CN1980957A

CN1980957A - 受体偶联剂及其治疗用途

Info

Publication number: CN1980957A
Application number: CNA2005800165978A
Authority: CN
Inventors: 杰弗里·L·布朗宁; 维罗尼克·贝利; 埃伦·加伯
Original assignee: Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2004-03-23
Filing date: 2005-03-23
Publication date: 2007-06-13
Also published as: KR20060132006A; SG151294A1; WO2005092927A1; US20070154476A1; US20100266542A1; IL178254A0; JP2007530588A; US7947271B2; NZ550518A; BRPI0509201A; US7799902B2; AU2005227322A1; EP1756162A1; CA2560742A1; EP2332992A1

Abstract

披露了受体偶联剂，包括包含抗TNF受体结合部分的多价构建物，用于在受试者中治疗癌症及抑制肿瘤体积。

Description

受体偶联剂及其治疗用途

发明背景

肿瘤学家已从事各种TNF家族成员诱导细胞死亡能力的研究近20年。最初，TNF自身用于治疗实体瘤，最后发现通过四肢灌注能用于黑素瘤局部治疗(Lejeune等(1998)Curr Opin Immunol 10：573)。最近，通过配体或抗受体抗体活化TNF受体在临床上引起了注意。例如，Fas受体的活化已显示出相当可观的前景，尽管其可能受限于肝脏毒性。对于另一个TNF家族成员，已报道通过TRAIL配体活化TRAILR1或TRAILR2能转导凋亡信号至对TRAIL敏感的癌细胞(Griffith等，J.Immunol.162：2597，1999；和Degli-Esposti等，Immunity，7：813-820，1997)。对于还有一个TNF家族成员，通过可溶性配体或激动性抗受体单克隆抗体活化LT-β-R也已显示能诱导某些癌瘤死亡(Lawerence等，(2001)Nat Med 7：383；Ichikawa等，(2001)Nat Med7：954)。因此，使用激动剂TNF活化剂治疗应当能用于治疗或减轻受试者(如人)中瘤形成的进展、严重程度或效应。

发明概述

本发明描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂。在一个实施方案中，所述受体偶联剂增强受体信号传导。在另一个实施方案中，所述受体偶联剂诱导异聚受体复合物形成。在一个实施方案中，所述受体偶联剂包含对一种受体的第一结合特异性和对另一种受体的第二结合特异性。在一个实施方案中，所述第一结合特异性为抗体或其抗原结合片段所赋予或实现。在另一个实施方案中，所述第二结合特异性为抗体或其抗原结合片段所赋予或实现。所述结合特异性可为例如单链Fv片段所赋予。在另一个实施方案中，所述第一结合特异性为受体的天然配体所实现，且第二结合特异性衍生自抗体或其抗原结合片段。在还有一个实施方案中，所述第一结合特异性为受体的天然配体所赋予，且第二结合特异性为受体的天然配体所赋予。

本发明描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中至少一种受体含死亡域。在一个实施方案中，所述受体偶联剂增强受体信号传导或诱导异聚受体复合物形成，其中至少一种受体含死亡域。在一个实施方案中，所述含死亡域的受体选自：TNFR1(DR1)、Fas(DR2)、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、DR6和p75NGF-R。

本发明包括一种活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中至少一种受体不含死亡域。本发明还描述了一种增强受体信号传导或诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂，其中至少一种受体不含死亡域。在一个实施方案中，所述受体不合死亡域且与组织分化有关。在另一个实施方案中，所述不含死亡域的受体选自：LTBR、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn14、Troy/Trade和TAJ。

本发明还描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中至少一种受体与组织分化有关。本发明还描述了一种增强受体信号传导或诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂，其中至少一种受体与组织分化有关。在一个实施方案中，所述受体选自：LTBR、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn14、Troy/Trade/TAJ和p75NGF-R。

在一个实施方案中，所述受体偶联剂活化不含死亡域的TNF受体和含死亡域的受体，如LTBR/TRAIL-R1；LTBR/TRAIL-R2；LTBR/p75NGF-R；Fn14/p75NGF-R；和p75NGF-R/TAJ。

在另一个实施方案中，所述受体偶联剂活化至少两种不含死亡域的TNF受体，如LTBR/Fn14；LTBR/RANK；Fn14/TAJ；LTBR/EDAR；LTBR/XEDAR；RANK/EDAR；RANK/XEDAR；TAJ/EDAR；和TAJ/XEDAR。

在本发明的还有一个实施方案中，所述受体偶联剂活化至少两种含死亡域的受体。

此外，本发明描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中至少一种受体与免疫调节有关。在一个实施方案中，所述受体选自：TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、TACI、BAFF-R、BCMA和RELT。

本发明提供了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中至少一种受体在正常肝细胞或内皮细胞上不过表达。

本发明还描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中所述受体偶联剂包含对一种受体的第一结合特异性和对另一种受体的第二结合特异性。在一个实施方案中，所述受体偶联剂增强受体信号传导或诱导异聚受体复合物形成。在一个实施方案中，所述第一结合特异性由抗LTβ受体(LTβR)抗体或其抗原结合片段所赋予或衍生。抗LTβR抗体的例子包括人源化CBE11抗体。在一个实施方案中，所述第二结合特异性由抗TRAIL-R2抗体或其抗原结合片段所赋予或衍生。抗TRAIL-R2抗体的例子是人源化或嵌合14A2抗体。在另一个实施方案中，所述第一结合特异性为人源化CBE11抗体的单链Fv片段所赋予，且第二结合特异性为14A2抗体所赋予。

本发明描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中所述受体偶联剂包含对一种受体的第一结合特异性和对另一种受体的第二结合特异性，其中所述第一结合特异性包含至少两个通常由三个二聚Fc结构域和六个配体分子形成的三聚配体-Fc构建物。在该情况下，所述第二结合特异性应由三个抗体分子构成。

本发明描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体的受体偶联剂，其中至少一种TNF家族受体不常见于细胞表面上的筏环境(raftenvironment)中。在一个实施方案中，所述受体偶联剂增强受体信号传导或诱导异聚受体复合物形成，其中至少一种TNF家族受体不常见于细胞表面上的筏环境中。

本发明包括一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、或诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂，其中至少一种TNF家族受体常见于细胞表面上的筏环境中。

本发明还描述了一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体或增强受体信号传导的受体偶联剂，其中所述信号强度经由受体增强。

本发明包括一种包含至少两种抗体或其抗原结合片段的受体偶联剂，其中每种抗体结合不同TNF家族受体，由此诱导异聚受体复合物的形成。在一个实施方案中，所述抗体衍生自抗LTβR抗体，包括例如人源化CBE11抗体。在另一个实施方案中，所述第二抗体衍生自抗TRAIL-R2抗体，包括例如人源化或嵌合14A2抗体。

在一个实施方案中，本发明包括一种用于将TNF家族受体定位至细胞膜筏的方法，包括给予一种包含对筏化TNF家族受体的第一结合特异性和对非筏化TNF家族受体的第二结合特异性的受体偶联剂，其中所述受体偶联剂的结合将非筏化TNF受体定位至细胞膜中的筏。

本发明还包括一种用于增强受体信号传导的方法，包括给予一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、和诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂。

在还有一个实施方案中，本发明描述了一种减小肿瘤体积的方法，包括给予受试者一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、或诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂。

在还有一个实施方案中，本发明包括一种治疗癌症的方法，包括给予受试者一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、或诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂。在一个实施方案中，所述受体偶联剂在IFNγ存在下给予。在另一个实施方案中，所述受体偶联剂在化疗剂存在下给予。

本发明还包括一种活化至少两种不同TNF家族受体并诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂，其包含针对第一TNF受体的第一结合特异性和针对第二TNF受体的第二结合特异性。在一个实施方案中，所述第一和第二结合特异性针对TNF受体，包括一种不含死亡域的TNF受体和一种含死亡域的TNF受体；两种不含死亡域的TNF受体；或两种含死亡域的TNF受体。在另一个实施方案中，至少一种结合特异性针对与组织分化相关的不含死亡域的TNF受体。在还有一个实施方案中，两种不含死亡域的TNF受体选自：LTBR/Fn14；LTBR/RANK；Fn14/TAJ；LTBR/EDAR；LTBR/XEDAR；RANK/EDAR；RANK/XEDAR；TAJ/EDAR；和TAJ/XEDAR。在本发明的另一个实施方案中，所述不含死亡域的TNF受体和含死亡域的TNF受体选自：LTBR/TRAIL-R1；LTBR/TRAIL-R2；LTBR/p75NGF-R；Fn14/p75NGF-R；和p75NGF-R/TAJ。

附图简述

图1图示的是WiDr细胞4天增殖测定的结果。结果显示抗TRAIL-R2抗体14A2和抗LTβR抗体CBE11都能通过激动剂活性诱导WiDr死亡。

图2图示的是在WiDr结肠癌瘤细胞中4天MTT生长测定的结果。结果证实了双特异性LTβR/TRAIL-R2抗体(LT-BS1)较单独的亲本抗体CBE11和14A2(图2a)具有更强的细胞死亡活性(图2b)。

图3图示的是在WiDr结肠癌瘤细胞中用80U/ml IFNγ的4天MTT生长测定的结果，比较了LTβR/TRAIL-R2双特异性抗体(LT-BS1)与四价LTβR双特异性抗体LL-BS1(抗体CBE11和BHA10)和LL-MS1(抗体CBE11)。

图4图示的是在LS174T肿瘤细胞中用或不用80U/ml IFNγ的4天MTT生长测定的结果。结果显示了受体偶联剂LT-BS1及抗体14A2和CBE11在抑制结肠癌瘤细胞(LS174T肿瘤细胞)生长方面的功效。

图5图示的是在ME180肿瘤细胞中用或不用80U/ml IFNγ的4天MTT生长测定的结果。结果证实了受体偶联剂LT-BS1及抗体14A2和CBE11在抑制***瘤细胞(ME180肿瘤细胞)生长方面的功效。

图6图示的是在MDA213肿瘤细胞中用或不用80U/ml IFNγ的4天MTT生长测定的结果。结果显示受体偶联剂LT-BS1及抗体14A2和CBE11在抑制***癌瘤细胞(MDA231肿瘤细胞)生长方面的功效。

图7图示的是在Hela肿瘤细胞中用或不用80U/ml IFNγ的4天MTT生长测定的结果。结果证实了受体偶联剂LT-BS1及单独的抗体14A2和CBE11在抑制Hela***瘤细胞生长方面的功效。

图8图示的是在一组肿瘤细胞类型中用80U/ml IFNγ的4天MTT生长测定的结果，所述肿瘤细胞包括***、宫颈和结肠肿瘤细胞。结果显示受体偶联剂LT-BS1和五聚CBE11抗体在抑制多种类型癌瘤细胞生长方面的功效，所述癌瘤细胞包括***(A，B)、宫颈(C)和结肠(D)。

图9描述的是包含抗TRAIL-R2抗体14A2和LTβR scFv抗体CBE11(带条纹的)的受体偶联剂LT-BS1构建物的示意图。

发明详述

I.定义

为了方便，在进一步描述本发明之前，在此定义在说明书、实施例和所附的权利要求书中使用的某些术语。

术语“给予”包括递送本发明化合物的任何方法，包括但不限于递送药用组合物或治疗剂入受试者***中或入受试者的特定区域中或上。在此使用的短语“全身用药”、“全身给药”、“外周用药”和“外周给药”意指除直接给予中枢神经***外，给予化合物、药物或其它物质，使得其进入病人***中且因此经历了新陈代谢和其它类似的过程，例如皮下用药。“肠胃外投药”和“肠胃外给药”指不同于肠内和局部的给药方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

在此使用的术语“抗体”意指完整的抗体，以及赋予本发明构建物以期望结合特异性的其Fab、Fab’、F(ab)₂、F_v和其它片段。抗体包括例如单克隆抗体诸如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、抗独特型抗体、抗抗独特型抗体和人源化抗体，及其多价形式。术语“免疫球蛋白”或“抗体”(在此可互换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本四多肽链结构、具有特异性结合抗原的能力的抗原结合蛋白，所述链通过例如链间二硫键稳定。重链和轻链都折叠为结构域。术语“(结构)域”指包含肽环(如包含3-4个肽环)、通过例如β-折叠和/或链内二硫键稳定的重链或轻链多肽球状区。在此域还称为“恒定”或“可变”的，基于：在类别各个成员的域中相对缺乏序列变异则为“恒定”域，或在类倍各个成员的域中存在明显变异则为“可变”域。轻链上的“恒定”域可互换的称为“轻链恒定区”、“轻链恒定域”、“CL”区或“CL”域。重链上的“恒定”域可互换的称为“重链恒定区”、“重链恒定域”、“CH”区或“CH”域。轻链上的“可变”域可互换的称为“轻链可变区”、“轻链可变域”、“VL”区或“VL”域。重链上的“可变”域可互换的称为“重链可变区”、“重链可变域”、“CH”区或“CH”域。

术语“区”指抗体链的一部分并包括在此定义的恒定域或可变域，以及所述域的更多离散部分。例如，轻链可变域或可变区包括在此定义的散布在“框架区”或“FR”中的“互补决定区”或“CDR”。

免疫球蛋白或抗体可以单体或多聚体的形式存在。术语“抗原结合片段”指结合抗原或与完整抗体(即衍生其的完整抗体)竞争对抗原的结合(即特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。术语“构造”指蛋白质或多肽(如抗体、抗体链、其域或区)的三级结构。例如，短语“轻(或重)链构造”指轻(或重)链可变区的三级结构，而短语“抗体构造”或“抗体片段构造”指抗体或其片段的三级结构。通过重组DNA技术或通过酶或化学切割完整免疫球蛋白产生结合片段。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fabc、Fv、单链和单链抗体。除“双特异性”或“双功能”免疫球蛋白或抗体外，认为免疫球蛋白或抗体各自具有相同的结合位点。“双特异性”或“双功能抗体”是具有两对不同的重/轻链和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。可通过多种方法产生双特异性抗体，包括杂交瘤融合或Fab′片段连接。参见如Songsivilai和Lachmann，(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等，(1992)J.Immunol.148：1547-1553。

术语“抗体构建物”指包含两个或更多来自抗体重链和轻链可变域的抗原结合片段的重组分子。抗体构建物可包含来自五类Ig(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)任一的抗体的完整或部分恒定区。例如，抗体构建物可由其重链在其C-末端包含单链可变片段的抗体制成。在另一个例子中，抗体构建物可由抗体两条重链的完整或部分恒定区制成，所述重链在其羧基和氨基末端包含单链可变片段。一个赋予所需结合特异性的抗体构建物的例子示于图9。在又一个例子中，抗体构建物可包含两条具有两个或更多可变区的重链和两条具有一个或多个可变区的轻链，这里这两条重链通过二硫键或其它共价键连接。在另一个例子中，抗体构建物可包含两条重链，所述重链包含两个或更多可变区，这里两条重链通过二硫键或其它共价键连接。

在此使用的术语“抗原”指与特异性抗体反应的分子。

术语“抗原结合位点”或“抗原识别位点”指特异性结合抗原上表位的抗体区域。

在此使用的术语“凋亡”、“凋亡性细胞死亡”或“程序性细胞死亡”指在细胞分化的特定阶段和应答特定刺激而发生的细胞事件级联所导致的任何细胞死亡。凋亡性细胞死亡通常表现为濒死细胞的细胞质和细胞核凝聚。

术语“结合特异性”是针对特定TNF家族受体的结合部分所赋予、给予、实现或衍生的，所披露受体偶联剂的特性。本发明的结合特异性可由结合部分所赋予，包括例如抗体或其抗原结合片段、单链Fv片段可溶性配体、fc融合体等。本领域技术人员应当理解，为了本申请，术语“结合特异性”和“结合部分”可互换使用，除非上下文另有限制性规定。因此，结合特异性(结合部分)亦可包括与TNF家族受体相互作用的TNF配体。在本发明的一个实施方案中，受体偶联剂包含至少一个对一种TNF受体的结合特异性(或结合部分)，及对另一种TNF受体的第二结合特异性(或结合部分)。

术语“癌症”或“瘤形成”通常指任何恶性新生物或细胞的自发性生长或增殖。在此使用的术语既包括充分发育的恶性新生物，又包括癌变前损伤。患“癌症”的受试者可具有例如肿瘤或白细胞增殖诸如白血病。在某些实施方案中，患癌症的受试者是具有肿瘤诸如实体瘤的受试者。与实体瘤相关的癌症包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)、睾丸癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌、***、胰癌、结肠直肠癌(CRC)、乳癌，及***、胃(gastric)、皮肤、胃(stomach)、食管和膀胱癌。

术语“化疗剂”指用于治疗由外来细胞或恶性细胞诸如肿瘤细胞引起的疾病的任何小分子或生物学化疗剂。化疗剂的非限制性例子包括DNA合成破坏剂、拓扑异构酶I抑制剂、烷化剂，或是植物生物碱。例示性生物学化疗剂包括利rituximab(妥昔单抗)、ibritumomab、bevacizumab(贝伐单抗)和trastuzumab(曲妥单抗)。本领域技术人员应当理解，与本申请的教学相容的其它化疗剂是易于辨别的。

术语“DNA合成破坏剂”指能降低或抑制DNA合成过程的任何分子或化合物。DNA合成破坏剂的例子包括但不限于核苷类似物，诸如嘧啶或嘌呤类似物，包括例如但不限于吉西他滨或蒽环类抗生素化合物，包括例如但不限于阿霉素、柔红霉素、多柔比星和伊达比星，及鬼臼乙叉甙诸如依托泊苷和替尼泊苷。术语“拓扑异构酶I抑制剂”指抑制或降低拓扑异构酶I酶的生物学活性的分子或化合物。包括例如但不限于camptosar(伊立替康)。术语“烷化剂”指能与(例如胺类、醇类、酚类、有机和无机酸)的亲核基团反应并由此添加烷基(例如乙基或甲基)到另一分子诸如蛋白质或核酸上的任何分子或化合物。用作化疗剂的烷化剂例子包括白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、美法仑、塞替派、各种亚硝基脲化合物、和铂化合物诸如顺铂和卡铂。术语“植物生物碱”指属于衍生自植物，具有生物学活性和细胞毒性的碱性、含氮分子家族的化合物。植物生物碱的例子包括但不限于紫杉烷类，诸如紫杉醇、docetaxel和paclitaxel，及长***类，诸如长春碱、长春新碱和长春瑞滨。

术语“嵌合抗体”指其轻链和重链基因业已自属于不同物种的免疫球蛋白基因片断得到构建的抗体，一般通过遗传工程。例如，来自小鼠单克隆抗体基因的可变区(V)片断可连接到诸如IgG1和IgG4的人恒定区(C)片断上。优选人同种型IgG1。因此，典型的嵌合抗体是由来自小鼠抗体的V或抗原结合域和来自人抗体的C或效应域组成的杂合蛋白。

术语“死亡域”指TNF家族受体中与TNF介导的细胞死亡信号传导及通过这些受体介导的细胞-细胞毒性诱导相关的细胞质区。该区经由衔接蛋白偶联受体至级联活化，导致外在死亡途径的活化。含死亡域的TNF受体的例子包括但不限于TNFR1(DR1)、Fas(DR2)、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、p75NGFR和DR6。

术语“有效量”指包含本发明化合物的化合物、物质或组合物足以实现所需效果的量，所述效果包括但不限于例如在体外或在体内缩小肿瘤体积。本发明药用组合物的有效量是药用组合物足以实现所需临床效果的量，所述临床效果包括但不限于例如改善、稳定、阻止或延迟病人中癌症的进展。在这两种情况下，可一次或多次给予本发明化合物的有效量。对上述这些指标的检测和测量是本领域技术人员所公知的，包括但不限于例如肿瘤负担减少、肿瘤体积抑制、继发性肿瘤增殖减缓、肿瘤组织中的基因表达、生物标记的存在、***连累、组织学分级和细胞核分级。

术语“表位”指抗原中抗体或抗体构建物优先且特异结合的区。单克隆抗体优先结合分子中可在分子水平定义的单一特异表位。在本发明中，可通过多特异性抗体识别多重表位。

术语“Fv片段”指包含其重链和轻链可变域的抗体片段。术语Fc片段指包含其重链恒定域的抗体片段。

术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”指包括至少一条人源化免疫球蛋白或抗体链(即至少一条人源化轻链或重链)的免疫球蛋白或抗体。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)指可变区的可变框架区基本上来自人免疫球蛋白或抗体而互补决定区(CDR)(如至少一个CDR，优选两个CDR，更优选三个CDR)基本上来自非人免疫球蛋白或抗体，且进一步包括恒定区(如就轻链而言，至少一个恒定区或其部分，而就重链而言，优选三个恒定区)的免疫球蛋白或抗体链(即分别为轻链或重链)。术语“人源化可变区”(如“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)指可变构架区基本上来自人免疫球蛋白或抗体而互补决定区(CDR)基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的可变区。

术语“异聚受体复合物”指包含受体偶联剂及受体偶联剂所靶向的两种或更多受体的复合物。在一个实施方案中，本发明的异聚受体复合物包含受体偶联剂和该偶联剂所靶向而活化的至少两种TNF家族受体。优选的是，作为异聚受体复合物形成的结果，经由受体的信号传导得到了增强。在本发明的一个实施方案中，异聚受体复合物在细胞膜中的脂筏上形成。在另一个实施方案中，本发明的异聚受体复合物在细胞膜上的脂筏以外形成。

术语“肿瘤体积抑制”指任何的肿瘤体积减少或缩小。

术语“配体”指结合蛋白质或其它分子上特定位点的任何分子。配体通常是以高亲和力及特异性方式与受体蛋白结合以引发功能反应的多肽或化合物。例如，本发明的配体包括TNF家族受体配体。术语“天然配体”指在正常生理条件下结合受体的配体。在此术语“受体”指位于细胞上或细胞中的结构，通常是多肽，其识别结合分子，即配体，并由此诱导细胞反应。本发明的受体包括TNF家族受体，包括例如TRAIL-R2、HVEM和LTβR。

术语“TNF家族受体”或“TNF-R”指属于TNF受体超家族的受体，所述TNF受体超家族具有通过二硫键形成“富含半胱氨酸域”或CRD的特征。TNF受体家族成员通常由胞外域、跨膜域和胞内信号传导域组成(综述参见Locksley等(2001)Cell 104：487)。胞外域由1-6个拷贝通过二硫键紧密相连的结构域组成，且基于独特的半胱氨酸残基排列得到识别(Babner等(1993)Cell 73：431)。尽管一种配体可结合多种受体，但每种TNF受体只结合相应的配体。

术语“淋巴毒素-β受体(LTβR)激动剂”指能提高配体与LTβR结合、细胞表面LTβR簇集、和/或LTβR信号传导的任何试剂。

短语“多价抗体”或“多价抗体构建物”指包含多于一个抗原识别位点的抗体或抗体构建物。例如，“二价”抗体构建物具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体构建物则具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性“、“四特异性”等指在本发明多价抗体构建物中存在的不同抗原识别位点特异性的数目(不同于抗原识别位点的数目)。例如，“单特异性”抗体构建物的抗原识别位点都结合相同的表位。“双特异性”抗体构建物具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点和至少一个结合不同于第一表位的第二表位的抗原识别位点。“多价单特异性”抗体构建物具有都结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体构建物具有多个抗原识别位点，其中一些结合第一表位，另一些结合不同于第一表位的第二表位。在本发明的一个实施方案中，抗体是如图9所示的多价双特异性抗体。

“病人”或“受试者”或“宿主”指人或非人动物。

术语“递药装置”指可用于给予受试者治疗剂的任何装置。递药装置的非限制性例子包括皮下注射器、多室注射器、支架、导管、经皮贴片、显微针、微量研磨器、和可植入的受控释放装置。在一个实施方案中，术语“递药装置”指能在注射前混合两种化合物的双室注射器。

在此使用的短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激、过敏反应、或其它问题或并发症，具有相应合理的利益/风险比的那些化合物、物质、组合物和/或剂量形式。

在此使用的短语“药学上可接受的载体”指药学上可接受的物质、组合物或媒介，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包囊物，涉及从一个器官或身体的一部分携带或运输主题化合物到另一个器官或身体的一部分。在与配方的其它成分配伍且对病人无害的意义上，每种载体都应当是“可接受的”。可作为药学上可接受的载体的物质的一些例子包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡类；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇类，诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类；及(22)在药用配方中使用的其它无毒可配伍物质。

“药学上可接受的盐类”指相对无毒的，化合物的无机或有机酸加成盐。

术语“筏(raft)”或“脂筏(lipid raft)”指脂筏或其部分，是一种特化的细胞膜结构域(参见Simons等，(2000)Nature Reviews/Molecular Cell Biology 1：31)。具体而言，术语“脂筏”描述的是真核细胞的任何膜上富含胆固醇和鞘糖脂的微结构域。脂筏倾向于在信号传导分子中富集，在与配体结合或交联后，已显示生长因子受体和传感分子迁移至脂筏。脂筏的特征在于其于低温在非离子去污剂中的抗增溶作用以及在响应胞内或胞外刺激中大小和组成可改变。在脂筏中有利于特异性蛋白质-蛋白质相互作用，就例如质膜细胞因子受体而言，引起信号级联活性的调节。

“筏化(rafting)”(在此定义为膜组分如受体掺入脂筏中)或“去筏化(de-rafting)”(在此定义为从脂筏上除去、脱离或排除膜组分如受体)给定受体的潜在作用包括调节细胞因子受体介导的信号传导(在有些情况中触发凋亡性细胞死亡)、受体的细胞定位、及受体丰度。有时，脂筏可簇集；已报道在人工和生理学上触发信号级联中都使用了这样的簇集。在一个实施方案中，本发明的受体偶联剂使两种TNF家族成员受体进入脂筏。在另一个实施方案中，本发明的受体偶联剂使TNF家族受体离开脂筏。

术语“受体偶联剂”包括能活化至少两种不同细胞表面受体的任何试剂或构建物。在一个实施方案中，受体偶联剂是蛋白质试剂。受体偶联剂用于提高细胞表面受体的信号传导能力。本发明的受体偶联剂针对的是TNF家族受体。在有些情况中，通过受体偶联剂活化至少两种TNF家族受体可诱导细胞死亡。在本发明的一个实施方案中，受体偶联剂包含双特异性多价构建物。在还有一个实施方案中，受体偶联剂是包含抗LTβR结合部分或特异性及抗TRAIL-R2结合部分或特异性的双特异性多价构建物。在另一个实施方案中，受体偶联剂包含抗LTβR抗体(如CBE11)赋予的结合特异性和抗TRAIL-R2抗体(如14A2)赋予的结合特异性。

术语“单链可变片段或scFv”指其中重链域和轻链域相连的Fv片段。一个或多个scFv片段可连接其它抗体片段(诸如重链或轻链的恒定域)以形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建物。

术语“协同作用”指较任何两种或多种单一药剂的累加作用更有效的组合。在本发明的一个实施方案中，术语协同作用包括超过累加抑制作用的组合类型，其中LT-β-R激动剂和化疗剂都单独具有抑制肿瘤体积的能力。术语“增强”指在两种或更多试剂同时作用大于所述试剂单独作用总和的情形。

“治疗”受试者的癌症或“治疗”患癌症受试者指使受试者经受药物治疗，如给予药物，从而降低或阻止癌症的程度。治疗包括(但不限于)给予组合物，诸如药用组合物，且可预防用药或在发生病理事件后给药。

术语“肿瘤体积”指肿瘤的总体积，其包括肿瘤自身以及如果适用的话加上受侵袭的***。可通过多种本领域公知方法测定肿瘤体积，诸如通过使用卡尺、计算机断层照相(CT)或磁共振成像(MRI)扫描测量肿瘤的尺寸，并使用基于例如z轴直径或标准形状诸如球体、椭球体或立方体的方程式计算体积。

II.受体偶联剂靶

在用TNF家族受体活化剂***中的一个限制因素是通常仅有一部分肿瘤似乎对这样的治疗敏感。受体偶联剂可特异活化TNF家族受体，并通过例如使TNF家族受体紧密接近而增强受体信号传导(对于TNF受体和TNF家族的评论参见Locksley等(2001)Cell 104：487)。本发明提供了能靶向多于一种TNF家族受体并增强信号传导的受体偶联剂，由此提供了一种治疗癌症的改良方法。同样地，受体偶联剂可传递更强或更复杂的信号传导，并因此能更有效地作用于更大范围的肿瘤，如实施例3所示。在一个实施方案中，受体偶联剂通过增加聚集在一起的受体数目增加了信号强度(Holler N Fau-Tardivel等，(2003)Mol.Cell Biol.23：1428)。在另一个实施方案中，受体偶联剂活化两种不同TNF家族受体，由此增加信号强度并触发两种不同信号转导级联。

本发明的受体偶联剂包含针对至少两种不同TNF家族受体成员的结合特异性。根据所要靶向的目的TNF家族受体成员选择结合特异性。例如，在一个实施方案中，受体偶联剂包含对TNF受体TRAIL-R2的第一结合特异性和对TNF受体淋巴毒素-β受体(LTβR)的第二结合特异性。可通过受体偶联剂靶向的不同类型TNF家族受体的例子如下详述。

A.含死亡域的TNF受体

受体偶联剂可靶向含死亡域的TNF家族受体，其可用于治疗癌症。“死亡域”或“DD”指某些TNF受体的蛋白质结构域，包含六条保守的α螺旋。含死亡域的TNF受体是本发明受体偶联剂的主要靶，且在实施例部分中提供了这样一种构建物的例子。

死亡域受体的一个例子是Fas。Fas途径分子包括涉及或与导致通过Fas诱导的细胞凋亡或编程性细胞死亡(PCD)的途径相关的任何分子。Fas途径分子包括但不限于Fas、Fas配体(FasL)和TNFR受体超家族的成员。FADD、胱天蛋白酶8、bid和胱天蛋白酶3也包括在Fas途径分子中。Fas途径分子也包括在在此定义的其它组中。

淋巴细胞的一些细胞毒效应受淋巴细胞产生的配体与Fas-R(也称为DR-2，APO-1和CD95；GenBank GI Nos.4507583，23510421，23510423，23510425，23510427，23510429，23510431，和23510434)的相互作用所介导，该Fas-R是广泛存在的细胞表面受体，具有触发细胞死亡的能力(参见Nagata和Golstein，(1995)Science 267：1449-56)。FasL与Fas受体的结合导致细胞膜上受体聚集并特异性募集称为DISC或死亡诱导信号复合物的胞内信号传导分子。衔接蛋白，FADD，与Fas的胞内死亡域结合，导致也称为FLICE或MACH的胱天蛋白酶-8的募集。Fas诱导的细胞死亡可活化改变线粒体透过性转换的途径。

单核吞噬细胞的细胞杀死涉及配体-受体对，TNF及其受体TNFR1(也称为DR-1，CD120，p55-R；GenBank GI No.4507575；参见US 5,395,760)，它在结构上与Fas-R及其配体相关(参见Vandenabeele等，(1995)Trends in CellBiology 5：392)。像其它受体诱导的效应，通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用发生TNF受体和Fas-R诱导的细胞死亡，配体-受体结合引起最终酶效应物功能的失活，在这些特定受体的情况下，导致细胞死亡。

在正常情况下，Fas受体的卷入伴随有炎性细胞浸润和继发性坏死，还引起炎症，如肝炎，通过诱导细胞趋化因子如肝趋化因子的表达，这些趋化因子招募并活化免疫细胞导致细胞如肝细胞在促炎症反应环境中死亡。相比之下，本发明的受体偶联剂设计成在特定靶细胞中诱导细胞死亡。本发明的靶向治疗可能更有效，原因在于增强信号传导及因此可容许用更低剂量药物进行治疗。这样的策略可使当通过活化单一细胞表面细胞因子受体***性诱导凋亡时所观察到的不利后果最小化。

除Fas-R和TNF-R1之外，含死亡域的TNF受体家族的其它成员包括DR3(也称为TRAMP，TR3和Apo3，参见GenBank GI Nos.4507569，23200021，23200023，23200025，23200027，23200029，23200031，23200033，23200035，23200037和23200039)；TRAIL-R1(也称为DR4和Apo2，参见GenBank GI No.21361086)；TRAIL-R2(也称为DR5，参见GenBank GI Nos.22547116和22547119)；p75NGF-R(也称为TNFRSF16；NCBI Refererce Seq.NP_002498；GenBank GI No.4505393)；和DR6(TRAIL-R3，GenBank GI No.22547121)，各自含有直接启动凋亡的死亡域。

存在四种称为TRAIL-R1-4的人TRAIL受体。TRAIL-R1和R2也称为死亡受体4和5(DR4-5)，在胞内区含有死亡域并能触发凋亡(Wang和El-Deiry(2003)Oncogene 22：8628)。TRAIL-R2是人肿瘤治疗首选的，因为其活化不触发肝细胞凋亡并因此应具有降低的毒性(Ichikaw等(2001)NatMed 7：954)。因此，单独活化各种含死亡域的TNF家族受体或活化上述受体与任何其它TNFR如无死亡域的TNFR例如LTβR的组合的受体偶联剂也包含在本发明中。

在一个实施方案中，受体偶联剂用于降低含死亡域的TNF受体的毒效应。虽然有些含死亡域的受体如TNFR1或Fas的活化已显示体内毒性，但是将这些受体与其它TNF受体拴在一起很可能可减小毒性并因此使毒性抗体毒性更小。例如，如果筏结合对于TNFR1的完整信号传导是关键性的，则通过与非筏化受体拴在一起去筏化可能足以降低抗TNFR1毒性。在一个实施方案中，受体偶联剂包含含有抗LTβR抗体或其抗原结合片段的结合部分和针对抗含死亡域的TNF家族受体的结合部分。

B.元死亡域受体

本发明的受体偶联剂可靶向不含死亡域的TNF家族受体。用于治疗实体瘤的不含死亡域的TNF受体的活化，特别是抗LTβR激动剂单克隆抗体(mAb)，也显示出作为抗肿瘤治疗的潜力(Browning等(1996)J Exp Med183：867；Wilson和Browning(2003)Cell Death Duff 9：1321)。

不合死亡域的TNF受体家族成员的一个例子是LTβR。LTβR涉及调控免疫***中各种特化基质细胞的成熟状态并在***原基(anlagen)基质成分发育过程中起关键作用(Mebius(2003)Nat Rev Immunol 3：292)。认为在转化细胞情况下上皮或类成纤维(fibroblastoid)细胞发育程序的活化对于它们的生存是有害的，而且这种作用可能是LTβ受体活化的有些抗肿瘤活性的原因。这些受体亦可启动涉及趋化因子释放或促进免疫学抗肿瘤应答的炎性程序(Yu等(2004)Nat Immunol 5：141；Baud(2001)Trends Cell Biol 11：372)。这样的释放可影响肿瘤的炎性状态和/或产生淋巴成分的浸润，促进对肿瘤的免疫反应。因此，单独活化各种不含死亡域的TNF家族受体或活化上述受体与含死亡域的TNF受体的组合的受体偶联剂也包含在本发明中。

除LTβR之外，其它缺少死亡域的TNF受体的例子包括Fn14(也称为TWEAK-R；参见申请人共同未决的申请WO 02/22166)；RANK(参见NCBI登记号AAB86809，AF018253)；TAJ(也称为TROY，参见NCBI登记号AAF71828，AAH47321，AAK28395)；EDAR(参见NCBI登记号AAD50076，AAD50077，AF130988)；XEDAR(参见NCBI登记号AAG28761，AAH34919，AAN73210)；和CD40(也称为CD40L受体，参见NCBI登记号AAH12419，AAH64518，AAR84238)。

一个不含死亡域的TNF受体亚组包括与组织分化相关的TNF受体，所述组织分化包括发育和伤口愈合。一些TNF受体在发育中具有明确的作用，如LTβR，RANK，EDAR和XEDAR(Mebius(2003)Nat Rev Immunol 3：292；Theill等，(2002)Ann Rev Immunol20：795；Larikkala等，(2002)Development129：2541；Rennert(2000)JExp Med 192：1677)。分化是正常细胞当其发育形成身体不同组织时经历的物理和结构改变过程。分化程序可在一些方面影响肿瘤。首先，与组织分化相关的TNF受体具有通过改变细胞周期进行而直接减缓肿瘤生长的潜力。其次，在转化情况下所述程序可导致细胞周期冲突且不履行凋亡。第三，这样的冲突输入可使细胞对化疗更敏感。

显示调节组织分化且为受体偶联剂所靶向以增强TNF信号传导的TNF受体分子的例子包括如下：RANK(也称为TNFRSF11A；GenBank GI No.4507565；登记号AF018523；US专利号6,562,948；6,537,763；6,528,482；6,479,635；6,271,349；6,017,729)；EDAR1(也称为Downless；GenBank GI No.11641231；登记号AF130988；US专利号6,355,782)；和TAJ/Troy/Trade(也称为TNFRSF19；GenBank GI Nos.23238202和23238204；登记号AF167555)。此外，XEDAR(也称为EDA-A2R；GenBank GI No.11140823；登记号AF130988)信号传导与外胚层分化过程有关。XEDAR在NF-κB和JNK途径活化中起主要作用。已显示Fn14与神经再生相关(Tanabe等(2003)J.Neurosci.23：9675)。Fn14也称为TWEAKR和TNFRSF12A(参见GenBank GINo.7706186；US专利6,727,225；US专利申请公开号2004/0033225A1)。因此，活化与组织分化相关的各种TNF家族受体的受体偶联剂也包含在本发明中。

C.免疫调节受体

TNF受体超家族也包含一些与免疫调节相关的受体，它们能为本发明的构建物所靶向。这样的受体包括TNFR2(也称为TNFRSF1B；GenBank GINo.4507577)，HVEM(也称为TNFRSF14；GenBank GI No.23200041)，CD27(也称为TNFRSF7；GenBank GI No.4507587)，CD30(也称为TNFRSF8；GenBank GI Nos.4507589和23510437)，CD40(也称为TNFRSF5；GI Nos.4507581和23312371)，4-1BB(也称为TNFRSF9；GI No.5730095)，OX40(也称为TNFRSF4；GI No.4507579)，GITR(也称为TNFRSF18；GenBank GI Nos.4759246，23238194和23238197)，TACI(也称为TNFRSF13B；GI No.6912694)，BAFF-R(也称为TNFRSF13C；GI No.16445027))，BCMA(也称为TNFRSF17；GI No.23238192)，和RELT(也称为TNFRSF19L；GI Nos.21361873和23238200)。与免疫调节相关的其它TNF家族受体包括TRAIL-R3和TRAIL-R4。因此，活化与免疫调节相关的各种TNF家族受体的受体偶联剂也包含在本发明中。

D.其它TNF受体

其它靶TNF家族受体可根据它们在肿瘤形成中所起作用来选择，并可使用各种细胞类型中受体表达的现有RNA数据库来鉴定，所述RNA数据库可用于确定在各种肿瘤上出现或理想地过表达的TNF家族受体。此外，现有的RNA数据库提供了额外的优点，在于通过鉴定那些在某一肿瘤类型或肿瘤子集中更独特表达但在正常组织特别是肝和脉管***上不丰富的受体对，能优化TNF家族受体对。以这样的方式所鉴定的受体对(或更多的)能传递有效的信号到肿瘤中且不损害正常组织。测试所选择受体功效的方法更详细的描述于下文及实施例部分中。

本发明受体偶联剂靶向至少两种不同TNF受体。靶TNF受体的选择是基于受体的个体特性。例如，受体偶联剂可靶向两种与分化事件有关的TNF受体，并因此可有效地治疗实体瘤。本发明受体偶联剂所针对的TNF受体组合的其它例子描述如下。

无死亡域/含死亡域TNF受体偶联剂

在本发明的一个实施方案中，受体偶联剂靶向并活化一种含死亡域的TNF受体和一种不含死亡域的TNF受体。靶向的不含死亡域/含死亡域的TNF受体组合的例子包括：LTBR/TRAIL-R1；LTBR/TRAIL-R2；LTBR/p75NGF-R；Fn14/p75NGF-R；和p75NGF-R/TAJ。偶联含死亡域的TNF受体到不含死亡域的受体上可进一步降低含死亡域的受体活化所产生的毒性。

在另一个实施方案中，至少一种与细胞分化相关的不含死亡域的TNF受体包括但不限于LTBR、RANK和Fn14。如下详述，LTBR、RANK和Fn14各自与细胞分化相关。其中不含死亡域的TNF受体与细胞分化相关的不含死亡域/含死亡域的TNF受体的例子包括例如LTBR/p75NGF-R；Fn14/p75NGF-R；和TAJ/p75NGF-R。

无死亡域/无死亡域TNF受体偶联剂

在本发明的一个实施方案中，受体偶联剂靶向并活化两种不同TNF受体，没有一种含死亡域。受体偶联剂所靶向的不含死亡域/不含死亡域的TNF受体组合的例子包括：LTBR/Fn14；LTBR/RANK；Fn14/TAJ；LTBR/EDAR；LTBR/XEDAR；RANK/EDAR；RANK/XEDAR；TAJ/EDAR；TAJ/XEDAR；和LTBR/CD40。

在另一个实施方案中，至少一种不含死亡域/不含死亡域的TNF受体与细胞分化相关。例如，受体偶联剂可针对LTBR和Fn14。Fn14是TWEAK，一种在腺癌细胞系HT29中能诱导细胞死亡的TNF配体的受体(参见Chicheportiche等(1997)J.Biol.Chem.272：32401)。TWEAK的凋亡活性受Fn14介导。Fn14也涉及损伤后组织重塑。组织重塑的分子机制类似于组织分化，因此这样的程序可能不利于肿瘤生长。在另一个例子中，受体偶联剂可针对LTBR和RANK。RANK信号传导触发***上皮的分化，并因此当与另一种分化诱导剂偶联时可增强活性。因此，使用受体偶联剂增强RANK和LTBR信号传导可用于阻止肿瘤生长。

除LTBR、RANK和Fn14之外，TAJ/TROY在组织分化中也起作用，特别是在调节轴突再生中(Shao等(2005)Neuron 45：353)。TAJ与响应髓磷脂成分之轴突生长即有效的分化事件的阻遏相关。由于Fn14在神经元损伤后表达(Tanabe等(2003)J.Neurosci.23：9675)，因此其信号与TAJ结合可用于治疗与中枢神经***相关的肿瘤。因此，在一个实施方案中，受体偶联剂可靶向TAJ和Fn14。

与组织分化相关并因此可利于抑制肿瘤生长的不含死亡域的TNF受体组合的其它例子包括但不限于LTBR/EDAR；LTBR/XEDAR；RANK/EDAR；RANK/XEDAR；TAJ/EDAR；和TAJ/XEDAR。

含死亡域/含死亡域TNF受体偶联剂

在本发明的一个实施方案中，受体偶联剂结合两种不同TNF受体，都含有死亡域。TRAIL-R1/TRAIL-R2是受体偶联剂可靶向的含死亡域/含死亡域的TNF受体组合的一个例子。

免疫学TNF受体偶联剂

在本发明的一个实施方案中，受体偶联剂结合与免疫应答相关的两种不同TNF受体。介导B细胞应答的免疫应答TNF受体组合的例子包括CD40/CD27；CD40/BAFF-R；CD40/BCMA；和BAFF-R/CD27。介导T细胞免疫应答的TNF受体组合的例子包括CD27/CD30；CD27/OX-40；CD27/41BB；和OX-40/41BB。

III.受体偶联剂

受体偶联剂能诱导包含受体偶联剂和至少两种不同TNF家族受体的异聚受体复合物的形成。TNF家族受体具有共同的信号传导模态，以及对特定受体独特的专有转导机制。这些信号转导途径十分复杂，在许多情况下有三种或更多途径遭到活化。使用受体偶联剂来诱导异聚受体复合物的形成可更有效地限制肿瘤生长。例如，靶向LTβR的相对独特能力以活化可选NFкB途径(Deiardin等，(2002)Immunity 17：525)并与源自含死亡域受体(如TRAIL-R2)的胱天蛋白酶活化填塞物(stemming)偶联的受体偶联剂可减缓肿瘤生长。此外，这样的试剂可将两种不同TNF家族受体结合为一种复合物，使得信号转导机制元件共组装为新的且甚至可能是非生理学的聚集体。

本发明的受体偶联剂可用于将TNF家族受体再定向于影响信号传导的独特细胞膜环境中。有些受体的信号传导能力取决于它们在特化膜环境诸如脂筏中的位置。这样的TNF家族受体的例子包括Fas和可能的TNFRI受体(Muppidi和Siegel(2004)Nat Immunol 5：182；Legler等，(2003)Immunity18：655)。TRAIL受体也具有复杂的定位模式(Zhang等(2000)J Immunol164：3961)。将一种通常存在于脂筏上的受体偶联至另一种并不通常筏化的受体上的受体偶联剂可使第二种受体进入筏环境中并增强其信号传导能力。同样地，将一种通常存在于脂筏以外的受体偶联至另一种通常位于筏内的受体上的受体偶联剂则可使第一种受体离开筏环境并降低信号传导能力。

本发明的受体偶联剂可增强信号强度，形成新的非生理学异聚受体复合物，其包含新的信号传导特性，和/或将受体再定位到以更高或更低效率传导信号的环境中。在一个实施方案中，本发明的受体偶联剂用于使TNF家族受体进入通常没有发现该TNF家族受体的脂筏中。在另一个实施方案中，受体偶联剂能使TNF家族受体再定位到脂筏以外。

本发明的受体偶联剂包括能与至少两种不同TNF受体形成异聚复合物的任何试剂。受体偶联剂包含至少两种针对两种不同TNF受体的结合特异性。结合特异性包括影响受体信号传导如增强或减弱受体信号传导的任何实体。可用于制备本发明的受体偶联剂的结合特异性试剂的例子包括但不限于抗体、其抗原结合片段、TNF受体的配体或其任何组合。

A.抗体

在一个实施方案中，本发明的受体偶联剂含有包含或衍生自至少两种针对TNF受体家族成员的抗体或其抗原结合片段的结合特异性或部分。作为双功能构建物的受体偶联剂可含有来自针对目的TNF受体的亲本抗体的序列。能结合并活化两种TNF受体的双功能构建物提供了一种新手段，即这样的构建物包含活化两种不同TNF受体的能力，并由此避免了将两种抗体包装在一种药物混合物中的复杂情况，从药物制造观点来看是一个复杂的过程。

在一个实施方案中，受体偶联剂是包含TNF家族受体激动剂的多价构建物，其中所述受体偶联剂包含至少两个能结合各自受体并诱导活化信号的结构域。本发明的抗体构建物可包括含有两个或更多可变区的重链，所述可变区包含特异性结合TNF家族受体的抗原识别位点，以及含有一个或多个可变区的轻链，所述可变区包含特异于TNF家族受体的抗原识别位点。也可构建仅包含重链或轻链的抗体构建物，所述重链或轻链含有两个或更多包含特异性结合不同TNF家族受体的CDR的可变区。在一个实施方案中，多价抗体包含能结合TRAIL-R2和LTβR的抗原结合位点或结合部分。

在一方面，本发明提供了作为TNF受体激动剂的多价抗体构建物，包括但不限于LTβR和TRAIL-R2激动剂。在一个实施方案中，多价抗体构建物包含至少一个特异于LTβR表位的抗原识别位点。在另一个实施方案中，多价抗体构建物包含至少一个特异于TRAIL-R2表位的抗原识别位点。在某些实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv域中，而在其它实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv域中。

在某些实施方案中，受体偶联剂是双特异性的。在其它实施方案中，构建物特异于至少两种TNF受体家族成员，包括但不限于LTβR表位和TRAIL-R2表位。在任何多特异性构建物中，至少一个抗原识别位点可位于scFv域中，而在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv域中。在还有一些实施方案中，本发明的抗体构建物包含SEQ ID NO：5和7所述的多核苷酸序列(LT-BS1构建物)。

包含抗原识别位点或整个可变区的结合特异性或部分可衍生自一种或多种亲本抗体。亲本抗体可包括天然存在的抗体或抗体片段、由天然存在的抗体改造的抗体或抗体片段、使用已知对LT-β受体特异的抗体或抗体片段序列重新构建的抗体。可由亲本抗体衍生的序列包括重链和/或轻链可变区和/或CDR、构架区或其其它部分。在本发明的一个实施方案中，用于构建受体偶联剂的亲本抗体是抗TRAIL-R2抗体，例如14A2和抗LTβR抗体，例如CBE11。

多价多特异性抗体可含有包含两个或更多可变区的重链和/或包含一个或多个可变区的轻链，其中至少两个可变区识别LT-β受体上的不同表位。

可以多种不同方式使用多种不同序列构建包含多价、抗TNF受体抗体的受体偶联剂，所述序列衍生自亲本抗LTβR抗体，包括鼠或人源化BHA10(WO 04/002431；也参见Browning等，(1995)J.Immunol.154：33；Browning等，(1996)J.Exp.Med.183：867)、鼠或人源化CBE11(分别见US专利6,312,691和WO 02/30986)、和/或亲本抗TRAIL-R2鼠或嵌合的14A2(参见SEQ ID NO：1和3)。

可用于本发明的受体偶联剂的鼠抗LTβR抗体的例子包括：BKA11，CDH10，BCG6，AGH1，BDA8，CBE11和BHA10。以下产生单克隆抗LT-β-R抗体的杂交瘤细胞系可用于产生衍生抗体构建物序列的抗LTβR抗体，这些杂交瘤细胞系业已根据布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，已给出ATCC登记号：

细胞系单克隆抗体名称登记号

a)AG.H1.5.1 AGH1 HB 11796

b)BD.A8.AB9 BDA8 HB 11798

c)BC.G6.AF5 BCG6 B 11794

d)BH.A10 BHA10 B 11795

e)BK.A11.AC10 BKA11 B 11799

f)CB.E11.1 CBE11 B 11793

g)CD.H10.1 CDH10 B 11797

可与本发明一起使用的人源化抗LTβR抗体的例子包括人源化CBE11和人源化BHA10。以下杂交瘤细胞系可用于产生衍生抗体构建物序列的抗LTβR抗体，它们已根据布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，已给出ATCC登记号：PTA-3357和3765(人源化CBE11，参见WO 02/30986)及PTA-4726(人源化BHA10，参见WO 04/002431)。

适用于本发明的受体偶联剂的抗TNF受体抗体的其它例子可衍生自针对含死亡域的TNF受体的抗体。已得到许多对含死亡域的TNF受体的抗体并为本领域所众所周知。这样的抗体包括抗TNF-R1单克隆抗体(R&Dsystems，抗TNF-R1；Tularik mAb #985，US专利号6,110,690；6,437,113)，抗Fas受体单克隆抗体CH-11(US专利号6,312,691；WO 95/10540)，抗DR3抗体(US专利号5,985,547；Johnson等，(1984)ImmunoBiology of HLA，编辑，Dupont，B.O.，Springer，New York；US专利号6,462,176；6,469,166)，及抗TRAIL-R抗体(US专利号5,763,223；6,072,047；6,284,236；6,521,228；6,569,642；6,642,358；和US专利号6,417,328)。

也已出现许多针对与组织分化相关的TNF受体的抗体并为本领域所公知。特异于与组织分化相关的TNF受体的抗TNF受体抗体的例子包括：抗RANK单克隆抗体(Immunex-US专利号6,562,948；6,537,763；6,528,482；6,479,635；6,271,349；6,017,729；Komed-WO 03/080671)，抗EDAR多克隆(抗人)和单克隆(抗小鼠)抗体(R&D Systems-MAB745，BAF157；Elomaa等(200 1)Human Molecular Genetics.10：953)，抗XEDAR单克隆和多克隆抗体(R&D Systems-MAB1093和AF1093)，抗Fn14单克隆抗体(Nakayama等(2003)J.Immunology 170：341；ITEM-1，ITEM-2和ITEM-4克隆，获得自eBioscience)，抗TROY抗体(T3323，来自Sigma-Aldrich)，和抗NGFR(抗啮齿动物)抗体(Chemicon USA)。

也已出现许多针对与免疫调节相关的TNF受体的抗体并为本领域所公知。特异于与免疫调节相关的TNF受体的抗TNF受体抗体的例子包括：抗HVEM抗体(HGSI-WO 03/086301)，抗CD40抗体(Biogen-WO 97/20063；Chiron-US专利号5,677,165；5,874,082；6,004,552；6,056,959；6,315,998；US申请公开号2002/0106371；US申请公开号2003/0059427；US20030118588A1；2003/0211100A1；US2002020142358A1；US专利号US6312693；US6051228；Fanslow等-US5801227)，抗4-1BB(PCT公开号WO 03/084999；EP0948353；US专利号6210669；Genecraft-WO 03/083069)，和抗BAFF-R抗体(兔多克隆-ProSci catalog #3097)，以及许多其它针对免疫调节受体的抗体。

本领域技术人员使用常规重组DNA技术可开发针对TNF受体的多价构建物，例如PCT国际申请号PCT/US86/02269；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT国际公开号WO86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等，(1988)Science 240：1041-1043；Liu等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等，(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等，(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；Shaw等，(1988).Natl.Cancer Inst.80：1553-1559；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等，(1986)BioTechniques 4：214；美国专利号5,225,539；Jones等，(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等，(1988)Science 239：1534；Beidler等，(1988)J.Immunol.141：4053-4060；及Winter和Milstein，(1991)Nature 349：293-99中所述。优选的是，通过将非人抗原结合域连接人恒定域而将非人抗体“人源化”(如Cabilly等美国专利号4,816,567；Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-55)。

其它可用于制备多价抗TNF受体抗体构建物的方法描述于下列出版物中：Ghetie等(2001)Blood 97：1392-1398；Wolff等(1993)Cancer Research53：2560-2565；Ghetie等(1997)Proc.Natl.Acad.SCi.94：7509-7514；Kim等(2002)Int.J.Cancer 97(4)：542-547；Todorovska等(2001)dournal ofImmunological Methods 248：47-66；Coloma等(1997)Nature Biotechnology15：159-163；Zuo等(2000)Protein Engineering(Suppl.)13(5)：361-367；Santos等(1999)Clical Cancer Research 5：3118s-3123s；Presta(2002)CurrentPharmaceutical Biotechnology 3：237-256；van Spriel等(2000)ReviewImmunology Today 21(8)：391-397。

B.TNF配体

本发明的受体偶联剂也包括包含偶联在一起的至少两种常规TNF家族配体的结合特异性。TNF家族配体的例子包括但不限于TNF-α(NP_000585.2，GI No.25952111)，LT-α(NP_000586.2，GI No.6806893)，FasL(NP_000630；GenBank GI No.4557329)，APO-3L(NP_003800，GI No.4507597；NP_694557，GI No.23510441)，TRAIL(APO-2L NP_003801，GI No.4507593)，RANKL(TNFSF11，NP_003692，GI No.4507595；NP_143026，GI No.14790152)，EDAR1 & XEDAR配体(ED1，NP_001390，GI No.4503449；Monreal等(1998)Am J Hum Genet.63：380)，Fn14配体(APO-3L/TWEAK)，Troy/Trade配体NGF(NGF-β，NP_002497，GI No.4505391)，NGF家族(NGF-2/NTF3，NP_002518，GI No.4505469；NTF5，NP_006170，GI No.5453808；BDNF：NP_001700，GI No.25306267；NP_733927，GI No.25306235；NP_733928，GINo.2530625 3；NP_733929，GI No.2530625 7；NP_733930，GI No.25306261；NP_733931，GI No.25306264；IFRD1，NP_001541，GI No.4504607)，TNFRII配体(TNF，见上文)，HVEM配体(NP_003798，GI No.25952144；NP_742011，GI No.25952147)，CD27L(CD70抗原，NP_001243，GI No.4507605)，CD30L(CD153，NP_001235，GI No.4507607)，CD40L(CD154，NP_000065，GI No.4557433)，4-1BB-L(ILA配体，NP_003802，GI No.4507609)，OX40L(CD134L，NP_003317，GI No.4507603)，GITRL(AITRL/TL6，NP_005083，GI No.4827034)，和BAFF(TALL1，NP_006564，GINo.5730097)。

C.抗体/受体组合

本发明的受体偶联剂也包括上述抗TNF受体抗体和TNF配体的任何组合。例如，受体偶联剂可以产生具有两个三聚配体和三个抗体的分子或任何更高阶复合物的方式包含与针对TNF家族受体的抗体偶联的配体-Fc构建物的组合。在一个实施方案中，第一结合特异性包含至少两个三聚配体-Fc构建物，通常由三个二聚Fc域和六个配体分子形成。在该情况下，第二结合特异性应由三个抗体分子构成。本发明也包括与针对TNF家族受体的抗体偶联的针对TNF家族受体的常规配体(非Ig融合蛋白)的组合。

IV.制造受体偶联剂的方法

可通过标准测定法评估针对TNF受体组合的受体偶联剂的功效，所述方法包括评估细胞毒性或生长抑制的体外测定法、软琼脂集落形成测定法和3-D肿瘤培养***，诸如确定用于乳瘤的那些。也可通过体内异种移植模型来验证功效。人初级肺、肝和内皮细胞系供总毒性体外预测之用。一般地，诱导的凋亡和诸如VCAM或ICAM的表面黏附分子的呈现作为可能的标记物。例如IL-8和/或IP-10可作为可能是有害的促炎程序的毒性或诱导的优良标志。

可用于测试本发明受体偶联剂的癌细胞系是本领域公知的。通常用作结肠直肠癌瘤标准模型的细胞系的例子包括例如用于评估TNF受体活化剂的HT29细胞系。该细胞系具有两种变体，HT29和WiDr，且国家癌症研究所(National Cancer Institute)已在其用于潜在新化疗剂的筛选系列中使用了HT29细胞系。同样地，它是用于评估有些抗癌剂潜力的优良工具。其它结肠直肠细胞系的例子包括KM20L2、LS174T和CACO-2。可用于测试受体偶联剂功效的乳癌细胞系的例子包括MCF7和MDA231。可用于测试受体偶联剂功效的***细胞系的例子包括Hela和ME180。此外，黑素瘤细胞系的例子包括A375，横纹肌肉瘤的例子包括RD，及肉瘤细胞系的例子是SAOS-2。

可利用多种公知测定法筛选候选抗体构建物的活性。例如，测定结合特异性的筛选测定法在本领域是众所周知且常规使用的。上述测定法的详尽讨论参见Harlow等(编辑)，Antibodies：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.，1988，第6章。以下实施例提供了用候选的抗TRAIL-R2和LTβR激动剂抗体构建物测定受体偶联剂活化功效的测定法。

上述受体偶联剂可纯化至合适的纯度用作药用组合物。一般来说，纯化的组合物应具有一种物质超过该组合物中所存在的所有物质的约85％，超过所有存在物质的约85％、90％、95％、99％或更多。目的物质可纯化至本质上同质(通过常规检测方法无法在该组合物中检测到污染物)，其中该组合物本质上由单一物质组成。本领域技术人员可根据本文的教导使用蛋白纯化的标准技术纯化本发明的多肽，例如免疫亲和层析、大小排阻层析等。通过多种本领域技术人员公知的方法可测定多肽的纯度，包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝胶电泳和质谱分析。

在一个实施方案中，本发明的受体偶联剂可缀合化疗剂以超越累加(supra-additive)的方式来抑制肿瘤体积。能与本发明抗体缀合的例示性化疗剂包括但不限于放射缀合物(90Y、131I、99mTc、111In、186Rh等)、肿瘤活化前药(美登木素生物碱类、CC-1065类似物、加利车霉素衍生物、蒽环类抗生素、长春花生物碱类等)、蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素。

在有些实施方案中，本发明的受体偶联多价抗体和抗体片段可进行化学修饰以提供所需效果。例如，通过任何本领域公知的聚乙二醇化反应可进行本发明抗体和抗体片段的聚乙二醇化，例如以下参考文献中所述：Focuson Growth Factors 3：4-10(1992)；EP 0 154 316；和EP 0 401 384(每篇全文在此引入作为参考)。优选的是，通过与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)起酰化反应或烷化反应来进行聚乙二醇化。优选用于本发明抗体和抗体片段聚乙二醇化的水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。在此使用的“聚乙二醇”意图包含用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。

用于制备聚乙二醇化的本发明抗体和抗体片段的方法一般包括以下步骤：(a)在借此抗体或抗体片段附着一个或多个PEG基团的条件下，将抗体或抗体片段与诸如PEG的反应性酯或醛衍生物的聚乙二醇反应，并(b)获得反应产物。基于已知参数和所需结果选择最佳的反应条件或酰化反应对于本领域技术人员是显而易见的。

聚乙二醇化抗体和抗体片段一般可用于治疗通过给予在此描述的抗体和抗体片段可以缓解或调节的状况。一般来说，与未聚乙二醇化抗体和抗体片段相比，聚乙二醇化抗体和抗体片段具有延长的半衰期。聚乙二醇化抗体和抗体片段可单独使用，一起使用，或与其它药用组合物联合使用。

在本发明的其它实施方案中，使用本领域公认技术将抗体或其抗原结合片段与清蛋白缀合。在本发明的另一个实施方案中，修饰多价抗体或其片段以减少或消除潜在的糖基化位点。这样修饰的抗体通常称为“不糖基化”抗体。为了改善抗体或其抗原结合片段的结合亲和力，可改变该抗体的糖基化位点，例如通过诱变(如定点诱变)。“糖基化位点”指为真核细胞所识别作为用于附着糖残基的部位的氨基酸残基。附着诸如寡糖的碳水化合物的氨基酸通常是天冬酰胺(N-连接)、丝氨酸(O-连接)和苏氨酸(O-连接)残基。为了鉴定抗体或抗原结合片段中潜在的糖基化位点，研究抗体的序列，例如通过使用公众可访问的数据库，诸如Center for Biological SequenceAnalysis提供的站点(参见http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/用于预测N-连接的糖基化位点和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/用于预测O-连接的糖基化位点)。用于改变抗体糖基化位点的其它方法描述于US专利号6,350,861和5,714,350中。

在本发明的又一个实施方案中，可改变作为多价抗体或其片段的受体偶联剂，其中相对于未修饰的抗体，修饰抗体恒定区以减轻至少一种恒定区介导的生物学效应物功能。为了修饰本发明的抗体以使其降低与Fc受体(FcR)结合，可在与FcR相互作用所必需的特定区域突变抗体的免疫球蛋白恒定区片断(参见如Canfield等(1991)J.Exp.Med.173：1483；和Lund等，(1991)J.of Immunol.147：2657)。降低抗体与FcR结合的能力也可降低其它依赖于FcR相互作用的效应物功能，诸如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞细胞毒性。

在一个特定的实施方案中，本发明进一步描述了具有改变的效应物功能诸如结合效应分子的能力的受体偶联多价抗体，所述效应分子例如效应细胞上的补体或受体。特别是，本发明的人源化抗体具有改变的恒定区，如Fc区，其中Fc区中的至少一个氨基酸残基已为不同的残基或侧链所替代，由此降低了该抗体与FcR结合的能力。降低抗体与FcR结合的能力也可降低其它依赖于FcR相互作用的效应物功能，诸如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞细胞毒性。在一个实施方案中，经过修饰的人源化抗体是IgG类，在Fc区包含至少一个氨基酸残基替代，使得与例如未修饰的人源化抗体相比，该人源化抗体具有改变的效应物功能。在特定的实施方案中，本发明的人源化抗体具有改变的效应物功能，使其免疫原性降低(如不引起不想要的效应细胞活性，溶解，或补体结合)，和/或具有更期望的半衰期，同时保持对LTβR的特异性。

或者，本发明描述了具有改变的恒定区以增强FcR结合如FcγR3结合的受体偶联多价人源化抗体。这样的抗体可用于调节效应细胞功能，如用于提高ADCC活性，如特别是用于本发明的肿瘤学应用。在此使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起该靶细胞溶解。用于介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞则表达抗体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII，如抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。

除非另有所述，本发明的实施可使用在本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技术。这样的技术描述于文献中。参见例如Molecular Cloning ALaboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编(Cold SpringHarbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，第I和II卷(Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(Gait编，1984)；Mullis等US专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Hames & Higgins编1984)；Transcription AndTranslation(Hames & Higgins编1984)；Culture Of Animal Cells(Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobolized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等编)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(Weir和Blackwell编，1986)；ManIPulating the Mouse Embryo，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，1986)。产生muBHA10和muCBE11可变区、鼠-人BHA10和CBE11嵌合抗体、整形(reshaped)BHA10和CBE11可变域、编码huBHA10和huCBE11的表达载体、五聚chCBE11抗体以及纯化和测定上述物质的方法之前已描述于申请人共同未决的申请PCT公开号WO 96/22788、PCT公开WO 02/30986、PCT申请号WO 04/002431和WO 04/058191中，每篇全文在此引入作为参考。

V.药用组合物

本发明提供了包含上述受体偶联剂的药用组合物。在某些实施方案中，药用组合物还可包含化疗剂。在一方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或多种上述化合物。在另一方面，在某些实施方案中，本发明的化合物可以就这样或与药学上可接受的载体混合给药，也可与其它化疗剂联合给药。因此，联合(组合)治疗包括以首先给予的活性化合物的疗效尚未完全消失时接着给药的方式，顺次、同时和分别，或共同给予活性化合物。

与所选择的给药途径无关，通过本领域技术人员公知的常规方法，将可以合适的水合形式使用的本发明化合物，和/或本发明的药用组合物配制为药学上可接受的剂量形式。虽然本发明的化合物有可能单独给药，但该化合物优选作为药物配方(组合物)给予。由其它药物类推，本发明的化合物可配制成以任何便利的方式供人或兽医用。

如下详述，本发明的药用组合物可特别配制为固体或液体形式用于给药，包括适用于以下给药的：(1)口服给药，例如兽用灌药(水或非水溶液或悬浮液)、片剂如用于含服、舌下和全身吸收的那些、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于舌的糊剂；(2)肠胃外给药，例如作为无菌溶液或悬浮液通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，或持续释放剂型；(3)局部施用，例如作为霜剂、软膏剂或控制释放贴剂或喷雾施用于皮肤；(4)***内或直肠内给药，例如作为***栓剂、霜剂或泡沫剂；(5)舌下给药；(6)经眼给药；(7)经皮给药；或(8)经鼻给药。在一个实施方案中，配制药用组合物用于肠胃外给药。在一个实施方案中，配制药用组合物用于动脉内注射。在另一个实施方案中，配制药用组合物用于全身给药。

在其它情况下，本发明的化合物可含有一种或多种酸性官能团，并因此能与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。

润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如硫酸月桂酯钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱离剂、包衣剂、甜味剂、芳香剂和香料、防腐剂以及抗氧化剂也可存在于组合物中。

本发明的剂型包括适合于口服、经鼻、局部(包括含服和舌下)、直肠、***和/或肠胃外给药的那些。这些剂型可便利地以单位剂量形式存在，并可通过药学领域众所周知的方法制备。可与载体物质结合以产生单剂量形式的活性成分的量取决于所要治疗的宿主、给药的特定方式而变化。可与载体物质结合以产生单剂量形式的活性成分的量通常是该化合物产生疗效的量。

用于口服给药的本发明化合物的液体剂量形式包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分外，液体剂量形式可含有本领域常用的惰性稀释剂，诸如例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物也可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、芳香剂、着色剂、香料和防腐剂。除活性化合物之外，悬浮液可含有助悬剂，例如异硬脂醇乙氧化物、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。

本发明适用于口服给药的剂型可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常用蔗糖和***胶或西黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂、或作为水或非水液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水液体乳状液、或作为酏剂或糖浆剂、或作为软锭剂(使用惰性基，诸如明胶和甘油、或蔗糖和***胶)和/或作为漱口剂等形式存在，每种剂型都含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的混合物也可以大丸剂、药糖剂或糊剂给药。

在用于口服给药的本发明的固体剂量形式(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体诸如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或如下任一混合：(1)填充剂或增充剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或***胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季胺化合物；(7)湿润剂，诸如例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸月桂酯钠及其混合物；及(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况中，药用组合物也可包含缓冲剂。在使用诸如乳糖或乳汁糖类、及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬壳胶囊中，类似类型的固体组合物也可用作填充剂。

可通过压力或模铸制造片剂，任选使用一种或多种助剂。可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压制片。可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制造模制片。本发明药用组合物的片剂和其它固体剂量形式，诸如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可任选用包衣和包壳来获得或制备，诸如肠溶衣和其它药剂学领域众所周知的包衣。它们也可配制以便提供缓慢或受控释放其中的活性成分，在此使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线、其它聚合物基质、脂质体和/或微球体。它们可配制用于快速释放，如冻干。它们可灭菌，例如通过细菌滞留过滤器过滤、或将灭菌剂掺入能在无菌水中溶解的无菌固体组合物中、或在即将使用前掺入某些其它无菌可注射介质中。这些组合物也可任选包含遮光剂且可以是一种仅释放活性成分的组合物，或优选地，在胃肠道的某一部分中释放，任选地，以延迟释放的方式。可利用的包埋组合物的例子包括聚合物和蜡。活性成分亦可以微胶囊形式存在，如果合适的话，带有一种或多种上述赋形剂。

用于局部或经皮给予本发明化合物的剂量形式包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除本发明的活性化合物之外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或它们的混合物。除本发明化合物之外，粉剂和喷雾剂可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可额外含有常用的推进剂，诸如含氯氟烃和挥发性未取代烃，诸如丁烷和丙烷。

适于肠胃外给药的本发明的药用组合物包含一种或多种本发明的化合物以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳状液、或可仅在使用前在无菌可注射溶液或分散液中重建的无菌粉剂，其可包含糖类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、调整制剂与预定接受者的血液等渗的溶质、助悬剂或增稠剂。这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过内含多种抗细菌剂和抗真菌剂以确保微生物不对主题化合物起作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等。可能还想在该组合物中包括等渗剂，诸如糖类、氯化钠等。此外，可通过内含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶带来可注射药物剂型延长的吸收。

有时，为了延长药物的疗效，希望通过皮下或肌内注射减缓药物吸收。这可通过利用具有不良水溶性的晶体或无定形物的液体悬浮液来实现。药物的吸收率则取决于其溶解速率，继而可能取决于晶体大小和晶形。或者，通过在油类介质中溶解或悬浮药物以实现肠胃外给予的药物剂型的延迟吸收。

通过在生物可降解的聚合物诸如聚交酯-聚乙交酯中形成主题化合物的微胶囊基质，制备了可注射的贮存剂型。根据药物和聚合物的比例，以及所使用的特定聚合物的特性，可以控制药物释放的速率。其它生物可降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也通过将药物包埋于与身体组织相容的脂质体或微乳剂中以制备可注射的贮存剂型。

VI.递送方法和装置

本发明的药用组合物也可使用多种递药装置给予，可包括皮下注射器、多室注射器、支架、导管、经皮贴片、显微针、微量研磨器和可植入的控制释放装置。在一个实施方案中，递药装置包含或能装载至少有效量的受体偶联剂。这样的装置可具有在递送前于该装置内重建抗体构建物冻干剂型的能力。在有些实施方案中，递药装置含有或能装载至少有效量的受体偶联剂和有效量的化疗剂。在有些实施方案中，该装置能同时递送或给予受体偶联剂和化疗剂。该装置可具有在用其给予之前混合抗体构建物和化疗剂的能力。在还有一些实施方案中，该装置能连续给予激动剂抗体构建物和化疗剂。

一种递药装置是在注射前能混合两种化合物或能连续递送它们的多室注射器。一种典型的双室注射器以及自动制造预装填的这样的注射器的方法披露于Neue Verpackung，No.3，1988，p.50-52；Drugs Made in Germany，Vol.30，Pag.136-140(1987)；Pharm.Ind.46，Nr.10(1984)p.1045-1048和Pharm.Ind.46，Nr.3(1984)p.317-318。注射器型安瓿是一种带有用于安针的前部瓶型开口、两个活塞以及用于混合前室中的冻干粉末与后室中的重建液体的外部型旁通的双室装置。所描述的方法包括以下主要步骤：清洗并硅烷化注射器筒、在托架中***多个筒、灭菌、在筒后端装入居中的活塞、倒转托架、通过前开口装入粉剂溶液、冻干至干粉、在冻干室中关闭前开口、倒转托架、通过筒后端装入重建液体、***后端活塞、从托架上移除产品、最后调节并包装。可制造预装填有各种组分的安瓿用于与注射器一起使用。

在另一个实施方案中，多室注射器是一种Lyo-ject***(Vetter PharmaTurm，Yardley，PA)。该Lyo-Ject能让使用者在注射器中直接冻干药物，用稀释剂封装用于快速重建和注射。其描述于专利4,874,381和5,080,649。

在其它实施方案中，使用两种分开的注射器、导管、显微针或其它能实现注射的装置给予化合物。

也可使用放置在患病组织或血流中、附近或以其它方式与之连通的微球体、脂质体、其它微粒递送***或持续释放剂型给予本发明的药用组合物。持续释放载体的合适的例子包括以成形产品诸如栓剂或微胶囊存在的半透性聚合物基质。可植入的或微囊化持续释放基质包括聚交酯(美国专利号3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯共聚物(Sidman等，(1985)Biopolymers，22：547-56)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或乙烯乙酸乙烯共聚物(Langer等，(1981)J.Biomed.Mater Res.15：167-277；Langer，(1982)Chem.Tech.，12：98-105)。

本发明的组合物应以有效剂量给予以治疗针对的特定临床状况。对于给定的施用确定优选的药物配方和治疗有效剂量服法完全落入本领域技术范围之内，要考虑例如患者的状况和体重、所需治疗的程度和患者对治疗的耐受。

经皮贴片具有提供受控递送本发明化合物到身体中的额外优点。可通过在合适的介质中溶解或分散化合物来制备这样的剂量形式。吸收促进剂也可用于提高化合物通过皮肤的流量。通过提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中可调控这样的流速。

VII.治疗方法

因此，本发明还提供了治疗癌症的新的治疗方法，包括给予受试者有效量的药用组合物，任选使用上述递药装置。本发明的方法可用于治疗任何癌症，包括但不限于治疗实体瘤。能为本发明化合物所治疗的实体瘤的例子包括但不限于乳癌、睾丸癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌、***、胰癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌以及***癌、胃(gastric)癌、皮肤癌、胃(stomach)癌、食管癌和膀胱癌。在某些实施方案中，所述方法包括肠胃外给予受试者有效量的主题药用组合物。在一个实施方案中，所述方法包括经动脉内给予受试者主题组合物。在其它实施方案中，所述方法包括直接对受试者中肿瘤的动脉供血给予有效量的主题组合物。在一个实施方案中，所述方法包括使用导管直接对癌性肿瘤的动脉供血给予有效量的主题组合物。在使用导管给予主题组合物的实施方案中，可通过荧光镜透视检查引导或观察导管的***，或可使用其它本领域公知的用于观察和/或引导导管***的方法。在另一个实施方案中，所述方法包括化疗栓塞。例如，化疗栓塞法可包括用由与油基(如在Ethiodol中的聚乙烯醇)混合的树脂样物质以及一种或多种化疗剂构成的组合物阻断癌性肿瘤血管供给养料。在还有一些实施方案中，所述方法包括全身给予受试者主题组合物。

一般来说，利用本发明药用组合物的化疗栓塞或直接动脉内或静脉内注射治疗通常以类似的方式进行，与部位无关。简言之，所要栓塞区域的血管造影术(血管路线图)或更具体地说，在某些实施方案中为动脉造影术，可首先通过***到要照射X射线的动脉或静脉(取决于所要栓塞或注射的部位)中的导管注射不透射线对照物。导管可经皮***或通过外科手术***。然后通过导管回流本发明的药用组合物来栓塞血管，直到观察到流动停止时。可通过重复的血管造影照片证实闭塞。在使用直接注射的实施方案中，接着灌注血管所需剂量的本发明药用组合物。

栓塞治疗通常导致含抑制剂的组合物遍布于待治疗的肿瘤或血管块间隙。大块栓塞颗粒堵塞了动脉腔管，导致供血中断。除这种效果之外，所存在的抗血管生成因子阻止了给肿瘤或血管块供血的新血管形成，增强了切断供血的促衰作用。同样地，直接动脉内或静脉内注射通常导致含抑制剂的组合物遍布于待治疗的肿瘤或血管间隙。但是，通常并不期望该方法能中断供血。

在本发明的一方面中，可利用栓塞形成或直接动脉内或静脉内注射疗法治疗肝脏或其它组织的原发性和继发性肿瘤。简言之，通过股动脉或肱动脉***导管并在荧光镜透视检查引导下通过操纵其通过动脉***前行至肝动脉。导管前行至肝动脉树之远是为完全阻断供给肿瘤的血管所需，同时尽可能不伤害到供给正常结构的动脉分支。根据肿瘤及其个体供血的程度，理想地是需要阻断肝动脉的部分分支，但有可能是整个肝动脉末梢到胃十二指肠动脉起点，乃至多条独立的动脉。一旦到达所需导管位置，通过动脉导管注射组合物(如上所述)栓塞动脉，直至动脉血流被阻断为止，优选在观察5分钟后。可通过导管注射不透射线对照物证实动脉阻塞，并通过荧光镜透视检查或X-射线胶片证实事先填满对照物的动脉不再如此。在使用直接注射的实施方案中，通过动脉导管注射所需剂量的组合物(如上所述)灌注动脉。可重复进行相同的程序以封闭每条营养动脉。

在大多数实施方案中，主题药用组合物应以一定数量包括待递送的物质，足以递送给患者治疗有效量的所包括的治疗剂或其它物质作为预防性或治疗性处理的一部分。颗粒中活性化合物的所需浓度取决于药物吸收、失活和***率以及该化合物的递送率。应当注意剂量值也可随所要缓解的状况的严重程度而变化。还要明白，对于任何特定的受试者，应根据个体需要和操纵或管理组合物给药的人士的专业判断，随时间调节特定的给药方案。一般而言，使用本领域技术人员公知的技术确定剂量。所选择的剂量水平取决于多种因素，包括所使用的本发明特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的***率或代谢率、治疗持续时间、与所使用的特定化合物联合使用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和病史、以及医学领域众所周知的类似因素。

剂量可以每公斤患者体重组合物的量为基准。其它的量应为本领域技术人员所公知并易于确定。或者，可通过参考组合物血浆浓度确定本发明的剂量。例如，可使用最大血浆浓度(Cmax)和时间0到无穷大(AUC(0-4))的血浆浓度-时间曲线下面积。本发明的剂量包括产生上述Cmax和AUC(0-4)值的那些，以及对于那些参数产生或大或小值的其它剂量。

具有本领域普通技能的医师和兽医可容易地确定并开出有效量的所需药用组合物。例如，医师或兽医能以低于获得所需疗效需要的水平起始在药用组合物中使用的本发明化合物的剂量，并逐渐提高剂量直至获得所需疗效。

一般而言，本发明化合物的合适的日剂量应当是该化合物能有效产生疗效的最低剂量的量。这样的有效剂量通常应取决于上述因素。能最有效治疗给定患者的任何特定化合物的精确给药时间和数量应取决于特定化合物的活性、药物代谢动力学和生物利用度、患者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体健康状况、对给定药物剂量和类型的应答)、给药途径等。在此提出的指导方针可用于优化治疗，如确定最适宜的给药时间和/或数量，其并不需要过多的例行试验，仅包括监测受试者和调节剂量和/或时间。

在治疗受试者的同时，可通过在24小时期间的预定时间测定一种或多种相关指数来监测患者的健康。治疗，包括增补给药、给药数量和时间以及配方可根据上述监测的结果进行优化。可周期性地再评估患者以确定通过测量上述参数所改善的程度，首次这样的再评估通常在治疗开始四周时进行，随后在治疗过程中每四到八周再评估一次，接着其后每三个月再评估一次。治疗可持续数月或经年，对于人而言通常最少一个月。可基于这些再评估结果，调节给药量并可能地调节给药时间。

治疗可以低于化合物最佳剂量的较小剂量开始。其后，可小量提高剂量直至获得最佳疗效。

对于任何单一组分而言，联合使用本发明的几种化合物或其它化疗剂可降低所需剂量，因为不同组分功效的开始和持续可能互补。在这样的联合治疗中，不同的活性剂可一起或分别递送，且可同时递送或在一天的不同时间递送。可通过在细胞培养物或实验动物中进行标准的药学流程测定主题化合物的毒性和疗效，如用于测定LD50和ED50。优选具有大治疗指数的组合物。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但为了降低副作用，应小心设计靶向化合物至所需部位的递药***。

细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。任何补充物的剂量或任何其中化合物的剂量，优选落在包括ED50的循环浓度的范围内，毒性很小或没有毒性。根据所使用的剂量形式和所利用的给药途径，剂量可在该范围内改变。对于本发明的试剂而言，开始可根据细胞培养测定估计治疗有效剂量。同在细胞培养中所测定的一样，可在动物模型中确定剂量以获得包括IC50(即达到症状半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更精确地测定用于人的剂量。可以测量血浆水平，例如通过高效液相层析。

VIII.受体偶联剂的联合治疗用途

在有些实施方案中，本发明还提供了受体偶联剂和化疗剂联合治疗癌症和/或抑制肿瘤生长的用途。同样地，在本发明的方法中可使用或测试多种化疗剂中的任一种。这样的化疗剂可包括抗代谢剂、烷化剂、基于铂的试剂、蒽环类抗生素、抗生剂、拓扑异构酶抑制剂等。可使用各种形式的化疗剂和/或其它生物活性剂。这些包括不限于诸如不带电荷的分子、分子复合物、盐类、醚类、酯类、胺类等形式，它们在植入、注射或以其它方式***肿瘤时，具有生物活性。

基于药物在癌细胞中如何作用于特定化学物质，药物干扰哪些细胞活性或过程，及药物作用于细胞周期的哪些特定阶段，可与本发明的受体偶联剂联合使用或以缀合物形式(如免疫毒素)存在的化疗药物可分成几类。

在某些实施方案中，化疗剂是一种破坏DNA合成的试剂。在一个实施方案中，破坏DNA合成的试剂是一种核苷类似物化合物。在某些实施方案中，核苷类似物化合物是吉西他滨。在另一个实施方案中，破坏DNA合成的试剂是一种蒽环类抗生素化合物，而在某些实施方案中，蒽环类抗生素化合物是阿霉素。

在其它实施方案中，化疗剂是一种拓扑异构酶I抑制剂。在某些实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是Camptosar(伊立替康)。

在其它实施方案中，化疗剂可以是一种烷化剂。烷化剂直接作用于DNA以阻止癌细胞再生。作为一类药物，这些试剂并不都是阶段特异的(换言之，它们在细胞周期的所有阶段都起作用)。烷化剂通常对慢性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、多发性骨髓瘤和某些肺癌、乳癌及卵巢癌有效。烷化剂的例子包括白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、双氯乙基甲胺(氮芥)和美法仑。在一个实施方案中，烷化剂是铂化合物，而在某些实施方案中，可选自卡铂和顺铂。在某些实施方案中，铂化合物是顺铂。

在还有一些实施方案中，化疗剂可以是植物生物碱。在一个实施方案中，植物生物碱是紫杉烷，而在某些实施方案中，可以是Taxol(紫杉醇)。

为确定肿瘤抑制是否发生，申请人共同未决的PCT申请号PCT/US03/41243教导了测试与化疗剂联合使用的候选受体偶联剂的方法，其全文在此引入作为参考。

在另一方面，本发明描述了经过修饰的抗体和抗体缀合物或其片段，缀合至其它治疗部分，诸如细胞毒素、药物或放射性同位素。术语经修饰抗体也旨在包括抗体，诸如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，其已通过如删除、添加或替代抗体的一部分而得到修饰。例如，抗体可通过删除恒定区和用意图延长抗体的半衰期如血清半衰期、稳定性或亲和力的恒定区替代其而进行修饰。

例示性放射性同位素包括：⁹⁰Y，¹²⁵I，¹³¹I，¹²³I，¹¹¹In，¹⁰⁵Rh，¹⁵³Sm，⁶⁷Cu，⁶⁷Ga，¹⁶⁶Ho，¹⁷⁷Lu，¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。放射性核素通过产生电离辐射起作用，它引起细胞核DNA中多处链断裂，导致细胞死亡。用来生产治疗性缀合物的同位素一般产生具有短路程长度的高能α-或β-粒子。这样的放射性核素杀死位于其附近的细胞，例如缀合物接触或进入的赘生细胞。它们稍微影响或不影响非定位的细胞。放射性核素本质上不具有免疫原性。

就放射性标记的缀合物联合本发明的使用而论，本发明的多肽可直接标记(诸如通过碘化作用)或可通过使用螯合剂间接标记。在此使用的短语“间接标记”和“间接标记方法”都指将螯合剂共价连接到抗体上，并将至少一种放射性核素与该螯合剂相连。这样的螯合剂通常称为双功能螯合剂，因为它们既结合多肽又结合放射性同位素。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(″MX-DTPA″)和环己基二乙烯三胺五乙酸(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核素包括¹¹¹In和⁹⁰Y。

在与细胞毒素缀合时，这些抗体缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或胞毒剂包括对细胞有害(如杀死)或抑制细胞生长的任何试剂。例子包括紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春花碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽杆菌素二酮，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-去氢睾甾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，***，肿瘤活化前药(如美登木素生物碱类(如DM-1，描述于US专利6,441,163中)、嘌呤霉素及其类似物或同系物、多拉司他汀10或其类似物(如auristatin E(AE)或monomethylauristatin E(MMAE))。治疗剂也包括例如抗代谢物(如甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红霉素(原来称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(如放线菌素(原来称为更生霉素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、抗有丝***剂(如长春新碱和长春花碱)、CC-1065类似物、加利车霉素衍生物、蒽环类抗生素、长春花生物碱类等)、蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌外毒素。其它可与本发明抗体缀合的治疗用细胞毒素的例子包括加利车霉素类和duocarmycins。

在一个特定的实施方案中，本发明的人抗体与美登木素生物碱或其衍生物缀合，由此形成免疫毒素。US专利6,441,163描述了使用二硫化物化学法将美登木素生物碱及其衍生物缀合到抗体上的方法。简言之，在一种制备缀合物的方法中，在水溶液中将具有二硫化物部分的过量的美登木素生物碱化合物与抗体混合。用过量的胺淬灭该反应并通过凝胶过滤纯化抗体缀合物。

本发明的抗体缀合物可用于修饰指定的生物学反应，且药物部分并不视为限制于传统化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、破伤风类毒素、或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应修饰物，诸如例如淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。对于诊断应用，抗体可包括容易分离或检测的部分(如生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸标签或其它肽标签)。抗体也可包括能延长其血清半衰期的部分，例如聚乙二醇(PEG)部分和免疫球蛋白超家族成员或其片段(如人IgG1重链恒定区的一部分，诸如铰链、CH2和CH3区)。

用于将这样的治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的，参见如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibody For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(编辑)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，pp.303-16(Academic Press 1985)；及Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

IX.试剂盒

本发明提供了用于治疗多种癌症的试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或多种上述药用组合物以及任选的使用说明书。在还有一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种药用组合物以及一种或多种用于实现上述组合物给药的装置的试剂盒。例如，主题试剂盒可包含药用组合物和用于实现直接动脉内注射组合物到癌性肿瘤中的导管。在其它实施方案中，主题试剂盒可包含预装填受体偶联剂的安瓿，任选配制为药物，或冻干的剂型，供递送装置使用。

本发明进一步以下列实施例说明之，不应把其理解为是限制性的。所有在本申请全文中引用的参考文献、专利和公开的专利中请的内容以及附图和序列表在此引入作为参考。

实施例

实施例1：多种抗TNF激动剂在诱导肿瘤细胞死亡上的功效

同时使用多种抗TNF受体抗体以诱导结肠癌瘤细胞中的细胞死亡以确定活化两种不同TNF家族受体是否改善受体激动剂的功效。结果显示与给予单一类型抗TNF抗体相比，在杀死肿瘤细胞方面多种抗体更有效。

在该测定法中使用了分别针对TNF家族受体TRAIL-R2和LTβR的激动剂抗体14A2和CBE11。单克隆鼠抗LTβR抗体CBE11业已描述于之前的PCT公开WO 96/22788和US专利号6,312,691，而人源化CBE11也已描述于WO 02/30986。

在TNF领域，抗TRAIL-R2抗体众所周知的，业已描述了类似于14A2的抗TRAIL-R2单克隆抗体(Ichikawa，K.等，(2001)Nat Med 7：954；Chuntharapai，A.等，(2001)J Immunol 166：4891)。为获得抗体14A2，简言之，通过用人TRAIL-R2-Ig融合蛋白免疫小鼠的标准杂交瘤技术产生了抗人TRAIL-R2单克隆抗体。接着筛选与TRAIL-R2部分结合的杂交瘤。一种这样的抗TRAIL-R2杂交瘤，14A2，在FACS分析中结合WiDr结肠直肠腺癌瘤细胞。在经由抗鼠Ig Fc域捕捉抗体固定在塑料表面时，14A2被鉴定为是一种能诱导肿瘤细胞死亡的单克隆抗体(参见实心方块，图1b)。

为测定活化TNF受体TRAIL-R2和LTβR的联合疗效，将结肠癌瘤WiDr细胞暴露于单独的可溶性鼠抗体CEB11、单独的14A2、及CBE11和14A2的组合。在用80U/ml IFNγ的4天MTT测定中使用WiDr细胞。当WiDr细胞与添加到培养基中的抗LTβR单克隆抗体CBE11(Browning，J.L.等，(1996)JExp Med 183：867)或14A2培养时，观察到了相对有限的细胞生长抑制。但是，抗TNF受体鼠抗体CBE11和14A2的组合更有效，如图2a所示。同样地，在类似测定中，抗CBE11能增强TNF活性(Mackay，F.等，(1997)JImmunol 159：3299)。因此，较单一抗体，在同时活化两种TNF家族受体方面鼠抗体CBE11和14A2的组合能更有效杀死肿瘤细胞。

实施例2：双特异性TNF受体偶联剂的构建

为了确定活化至少两种不同TNF受体的偶联剂是否具有超过个体活化部分的改善功效，创建以结合两种不同TNF家族受体如TRAIL-R2和LTβR的双特异性多价抗体形式存在的受体偶联剂。该双特异性多价抗体构建成含有CBE11和14A2表位结合域。

抗huTRAILR2/抗huLTβR双特异性抗体(称为LT-BS1)构建如下。通过PCR使用14A2杂交瘤测定14A2免疫球蛋白重链和轻链的抗体可变区。接着将可变区与人轻链恒定区连接以形成完整的嵌合小鼠-人14A2轻链。使用鼠λ轻链的可变域融合至人κ恒定域上构建嵌合的14A2轻链。接着，将λ-κ轻链用于构建双特异性抗体。将重链可变区与带有CBE11C-末端Fv片段的人IgG1重链的非可变区连接。人源化CBE11单链Fv型的构建之前业已描述于PCT/US03/41393(WO 04/058191)。因此，Hercules LT-BS1重链含有抗huTRAILR2 14A2-huIgG1重链(SEQ ID NO：1和2)，其C-末端融合有经过改造的huCBE11 scFv，而Hercules轻链则是嵌合的14A2-hu κ轻链(SEQ ID NO：3和4)。LT-BS1 Hercules构建物的示意图如图9所示。LT-BS1抗体构建物的核苷酸和氨基酸序列示于SEQ ID NO：5-8。

在CHO细胞中共表达重链和轻链产生了14A2/CBE11双特异性分子，这里为简单起见称为LT-BS1(LTβR/TRAIL-R2双特异性-1)。使用蛋白A亲和层析从培养物上清液中纯化LT-BS1。通过大小排阻层析没有检测到聚集物。

实施例3：双特异性TNF受体偶联剂在诱导肿瘤细胞死亡上的功效

如图1所示，在固定(捕捉)在塑料上时，原始的鼠14A2和CBE11单克隆抗体都能抑制HT29细胞生长。但是，这两种抗体在溶液中时仅具有微弱的功效。当两种单克隆抗体联合使用时，LTβR和TRAIL-R2的同时活化增强了生长抑制活性，如图2a所示。因此，通过联合针对两种不同TNF家族受体的抗体可获得提高的功效。

LT-BS1构建物与这两种单克隆抗体的组合一样有效，如图2b所示。LT-BS1构建物证实了当这两种单克隆抗体组合在一个分子实体中时仍具活性，并例证了组合针对两种不同TNF家族成员的抗受体单克隆抗体增加功效的原理。

为进一步研究双特异性LT-BS1抗体的功效，在根据标准方案进行的HT29或WiDr 3-4天增殖测定中使用纯化的LT-BS1。WiDr是一种具有类似特性的HT29变体系。在用针对LTβR的多价抗体作为平行对照下，于WiDr细胞中测试LT-BS1。使用的抗LTβR抗体是LL-MS1(一种含CBE11抗原识别位点的单特异性抗体)及LL-BS1(一种含CBE11和BHA10抗原识别位点的双特异性抗体)。对于LL-MS1和LL-BS1构建物的描述及序列见申请人共同未决的PCT申请WO 04/058191，在此引入作为参考。如图3所示，在WiDr结肠癌瘤细胞中LT-BS1能诱导细胞死亡，证实了其在结肠癌瘤细胞中的功效与LL-MS1和LL-BS1构建物相当。

有趣的是，与在WiDr结肠癌瘤细胞系中进行的增殖试验形成对比，在比较LT-BS1和CBE11/14A2组合获得类似结果时，较CBE11/14A2组合在LS174T结肠癌瘤细胞系中诱导细胞死亡方面LT-BS1更有效。如图4所示，单独的鼠CBE11和14A2组合对于细胞死亡功效很低，而暴露于LT-BS1或LT-BS1与IFNγ组合则明显降低了细胞生存力。

使用各种肿瘤细胞系进一步研究LT-BS1超越两种分开的鼠单克隆抗体组合的改善功效，如表1和图5-8所示。在80U/ml IFNγ存在或不存在的情况下，使用可溶性抗体根据标准的4天MTT生长测定方案进行增殖测定。测量了多种肿瘤类型，包括宫颈和***肿瘤细胞系。

结果证实较单独的亲本单克隆抗体CBE11和14A2或其组合，LT-BS1对于更多肿瘤有效。在有些细胞系中LT-BS1活性依赖于IFNγ的存在，诸如HT29和WiDR肿瘤系，这种细胞类型中的TNF家族受体活化典型的就是这样。但是，针对有些肿瘤类型的功效并不依赖于添加IFNγ。即使是WiDr/HT29对IFNγ的需要也不是绝对的，例如，在体内异种移植肿瘤模型的HT29细胞中，在完全不存在外源IFNγ下使用抗LTBR单克隆抗体观察到优良的抗肿瘤功效(Browning等(1996)J.Exp.Med.183：867)。LT-BS1增强的抗肿瘤活性谱证实了各种TNF家族受体组合能具有独特活性的原理。通过单独的亲本单克隆抗体无法预测到该增强的活性。

表1：

阴影表示响应LT-BS1，但基本上不响应CBE11p或其它组合的细胞++++，++，+打分指所获得的死亡程度，并不主要依赖于浓度

CBE11 抗LTBR(鼠)

CBE11p 五聚体型

LL-BS1 双特异性抗LTBR

14A2 抗TRAIL-R2(鼠)

LT-BS1 LTBR/TRAIL-R2双特异性

ME180和MDA231代表的是具有不同响应模式的宫颈和***肿瘤细胞系。这两种肿瘤细胞系都不响应CBE11或14A2单克隆抗体或强LTβR激动剂五聚CBE11(CBE11p)；但是，在体外培养中，双特异性LT-BS1十分有效地降低了它们的生长，如图5(ME180宫颈细胞系)和6(MDA321***癌瘤细胞系)。在ME180宫颈细胞系中使用IFNγ增强了LT-BS1活性，而IFN的存在却没有影响对***癌瘤细胞系MDA231的功效。

也测定了Hela***瘤细胞，如图7所示。使用Hela细胞，LT-BS1构建物证实较单独的鼠CBE11和14A2或其组合更有效地诱导细胞死亡。

如图8所示，比较了不同类型的细胞系以及与五聚CBE11(CBE11p，如PCT申请号PCT/US03/41393，WO 04/058191中所述)相比的LT-BS1在每种细胞系中的功效。总的来说，LT-BS1较CBE11p更有效得多。

基于上述结果，在肿瘤细胞中诱导细胞死亡上双特异性构建物LT-BS1较单独的每种抗体或其组合更有效。因为任一受体的二聚化效率较低，双特异性构建物可产生新的信号转导事件和/或改变一种受体的定位以使得信号传导更有效。双特异性LT-BS1构建物改善的功效表明诱导了新事件。

LT-BS1较单独的单克隆抗体14A2和CBE11所增加的功效由上述机制所产生，即组装了新的信号转导复合物或改变了受体定位。其它可能的机制可源自LT-BS1的寡聚化/聚集及同样它就像具有增加功效的CBE11五聚形式(用敏感的细胞)或寡聚14A2抗TRAIL-R2单克隆抗体。纯化的LT-BS1的生化分析显示在刚从冷冻室取出或在4℃下贮存5个月后都没有检测到更高分子量形式。

实施例4：交联TNF受体

为证实两种受体间的交联，即使用受体偶联剂连接两种受体增强活性，将受体-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白与受体偶联剂LT-BS1预混合以确定该受体-Ig融合物是否能阻断LT-BS1活性。预计将LTBR-Ig或TRAIL-R2-Ig与LT-BS1预混合以中和构建物的一侧应当能以类似方式阻断活性。用三种肿瘤系WiDr、ME180和MDA231进行试验。在所有三种情况中，两种受体-Ig融合物(LTβR或TRAIL-R2)都是LT-BS1活性的有效阻断物。此外，溶液中的单独单克隆抗体不起作用(只有可溶性CBE11具有对WiDr相对弱的活性，这正是选择该单克隆抗体用于临床研究的基础)。该试验表明用受体偶联剂交联两种TNF受体提供了增强的活性。

实施例5：另外的TNF家族受体对的设计和测试

另一种偶联剂的例子是针对人Fn14受体的试剂，它是TWEAK的受体。通过用重组Fn14-Fc融合蛋白或可溶性Fn14免疫野生型小鼠或Fn14受体缺陷型小鼠或其它物种制备针对人Fn14受体的抗体。通过常规方法制备杂交瘤并筛选Fn14结合。

通过分析NFkB活化鉴定激动性TNF单克隆抗体。就Fn14而言，NFkB活化导致释放IL-8或其它趋化因子，这构成了基于简单细胞的筛选方法。为确定抗体是否具激动性，将单克隆添加到溶液中或固定在塑料上。在添加抗体的情况下，释放趋化因子表明受体活化了。或者，现今可购买到大量的受体细胞系或能容易地构建以监测NFkB活化。另一种确定抗体是否活化的替换手段包括细胞增殖和细胞死亡及胱天蛋白酶活化测定，常用于测试死亡程序的诱导。

一旦通过标准筛选技术鉴定出激动性抗体，对编码Ig分子的RNA测序并可设计这些单克隆抗体的重组形式。添加CBE11 scFv构建物到激动性Fn14单克隆抗体序列的C末端，并表达上述抗Fn14-抗LTBR组合的双特异性形式，再通过蛋白A层析分离。或是使用原始的鼠Fc，或是将原始的抗Fn14单克隆抗体用人IgG Fc域转变为嵌合单克隆抗体。或者，设计激动性抗Fn14 scFv并添加到嵌合型抗LTBR上，如CBE11。

一旦构建针对诸如Fn14和LTBR的两种不同TNF受体的双特异性抗体，就在体外测试所得蛋白质对表达这两种受体的肿瘤系的活性。使用异种移植环境中的肿瘤在体内测试中确认双特异性的累加或协同活性。筛选人肿瘤数据库以确定这样的受体对是否以合理的频率出现，即在人群中大于5-30％。如上定义的具有合理频率靶向肿瘤的活性分子是用于人体测试的候选物。

实施例6：选择用于肿瘤治疗的潜在TNF家族受体对

查询现有的公开基因表达数据库以寻找在例如导管侵入性***癌瘤的特定肿瘤类型上表达的那些受体。选择肿瘤特异性受体对，如LTβR和RANK，而在诸如微脉管***和肝细胞的关键细胞类型中并不大量表达的那些受体优先级较低。

使用体外测定进一步确认所预测方法。例如，LT-BS1构建物可杀死诸如如上定义的MDA231的肿瘤细胞。在另一个例子中，将LT-BS1添加到初级(primary)内皮细胞的培养物中，接着用几种方法检查内皮活化的证据。首先，研究从这些细胞中释放的趋化因子，因为其作为信号传导能力的指标。内皮细胞的促炎活化牵涉促进白细胞黏附和运输的多种黏附分子的诱导展示。E-选择蛋白、VCAM和ICAM就是这样的分子，且通过FACS分析跟踪它们的诱导(参见例如Hochmna等(1995)J.Inflammation 46：220)。很可能LT-BS1并不能有效活化内皮细胞。相比之下，TNF是一种强促炎信号，它上调所有这些三种分子的表达。使用芯片技术的基因表达分析也用于获得这些新的双特异性抗体是否具有不寻常的和潜在的有害结果的更详细图像。内皮活化和内皮或内皮和肝细胞死亡是负指标。

通过制谱(profiling)以发现独特的肿瘤导向受体组合，结合在内皮细胞和肝细胞上表达降低的有利预测，优化了该选择过程。通过使用体外肿瘤生长测定以及内皮活化和生存测定确认了该选择。

等效方案

本领域普通技术人员应意识到可对“详述”中描述的本发明进行许多变化和改变而不背离本发明的精神和范围。在此提供的实施例仅作为例证，不应解释为对所附权利要求中列举的本发明范围的限制。

所有在此提及的出版物和专利其全文引入作为参考，就象每一篇个别的出版物或专利明确且单独指明引入作为参考。

序列表

<110>比奥根艾迪克MA公司(BIOGEN IDEC MA INC.)

<120>受体偶联剂及其治疗用途

<130>BGN-A225-PC

<140>

<141>

<150>60/555,805

<151>2004-03-23

<160>8

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>1350

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟嵌合14A2-huIgG1重链的DNA序列

<400>1

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180

acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300

tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360

gccagcacga agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

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ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

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ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

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<210>2

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟嵌合14A2-huIgG1重链的蛋白质序列

<400>2

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1 5 10 15

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20 25 30

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65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

ASh Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

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Gly

<210>3

<211>669

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟嵌合14A2-人κ轻链的DNA序列

<400>3

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<210>4

<211>222

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟嵌合14A2-人κ轻链的蛋白质序列

<400>4

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<210>5

<211>2106

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟Hercules双特异性抗体重链(LT-BS1)的DNA序列

<400>5

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acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300

tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360

gccagcacga agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaagactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

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<220>

<223>人工序列的描述：成熟Hercules双特异性重链(LT-BS1)的蛋白质序列

<400>6

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

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Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

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355 360 365

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370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

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Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser

530 535 540

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Asn

545 550 555 560

Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

565 570 575

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

595 600 605

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys

610 615 620

Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

625 630 635 640

Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

645 650 655

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

660 665 670

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser

675 680 685

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

690 695 700

<210>7

<211>669

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟Hercules双特异性抗体轻链(LT-BS1)的DNA序列

<400>7

caacttgtgc tcactcagtc atcttcagtc tctttctccc tgggagcctc agcaaaactc 60

acgtgcacct tgagtagtca gcacagtacg tacaccattg aatggtatca gcaacagccc 120

ctcaagcctc ctaagtatgt gatggagctt aagaaagatg gaagccacag cacaggtgat 180

gggattcctg atcgcttctc tggatccagc tctggtgctg atcgctacct tagcatttcc 240

aacatccagc ctgaagatga agcaatatac atctgtggtg tgggtgatac aattaaggaa 300

caatttgtgt atgttttcgg cggtggaacc aaggtcgaaa tcaaacgtac ggtggctgca 360

ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 420

gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 480

gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 540

tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 600

gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 660

gagtgttag 669

<210>8

<211>222

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：成熟Hercules双特异性抗体轻链(LT-BS1)的蛋白质序列

<400>8

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser

65 70 75 80

Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100 105 110

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

Claims

1.一种特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、并诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂。

2.权利要求1的受体偶联剂，其包含对第一受体的第一结合特异性和对第二受体的第二结合特异性。

3.权利要求2的受体偶联剂，其中所述第一结合特异性为抗体或其抗原结合片段所赋予。

4.权利要求3的受体偶联剂，其中所述第二结合特异性为抗体或其抗原结合片段所赋予。

5.权利要求3的受体偶联剂，其中所述第一结合特异性为单链Fv片段所赋予。

6.权利要求5的受体偶联剂，其中所述第二结合特异性为抗体或其抗原结合片段所赋予。

7.权利要求2的受体偶联剂，其中所述第一结合特异性为受体的天然配体所赋予。

8.权利要求7的受体偶联剂，其中所述第二结合特异性为抗体或其抗原结合片段所赋予。

9.权利要求7的受体偶联剂，其中所述第二结合特异性为受体的天然配体所赋予。

10.权利要求1的受体偶联剂，其中至少一种受体含死亡域。

11.权利要求10的受体偶联剂，其中所述受体选自：TNFR1(DR1)、Fas(DR2)、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、p75NGF-R和DR6。

12.权利要求1的受体偶联剂，其中至少一种受体与组织分化有关。

13.权利要求12的受体偶联剂，其中至少所述受体选自：LTBR、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn14、Troy/Trade、TAJ和p75NGF-R。

14.权利要求1的受体偶联剂，其中至少一种受体与免疫调节有关。

15.权利要求14的受体偶联剂，其中所述受体选自：TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、TACI、BAFF-R、BCMA和RELT。

16.权利要求1的受体偶联剂，其中至少一种受体在肿瘤细胞上过表达。

17.权利要求16的受体偶联剂，其中至少一种受体在正常肝细胞或内皮细胞上不过表达。

18.权利要求2的受体偶联剂，其中所述第一结合特异性为抗LTβ受体(LTβR)抗体或其抗原结合片段所赋予。

19.权利要求18的受体偶联剂，其中所述抗LTβR抗体衍生自人源化CBE11抗体。

20.权利要求18的受体偶联剂，其中所述第二结合特异性为抗TRAIL-R2抗体或其抗原结合片段所赋予。

21.权利要求20的受体偶联剂，其中所述抗TRAIL-R2抗体衍生自人源化14A2抗体。

22.权利要求19的受体偶联剂，其中所述第一结合特异性为人源化CBE11抗体的单链Fv片段所赋予且所述第二结合特异性为人源化14A2抗体或其抗原结合片段所赋予。

23.权利要求2的受体偶联剂，其中所述第一结合特异性为至少两个三聚配体-Fc构建物所赋予且所述第二结合特异性为三个抗体所赋予。

24.权利要求1的受体偶联剂，其中至少一种TNF家族受体不常见于细胞表面上的筏环境中。

25.权利要求1的受体偶联剂，其中至少一种TNF家族受体常见于细胞表面上的筏环境中。

26.权利要求1的受体偶联剂，其中所述信号强度经由受体增强。

27.一种包含至少第一和第二抗体或其抗原结合片段的受体偶联剂，其中每种抗体结合不同TNF家族受体，由此诱导异聚受体复合物的形成。

28.权利要求27的受体偶联剂，其中所述第一抗体衍生自抗LTβR抗体。

29.权利要求28的受体偶联剂，其中所述抗LTβR抗体衍生自人源化CBE11抗体。

30.权利要求28的受体偶联剂，其中所述第二抗体衍生自抗TRAIL-R2抗体。

31.权利要求30的受体偶联剂，其中所述抗TRAIL-R2抗体衍生自人源化14A2抗体。

32.一种用于定位TNF家族受体至细胞膜筏的方法，包括给予包含对筏化TNF家族受体的第一结合特异性和对非筏化TNF家族受体的第二结合特异性的受体偶联剂，其中受体偶联剂的结合定位非筏化TNF受体至细胞膜中的筏。

33.一种用于增强受体信号传导的方法，包括给予特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、和诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂。

34.一种减少肿瘤体积的方法，包括给予受试者特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、和诱导异聚受体复合物形成的受体偶联物。

35.一种治疗癌症的方法，包括给予受试者特异性活化至少两种不同TNF家族受体、增强受体信号传导、和诱导异聚受体复合物形成的受体偶联物。

36.权利要求34或35的方法，其中所述受体偶联剂在IFNγ存在下给予。

37.权利要求34或35的方法，其中所述受体偶联剂在化疗剂存在下给予。

38.一种活化至少两种不同TNF家族受体并诱导异聚受体复合物形成的受体偶联剂，其包含针对第一TNF受体的第一结合特异性和针对第二TNF受体的第二结合特异性。

39.权利要求38的受体偶联剂，其中所述第一和第二结合特异性所针对的TNF受体选自：

a)一种不含死亡域的TNF受体和一种含死亡域的TNF受体；

b)两种不含死亡域的TNF受体；和

c)两种含死亡域的TNF受体。

40.权利要求39的受体偶联剂，其中至少一种结合特异性针对与组织分化相关的不含死亡域的TNF受体。

41.权利要求39的受体偶联剂，其中两种不含死亡域的TNF受体选自：LTBR/Fn14；LTBR/RANK；Fn14/TAJ；LTBR/EDAR；LTBR/XEDAR；RANK/EDAR；RANK/XEDAR；TAJ/EDAR；和TAJ/XEDAR。

42.权利要求39的受体偶联剂，其中不含死亡域的TNF受体和含死亡域的TNF受体选自：LTBR/TRAIL-R1；LTBR/TRAIL-R2；LTBR/p75NGF-R；Fn14/p75NGF-R；和p75NGF-R/TAJ。