重鎖はCDR3を含み、またそれぞれ配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98(図1D〜1Hまたは図2D〜2Hに記載)から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、もしくは97から選択される核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR1領域およびCDR2領域から独立に選択されるCDR1領域およびCDR2領域を含む場合もある。別の態様では、抗体は、上述の重鎖および上述の軽鎖を含む。
作製可能な、ある種類のアミノ酸置換は、アラニンもしくはセリンなどを含むがこれらに限定されない別の残基に対する化学的反応性を有する場合がある抗体内の1個もしくは複数のシステインを変化させることである。1つの態様では、システインの置換は、抗体の可変ドメインのフレームワーク領域内、または定常ドメイン内に作られる。別の態様では、システインは、抗体の非標準的領域内に存在する。作製可能な別の種類のアミノ酸置換は、抗体内における、特に可変ドメインのフレームワーク領域内における、抗体の定常ドメイン内における、または抗体の非標準的領域内における任意の潜在的タンパク質分解部位の変化である。システイン残基の置換、およびタンパク質分解部位の除去は、抗体産物中において任意の不均一性が生じるリスクを小さくすることで、均一性を高めることができる。別の種類のアミノ酸置換は、潜在的な脱アミド部位を形成するアスパラギン-グリシン対を、一方もしくは両方の残基を変化させることで除去することである。これは好ましくは、抗体のフレームワーク領域、定常ドメイン、または非標準的領域の内部で行う。
抗CD40抗体によるCD40の活性化
本発明の別の局面は、活性化抗体(CD40アゴニスト)である抗CD40抗体に関する。活性化抗体は、CD40LがCD40に及ぼす作用を増幅したり置換したりする。いくつかの態様では、活性化抗体は、CD40Lと本質的に似ており、CD40との結合をめぐってCD40Lと競合する。いくつかの態様では、同抗体は、CD40との結合をめぐってCD40Lと競合しないが、CD40LがもつCD40に対する結合の作用を増幅する。いくつかの態様では、抗CD40抗体は、CD40Lの存在下または非存在下でCD40を活性化する。
抗CD40抗体によるインビボにおける腫瘍成長の阻害
いくつかの態様では、本発明は、インビトロにおける腫瘍細胞の増殖、またはインビボにおける腫瘍成長を阻害する抗CD40抗体を提供する。
いくつかの態様では、同抗体は腫瘍成長を少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％阻害する。いくつかの態様では、同抗体は腫瘍成長を75％阻害する。1つの態様では、腫瘍成長の阻害は、抗体の投与開始から14日後に検出可能である。他の態様では、腫瘍成長の阻害は、同抗体の投与開始から7日後に検出可能である。いくつかの態様では、別の抗腫瘍剤を、抗CD40抗体とともに動物に投与する。いくつかの態様では、抗悪性腫瘍剤は、腫瘍成長をさらに阻害する。いくつかの態様では、抗悪性腫瘍剤はアドリアマイシンまたはタキソールである。いくつかの態様では、抗悪性腫瘍剤と抗CD40抗体の同時投与によって、投与開始から22〜24日後に、腫瘍成長は、非投与動物における腫瘍成長と比較して少なくとも50％阻害される。
抗CD40抗体によるアポトーシスの誘導
本発明の別の局面は、CD40陽性細胞の細胞死を誘導する抗CD40抗体を提供する。いくつかの態様では、同抗体は、CD40陽性細胞のアポトーシスをインビボまたはインビトロのいずれかで誘導する。
細胞表面分子の発現の促進
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体は、ICAM、MHC-II、B7-2、CD71、CD23、およびCD83を含むがこれらに限定されないB細胞表面分子の発現を高める。いくつかの態様では、1 μg/mlの同抗体が、全血B細胞表面分子上方制御アッセイ法でICAMの発現を少なくとも2倍、またはより好ましくは少なくとも4倍高める。いくつかの態様では、1 μg/mlの同抗体が、全血B細胞表面分子上方制御アッセイ法でMHC-IIの発現を少なくとも2倍、またはより好ましくは少なくとも3倍高める。いくつかの態様では、1 μg/mlの同抗体が、全血B細胞表面分子上方制御アッセイ法でCD23の発現を少なくとも2倍、またはより好ましくは少なくとも5倍高める。これについては例えば実施例VIIの表25を参照されたい。
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体は、MHC-II、ICAM、B7-2、CD83、およびB7-1を含むがこれらに限定されない樹状細胞表面分子の発現を高める。いくつかの態様では、上方制御の範囲は、B細胞で得られる上方制御の範囲と同等である(例えば上述の表25および表26を参照)。いくつかの態様では、同抗体は、B7-2やMHC-IIなどの樹状細胞表面分子の発現を、同分子のB細胞における発現と比較して選択的に上方制御する(例えば表27を参照)。
細胞によるサイトカイン分泌の促進
いくつかの態様では、本発明の抗体は、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、およびIL-23を含むがこれらに限定されないサイトカインの細胞からの分泌を促進する。
いくつかの態様では、同抗体は、樹状細胞および接着性単球(adherent monocyte)からのサイトカインの分泌を促進する。いくつかの態様では、サイトカイン産生は、LPS、IFN-γ、またはIL-1βの1種類または複数による同時刺激によって、さらに促進される。本発明のさらに別の局面では、本発明の抗体とLPSの同時刺激によって、樹状細胞アッセイ法でIL-12p70の産生が促進される(EC50＝約0.48 μg/ml)。いくつかの態様では、同抗体によって、樹状細胞におけるIL-12p40の産生が促進される(EC50＝約0.21 μg/ml)(例えば実施例VIIIを参照)。
いくつかの態様では、本発明の抗体は、実施例VIIIで説明する同種T細胞/樹状細胞アッセイ法でT細胞からのIFN-γの分泌を促進する。いくつかの態様では、同抗体は、同種T細胞/樹状細胞アッセイ法でIFN-γの分泌を促進する(EC50＝約0.3 μg/ml)。いくつかの態様では、同抗体は、同種T細胞/樹状細胞アッセイ法でIFN-γの分泌を促進する(EC50＝約0.2 μg/ml)。1つの態様では、同抗体は、同種T細胞/樹状細胞アッセイ法でIFN-γの分泌を促進する(EC50＝約0.03 μg/ml)。
抗体および抗体産生細胞株の作製法
免疫化
いくつかの態様では、ゲノムにヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位の一部または全体を含む非ヒト動物をCD40抗原で免疫化することでヒト抗体を産生させる。好ましい態様では、非ヒト動物はXenoMouse(商標)動物である。
XenoMouse(商標)マウスは、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位の大きな断片を含み、またマウスの抗体が産生されない、人工的に作製されたマウス系列である。これについては例えばGreenら、Nature Genetics 7：13-21(1994)、および米国特許第5,916,771号、第5,939,598号、第5,985,615号、第5,998,209号、第6,075,181号、第6,091,001号、第6,114,598号、第6,130,364号、第6,162,963号、および第6,150,584号を参照されたい。また国際公開公報第91/10741号、国際公開公報第94/02602号、国際公開公報第96/34096号、国際公開公報第96/33735号、国際公開公報第98/16654号、国際公開公報第98/24893号、国際公開公報第98/50433号、国際公開公報第99/45031号、国際公開公報第99/53049号、国際公開公報第00/09560号、および国際公開公報第00/037504号も参照されたい。
別の局面では、本発明は、ヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒトトランスジェニック動物をCD40抗原で免疫化することで、非ヒト、非マウス動物に由来する抗CD40抗体を作製する方法を提供する。このような動物は、上述の引用文献に記載された方法で作製できる。これらの文献に記載された方法は、米国特許第5,994,619号で修飾することができる。好ましい態様では、非ヒト動物はラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。
XenoMouse(商標)マウスは、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒト抗体を生じる。いくつかの態様では、XenoMouse(商標)マウスは、ヒト重鎖座位およびκ軽鎖座位の、大きさがメガ塩基の生殖細胞型の酵母人工染色体(YAC)断片の導入によって、約80％のヒト抗体V遺伝子レパートリーを含む。これについては、参照として本明細書に組み入れられるMendez ら、Nature Genetics 15：146-156(1997)、GreenおよびJakobovits、J. Exp. Med. 188：483-495(1998)、および国際公開公報第98/24893号を参照されたい。
いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒトの免疫グロブリンの「minilocus」を有する動物である。minilocusを用いる方法では、外因性Ig座位を、Ig座位に由来する各遺伝子を含めることで模倣する。したがって、1個または複数のVH遺伝子、1個または複数のDH遺伝子、1個または複数のJH遺伝子、mu定常ドメイン、および第2の定常ドメイン(好ましくはγ定常ドメイン)を、動物挿入用の構築物中に作り込む。この方法は特に、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、第5,770,429号、第5,789,650号、第5,814,318号、第5,591,669号、第5,612,205号、第5,721,367号、第5,789,215号、および第5,643,763号に記載されている。
minilocus法の長所の1つは、Ig座位の一部を含む構築物を作製して動物に導入する迅速さである。一方、minilocus法の潜在的な短所の1つは、完全なB細胞の発生を支持するだけの免疫グロブリンの多様性が十分でない場合がある(抗体産生を低下させる可能性がある)ことである。
別の局面では、本発明は、ヒト化抗CD40抗体の作製法を提供する。いくつかの態様では、非ヒト動物を、後述するように抗体産生を可能とする条件でCD40抗原で免疫化する。抗体産生細胞を動物から単離し、ミエローマと融合させてハイブリドーマを作り、対象となる抗CD40抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を単離する。得られた核酸を次に、当技術分野で周知の手法、および詳しく後述する手法で操作することで、(抗体をヒト化してヒトにおける免疫応答を低下させるために)非ヒト配列の量を減らす。
いくつかの態様では、本発明のCD40抗原を単離し、および/またはCD40を精製する。好ましい態様では、同CD40抗原はヒトCD40である。いくつかの態様では、同CD40抗原はCD40の断片である。いくつかの態様では、CD40断片はCD40の細胞外ドメインである。いくつかの態様では、CD40断片はCD40の少なくとも1つのエピトープを含む。他の態様では、CD40抗原は、表面にCD40もしくはこの免疫原性断片を発現するか、または過剰に発現する細胞である。いくつかの態様では、CD40抗原はCD40融合タンパク質である。
動物の免疫化は、当技術分野で周知の任意の方法に実施することができる。これについては例えばHarlowおよびLane、「Antibodies：A Laboratory Manual」、New York：Cold Spring Harbor Press、1990を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどの非ヒト動物を免疫化する方法は当技術分野で周知である。これについては例えばHarlowおよびLane、前掲、ならびに米国特許第5,994,619号を参照されたい。好ましい態様では、本発明のCD40抗原を、免疫応答を高めるためにアジュバントとともに投与する。例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)、またはISCOM(免疫刺激複合体)などがある。このようなアジュバントは、ポリペプチドを局所的な沈着部位に隔離することによって、ポリペプチドの迅速な分散を防ぐことができるほか、宿主を刺激して、マクロファージに化学走性をもたらす諸因子、および免疫系の他の成分を分泌させる物質を含む場合がある。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合には、ポリペプチドの2回もしくは2回以上の投与を免疫化のスケジュールに含め、数週間をかけて拡散させる。
実施例Iで、抗CD40モノクローナル抗体の産生について説明する。
抗体および抗体産生細胞株の作製
動物をCD40抗原で免疫化した後に、抗体および/または抗体産生細胞を個体から回収することができる。いくつかの態様では、抗CD40抗体を含む血清を、個体の血液を採取して入手するか、個体を殺すことで入手する。動物から得た血清をそのまま使用することができるほか、血清から免疫グロブリン画分を回収したり、抗CD40抗体を血清から精製したりすることができる。このようにして得られた血清または免疫グロブリンがポリクローナルであることは当業者に周知である。血清から調製したポリクローナル抗体を使用することの短所は、得られる抗体の量が限られていることと、ポリクローナル抗体が不均一な諸特性を有することである。
いくつかの態様では、抗体を産生する不死化細胞株を、免疫化した動物から単離された細胞から調製する。免疫化後に、個体を殺して、リンパ節および/または脾臓のB細胞を不死化させる。細胞を不死化する方法は、細胞に癌遺伝子を導入する段階、細胞に発癌性ウイルスを感染させる段階、不死化細胞が選択される条件で細胞を培養する段階、細胞に発癌性または変異原生をもつ化合物を添加する段階、ならびに細胞を不死化細胞(例えばミエローマ細胞)と融合させる段階、ならびに腫瘍抑制遺伝子を不活性化させる段階を含むがこれらに限定されない。これについては例えばHarlowおよびLane(前掲)を参照されたい。仮にミエローマ細胞との融合を行う場合、対象ミエローマ細胞は好ましくは、免疫グロブリンのポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞株)。不死化細胞を、CD40、この一部、またはCD40発現細胞を用いてスクリーニングする。好ましい態様では初期スクリーニングを、酵素結合免疫アッセイ法(ELISA)、または放射免疫アッセイ法で行う。ELISAによるスクリーニングの例は、参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第00/37504号に記載されている。
抗CD40抗体産生細胞(例えばハイブリドーマ)を選択し、クローニングし、またさらに確実な成長、高抗体産生、および所望の抗体特性を含む所望の特徴に関して、後述する手順でスクリーニングを行う。ハイブリドーマは、インビボの場合は同系動物で、免疫系を欠く動物(例えばヌードマウス)で、またはインビトロの場合は培養細胞で増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、および増殖させる方法は当技術分野で周知である。
好ましい態様では、免疫化された動物は、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、脾臓のB細胞を、非ヒト動物と同じ種に由来するミエローマ細胞株と融合させる。より好ましい態様では、免疫化動物はXENOMOUSE(商標)動物であり、またミエローマ細胞株は非分泌型マウスミエローマである。さらにより好ましい態様では、ミエローマ細胞株はP3-X63-AG8.653である(例えば実施例I参照)。
別の局面では、本発明は、ヒトの抗CD40抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい態様では、ハイブリドーマは、上述したようにマウスのハイブリドーマである。他の態様では、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマなどの、ヒトでもマウスでもない種で産生される。別の態様では、ハイブリドーマはヒトハイブリドーマである。
核酸、ベクター、宿主細胞、および抗体の組換え的作製法
核酸
本発明は、抗CD40抗体をコードする核酸分子も含む。いくつかの態様では、さまざまな核酸分子が、抗CD40免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。他の態様では、同じ核酸分子が、抗CD40免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。
いくつかの態様では、軽鎖の可変ドメインをコードする核酸分子は、ヒトA3/A19(DPK-15)、L5(DP5)、またはA27(DPK-22)Vκの遺伝子配列、またはこれらに由来する配列を含む。いくつかの態様では、核酸分子は、A3/A19のVκ遺伝子、およびJκ1、Jκ2、もしくはJκ3遺伝子のヌクレオチド配列、またはこれらに由来する配列の配列を含む。いくつかの態様では、核酸分子は、L5のVκ遺伝子およびJκ4遺伝子のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸分子は、A27のVκ遺伝子およびJκ3遺伝子のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、軽鎖をコードする核酸分子は、生殖系列のアミノ酸配列に由来する1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、生殖系列の配列と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の非保存的アミノ酸置換、および/または1個、2個、もしくは3個の非保存的置換を含む、VLのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。置換は、CDR領域、フレームワーク領域、または定常ドメイン内に存在する場合がある。
いくつかの態様では、軽鎖(VL)の可変ドメインをコードする核酸分子は、抗体3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、および24.2.1の1つのVLに存在する変異と同一な、生殖系列の配列と比較して1つまたは複数の変異を含むVLのアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、抗体3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、および24.2.1の1つのVLに存在する生殖系列の配列と比較して、少なくとも3個のアミノ酸変異をコードする。
いくつかの態様では、同核酸分子は、モノクローナル抗体
Figure 0005848232
またはこの一部のVLのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、この「一部」は、少なくともCDR3領域を含む。いくつかの態様では、核酸は、同の抗体の軽鎖のCDRのアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、「一部」は、CDR1〜CDR3を含む隣接する部分である。
いくつかの態様では、核酸分子は、配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、または100の1つのアミノ酸配列、またはシグナル配列を欠く同配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい態様では、核酸分子は、配列番号：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、もしくは99、またはこの一部のヌクレオチド配列(これらの配列は任意にシグナル配列を欠く)を含む。
いくつかの態様では、この「一部」は、VL領域をコードする。いくつかの態様では、「一部」は、少なくともCDR2領域をコードする。いくつかの態様では、核酸は、抗体の軽鎖のCDRのアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、「一部」は、CDR1〜CDR3に由来する隣接領域をコードする。
いくつかの態様では、核酸分子は、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、もしくは99％が抗体
Figure 0005848232
の任意の1つのVLのアミノ酸配列、または配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、もしくは100の任意の1つのVLのアミノ酸配列と同一なVLのアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子は、上述したように、配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、もしくは100のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、または配列番号：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、もしくは99の核酸配列を有する核酸配列と、高ストリンジェント条件でハイブリダイズする核酸を含む。
別の態様では、核酸は、
Figure 0005848232
から選択される抗体の完全長の軽鎖、または配列番号：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、94、100、もしくは102のアミノ酸配列を含む軽鎖、または本明細書に記載されるような変異を含む軽鎖をコードする。また核酸は、配列番号：7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、もしくは87のヌクレオチド配列を含む場合があるか、または軽鎖をコードする核酸分子は、本明細書に記載されたような変異を含む。
別の好ましい態様では、核酸分子は、ヒトの3-30+、4-59、1-02、4.35、もしくは3-30.3のVH遺伝子配列、またはこれらに由来する配列を含む重鎖の可変ドメイン(VH)をコードする。さまざまな態様では、核酸分子は、ヒト3-30+ VH遺伝子、D4(DIR3)遺伝子、およびヒトJH6遺伝子；ヒト3-30+ VH遺伝子、ヒトD1-26(DIR5)遺伝子、およびヒトJH6遺伝子；ヒト4.35 VH遺伝子、ヒトDIR3遺伝子、およびヒトJH6遺伝子；ヒト4-59 VH遺伝子、ヒトD4-23遺伝子、およびヒトJH4遺伝子；ヒト1-02 VH遺伝子、ヒトDLR1遺伝子、およびヒトJH4遺伝子；ヒト3-30+ VH遺伝子、ヒトD6-19(DIR3)遺伝子、およびヒトJH4遺伝子；ヒト3-30+ VH遺伝子、ヒトD1-1遺伝子、およびヒトJH6遺伝子；ヒト3-30+ VH遺伝子、ヒトD4-17遺伝子、およびヒトJH6遺伝子；ヒト3-30.3 VH遺伝子、ヒトD4-17遺伝子、およびヒトJH6遺伝子；ヒト4-59 VH遺伝子、ヒトD4-17(DIRT)遺伝子、およびヒトJH5遺伝子、またはこれらのヒト遺伝子に由来する配列を含む。
いくつかの態様では、核酸分子は、ヒトのV遺伝子、D遺伝子、またはJ遺伝子の生殖系列のアミノ酸配列と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、もしくは18個の変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、これらの変異はVH領域内に存在する。いくつかの態様では、これらの変異はCDR領域内に存在する。
いくつかの態様では、核酸分子は、モノクローナル抗体
Figure 0005848232
のVHに存在するアミノ酸変異と同一な、生殖系列の配列と比較して1個または複数のアミノ酸変異をコードする。いくつかの態様では、核酸は、上述のモノクローナル抗体の1つに存在する少なくとも3個のアミノ酸変異と同一な、生殖系列の配列と比較して少なくとも3個のアミノ酸変異をコードする。
いくつかの態様では、核酸分子は、抗体
Figure 0005848232
のVHのアミノ酸配列、または保存的アミノ酸変異、および/または総数3個もしくはそれ未満の非保存的アミノ酸置換を有する配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。さまざまな態様では、同配列は、1つまたは複数のCDR領域、好ましくはCDR3領域、3つの全てのCDR領域、CDR1〜CDR3を含む隣接部分、またはVH領域の全体(シグナル配列を含む場合も含まない場合もある)をコードする。
いくつかの態様では、核酸分子は、配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98の1つのアミノ酸配列、またはシグナル配列を欠く同配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい態様では、核酸分子は、配列番号：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、もしくは97の少なくとも一部のヌクレオチド配列、またはシグナル配列を欠く同配列を含む。いくつかの態様では、「一部」は、VH領域(シグナル配列を含む場合も含まない場合もある)、CDR3領域、3つ全てのCDR領域、またはCDR1〜CDR3を含む隣接領域をコードする。
いくつかの態様では、核酸分子は、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、もしくは99％が、図1A〜1Cもしくは2A〜2Cに示したVHのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列、または配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98の任意の1つのVHのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子は、配列番号：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、もしくは98のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、もしくは97の核酸配列と、上述の条件などの高ストリンジェント条件でハイブリダイズする核酸を含む。本発明の核酸分子は、上述の条件などの高ストリンジェント条件で、すぐ上に記載したVHをコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸分子を含む。
別の態様では、核酸は、
Figure 0005848232
から選択される抗体の完全長の重鎖、もしくは配列番号：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、もしくは86のアミノ酸配列を有する重鎖、または本明細書に記載された変異の1つなどの変異を含む重鎖をコードする。また同核酸は、配列番号：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、もしくは89のヌクレオチド配列、または本明細書に記載された変異の1つなどの変異を含む重鎖をコードする核酸分子を含む場合がある。
抗CD40抗体の重鎖、または軽鎖の全体、もしくはこの一部をコードする核酸分子を、このような抗体を産生する任意の供給源から単離することができる。さまざまな態様では、核酸分子を、CD40で免疫化した動物から、または抗CD40抗体を発現する、このようなB細胞に由来する不死化細胞から単離したB細胞から単離する。抗体をコードするmRNAを単離する方法は当技術分野で周知である(例えばSambrookらの文献を参照)。このようなmRNAを用いて、抗体遺伝子を対象としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはcDNAクローニングに使用するためのcDNAを作ることができる。好ましい態様では、核酸分子を、その融合パートナーの1つとして、非ヒトトランスジェニック動物に由来するヒト免疫グロブリン産生細胞を有するハイブリドーマから単離する。さらにより好ましい態様では、ヒト免疫グロブリン産生細胞をXenoMouse(商標)動物から単離する。別の態様では、ヒト免疫グロブリン産生細胞は、上述のように、非ヒト、非マウスのトランスジェニック動物に由来する。別の態様では、核酸を、非ヒトの非トランスジェニック動物から単離する。非ヒトの非トランスジェニック動物から単離した核酸分子は、例えばヒト化抗体に使用することができる。
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体の重鎖をコードする核酸は、任意の供給源に由来する重鎖の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明のVHドメインをコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。同様に、本発明の抗CD40抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、任意の供給源に由来する軽鎖の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明のVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。
本発明の他の局面では、重鎖の可変ドメイン(VH)および軽鎖の可変ドメイン(VL)をコードする核酸分子を、完全長の抗体遺伝子に変換する。1つの態様では、VHドメインもしくはVLドメインをコードする核酸分子を、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに機能的に連結され、またVLセグメントがベクター内のCLセグメントに機能的に連結されるように、重鎖の定常ドメインもしくは軽鎖の定常ドメインをそれぞれ既にコードする発現ベクターに挿入することによって、完全長の抗体遺伝子に変換する。別の態様では、VHドメインおよび/またはVLドメインをコードする核酸分子を、VHドメインおよび/またはVLドメインをコードする核酸分子をCHドメインおよび/またはCLドメインをコードする核酸分子に、標準的な分子生物学的手法で連結する(例えばリガーゼで結合する)ことで、完全長の抗体遺伝子に変換する。ヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリンの定常ドメインの遺伝子の核酸配列は、当技術分野で周知である。これについては例えばKabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、NIH Publ. No. 91-3242、1991を参照されたい。完全長の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を次に、核酸分子を導入した細胞で発現させて、抗CD40抗体を単離することができる。
このような核酸分子を用いて、大量の抗CD40抗体を組換え的に発現させることができる。また同核酸分子を用いて、詳しく後述するように、キメラ抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、免疫接着分子(immunoadhesin)、ダイアボディ、変異型抗体、および抗体誘導体を産生させることもできる。仮に同核酸分子が、非ヒトの非トランスジェニック動物に由来する場合、同核酸分子を、後述する抗体のヒト化に用いることができる。
別の態様では、本発明の核酸分子を、特定の抗体配列に対するプローブまたはPCR用プライマーとして使用する。例えば、同核酸を診断法におけるプローブとして、またはDNAの領域を増幅させて、特に、抗CD40抗体の可変ドメインをコードする、追加した核酸分子を単離するPCR用プライマーとして使用することができる。いくつかの態様では、同核酸分子はオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、同オリゴヌクレオチドは、対象抗体の重鎖および軽鎖の高度の可変性を示す領域に由来する。いくつかの態様では、同オリゴヌクレオチドは、抗体
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のCDRの1つまたは複数の全体または一部をコードする。
ベクター
本発明は、本発明の抗CD40抗体またはその抗原結合部分の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はまた、このような抗体の軽鎖、またはこの抗原結合部分をコードする核酸分子を含むベクターも提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾型抗体、抗体断片、およびこのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体、または抗原結合部分を、上述の手順で得られた一部または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、対象遺伝子が転写および翻訳の制御配列などの必要な発現制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクターに挿入することで発現させる。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、植物ウイルス(カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなど)、コスミド、YAC、EBVに由来するエピソームなどを含む。抗体遺伝子を、ベクター内の転写および翻訳の制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図した機能を発揮するようにベクターに連結する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体の軽鎖遺伝子、および抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入することができる。好ましい態様では、両遺伝子を同じ発現ベクター挿入する。抗体遺伝子を、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上における相補的な制限酵素切断部位の連結、または制限酵素切断部位が存在しない場合は平滑末端の連結)で発現ベクターに挿入する。
好都合のベクターとは、上述のように、任意のVH配列またはVL配列の挿入および発現が容易なように作り込まれた適切な制限酵素切断部位を有する、機能性の完全な、ヒトのCHまたはCLの免疫グロブリン配列をコードするベクターである。このようなベクターにおけるスプライシングは通常、挿入されたJ領域のスプライスドナー部位と、ヒトのCドメインに先行するスプライスアクセプター部位との間で、またヒトCHのエキソン内に存在するスプライス領域でも起きる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の、天然の染色体部位で起きる。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの、抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードする場合もある。抗体鎖の遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチド、または異種シグナルペプチド(非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド)の場合がある。
抗体鎖の遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換対象の宿主細胞の選択や、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に影響されうることは当業者には明らかであろう。哺乳類の宿主細胞における発現に好ましい調節配列は、レトロウイルスのLTRに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVのプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマおよび強力な哺乳類のプロモーター(天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーターなど)などの、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質の発現を誘導するウイルスエレメントを含む。ウイルスの調節エレメント、およびこの配列の詳細については、例えば米国特許第5,168,062号、米国特許第4,510,245号、および米国特許第4,968,615号を参照されたい。プロモーターおよびベクターに関する記述を含む、植物で抗体を発現させる方法、ならびに植物の形質転換法は当技術分野で周知である。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,517,529号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞(例えば酵母細胞)でポリペプチドを発現させる方法は当技術分野で周知である。
抗体鎖の遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)、および選択マーカー遺伝子などの、追加の配列を含む場合がある。選択マーカー遺伝子があることで、ベクターを導入した宿主細胞の選択が容易になる(例えば米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、および第5,179,017号を参照)。例えば典型的には、選択マーカー遺伝子は、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を、ベクターを導入した宿主細胞にもたらす。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(dfhr-宿主細胞を用いたメトトレキセートによる選択/増幅用に使用)、neo遺伝子(G418による選択用)、およびグルタミン酸合成酵素の遺伝子などがある。
非ハイブリドーマ宿主細胞、およびタンパク質を組換え的に産生させる方法
抗CD40抗体をコードする核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳類、植物、細菌または酵母の宿主細胞のトランスフェクションに用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する任意の既知の方法とすることができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、デキストランを用いるトランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレンを用いるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを含む。また核酸分子は、ウイルスベクターを用いて哺乳類細胞に導入することができる。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。これについては例えば米国特許第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号、および第4,959,455号を参照されたい(これらの特許は参照として本明細書に組み入れられる)。例えばアグロバクテリウムを用いる形質転換、微粒子銃による形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルスによる形質転換を含む、植物細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野で周知である。
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当技術分野で周知であり、またAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。このような細胞には特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼若ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)、A549細胞、およびいくつかの他の細胞株などがある。特定の選択性を有する細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有するかを決定することで選択される。使用可能な他の細胞株は、Sf9細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類の宿主細胞に導入する場合は、宿主細胞内における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を成長させた培地中への抗体の放出を可能とする十分な期間、宿主細胞を培養することで抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法で培地から回収できる。植物の宿主細胞は、例えばタバコ(Nicotiana)、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、イモなど含む。細菌の宿主細胞は大腸菌およびストレプトマイセス種を含む。酵母の宿主細胞は、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)を含む。
また、産生細胞株による、本発明の抗体(またはこれに由来する他の部分)の発現を、いくつかの既知の手法で高めることができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子の発現系(GS系)は、特定の条件で発現を高める一般的な方法である。GS系については、欧州特許第0 216 846号、第0 256 055号、および第0 323 997号、および欧州特許出願第89303964.4号の全体または一部で説明されている。
さまざまな細胞株、またはトランスジェニック動物で発現される抗体が、さまざまな糖修飾を相互に受けている可能性は高い。しかし、本明細書に記載された核酸分子にコードされた全ての抗体、または本明細書に記載されたアミノ酸配列を含む抗体は、抗体の糖修飾の有無にかかわらず本発明の一部である。
トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物
本発明の抗CD40抗体は、対象となる免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列に関してトランスジェニックである哺乳類または植物を作製し、抗体の産生を回収可能な状態で行う、トランスジェニック技術で作製することもできる。哺乳類におけるトランスジェニック技術による産生に関連して、抗CD40抗体を産生させて、ヤギ、ウシ、または他の哺乳類の乳から回収することができる。これについては例えば米国特許第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号、および第5,741,957号を参照されたい。いくつかの態様では、上述したように、ヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒトトランスジェニック動物を、上述したようにCD40、またはこの免疫原性部分で免疫化する。植物で抗体を作製する方法は、例えば米国特許第6,046,037号および米国特許第5,959,177号に記載されている。
いくつかの態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を、本発明の抗CD40抗体をコードする1つまたは複数の核酸分子を、標準的なトランスジェニック法で動物または植物に導入することで作製する。これについては上述のHoganの文献、および米国特許第6,417,429号を参照されたい。トランスジェニック動物を作製するために使用するトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞または体細胞の場合がある。トランスジェニックの非ヒト生物は、キメラ、非キメラのヘテロ接合体、および非キメラのホモ接合体の場合がある。これについては例えばHoganら、「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Press(1999)；Jacksonら、「Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach」、Oxford University Press(2000)；およびPinkert、「Transgenic Animal Technology: A Laboratorv Handbook」、Academic Press(1999)を参照されたい。いくつかの態様では、トランスジェニックの非ヒト動物は、対象となる重鎖および/または軽鎖をコードする構築物を標的とすることにより、標的破壊および標的置換を有する。好ましい態様では、このようなトランスジェニック動物は、CD40、好ましくはヒトCD40に特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現する。いくつかの態様では、トランスジェニック動物は、単鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体などの修飾型抗体をコードする核酸分子を含む。本発明の抗CD40抗体は、任意のトランスジェニック動物で作製することができる。好ましい態様では、非ヒト動物はマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、コードされたポリペプチドを、血液、乳、尿、唾液、涙液、粘液、および他の体液中に発現する。
ファージディスプレイライブラリー
本発明は、ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成する段階、CD40またはこの一部でライブラリーをスクリーニングする段階、CD40に結合するファージを単離する段階、およびファージから抗体を回収する段階を含む、抗CD40抗体またはその抗原結合部分を作製する方法を提供する。例として、ファージディスプレイ手法に使用する抗体のライブラリーを調製する1つの方法は、ヒトの免疫グロブリン座位を含む非ヒト動物をCD40、またはこの抗原性部分で免疫化して、免疫応答を誘導する段階、免疫化した動物から抗体産生細胞を抽出する段階、抽出後の細胞からRNAを単離する段階、RNAを逆転写してcDNAを作製する段階、cDNAをプライマーで増幅する段階、ならびに抗体がファージ上で発現されるようにcDNAをファージディスプレイベクターに挿入する段階を含む。本発明の組換え抗CD40抗体は、このようにして得ることができる。
本発明の組換え抗CD40ヒト抗体は、組換え型コンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離できる。好ましくは同ライブラリーは、B細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトのVLおよびVHのcDNAを用いて作製されるscFvファージディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーの調製法およびスクリーニング法は当技術分野で周知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するキットは市販されている(例えばPharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01；およびStratagene SurfZAP(商標)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612)。抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに使用可能な他の方法および試薬もある(例えば米国特許第5,223,409号；PCT国際公開公報第92/18619号、国際公開公報第91/17271号、国際公開公報第92/20791号、国際公開公報第92/15679号、国際公開公報第93/01288号、国際公開公報第92/01047号、国際公開公報第92/09690号；
Figure 0005848232
を参照)。
1つの態様では、所望の特徴をもつヒト抗CD40抗体を単離するために、本明細書に記載されたヒト抗CD40抗体を最初に用いて、CD40に対する類似の結合活性を有する、ヒトの重鎖および軽鎖の配列を、国際公開公報第93/06213号に記載されたエピトープインプリンティング(epitope imprinting)法で選択する。この方法で使用される抗体ライブラリーは好ましくは、国際公開公報第92/01047号、McCaffertyら、Nature 348：552-554(1990)；およびGriffithsら、EMBO J. 12：725-734(1993)に記載された手順で調製されてスクリーニングされたscFvライブラリーである。scFv抗体ライブラリーは好ましくは、ヒトCD40を抗原としてスクリーニングする。
最初のヒトのVLドメインおよびVHドメインが選択されたら、最初に選択されたVLおよびVHのセグメントの異なる対をCD40結合に関してスクリーニングを行う「ミックス・アンド・マッチ(mix and match)」実験を行うことで、好ましいVL/VH対の組み合わせ選択する。また抗体の質をさらに改善するために、好ましいVL/VH対のVLおよびVHのセグメントに、好ましくは、VHおよび/またはVLのCDR3領域内にランダムな変異を、天然の免疫応答における抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異過程に類似の過程で導入することができる。インビトロにおける親和性成熟は、VHのCDR3またはVLのCDR3にそれぞれ相補的なPCR用プライマーを用いて、VHドメインおよびVLドメインを増幅することで達成できる(プライマーは、特定の位置における4種類のヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」されたものを使用し、結果として得られるPCR産物が、VHおよび/またはVLのCDR3領域にランダム変異が導入されたVHおよびVLのセグメントをコードするようにする)。このような、ランダムに変異が導入されたVHおよびVLのセグメントを対象に、CD40への結合に関するスクリーニングを行う場合がある。
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーを対象に、本発明の抗CD40抗体のスクリーニングおよび単離を行った後に、選択された抗体をコードする核酸を、ディスプレイパッケージ(例えばファージゲノム)から回収し、標準的な組換えDNA技術で他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。望ましいならば、このような核酸をさらに操作して、後述するように、本発明の他の抗体型を作ることができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換え型ヒト抗体を発現させるためには、上述のように、抗体をコードするDNAを組換え発現ベクターにクローニングして、哺乳類宿主細胞に導入する。
クラススイッチ
本発明の別の局面は、抗CD40抗体のクラスまたはサブクラスを、別のクラスまたはサブクラスに変換する方法を提供する。いくつかの態様では、CLまたはCHをコードする任意の核酸配列を含まないVLまたはVHをコードする核酸分子を、当技術分野で周知の方法で単離する。この核酸分子を次に、所望の免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに由来するCLまたはCHをコードする核酸配列に機能的に連結する。これは、上述のようにCL鎖またはCH鎖を含むベクターまたは核酸分子で達成することができる。例えば、当初IgMであった抗CD40抗体をIgGにクラスを変えることができる。また、このようなクラススイッチを行うことで、あるIgGサブクラスを別のサブクラスに(例えばIgG1からIgG2に)変換することができる。所望のアイソタイプを含む本発明の抗体を作製する別の方法は、抗CD40抗体の重鎖をコードする核酸、および抗CD40抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する段階、VH領域をコードする配列を単離する段階、VH配列を所望のアイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列に連結する段階、軽鎖遺伝子および重鎖の構築物を細胞内で発現させる段階、ならびに所望のアイソタイプを有する抗CD40抗体を回収する段階を含む。
脱免疫化抗体
免疫原性の低下した抗体を作製する別の方法は、抗体の脱免疫化である。本発明の別の局面では、抗体を、例えば全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT国際公開公報第98/52976号および国際公開公報第00/34317号に記載された手法で脱免疫化することができる。
変異型抗体
別の態様では、核酸分子、ベクター、および宿主細胞を用いて、変異型の抗CD40抗体を作製することができる。抗体の重鎖および/または軽鎖の可変領域に変異を導入することで、例えば抗体の結合特性を変えることができる。例えば変異を1つまたは複数のCDR領域に作り込むことで、CD40に対する抗体のKDを高めたり低めたり、Koffを高めたり低めたり、または抗体の結合特異性を変えたりすることができる。部位特異的変異導入法は当技術分野で周知である。これについては例えばSambrookら、およびAusubelら(前掲)を参照されたい。好ましい態様では、変異は、抗CD40抗体の可変ドメイン中において、生殖系列と比較して変化することがわかっているアミノ酸残基に導入する。別の態様では、1つまたは複数の変異を、可変ドメインのCDR領域またはフレームワーク領域内において、またはモノクローナル抗体
Figure 0005848232
の定常ドメイン中において、生殖系列と比較して変化することがわかっているアミノ酸残基に導入する。別の態様では、1つまたは複数の変異を、配列番号：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、102、2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、98、100、もしくは102、または配列番号：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、99、101、1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、97、99、もしくは101に記載されるこれらの核酸配列から選択されるアミノ酸配列の可変ドメインのCDR領域またはフレームワーク領域内において、生殖系列と比較して変化することがわかっているアミノ酸残基に導入する。
1つの態様では、フレームワーク領域に、結果として得られるフレームワーク領域(群)が、対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異を導入する。変異をフレームワーク領域または定常ドメインの内部に導入することで、抗CD40抗体の半減期を長くすることができる。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられるPCT国際公開公報第00/09560号を参照されたい。フレームワーク領域または定常ドメイン内に変異を導入することで、抗体の免疫原性を変えたり、別の分子に対する共有結合または非共有結合の結合部位を提供したり、または補体結合、FcR結合、およびADCCのような特性を変えたりすることもできる。本発明では、1本の抗体が、任意の1つまたは複数のフレームワーク領域、定常ドメイン、および可変領域に変異をもつ場合がある。
いくつかの態様では、変異導入前の抗CD40抗体と比較して、変異型の抗CD40抗体のVHドメインまたはVLドメインのいずれかにおけるアミノ酸変異の数は1〜18の間の任意の数である。上記のいずれかにおいて、変異は1つまたは複数のCDR領域内に存在する場合がある。また任意の変異が保存的アミノ酸置換である場合がある。いくつかの態様では、定常ドメインにおけるアミノ酸の変化は、わずか5、4、3、2、または1個である。
修飾型抗体
別の態様では、別のポリペプチドに連結させた本発明の抗CD40抗体の全体または一部を含む融合抗体または免疫接着分子を作製することができる。好ましい態様では、抗CD40抗体の可変ドメインのみをポリペプチドに連結させる。別の好ましい態様では、抗CD40抗体のVHドメインを第1のポリペプチドに連結させ、一方で抗CD40抗体のVLドメインを、VHドメインおよびVLドメインが相互に作用して抗体結合部位を形成するように第1のポリペプチドと結合する第2のポリペプチドに連結させる。別の好ましい態様では、VHドメインは、リンカーによってVHドメインとVLドメインが相互作用可能なようにVLドメインから隔てられている(後述する「単鎖抗体」を参照)。次にVH-リンカー-VL抗体を対象ポリペプチドに連結させる。この融合抗体は、CD40を発現する細胞または組織にポリペプチドを導く際に有用である。このようなポリペプチドは、毒素などの治療薬、成長因子、または他の調節タンパク質となる可能性があるほか、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの、容易に可視化可能な酵素などの診断薬となる可能性がある。また融合抗体は、2本(またはこれ以上)の単鎖抗体を相互に連結するように作製することができる。これは、1本のポリペプチド鎖上に二価抗体または多価抗体を作製を試みる際に、または二重特異性抗体の作製を試みる際に有用である。
単鎖抗体(scFv)を作製するためには、VHおよびVLをコードするDNA断片を、柔軟なリンカーをコードする別の断片(例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする断片)に機能的に連結させる。こうすることでVHおよびVLの配列を、接触する単鎖タンパク質として、柔軟なリンカーで連結されたVLドメインおよびVHドメインとともに発現させることができる。これについては例えばBirdら、Science 242：423-426(1988)；Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883(1988)；McCaffertyら、Nature 348：552-554(1990)を参照されたい。単鎖抗体は、1つのVHおよびVLのみが用いられる場合には一価の場合があり、2つのVHおよびVLが用いられる場合には二価の場合があり、または2つを越えるVHおよびVLが用いられる場合には多価の場合がある。二重特異性抗体または多価抗体は、CD40および別の分子に特異的に結合するように作製することができる。
他の態様では、他の修飾型抗体を、抗CD40抗体をコードする核酸分子を用いて調製することができる。例えば「κ体」(Illら、Protein Eng. 10：949-57(1997))、「ミニボディ(Minibody)」(Martinら、EMBO J. 13：5303-9(1994))、「ディアボディ」(Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993))、または「ジャヌシン(Janusin)」(Trauneckerら、EMBO J. 10：3655-3659(1991)、ならびにTrauneckerら、Int. J. Cancer(補遺)7：51-52(1992))を標準的な分子生物学的手法で、本明細書の記述にしたがって調製することができる。
二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合やFab'断片の連結を含む、さまざまな方法で作製することができる。これについては例えばSongsivilaiおよびLachmann、Clin. Exp. Immunol. 79：315-321(1990)、Kostelnyら、J. Immunol. 148：1547-1553(1992)を参照されたい。また二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ジャヌシン(Janusin)」として形成される場合がある。いくつかの態様では、二重特異性抗体は、CD40の2種類の異なるエピトープと結合する。いくつかの態様では、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体
Figure 0005848232
ならびに追加的な抗体の重鎖および軽鎖に由来する第1の重鎖および第1の軽鎖を有する。いくつかの態様では、追加的な軽鎖および重鎖は、上述のモノクローナル抗体の1つにも由来するが、第1の重鎖および軽鎖とは異なる。
いくつかの態様では、上述の修飾型抗体を、本明細書に記載されたヒト抗CD40モノクローナル抗体に由来する、同モノクローナル抗体のアミノ酸配列に由来する、または同モノクローナル抗体をコードする核酸配列にコードされた重鎖もしくは軽鎖に由来する1つまたは複数の可変ドメインまたはCDR領域を用いて調製する。
誘導体化抗体および標識化抗体
本発明の抗CD40抗体または抗原結合部分は、誘導体化するか、または別の分子(例えば別のペプチドもしくはタンパク質)と連結させることができる。一般に、このような抗体またはその一部を、CD40との結合が誘導体化または標識化によって悪影響を受けないように誘導体化する。したがって本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載された完全型と修飾型のヒト抗CD40抗体の両方を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分を、(化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、またはこれ以外の手法で)、別の抗体(例えば二重特異性抗体もしくはディアボディ)、検出用薬剤、細胞障害性薬剤、薬物、および/または抗体もしくは抗体部分と別の分子(ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなど)との結合に介在可能なタンパク質もしくはペプチドなどの1個もしくは複数の他の分子体と機能的に連結させることができる。
誘導体化抗体の1つの種類は、(例えば二重特異性抗体を作るために、同じ種類または異なる種類の)2つまたはそれ以上の抗体を架橋することで作られる。適切な架橋剤には、適切なスペーサーで隔てられた2つの異なる反応基を有する異種二機能性の薬剤(例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、または同種二機能性の薬剤(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)などが含まれる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company(Rockford、Ill)から購入することができる。
別の種類の誘導体化抗体は標識化抗体である。本発明の抗体または抗原結合部分を誘導体化可能な有用な検出用薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-塩化ナフタレンスルホニル、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含む蛍光化合物がある。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの、検出に有用な酵素によっても標識できる。抗体を検出用酵素で標識する場合は、酵素を用いて、識別可能な反応産物を産生させる他の試薬を添加することで検出を行う。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加することで、検出可能な発色反応産物が得られる。抗体をビオチンで標識して、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することで検出することもできる。抗体を、2次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパー対の配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)で標識することもできる。いくつかの態様では、標識を、さまざまな長さのスペーサーアームで結合することで、潜在的な立体障害を小さくする。
抗CD40抗体は放射性アミノ酸でも標識することができる。放射標識は、診断と治療の両方の目的に使用することができる。例えば放射標識を用いて、CD40を発現する腫瘍をX線、または他の診断法で検出することができる。また放射標識は、癌性細胞または腫瘍に対する毒素として治療目的で使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131Iなどの放射性同位元素または放射性核種などがあるがこれらに限定されない。
抗CD40抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)、メチル基もしくはエチル基、または糖鎖グループなどの官能基で誘導体化することもできる。これらの官能基は、抗体の生物学的特性を改善するために、例えば血清半減期を延長したり、組織に対する結合を強めたりするために有用である。
薬学的組成物およびキット
本発明は、免疫系を刺激する必要のある被験者の治療用のヒト抗CD40アゴニスト抗体を含む組成物にも関する。このような組成物は、ヒトを含む哺乳類における、ウイルスおよび細菌の感染を含む感染症の治療、予防、頻度もしくは重症度の低下に、癌性状態および前癌性状態を含む過増殖性疾患の治療に、高IgM症候群などの遺伝性免疫不全状態の治療に、ならびに好中球減少症を特徴とする状態を含む原発性または複合免疫不全疾患の治療に有用である。したがって、アゴニスト抗CD40抗体による治療の被験者は、高齢者や、例えば化学療法に起因する免疫抑制状態にある者を含むがこれらに限定されない、免疫系の賦活を必要とする任意の被験者を含む。
本発明のアゴニスト抗CD40抗体で治療される場合がある過増殖性疾患は、任意の組織または器官が冒される場合があり、また脳、肺、扁平細胞、膀胱、胃、膵臓、***、頭部、頚部、肝臓、腎臓、卵巣、前立腺、結腸直腸、食道、婦人科、上咽頭、または甲状腺の癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、もしくは多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない。特に、本発明のヒトアゴニスト抗CD40抗体は、***、前立腺、結腸、および肺の癌に治療に有用である。
治療には、本発明の1種類または複数のアゴニスト抗CD40モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の単独投与、または薬学的に許容される担体を併用した投与を含めることができる。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という表現は、生理的に適合性のある、任意の、および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体のいくつの例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組み合わせである。多くの場合、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの糖、多価アルコールを組成物に含めることが好ましい。薬学的に許容される物質の別の例には、抗体の有効期間を長くしたり、抗体の有効性を高めたりする湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤もしくは緩衝液などの少量の補助剤などがある。
本発明のアゴニスト抗CD40抗体、およびこれを含む組成物を、1種類もしくは複数の種類の他の治療薬、診断薬、または予防薬と組み合わせて投与することができる。他の治療薬には、他の抗悪性腫瘍剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、または化学治療剤などが含まれる。このような追加的な薬剤を同じ組成物中に含めたり、別個に投与したりすることができる。いくつかの態様では、本発明の1種もしくは複数のアゴニスト抗CD40抗体をワクチンとして、またはワクチンに対するアジュバントを使用することができる。
本発明の組成物は、例えば、溶液(例えば注射溶液および不溶解性溶液)、分散媒もしくは懸濁液、錠剤、丸薬、粉末剤、リポソーム、および坐剤といった、液体、半固体、および固形の剤形などの、さまざまな状態をとりうる。好ましい形状は、意図された投与様式、および治療における応用によって変わる。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫に用いられる組成物に似た組成物などの、注射溶液または注入可能溶液の状態である。好ましい投与様式は、非経口(例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)への投与である。好ましい態様では、抗体を静脈内への注入または注射で投与する。別の好ましい態様では、抗体を筋肉内または皮下への注射で投与する。
治療的組成物は典型的には、製造および貯蔵の条件で無菌性で安定でなければならない。同組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散、リポソーム、または高薬剤濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。無菌性注射用溶液は、必要量の抗CD40抗体を適切な溶媒中に、上述の成分の単剤または複合剤を混合し、必要に応じて濾過滅菌して調製することができる。一般に分散液は、活性化合物を、基礎分散媒と、上述の必要な他の成分を含む無菌性溶媒に混合することで調製する。無菌性注射用溶液を調製するための無菌性粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分に加えて、過去に無菌濾過した同溶液に由来する任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。例えばレシチンなどのコーティング剤を用いることで、分散液の場合であれば必要な粒子径を維持することで、また界面活性剤を使用することで、溶液の適切な流動性を保つことができる。注射用組成物の長時間の吸収は、例えばモノステアレート塩やゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を組成物に含めることで達成することができる。
本発明の抗体は、当技術分野で周知のさまざまな方法によって投与することができるが、一部の治療的応用では、好ましい投与の経路/様式は、皮下、筋肉内、または静脈内への注入である。当業者であれば理解するように、投与の経路および/または様式は所望の結果に応じて変わる。
ある態様では、抗体組成物の活性化合物は、インプラント、経皮吸収製剤(パッチ)、およびマイクロカプセル輸送系を含む放出制御薬剤などの、抗体の速やかな放出を防ぐ担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤の多くの調製法は特許の対象であり、一般に当業者に知られている。これについては例えば「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」(J.R. Robinson編、Marcel Dekker社、New York、1978)を参照されたい。
ある態様では、本発明の抗CD40抗体は、例えば不活性希釈物、または吸収性で可食可能な担体とともに経口投与することができる。このような化合物(および、望ましいならば他の成分)を、硬軟のシェルのゼラチンカプセルで包んだり、錠剤中に圧縮したり、または被験者の食事に直接混ぜたりすることもできる。経口による治療的投与の場合、抗CD40抗体に賦形剤を混ぜて、摂取可能な錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの状態で使用することができる。本発明の化合物を、非経口投与以外で投与するには、化合物の不活性化を防ぐ材料で化合物を被覆したり、このような材料を化合物と同時投与したりする必要がある場合がある。
他の活性化合物を組成物に混ぜることもできる。ある態様では、本発明の抗CD40抗体を、1種類もしくは複数の追加的な治療薬と同時に製剤化するか、および/または同時に投与する。このような薬剤は、他の標的に結合する抗体(例えば1種類もしくは複数の成長因子もしくはサイトカイン、または抗CTL4抗体などの細胞表面受容体に結合する抗体)、抗悪性腫瘍剤、抗腫瘍剤、化学療法剤、CD40を活性化するペプチド類似体、可溶性CD40L、CD40を活性化する1種類もしくは複数の化学薬剤、および/または腫瘍細胞に対する免疫応答を促進可能な、当技術分野で周知の他の薬剤(例えばIFN-β1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IFN-γ、およびGM-CSF)を含むがこれらに限定されない。このような併用療法は、低用量の抗CD40抗体、ならびに同時投与することで、さまざまな単独療法に関連した潜在的な毒性または合併症を避ける薬剤を必要とする場合がある。
本発明のアゴニスト抗CD40抗体、およびこれを含む組成物は、他の治療法と組み合わせて、特に放射線療法と組み合わせて投与することもできる。
本発明の組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本発明の抗体もしくは抗原結合部分を含む場合がある。「治療的有効量」は、所望の治療効果を達成するために必要な用量および期間における有効量を意味する。抗体または抗体部分の治療的有効量は、個体の疾患段階、年齢、性別、および体重、ならびに抗体もしくは抗体部分が所望の反応を個体で発生させる能力などの諸因子によって変動する場合がある。治療的有効量は、抗体もしくは抗体部分の任意の毒性作用または有害作用が、治療的に有効な効果を上回る量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な用量および期間における有効量を意味する。典型的には、予防的用量は、疾患の発症前、または初期段階で被験者に用いられるので、予防的有効量は治療的有効量より少なくなる。
投与方法を調節して、最適な所望の反応(例えば治療反応または予防反応)を得ることができる。例えば単回ボーラスで投与できるほか、複数回に分けた用量を時間をかけて投与したり、または治療状況の緊急性に応じて、用量を比例的に減少したり増加したりすることが可能である。投与を容易にするため、また投与量を均一にするために、非経口組成物を投与単位で製剤化することは特に有利である。本明細書で用いる用量単位とは、投与対象の哺乳類個体を対象とした単一の用量に適した物理的に明瞭な単位を意味し；各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の用量単位の仕様は、(a)抗CD40抗体、もしくはこの一部の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果もしくは予防効果、ならびに(b)個体で感受性のある抗体のような、配合の分野における固有の限界によって決定され、またこれらに直接依存する。
治療的または予防的に有効な量の本発明の抗体もしくは抗体部分の例示的な非制限的な範囲は0.025〜50 mg/kg、より好ましくは0.1〜50 mg/kg、より好ましくは0.1〜25 mg/kg、0.1〜10 mg/kg、または0.1〜3 mg/kgである。用量の値が、緩和対象の状態の種類および重症度とともに変動する場合があることは重要である。また、任意の特定の被験者にとって、特定の投与方法を、個人の必要性、および専門家による、対象組成物の投与を受ける者、または投与を監視する者に対する判断にしたがって経時的に調製すべきであること、また本明細書に記載された用量範囲が例示的なものであって、主張された組成物の範囲もしくは実践を制限する意図がないことを理解すべきである。
本発明の別の局面は、本発明の抗CD40抗体もしくは抗体部分、またはこのような抗体を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体もしくは組成物に加えて、診断薬または治療薬を含む場合がある。キットはまた、診断法または治療法における使用に際しての指示書を含む場合もある。好ましい態様では、キットは、抗体、または抗体と、後述する方法で使用可能な診断薬を含む組成物を含む。別の好ましい態様では、キットは、抗体、または抗体と、後述する方法で使用可能な1種類もしくは複数の治療薬を含む組成物を含む。
本発明はまた、一定量の化学療法薬と併用した、一定量の本発明の抗体を含む、哺乳類における異常な細胞成長を抑えるための組成物にも関する(化合物、塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグの量、ならびに化学療法薬の量は、ともに異常な細胞成長を抑えるのに有効である)。いくつかの化学療法が現在、当技術分野で周知である。いくつかの態様では、化学療法薬は、有糸***阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物、インターカレートする抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的反応修飾物質、抗ホルモン(例えば抗アンドロゲン)、ならびに抗血管新生剤からなる群より選択される。
MMP-2(マトリックスメタロプロテイナーゼ2)阻害剤、MMP-9(マトリックスメタロプロテイナーゼ9)阻害剤、およびCOX-II(シクロオキシゲナーゼII)阻害剤などの抗血管新生剤を、本発明の抗CD40抗体と併用することができる。有用なCOX-II阻害剤の例にはCELEBREX(商標)(アレコキシブ(alecoxib))、バルデコキシブ(valdecoxib)、およびロフェコキシブ(rofecoxib)などがある。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、いずれも参照として全体が本明細書に組み入れられる国際公開公報第96/33172号(1996年10月24日公開)、国際公開公報第96/27583号(1996年3月7日公開)、欧州特許出願第97304971.1号(1997年7月8日出願)、欧州特許出願第99308617.2号(1999年10月29日出願)、国際公開公報第98/07697号(1998年2月26日公開)、国際公開公報第98/03516号(1998年1月29日公開)、国際公開公報第98/34918号(1998年8月13日公開)、国際公開公報第98/34915号(1998年8月13日公開)、国際公開公報第98/33768号(1998年8月6日公開)、国際公開公報第98/30566号(1998年7月16日公開)、欧州特許第606,046号(1994年7月13日公開)、欧州特許第931,788号(1999年7月28日公開)、国際公開公報第90/05719号(1990年3月31日公開)、国際公開公報第99/52910号(1999年10月21日公開)、国際公開公報第99/52889号(1999年10月21日公開)、国際公開公報第99/29667号(1999年6月17日公開)、PCT国際出願PCT/IB98/01113(1998年7月21日出願)、欧州特許出願第99302232.1号(1999年3月25日出願)、英国特許出願第9912961.1号(1999年6月3日出願)、米国特許仮出願第60/148,464号(1999年8月12日出願)、米国特許第5,863,949号(1999年1月26日発行)、米国特許第5,861,510号(1999年1月19日発行)、および欧州特許第780,386号(1997年6月25日公開)に記載されている。好ましいMMP阻害剤は、関節痛を生じない薬剤である。より好ましくは、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12、およびMMP-13)に対して、MMP-2および/またはMMP-9を選択的に阻害する薬剤である。本発明に有用なMMP阻害剤のいくつかの特定の例は、AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830、および以下に列挙した化合物である：3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(1-ヒドロキシカルバモイル-シクロペンチル)アミノ］-プロピオン酸；3-エキソ-3-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-8-オキサ-ビシクロ［3.2.1］オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；(2R, 3R)1-［4-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンジルオキシ)-ベンゼンスルホニル］-3-ヒドロキシ-3-メチル-ピぺリジン-2-カルボン酸ヒドロキシアミド；4-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-テトラヒドロ-ピラン-4-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(1-ヒドロキシカルバモイル-シクロブチル)-アミノ］-プロピオン酸；4-［4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-テトラヒドロ-ピラン-4-カルボン酸ヒドロキシアミド；(R)3-［4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-テトラヒドロ-ピラン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；(2R, 3R)1-［4-(4-フルオロ-2-メチル-ベンジルオキシ)-ベンゼンスルホニル］-3-ヒドロキシ-3-メチル-ピぺリジン-2-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(1-ヒドロキシカルバモイル-1-メチル-エチル)-アミノ］-プロピオン酸；3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(4-ヒドロキシカルバモイル-テトラヒドロ-ピラン-4-イル)-アミノ］-プロピオン酸；3-エキソ-3-［4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-8-オキサ-ビシクロ［3.2.1］オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-エンド-3-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-8-オキサ-ビシクロ［3.2.1］オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド酸；および(R)3-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］テトラヒドロ-フラン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；ならびにこれらの化合物の薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
本発明の化合物は、EGF-R抗体、EGF抗体、およびEGF-R阻害剤分子などの、EGF-R(上皮成長因子受容体)応答を阻害する薬剤などのシグナル伝達阻害剤；VEGF(血管内皮成長因子)受容体、およびVEGFを阻害可能な分子などのVEGF阻害剤；ならびにerbB2受容体、例えばHERCEPTIN(商標)(Genentech社)と結合する有機分子または抗体などのerbB2受容体阻害剤とともに使用することもできる。EGF-R阻害剤は例えば国際公開公報第95/19970号(1995年7月27日公開)、国際公開公報第98/14451号(1998年4月9日公開)、国際公開公報第98/02434号(1998年1月22日公開)、ならびに米国特許第5,747,498号(1998年5月5日発行)に記載されており、またこのような物質は、本明細書に記載したように本発明で使用することができる。EGFR阻害剤には、モノクローナル抗体のC225、および抗EGFR 22Mab(ImClone Systems社)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex社およびMerck KgaA)、および化合物のZD-1834、ZD-1838、およびZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、レフルノミド(leflunomide)(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183,805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck社)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Seragen社)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSEAM)、LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)、ならびにEGF-Rワクチン(York Medical/Centro de Immunologia Molecular(CIM))などがあるがこれらに限定されない。これらの薬剤、および他のEGF-R阻害剤を本発明で使用することができる。
VEGF阻害剤、例えばSU-5416やSU-6668(Sugen社)、SH-268(Schering)、およびNX-1838(NeXstar)を、本発明の化合物と組み合わせることもできる。VEGF阻害剤は例えば、全て参照として全体が本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/24440号(1999年5月20日公開)、PCT国際出願PCT/IB99/00797(1999年5月3日出願)、国際公開公報第95/21613号(1995年8月17日公開)、国際公開公報第99/61422号(1999年12月2日公開)、米国特許第5,834,504号(1998年11月10日発行)、国際公開公報第98/50356号(1998年11月12日公開)、米国特許第5,883,113号(1999年3月16日発行)、米国特許第5,886,020号(1999年3月23日発行)、米国特許第5,792,783号(1998年8月11日発行)、国際公開公報第99/10349号(1999年3月4日公開)、国際公開公報第97/32856号(1997年9月12日公開)、国際公開公報第97/22596号(1997年6月26日公開)、国際公開公報第98/54093号(1998年12月3日公開)、国際公開公報第98/02438号(1998年1月22日公開)、国際公開公報第99/16755号(1999年4月8日公開)、ならびに国際公開公報第98/02437号(1998年1月22日公開)に記載されている。本発明で有用ないくつかの特異的なVEGF阻害剤の他の例は、IM862(Cytran社)；Genentech社の抗VEGFモノクローナル抗体；ならびにRibozyme社およびChiron社の合成リボザイムであるアンジオザイム(angiozyme)である。これらのVEGF阻害剤および他のVEGF阻害剤は、本明細書に記載されたように本発明に使用することができる。GW-282974(Glaxo Wellcome plc)などのErbB2受容体阻害剤、ならびにモノクローナル抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals社)、および2B-1(Chiron)はさらに、例えば全体が参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第98/02434号(1998年1月22日公開)、国際公開公報第99/35146号(1999年7月15日公開)、国際公開公報第99/35132号(1999年7月15日公開)、国際公開公報第98/02437号(1998年1月22日公開)、国際公開公報第97/13760号(1997年4月17日公開)、国際公開公報第95/19970号(1995年7月27日公開)、米国特許第5,587,458号(1996年12月24日発行)、および米国特許第5,877,305号(1999年3月2日号発行)に記載されている本発明の化合物と組み合わせることができる。本発明で有用なErbB2受容体阻害剤は、いずれも全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第60/117,341号(1999年1月27日出願)、および米国特許仮出願第60/117,346号(1999年1月27日出願)にも記載されている。上述のPCT出願、米国特許、および米国仮特許出願に記載されたerbB2受容体阻害剤の化合物および物質、ならびにerbB2受容体を阻害する他の化合物および物質を、本発明の化合物とともに、本発明で使用することができる。
抗生存剤には、抗IGF-IR抗体や、抗インテグリン抗体などの抗インテグリン剤がある。
使用する診断法
別の局面では、本発明は診断法を提供する。抗CD40抗体を使用して、生物学的試料中のCD40をインビトロまたはインビボで検出することができる。1つの態様では、本発明は、抗体を被験者に注射する段階、抗体結合位置を決定することで被験者におけるCD40の発現を判定する段階、被験者における発現を、正常標準被験者または標準における発現と比較する段階、ならびに腫瘍の存在または位置を診断する段階を含む、処置を必要とする被験者における、CD40を発現する腫瘍の存在または位置を診断する方法を提供する。
抗CD40抗体は、ELISA、RIA、FACS、組織免疫組織化学的手法、ウェスタンブロット、または免疫沈殿を含むがこれらに限定されない、従来の免疫アッセイ法に使用することができる。本発明の抗CD40抗体は、ヒトに由来するCD40の検出に使用することができる。別の態様では、抗CD40抗体は、カニクイザルおよびアカゲザル、チンパンジーおよび類人猿などの旧世界霊長類に由来するCD40の検出に使用することができる。本発明は、生物学的試料に本発明の抗CD40抗体を接触させる段階、および結合状態の抗体を検出する段階を含む、生物学的試料中のCD40を検出する方法を提供する。1つの態様では、抗CD40抗体を、検出可能な標識で直接標識する。別の態様では、抗CD40抗体(一次抗体)を標識せず、抗CD40抗体に結合可能な二次抗体または他の分子を標識する。当業者に周知なように、特定の種およびクラスの一次抗体に特異的に結合可能な二次抗体を選択する。例えば抗CD40抗体がヒトIgGの場合、二次抗体は抗ヒトIgGとなる場合がある。抗体に結合可能な他の分子には、いずれも例えばPierce Chemical社から市販されているプロテインA(Protein A)やプロテイン(Protein G)などがあるがこれらに限定されない。
抗体または二次抗体用の適切な標識は、上述の通りであり、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、および放射性材料を含む。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがあり；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチン、およびアビジン/ビオチンなどがあり；適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどがあり；発光材料の例にはルミノールがあり；また適切な放射性物質の例には125I、131I、35S、または3Hなどがある。
他の態様では、CD40を、検出用物質で標識したCD40標準、および非標識抗CD40抗体を用いる競合免疫アッセイ法で生物学的試料中で調べることができる。このアッセイ法では、生物学的試料、標識されたCD40標準、および抗CD40抗体を混合して、非標識抗体に結合した標識CD40標準の量を決定する。生物学的試料中のCD40の量は、抗CD40抗体に結合した標識CD40標準の量に逆比例する。
上述の免疫アッセイ法を、いくつかの目的で使用することができる。例えば、抗CD40抗体を用いて、培養細胞中の細胞内のCD40を検出することができる。好ましい態様では、抗CD40抗体を用いて、さまざまな化合物で処理した細胞の表面上におけるCD40の量を決定することができる。この方法で、CD40を活性化させたり阻害したりするために有用な化合物を同定することができる。この方法では、ある細胞試料を、試験化合物で一定期間処理し、別の試料を処理せずにおく。CD40の全体濃度を測定するのであれば、細胞を溶解し、上述の免疫アッセイ法の1つでCD40の全体濃度を測定する。処理細胞と非処理細胞におけるCD40の全体濃度を比較することで、試験化合物の作用を決定する。
総CD40量を測定する好ましい免疫アッセイ法は、ELISAまたはウェスタンブロットである。CD40の細胞表面量を測定するのであれば、細胞を溶解せず、上述の免疫アッセイ法の1つでCD40の細胞表面量を測定する。CD40の細胞表面量を決定する好ましい免疫アッセイ法は、細胞表面タンパク質をビオチンや125Iなどの検出用標識で標識する段階、CD40を抗CD40抗体で免疫沈殿させる段階、また続いて、標識されたCD40を検出する段階を含む。CD40の(例えば細胞表面における)局在を決定する別の好ましい免疫アッセイ法は、免疫組織化学的手法で行う。ELISA、RIA、ウェスタンブロット、免疫組織化学的手法、膜内在性タンパク質の細胞表面標識、および免疫沈殿などの方法は当技術分野で周知である(HarlowおよびLane(前掲)を参照)。また、この免疫アッセイ法は、CD40の活性化または阻害に関して大量の化合物を検討する目的の高スループットのスクリーニング用にスケールアップすることができる。
本発明の抗CD40抗体を用いて、組織中、または組織に由来する細胞中におけるCD40量を決定することもできる。いくつかの態様では、このような組織は疾患組織である。いくつかの態様では、組織は、腫瘍または腫瘍の生検である。この方法のいくつかの態様では、組織、またはこの生検を患者から切除する。組織または生検試料を次に免疫アッセイ法に用いて、例えば総CD40量、CD40の細胞表面量、またはCD40の局在を上述の方法で決定する。
上述の診断法で、抗CD40抗体を用いた治療の標的であることの指標となりうる、高量のCD40を腫瘍が発現するか否かを判定することができる。また同じ方法で、腫瘍内の細胞死を検出することによって、抗CD40を用いる治療の効果をモニタリングすることもできる。このような診断法は、組織もしくは細胞が、CD40もしくは活性化CD40を不十分な量しか発現していないかどうかという判定にも使用できるので、活性化抗CD40抗体、CD40L、および/またはCD40の量または活性を高める他の治療薬を用いる治療法の候補となる。
本発明の抗体をインビボで用いて、CD40を発現する組織および器官を同定することもできる。いくつかの態様では、抗CD40抗体を用いて、CD40を発現する腫瘍を同定する。本発明のヒト抗CD40抗体を使用することの1つの利点は、非ヒト起源の抗体またはヒト化抗体とは異なり、投与時に抗体に対する免疫応答を引き起こすことなく、インビボで安全に使用できる点である。
この方法は、検出目的で標識された抗CD40抗体、または同抗体を含む組成物を、このような診断試験を必要とする患者に投与する段階、ならびに患者を対象に画像解析を行ってCD40を発現する組織の位置を決定する段階を含む。画像解析は医学分野でよく知られており、X線解析、磁気共鳴画像法(MRI)、またはコンピュータ断層撮影(CE)を含むがこれらに限定されない。抗体は、X線解析に使用可能な、インビボにおける画像解析に適した任意の薬剤(例えばバリウムなどの造影剤)、またはMRIもしくはCEに使用可能なガドリニウムキレート剤などの磁気造影剤で標識することができる。他の標識用薬剤には、99Tcなどの放射性同位元素が含まれるがこれらに限定されない。別の態様では、抗CD40抗体を標識せず、2次抗体、または検出可能で抗CD40抗体に結合可能な他の分子を投与することで描出する。態様では、患者から生検を得て、対象組織がCD40を発現しているか否かを判定する。
使用する治療法
別の局面では、本発明は、本発明の抗CD40抗体を使用する治療法を提供する。
本発明のヒトアゴニスト抗CD40抗体は、交差反応性CD40を発現するヒト、または非ヒト哺乳類に投与することができる。このような抗体は、獣医学的な目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、非ヒト哺乳類(霊長類、カニクイザル、またはアカゲザル)に投与することができる。このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効率を評価するために有用である。
いくつかの態様では、抗CD40抗体を、過剰IgM症候群を伴うCD40依存性の免疫不全症、分類不能型免疫不全症、ブルトン型無γグロブリン血症、IgGサブクラス欠損症、およびX連鎖SCID(分類不能型γ鎖変異)を含む、原発性および/または複合免疫不全症の被験者に投与する。いくつかの態様では、抗CD40抗体を、例えば化学療法に起因する免疫不全状態の被験者、またはHIVなどの任意の後天性免疫不全疾患を含む免疫消耗性疾患(immune-debilitating disease)の被験者に治療目的で投与する。いくつかの態様では、抗CD40抗体を投与して、高齢被験者の免疫を高める。いくつかの態様では、抗CD40抗体を、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫に感染した被験者に治療目的で投与する。いくつかの態様では、本発明のヒトアゴニスト抗CD40抗体を、年齢、疾患、または全般的な健康不良のために、感染しやすい被験者に対して、感染症の予防、または感染症の重症度を低下させるために予防的に投与することができる。
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体を、過増殖性疾患の被験者に投与する。
いくつかの態様では、本発明の抗CD40抗体を、腫瘍のある被験者に治療目的で投与する。いくつかの態様では、このような腫瘍はCD40陽性である。いくつかの態様では腫瘍はCD40陰性である。腫瘍は、リンパ腫などの固形腫瘍、または非固形腫瘍の場合がある。いくつかの態様では、抗CD40抗体を、癌性細胞である腫瘍のある患者に投与する。いくつかの態様では、抗体は、癌細胞の増殖を抑制し、腫瘍の重量または容積の増加を抑制または防止し、および/または腫瘍の重量または容積の低下を引き起こす。
本発明の抗CD40抗体または抗体部分で治療可能な患者は、脳腫瘍、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚もしくは眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌(stomach cancer、gastric cancer)、結腸直腸癌、大腸癌、乳癌、婦人科腫瘍(例えば、子宮肉腫、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頚部の癌、膣の癌、または外陰の癌)、食道癌、小腸癌、内分泌系癌(例えば甲状腺癌、副甲状腺または副腎の癌)、軟組織の癌、白血病、ミエローマ、多発性骨髄腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性もしくは急性の白血病、小児の固形腫瘍、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、肝臓癌、腎癌、腎臓もしくは尿管の癌(例えば腎細胞癌、腎盂癌)、または中枢神経系の新生物(例えば原発性のCNSリンパ腫、脊柱軸の腫瘍、脳幹部神経膠腫、または下垂体腺腫)、神経膠腫、または線維肉腫であると診断された患者を含むがこれらに限定されない。
抗体は、1日3回〜6か月毎に1回投与することができる。また好ましくは、口腔、粘膜、舌下、鼻腔内、吸入、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、腫瘍内、経皮、または局所的な経路で投与することができる。抗体をミニポンプで連続的に投与することもできる。抗体は一般に、抗体が腫瘍または癌の成長を停止させたり、重量または容積を減少させるのであれば、腫瘍が存在する限りにおいて投与する。抗体の用量は一般に0.025〜50 mg/kg、より好ましくは0.1〜50 mg/kg、より好ましくは0.1〜20 mg/kg、0.1〜10 mg/kg、0.1〜5 mg/kg、またはさらにより好ましくは0.1〜2 mg/kgの範囲にある。抗体を予防的に投与することもできる。
いくつかの態様では、抗CD40抗体を、1種もしくは複数の追加的な抗悪性腫瘍薬剤または分子を含む治療法の一部として、癌や腫瘍などの過増殖性疾患の患者に投与する。例示的な抗腫瘍剤には、有糸***阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物、挿入剤、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的反応修飾剤、抗ホルモン、キナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、遺伝子治療用の薬剤、および抗アンドロゲンなどがあるがこれらに限定されない。より好ましい態様では、抗CD40抗体を、アドリアマイシンやタキソールなどの抗悪性腫瘍剤とともに投与する。いくつかの好ましい態様では、抗CD40療法を、放射線療法、化学療法、光力学療法、外科手術、または他の免疫療法と並行して行う。いくつかの態様では、抗CD40抗体を、1種類または複数の追加的な抗体とともに投与する。例えば、抗CD40抗体を、腫瘍または癌細胞の増殖を阻害することが知られている抗体とともに投与することができる。このような抗体には、CTLA4、erbB2受容体、EGF-R、IGF-1R、CD20、またはVEGFを阻害する抗体などがあるがこれらに限定されない。
いくつかの態様では、抗CD40抗体を、放射標識、免疫毒素、または毒素で標識する。または抗CD40抗体は、毒性ペプチドを含む融合タンパク質である。抗CD40抗体、または抗CD40抗体融合タンパク質は、放射標識、免疫毒素、毒素、または毒性ペプチドを、腫瘍もしくは癌細胞に導く。好ましい態様では、放射標識、免疫毒素、毒素、または毒性ペプチドは、抗CD40抗体が細胞表面上のCD40と結合した後に、腫瘍または癌細胞に取り込まれる。
別の局面では、抗CD40抗体を治療的に用いて、患者の特定の細胞のアポトーシスを誘導することができる。多くの場合、アポトーシスの標的となる細胞は、癌性細胞または腫瘍細胞である。したがって本発明は、抗CD40抗体を、処置の必要な患者に投与することでアポトーシスを誘導する方法を提供する。
別の局面では、本発明は、活性化抗CD40抗体を患者に投与して、CD40活性を高める方法を提供する。抗CD40抗体を、CD40活性を高める1種類または複数の他の因子とともに投与する。このような因子には、CD40を活性化するCD40L、および/またはCD40Lの類似体が含まれる。
いくつかの態様では、抗CD40抗体を、IFN-β1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IFN-γ、およびGM-CSFを含むがこれらに限定されない1種類または複数の追加的な免疫促進剤とともに投与する。
いくつかの態様では、本発明のヒトアゴニストの抗CD40抗体をアジュバントとして用いて、ワクチンの効力を高める。このように使用する場合、抗CD40抗体は、B細胞、樹状細胞、および単球を含む抗原提示細胞上のCD40を活性化し、ならびにサイトカインやケモカインなどの免疫調節性分子の産生を促進する。抗体のもつ免疫刺激効果は、ワクチンを接種した被験者における、ワクチン抗原に対する免疫応答を促進する。
別の局面では、本発明は、癌に対する樹状細胞ワクチンを作製する方法、または樹状細胞免疫療法を提供する。この方法では、癌患者の樹状細胞を、腫瘍溶解物またはホモジネート、放射線照射もしくは他の手段で死滅させた腫瘍細胞、または腫瘍特異的抗原(例えばペプチド、イディオタイプ)、および1〜10 μg/mlの抗CD40抗体とともに1〜5日培養する。腫瘍抗原をパルスした樹状細胞を患者に再注入して、抗腫瘍免疫応答、特に抗腫瘍CTL応答を刺激する。この方法に使用する単球由来樹状細胞は、IL-4およびGM-CSFと培養することで末梢血試料から得られる。樹状細胞は、磁気精製、またはCD34陽性細胞のソーティングと、これに続くIL-4およびGM-CSFとの培養によって、患者の骨髄から抽出することもできる。
遺伝子治療
本発明の核酸分子を、処置を必要とする患者に遺伝子治療で投与することができる。遺伝子治療はインビボまたはエキソビボのいずれかの場合がある。好ましい態様では、重鎖と軽鎖の両方をコードする核酸分子を患者に投与する。より好ましい態様では、核酸分子を、B細胞の染色体に同分子が安定に組み入れられるように投与する(B細胞がもっぱら抗体産生に関与するため)。好ましい態様では、B細胞前駆細胞を、トランスフェクトするか、エキソビボで感染させ、処置を必要とする患者に再移植する。別の態様では、B細胞前駆細胞または他の細胞に、対象細胞種に感染することが知られているウイルスを用いてインビボで感染させる。遺伝子治療に使用される典型的なベクターには、リポソーム、プラスミド、およびウイルスベクターなどがある。例示的なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスである。インビボまたはエキソビボにおける感染後に、抗体発現のレベルを、投与患者から試料を採取し、当技術分野で周知の、また本明細書に記載された任意の免疫アッセイ法でモニタリングすることができる。
好ましい態様では、遺伝子治療法は、抗CD40抗体の重鎖、またはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびにこの核酸分子を発現させる段階を含む。別の態様では、遺伝子治療法は、抗CD40抗体の軽鎖、またはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびに核酸分子を発現させる段階を含む。より好ましい方法では、遺伝子治療法は、本発明の抗CD40抗体の、重鎖もしくはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、および軽鎖もしくはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびにこれらの核酸分子を発現させる段階を含む。遺伝子治療法は、タキソールやアドリアマイシンなどの別の抗癌剤を投与する段階を含む場合もある。
本発明をさらに深く理解するために、実施例を以下に記載する。これらの実施例は、説明する目的でのみ提供するものであり、本発明の範囲をいかなる意味においても制限すると解釈されない。
実施例I
抗CD40抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明の抗体を、以下の手順で調製し、選択し、検討した：
免疫化およびハイブリドーマの作製
本発明者らは、8〜10週齢のXenoMice(商標)を、CD40-IgG融合タンパク質(10 μg/用量/個体)、または形質膜上にヒトCD40を発現するトランスフェクトした細胞株である300.19-CD40細胞(10×106細胞/用量/個体)のいずれかを、腹腔内または後足蹠に注射することで免疫化した。本発明者らは3〜8週間にわたって投与を5〜7回繰返した。融合に先立つ4日前に、本発明者らは、ヒトCD40の細胞外ドメイン(溶媒はPBS)の最終的な注射をマウスに行った。本発明者らは、免疫化マウスの脾臓とリンパ節のリンパ球を、非分泌性ミエローマP3-X63-Ag8.653細胞株と融合し、融合細胞を対象に、文献(GalfreおよびMilstein、Methods Enzymol. 73：3-46、1981)に記載された手順でHAT選択を行った。本発明者らは、CD40特異的なヒトIgG2κ抗体を全て分泌するハイブリドーマのパネルを回収した。本発明者らは、さらに調べるために11個のハイブリドーマを選択し、これらを3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1と命名した。
本発明者らは、ハイブリドーマ3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、および21.4.1をAmerican Type Culture Collection(ATCC；10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209)に、ブダペスト条約に準じて2001年8月6日に登録した。本発明者らは、ハイブリドーマ21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.29.1、および24.2.1を、ATCCに2002年7月16日に登録した。これらのハイブリドーマには、以下の登録番号が割り当てられた：
Figure 0005848232
実施例II
本発明の手順で調製した抗CD40抗体の配列
本発明の手順で産生された抗体の構造を解析するために、本発明者らは、抗CD40モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに由来する重鎖および軽鎖の断片をコードする核酸をクローニングした。クローニングおよび配列決定は、以下の手順で行った。
本発明者らは、実施例Iに記載された手順で、ヒトCD40で免疫化したXenoMouse(商標)マウスに由来する約2×105個のハイブリドーマ細胞から、ポリ(A)＋mRNAをFast-Trackキット(Invitrogen)を用いて単離した。本発明者らは次にPCRを行ってランダムプライムcDNAを得た。本発明者らは、ヒトVHまたはヒトVκファミリーに特異的な可変領域のプライマー(Marksら、「Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes」、Eur. J. Immunol. 21：985-991(1991))、またはユニバーサルのヒトVHプライマーMG-30、
Figure 0005848232
を、ヒトCj2定常領域、MG-40d、
Figure 0005848232
またはCκ定常領域(hκP2；Greenら、1994に記載)に特異的なプライマーとともに使用した。本発明者らは、抗CD40産生ハイブリドーマから、ヒトの重鎖およびκ軽鎖の転写物をコードする核酸分子を、ポリ(A+)RNAから作製したPCR産物の、上記プライマーを用いた直接配列決定によって得た。本発明者らはまた、PCR産物をTAクローニングキット(Invitrogen)を用いてpCRIIにクローニングし、両鎖の配列をPrismダイターミネーター配列決定キットおよびABI 377配列決定装置で決定した。本発明者らは全配列を解析を、MacVectorおよびGeneworksソフトウェアプログラムを用いて「V BASE 配列ディレクトリ」に対するアライメントによって行った(Tomlinsonら、MRC Centre for Protein Engineering、Cambridge、UK)
また本発明者らは、モノクローナル抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.28.1、23.29.1、および24.2.1を対象に、完全長のDNAのクローニングおよび配列決定を行った。この配列決定に際して本発明者らは、約4×106個のハイブリドーマ細胞から、QIAGEN RNeasy RNA単離キット(QIAGEN)を用いてRNAを単離した。本発明者らは、オリゴdT(18)、およびAdvantage RT/PCRキット(Clonetech)を用いてmRNAを逆転写した。本発明者らはV Baseを用いて、制限酵素切断部位、最適なコザック配列、ATG開始部位、および重鎖のシグナル配列の一部を含むフォワード増幅プライマーを設計した。表1に、抗体クローンの配列決定に使用したフォワード増幅プライマーを示す。
(表１)
Figure 0005848232
本発明者らは同じ方法で、3'コード配列、IgG2定常領域の終止コドン
Figure 0005848232
および制限酵素切断部位を含むようにプライマーを設計した。
本発明者らは同じ方法で、κ鎖のATG開始部位の周囲のプライマー：
Figure 0005848232
も設計した。最適なコザック配列(CCGCCACC)をATG開始部位の5'側に加えた。このプライマーを用いて、以下の抗体クローン：3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、および23.29.1の軽鎖をPCRでクローニングした。本発明者らは第2のフォワードプライマー
Figure 0005848232
を用いて、クローン23.28.1および24.2.1の軽鎖をクローニングした。本発明者らは同じ方法で、κ定常領域
Figure 0005848232
の終止コドンの周囲のプライマーも設計した。本発明者らは、このプライマー対を用いて、Advantage High Fidelity PCRキット(Clonetech)を用いてcDNAを増幅した。本発明者らは、ダイターミネーター配列決定キット、およびABI配列決定装置を用いた標準的な手法(例えばプライマーウォーキング)で、直接配列決定によってPCR産物の配列を得た。本発明者らは、PCR産物を哺乳類発現ベクターにクローニングし、また本発明者らは、クローンの配列を決定して体細胞変異の存在を確認した。各クローンに関して、本発明者らは両鎖の配列を少なくとも3回の反応で検証した。
遺伝子利用解析
本発明にしたがって、抗体の一部のハイブリドーマクローンによって明らかとなった遺伝子利用を表2に示す：
(表２)重鎖および軽鎖における遺伝子利用
Figure 0005848232
配列および変異の解析
言うまでもなく、遺伝子利用の解析では抗体構造の一面しかわからない。XenoMouse(商標)動物のB細胞は確率的にV-D-J重鎖またはV-Jκ軽鎖の転写物を生じるので、体細胞高頻度変異、変異、欠失、Nの付加、およびCDR3の伸長を含むがこれらに限定されない、いくつかの2次過程が存在する。これについては例えばMendezら、Nature Genetics 15：146-156(1997)、および国際公開公報第98/24893号を参照されたい。したがって本発明者らは抗体構造をさらに詳しく調べるために、クローンから得られたcDNAから抗体の推定アミノ酸配列を得た。表Aに、配列が決定された抗体の、個々のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列に関する配列同定子を示す。
表3〜7に、抗体3.1.1(表3)、7.1.2(表4)、10.8.3(表5)、15.1.1(表6)、および21.4.1(表7)の重鎖およびκ軽鎖のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
表8〜13に、抗体21.2.1(表8)、22.1.1(表9)、23.5.1(表10)、23.28.1(表11)、23.29.1(表12)、および24.2.1(表13)の重鎖およびκ軽鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
モノクローナル抗体23.28.1の完全長配列決定で明らかとなったDNA配列は、当初のPCR産物のVH領域の配列決定の結果明らかとなったDNA配列とは1塩基対が異なり(CからG)、天然の重鎖の残基16におけるDからEへの変化を生じる。
表14〜19に、抗体21.2.1(表14)、22.1.1(表15)、23.5.1(表16)、23.28.1(表17)、23.29.1(表18)、および24.2.1(表19)の重鎖およびκ軽鎖のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。この表では、シグナルペプチド配列(またはこれをコードする塩基)に下線を付した。
本発明者らは、2つの変異型抗体、22.1.1および23.28.1を作製した。抗体22.1.1の重鎖に、109位におけるシステイン残基がアラニン残基に変化するように変異を導入した。本発明者らは、この変異型クローンを22.1.1H-C019Aと命名した。抗体23.28.1の軽鎖の92位についても、システイン残基をアラニン残基に変化するように変異を導入した。本発明者らは、この変異型クローンを23.28.1L-C92Aと命名した。
特定の残基の変異導入は、プライマーを設計し、またStratagene社のQuickChange Site Directed Mutagenesisキットを用いて、製造業者の指示書にしたがって行った。変異は自動配列決定によって確認し、変異が導されした挿入配列を発現ベクターにサブクローニングした。
表20に、抗体22.1.1H-C109Aの変異型重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。表21に、抗体23.28.1の変異型軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。変異が導入されたDNAコドンを斜体字で示す。変異が導入されたアミノ酸残基を太字で示す。
(表３)抗体3.1.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表４)抗体7.1.2のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表５)抗体10.8.3のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表６)抗体15.1.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表７)抗体21.4.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表８)抗体21.2.1の成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
(表９)抗体22.1.1の成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
(表１０)抗体23.5.1の成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
(表１１)抗体23.28.1の成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表１２)抗体23.29.1の成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
(表１３)抗体24.2.1の成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
(表１４)抗体21.2.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表１５)抗体22.1.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表１６)抗体23.5.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表１７)抗体23.28.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表１８)抗体23.29.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表１９)抗体24.2.1のDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
Figure 0005848232
(表２０)抗体22.1.1H-C109Aの成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
(表２１)抗体23.28.1L-C92Aの成熟可変ドメインのDNAおよびタンパク質の配列
Figure 0005848232
実施例III
重鎖および軽鎖のアミノ酸置換の解析
図1D〜1Hおよび2D〜2Hに、モノクローナル抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1、および24.2.1の推定重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と、各遺伝子の生殖系列のアミノ酸配列間の配列アライメントを示す。重鎖のCDR3領域の大半はアミノ酸の挿入を含む。
抗体21.4.1のVHドメインに使用されるDLR1遺伝子は、2つのシステイン(Cys)残基をコードする。質量分析による解析、および相同モデル法の結果、2つのCys残基がジスルフィド結合を形成していること、またこのジスルフィド結合が抗体の構造を破壊しないことがわかった。
図1A〜1Cおよび2A〜2Cに、モノクローナル抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、および24.2.1のクローンの推定軽鎖可変アミノ酸配列と、各遺伝子の生殖系列のアミノ酸配列間の配列アライメントを示す。これらの抗体の軽鎖は、3種類の異なるVκ遺伝子に由来する。11種類の抗体のうち7種類がA3/A19 Vκ遺伝子を使用し、このうち6種類はCDR1領域に2つの変異がある。またA3/A19 Vκ遺伝子を使用する7種類の抗体のうち5種類はJκ1遺伝子も使用する。これら全ての抗体において、Jκ1遺伝子に由来する先頭のアミノ酸はいずれもWからRへ変化している。
上述のアミノ酸の置換または挿入の多くが、CDRに近接して、またはCDRの内部に存在することが理解されるであろう。このような置換は、抗体とCD40分子の結合に際して、何らかの効果をもたらすように現れる場合がある。また、このような置換は、抗体の親和性に有意な作用を有する場合がある。
実施例IV
本発明の抗体の種の交差反応
本発明者らはFACS解析を行い、本発明の抗体の、さまざまな種、特にある種の旧世界サルに由来するCD40に対する結合および親和性を決定した。本発明者らは、ヒトおよびサルの全血のアリコートを氷上で、本明細書に記載された本発明の抗CD40抗体の濃度を増加させながら、負の対照として抗キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)抗体とともに1時間インキュベートした。本発明者らは次に、同試料を氷上で30分間、抗ヒトIgG2結合RPE(フィコエリトリン)とインキュベートした。本発明者らは、フローサイトメトリーでCD19/CD20陽性B細胞の結合を測定し、細胞数(Counts)に対する蛍光強度(Fl2-H)のヒストグラムをCellQuestソフトウェアで解析した。本発明者らは、各抗体の結合(KD)を、平均蛍光強度-抗体濃度のグラフから推定した。本発明者らは、細胞濃度範囲における結合を測定することで抗体の枯渇を制御した。
本発明者らは、抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、および21.4.1を対象に、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのB細胞に対する結合を調べた。本発明者らは、抗体21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.29.1、および24.2.1を対象に、ヒトおよびカニクイザルのB細胞に対する結合も調べた。
本発明者らは、サル細胞に対する半最大結合の最大のシグナルおよび濃度が、ヒトB細胞に対応するパラメータに対して2倍の範囲内にあることを観察した。マウス、ラット、ウサギ、およびイヌの血液を対象とした類似の実験では、結合は認められなかった
実施例V
CD40に対する抗体の選択性
本発明者らは、別のインビトロアッセイ法を行って、CD40に関する本発明の抗体の選択性を決定した。
CD40選択的ELISA：材料および方法
本発明者らは、96ウェルのFluroNUNCプレート(Nuncカタログ番号475515)を4種類の抗原：CD40/Ig、CD44/Ig、RANK/Ig、4-1BB/Ig、TNFR-1/Ig、およびTNFR-2/Ig(抗原は施設内で作製)で4℃で一晩、1 μg/ml(溶媒：0.1 M 炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH 9.6)の溶液を100 μl/ウェルになるように用いてコーティングした。次に本発明者らは、プレートをPBST(PBS＋0.1％ Tween-20)で3回洗浄し、プレートをPBST+0.5％ BSAでブロックした(150 μl/ウェル)。本発明者らは、このプレートを室温で1時間かけてインキュベートした後に、PBSTで3回洗浄した。次に本発明者らは、実施例Iで作製した抗CD40抗体をブロック中で希釈し(1 μg/ml)、希釈後の抗体をプレートに添加した。本発明者らは、プレートを室温で1時間インキュベートした後に、PBSTで3回洗浄した。次に本発明者らは、実施例Iで作製した抗体を含むウェルを100 ml/ウェルの抗ヒトIgG2-HRP(Southern Biotechカタログ番号9070-05)で、ブロック中で1：4000の希釈率で処理した。また本発明者らは1列を、ブロック中で1：5000に希釈した抗ヒトIgG(Jacksonカタログ番号209-035-088)で処理し、100 μl/ウェルになるように添加して、プレートのコーティングを標準化した。本発明者らはまた1列を正の対照として、抗ヒトCD40-HRP(Pharmingenカタログ番号345815/Custom HRP結合)で、ブロック内で0.05 μg/mlに希釈されるように処理した。本発明者らは、このプレートを室温で1時間インキュベートした後に、PBSTで3回洗浄した。本発明者らは、TMB基質(K&P Labs)を100 μl/ウェルとなるように添加し、プレートを5〜10分インキュベートした。次に本発明者らは、Speckra-Max(商標)プレートリーダーでプレートの読み取りを行った。この結果から、抗体がRANK、4-1BB、TNFR-1、およびTNFR-2に対する選択性と比較して、CD4特異的シグナル(CD40シグナルからバックグラウンドを差し引いたもの)が、他の分子に対する対応シグナルと比較して少なくとも100倍大きいという点で、少なくとも100倍大きいCD40選択性を有することがわかった。
実施例VI
エピトープ分類試験
本発明の抗体がCD40に対する選択性を有することが明らかになったので、本発明者らはBIAcoreおよびFACSで競合結合解析を行った。
BIAcore競合試験
本発明者らはBIAcore競合試験を行い、本発明のヒト抗CD40抗体が、CD40分子上の同じ部位または異なる部位に結合するか否かを判定した。
この実験では、本発明者らは、BIAcore 2000装置を、製造業者のプロトコルにしたがって使用した。プロテイン-AをBIAcoreのセンサーチップの表面に固定した。CD40の細胞外ドメインを含む飽和濃度のCD40-Igをセンサーチップに結合させた。次に本発明者らは、第1の本発明のヒトアゴニスト抗CD40抗体、市販の抗CD40抗体、またはCD40Lを、センサーチップに結合させた状態のCD40に、飽和条件で結合させた。次に本発明者らは、本発明の第2のヒトアゴニスト抗CD40抗体が、CD40との結合をめぐって第1の抗体、市販の抗体、またはCD40Lと競合する能力を測定した。この手法により本発明者らは、抗体をさまざまな結合グループに割り当てることができた。CD40との結合は、独立のエピトープによる認識を意味していた。結合が認められない場合は、同じエピトープまたは重複するエピトープによって認識されることを意味する可能性がある。
FACS試験
本発明者らはFACS試験を行って、本発明のヒト抗CD40抗体が、CD40分子上の同じ部位または異なる部位に結合するか否かを判定し、また市販の抗CD40抗体EA5(Alexisカタログ番号ANC-300-050)、LOB7/6(Serotec MCA/590PE)、および5C3(Pharmingen #555458(非標識)、ならびに555460(FACS用にPEで標識)と同様に、CD40分子上の同じ部位または異なる部位と結合するか否かを判定した。
本発明者らは、本発明の抗CD40抗体で処理した樹状細胞を、PEで標識したEA5、またはPEで標識したLOB7/6抗体で氷上で30分間かけて対比染色した。洗浄後、細胞の染色をB-Dキャリバーサイトメーターで解析した。市販の抗体に結合の低下がみられた場合は、試験抗体が同じエピトープまたは重複するエピトープと結合した状態にあることを示すものと解釈した。
BIAcoreおよびFACSによる競合結合解析の結果、mAb 21.4.1抗体によって認識されるエピトープが、EA5抗体によって認識されるエピトープと重複すること、市販のLOB7/6抗体によって認識されるエピトープと重複しないこと、またCD40Lに対する結合部位と重複しないことがわかった。残りの抗体によって認識されるエピトープは、CD40Lに対する結合部位と重複する。
表22に、以上のエピトープ分類試験の結果をまとめた。
(表２２)本発明の特定の抗CD40抗体を対象としたBIAcore競合エピトープ分類
Figure 0005848232
実施例VII
抗CD40抗体による表面分子の上方制御
本発明者らは全血アッセイ法を行い、本発明のヒト抗CD40抗体がB細胞の表面分子の発現を上方制御するか否かを判定した。
ヒトまたは霊長類の全血をRPMI培地で1：1に希釈し、さまざまな濃度のCD40アゴニスト抗体または対照と24時間インキュベートした。細胞を、HLA-DR、ICAM、B7-1、B7-2、CD19/CD20、CD40、CD23、およびCD71に対して30分間かけて、市販の蛍光色素標識抗体試薬を用いて染色した(氷上、暗所)。この細胞を次にFACS-Caliber(Becton-Dickinson)で解析した。B細胞を、CD19またはCD20の陽性細胞、およびこのゲートに関して決定された活性化マーカーに関して、ゲーティングにより同定した。
請求された本発明の抗CD40抗体(21.4.1)の1つを用いて得た、蛍光中央値の最大倍加率(≦1 μg/ml 抗体)、および平均EC50を表23に示す。
(表２３)本発明の抗CD40抗体によるB細胞表面分子の上方制御
Figure 0005848232
本発明者らは実験を行って、本発明のヒト抗CD40抗体が、単球由来樹状細胞の表面分子の発現を上方制御するか否かも判定した。
単球由来樹状細胞の調製
末梢血を正常ヒトボランティアから採取した。単核球を、Sigma Accuspinチューブ(St. Louis、MO)を用いて単離し、RPMI培地(Gibco BRL、Rockville、MD)で洗浄し、また5×106/mlとなるように組織培養フラスコ内の完全RPMI培地中(100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES緩衝液、2 mM グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸；いずれもGibco BRL製)；ならびに10％ ウシ胎児血清(Hyclone、Logan、Utah)を含む)に注入した。37℃における3時間のインキュベーション(5％ CO2)後に非接着細胞を除去し、選択用カラム(R&D systems、Minneapolis、MN)を用いてT細胞を単離した。接着細胞をRPMI培地で洗浄し、10 ng/ml IL-4(R&D systems)、および100 ng/ml GM-CSF(R&D systems)を添加した完全RPMI培地中で7日間インキュベートした。次に非接着細胞を単離し、洗浄し、また単球由来樹状細胞(mDC)として全ての実験に用いた。残りの接着細胞を、トリプシン/EDTAを用いて除去し、接着性単球を使用する実験に用いた。
本発明の抗CD40抗体が、細胞表面マーカーの発現を上方制御するか否かを判定するために、単球由来樹状細胞を、さまざまな濃度のアゴニスト抗体とともに48〜72時間培養した後に、HLA-DR、ICAM、B7-1、B7-2、CD40、およびCD83に対する染色を、市販の蛍光色素標識抗体試薬を用いて行った(30分、氷上、暗所)。次にこれらの細胞をFACS-Caliber(Becton Dickinson)で解析した。
請求された本発明の抗CD40抗体(21.4.1)の1つ用いて得た、蛍光中央値の最大倍加率(≦1 μg/ml 抗体)、および平均EC50を表24に示す。
(表２４)本発明の抗CD40抗体による樹状細胞表面分子の上方制御
Figure 0005848232
本発明者らは、さまざまな本発明の抗CD40抗体、および別のマーカーを用いて、B細胞およびmDCを対象に類似の実験を行った。本発明者らは、B細胞表面分子(MHC-II、ICAM、B7-1、B7-2、およびCD23)の発現を、上述の手順で、ただし1 μg/mlの抗CD40抗体を用いて測定した。この実験の結果を表25に示す。本発明者らは、樹状細胞の表面分子(MHC-II、ICAM、B7-1、B7-2、およびCD83)の発現を72時間後に上述の手順で、ただし1 μg/mlの抗CD40抗体を用いて測定した。この実験の結果を表26に示す。表25〜26に、強度+/-標準偏差の中央値の倍加率を示す。
(表２５)本発明の抗CD40抗体によるB細胞表面分子の上方制御
Figure 0005848232
(表２６)本発明の抗CD40抗体による樹状細胞表面分子の上方制御
Figure 0005848232
表27に、B細胞における平均-倍加率に対する樹状細胞における平均-倍加率の比で表した、B細胞に対する樹状細胞の細胞表面分子の上方制御を比較した結果を示す。
(表２７)B細胞に対する樹状細胞上の細胞表面分子の上方制御
Figure 0005848232
実施例VIII
サイトカイン分泌の促進
本発明者らは、本発明のヒト抗CD40抗体が、IL-12p40、IL-12p70、およびIL-8の分泌を促進するか否かを判定するために、単球由来樹状細胞アッセイ法を実施した。
単球由来樹状細胞および接着性単球は上述の手順で調製した。細胞を、本発明の抗CD40抗体(21.4.1)の存在下で、または負の対照として抗キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)抗体とともに培養した。上清中のサイトカインを、24時間の時点でELISA(R&D systems)で測定した。一部の試験(表28参照)では、抗体で処理した単球由来樹状細胞を対象に、100 ng/mlのLPS(Sigma)、1000 U/mlのIFNγ(R&D systems)、または25 ng/mlのIL-1β(R&D systems)のいずれかによる同時刺激も行った。
抗CD40抗体は、単球由来樹状細胞と接着性単球の両方において、IL-12p40、IL-12p70、およびIL-8の産生を促進した。LPSが存在すると、IL-12p40およびIL-12p70の産生はさらに促進された。最小レベルのサイトカインのみが、アイソタイプ対照抗体である抗KLHとインキュベートした樹状細胞の上清中に検出された。代表的な結果を表28、ならびに図3および図4に示す。表28に、1 μg/mlの本発明の抗CD40抗体(21.4.1)±100 ng/mlのLPSにより、樹状細胞または接着性単球から産生された主なサイトカインをまとめた。図3に示すように抗CD40抗体は、ヒト樹状細胞によるIL-12p40の産生を促進した。図4は、抗体および100 ng/mlのLPSの存在下における、ヒト樹状細胞によるIL-12p70の産生が促進されたことを示す。
(表２８)本発明の抗CD40抗体によるIL-12p40、IL-12p70、およびIL-8の分泌の促進
Figure 0005848232
ND＝決定せず。
同様の実験を、複数の本発明の抗CD40抗体を用いて実施した。単球由来樹状細胞を上述の手順で調製し、さまざまな濃度の抗CD40抗体の存在下で培養し、100 ng/mlのLPS(Sigma)で同時刺激した。上清中のIL-12p70を24時間の時点でELISA(R&D systems)で測定し、各抗体についてEC50を決定した。この実験の結果を表29に示す。
(表２９)樹状細胞におけるIL-12p70分泌の促進
Figure 0005848232
本発明者らは、本発明の抗CD40抗体のもつ、T細胞に由来するIFN-γの分泌を促進する能力も、同種T細胞/樹状細胞アッセイ法で調べた。このアッセイ法を実施するために、T細胞および単球を、健康なボランティアの末梢血から単離した。単球を上述の方法で樹状細胞に分化させた。個体から得た1×105個のT細胞を、さまざまな個体から得た1×105個の樹状細胞とともに、本発明の抗CD40抗体または対照抗体の存在下で培養した。4日間の培養後、上清を対象にIFN-γの分泌をELISAで調べた。このアッセイ法の結果を表30に示す。
(表３０)本発明の抗CD40抗体によるIFN-γの分泌の促進
Figure 0005848232
実施例IX
本発明の抗CD40抗体による炎症性サイトカインの誘導
抗体10.8.3、15.1.1、21.4.1、および3.1.1を、Wingら、Therapeutic. Immunol. 2：183-90(1995)に記載された全血サイトカイン放出アッセイ法で調べ、炎症性サイトカインが、1、10、および100 μg/mlの濃度の抗体によって誘導されるか否かを判定した。TNF-α、IL-1β、IFN-γ、またはIL-6の有意な放出は、これらの抗体について、10人の正常ドナーから採取した、記載濃度の血液では認められなかった。
実施例X
抗CD40抗体による細胞株Jyの免疫原性の促進
CD40陽性JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)(「Jy細胞」)を、RPMI培地で培養して維持した。JIYOYE細胞を、本発明の抗CD40抗体(21.4.1)、またはアイソタイプをマッチさせた抗体(抗KLH)と、完全RPMI培地中で24時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、25 mgマイトマイシンC(Sigma)/7 ml培地で60分間処理した。次にこれらの細胞を、単離ヒトT細胞と1：100の比で6日間37℃(5％ CO2)でインキュベートした。次にT細胞を回収し、洗浄し、新鮮なクロム51(New England Nuclear、Boston、MA)で標識したJIYOYE細胞に対するCTL活性のレベルを決定した。CTLの比活性を、％比細胞溶解＝(細胞溶解Jy(cpm)−自然細胞溶解(cpm))/(総細胞溶解(cpm)−自然細胞溶解(cpm))として計算した。
図5に示すように、本発明の抗CD40抗体(21.4.1)は、抗体で処理したJy細胞に対する免疫原性を有意に高めた。
実施例XI
動物の腫瘍モデル
本発明の手順で作製した抗CD40抗体の抗腫瘍活性をさらに調べるために、本発明者らは、SCIDベージュマウスモデルを設計し、抗体がインビボで腫瘍成長に及ぼす作用を検討した。
本発明者らは、Charles RiverからSCIDベージュマウスを入手し、使用の1週間前から順化させた。本発明者らは、腫瘍細胞(Daudi細胞(ATCC CCL 213)、CD40(-)K562細胞(ATCC CCL 243)、およびCD40(+)Raji細胞(ATCC CCL 86)、BT474乳癌細胞(ATCC HTB 20)、またはPC-3前立腺細胞(ATCC CRL 1435))を1×107個の細胞/個体の濃度となるように皮下注射した。場合によっては、本発明者らは、同じヒトドナーに由来するT細胞(5×105)、および樹状細胞(1×105)を、腫瘍細胞とともに注射した。本発明者らはまた、本発明の抗CD40抗体、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を腹腔内に、腫瘍注射の直前に注射した(1回のみの注射)。次に本発明者らは腫瘍成長を測定した。具体的な実験の内容については後述する。
1つの実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(21.4.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に腹腔内に10 mg/kgの用量で注射した(1回のみの注射)。腫瘍細胞(Daudi細胞)を1×107個/個体の濃度で皮下に注射した。本発明者らは、移植後17日、19日、20日、21日、25日、26日、27日、および28日の時点でキャリパーを用いて、ヒトT細胞および樹状細胞の存在下で腫瘍の成長を測定した。図6に示すように、抗CD40抗体は腫瘍成長を約［60］％抑制した。
別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(21.4.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に0.1 mg/kg、1 mg/kg、または10 mg/kgの用量で腹腔内に注射した(1回のみの注射)。腫瘍細胞(K562細胞)は、1×107細胞/個体の濃度で皮下注射した。この実験では、本発明者らは、同じヒトドナーに由来するT細胞(5×105個)および樹状細胞(1×105個)を、腫瘍細胞とともに注射した。本発明者らは、移植後17日、19日、20日、21日、25日、26日、27日、および28日の時点で、キャリパーを用いて腫瘍の成長を測定した。図7に示すように、抗CD40抗体は腫瘍の成長を60〜85％抑制した。
別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(21.4.1、23.29.1、もしくは3.1.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に腹腔内に注射した(1回のみの注射)。アイソタイプをマッチさせた対照抗体、および抗体21.4.1は1 mg/mlの用量で注射した。抗体23.29.1および3.1.1を1、0.1、0.01、0.001、または0.0001 mg/kgの用量で注射した。腫瘍細胞(K562細胞)を1×107細胞/個体の濃度で皮下に注射した。この実験では、本発明者らは、同じヒトドナーに由来するT細胞(5×105個)、および樹状細胞(1×105個)を、腫瘍細胞とともに注射した。次に本発明者らは、移植後28日の時点で、キャリパーを用いて腫瘍の成長を測定した。この実験の結果を図8および図9に示す。図の各点は、各個体で得られた測定値を示す。
別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(21.4.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に腹腔内に注射した(1回のみの注射)。抗体は1、0.1、0.01、0.001、または0.0001 mg/kgの用量で注射した。腫瘍細胞(Raji細胞)を1×107細胞/個体の濃度で皮下に注射した。一部の個体に関しては、本発明者らは、同じヒトドナーに由来するT細胞(5×105個)、および樹状細胞(1×105個)を、腫瘍細胞とともに注射した。次に本発明者らは、移植後28日の時点で、キャリパーを用いて腫瘍の成長を測定した。この実験の結果を図10に示す。図の各点は、各個体で得られた測定値を示す。
さらに別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(21.4.1、23.28.1、3.1.1、もしくは23.5.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に腹腔内に注射した(1回のみの注射)。抗体は、1 mg/kgまたは0.1 mg/kgの用量で注射した。腫瘍細胞(Raji細胞)を、1×107細胞/個体の濃度で皮下に注射した。次に本発明者らは、移植後28日の時点で、キャリパーを用いて腫瘍の成長を測定した。この実験の結果を図11に示す。図の各点は、各個体で得られた測定値を示す。
さらに別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(21.4.1、23.29.1、もしくは3.1.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に腹腔内に注射した(1回のみの注射)。抗体は1 mg/kgの用量で注射した。腫瘍細胞(BT474乳癌細胞)を、1×107細胞/個体の濃度で皮下に注射した。本発明者らは、同じヒトドナーに由来するT細胞(5×105個)、および樹状細胞(1×105個)を、腫瘍細胞とともに注射した。次に本発明者らは、移植後39日の時点で、キャリパーを用いて腫瘍の成長を測定した。図12に示すように、全ての抗体が乳癌の腫瘍成長を抑制した。図の各点は、各個体で得られた測定値を示す。
さらに別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体(3.1.1)、またはアイソタイプをマッチさせた対照(抗KLH)を、腫瘍注射の直前に腹腔内に注射した(1回のみの注射)。抗体は1 mg/kgの用量で注射した。腫瘍細胞(PC-3前立腺腫瘍細胞)を1×107細胞/個体の濃度で皮下に注射した。次に本発明者らは、移植後41日の時点で、キャリパーを用いて腫瘍の成長を測定した。図13に示すように、抗CD40抗体は、前立腺腫瘍の成長を約60％抑制した。図の各点は、各個体で得られた測定値を示す。
実施例XII
Daudi腫瘍細胞を注射し、本発明の抗CD40抗体で処理したSCIDベージュマウスの生存
別の実験では、本発明者らは、本発明の抗CD40抗体、またはアイソタイプをマッチさせた対照を、腫瘍注射の直前に腹腔内に注射した(1回の注射)。抗体は1 mg/kgまたは0.1 mg/kgの用量で注射した。腫瘍細胞(Daudi細胞)を5×106細胞/個体の用量で静脈内に注射した。次に本発明者らは動物の生存をモニタリングした。図14に示すように、検討した全ての抗CD40抗体が、腫瘍を注射したマウスの生存期間を少なくとも6日間延長した。
表31に、実施例XIに記載された、さまざまな固形腫瘍モデルにおける抗CD40抗体のED50を列挙する。表31には、SCIDマウスにおける、いくつかの本発明の抗CD40抗体のインビボにおける抗腫瘍活性をまとめてある。また同じ表に、実施例XIIに記載されたDaudi全身性腫瘍モデルにおける抗CD40抗体のED50を記載した。
(表３１)SCIDマウスを用いたさまざまなインビボ腫瘍モデルにおける本発明の抗CD40抗体のED50
Figure 0005848232
ND＝実施せず。
実施例XIII
BIAcoreによる完全ヒト抗CD40抗体の親和定数(KD)の決定
本発明者らは、BIAcore 3000装置を用いて、表面-プラズモン共鳴による、精製抗体の親和性の測定を製造業者のプロトコルにしたがって実施した。
バイオセンサー生物特異的相互作用解析装置(BIAcore)は、表面プラズモン共鳴を利用して、CM5センサーチップ上における分子間相互作用を測定する。センサーチップのデキストラン側と分子の相互作用によって生じる、2種類の溶媒、ガラス、およびカルボキシメチル化デキストラン間における屈折率の変化を測定して、製造業者のアプリケーション・ノートに詳細が記載された、任意の反射単位(RU)の変化として表す。
センサーチップ上のフローセルのカルボキシメチル化デキストラン表面を、0.2 MのN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドによって媒介される7分間の、0.05 MのN-ヒドロキシスクシンイミドの誘導体化によって活性化させた。10 mM 酢酸ナトリウム(pH 3.5)中に5 μg/mlの濃度のCD40-Ig融合タンパク質(実施例Iに記載)を5 μl/分の速度で手動でフローセルに注入し、フローセル表面に所望量のRUで共有結合を介して固定した。反応しなかったN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、1 Mの塩酸エタノールアミン、pH 8.5を用いて失活させた。固定化に続いて、フローセルから、反応しなかった材料、または弱く結合した材料を、5 μlの50 mM NaOHの5回の再生注入により、安定なベースラインが得られるまで除いた。高密度表面であるフローセル2は、表面調製後に約300 RUと測定され、また低密度表面であるフローセル3は、約150 RUと測定された。活性化されたブランク表面であるフローセル1の場合は、35 μlの10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液を抗原に代えて固定化中に注入した。フローセル4は、無関係の抗原対照であるCTLA4-Igを約450 RUの固定化状態で含むものとした。
各抗体の段階希釈を100 μg/ml〜0.l μg/mlの濃度範囲でhalf logで調製した。フロー速度を5 μl/分に設定し、25 μlの各濃度点の試料をセンサーチップ上に注入した(注入した各濃度の抗体間で5 μlの50 mM NaOHの再生注入を行った)。得られたデータはBIAevaluation 3.0ソフトウェアで解析した。
逆方向の動態実験では、抗体21.4.1を、上述のプロトコルでセンサーチップ表面に固定した。抗KLHを対照抗体表面として使用した。抗原としてCD40-Ig融合タンパク質を100 μg/ml〜0.1 μg/mlの濃度範囲で注入した。
表32に、本発明の代表的な抗CD40抗体の親和性の測定値を示す：
(表３２)本発明の抗CD40抗体の親和性測定値
Figure 0005848232
実施例XIV
抗CD40抗体のエピトープマッピング
結合アッセイ法を、プロテインAで精製したCD40-ヒトIgG1 Fc融合抗原を用いて実施した。ヒトCD40-IgG1 Fc融合タンパク質は、Pfizer社によってクローニングされた。ヒトCD40 IgG1融合タンパク質を哺乳類細胞株で発現させ、プロテインAカラムで精製した。融合抗原の純度をSDS/PAGEで評価した。
CD40は、典型的なI型膜貫通タンパク質の構造を有する。成熟型分子は277アミノ酸を含む。CD40の細胞外ドメインは4つのTNFR様のシステインに富むドメインからなる。これについては例えばNeismithおよびSprang、TIBS 23：74-79(1998)；van KootenおよびBanchereau、J. Leukocyte Biol. 67：2-17(2000)；Stamenkovicら、EMBO J. 8：1403-1410(1989)を参照されたい。
還元型ヒトCD40および非還元型ヒトCD40に対する抗CD40抗体の結合：
CD40の細胞外ドメインは、4つのシステインに富むドメインからなるので、還元剤によって分子内結合が破壊されると、抗体の反応性が変化する可能性がある。還元剤による分子内結合の破壊が、本発明の一部の抗CD40抗体の反応性を変化させるか否かを判定するために、精製したCD40-hIgGを、非還元(NR)条件または還元(R)条件でSDS/PAGE(4〜20％ゲル)にロードした。SDS/PAGEはLaemmliの方法で、ミニゲルシステムを用いて行った。分離後のタンパク質をニトロセルロース膜上にトランスファーした。膜を5％(w/v)無脂肪乾燥ミルクを含むPBSで少なくとも1時間ブロックした後に展開し、各抗体で1時間かけてプローブ処理を行った。抗CD40抗体を、HRP-結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン(希釈率1：8,000；カタログ番号A-8667、Sigma社)で検出した。膜を、エンハンスド・ケミルミネセンス(Enhanced Chemiluminescence; ECL(登録商標)；Amersham Bioscience)を用いて、製造業者の指示書にしたがって展開した。
次にウェスタンブロットを対象に、21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1(1 μg/ml)の本発明の4種類の抗CD40抗体で、また続けてHRP結合ヤギ抗ヒトIgG(希釈率1：8000)でプローブ処理を行った。この実験の結果を図15に示す。結果から、抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1が、非還元型CD40とは結合するが、還元型CD40とは結合しないこと、したがって抗体が立体構造エピトープを認識することがわかる。
ヒトCD40ドメイン欠失タンパク質に対する抗CD40抗体の結合：
CD40の細胞外領域は4つのTNFR様反復ドメイン(D1〜D4と呼ばれる)を含む。これについては例えばNeismithおよびSprang、TIBS 23：74-79(1998)；van KootenおよびBanchereau、J. Leukocyte Biol. 67：2-17(2000)；Stamenkovicら、EMBO J. 8：1403-1410(1989)を参照されたい。図16に、マウスおよびヒトのCD40ドメインD1〜D4のアミノ酸配列を示す。エピトープの提示におけるCD40分子のさまざまな領域の寄与を調べるために、いくつかのドメイン欠失変異体を構築した。
ヒトCD40欠失構築物を作製するために、ヒトCD40の細胞外ドメイン全体(アミノ酸1〜193)を、ヒトB細胞(CD19+)のcDNA(Multiple Tissue cDNA Panel、カタログ番号K1428-1、Clontech社)から、配列特異的なプライマーを用いたPCRで増幅し、6×HisタグをC末端に加えた。ヒトCD40の5'プライマー
Figure 0005848232
をさまざまな組み合わせの3'プライマーと用いて、完全長および切断型のCD40分子をクローニングした。ヒトCD40の完全長の細胞外ドメインのクローニングには、3'プライマー
Figure 0005848232
を使用した。ヒトCD40のD1〜D3ドメインのクローニングには3'プライマー
Figure 0005848232
を使用した。CD40のD1〜D2ドメインのクローニングには3'プライマー
Figure 0005848232
を使用した。切断型CD40のcDNAの以上の構築物を構築した後に、pCR3.1ベクター(Invitrogen)を用いて293F細胞株で発現させた。CD40-6×His融合タンパク質をニッケルカラムから溶出して精製した。
これら4種類の欠失変異体のアミノ酸配列を表33に示す。
(表３３)CD40 Hisタグ融合タンパク質
Figure 0005848232
以上のヒトCD40欠失構築物を発現させるために、構築物をpCR3.1ベクター(Invitrogen)にクローニングし、発現を、さまざまな安定な293F細胞株で、また一過的にトランスフェクトした同細胞株で評価した。一過的にトランスフェクトした293F細胞に由来する上清を、抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1との結合に関してELISAおよびウェスタンブロットで解析した。
さまざまなCD40構築物をトランスフェクトした293F細胞に由来する上清を用いてELISAアッセイ法を実施した。ELISAプレートを、ELISAプレートコーティング緩衝液で1 μg/mlになるように希釈したヤギ抗ヒトCD40ポリクローナル抗体(R&Dカタログ番号AF 632)、またはヤギ抗マウスCD40ポリクローナル抗体(R&Dカタログ番号AF 440)でコーティングした。293F細胞におけるCD40構築物の発現を、ビオチン化ヤギ抗ヒトCD40(R&Dカタログ番号AF 632)、ヤギ抗マウスCD40(R&Dカタログ番号AF 440)、またはHRP結合抗His(C末端)抗体(Invitrogen、カタログ番号46-0707)で検出して確認した。抗CD40ヒト抗体の結合を、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG(FC特異的、カタログ番号H10507)(希釈率1：2,000)で検出した。表34に示す結果から、mAb 21.4.1、23.28.1、および23.29.1によって認識される、全てではないものの大半のエピトープがCD40のD1〜D2領域に位置すること、またmAb 24.2.1に対するエピトープが、少なくとも部分的にはドメインD3〜D4に位置することがわかる。ヒトCD40ウサギのFc融合タンパク質を対照として用いることで、抗体結合の特異性が確認された。
(表３４)ELISA：CD40欠失変異体に対する抗体の結合
Figure 0005848232
CD40欠失構築物も、ウェスタンブロット解析で解析した。結果を表35に示す。ELISAの結果から、抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1の結合部位がドメインD1〜D3を含むことがわかる。この結果はまた、抗体21.4.1、23.25.1、および23.29.1の結合部位がドメインD1〜D2を含むこと、ならびに抗体24.2.1の結合部位がドメインD3を含むことも示している。
(表３５)ウェスタンブロット：CD40欠失変異体に対する抗体の結合
Figure 0005848232
マウスCD40に対する抗CD40抗体の結合：
本発明者らは、抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1のもつ、対マウスCD40結合能力を決定することとした。
この実験では、マウスCD40を、マウスのB細胞のcDNAから増幅した。マウスCD40(D1〜D3)-6×His融合タンパク質を、転写誘導用にCMVプロモーターを備えたpCR3.1にクローニングした。マウスCD40の細胞外ドメインのクローニングには5'プライマー
Figure 0005848232
を使用した。マウスCD40のD1〜D3ドメインのクローニングには3'プライマー
Figure 0005848232
を使用した。マウスおよびヒトのcDNA構築物で、293F細胞を一過的にトランスフェクトした。組換え型CD40の発現を、マウスおよびヒトのCD40、抗His抗体、および抗CD40抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1に対するポリクローナル抗体を用いたELISAで検出した。これらの実験の結果を表36に示す。この実験から、全ての抗体がヒトCD40に特異性を有し、マウスCD40と交差反応しないことがわかる。
(表３６)マウスおよびヒトのCD40の交差反応
Figure 0005848232
ヒト/マウスキメラCD40に対する抗CD40抗体の結合：
抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1はマウスCD40に結合しないので、本発明者らは、これらの抗体のエピトープを決定的にマップするために、ヒト/マウスキメラCD40タンパク質を構築した。
ヒトとマウスのCD40キメラタンパク質のインフレーム融合体の構築に関して、本発明者らは、ヒトおよびマウスのCD40の両方のcDNA中の同一の場所における、CD40ドメインの境界において1か所しかない制限酵素切断部位を利用した。CD40のさまざまなcDNA構築物を、ドメイン1の末端に位置するEcoRI制限酵素切断部位(ヌクレオチド244位、アミノ酸64位)、ならびにドメイン2の末端に位置するBanI制限酵素切断部位(ヌクレオチド330位、アミノ酸94位)を用いて作製した(図17)。
さまざまなCD40ドメインをPCRで増幅して連結した。この方法で、マウスCD40のさまざまなドメインが、ヒトCD40の相同ドメインと置換された。得られた構築物を図18に示す。
次に本発明者らは、抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1、および24.2.1が、マウス/ヒトキメラCD40タンパク質に結合可能か否かをELISAで判定した。この実験の結果を表37に示す。表37からわかるように、mAb 21.4.1および23.25.1は、部分的にD1に、また部分的にD2に位置するエピトープを認識し；mAb 23.29.1は、完全ではないものの大部分がD2に位置するエピトープを認識し；またmAb 24.2.1は、D2およびD3に位置するエピトープを認識する。
(表３７)キメラCD40タンパク質に対する抗体結合
Figure 0005848232
本明細書で引用された全ての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願が具体的に、また個別に参照として本明細書に組み入れられることが示されているように、参照として本明細書に組み入れられる。前述の発明は、明瞭な理解を促すことを目的として説明および実施例によって、ある程度詳細に記載されているが、変更および修飾が本発明の精神および範囲から解離することなく加えられる場合があることを、本発明の技術分野の当業者であれば容易に理解すると思われる。

Claims (16)

  1. ヒトCD40に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号：92のアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖が配列番号：94のアミノ酸配列を含む、前記抗体または抗原結合部分。
  2. (a)シグナル配列を欠く配列番号：6に記載のアミノ酸配列であって、成熟配列において、残基78位がアラニンからスレオニンに変更され、残基88位がバリンからアラニンに変更され、かつ残基97位がバリンからアラニンに変更されている、前記アミノ酸配列：および
    (b)シグナル配列を欠く配列番号：8に記載のアミノ酸配列であって、成熟配列において、残基4位がロイシンからメチオニンに変更され、残基83位がロイシンからバリンに変更されている、前記アミノ酸配列
    を含む、モノクローナル抗体。
  3. 重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列がそれぞれ、重鎖配列の78番目の残基がアラニンからスレオニンに置換、88番目の残基がバリンからアラニンに置換、97番目の残基がバリンからアラニンに置換され；かつ軽鎖配列の4番目の残基がロイシンからメチオニンに置換、83番目の残基がロイシンからバリンに置換されている抗体3.1.1（ATCCアクセッションナンバーPTA-3600）の重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列である、モノクローナル抗体。
  4. a)免疫グロブリンG(IgG)分子であるか、もしくはその抗原結合部分であるか；または
    b)Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、単鎖抗体、もしくは二重特異性抗体である、
    請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分。
  5. 請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  6. 処置を必要とするヒトの、癌を治療するもしくは免疫応答を増強させるための請求項5記載の薬学的組成物。
  7. 請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分を産生する、単離された細胞株。
  8. 請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  9. 以下からなる群から選択される一又は複数のヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の単離された核酸分子：
    (a) 重鎖配列の78番目の残基がアラニンからスレオニンに置換、88番目の残基がバリンからアラニンに置換、97番目の残基がバリンからアラニンに置換されている抗体3.1.1（ATCCアクセッションナンバーPTA-3600）の重鎖またはその抗原結合部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    (b) 軽鎖配列の4番目の残基がロイシンからメチオニンに置換、83番目の残基がロイシンからバリンに置換されている抗体3.1.1（ATCCアクセッションナンバーPTA-3600）の軽鎖またはその抗原結合部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    (c) 重鎖配列の78番目の残基がアラニンからスレオニンに置換、88番目の残基がバリンからアラニンに置換、97番目の残基がバリンからアラニンに置換され；かつ軽鎖配列の4番目の残基がロイシンからメチオニンに置換、83番目の残基がロイシンからバリンに置換されている抗体3.1.1（ATCCアクセッションナンバーPTA-3600）の、重鎖またはその抗原結合部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖またはその抗原結合部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    (d) 配列番号：92または94のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    (e) 配列番号：92のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および配列番号：94のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    (f) 配列番号：91または93のヌクレオチド配列；および
    (g) 配列番号：91のヌクレオチド配列および配列番号：93のヌクレオチド配列。
  10. 請求項8または9記載の核酸分子を含むベクター。
  11. 請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
  12. 請求項11記載の宿主細胞または請求項7記載の細胞株を、適切な条件下で培養する段階、および該抗体もしくは抗原結合部分を回収する段階を含む、抗CD40抗体またはその抗原結合部分を作製する方法。
  13. 請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列を発現する、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物。
  14. 請求項13記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物から抗体を単離する段階を含む、ヒトCD40に特異的に結合し、活性化する抗体またはその抗原結合部分を作製する方法。
  15. 医薬を製造するための、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分の使用。
  16. 医薬が、処置を必要とするヒトの、癌を治療するためまたは免疫応答を増強するためである、請求項15記載の使用。
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