WO2021215462A1 - 改良ペプチドワクチン - Google Patents

改良ペプチドワクチン Download PDF

Info

Publication number
WO2021215462A1
WO2021215462A1 PCT/JP2021/016133 JP2021016133W WO2021215462A1 WO 2021215462 A1 WO2021215462 A1 WO 2021215462A1 JP 2021016133 W JP2021016133 W JP 2021016133W WO 2021215462 A1 WO2021215462 A1 WO 2021215462A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
arg
seq
asp
cys
gly
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/016133
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
由貴江 笹倉
徳弘 中村
雄二 三嶋
典子 松本
扶美子 磯田
祐二 伊東
Original Assignee
ブライトパス・バイオ株式会社
国立大学法人 鹿児島大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ブライトパス・バイオ株式会社, 国立大学法人 鹿児島大学 filed Critical ブライトパス・バイオ株式会社
Priority to CN202180044705.1A priority Critical patent/CN115702002A/zh
Priority to JP2022517065A priority patent/JPWO2021215462A1/ja
Priority to EP21793632.7A priority patent/EP4140501A1/en
Priority to US17/996,866 priority patent/US20230210967A1/en
Publication of WO2021215462A1 publication Critical patent/WO2021215462A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a new type of cancer peptide vaccine for the treatment or prevention of cancer. More specifically, it relates to a cancer peptide vaccine that can be specifically delivered to immune cells to which the cancer peptide vaccine is to be contacted.
  • Cancer peptide vaccine therapy is a cancer treatment method that aims to prevent or treat cancer by activating and proliferating a specific immune response against cancer antigens expressed in cancer cells in the patient's body.
  • An antigen consisting of a peptide that is a part of a cancer antigen protein is administered as a vaccine.
  • Non-Patent Document 1 Fifis T. et al., Vaccine. 2004 Nov 25; 23 (2): 258-66.
  • some cancer vaccines have been reported to have exploratory efficacy such as immunoinduction and prolongation of survival in early clinical trials
  • Non-Patent Document 2 Cancer Sci. 2018 Sep; 109 (9): 2660- 2669
  • Non-Patent Document 3 Cancer Sci. 2017 Dec; 108 (12): 2430-2437
  • An object of the present invention is to provide a peptide vaccine in which a peptide vaccine is complexed so that it can be specifically delivered to a specific immune cell surface. It is also an object of the present invention to provide a method for specifically delivering a peptide vaccine to a specific immune cell surface.
  • an IgG-binding peptide capable of binding to IgG which is characterized by being an antibody against a molecule on the surface of a specific immune cell (for example, dendritic cell). It was shown that the above-mentioned problems can be solved by providing a combined peptide vaccine.
  • Each of Xaa3, Xaa4, Xaa5, and Xaa8 is an arbitrary amino acid other than Cys.
  • Xaa6 is Lys, Cys, Asp, Glu, Arg, Leu, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid.
  • Xaa13 and Xaa14 are independently selected from the group consisting of Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, and Cys],
  • Xaa4 is selected from the group consisting of Ala, Ser, and Thr.
  • Xaa5 is Tyr or Trp, The peptide vaccine according to any one of [1] to [4].
  • the peptide vaccine according to any one of [8] to [10].
  • the peptide vaccine is a cancer vaccine selected from the group consisting of cancer-related antigens, cancer neoantigens, and cancer individualized neoantigens;
  • Each of Xaa3, Xaa4, Xaa5, and Xaa8 is an arbitrary amino acid other than Cys.
  • Xaa6 is Lys, Cys, Asp, Glu, Arg, Leu, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid.
  • Xaa13 and Xaa14 are independently selected from the group consisting of Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, and Cys], The method according to any one of [12] to [14], which is selected from the group consisting of; [16]: Xaa4 is selected from the group consisting of Ala, Ser, and Thr. Xaa5 is Tyr or Trp, The peptide vaccine according to any one of [12] to [15].
  • the peptide vaccine disclosed in the present invention in combination with an IgG-binding peptide can efficiently deliver the peptide vaccine to the surface of a specific immune cell (for example, dendritic cell), enhance its activation, and produce a peptide.
  • a specific immune cell for example, dendritic cell
  • the effectiveness of the vaccine can be enhanced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a complex (peptide vaccine-IgG complex) in which a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide is bound to IgG via an IgG-binding peptide portion.
  • FIG. 3 shows the results of the affinity analysis of the H-2Kb-binding OVA-derived peptides having various IgG-binding peptides prepared in Example 3 for IgG, in which the affinity for IgG was examined in vivo. It is a figure which shows.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a complex (peptide vaccine-IgG complex) in which a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide is bound to IgG via an IgG-binding peptid
  • FIG. 4 shows, in vitro, whether or not the antibody-peptide vaccine complex (covalent bond type, non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the immunoinduction test (Whole PBMC method).
  • FIG. 5 shows, in vitro, whether or not the antibody-peptide vaccine complex (covalent bond type, non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the immunity induction test (Monocyte derived peptide cell (MDDC) method).
  • MDDC Monocyte derived peptide cell
  • FIG. 6 shows a wild type in which it was examined in vivo whether or not the antibody-peptide complex was taken up by dendritic cells when the antibody-peptide complex using the peptide vaccine prepared in Example 3 was subcutaneously administered. It is a figure which shows the result of the uptake evaluation of a peptide into a dendritic cell in a mouse.
  • FIG. 7 is a diagram showing a schedule of immune induction tests in wild-type mice.
  • FIG. 8 shows immunoinduction in wild-type mice examined in vivo to see if the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the test.
  • FIG. 7 is a diagram showing a schedule of immune induction tests in wild-type mice.
  • FIG. 8 shows immunoinduction in wild-type mice examined in vivo to see if the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has
  • FIG. 9 shows immunoinduction in wild-type mice examined in vivo to see if the antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the test (comparative test of antibody-vaccine mixture ratio).
  • FIG. 10 shows immunoinduction in wild-type mice examined in vivo to see if the antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the test (dose-dependent test).
  • FIG. 11 shows the results of a cancer-bearing mouse test in vivo, which examined whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 had an antitumor effect. It is a figure which shows. In this figure, the antibody: antigen peptide-IgG binding peptide group showed a high tumor growth inhibitory effect even in vivo.
  • FIG. 12 shows the results of a cancer-bearing mouse test in vivo, which examined whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 had an antitumor effect. It is a figure which shows.
  • FIG. 13 is a diagram showing a schedule of immune induction tests in wild-type mice.
  • FIG. 14 shows whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity in a test system with higher clinical extrapolability.
  • FIG. 15 shows the result of the immunity induction test (neoantibody model) in a wild type mouse.
  • the antibody: antigen-IgG binding peptide group showed the highest immunoinducing effect.
  • FIG. 15 is a diagram showing a schedule of immune induction tests in wild-type mice.
  • FIG. 16 shows whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) combined with the CD40 antibody or PD-L1 antibody using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the immunity induction test in the wild type mouse examined in vivo.
  • FIG. 17 shows whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) combined with the CD40 antibody or PD-L1 antibody using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the immunity induction test in the wild type mouse examined in vivo.
  • FIG. 17 shows whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) combined with the CD40 antibody or PD-L1 antibody using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. It is a figure which shows the result of the immunity induction test in the wild type mouse examined in vivo.
  • FIG. 18 shows whether or not the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) prepared in combination with the anti-PD-L1 antibody using the peptide vaccine prepared in Example 3 has an antitumor effect. It is a figure which shows the result of the cancer-bearing mouse test examined in vivo. In this figure, the antibody: antigen peptide-IgG binding peptide group showed a high tumor growth inhibitory effect even in vivo.
  • FIG. 19 shows the results of a cancer-bearing mouse test in vivo, which examined whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 had an antitumor effect. It is a figure which shows.
  • FIG. 20 is a diagram showing a schedule of immune induction tests in wild-type mice.
  • FIG. 21 shows in wild mice examined whether an antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) containing a non-synonymous somatic mutation sequence of a mouse tumor cell line has an antitumor effect. It is a figure which shows the result of the immunoinduction test.
  • Cancer vaccine All or part of a protein (cancer antigen) whose expression is enhanced in cancer cells or expressed only in cancer cells is administered as a drug to induce immunity to the cancer antigen.
  • a therapeutic drug that eliminates cancer (B) Dendritic cells: Immune cells that initially recognize foreign substances such as cancer antigens when inducing the immune system; (C) T cells: Immune cells that are endowed with the function of specifically killing cancer cells based on the information of cancer antigens recognized by dendritic cells; (D) CD40: One of the proteins expressed on the surface of antigen-presenting cells such as dendritic cells. Binding of agonist molecules such as ligands can enhance the function of antigen-presenting cells; (E) Antibody vaccine: A complex of vaccine and antibody.
  • the present invention discloses, as one aspect, the invention of a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide (Fig. 1).
  • the peptide vaccine may be used as a vaccine against a pathogen, a vaccine against cancer (cancer vaccine), or the like, as long as it is a vaccine using a peptide having antigenicity, the origin of the antigen may be any. can.
  • an antigenic peptide of the pathogen such as an HIV vaccine, an HBV vaccine, or an RSV vaccine can be used.
  • a cancer vaccine as a peptide vaccine
  • brain tumor myeloma, gastric cancer, colonic rectal cancer, uterine cancer, head and neck cancer, gastric cancer, colonic rectal cancer, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, middle Cancer-specific antigenic peptides such as spleen, ovarian cancer, prostate cancer and melanoma
  • middle Cancer-specific antigenic peptides such as spleen, ovarian cancer, prostate cancer and melanoma
  • an antigenic peptide derived from a cancer antigen which is considered to be suitable for immunotherapy, can be used as an antigen for a cancer vaccine.
  • ⁇ Those that are expressed in specific tumor cells but only in the testis in normal tissues (NY-ESO-1, MAGEA1-4, PRAME, SSX2, CT83, etc.), ⁇ Tumor cells expressed at much higher levels than normal cells (WT1, HER2, CEA, MUC1, cyclin B1, EGFR, mesothelin, telomerase, etc.), -Expressed in tumor cells and expressed only in cells of a limited lineage of normal tissues (MART1, PSA, PSMA, CD19, GP100, etc.), -Although it is expressed in normal tissues, it is specially modified in tumor cells (MUC1T, LSP1, etc.), ⁇ New proteins (BCR-ABL1, HRAS, KRAS, etc.) that occur specifically in diseases due to abnormalities such as gene translocations and point mutations commonly observed in diseases.
  • -It can be selected from a group of peptides derived from a mutant protein (neoantigen) that occurs only in tumor cells as a result
  • the peptide vaccine in the present invention is a peptide vaccine by utilizing IgG to deliver the peptide vaccine to the target immune cells for the purpose of compensating for the disadvantages of such a commonly observed peptide vaccine.
  • IgG IgG-binding peptide
  • IgG-binding peptide used in the present invention those known as capable of binding IgG and the peptide of the peptide vaccine can be used, and for example, those described in WO2016 / 186206 (Patent Document 1). (Type 1) and those described in WO2018 / 230257 (Patent Document 2) (Type 2) can be used, but are not limited thereto. In the present invention, these IgG-binding peptides can be provided in combination with a peptide vaccine.
  • the IgG-binding peptide that can be used in one embodiment of the present invention is ⁇ Type 1> Xaa1 Xaa2 Xaa3 Cys Xaa4 Xaa5 His Xaa6 Gly Xaa7 Leu Val Trp Cys Xaa8 Xaa9 Xaa10 (SEQ ID NO: 1) [At SEQ ID NO: 1, Each of Xaa1, Xaa2, Xaa9, and Xaa10 is or does not exist with any amino acid other than Cys, or Xaa1 and Xaa2 are combined to form Arg Arg Gly Pro.
  • Each of Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa8, is any amino acid other than Cys, more preferably Xaa4 may be selected from the group consisting of Ala, Ser, and Thr, and Xaa5 is Tyr or Trp.
  • Xaa6 is Lys, Cys, Asp, Glu, Arg, Leu, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid.
  • Xaa13 and Xaa14 are independently selected from the group consisting of Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, and Cys] Those selected from the group consisting of can be used, and these IgG-binding peptides can be used in combination with a peptide vaccine.
  • the IgG-binding peptide that can be used in one embodiment of the present invention is ⁇ Type 1>: Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr (SEQ ID NO: 3); Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 4); Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser (SEQ ID NO: 5); Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His (SEQ ID NO: 6); Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 7); Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 3);
  • those particularly useful in the present invention are IgG-binding peptides in which Xaa6 is Arg, Lys, or Leu, and for example, as a specific amino acid sequence of such a useful IgG-binding peptide, Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 25) or Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 26) Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 39) Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His (SEQ ID NO: 40) Can be mentioned.
  • the IgG-binding peptide of the present invention is preferably for binding to human IgG (for example, any IgG subclass of human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) or humanized IgG. However, it can also be used against IgG in animals other than humans, such as rats, mice, and rabbits.
  • Any method may be used for combining the IgG-binding peptide with the peptide vaccine, and a conventional liquid phase synthesis method, a peptide synthesis method such as a solid phase synthesis method, a peptide synthesis by an automatic peptide synthesizer, or the like is used. Then, it is produced by a method of combining an IgG-binding peptide and a peptide of a peptide vaccine by producing one continuous peptide, or a method of combining a separately synthesized IgG-binding peptide and a peptide of a peptide vaccine via a linker. be able to.
  • the peptide may be produced by a gene recombination method using a nucleic acid encoding the peptide of the present invention.
  • the target peptide is produced by incorporating the IgG-binding peptide of the present invention and the peptide of the peptide vaccine into an expression vector, introducing DNA encoding the amino acid sequence of one continuous peptide, introducing the peptide into a host cell, and culturing the peptide. You can also do it.
  • the IgG-binding peptide and the peptide of the peptide vaccine are synthesized as one continuous peptide as a method of combining.
  • a method of combining the target sequence of the peptide vaccine combined with the IgG-binding peptide is designed, and a peptide synthesizer (for example, Symphony® X manufactured by Gyros Protein Technologies) is used.
  • a peptide synthesizer for example, Symphony® X manufactured by Gyros Protein Technologies
  • Contaminants contained when the peptide is synthesized can be subjected to, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography and other chromatography, sulfur fractionation, ultrafiltration, and immunoadsorption.
  • the peptide can be purified by removing it by a method or the like. Equipment such as high performance liquid chromatography (HPLC) can be used for purification by chromatography.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the present invention is characterized in providing a complex in which a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide is bound to IgG via an IgG-binding peptide moiety (FIG. 2).
  • the IgG used in the present invention can be selected according to the immune cell to which the peptide vaccine is to be delivered, and in the present invention, the IgG intended to bind to the target immune cell or the target IgG or the like for binding to immune cells and activating the immune cells can be used.
  • anti-CD40 antibody IgG
  • anti-PD-L1 antibody IgG
  • anti-DEC205 antibody IgG
  • anti-DCIR antibody IgG
  • anti-Mannose reseptor antibody IgG
  • Anti-DC-SIGN antibody IgG
  • anti-CD11c antibody IgG
  • anti-Dectin-1 antibody IgG
  • an IgG known as an IgG for a target substance characteristic of an immune cell delivering a peptide vaccine can be used, and dendritic cells can be used.
  • Antibodies targeting CD40 (clinically developed by J & J, Roche, Seattle Genetics, etc.), antibodies targeting DEC205 (clinically developed by Celldex), and antibodies targeting DCIR (clinically developed by Celldex) Ascend Biopharmaceuticals (clinically developed by Biopharmaceuticals) etc. can be used.
  • the binding of an IgG-binding peptide moiety to IgG modifies a specific amino acid residue of the IgG-binding peptide moiety of the present invention with a cross-linking agent, and the cross-linking agent is used. This can be done by forming a crosslinked structure with a specific amino acid residue of IgG Fc.
  • peptide synthesis of a peptide vaccine combined with an IgG-binding peptide using an amino acid residue modified by the cross-linking agent is performed. It can be carried out by carrying out, or by synthesizing a peptide vaccine in combination with an IgG-binding peptide and then specifically modifying the side chain of a specific amino acid residue in the IgG-binding peptide portion.
  • the cross-linking agent that can be used for complex formation in the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art, and at least two that can bind to a specific amino acid residue of the IgG-binding peptide moiety.
  • Compounds having a site can be used, for example, at least one succinimidyl group such as disuccinimidyl glutarate (DSG), discuccinimidyl suberate (DSS), preferably at least one succinimidyl group.
  • DSG disuccinimidyl glutarate
  • DSS discuccinimidyl suberate
  • a cross-linking agent having an SS bond in addition to the above-mentioned functional group such as dithiobis (succinimidylpropionate), DSP
  • WO2016 / 186206 Patent Document 1
  • WO2018 / 230257 Patent Document 2
  • Modification of a specific amino acid residue with a cross-linking agent can be performed by selecting a combination of the cross-linking agent and a specific type of amino acid residue (WO2016 / 186206 (Patent Document 1), WO2018 / 230257 (Patent Document 1). 2)).
  • a cross-linking agent containing a succinimidyl group such as DSS or DSG
  • it reacts with the amine ( ⁇ -amino group) in the side chain of the lysine residue and the primary amine ( ⁇ -amino group) present at the N-terminal of the polypeptide.
  • the peptide vaccine of the present invention in which the IgG-binding peptide portion is modified with a cross-linking agent can bind to IgG to form a complex by mixing with IgG.
  • the conditions of this mixing step are not particularly limited as long as they are carried out under conditions where a cross-linking reaction occurs between the IgG-binding peptide moiety of the present invention modified with a cross-linking agent and IgG.
  • the cross-linking reaction is carried out by mixing the peptide vaccine of the present invention containing an IgG-binding peptide moiety modified with a cross-linking agent and IgG in an appropriate buffer at room temperature (for example, about 15 ° C to 30 ° C). Can be done.
  • room temperature for example, about 15 ° C to 30 ° C.
  • an appropriate amount of a catalyst that promotes the cross-linking reaction may be added.
  • Other reaction conditions may be appropriately adjusted.
  • the pH at the time of the reaction is pH 4.5 to 6.5 (for example, pH 5.0 to 6.0, pH 5.2 to 5.8, pH 5.4 to 5.6, or pH about 5.5).
  • conditions such as pH 6.5 to 8.5 (for example, pH 6.9 to 7.9, pH 7.2 to 7.7, pH 7.3 to 7.5, or pH about 7.4) can be selected, and the book contains an IgG-binding peptide moiety modified with a cross-linking agent.
  • the mixing ratio of the peptide vaccine of the present invention and IgG can be, for example, 1: 1 to 20: 1, 2: 1 to 20: 1 or 5: 1 to 10: 1 in terms of molar ratio, and the mixing time.
  • the (reaction time) can be, for example, 1 minute to 5 hours, 10 minutes to 2 hours, or 15 minutes to 1 hour.
  • the present invention uses a complex of the peptide vaccine of the present invention and IgG in which the above-mentioned IgG-binding peptide moiety is combined with respect to a cell having a target molecule targeted by IgG on the cell surface.
  • a method for delivering a peptide vaccine can be provided.
  • a vaccine composition for treating or preventing a target disease which comprises a complex of IgG and the peptide vaccine of the present invention in which the above-mentioned IgG-binding peptide moiety is combined.
  • the target disease to be treated / prevented by the vaccine composition of the present invention means a target from which the antigen of the peptide vaccine of the present invention is derived, and examples thereof include infectious diseases against pathogens and cancer. ..
  • the vaccine composition of the present invention can efficiently generate an antibody against the peptide vaccine. It can be a vaccine composition for inducing a vaccine, a vaccine composition for inducing activation of T cells against a peptide vaccine, or a vaccine composition for inducing cell-mediated immunity against a peptide vaccine.
  • the vaccine composition of the present invention comprises a peptide vaccine against the target disease and an IgG corresponding to an immune cell that induces an immune response desired to be induced in a patient who develops the target disease.
  • the vaccine composition of the present invention may include a peptide vaccine against the target disease and IgG depending on the immune cell that induces a favorable immune response that is desired to be induced against the target disease. can.
  • an immune response is induced when the cause of the target disease invades or occurs in the body of the subject. be able to.
  • the vaccine composition of the present invention is to deliver the peptide vaccine of the present invention to immune cells using IgG
  • parenteral administration for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, or intraperitoneal administration
  • Etc. parenteral administration
  • it can be prepared in various formulation forms as an appropriate dosage form according to the administration route.
  • the administration method and dosage form can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the sex, age, body weight, symptoms and the like of the patient.
  • the vaccine composition of the present invention can be formulated according to general knowledge in the art, including pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • the complex of the present invention when used as an injectable preparation, is dissolved in a solution containing, for example, physiological saline, a buffer solution, a glucose solution, etc., and a container adsorption inhibitor, for example, Tween80, Tween20, gelatin, etc. , Human serum albumin and the like can be used.
  • a container adsorption inhibitor for example, Tween80, Tween20, gelatin, etc.
  • Human serum albumin and the like can be used.
  • it may be freeze-dried to form a dosage form that dissolves and reconstitutes before use, and the stabilizer for freeze-drying includes, for example, sugar alcohols such as mannitol and glucose and / or sugars. Can be used.
  • Example 1 Production of anti-CD40 antibody The purpose of this example is to select dendritic cells that induce vaccine-specific T cells as immune cells for delivering the peptide vaccine of the present invention and activate the cells. , To prepare an agonist antibody against CD40 specific as its surface antigen.
  • the anti-mouse CD40 antibody was prepared as a chimeric antibody in which the variable region of an FGK45 clone known as an anti-mouse CD40 agonist antibody and the constant region of a human antibody were fused.
  • the variable region sequence of the FGK45 clone the sequence published on NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (heavy chain: AEI27236.1, light chain: AEI27235.1) was used. ..
  • pCI-neo As vectors for expression, pCI-neo, light chain expression element (EF-1 ⁇ promoter, secretory signal, light chain variable region, light chain constant region linked in tandem), heavy chain expression element (EF-1 ⁇ promoter, secretion A promoter ligated with a signal, a heavy chain variable region, and a heavy chain constant region ligated in tandem) was constructed.
  • light chain expression element EF-1 ⁇ promoter, secretory signal, light chain variable region, light chain constant region linked in tandem
  • heavy chain expression element EF-1 ⁇ promoter, secretion A promoter ligated with a signal, a heavy chain variable region, and a heavy chain constant region ligated in tandem
  • the DNA sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region were designed based on the codons optimized for the hamster expression system based on the sequences obtained from the above database.
  • a DNA sequence defining the amino acid sequence of the heavy chain constant region portion and the light chain constant region portion of a known human antibody or a variant thereof can be utilized.
  • the sequences of mutants (IgG1-lala) having L4A and L5A substitutions in the CH2 region of human IgG1 and the sequences of human IgG kappa were used as the amino acid sequences of the heavy chain constant region portion and the light chain constant region portion, respectively. ..
  • ExpiCHO cells (invitrogen A2910002) were used as cells for antibody expression. The cells were cultured using ExpiCHO Expression Medium (Gibco, A2910002), the antibody expression plasmid was transfected using ExpiCHO TM Expression System (GIbco A29129), and then cultured for 14 days to collect the culture supernatant. .. Antibodies were obtained by purifying the culture supernatant using a protein A column (MonoSpin ProA, GL Science 7510-11314).
  • the purity and binding properties of the purified antibody were confirmed based on SDS-PAGE and binding to mouse spleen cells, and it was confirmed that the desired anti-mouse CD40 agonist antibody was obtained.
  • the anti-human CD40 antibody was prepared as a chimeric antibody in which the variable region of a 21.4.1 clone known as an anti-human CD40 agonist antibody and the constant region of a human antibody were fused.
  • the sequence of the 21.4.1 clone the sequence published in Patent Document (Patent No. 4616555) was used.
  • the production of the vector for expressing the anti-human CD40 antibody and the expression / purification of the antibody were carried out by the same method as that used for the anti-mouse CD40 antibody described in (1).
  • the purity and binding properties of the purified antibody were confirmed based on SDS-PAGE and target activation ability in CD40 forced expression cells, and it was confirmed that the desired anti-human CD40 agonist antibody was obtained.
  • Example 2 Peptide production This example was carried out to prepare an antigenic peptide against various target substances as an example of the peptide vaccine of the present invention.
  • Adpgk-derived peptide sequence (ASMTNMELM [peptide (8), SEQ ID NO: 35]) (Nature. 2014 Nov 27; 515 (7528)) 17 mer peptide with: 572-6) (HLELASMTNMELMSSIV [peptide (9)], SEQ ID NO: 36) was used.
  • IgG-binding peptide sequence As an IgG-binding peptide sequence, the sequence reported in Patent Document PCT / JP2016 / 065061 (GPDCAYHRGELVWCTFH [IgG BP (1), (SEQ ID NO: 25)] or GPDCAYHKGELVWCTFH [IgG BP (2), (SEQ ID NO: 26)]), and the newly created sequence (GPDCAWHRGELVWCTFH [IgGBP (3), (SEQ ID NO: 39)] or GPDCAWHLGELVWCTFH [IgG BP (4), (SEQ ID NO: 40)]) were used. .. These sequences are those in which the peptide Xaa6 described in SEQ ID NO: 4 is Arg, Lys or Leu.
  • IgG non-binding peptide sequence a sequence in which a partial mutation was added to an IgG-binding peptide (GPDCAYHRGEAAACTFH [IgG BP (NC), SEQ ID NO: 27]) was used.
  • IgG-binding peptides are characterized in that they bind to an IgG antibody in a non-covalent bond to form a complex.
  • a vaccine peptide As a peptide for forming a peptide vaccine-antibody complex (antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type)) by non-covalent binding, a vaccine peptide is tandemly linked to the N-terminal side of the IgG-binding peptide and IgG-bound.
  • Peptide (3-1) SEQ ID NO: 30
  • peptide (7) SEQ ID NO: 34
  • 10 SEQ ID
  • a vaccine peptide is tandemly linked to the N-terminal side of the IgG non-binding peptide ([IgG BP (NC) (SEQ ID NO: 27)] above), and the peptide is present in the IgG non-binding peptide sequence.
  • Peptides in which two cysteines were crosslinked by SS bonds were synthesized [peptides (4) (SEQ ID NO: 31) and (11) (SEQ ID NO: 38)].
  • peptides were produced by chemical synthesis. Further, as a peptide for forming an antibody-peptide vaccine complex (covalent bond type), a DBCO derivative peptide [peptide (6D)] in which a DBCO (Dibenzylcyclooctyne) group is added to the N-terminal side of an antigen peptide, and N of an IgG-binding peptide.
  • a DBCO derivative peptide (IgG-binding peptide-PEG-N3 [peptide (2P)]) was prepared by adding a PEG linker and an azide group to the terminal side and cross-linking two cysteines with SS bonds.
  • Example 3 Preparation of Peptide Vaccine-Antibody Complex This example was carried out for the purpose of preparing a peptide vaccine-antibody complex. In preparing the complex, a method of covalently conjugating the antibody and the peptide vaccine and a method of covalently conjugating the antibody were used.
  • the non-covalently bound peptide vaccine-antibody complex is a peptide vaccine (peptide (3-1) (SEQ)) combined with the IgG-binding peptide prepared in Example 2.
  • the covalently bound peptide vaccine-antibody complex (antibody-peptide vaccine complex (covalently bound)) is first described as a DBCO derivative peptide [peptide (6D)] and an IgG-binding peptide-PEG-N3 [IgG BP (2P)).
  • CMV-IgG binding peptide a fusion peptide of both peptides
  • CMV- DSG discussedin imidazole glutarate
  • acetonitrile a fusion peptide of both peptides
  • the peptide is purified by HPLC and then mixed with the anti-human CD40 antibody or isotype control antibody (human IgG1-lala antibody, self-prepared product) prepared in Example 1 at a molar ratio of 10: 1 at room temperature. Incubated for 3 hours. After confirming the formation of the antibody-peptide vaccine complex (covalent bond type) by electrophoresis, small molecules were removed by ultrafiltration.
  • Example 4 Analysis of peptide affinity for IgG The purpose of this example is to investigate the affinity of H-2Kb-binding OVA-derived peptides having various IgG-binding peptides prepared in Example 3 for IgG. I went as.
  • Peptides to be evaluated include peptides (3-1) (SEQ ID NO: 30), peptides (3-2) (SEQ ID NO: 41), peptides (3-3) (SEQ ID NO: 42), and peptides. (3-4) (SEQ ID NO: 43) and peptide (4) (negative control, SEQ ID NO: 31) were used.
  • the binding activity to the antibody was evaluated for the H-2Kb-restricted OVA-derived peptide having the above four different IgG-binding peptide sequences.
  • the IgG for evaluating the affinity the anti-CD40 antibody prepared in Example 1 was used, and the CM5 sensor chip (GE Healthcare) was immobilized on the CM5 sensor chip (GE Healthcare).
  • the sample solution of each peptide has a dilution series of 3 times the common ratio from 3 nM to 243. Prepared up to nM, measured and analyzed in single kinetics mode. The dissociation constant was calculated using Biacore Insight Evaluation software for the analysis of the observation results.
  • the dissociation rate constant (Kd) of the peptide (3-3) was about the same as that of the peptide (3-1) and had a higher affinity than the peptide (3-2).
  • the peptide (3-4) has a higher affinity than the peptide (3-2) peptide (3-3).
  • the peptide (4) which is a negative control, had a low affinity for the anti-CD40 antibody, and the dissociation rate constant and affinity could not be calculated (Figs. 3 and 2).
  • Example 5 In vitro immunoinduction test 1 (Whole PBMC method) The purpose of this example is to investigate in vitro whether the antibody-peptide vaccine complex (covalent bond type, non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity. I went as.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells obtained from healthy volunteers were prepared to 2 ⁇ 10 6 cells / mL using RPMI1640 medium (Thermo 61870-0362) containing 10% serum (BioWest, S4190). Then, 500 ⁇ L of each was seeded on a 24-well plate (FALCON, 353047) and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions.
  • Anti-CD40 antibody and peptide (7) were 20 ⁇ g / mL and 1 ⁇ g / ml, respectively, using RPMI1640 medium containing 10% serum and 200 U / mL IL-2 (NIPRO, 87890). After adjusting to the above, 500 ⁇ L of PBMC was added to the seeded wells (final concentrations of 10 ⁇ g / ml and 0.5 ⁇ g / ml, respectively) (Group 2).
  • the antibody-peptide vaccine complex (covalently bound) with anti-CD40 antibody-CMV peptide was adjusted to 21 ⁇ g / ml using RPMI1640 medium containing the same additives as in Group 2 above, and PBMC was seeded. 500 ⁇ L each was added to the wells (final concentration 10.5 ⁇ g / ml) (Group 3).
  • control -Anti-CD40 antibody was adjusted to 20 ⁇ g / mL using RPMI1640 medium containing 10% serum and 200 U / mL IL-2 (NIPRO, 87890), and then 500 ⁇ L was added to each well seeded with PBMC.
  • (Final concentration 10 ⁇ g / ml) Group 1
  • 20 ⁇ g / g of isotype control antibody human IgG1-lala antibody, self-prepared product
  • peptide (7) using RPMI1640 medium containing 10% serum and 200 U / mL IL-2 (NIPRO, 87890).
  • LPS (SIGMA, L2762), R848 (Invivogen, vac-r848), poly I: C (Invivogen, tlrl-pic) using RPMI1640 medium containing 10% serum and 200 U / mL IL-2, 800 each After adjusting to ng / ml, 2 mM, and 4 ⁇ g / ml, 330 ⁇ l was added to each well in which PBMC was seeded.
  • Fig. 4 Peptide-specific T cell induction was evaluated based on the proportion of tetramer-positive cells in CD3 and CD8-positive cells. As a result, the anti-CD40 antibody-peptide vaccine complex was more efficient than the isotype control antibody vaccine complex (Group 4 and Group 5), both non-covalent (Group 2) and covalent (Group 3). Vaccine-specific T cells were induced (Fig. 4).
  • Example 6 In vitro immunoinduction test 2 (Monocyte derived dendritic cell (MDDC) method) In this example, whether or not the antibody-peptide vaccine complex (covalent bond type, non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity is different from that in Example 5. The method was performed for the purpose of investigating in vitro.
  • MDDC Monocyte derived dendritic cell
  • CD14-positive monosites were purified using CD14 MACS beads (Miltenyl Biotec, 130-050-20110). CD14-negative cells were separately cryopreserved using a cell cryopreservation solution (Takara, CB011).
  • the antibody-peptide vaccine complex (covalent) with anti-CD40 antibody-CMV peptide was adjusted to 42 ⁇ g / ml using RPMI1640 medium containing the same additives as in Group 2 above and CD14 positive monosite. was added to each of the 96-well plates seeded with 50 ⁇ L (final concentration 10.5 ⁇ g / ml) (Group 3).
  • LPS, R848, polyI: C, and IL-2 were adjusted to 800 ng / ml, 2 mM, 4 ⁇ g / ml, and 80 U / mL, respectively, using the same medium. After adjustment, 50 ⁇ l was added at a time.
  • CD8-positive cells were purified using CD8 MACS beads (Miltenyl Biotec, 130-045-201). .. Cells were adjusted to 1.8 ⁇ 10 6 cells / mL with RPMI1640 containing 10% FBS, non-essential amino acids, 1 mM Sodium Pyruvate, 10 mM HEPES, 50 ⁇ M 2ME, added in 50 ⁇ L increments and cultured at 37 ° C. bottom.
  • Cells were harvested 14 days after the start of the study and used with APC-CMV-tetramer (MBL, TS-0020-2C), BV421-anti-CD3 antibody (Biolegend, 300434) and FITC-anti-CD8 antibody (Biolegend, 300906). Was stained and used for FACS analysis.
  • Example 7 Evaluation of uptake of peptide into dendritic cells in wild-type mice
  • the lymph nodes near the administration site.
  • the purpose of this study was to investigate in vivo whether the antibody-peptide complex was incorporated into dendritic cells (classical dendritic cell 1/2, (cDC1 / cDC2)) existing in the cell.
  • an IgGBP (1) peptide to which a peptide labeled with the fluorescent dye FAM (6-Carboxyfluorescein) (K * RRK * RRK * RR) (“K *” indicates FAM-linked lysine) was added ( SEQID NO: 25) (the entire sequence is K * RRK * RRK * RRGPDCAYHRGELVWCTFH) was used as the test peptide.
  • FAM 6-Carboxyfluorescein
  • Administration was performed by administering the drug once to each group of mice. Five hours later, inguinal lymph nodes near the administration site were collected, the tissue was disrupted to prepare lymph node cells, and then stained with anti-CD11c antibody, anti-IA / IE antibody, anti-XCR1 antibody, and anti-CD172a antibody. was used for flow cytometric analysis.
  • IgGBP (1) Fluorescently labeled IgGBP (1) based on the proportion of FAM-positive cells in cDC1 cells (CD11c + / IA / I-E + / XCR1 + / CD172-) and cDC2 cells (CD11c + / IA / I-E + / XCR1- / CD172 +) ) Peptide uptake was evaluated.
  • Example 8 Immune induction test 1 in wild-type mice (comparative test with conventional vaccine regimen) The purpose of this example was to investigate in vivo whether or not the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has the ability to induce immunity.
  • Group 1 Peptide vaccine (Peptide from H-2Kb restrictive OVA of Example 2 (3-1), SEQ ID NO: 30) only;
  • Group 2 Peptide (3-1) and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 3 Antibody-peptide vaccine complex with peptide (3-1) and anti-mouse CD40 antibody (non-covalent);
  • -Group 4 A mixture of an antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) consisting of peptide (3-1) and anti-mouse CD40 antibody, to which the adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) was further added;
  • Group 5 Negative control containing no peptide (3-1), anti-mouse CD40 antibody, or adjuvant; was administered respectively.
  • the dosage of each component is as shown in Table 4.
  • Fig. 7 Administration was performed according to the schedule shown in Fig. 7. Specifically, the drug was subcutaneously administered to the mice in each group twice every 7 days (the first administration day was day 0, day 0 and day 7). On Day 14, the spleen was collected, the tissue was crushed to prepare spleen cells, and then stained with anti-CD8 antibody and PE-OVA Tetramer (MBL, TS-5001-1C), which was used for flow cytometric analysis. .. Ova-specific T cell induction was evaluated based on the proportion of tetramer-positive cells in CD8-positive T cells.
  • Example 9 Immune induction test 2 in wild-type mice (comparative test of antibody-vaccine mixture ratio)
  • the effect of the mixed ratio of the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent binding type) antibody and peptide vaccine using the peptide vaccine prepared in Example 3 on the immunoinducibility is investigated in vivo. I went for the purpose.
  • Group 1 2 equal doses of peptide vaccine (Peptide from H-2Kb-binding OVA of Example 2 (3-1), SEQ ID NO: 30) and 1 equal dose of anti-mouse CD40 antibody antibody-peptide vaccine A mixture containing a complex (non-covalent bond type) and an adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 2 2 equal doses of IgG non-binding peptide as control peptide (peptide (4), SEQ ID NO: 31), 1 equal dose of anti-mouse CD40 antibody, and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) mixture; -Add the adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) to the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent type) with group 3: 4 equal dose
  • Group 4 4 equal doses of IgG unbound peptide as control peptide (peptide (4)), 1 equal dose of anti-mouse CD40 antibody, and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir); Was administered respectively. Each dose is as shown in Table 5.
  • Example 8 Ova-specific T cell induction was evaluated in the same manner as in Example 8.
  • Example 10 Immune induction test 3 in wild-type mice (dose-dependent test) The purpose of this example was to investigate the dose dependence of the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 in vivo.
  • Group 1 High-dose (10.5 ⁇ g) peptide vaccine (H-2Kb-binding OVA-derived peptide (3-1) from Example 2, SEQ ID NO: 30) and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) Mixture;
  • Group 2 High-dose (10.5 ⁇ g, equivalent to 2 equal doses) peptide vaccine (peptide (3-1) from Example 2) and anti-mouse CD40 antibody (200 ⁇ g, equivalent to 1 equal dose) antibody-peptide vaccine Mixture of complex (non-covalent) and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 3 A mixture of IgG non-binding peptide (peptide (4), SEQ ID NO: 31) as a high dose (10.0 ⁇ g) control peptide and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 4 IgG non-binding peptide (peptide (4)) as a high-dose (10.0 ⁇ g, equivalent
  • Ova-IgG binding peptides (groups 2 and 6) are Ova-IgG binding peptides (groups 1 and 5), Ova-IgG non-binding peptides (groups 3 and 7), and antibodies: Ova. -It showed a high immunoinducing effect as compared with the IgG non-binding peptide group (Group 4 and Group 8). In addition, the effect was observed in a dose-dependent manner (Fig. 10).
  • Example 11 Cancer-bearing mouse test 1 (Evaluation of antibody-peptide vaccine complex: complex with anti-CD40 antibody) This example uses the peptide vaccine prepared in Example 3 to determine in vivo whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent) prepared in combination with the anti-CD40 antibody has an antitumor effect. It was done for the purpose of investigating.
  • Group 1 Saline only (negative control); -Group 2: Adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) (negative control); Group 3: A mixture of peptide (3-1) (SEQ ID NO: 30) and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir); Group 4: A mixture of peptide (3-1) and antibody-peptide vaccine complex (non-covalent) with anti-mouse CD40 antibody and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir); Group 5 :; A mixture of an IgG non-binding peptide as a control peptide (peptide (4), SEQ ID NO: 31) and an adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir); Group 6: A mixture of IgG non-binding peptide as a control peptide (peptide (4)), anti-mouse CD40 antibody, and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • the drug in each group was administered subcutaneously twice in total on day 3 and day 10 to the mice in each group, and the tumor volume and body weight were observed twice a week from the start date of drug administration.
  • the antibody: Ova-IgG binding peptide group includes the Ova-IgG binding peptide group (group 3), the Ova-IgG non-binding peptide group (group 5), and the antibody: Ova-IgG non-binding peptide group (group 6). ), It was clarified that it shows a higher tumor growth inhibitory effect even in vivo (Fig. 11).
  • Ova-IgG-binding peptide group (group 4) were Ova-IgG-binding peptide group (group 3), Ova-IgG non-binding peptide group (group 5), and And antibody: A remarkable prolonging effect on survival was confirmed as compared with the Ova-IgG non-binding peptide group (Group 6) (Fig. 12).
  • Example 12 Immune induction test 4 (neoantigen model) in wild-type mice
  • whether or not the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) using the peptide vaccine prepared in Example 3 has an antitumor effect is determined by a test system with higher clinical extrapolability, specifically.
  • the purpose of this was to evaluate in a test system in which a peptide sequence selected based on a mutation peculiar to cancer was adopted as a vaccine sequence.
  • Group 1 Peptide vaccine (peptide (10) from Example 2, SEQ ID NO: 37) and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 2 A mixture of an antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) with a peptide vaccine (peptide (10) from Example 2) and an anti-mouse CD40 antibody) and an adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 3 A mixture of an IgG non-binding peptide as a control peptide (peptide (11), SEQ ID NO: 38) and an adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir);
  • Group 4 An IgG non-binding peptide as a control peptide (peptide (11)), an anti-mouse CD40 antibody anti-mouse CD
  • Administration was performed according to the schedule shown in Fig. 13. Specifically, the drug was subcutaneously administered to the mice in each group three times every four days (the first administration day was set to day 0, and the drug was administered on day 0, day 4 and day 8).
  • Splenocyte growth medium (10% FBS (BioWest, S4190), 1 mM sodium pyruvate (Wako, 190-14881), 0.05 mM 2-ME (Wako, 131)) of 3 ⁇ 10 6 cells.
  • peptide (8) 100 ⁇ l of a solution in which SEQ ID NO: 35 was dissolved was added to a final concentration of 10 ⁇ g / ml, and the cells were cultured under 37 ° C. and 5% CO2 conditions for 15 hours.
  • the results are shown in Fig. 14.
  • the antibody: Adpgk-IgG binding peptide group (group 2) includes the Adpgk-IgG binding peptide group (group 1), the Adpgk-IgG non-binding peptide group (group 3), and the antibody: Adpgk-IgG non-binding peptide group (group 4). ), It showed a high immunoinducing effect. Thus, the highest immunoinduction was obtained with antibody-bound neoantigen (Group 2), suggesting the usefulness of the antibody vaccine in this model as well.
  • Example 13 Immune induction test in wild-type mice 5 (evaluation of multiple antibodies-vaccine peptides) This example uses the peptide vaccine prepared in Example 3 to determine whether the antibody-peptide vaccine complex (non-covalently bound) combined with the CD40 antibody or PD-L1 antibody has the ability to induce immunity. , In vivo for the purpose of investigation.
  • Administration was performed according to the schedule shown in Fig. 15. Specifically, the drug was subcutaneously administered twice every 7 days to the mice in each group (the first administration day was set to day 0, and the drug was administered on day 0 and day 7). The spleen was collected on Day 14 and Ova-specific T cell induction was evaluated in the same manner as in Example 8.
  • Fig. 16 The results are shown in Fig. 16.
  • the T cell induction promoting ability was also shown in the group (group 2) in which the peptide vaccine was administered together with the adjuvant without antibody, but the CD40 antibody-peptide vaccine Similar to the non-covalent complex-administered group (Group 3), the PD-L1 antibody-peptide vaccine non-covalent complex-administered group (Group 4) resulted in significant T cell induction compared to Group 2.
  • the facilitative ability was shown (Group 3 and Group 4) (Fig. 16).
  • Example 14 Immunoinduction test 6 in wild-type mice (evaluation of multiple antibodies-vaccine peptides)
  • the peptide vaccine prepared in Example 3 is used in the same manner as in Example 13, and the antibody-peptide vaccine complex (non-covalent binding type) combined with the CD40 antibody or PD-L1 antibody is a complex.
  • the purpose of this study was to investigate in vivo whether or not it has the ability to enhance immune induction with respect to the mixed administration of a peptide vaccine and an antibody that do not form.
  • -Group 1 Adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) only
  • -Group 2 A mixture in which an IgG non-binding peptide (peptide (4), SEQ ID NO: 31) as a control peptide, an anti-mouse CD40 antibody, and an adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) were added
  • -Group 3 A mixture of an antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) consisting of peptide (3-1) and anti-mouse CD40 antibody, to which the adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir) was further added
  • -Group 4 Peptide (4), anti-PD-L1 antibody, and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir)
  • Example 13 Administration was performed according to the schedule shown in FIG. 15, as in Example 13. Specifically, the drug was subcutaneously administered twice every 7 days to the mice in each group (the first administration day was set to day 0, and the drug was administered on day 0 and day 7). The spleen was collected on Day 14 and Ova-specific T cell induction was evaluated in the same manner as in Example 8.
  • Example 15 Cancer-bearing mouse test 2 (evaluation of antibody-peptide vaccine complex: complex with anti-PD-L1 antibody)
  • antibody-peptide vaccine complex non-covalent bond type
  • Adjuvant PolyIC LC (manufactured by Oncovir) (negative control);
  • Group 2 A mixture of peptide (3-1) (SEQ ID NO: 30) and adjuvant PolyICLC (manufactured by Oncovir);
  • -Group 3 Mixture (control) of anti-PD-L1 antibody alone and adjuvant PolyICLC (manufactured by Oncovir);
  • Group 4 A mixture of peptide (3-1) and antibody-peptide vaccine complex (non-covalent) with anti-PD-L1 antibody and adjuvant PolyIC: LC (manufactured by Oncovir); Was administered subcutaneously.
  • a human PD-L1 antibody MedChemExpress CAS NO: 1380723-44-3 was used as the PD-L1 antibody.
  • the amount of each inoculation is as shown in Table 11.
  • the drug in each group was administered subcutaneously twice on day 4 and day 11 to the mice in each group, and the tumor volume and body weight were observed twice a week from the start date of drug administration.
  • the results are shown in Fig. 18 and Fig. 19.
  • Antibodies The Ova-IgG binding peptide group (group 4) has a higher tumor growth inhibitory effect in vivo as compared with the Ova-IgG binding peptide group (group 2) and the anti-PD-L1 antibody alone group (group 3). It was revealed that (Fig. 18).
  • Example 16 Immune induction test 7 (neoantigen model) in wild-type mice The purpose of this example is to investigate in vivo whether an antibody-peptide vaccine complex (non-covalent bond type) containing a non-synonymous somatic cell mutation sequence of a mouse tumor cell line has an antitumor effect. rice field.
  • a non-synonymous somatic cell mutation sequence of a mouse tumor cell line a peptide containing a non-synonymous somatic cell mutation sequence (27 mer each, based on the analysis result of the genome sequence obtained from the mouse tumor cell line MC-38). 30 peptides of peptide (101) to peptide (130)) were prepared as shown in Table 12 below.
  • peptides 44 mer each, peptide (101BP)- 30 peptides of peptide (130BP) were prepared as shown in Table 13 below.
  • Group 2 An antibody-peptide vaccine complex (non-covalent binding) in which an anti-mouse CD40 antibody was complexed against the IgG-binding peptides (44 mer each, peptide (101BP) to peptide (130BP)) shown in Table 13 above.
  • Peptide-peptide vaccine complex (non-covalently bound) (eg, pool 11 (peptide (101BP) -peptide (103BP)), pool 20 (peptide (128BP) -peptide (130BP))))
  • And adjuvant PolyIC LC (manufactured by Oncovir); Was subcutaneously administered to 2 mice in each pool. The amount of each inoculation is as shown in Table 14.
  • Administration was performed according to the schedule shown in FIG. Specifically, the drug was subcutaneously administered to each group of mice three times every 7 days (the first administration day was set to day 0, and the drug was administered on day 0, day 7 and day 14). After harvesting the spleen on Day 21, 100 ⁇ l of Splenocyte growth medium (10% FBS (BioWest, S4190), 1 mM sodium pyruvate (Wako, 190-14881), 0.05 mM 2-ME (Wako, 131)) of 2 ⁇ 10 6 cells.
  • Splenocyte growth medium (10% FBS (BioWest, S4190), 1 mM sodium pyruvate (Wako, 190-14881), 0.05 mM 2-ME (Wako, 131)
  • Spleen cells and each added peptide were removed by aspirate, and after washing the filter plate, 100 ⁇ L of biotin-labeled mouse IFN- ⁇ antibody (MabTech) was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The filter plate was washed, 100 ⁇ l of Streptavidin-ALP (MabTech) was added, and the mixture was incubated for another 1 hour. The filter plate was washed again, 100 ⁇ L of the substrate solution (MabTech; BCIP / NBT-plus) was added, and IFN ⁇ secreted by the cells was detected.
  • MabTech biotin-labeled mouse IFN- ⁇ antibody
  • the peptide vaccine disclosed in the present invention in combination with an IgG-binding peptide can efficiently deliver the peptide vaccine to the surface of a specific immune cell (for example, dendritic cell), enhance its activation, and produce a peptide.
  • a specific immune cell for example, dendritic cell
  • the effectiveness of the vaccine can be enhanced.

Abstract

本発明は、ペプチドワクチンを特定の免疫細胞表面に特異的にデリバリーできるように複合体化させた、ペプチドワクチンを提供することを課題とする。本発明はまた、ペプチドワクチンを特定の免疫細胞表面に特異的にデリバリーする方法を提供することもまた課題とする。　本発明の発明者らは、鋭意検討を進めた結果、特定の免疫細胞（例えば樹状細胞）の表面の分子に対するアゴニストであることを特徴とするIgGと結合させることができる、IgG結合ペプチドと組み合わせた、ペプチドワクチンを提供することにより、上記の課題を解決することができることを示した。

Description

改良ペプチドワクチン
　本発明は、がんの治療または予防のための新しいタイプのがんペプチドワクチンに関わるものである。より詳しくは、がんペプチドワクチンを接触させたい免疫細胞に対して特異的にデリバリーできるがんペプチドワクチンに関するものである。
　がんの新しい治療方法のひとつとして、がんペプチドワクチンが検討されている。がんペプチドワクチン療法は、がん細胞に発現するがん抗原に対する特異的免疫応答を患者体内で活性化・増殖させ、がんを予防ないし治療することを目的とするがん治療法であり、がん抗原タンパク質の一部分であるペプチドからなる抗原をワクチンとして投与するものである。
　このような研究の中で、1990年代から、多くのがん抗原に関する研究とそれらを標的とするワクチン開発が進められてきたが、がんペプチドワクチンとして、研究室レベルではがん特異的な免疫を誘起する効果が報告されているものもある（非特許文献1：Fifis T. et al., Vaccine. 2004 Nov 25;23(2):258-66）。また、一部のがんワクチンは、早期臨床試験において免疫誘導や生存期間延長といった探索的な有効性が報告されている（非特許文献2：Cancer Sci. 2018 Sep; 109(9): 2660-2669、非特許文献3：Cancer Sci. 2017 Dec;108(12):2430-2437）
　しかしながら、これらのがんワクチンの中で、検証的な治験において十分な有効性（治療効果）が証明されたものは見いだされておらず、いまだ承認されたものは存在していない。有効性が得られていない理由として、ワクチンの免疫細胞へのデリバリーや免疫細胞の活性化が十分でない点が一因であると考えられている。
WO2016/186206 WO2018/230257
Fifis T. et al., Vaccine. 2004 Nov 25;23(2):258-66 Cancer Sci. 2018 Sep; 109(9): 2660-2669 Cancer Sci. 2017 Dec;108(12):2430-2437
　本発明は、ペプチドワクチンを特定の免疫細胞表面に特異的にデリバリーできるように複合体化させた、ペプチドワクチンを提供することを課題とする。本発明はまた、ペプチドワクチンを特定の免疫細胞表面に特異的にデリバリーする方法を提供することもまた課題とする。
　本発明の発明者らは、鋭意検討を進めた結果、特定の免疫細胞（例えば樹状細胞）の表面の分子に対する抗体であることを特徴とするIgGと結合させることができる、IgG結合ペプチドと組み合わせた、ペプチドワクチンを提供することにより、上記の課題を解決することができることを示した。
　より具体的には、本件出願は、前述した課題を解決するため、以下の態様を提供する：
　［1］：IgG結合ペプチドと組み合わせた、ペプチドワクチン；
　［2］：ペプチドワクチンが、がんワクチン、感染症ワクチンからなる群から選択される、［1］に記載のペプチドワクチン；
　［3］：ペプチドワクチンが、がん関連抗原、がんネオアンチゲン、がん個別化ネオアンチゲンからなる群から選択される、がんワクチンである、［2］に記載のペプチドワクチン；
　［4］：IgG結合ペプチドが、
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Cys Xaa4 Xaa5 His Xaa6 Gly Xaa7 Leu Val Trp Cys Xaa8 Xaa9 Xaa10（SEQ ID NO: 1）
［SEQ ID NO: 1において、
　Xaa1、Xaa2、Xaa9、Xaa10の各々はCys以外の任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、またはXaa1とXaa2を合わせてArg Arg Gly Proであり、
　Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa8、の各々はCys以外の任意のアミノ酸であり、
　Xaa6はLys、Cys、Asp、Glu、Arg、Leu、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
　Xaa7はGlu、AsnまたはGlnである］、または
Xaa11 Xaa12 Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Xaa13 Ile Xaa14 Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 2）
［SEQ ID NO: 2において、
　Xaa11は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、β-Ala、2-アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、及びNH 2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在せず、
　Xaa12は、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、Phe、2-アミノスベリン酸、及びジアミノプロピオン酸からなる群から選択され、
　Xaa13およびXaa14は、それぞれ独立に、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、及びCysからなる群から選択される］、
からなる群から選択される、［1］～［3］のいずれか1項に記載のペプチドワクチン；
　［5］：　Xaa4がAla、Ser、およびThrからなる群から選択され、
　Xaa5がTyrまたはTrpである、
［1］～［4］のいずれか1項に記載のペプチドワクチン。
　［6］：IgG結合ペプチドが、
Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr （SEQ ID NO: 3）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 4）
Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser （SEQ ID NO: 5）
Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 6）
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 7）
Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 8）
Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 9）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 10）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His His （SEQ ID NO: 11）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 12）
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 13）
Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 14）
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr His （SEQ ID NO: 15）
Gly Xaa2 Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa9 His （SEQ ID NO: 16）
Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 17）
Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 18）、
Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 19）、
Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 20）、
Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 21）、
Lys Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 22）、
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp （SEQ ID NO: 23）、又は
Gly Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 24）
からなる群から選択される、［4］に記載のペプチドワクチン；
　［7］：IgG結合ペプチドが、
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 25）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 26）
Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 39）
Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 40）
である、［6］に記載のペプチドワクチン；
　［8］：IgG結合ペプチドに、IgGを結合させた、［1］～［7］のいずれか1項に記載のペプチドワクチン；
　［9］：IgGが、ペプチドワクチンをデリバリーする免疫細胞に特徴的な標的物質に対する抗体である、［8］に記載のペプチドワクチン；
　［10］：免疫細胞が、抗原提示細胞、樹状細胞、B細胞からなる群から選択される、［9］に記載のペプチドワクチン；
　［11］：IgGが、抗CD40抗体、抗PD-L1抗体、抗DEC205抗体、抗DCIR抗体、抗Mannose receptor抗体、抗DC-SIGN抗体、抗CD11c抗体、抗Dectin-1抗体からなる群から選択される、［8］～［10］のいずれか1項に記載のペプチドワクチン；
　［12］：IgG、IgG結合ペプチド、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンを使用して、IgGが標的とする分子を細胞表面に有する細胞にペプチドワクチンをデリバリーする方法；
　［13］：ペプチドワクチンが、がんワクチン、感染症ワクチンからなる群から選択される、［12］に記載の方法；
　［14］：ペプチドワクチンが、がん関連抗原、がんネオアンチゲン、がん個別化ネオアンチゲンからなる群から選択される、がんワクチンである、［13］に記載の方法；
　［15］：IgG結合ペプチドが、
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Cys Xaa4 Xaa5 His Xaa6 Gly Xaa7 Leu Val Trp Cys Xaa8 Xaa9 Xaa10（SEQ ID NO: 1）
［SEQ ID NO: 1において、
　Xaa1、Xaa2、Xaa9、Xaa10の各々はCys以外の任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、またはXaa1とXaa2を合わせてArg Arg Gly Proであり、
　Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa8、の各々はCys以外の任意のアミノ酸であり、
　Xaa6はLys、Cys、Asp、Glu、Arg、Leu、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、 
　Xaa7はGlu、AsnまたはGlnである］、または
Xaa11 Xaa12 Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Xaa13 Ile Xaa14 Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 2）
［SEQ ID NO: 2において、
　Xaa11は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、β-Ala、2-アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、及びNH 2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在せず、
　Xaa12は、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、Phe、2-アミノスベリン酸、及びジアミノプロピオン酸からなる群から選択され、
　Xaa13およびXaa14は、それぞれ独立に、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、及びCysからなる群から選択される］、
からなる群から選択される、［12］～［14］のいずれか1項に記載の方法；
　［16］：　Xaa4がAla、Ser、およびThrからなる群から選択され、
　Xaa5がTyrまたはTrpである、
［12］～［15］のいずれか1項に記載のペプチドワクチン。
　［17］：IgG結合ペプチドが、
Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr （SEQ ID NO: 3）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 4）
Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser （SEQ ID NO: 5）
Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 6）
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 7）
Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 8）
Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 9）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 10）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His His （SEQ ID NO: 11）
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 12）
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 13）
Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 14）
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr His （SEQ ID NO: 15）
Gly Xaa2 Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa9 His （SEQ ID NO: 16）
Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 17）
Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 18）、
Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 19）、
Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 20）、
Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 21）、
Lys Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 22）、
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp （SEQ ID NO: 23）、又は
Gly Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 24）
からなる群から選択される、［15］に記載の方法；
　［18］：IgG結合ペプチドが、
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 25）または
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 26）
Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 39）
Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 40）
である、［17］に記載の方法；
　［19］：IgGが、ペプチドワクチンをデリバリーする免疫細胞に特徴的な標的物質に対する抗体である、［12］～［18］のいずれか1項に記載の方法；
　［20］：免疫細胞が、抗原提示細胞、樹状細胞、B細胞からなる群から選択される、［19］に記載の方法；
　［21］：IgGが、抗CD40抗体、抗PD-L1抗体、抗DEC205抗体、抗DCIR抗体、抗Mannose receptor抗体、抗DC-SIGN抗体、抗CD11c抗体、抗Dectin-1抗体からなる群から選択される、［19］または［20］に記載の方法。
　本発明において開示する、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンは、ペプチドワクチンの特定の免疫細胞（例えば樹状細胞）表面へのデリバリーを効率的に行うことができ、その活性化を亢進し、ペプチドワクチンの効果を増強することができる。
図1は、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンを示す模式図である。 図2は、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンを、IgG結合ペプチド部分を介してIgGと結合させた複合体（ペプチドワクチン-IgG複合体）を示す模式図である。 図3は、実施例3において作製した、種々のIgG結合性ペプチドを有するH-2Kb拘束性OVA由来ペプチドの、IgGに対する親和性をin vivoにおいて調べた、ペプチドのIgGに対する親和性解析の結果を示す図である。 図4は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型、非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vitroにおいて調べた、In vitro免疫誘導試験（Whole PBMC法）の結果を示す図である。 図5は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型、非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vitroにおいて調べた、In vitro免疫誘導試験（Monocyte derived dendritic cell（MDDC）法）の結果を示す図である。 図6は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチド複合体を皮下投与した場合、樹状細胞へ抗体-ペプチド複合体が取り込まれるかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおけるペプチドの樹状細胞への取り込み評価の結果を示す図である。 図7は、野生型マウスにおける免疫誘導試験のスケジュールを示す図である。 図8は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験の結果を示す図である。 図9は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験（抗体-ワクチン混合比率の比較試験）の結果を示す図である。 図10は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験（用量依存性試験）の結果を示す図である。 図11は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、担癌マウス試験の結果を示す図である。この図において、抗体：抗原ペプチド-IgG結合ペプチド群が、生体内においても高い腫瘍増殖抑制効果を示した。 図12は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、担癌マウス試験の結果を示す図である。この図において、抗体：抗原ペプチド-IgG結合ペプチド群が、顕著な生存期間の延長効果を示した。 図13は、野生型マウスにおける免疫誘導試験のスケジュールを示す図である。 図14は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、より臨床外挿性の高い試験系で調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験（ネオアンチゲンモデル）の結果を示す図である。この図において、抗体：抗原-IgG結合ペプチド群が、最も高い免疫誘導効果を示した。 図15は、野生型マウスにおける免疫誘導試験のスケジュールを示す図である。 図16は、実施例3において作製したペプチドワクチンを使用し、CD40抗体またはPD-L1抗体と組み合わせた抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が、免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験の結果を示す図である。 図17は、実施例3において作製したペプチドワクチンを使用し、CD40抗体またはPD-L1抗体と組み合わせた抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が、免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験の結果を示す図である。 図18は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用し、抗PD-L1抗体と組み合わせて作製した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が、抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、担癌マウス試験の結果を示す図である。この図において、抗体：抗原ペプチド-IgG結合ペプチド群が、生体内においても高い腫瘍増殖抑制効果を示した。 図19は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、担癌マウス試験の結果を示す図である。この図において、抗体：抗原ペプチド-IgG結合ペプチド群が、顕著な生存期間の延長効果を示した。 図20は、野生型マウスにおける免疫誘導試験のスケジュールを示す図である。 図21は、マウス腫瘍細胞株のnon-synonymous体細胞変異配列を含む抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べた、野生型マウスにおける免疫誘導試験の結果を示す図である。
　本発明において使用する用語を以下の通り定義する：
（a）がんワクチン：がん細胞において発現増強するもしくはがん細胞でのみ発現するタンパク質の全部もしくは一部（がん抗原）を医薬品として投与し、当該がん抗原に対する免疫を誘起してがんを排除する治療薬；
（b）樹状細胞：がん抗原等の外来異物に対する免疫系の誘起において、当該異物を初期に認識する免疫細胞；
（c）T細胞：樹状細胞によって認識されたがん抗原の情報に基づき、がん細胞を特異的に殺傷する機能を付与される免疫細胞；
（d）CD40：樹状細胞をはじめとする抗原提示細胞表面に発現するタンパク質の一つ。リガンド等のアゴニスト分子の結合により、抗原提示細胞の機能を亢進することができる；
（e）抗体ワクチン：ワクチンと抗体の複合体。
＜ペプチドワクチン＞
　本発明は、一態様として、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンについての発明を開示する（図1）。この態様において、ペプチドワクチンは、抗原性を有するペプチドを用いたワクチンであればその抗原の由来は何であってもよく、病原体に対するワクチン、がんに対するワクチン（がんワクチン）などとして使用することができる。ペプチドワクチンとして病原体に対するワクチンを利用する場合、HIVワクチン、HBVワクチン、RSVワクチンなどの病原体の抗原性ペプチドを使用することができる。また、ペプチドワクチンとしてがんワクチンを利用する場合、脳腫瘍、骨髄腫、胃がん、大腸直腸がん、子宮がん、頭頚部がん、胃がん、大腸直腸がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、中脾腫、卵巣がん、前立腺がん、メラノーマなどのがんに特異的な抗原性ペプチドを使用することができる。一般的には、免疫療法に適していると考えられているがん抗原由来の抗原性ペプチドを、がんワクチンの抗原として使用することができる。たとえば、
・特定の腫瘍細胞では発現するが、正常組織では精巣のみに発現しているもの（NY-ESO-1、MAGEA1-4、PRAME、SSX2、CT83など）、
・腫瘍細胞において正常細胞よりも非常に高いレベルで発現しているもの（WT1、HER2、CEA、MUC1、cyclin B1、EGFR、mesothelin、telomeraseなど）、
・腫瘍細胞で発現し、正常な組織のうち限られた系列の細胞においてのみ発現しているもの（MART1、PSA、PSMA、CD19、GP100など）、
・正常組織でも発現するが、腫瘍細胞では特別な修飾をうけているもの（MUC1T、LSP1など）、
・疾患に共通して観察される遺伝子の転座、点突然変異などの異常により疾患特異的に生じる新規タンパク質（BCR-ABL1、HRAS、KRASなど）、
・腫瘍細胞で往々にして観察されるゲノム不安定性などに由来する遺伝子突然変異の結果、腫瘍細胞にのみ生じる変異タンパク質（ネオアンチゲン）に由来するペプチド群
などから選択できる。
　ペプチドワクチンは、単体で投与した場合、しばしば十分な免疫誘導を生じることができないことが知られている。この理由としては、目的とする免疫細胞にペプチドワクチンをデリバリーすることができないことが考えられている。本発明におけるペプチドワクチンは、このような一般的にみられるペプチドワクチンの短所を補うことを目的として、目的とする免疫細胞に対してペプチドワクチンをデリバリーするためにIgGを利用することとして、ペプチドワクチンをIgG結合ペプチドと組み合わせて提供することとした。
　本発明において使用するIgG結合ペプチドは、IgGとペプチドワクチンのペプチドとを結合することができるものとして公知のものを使用することができ、例えば、WO2016/186206（特許文献1）に記載されるもの（タイプ1）、WO2018/230257（特許文献2）に記載されるもの（タイプ2）を使用することができるが、これらには限定されない。本発明においては、これらのIgG結合ペプチドにペプチドワクチンを組み合わせて提供することができる。本発明の一態様において使用することができるIgG結合ペプチドは、
＜タイプ1＞
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Cys Xaa4 Xaa5 His Xaa6 Gly Xaa7 Leu Val Trp Cys Xaa8 Xaa9 Xaa10（SEQ ID NO: 1）
［SEQ ID NO: 1において、
　Xaa1、Xaa2、Xaa9、Xaa10の各々はCys以外の任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、またはXaa1とXaa2を合わせてArg Arg Gly Proであり、
　Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa8、の各々はCys以外の任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Xaa4はAla、Ser、およびThrからなる群から選択されてもよく、Xaa5はTyrまたはTrpであってもよく、
　Xaa6はLys、Cys、Asp、Glu、Arg、Leu、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、 
　Xaa7はGlu、AsnまたはGlnである］
＜タイプ2＞
Xaa11 Xaa12 Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Xaa13 Ile Xaa14 Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 2）
［SEQ ID NO: 2において、
　Xaa11は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、β-Ala、2-アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、及びNH 2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在せず、
　Xaa12は、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、Phe、2-アミノスベリン酸、及びジアミノプロピオン酸からなる群から選択され、
　Xaa13およびXaa14は、それぞれ独立に、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、及びCysからなる群から選択される］
からなる群から選択されるものを使用することができ、これらのIgG結合ペプチドをペプチドワクチンに組み合わせて使用することができる。
　より具体的には、本発明の一態様において使用することができるIgG結合ペプチドは、
＜タイプ1＞：
Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr （SEQ ID NO: 3）；
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 4）；
Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser （SEQ ID NO: 5）；
Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 6）；
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 7）；
Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 8）；
Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 9）；
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 10）；
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His His （SEQ ID NO: 11）；
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 12）；
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 13）；
Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 14）；
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr His （SEQ ID NO: 15）；
Gly Xaa2 Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa9 His （SEQ ID NO: 16）；
Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 17）；
＜タイプ2＞：
Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 18）；
Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 19）；
Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 20）；
Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 21）；
Lys Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 22）；
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp （SEQ ID NO: 23）；
Gly Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 24）
からなる群から選択されるものである。
　このようなもののうち、本発明において特に有用なものは、Xaa6がArg、Lys、またはLeuであるIgG結合ペプチドであり、例えば、そのような有用なIgG結合ペプチドの具体的なアミノ酸配列としては、
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 25）または
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 26）
Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 39）
Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 40）
を
挙げることができる。
　本発明のIgG結合ペプチドは、ヒトのIgG（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4のいずれのIgGサブクラスであってもよい）またはヒト化型IgGに対して結合させるためのものであることが好ましいが、ヒト以外の動物、例えばラット、マウス、及びウサギのIgGに対して用いることもできる。
　IgG結合ペプチドをペプチドワクチンに対して組み合わせる方法は、どのような方法であってもよく、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等を使用して、IgG結合ペプチドとペプチドワクチンのペプチドとを一つの連続したペプチドとして生成することで組み合わせる方法あるいは別個に合成されたIgG結合ペプチドとペプチドワクチンのペプチドとをリンカーを介して組み合わせる方法によって製造することができる。あるいは、本発明のペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法によって、ペプチドを製造してもよい。例えば本発明のIgG結合ペプチドとペプチドワクチンのペプチドとを一つの連続したペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のペプチドを製造することもできる。
　合成の容易性などを考慮する場合、組み合わせる方法としては、IgG結合ペプチドとペプチドワクチンのペプチドとを一つの連続したペプチドとして合成することが好ましい。このような方法を採用する場合、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンの目的とする配列を設計し、ペプチド合成機（例えば、Gyros Protein Technologies社製のSymphony（登録商標）Xなど）を使用して合成することができる。ペプチドを合成した際に含まれる夾雑物を、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、除去し、ペプチドを精製することができる。クロマトグラフィーによる精製にあたっては、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の機器を使用することができる。
＜IgGとの複合体＞
　本発明においては、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンを、IgG結合ペプチド部分を介してIgGと結合させた複合体を提供することを特徴とする（図2）。本発明において使用するIgGは、ペプチドワクチンをデリバリーしたい免疫細胞に応じて選択することができ、本発明においては、対象とする免疫細胞に対して結合することを目的とするIgGや、対象とする免疫細胞に対して結合するとともにその免疫細胞を活性化するためのIgGなどを使用することができる。例えば免疫細胞として樹状細胞を使用する場合には、抗CD40抗体（IgG）、抗PD-L1抗体（IgG）、抗DEC205抗体（IgG）、抗DCIR抗体（IgG）、抗Mannose reseptor抗体（IgG）、抗DC-SIGN抗体（IgG）、抗CD11c抗体（IgG）、抗Dectin-1抗体（IgG）などを使用することができるが、これら以外の抗体であっても、目的に応じて他のIgGを使用することもできる。
　ペプチドワクチンとして病原体に対するワクチンを利用する場合、およびペプチドワクチンとしてがんワクチンを利用する場合、いずれも樹状細胞もしくはB細胞などの免疫細胞にデリバリーすることが効果的である。したがって、本発明において、それぞれの細胞に対してデリバリーするために使用するIgGは、ペプチドワクチンをデリバリーする免疫細胞に特徴的な標的物質に対するIgGとして公知のものを使用することができ、樹状細胞にデリバリーするためにはCD40を標的物質とする抗体（J&J, Roche, Seattle Genetics社等が臨床開発）、DEC205を標的物質とする抗体（Celldexが臨床開発）を、DCIRを標的物質とする抗体（Ascend Biopharmaceuticalsが臨床開発）等を使用することができる。
　本発明において複合体を形成するために使用することができるIgG結合ペプチド部分とIgGとの結合は、本発明のIgG結合ペプチド部分の特定のアミノ酸残基を架橋剤で修飾し、その架橋剤を介して、IgG Fcの特定のアミノ酸残基とのあいだで架橋構造を形成させることにより行うことができる。本発明のIgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンのIgG結合ペプチド部分を架橋剤により修飾する方法としては、架橋剤により修飾されたアミノ酸残基を用いてIgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンのペプチド合成を行うことにより行うか、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンを合成したのちIgG結合ペプチド部分中の特定のアミノ酸残基の側鎖を特異的に修飾することにより行うことができる。
　本発明において複合体形成のために使用することができる架橋剤は、当業者であれば適宜選択することが可能であり、IgG結合ペプチド部分の特定のアミノ酸残基と結合可能な少なくとも2個の部位を有する化合物を使用することができ、その例として、ジスクシンイミジルグルタレート（disuccinimidyl glutarate、DSG）、ジスクシンイミジルスベレート（disuccinimidyl suberate、DSS）等のスクシンイミジル基を少なくとも1個、好ましくは2個以上含む架橋剤、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩（dimethyl adipimidate・2HCl、DMA）、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（dimethyl pimelimidate・2HCl、DMP）、またはスベルイミド酸ジメチル二塩酸塩（dimethyl suberimidate・2HCl、DMS）等のイミド酸部分を少なくとも1個、好ましくは2個以上含む架橋剤、並びに3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩（dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate・2HCl、DTBP）又はジチオビススクシンイミジルプロピオン酸（dithiobis（succinimidyl propionate）、DSP）等の、前述官能基に加えてSS結合を有する架橋剤、を使用することができるが（WO2016/186206（特許文献1）、WO2018/230257（特許文献2））、これらのものに限定されない。
　架橋剤による特定のアミノ酸残基の修飾は、架橋剤と特定のアミノ酸残基の種類との組み合わせを選択することにより行うことができる（WO2016/186206（特許文献1）、WO2018/230257（特許文献2））。例えば、DSS又はDSG等のスクシンイミジル基を含む架橋剤を使用する場合、リシン残基の側鎖のアミン（εアミノ基）及びポリペプチドのN末端に存在する一級アミン（αアミノ基）と反応するため、IgG結合ペプチド部分のN末端をブロッキングした上でDSS又はDSGと反応させることで、IgG結合ペプチド部分の特定のアミノ酸残基として配置されたリシン残基の側鎖のみをDSS又はDSGで特異的に修飾することができる。このようなアミノ酸残基と架橋剤の組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。また、DSS又はDSGを用いる場合は、リシン残基を含まないようなペプチドにおいて、ポリペプチドのN末端に存在する一級アミン（αアミノ基）を非修飾とすることで、αアミノ基を特異的に修飾することもできる。
　本発明において、IgG結合ペプチド部分を架橋剤で修飾した本発明のペプチドワクチンは、IgGと混合することにより、IgGと結合して複合体を形成することができる。この混合する工程の条件は、架橋剤で修飾された本発明のIgG結合ペプチド部分とIgGの間で架橋反応が生じる条件で行うものであれば特に限定されない。例えば、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド部分を含む本発明のペプチドワクチンとIgGとを、適当なバッファー中において、室温（例えば約15℃～30℃）で混合することにより架橋反応を行うことができる。この混合する工程においては、必要に応じて、架橋反応を促進する触媒を適量加えて行ってもよい。
　その際、IgG結合ペプチド部分とIgGとのあいだの結合性を高めるため、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド部分を含む本発明のペプチドワクチン及びIgGの種類などを考慮して、この混合する工程のその他の反応条件を適宜調整してもよく、例えば、反応の際のpHについては、pH 4.5～6.5（例えばpH 5.0～6.0、pH 5.2～5.8、pH 5.4～5.6、又はpH約5.5）、又はpH 6.5～8.5（例えばpH 6.9～7.9、pH 7.2～7.7、pH 7.3～7.5、又はpH約7.4）などの条件を選択することができ、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド部分を含む本発明のペプチドワクチンとIgGとの混合比率については、モル比にして、例えば1：1～20：1、2：1～20：1又は5：1～10：1とすることができ、混合時間（反応時間）については、例えば、1分～5時間、10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
＜複合体の用途＞
　本発明は、別の一態様として、上述したIgG結合ペプチド部分を組み合わせた本発明のペプチドワクチンとIgGとの複合体を使用して、IgGが標的とする標的分子を細胞表面に有する細胞に対して特異的に、ペプチドワクチンをデリバリーする方法を提供することができる。このような所望の細胞として免疫細胞を選択し、その免疫細胞にペプチドワクチンを特異的にデリバリーすることにより、ペプチドワクチンに対する抗体生成を効率的に行うことができ、ペプチドワクチンに対するT細胞の活性化を誘導するなど、ペプチドワクチンに対する細胞性免疫を誘導することができる。
　本発明は、さらに別の一態様として、上述したIgG結合ペプチド部分を組み合わせた本発明のペプチドワクチンとIgGとの複合体を含む、標的疾患の治療用又は予防用のワクチン組成物を提供することができる。本発明のワクチン組成物の治療・予防対象となる標的疾患は、本発明のペプチドワクチンの抗原の由来となる対象を意味しており、例えば、病原体に対する感染症、がんなどを挙げることができる。また、ペプチドワクチンをデリバリーしたい免疫細胞に応じてIgGを選択することにより、免疫細胞に応じた免疫応答を誘導することができ、したがって本発明のワクチン組成物を、ペプチドワクチンに対する抗体生成を効率的に誘導するためのワクチン組成物、ペプチドワクチンに対するT細胞の活性化を誘導するなど、またはペプチドワクチンに対する細胞性免疫を誘導するためのワクチン組成物などとすることができる。
　標的疾患の治療を目的として使用する場合、本発明のワクチン組成物は、標的疾患に対するペプチドワクチンと、標的疾患を発症した患者に対して誘導したい免疫反応を誘導する免疫細胞に応じたIgGとを含むことができる。この本発明のワクチン組成物を、標的疾患を発症した患者に対して投与することにより、当該患者の体内で標的疾患を治療することができる。
　標的疾患の予防を目的として使用する場合、本発明のワクチン組成物は、標的疾患に対するペプチドワクチンと、標的疾患に対して誘導したい好ましい免疫反応を誘導する免疫細胞に応じたIgGとを含むことができる。この本発明のワクチン組成物を、標的疾患を発症していない被検体に対して投与することにより、当該被検体の体内で標的疾患の原因が体内に侵入・発生した場合の免疫応答を誘導することができる。
　本発明のワクチン組成物は、IgGを用いて本発明のペプチドワクチンを免疫細胞にデリバリーすることが目的であることから、非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、又は腹腔内投与等）の経路で、投与することができ、その投与経路に応じた適切な剤形として各種製剤形態に調製することができる。投与方法及び剤型は、患者の性別、年齢、体重、症状等により、当業者であれば適宜選択することができる。
　本発明のワクチン組成物は、医薬的に許容される担体や添加物を含め、当該技術分野における一般的知見に従って製剤化することができる。 例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の複合体を、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等を含む溶液に溶解し、これに容器吸着防止剤、例えばTween 80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解して再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のため安定化剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコール及び／又は糖類を使用することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
　実施例1：抗CD40抗体の製造
　本実施例は、本発明のペプチドワクチンをデリバリーする免疫細胞としてワクチン特異的T細胞を誘導する樹状細胞を選択し、当該細胞を活性化することを目的として、その表面抗原として特異的なCD40に対するアゴニスト抗体を作製するために行った。
（1）抗マウスCD40抗体の製造
　抗マウスCD40抗体は、抗マウスCD40アゴニスト抗体として公知のFGK45クローンの可変領域と、ヒト抗体の定常領域を融合したキメラ抗体として作製した。FGK45クローンの可変領域配列は、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にて公開されている配列（重鎖：AEI27236.1、軽鎖：AEI27235.1）を用いた。発現用のベクターとして、pCI-neoに、軽鎖発現エレメント（EF-1αプロモーター、分泌シグナル、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域をタンデムに連結）、重鎖発現エレメント（EF-1αプロモーター、分泌シグナル、重鎖可変領域、重鎖定常領域をタンデムに連結）を連結したプラスミドを構築した。
　重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列は、前述のデータベースより取得した配列をもとに、ハムスター発現系に最適化したコドンに基づきデザインした。重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、公知のヒト抗体の重鎖定常領域部分および軽鎖定常領域部分のアミノ酸配列またはその改変体を規定するDNA配列を利用することができ、本実施例においては、重鎖定常領域部分および軽鎖定常領域部分のアミノ酸配列としてそれぞれ、ヒトIgG1のCH2領域にL4AおよびL5A置換を有する変異体（IgG1-lala）およびヒトIgG kappaの配列を使用した。
　抗体発現用の細胞として、ExpiCHO細胞（invitrogen A2910002）を使用した。当該細胞は、ExpiCHO Expression Medium（Gibco,A2910002）を用いて培養し、抗体発現プラスミドをExpiCHOTM Expression System（GIbco A29129）を用いてトランスフェクションした後、14日間培養して、培養上清を回収した。抗体は、培養上清をプロテインAカラム（MonoSpin ProA, GLサイエンス7510-11314）を用いて精製することにより取得した。
　精製した抗体は、SDS-PAGEおよびマウス脾臓細胞への結合性に基づき、純度と結合性を確認し、目的とした抗マウスCD40アゴニスト抗体が得られたことを確認した。
（2）抗ヒトCD40抗体の製造
　抗ヒトCD40抗体は、抗ヒトCD40アゴニスト抗体として公知の21.4.1クローンの可変領域と、ヒト抗体の定常領域を融合したキメラ抗体として作製した。21.4.1クローンの配列は、特許文献（特許第4616555号）にて公開されている配列を用いた。
　抗ヒトCD40抗体発現用のベクターの製造および抗体の発現・精製は、（1）で上述した抗マウスCD40抗体の際に使用した方法と同一の方法にて実施した。
　精製した抗体は、SDS-PAGEおよびCD40強制発現細胞における標的活性化能に基づき、純度と結合性を確認し、目的とした抗ヒトCD40アゴニスト抗体が得られたことを確認した。
　実施例2：ペプチド製造
　本実施例は、本発明のペプチドワクチンの例として、種々の標的物質に対する抗原性ペプチドを作製するために行った。
　ワクチンペプチド配列として、
・マウス体内における抗原特異的なT細胞の誘導機能が報告されているH-2Kb拘束性OVA由来の抗原ペプチド配列（SIINFEKL［ペプチド（1）、SEQ ID NO: 28］）（Vaccine. 2004 Nov 25;23(2):258-66）を包含する16 merペプチド（EQLESIINFEKLTEWT［ペプチド（2）］、SEQ ID NO: 29）、
・ヒトA24:02拘束性CMV由来の抗原ペプチド配列（PVAALFFF［ペプチド（5）、SEQ ID NO: 32］）（J Transl Med. 2005 May 26;3:23）を有する16 merペプチド（RQYDPVAALFFFDIDL［ペプチド（6）］、SEQ ID NO: 33）、もしくは
・H-2Db拘束性ネオアンチゲンAdpgk由来ペプチド配列（ASMTNMELM［ペプチド（8）、SEQ ID NO: 35］）（Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6）を有する17 merペプチド（HLELASMTNMELMSSIV［ペプチド（9）］、SEQ ID NO: 36）
を用いた。
　IgG結合ペプチド配列として、特許文献PCT/JP2016/065061で報告されている配列（GPDCAYHRGELVWCTFH［IgG BP（1）、（SEQ ID NO: 25）］もしくはGPDCAYHKGELVWCTFH［IgG BP（2）、（SEQ ID NO: 26）］）、および新たに作成した配列（GPDCAWHRGELVWCTFH［IgG BP（3）、（SEQ ID NO: 39）］、またはGPDCAWHLGELVWCTFH［IgG BP（4）、（SEQ ID NO: 40）］）を用いた。これらの配列は、SEQ ID NO: 4に記載のペプチドのXaa6がArg、LysまたはLeuであるものである。また、陰性コントロールのIgG非結合ペプチド配列として、IgG結合ペプチドに部分変異を加えた配列（GPDCAYHRGEAAACTFH［IgG BP（NC）、SEQ ID NO: 27］）を用いた。これらのIgG結合ペプチドは、IgG抗体に対して非共有結合で結合して複合体形成することを特徴とするものである。
　非共有結合によるペプチドワクチンと抗体の複合体（抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型））の形成用のペプチドとして、IgG結合ペプチドのN末端側にワクチンペプチドをタンデムに連結し、IgG結合ペプチドに存在する二つのシステインをS-S結合で架橋したペプチドを合成した［ペプチド（3-1）（SEQ ID NO: 30）およびペプチド（7）（SEQ ID NO: 34）および（10）（SEQ ID NO: 37）］。また、コントロールペプチドとして、IgG非結合ペプチド（上記［IgG BP（NC）（SEQ ID NO: 27）］）のN末端側にワクチンペプチドをタンデムに連結し、IgG非結合ペプチド配列中に存在する二つのシステインをSS結合で架橋したペプチドを合成した［ペプチド（4）（SEQ ID NO: 31）および（11）（SEQ ID NO: 38）］。
　これらのペプチドは、化学合成にて製造した。更に、抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型）の形成用のペプチドとして、抗原ペプチドのN末端側にDBCO（Dibenzylcyclooctyne）基を付与したDBCO誘導体ペプチド［ペプチド（6D）］、IgG結合ペプチドのN末端側にPEGリンカーおよびアジド基を付与し、二つのシステインをSS結合で架橋したIgG結合ペプチド誘導体（IgG結合ペプチド-PEG-N3［ペプチド（2P）］）をそれぞれ作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例3：ペプチドワクチン-抗体複合体の作製
　本実施例は、ペプチドワクチンと抗体の複合体を作製することを目的として行った。複合体の作製に当たっては、抗体とペプチドワクチンとを非共有結合的に複合体化する方法及び共有結合的に複合体化する方法を使用した。
　非共有結合によるペプチドワクチンと抗体の複合体（抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型））は、実施例2で作製したIgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチン（ペプチド（3-1）（SEQ ID NO: 30）、ペプチド（3-2）（SEQ ID NO: 41）、ペプチド（3-3）（SEQ ID NO: 42）、ペプチド（3-4）（SEQ ID NO: 43）、またはペプチド（7）（SEQ ID NO: 34）またはペプチド（10）（SEQ ID NO: 37））および実施例1で作製した抗マウスCD40抗体または抗ヒトCD40抗体または市販のヒトPD-L1抗体（MedChemExpress CAS NO: 1380723-44-3）を、室温条件下で混合することにより作製した。
　共有結合によるペプチドワクチンと抗体の複合体（抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型））は、まず、DBCO誘導体ペプチド［ペプチド（6D）］およびIgG結合ペプチド-PEG-N3［IgG BP（2P）］を、それぞれDMSOを用いて10 mMおよび10.8 mMに調製し、混合して室温で2時間インキュベートすることにより、両ペプチドの融合ペプチド（CMV-IgG結合ペプチド）を作製し、次に、CMV-IgG結合ペプチドに対し、モル比1.4倍になるようにアセトニトリルに溶解したDSG（グルタル酸ジスクシンイミジル）を加え、ピリジン存在下、50℃で4時間インキュベートし、ペプチド（7）と同一の配列を有し、グルタル酸スクシンイミジル化されたCMV-IgG結合ペプチドを作製した。
　同ペプチドを、HPLCを用いて精製した後、実施例1で作製した抗ヒトCD40抗体もしくはアイソタイプコントロール抗体（ヒトIgG1-lala抗体、自家調製品）と10:1のモル比で混合し、室温で3時間インキュベートした。電気泳動により、抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型）の生成を確認した後、限外ろ過により低分子を除去した。
　実施例4：ペプチドのIgGに対する親和性解析
　本実施例は、実施例3において作製した、種々のIgG結合性ペプチドを有するH-2Kb拘束性OVA由来ペプチドの、IgGに対する親和性を調べることを目的として行った。
　評価対象のペプチドとしては、ペプチド（3-1）（SEQ ID NO: 30）、ペプチド（3-2）（SEQ ID NO: 41）、ペプチド（3-3）（SEQ ID NO: 42）、ペプチド（3-4）（SEQ ID NO: 43）、およびペプチド（4）（陰性コントロール、SEQ ID NO: 31）を使用した。
　上記4種類の異なるIgG結合性ペプチド配列を有する、H-2Kb拘束性OVA由来のペプチドについて、抗体に対する結合活性を評価した。親和性を評価するIgGは、実施例1で作成した抗CD40抗体を使用し、CM5センサーチップ（GE Health care）に固相化を行った。
　具体的には、BIAcore 8K（GE Health care）を用いて、CM5センサーチップ上に固定化した抗CD40抗体に対して、各ペプチドの試料溶液は、公比3倍の希釈系列を3 nMから243 nMまで調製し、シングルカイネティクスモードで測定、解析した。観測結果の解析にはBiacore Insight Evaluationソフトウエアを用いて解離定数を算出した。
　その結果、ペプチド（3-3）の解離速度定数（Kd）はペプチド（3-1）と同程度の値であり、ペプチド（3-2）より高い親和性を有することが確認された。これに対し、ペプチド（3-4）はペプチド（3-2）ペプチド（3-3）よりさらに高い親和性を有していることが確認された。また陰性コントロールであるペプチド（4）は、抗CD40抗体に対する親和性が低く解離速度定数、アフィニティの算出できなかった（図3、表2）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例5：In vitro免疫誘導試験１（Whole PBMC法）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型、非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vitroにおいて調べることを目的として行った。
　健常人ボランティアから取得した末梢血単核細胞（PBMC）を、10％血清（BioWest, S4190）を含んだRPMI1640培地（Thermo 61870-0362）を用いて2×106 cells/mLになるように調製し、24ウェルプレート（FALCON, 353047）へ500μLずつ播種し、37℃、5％CO2条件下で培養した。
　抗CD40抗体およびペプチド（7）（SEQ ID NO: 34）は、10％血清および200 U/mL IL-2（NIPRO, 87890）を含んだRPMI1640培地を用いて、それぞれ20μg/mLおよび1μg/mlになるように調整した後、PBMCを播種したウェルに500μLずつ添加した（終濃度それぞれ10μg/mlおよび0.5μg/ml）（群2）。
　抗CD40抗体-CMVペプチドによる抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型）は、上記の群2と同様の添加物を含むRPMI1640培地を用いて21μg/mlになるように調整し、PBMCを播種したウェルに500μLずつ添加した(終濃度10.5μg/ml)（群3）。
　対照として、
・抗CD40抗体を10％血清および200 U/mL IL-2（NIPRO, 87890）を含んだRPMI1640培地を用いて20μg/mLになるように調整した後、PBMCを播種したウェルに500μLずつ添加した（終濃度10μg/ml）（群1）
・アイソタイプコントロール抗体（ヒトIgG1-lala抗体、自家調製品）とペプチド（7）を、10％血清および200 U/mL IL-2（NIPRO, 87890）を含んだRPMI1640培地を用いて、それぞれ20μg/mLおよび1μg/mlになるように調整した後、PBMCを播種したウェルに500μLずつ添加した（終濃度それぞれ10μg/mlおよび0.5μg/ml）（群4）、そして
・アイソタイプコントロール抗体と実施例3で作製したDSG化ペプチドによる抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型）を、上記の群2と同様の添加物を含むRPMI1640培地を用いて21μg/mlになるように調整し、PBMCを播種したウェルに500μLずつ添加した(終濃度10.5μg/ml)（群5）
を用意した。
　LPS（SIGMA, L2762）、R848（Invivogen, vac-r848）、poly I:C (Invivogen, tlrl-pic)を、10％血清および200 U/mL IL-2を含んだRPMI1640培地を用い、それぞれ800 ng/ml、2 mM、4μg/mlとなるように調整した後、PBMCを播種したウェルに330μlずつ添加した。
　37℃、5％CO2条件下で7日間培養した後に細胞を回収し、APC-CMV-tetramer（MBL, TS-0020-2C）、BV421-抗ヒトCD3抗体（Biolegend,300434）およびFITC-抗ヒトCD8抗体（Biolegend, 300906）を用いて染色し、FACS解析に供試した。
　結果を図4に示す。CD3およびCD8陽性細胞におけるテトラマー陽性細胞割合に基づき、ペプチド特異的なT細胞誘導を評価した。その結果、抗CD40抗体-ペプチドワクチン複合体は、非共有結合型（群2）および共有結合型（群3）とも、アイソタイプコントロール抗体ワクチン複合体（群4および群5）と比較して、効率的にワクチン特異的T細胞を誘導した（図4）。
　実施例6：In vitro免疫誘導試験2（Monocyte derived dendritic cell（MDDC）法）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型、非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、実施例5とは別の方法で、in vitroにおいて調べることを目的として行った。
　健常人ボランティアから取得したPBMCを用い、CD14 MACSビーズ（Miltenyl Biotec, 130-050-20110）を用いてCD14陽性モノサイトを精製した。CD14陰性細胞は、細胞凍結保存液（Takara, CB011）を用いて別途凍結保存した。
　精製したCD14陽性モノサイトを、10％FBS（SIGMA, 172072-500ML）、10 mM HEPES（nacalai, 17557-94）、50μM 2-メルカプトエタノール（2-ME；nacalai, 21438-82）、6.5 ng/mL IL-4（peprotech, 200-04）、100 ng/mL GM-CSF（R＆D, 215-GM-500）を含むRPMI1640培地（Thermo, 61870-036）を用いて1×106 cells/mLになるように調製し、24ウェルプレート（FALCON, 353047）に1 mlずつ播種し、37℃、5％CO2条件下で培養した。
　培養開始から6日後に細胞を回収し、10％ FBS（SIGMA, 172072-500ML）、非必須アミノ酸（nacalai, 06344-56）、1 mM Sodium Pyruvate（nacalai, 06977-34）、10 mM HEPES（nacalai, 17557-94）、50μM 2ME（nacalai, 21438-82）を含むRPMI1640を用いて6×104 cells/mLに調整し、96ウェルU底プレート(FALCON, 353077)に50μLずつ播種した。
　抗ヒトCD40抗体およびペプチド（7）（SEQ ID NO: 34）を、上記でモノサイトを培養した際と同様の培地を用いて、それぞれ40μg/mLおよび2μg/mLになるように調整した後、CD14陽性モノサイトを播種した96ウェルプレートに対して、50μLずつ添加した（終濃度それぞれ10μg/mlおよび0.5μg/ml）（群2）。
　抗CD40抗体-CMVペプチドによる抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型）は、上記の群2と同様の添加物を含むRPMI1640培地を用いて42μg/mlになるように調整し、CD14陽性モノサイトを播種した96ウェルプレートに対して、50μLずつ添加した(終濃度10.5μg/ml)（群3）。
　対照として、
・抗ヒトCD40抗体を10％血清および200 U/mL IL-2（NIPRO, 87890）を含んだRPMI1640培地を用いて40μg/mLになるように調整した後、CD14陽性モノサイトを播種した96ウェルプレートに対して、50μLずつ添加した（終濃度10μg/ml）（群1）
・アイソタイプコントロール抗体（ヒトIgG1-lala抗体、自家調製品）とペプチド（7）を10％血清および200 U/mL IL-2（NIPRO, 87890）を含んだRPMI1640培地を用いてそれぞれ40μg/mLおよび2μg/mLになるように調整した後、CD14陽性モノサイトを播種した96ウェルプレートに対して、50μLずつ添加した（終濃度それぞれ10μg/mlおよび0.5μg/ml）（群4）、そして
・アイソタイプコントロール抗体と実施例3で作製したDSG化ペプチドによる抗体-ペプチドワクチン複合体（共有結合型）を、上記の群2と同様の添加物を含むRPMI1640培地を用いて42μg/mlになるように調整し、CD14陽性モノサイトを播種した96ウェルプレートに対して、50μLずつ添加した(終濃度10.5μg/ml)（群5）
を用意した。
　更に、実施例5と同様に、LPS、R848、poly I:C、IL-2を、同様の培地を用いてそれぞれ800 ng/ml、2 mM、4μg/ml、80 U/mLとなるように調整した後、50μlずつ添加した。
　37℃、5％CO2条件下で培養開始から7日目に、凍結したCD14陰性細胞を起眠し、CD8 MACSビーズ（Miltenyl Biotec, 130-045-201）を用いてCD8陽性細胞を精製した。細胞を10％ FBS、非必須アミノ酸、1 mM Sodium Pyruvate、10 mM HEPES、50μM 2MEを含むRPMI1640を用いて1.8×106 cells/mLになるように調整し、50μLずつ添加して37℃で培養した。試験開始から14日目に細胞を回収し、APC-CMV-tetramer（MBL, TS-0020-2C）、BV421-抗CD3抗体（Biolegend,300434）およびFITC-抗CD8抗体（Biolegend, 300906）を用いて染色し、FACS解析に供試した。
　結果を図5に示す。CD3およびCD8陽性細胞におけるテトラマー陽性細胞割合に基づき、ペプチド特異的なT細胞誘導を評価した。その結果、抗CD40抗体ワクチン複合体は、非共有結合型(群2)および共有結合型(群3)とも、アイソタイプコントロール抗体ワクチン複合体（群4および群5）と比較して効率的にワクチン特異的T細胞を誘導した（図5）。
　実施例7：野生型マウスにおけるペプチドの樹状細胞への取り込み評価
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチド複合体を皮下投与した場合、投与部位近傍のリンパ節内に存在する樹状細胞（classical dendritic cell 1/2、（cDC1/cDC2））へ抗体-ペプチド複合体が取り込まれるかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　本実施例においては、蛍光色素FAM（6-Carboxyfluorescein）を標識したペプチド（K*RRK*RRK*RR）（「K*」はFAM-結合リジンを示す）を付加したIgG BP（1）ペプチド（SEQ ID NO: 25）（全体の配列は、K*RRK*RRK*RRGPDCAYHRGELVWCTFH）を被検ペプチドとして使用した。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群3匹、3群に分け、表3の群構成にて実験を行った。具体的には、
・群1：アジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製)のみ；
・群2：蛍光標識を付加したIgG BP（1）ペプチド（被検ペプチド）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：被検ペプチドと抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
を、ぞれぞれ鼠径部皮下に投与した。それぞれの成分の投与量は、表3に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　投与は、各群のマウスに対して、薬剤を単回投与することにより行った。5時間後に、投与部位近傍の鼠経リンパ節を回収し、組織を破砕してリンパ節細胞を調製した後、抗CD11c抗体、抗I-A/I-E抗体、抗XCR1抗体、および抗CD172a抗体にて染色を行い、フローサイトメトリー解析に供試した。
　cDC1細胞（CD11c+/I-A/I-E+/XCR1+/CD172-）およびcDC2細胞（CD11c+/I-A/I-E+/XCR1-/CD172+）中のFAM陽性細胞の割合に基づき、蛍光標識化IgG BP（1）ペプチドの取り込みを評価した。
　結果を図6に示す。群1と群2の対比および群1と群3の対比の結果、cDC1細胞およびcDC2細胞へのペプチドの取り込みは、ともに、ペプチドワクチンを抗体なしで単独で投与した群（群2）と比較して、抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）を投与した群（群3）において、ペプチド取り込みの促進が示された（図6）。
　実施例8：野生型マウスにおける免疫誘導試験1（従来ワクチンレジメンとの比較試験）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群6匹、5群に分け、表4の群構成にて実験を行った。具体的には、
・群1：ペプチドワクチン（実施例2のH-2Kb拘束性OVA由来のペプチド（3-1）、SEQ ID NO: 30）のみ；
・群2：ペプチド（3-1）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：ペプチド（3-1）と抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）；
・群4：ペプチド（3-1）と抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群5：ペプチド（3-1）、抗マウスCD40抗体、アジュバントのいずれも含まないネガティブコントロール；
を、ぞれぞれ投与した。それぞれの成分の投与量は、表4に記載した通りである。
　投与は、図7に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を7日おきに二回（初回投与日をday0とし、day0およびday7）、皮下投与した。Day14に脾臓を回収し、組織を破砕して脾細胞を調製した後、抗CD8抗体およびPE- OVA Tetramer（MBL, TS-5001-1C）にて染色を行い、フローサイトメトリー解析に供試した。CD8陽性T細胞中のテトラマー陽性細胞割合に基づき、Ova特異的T細胞誘導を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　結果を図8に示す。群1と群2の対比および群3と群4の対比の結果、アジュバントPolyIC:LCの存在下において、T細胞誘導促進能が示された（群1と群2、および群3と群4）（図8）。また、アジュバントPolyIC:LCの存在下において、群2と群4の対比の結果、ペプチドワクチンを抗体なしで単独で投与した群（群2）でもT細胞誘導促進能が示されたが、抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）を投与した群（群4）では、群2と比較して、有意なT細胞誘導促進能が示された（群2および群4）（図8）。
　実施例9：野生型マウスにおける免疫誘導試験2（抗体-ワクチン混合比率の比較試験）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）の抗体とペプチドワクチンの混合比率による免疫誘導能への影響を、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群４匹に分け、表5の群構成にて実験を行った。具体的には、
・群1：2等量のペプチドワクチン（実施例2のH-2Kb拘束性OVA由来のペプチド（3-1）、SEQ ID NO: 30）と1等量の抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群2：2等量のコントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4）、SEQ ID NO: 31）、1等量の抗マウスCD40抗体、およびアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：4等量のペプチド（3-1）と1等量の抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群4：4等量のコントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4））、1等量の抗マウスCD40抗体、およびアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
を、それぞれ投与した。それぞれの投与量は、表5に記載した通りである。
　投与は、図7に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を7日おきに二回（初回投与日をday0とし、day0およびday7）、皮下投与した。Day14に脾臓を回収し、実施例8と同様の方法で、Ova特異的T細胞誘導を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　結果を図9に示す。抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）（抗CD40抗体：Ova-IgG結合ペプチド）の群と、抗体とOva-IgG非結合ペプチドの混合物の群を比較すると、2等量群（群1および群2）および4等量群（群3および群4）のいずれにおいても、複合体における免疫誘導の効率化が認められた（図9）。この結果から、2等量群と4等量群で比較した場合、抗体とOva-IgG結合ペプチド群（群1および群3）および抗体とOva-IgG非結合ペプチド群（群2および群4）いずれにおいても4等量群のほうが強い免疫誘導が観察された。4等量群において過剰に加えられたペプチドによる誘導の効果が上乗せされていることが明らかになった。
　実施例10：野生型マウスにおける免疫誘導試験3（用量依存性試験）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）の用量依存性を、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群4匹に分け、表6の群構成にて実験を行った。具体的には、群1～群4はペプチドワクチンの高用量群（10.5μgのペプチドワクチン）を投与する場合であり、群5～群8はペプチドワクチンの中用量群（2.1μgのペプチドワクチン）を投与する場合である。具体的には、
・群1：高用量（10.5μg）のペプチドワクチン（実施例2のH-2Kb拘束性OVA由来のペプチド（3-1）、SEQ ID NO: 30）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群2：高用量（10.5μg、2等量に相当）のペプチドワクチン（実施例2のペプチド（3-1））と抗マウスCD40抗体（200μg、1等量に相当）による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：高用量（10.0μg）のコントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4）、SEQ ID NO: 31）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群4：高用量（10.0μg、2等量に相当）のコントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4））、抗マウスCD40抗体（200μg、1等量に相当）の抗マウスCD40抗体、およびアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群5：中用量（2.1μg）のペプチドワクチン（実施例2のペプチド（3-1））とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群6：中用量（2.1μg、2等量に相当）のペプチドワクチン（実施例2のペプチド（3-1））と抗マウスCD40抗体（40μg、1等量に相当）による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群7：中用量（2.0μg）のコントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4））とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群8：中用量（2.0μg、2等量に相当）のコントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4））、抗マウスCD40抗体（40μg、1等量に相当）の抗マウスCD40抗体、およびアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
を、それぞれ投与した。それぞれの投与量は、表6に記載した通りである。
　投与は、図7に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を7日おきに二回、皮下投与（初回投与日をday0とし、day0およびday7に投与）した。Day14に脾臓を回収し、実施例8と同様の方法で、Ova特異的T細胞誘導を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　結果を図10に示す。抗体：Ova-IgG結合ペプチド群（群2および群6）は、Ova-IgG結合ペプチド群（群1および群5）、Ova-IgG非結合ペプチド群（群3および群7）、および抗体：Ova-IgG非結合ペプチド群（群4および群8）と比較して高い免疫誘導効果を示した。また、当該効果は用量依存的に認められた（図10）。
　実施例11：担癌マウス試験1（抗体-ペプチドワクチン複合体の評価：抗CD40抗体との複合体）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用し、抗CD40抗体と組み合わせて作製した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスに対し、Ova抗原を強制発現させたマウスT細胞リンパ腫細胞株であるE.G7（ATCC（登録商標）CRL-2113）を一匹あたり1×106 cells、皮下移植した。移植日をDay0とし、Day3に腫瘍体積に基づいて群分け（一群6匹）を行った。各群に対して表7の群構成にて実験を行った。具体的には、それぞれの群に対して、
・群1：生理食塩水のみ（陰性対照）；
・群2：アジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）（陰性対照）；
・群3：ペプチド（3-1）（SEQ ID NO: 30）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群4：ペプチド（3-1）と抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群5：；コントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4）、SEQ ID NO: 31）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群6：コントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4））、抗マウスCD40抗体、およびアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
を、それぞれ皮下投与した。それぞれの接種量は、表7に記載した通りである。
　それぞれの群の薬剤の投与は、各群のマウスに対して、day3およびDay10の合計二回皮下に行い、薬剤投与開始日から週二回の頻度で、腫瘍体積および体重の観察を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　結果を図11及び図12に示す。抗体：Ova-IgG結合ペプチド群（群4）は、Ova-IgG結合ペプチド群（群3）、Ova-IgG非結合ペプチド群（群5）、および抗体：Ova-IgG非結合ペプチド群（群6）と比較して、生体内においても高い腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図11）。
　さらに、それぞれの個体の生存期間を確認したところ、抗体：Ova-IgG結合ペプチド群（群4）は、Ova-IgG結合ペプチド群（群3）、Ova-IgG非結合ペプチド群（群5）、および抗体：Ova-IgG非結合ペプチド群（群6）と比較して、顕著な生存期間の延長効果が確認された（図12）。
　実施例12：野生型マウスにおける免疫誘導試験4（ネオアンチゲンモデル）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、より臨床外挿性の高い試験系、具体的にはがん特有の変異に基づいて選定されたペプチド配列をワクチン配列として採用した試験系において評価することを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群4匹に分け、表8の群構成にて実験を行った。具体的には、
・群1：ペプチドワクチン（実施例2のペプチド（10）、SEQ ID NO: 37）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群2：ペプチドワクチン（実施例2のペプチド（10））と抗マウスCD40抗体）による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：コントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（11）、SEQ ID NO: 38）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群4：コントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（11））、抗マウスCD40抗体の抗マウスCD40抗体、およびアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群5：アジュバントPolyIC:LCのみ
を、それぞれ投与した。それぞれの投与量は、表8に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　投与は、図13に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を4日おきに3回、皮下投与（初回投与日をday0とし、day0およびday4およびday8に投与）した。
　Day15に脾臓を回収した後、3×106細胞を100μlのSplenocyte growth medium（10％FBS（BioWest, S4190）、1 mM sodium pyruvate（Wako, 190-14881）、0.05 mM 2-ME（Wako, 131-14572）、20 mM HEPES（Wako, 345-06681）、1％ペニシリンストレプトマイシン（nakarai、26253-84）を含むRPMI-1640（Thermo 61870-0362）)に懸濁して播種し、ペプチド（8）（SEQ ID NO: 35）を溶解した溶液100μlを終濃度10μg/mlとなるように添加し、37℃、5％CO2条件下で15時間培養した。
　10×Brefeldin A（Biolegend 420601）を22μl添加して3～4時間インキュベートした後に2000 rpmで遠心して細胞を回収し、Zombie Violet（BioLegend 423114）、APC anti-mouse CD4（BioLegend 100412）、FITC anti-mouse CD8a（BioLegend 100706）、PE anti mouse IFN-g（BioLegend 505807）で染色してフローサイトメトリー解析に供試した。CD8陽性細胞中のIFNγ陽性細胞割合に基づき、Adpgkペプチドに対する免疫活性化を評価した。
　結果を図14に示す。抗体：Adpgk-IgG結合ペプチド群（群2）は、Adpgk-IgG結合ペプチド群（群1）、Adpgk-IgG非結合ペプチド群（群3）、および抗体：Adpgk-IgG非結合ペプチド群（群4）と比較して高い免疫誘導効果を示した。このように、抗体結合ネオアンチゲン（群2）で、最も高い免疫誘導が得られていることから、本モデルにおいても抗体ワクチンの有用性が示唆された。
　実施例13：野生型マウスにおける免疫誘導試験5（複数の抗体-ワクチンペプチドの評価）
　本実施例は、実施例3において作製したペプチドワクチンを使用し、CD40抗体またはPD-L1抗体と組み合わせた抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が、免疫誘導する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　本実施例においてはまず、野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群5匹、4群に分け、表9の群構成にて実験を行った。具体的には、
・群1：アジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製)のみ；
・群2：ペプチドワクチン（実施例2のH-2Kb拘束性OVA由来のペプチド（3-1）、SEQ ID NO: 30）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：ペプチド(3-1)と抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群4：ペプチド(3-1)と抗PD-L1抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
を、ぞれぞれ投与した。本実施例において、PD-L1抗体として、ヒトPD-L1抗体（MedChemExpress CAS NO: 1380723-44-3）を使用した。それぞれの成分の投与量は、表9に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　投与は、図15に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を7日おきに2回、皮下投与（初回投与日をday0とし、day0およびday7に投与）した。Day14に脾臓を回収し、実施例8と同様の方法で、Ova特異的T細胞誘導を評価した。
　結果を図16に示す。群2と群3の対比および群2と群4の対比の結果、ペプチドワクチンを抗体なしでアジュバントともに投与した群（群2）でもT細胞誘導促進能が示されたが、CD40抗体-ペプチドワクチン非共有結合複合体を投与した群（群3）と同様に、PD-L1抗体-ペプチドワクチン非共有複合体を投与した群（群4）では、群2と比較して、顕著なT細胞誘導促進能が示された（群3および群4）（図16）。
　実施例14：野生型マウスにおける免疫誘導試験6（複数の抗体-ワクチンペプチドの評価）
　本実施例は、実施例13と同様に、実施例3において作製したペプチドワクチンを使用し、CD40抗体またはPD-L1抗体と組み合わせた抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が、複合体を形成しないペプチドワクチン及び抗体の混合投与に対して、免疫誘導を亢進する能力を有するかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、一群6匹、5群に分け、表10の群構成にて実験を行った。具体的には、
・群1：アジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製)のみ；
・群2：コントロールペプチドとしてのIgG非結合ペプチド（ペプチド（4）、SEQ ID NO: 31）と抗マウスCD40抗体、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群3：ペプチド(3-1)と抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群4：ペプチド（4）と抗PD-L1抗体、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
・群5：ペプチド(3-1)と抗PD-L1抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）に、さらにアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）を添加した混合物；
を、ぞれぞれ投与した。本実施例において、PD-L1抗体として、ヒトPD-L1抗体（MedChemExpress CAS NO: 1380723-44-3）を使用した。それぞれの成分の投与量は、表10に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　投与は、実施例13と同様に、図15に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を7日おきに2回、皮下投与（初回投与日をday0とし、day0およびday7に投与）した。Day14に脾臓を回収し、実施例8と同様の方法で、Ova特異的T細胞誘導を評価した。
　結果を図17に示す。群2と群3の対比および群4と群5の対比の結果、抗体への結合のないペプチドワクチンを抗体とともに投与した群（群2および群4）でもT細胞誘導が示されたが、CD40抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）（群3)、あるいはPD-L1抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）を投与した群（群5）では、顕著なT細胞誘導の亢進が示された（図17）。
　実施例15：担癌マウス試験2（抗体-ペプチドワクチン複合体の評価：抗PD-L1抗体との複合体）
　本実施例は、実施例3で作製したペプチドワクチンを使用し、抗PD-L1抗体と組み合わせて作製した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が、抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスに対し、Ova抗原を強制発現させたマウスT細胞リンパ腫細胞株であるE.G7（ATCC（登録商標）CRL-2113）を一匹あたり1×106cells、皮下移植した。移植日をDay0とし、Day4に腫瘍体積に基づいて群分け（一群6匹）を行った。各群に対して表11の群構成にて実験を行った。具体的には、それぞれの群に対して、
・群1：アジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）（陰性対照）；
・群2：ペプチド（3-1）（SEQ ID NO: 30）とアジュバントPolyICLC（Oncovir社製）との混合物；
・群3：抗PD-L1抗体単体とアジュバントPolyICLC（Oncovir社製）との混合物（コントロール）；
・群4：ペプチド（3-1）と抗PD-L1抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
を、それぞれ皮下投与した。本実施例において、PD-L1抗体として、ヒトPD-L1抗体（MedChemExpress CAS NO: 1380723-44-3）を使用した。それぞれの接種量は、表11に記載した通りである。
　それぞれの群の薬剤の投与は、各群のマウスに対して、day4およびDay11の合計2回皮下に行い、薬剤投与開始日から週二回の頻度で、腫瘍体積および体重の観察を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　結果を図18及び図19に示す。抗体：Ova-IgG結合ペプチド群（群4）は、Ova-IgG結合ペプチド群（群2）、抗PD-L1抗体単体群（群3）と比較して、in vivoにおいても高い腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図18）。
　さらに、それぞれの個体の生存期間を確認したところ、抗体：Ova-IgG結合ペプチド群（群4）は、Ova-IgG結合ペプチド群（群2）、抗PD-L1抗体単体群（群3）と比較して、顕著な生存期間の延長効果が確認された（図19）。
　実施例16：野生型マウスにおける免疫誘導試験7（ネオアンチゲンモデル）
　本実施例は、マウス腫瘍細胞株のnon-synonymous体細胞変異配列を含む抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）が抗腫瘍効果を有するかどうかを、in vivoにおいて調べることを目的として行った。
　まず、マウス腫瘍細胞株のnon-synonymous体細胞変異配列として、マウス腫瘍細胞株MC-38から得られたゲノム配列の解析結果に基づいて、non-synonymous体細胞変異配列を含むペプチド（各27mer、ペプチド（101）～ペプチド（130）の30ペプチド）を、下記の表12の通り作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　次に、上記表記載のペプチドワクチン（27mer、ペプチド（101）～ペプチド（130））に対してIgG BP（1）（SEQ ID NO: 25）を付加したペプチド（各44mer、ペプチド（101BP）～ペプチド（130BP）の30ペプチド）を、下記の表13の通り作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
　野生型マウスC57BL/6（日本クレア）7週齢、メスを、2群に分け、表14の群構成にて実験を行った。具体的には、それぞれの群に対して、
・群1：上記表12記載のペプチドワクチン（各27mer、ペプチド（101）～ペプチド（130））を、6ペプチドずつプールしたワクチンペプチド（例：プール01（ペプチド（101）～ペプチド（106））、プール06（ペプチド（125）～ペプチド（130）））とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物；
・群2：上記表13記載のIgG結合性ペプチド（各44mer、ペプチド（101BP）～ペプチド（130BP））に対して、抗マウスCD40抗体を複合体化した抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）を、3ペプチドずつプールした抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）（例：プール11（ペプチド（101BP）～ペプチド（103BP））、プール20（ペプチド（128BP）～ペプチド（130BP）））とアジュバントPolyIC:LC（Oncovir社製）との混合物;
を、各プール毎に2匹のマウスに皮下投与した。それぞれの接種量は、表14に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　投与は、図20に示すスケジュールで行った。具体的には、各群のマウスに対して、薬剤を7日おきに3回、皮下投与（初回投与日をday0とし、day0、day7およびday14に投与）した。Day21に脾臓を回収した後、2×106細胞を100μlのSplenocyte growth medium（10％FBS（BioWest, S4190）、1 mM sodium pyruvate（Wako, 190-14881）、0.05 mM 2-ME（Wako, 131-14572）、20 mM HEPES（Wako, 345-06681）、1％ペニシリンストレプトマイシン（Nakarai、26253-84）を含むRPMI-1640（Thermo 61870-0362）)に懸濁して、マウスIFN-γ抗体(MabTech)をコーティングしたフィルタープレート(Millipore)に播種し、表15に記載するそれぞれのペプチドのエピトープペプチドであるペプチド（101e）～ペプチド（130e））（SEQ ID NO: 74～SEQ ID NO: 103）を個別に溶解した溶液100μlを終濃度10μg/mlとなるように添加し、37℃、5％CO2条件下で15時間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　脾臓細胞と添加した各ペプチドをアスピレートにより除去し、さらにフィルタープレートを洗浄後、biotin標識マウスIFN-γ抗体 (MabTech) 100μLを添加して37℃で2時間インキュベートした。フィルタープレートを洗浄し、Streptavidin-ALP  (MabTech) 100μlを添加しさらに1時間インキュベートした。フィルタープレートを再度洗浄し、基質溶液（MabTech; BCIP/NBT-plus) 100μLを添加し、細胞が分泌したIFNγを検出した。
　結果を図21に示す。27merペプチドワクチン群（群1）と比較し、抗マウスCD40抗体による抗体-ペプチドワクチン複合体（非共有結合型）を投与した群（群2）は、同一エピトープ配列に対してより強い免疫応答が起きていることが確認された。
　本発明において開示する、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンは、ペプチドワクチンの特定の免疫細胞（例えば樹状細胞）表面へのデリバリーを効率的に行うことができ、その活性化を亢進し、ペプチドワクチンの効果を増強することができる。

Claims (21)

  1. 　IgG結合ペプチドと組み合わせた、ペプチドワクチン。
  2. 　ペプチドワクチンが、がんワクチン、感染症ワクチンからなる群から選択される、請求項1に記載のペプチドワクチン。
  3. 　ペプチドワクチンが、がん関連抗原、がんネオアンチゲン、がん個別化ネオアンチゲンからなる群から選択される、がんワクチンである、請求項2に記載のペプチドワクチン。
  4. 　IgG結合ペプチドが、
    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Cys Xaa4 Xaa5 His Xaa6 Gly Xaa7 Leu Val Trp Cys Xaa8 Xaa9 Xaa10（SEQ ID NO: 1）
    ［SEQ ID NO: 1において、
    　Xaa1、Xaa2、Xaa9、Xaa10の各々はCys以外の任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、またはXaa1とXaa2を合わせてArg Arg Gly Proであり、
    　Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa8、の各々はCys以外の任意のアミノ酸であり、
    　Xaa6はLys、Cys、Asp、Glu、Arg、Leu、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    　Xaa7はGlu、AsnまたはGlnである］、または
    Xaa11 Xaa12 Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Xaa13 Ile Xaa14 Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 2）
    ［SEQ ID NO: 2において、
    　Xaa11は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、β-Ala、2-アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、及びNH 2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在せず、
    　Xaa12は、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、Phe、2-アミノスベリン酸、及びジアミノプロピオン酸からなる群から選択され、
    　Xaa13およびXaa14は、それぞれ独立に、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、及びCysからなる群から選択される］、
    からなる群から選択される、請求項1～3のいずれか1項に記載のペプチドワクチン。
  5. 　Xaa4がAla、Ser、およびThrからなる群から選択され、
    　Xaa5がTyrまたはTrpである、
    請求項1～4のいずれか1項に記載のペプチドワクチン。
  6. 　IgG結合ペプチドが、
    Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr （SEQ ID NO: 3）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 4）
    Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser （SEQ ID NO: 5）
    Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 6）
    Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 7）
    Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 8）
    Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 9）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 10）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His His （SEQ ID NO: 11）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 12）
    Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 13）
    Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 14）
    Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr His （SEQ ID NO: 15）
    Gly Xaa2 Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa9 His （SEQ ID NO: 16）
    Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 17）
    Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 18）、
    Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 19）、
    Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 20）、
    Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 21）、
    Lys Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 22）、
    Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp （SEQ ID NO: 23）、又は
    Gly Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 24）
    からなる群から選択される、請求項4に記載のペプチドワクチン。
  7. 　IgG結合ペプチドが、
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 25）または
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 26）
    Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 39）
    Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 40）
    である、請求項6に記載のペプチドワクチン。
  8. 　IgG結合ペプチドに、IgGを結合させた、請求項1～7のいずれか1項に記載のペプチドワクチン。
  9. 　IgGが、ペプチドワクチンをデリバリーする免疫細胞に特徴的な標的物質に対する抗体である、請求項8に記載のペプチドワクチン。
  10. 　免疫細胞が、抗原提示細胞、樹状細胞、B細胞からなる群から選択される、請求項9に記載のペプチドワクチン。
  11. 　IgGが、抗CD40抗体、抗PD-L1抗体、抗DEC205抗体、抗DCIR抗体、抗Mannose receptor抗体、抗DC-SIGN抗体、抗CD11c抗体、抗Dectin-1抗体からなる群から選択される、請求項8～10のいずれか1項に記載のペプチドワクチン。
  12. 　IgG、IgG結合ペプチド、IgG結合ペプチドと組み合わせたペプチドワクチンを使用して、IgGが標的とする分子を細胞表面に有する細胞にペプチドワクチンをデリバリーする方法。
  13. 　ペプチドワクチンが、がんワクチン、感染症ワクチンからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
  14. 　ペプチドワクチンが、がん関連抗原、がんネオアンチゲン、がん個別化ネオアンチゲンからなる群から選択される、がんワクチンである、請求項13に記載の方法。
  15. 　IgG結合ペプチドが、
    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Cys Xaa4 Xaa5 His Xaa6 Gly Xaa7 Leu Val Trp Cys Xaa8 Xaa9 Xaa10（SEQ ID NO: 1）
    ［SEQ ID NO: 1において、
    　Xaa1、Xaa2、Xaa9、Xaa10の各々はCys以外の任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、またはXaa1とXaa2を合わせてArg Arg Gly Proであり、
    　Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa8、の各々はCys以外の任意のアミノ酸であり、
    　Xaa6はLys、Cys、Asp、Glu、Arg、Leu、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、 
    　Xaa7はGlu、AsnまたはGlnである］、または
    Xaa11 Xaa12 Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Xaa13 Ile Xaa14 Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 2）
    ［SEQ ID NO: 2において、
    　Xaa11は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、β-Ala、2-アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、及びNH 2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在せず、
    　Xaa12は、Lys、オルニチン、Cys、Asp、Glu、Phe、2-アミノスベリン酸、及びジアミノプロピオン酸からなる群から選択され、
    　Xaa13およびXaa14は、それぞれ独立に、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、及びCysからなる群から選択される］、
    からなる群から選択される、請求項12～14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 　Xaa4がAla、Ser、およびThrからなる群から選択され、
    　Xaa5がTyrまたはTrpである、
    請求項12～15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 　IgG結合ペプチドが、
    Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr （SEQ ID NO: 3）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 4）
    Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser （SEQ ID NO: 5）
    Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 6）
    Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 7）
    Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 8）
    Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 9）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe His （SEQ ID NO: 10）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His His （SEQ ID NO: 11）
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 12）
    Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 13）
    Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe Tyr （SEQ ID NO: 14）
    Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr His （SEQ ID NO: 15）
    Gly Xaa2 Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa9 His （SEQ ID NO: 16）
    Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa6 Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His （SEQ ID NO: 17）
    Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 18）、
    Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 19）、
    Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 20）、
    Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 21）、
    Lys Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 22）、
    Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp （SEQ ID NO: 23）、又は
    Gly Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys （SEQ ID NO: 24）
    からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
  18. 　IgG結合ペプチドが、
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 25）または
    Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 26）
    Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 39）
    Gly Pro Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe His（SEQ ID NO: 40）
    である、請求項17に記載の方法。
  19. 　IgGが、ペプチドワクチンをデリバリーする免疫細胞に特徴的な標的物質に対する抗体である、請求項12～18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 　免疫細胞が、抗原提示細胞、樹状細胞、B細胞からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
  21. 　IgGが、抗CD40抗体、抗PD-L1抗体、抗DEC205抗体、抗DCIR抗体、抗Mannose receptor抗体、抗DC-SIGN抗体、抗CD11c抗体、抗Dectin-1抗体からなる群から選択される、請求項19または20に記載の方法。
PCT/JP2021/016133 2020-04-23 2021-04-21 改良ペプチドワクチン WO2021215462A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202180044705.1A CN115702002A (zh) 2020-04-23 2021-04-21 改良肽疫苗
JP2022517065A JPWO2021215462A1 (ja) 2020-04-23 2021-04-21
EP21793632.7A EP4140501A1 (en) 2020-04-23 2021-04-21 Improved peptide vaccine
US17/996,866 US20230210967A1 (en) 2020-04-23 2021-04-21 Improved peptide vaccine

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020076785 2020-04-23
JP2020-076785 2020-04-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021215462A1 true WO2021215462A1 (ja) 2021-10-28

Family

ID=78269119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/016133 WO2021215462A1 (ja) 2020-04-23 2021-04-21 改良ペプチドワクチン

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230210967A1 (ja)
EP (1) EP4140501A1 (ja)
JP (1) JPWO2021215462A1 (ja)
CN (1) CN115702002A (ja)
WO (1) WO2021215462A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4616555B2 (ja) 2001-11-09 2011-01-19 ファイザー・プロダクツ・インク Ｃｄ４０に対する抗体
JP5780693B2 (ja) * 2005-12-21 2015-09-16 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
WO2016186206A1 (ja) 2015-05-20 2016-11-24 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドによる抗体の特異的修飾
WO2018230257A1 (ja) 2017-06-16 2018-12-20 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4616555B2 (ja) 2001-11-09 2011-01-19 ファイザー・プロダクツ・インク Ｃｄ４０に対する抗体
JP5780693B2 (ja) * 2005-12-21 2015-09-16 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
WO2016186206A1 (ja) 2015-05-20 2016-11-24 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドによる抗体の特異的修飾
WO2018230257A1 (ja) 2017-06-16 2018-12-20 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. AEI27235.1
CANCER SCI., vol. 108, no. 12, December 2017 (2017-12-01), pages 2430 - 2437
CANCER SCI., vol. 109, no. 9, September 2018 (2018-09-01), pages 2660 - 2669
CAS , no. 1380723-44-3
DIAMOS ANDREW G., PARDHE MARY D., SUN HAIYAN, HUNTER JOSEPH G. L., KILBOURNE JACQUELYN, CHEN QIANG, MASON HUGH S.: "A Highly Expressing, Soluble, and Stable Plant-Made IgG Fusion Vaccine Strategy Enhances Antigen Immunogenicity in Mice Without Adjuvant", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 11, XP055868221, DOI: 10.3389/fimmu.2020.576012 *
FIFIS T. ET AL., VACCINE, vol. 23, no. 2, 25 November 2004 (2004-11-25), pages 258 - 66
J TRANSL MED, vol. 3, no. 23, 26 May 2005 (2005-05-26)
MATSUO HIDENORI, SOMIYA MASAHARU, IIJIMA MASUMI, ARAKAWA TAKESHI, KURODA SHUN’ICHI: "CD11c-specific bio-nanocapsule enhances vaccine immunogenicity by targeting immune cells", JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY, vol. 16, no. 1, 1 December 2018 (2018-12-01), pages 59, XP055868215, DOI: 10.1186/s12951-018-0386-6 *
NATURE, vol. 515, no. 7528, 27 November 2014 (2014-11-27), pages 572 - 6
WANG YU, ZHU XIAO MING, WANG FANG, WU SHUAI, WANG ZI CHENG, DU ZHI YAN, YAN JIN QI, YU JI YUN: "Design, expression, and characterization of a novel dendritic cell-targeted proteins", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 460, no. 2, 1 May 2015 (2015-05-01), Amsterdam NL , pages 227 - 232, XP055868219, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.03.015 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4140501A1 (en) 2023-03-01
CN115702002A (zh) 2023-02-14
JPWO2021215462A1 (ja) 2021-10-28
US20230210967A1 (en) 2023-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7037506B2 (ja) Ｃｄ３結合ドメインを有する多量体ｉｌ－１５系分子の構築及び特性評価
JP6993240B2 (ja) 結腸直腸癌を治療するための細胞透過性ペプチド、カーゴ、及びｔｌｒペプチドアゴニストを含む新規複合体
KR102557834B1 (ko) 신규의 세포 태그의 발현
JP5798919B2 (ja) Ｐｄ−１アンタゴニストの組成物および使用方法
JP2020533971A (ja) Ｉｌ−１５をベースとするｉｌ−７及びｉｌ−２１への融合物
JP2022535429A (ja) 免疫療法のための操作されたナチュラルキラー細胞と操作されたｔ細胞の組み合わせ
WO2016168766A1 (en) Optimized chimeric receptor t cell switches and uses thereof
JP2019508444A (ja) 医療において使用するための、免疫チェックポイントモジュレータと、細胞透過性ペプチド、カーゴ、及びｔｌｒペプチドアゴニストを含む複合体との組合せ
JP2021513570A (ja) サイトカインをコードするｒｎａを用いた治療
AU2012286690A1 (en) Dendritic cell (DC)-vaccine therapy for pancreatic cancer
WO2015002134A1 (ja) 細胞性免疫誘導ワクチン
JP2021500878A (ja) 免疫療法のためのｔ細胞受容体
JP2017503810A (ja) 癌治療のための改善された細胞組成物および方法
JP2022538974A (ja) 免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体およびその方法
KR20220035032A (ko) 변이체 icos 리간드(icosl) 융합 단백질의 방법 및 용도
TW202144569A (zh) 用於調節免疫細胞中精胺酸含量之方法及組合物
JP2022528422A (ja) インターロイキン２（ｉｌ２）およびインターフェロン（ｉｆｎ）を含む治療
JP6077641B2 (ja) 新規ｃｔｌエピトープ５連結ペプチド
WO2021215462A1 (ja) 改良ペプチドワクチン
JP2022519713A (ja) Ｃａｒ操作されたｔ細胞およびサイトカインを含む治療
JP2022525921A (ja) 免疫エフェクタ細胞の特異的活性化のためのインターロイキン２受容体（ｉｌ２ｒ）およびインターロイキン２（ｉｌ２）バリアント
US20220177548A1 (en) Methods and Compositions for Treating Melanoma
TWI805792B (zh) 抗腫瘤劑及其評估方法
KR20230107810A (ko) Pd-l1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원
TW202118780A (zh) Ｉｉ類ｍｈｃ分子及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21793632

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022517065

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021793632

Country of ref document: EP

Effective date: 20221123