KR20210097750A

KR20210097750A - Cd40 항체 약학 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210097750A
Application number: KR1020217020189A
Authority: KR
Inventors: 지안지안 양; 하오 리; 쉰 리우; 지아후아 지앙
Original assignee: 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-08-09
Also published as: AU2019388931A1; MX2021006360A; CA3121291A1; CN112839961A; WO2020108621A1; EP3939998A4; EP3939998A1; TW202021620A; JP2022513671A; BR112021010414A2; CN112839961B

Abstract

본 발명은 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 아세트산-아세트산 나트륨 완충제 용액을 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도를 제공한다. 약학 조성물은 당, 비-이온성 계면활성제 및 기타 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 양호한 항체 안정성을 나타낸다.

Description

CD40 항체 약학 조성물 및 이의 용도

본원은 CN201811448238.5(출원일: 2018년 11월 30일)를 우선권 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.

본원은 약학 제제 분야에 관한 것이고, 구체적으로 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유하는 약학 조성물, 및 약제로서 이의 용도에 관한 것이다.

세포 표면 상에 발현되는 당단백질 중 하나로서 CD40은 48 kDa의 분자량을 갖는 유형 I 막 내재 당단백질이며, 이는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과에 속하고 면역계에서 중요한 역할을 한다. 이는 다양한 면역 세포, 예컨대 B 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식 세포에서 발현된다. 신호 전달이 CD40에 의해 매개될 때, 특수화된 항원 제시 세포가 활성화될 것이다. CD40의 천연 리간드는 CD154 또는 CD40L로 지정되고 성숙 T 림프구에서 대개 발현되는 것으로 공지되어 있다. CD40L-매개된 신호 전달은 면역 세포의 활성화 및 증식, 및 시토카인 및 케모카인의 생산을 포함하는 많은 세포의 생물학적 이벤트를 촉발할 수 있다. CD40 신호 전달은 T 세포-의존성 면역 반응에서, 특히 종양 환경에 있어서 극히 중요하며, 여기서 CD40-자극된 수지상 세포는 종양-특이적 효과기 T 세포를 활성화시키고, 이는 종양 세포를 근절하는 잠재력을 갖는다.

CD40의 발현은 B 림프구를 포함하는 다양한 정상 세포 및 종양 세포에서 발견되었다. 예를 들어, 흑색종은 CD40 발현을 수반하는 종양 중 하나이고, 고형 종양 중 30 내지 70%가 또한 CD40을 발현한다. CD40의 활성화는 종양-특이적 T 세포 반응의 면역 활성화, CD40-양성 종양의 직접 세포자멸, 및 자극에 의해 초래된 ADCC의 체액 반응을 포함하는 항종양 반응을 효과적으로 촉발하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Tong et al, Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1-13]). 또한, 관찰된 종양 근절은 종양-특이적 세포독성 T 림프구의 존재와 크게 연관된다. 한편, CD40 항체의 전신 투여가 일반적으로 다양한 부작용, 예컨대 쇼크 증후군 및 시토카인 방출 증후군과 관련된다는 것이 또한 무시되어서는 안 된다(문헌[van Mierlo et al, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5561-5566]).

현재 많은 세계적 제약 회사가, 특이적으로 면역 활성화를 자극하여 종양에 대한 환자 자신의 면역계 반응을 최대화시키고 이에 따라 종양 세포 사멸의 목적을 달성하는, 상기에 기재된 CD40에 대한 단클론성 항체를 개발하고 있다. 관련 특허는 하기를 포함한다: CN1198647, CN1369015, CN1582165, CN100430419, CN101014386, CN101237882, CN101289510, CN101490086, CN103842382, CN104918957, WO2002028904, WO2011123489, WO2012149356, WO2013034904, WO2015091853, WO2016196314, WO2017040932 및 WO2017004006 등. 지금까지, Pfizer(관련 제품은 Roche에 인가되어 있다), Alligator 및 기타 회사의 항-CD40 항체가 전임상 동물 모델에서 양호한 종양 사멸 효과를 나타냈다.

WO2018219327(PCT/CN2018/089252)은, CD40 항체를 자극시킴으로써 사용하기 위한 고 친화도, 고 선택성 및 고 생물학적 활성을 갖는 항-CD40 항체를 제공한다.

그러나, 큰 분자량 및 복합 구조를 갖는 항체 약물은 분해 경향, 중합 또는 바람직하지 않은 화학적 변경 경험으로 인해 불안정해질 수 있다. 항체를 투여에 적합하도록 만들고 저장 및 후속 사용을 위해 안정성 및 보다 양호한 성능을 유지하기 위해, 항체 약물의 안정한 제제의 연구가 매우 중요하다. CD40 항체 제제와 관련된 특허의 예는 WO2005063289이다. 새로운 CD40 항체에 있어서, 투여에 보다 적합한 CD40을 포함하는 약학 조성물(제제)을 개발할 필요가 여전히 존재한다.

본원은 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 완충제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제 및 석시네이트 완충제, 바람직하게는 아세테이트 완충제, 보다 바람직하게는 아세트산-아세트산 나트륨 완충제로부터 선택된다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약 1 내지 120 mg/ml의 농도를 가지며, 이는 약 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 12 mg/ml, 14 mg/ml, 16 mg/ml, 18 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml, 24 mg/ml, 26 mg/ml, 28 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml, 95 mg/ml, 100 mg/ml, 105 mg/ml, 110 mg/ml, 115 mg/ml, 120 mg/ml 또는 임의의 2개의 값 사이의 임의의 값, 바람직하게는 10 내지 40 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 25 mg/ml일 수 있다.

대안적 실시양태에서, 완충제는 약 5 내지 30 mM, 바람직하게는 약 10 내지 20 mM의 농도를 가지며, 비제한적인 예는 약 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM 또는 임의의 2개의 값 사이의 임의의 값, 가장 바람직하게는 약 10 mM을 포함한다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 완충제는 약 4.5 내지 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 6.0의 pH를 가지며, 비제한적인 실시양태에서, 이는 또한 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0 또는 임의의 2개의 값 사이의 임의의 값, 가장 바람직하게는 약 5.0 또는 5.5일 수 있다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물은 추가로 당을 포함한다. 본원에서 "당"은 통상적 조성물 (CH₂O)_n 및 이의 유도체, 예컨대 모노사카라이드, 다이사카라이드, 트라이사카라이드, 폴리사카라이드, 당 알코올, 환원 당, 비-환원 당 등을 포함한다. 본원에서 "당"은 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 실리톨, 솔비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트라이오스, 스타키오스, 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 솔비톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 당은 비-환원 다이사카라이드, 보다 바람직하게는 트레할로스 및 수크로스이다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 당은 약 40 내지 95 mg/ml(예를 들어 55 mg/ml), 바람직하게는 약 60 내지 90 mg/ml의 농도를 갖는다. 비제한적인 예에서 당의 농도는 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml 또는 임의의 2개의 값 사이의 임의의 값, 보다 바람직하게는 약 80 mg/ml이다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물은 추가로 계면활성제를 포함하고, 이는 폴리솔베이트 20; 폴리솔베이트 80; 폴록사머; 트라이톤(Triton); 나트륨 도데실 설포네이트; 나트륨 라우릴 설포네이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카아미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔마미도프로필-, 이소스테아르아미도프로필-베타인; 미리스트아미도프로필-, 팔마미도프로필-, 이소스테아르아미도프로필-다이메틸아민; 나트륨 메틸코코일; 나트륨 메틸올레일 타우레이트; 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체; 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체; 에틸렌 글리콜의 공중합체 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 등으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리솔베이트, 예컨대 폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 20, 보다 바람직하게는 폴리솔베이트 80이다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 계면활성제는 약 0.02 내지 0.8 mg/ml (예를 들어 0.1 mg/ml), 바람직하게는 약 0.3 내지 0.6 mg/ml의 농도를 갖는다. 비제한적인 예에서 계면활성제의 농도는 0.3 mg/ml, 0.35 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.45 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.55 mg/ml, 0.6 mg/ml 또는 임의의 2개의 값 사이의 임의의 값, 보다 바람직하게는 약 0.4 mg/ml를 포함한다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 1 내지 120 mg/ml의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편(여기서 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는다), 및

(b) 5 내지 30 mM의 아세테이트 완충제.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물은 하기를 포함하고, 바람직하게는 약학 조성물은 4.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.0 내지 6.0, 추가로 바람직하게는 5.5의 pH를 갖는다:

(a) 1 내지 120 mg/ml의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편(여기서 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는다),

(b) 5 내지 30 mM의 아세테이트 완충제,

(c) 40 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및

(d) 0.02 내지 0.8 mg/ml의 폴리솔베이트 80.

(b) 5 내지 30 mM의 아세테이트 완충제,

(c) 40 내지 95 mg/ml의 트레할로스, 및

(d) 0.02 내지 0.8 mg/ml의 폴리솔베이트 80.

약학 조성물은

(b) 10 내지 20 mM의 아세테이트 완충제

를 포함하고, 약학 조성물은 5.0 내지 5.5의 pH를 갖는다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물은 하기를 포함하고, 바람직하게는 약학 조성물은 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는다:

(a) 10 내지 40 mg/ml의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편(여기서 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는다),

(b) 10 내지 20 mM의 아세테이트 완충제,

(c) 60 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및

(d) 0.3 내지 0.8 mg/ml의 폴리솔베이트 80.

(a) 25 mg/ml의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편(여기서 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는다),

(b) 10 내지 20 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충제,

(c) 60 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및

(d) 0.3 내지 0.8 mg/ml의 폴리솔베이트 80.

구체적 실시양태에서, 약학 조성물은 하기를 포함한다:

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.8;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 6.0;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.6;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.8;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 6.0;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.5;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 6.0;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.5;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.8;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80, 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 6.0;

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충제, pH 5.5; 또는

25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충제, pH 5.5.

상기에 정의된 구체적 실시양태에서, CD40 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는다.

일부 실시양태에서, 본원의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 1에 나타낸 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 나타낸 경쇄 가변 영역을 갖는다:

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체, 바람직하게는 인간화된 항체로부터 선택될 수 있다.

대안적 실시양태에서, 약학 조성물의 인간화된 항체의 경쇄 가변 영역 상의 경쇄 FR 및 중쇄 가변 영역 상의 중쇄 FR은 각각 인간 생식계열 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이 서열로부터 유래된다.

또한, 인간화된 CD40 항체의 중쇄는 서열번호 17에 나타낸 서열 또는 이의 변이체를 가지며, 상기 변이체는 바람직하게는 중쇄 가변 영역에서 0 내지 10개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 위치 6 및 8에서 돌연변이를 갖되, 상기 아미노산은 바람직하게는 I, A 또는 L로 돌연변이되고; 인간화된 항체의 경쇄는 서열번호 18에 나타낸 서열 또는 이의 변이체를 가지며, 상기 변이체는 바람직하게는 경쇄 가변 영역에서 0 내지 10개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 위치 2 및 3에서 돌연변이를 갖되, 상기 아미노산은 바람직하게는 I, V 또는 L로 돌연변이된다.

대안적 실시양태에서, 인간화된 CD40 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 FR 또는 이의 변이체를 추가로 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 FR을 포함하고, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 또는 IgG2의 중쇄 FR을 포함한다.

대안적 실시양태에서, CD40 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 hu9E5 항체 경쇄의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 hu9E5 항체 중쇄의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖되, hu9E5 항체 경쇄의 서열은 서열번호 18에 나타나 있고, hu9E5 항체 중쇄의 서열은 서열번호 17에 나타나 있다.

본원의 약학 조성물은 충분한 약물 안정성을 가지며 장기간 동안 안정하게 저장될 수 있다. 다른 한편으로는, 약물 수송의 편의를 위해, 본원의 약학 조성물을 동결건조된 제제로 추가로 생산할 수 있다.

또한, 본원은 CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 생산 방법을 제공하되, 이는 상기에 정의된 약학 조성물을 동결건조하는 단계를 포함한다.

대안적 실시양태에서, CD40 항체를 포함하는 제제의 생산 방법에서, 동결건조는 사전-동결건조 단계, 일차 건조 단계 및 이차 건조 단계를 순서대로 포함한다.

또한, 본원은 상기에 정의된 CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 생산 방법에 의해 생산한 CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제를 제공한다.

일부 실시양태에서, 동결건조된 제제는 2℃ 내지 8℃에서 3개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 18개월 이상 또는 24개월 이상 동안 안정하다.

일부 실시양태에서, 동결건조된 제제는 25℃에서 3개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 18개월 이상 또는 24개월 이상 동안 안정하다.

일부 실시양태에서, 동결건조된 제제는 40℃에서 7일 이상, 14일 이상 또는 28일 이상 동안 안정하다.

또한, 본원은 CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 재구성 용액의 생산 방법을 제공하되, 이는 상기에 정의된 동결건조된 제제를 재구성하는 단계를 포함하고, 재구성에 사용된 용액은 비제한적으로 주사용 물, 생리 식염수 또는 글루코스 용액으로부터 선택된다.

또한, 본원은 상기에 정의된 CD40 항체를 함유하는 동결건조된 제제의 재구성 용액의 생산 방법에 의해 생산된 CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 재구성 용액을 제공한다.

또한, 본원은 임의의 안정한 약학 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 제품 또는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 유리병은 중성 보로실리케이트 유리 튜브로 제조된 주사 바이알이다.

또한, 본원은 CD40-관련된 질병 또는 증상의 치료용 약제의 생산에서 약학 조성물, 동결건조된 제제 또는 동결건조된 제제의 재구성 용액의 용도를 제공하되, 여기서 상기 질병 또는 증상은 바람직하게는 암이고, 상기 암은 림프종, 유방암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 횡문근육종, 식도암, 자궁경부암, 다발성 골수종, 백혈병, 담낭암, 교아종 및 흑색종으로부터 선택된다.

또한, 본원은 CD40-관련된 질병 또는 증상의 치료 또는 예방 방법을 제공하되, 이는 치료적 유효량의 본원에 정의된 약학 조성물, 동결건조된 제제 또는 동결건조된 제제의 재구성 용액을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 질병 또는 증상은 바람직하게는 암이고, 상기 암은 림프종, 유방암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 횡문근육종, 식도암, 자궁경부암, 다발성 골수종, 백혈병, 담낭암, 교아종 및 흑색종으로부터 선택된다.

또한, 본원은 상기에 정의된 약학 조성물, 동결건조된 제제 또는 동결건조된 제제의 재구성 용액를 함유하는 용기를 포함하는 제품을 제공한다.

본원에 기재된 다양한 실시양태의 특징 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본원의 다른 실시양태를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원의 이들 양태 및 기타 양태는 당업자에게 자명할 것이다. 본원의 이들 실시양태 및 기타 실시양태는 하기 상세한 설명에 추가로 기재된다.

1. 정의

당업자에게 본원을 보다 쉽게 이해시키기 위해, 특정 기술 용어 및 과학 용어가 하기에 구체적으로 정의된다. 본원에 달리 분명히 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 용어 및 과학 용어는 본원이 속하는 분야의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.

"완충제"는 산-염기 복합 성분의 작용을 통해 pH 변화에 저항할 수 있는 완충제를 지칭한다. 적절한 범위에서 pH를 조절할 수 있는 완충제의 예는 아세테이트 완충제, 석시네이트 완충제, 글루코네이트 완충제, 히스티딘 완충제, 옥살레이트 완충제, 락테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 퓨마레이트 완충제, 글리실글리신 완충제 및 기타 유기산 완충제를 포함한다.

"히스티딘 완충제"는 히스티딘 이온을 함유하는 완충제이다. 히스티딘 완충제의 예는 히스티딘-하이드로클로라이드 완충제, 히스티딘-아세테이트 완충제, 히스티딘-포스페이트 완충제, 히스티딘-설페이트 완충제 등, 바람직하게는 히스티딘-하이드로클로라이드 완충제를 포함한다. 히스티딘-하이드로클로라이드 완충제는 히스티딘 및 염산 또는 히스티딘 및 히스티딘 하이드로클로라이드로부터 제조된다.

"시트레이트 완충제"는 시트레이트 이온을 함유하는 완충제이다. 시트레이트 완충제의 예는 시트르산-시트르산 나트륨 완충제, 시트르산-시트르산 칼륨, 시트르산-시트르산 칼슘, 시트르산-시트르산 마그네슘 등을 포함한다. 바람직한 시트레이트 완충제는 시트르산-시트르산 나트륨 완충제이다.

"석시네이트 완충제"는 석시네이트 이온을 함유하는 완충제이다. 석시네이트 완충제의 예는 석시네이트-석신산 나트륨 완충제, 석시네이트-석신산 칼륨 완충제, 석시네이트-석신산 칼슘 완충제 등을 포함한다. 바람직한 석시네이트 완충제는 석시네이트-석신산 나트륨 완충제이다.

"포스페이트 완충제"는 포스페이트 이온을 함유하는 완충제이다. 포스페이트 완충제의 예는 인산 수소 이나트륨-인산 이수소 나트륨 완충제, 인산 수소 이나트륨-인산 이수소 칼륨 완충제 등을 포함한다. 바람직한 포스페이트 완충제는 인산 수소 이나트륨-인산 이수소 나트륨 완충제이다.

"아세테이트 완충제"는 아세테이트 이온을 함유하는 완충제이다. 아세테이트 완충제의 예는 아세트산-아세트산 나트륨 완충제, 아세트산-히스티딘 완충제, 아세트산-아세트산 칼륨 완충제, 아세트산-아세트산 칼슘 완충제, 아세트산-아세트산 마그네슘 완충제 등을 포함한다. 바람직한 아세테이트 완충제는 아세트산-아세트산 나트륨 완충제이다.

"약학 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로/약학적으로 허용되는 염 또는 전구약물, 및 기타 화학적 성분, 예컨대 생리학적으로/약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 의미한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 대한 투여를 촉진하고 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 이의 생물학적 활성을 행사하는 것이다. 이러한 맥락에서, "약학 조성물" 및 "제제"는 상호 배타적이지 않다.

본원에 기재된 약학 조성물의 용액 형태에서, 달리 명시되지 않는 한, 내부의 용매는 물이다.

"동결건조된 제제"는 액체 또는 용액 형태의 약학 조성물 또는 용액 제제를 진공 동결건조함으로써 수득한 제제 또는 약학 조성물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 지수 값이 당업자에 의해 결정된 구체적 값의 허용가능한 오차 범위 내에 있고, 상기 값이 결정되거나 측정되는 방법에 부분적으로 의존적임(즉 측정 시스템의 한계)을 의미한다. 예를 들어, "약"은 기술의 모든 실행에서 1 또는 1 초과 이내의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "실질적으로 포함함"은 20% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 있어서, 상기 용어는 값의 최대 10배 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본원 및 청구범위에 구체적 값이 나타나는 경우, "약" 또는 "실질적으로 포함함"의 의미가 상기 구체적 값의 허용가능한 오차 범위 내에 있다고 가정되어야 한다.

본원에 기재된 약학 조성물은 안정한 효과를 달성해야 한다: 내부의 항체가 저장 후에 이의 물리적 안정성 및/또는 화학 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 유지해야 한다. 바람직하게는, 약학 조성물은 저장 후에 이의 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 유지한다. 저장 기간은 일반적으로 약학 조성물의 사전 결정된 저장 수명을 기반으로 선택된다. 단백질의 안정성을 측정하기 위해 이용가능한 다양한 분석 기법이 존재하며, 이는 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 저장 후에 안정성을 측정할 수 있다.

안정한 약학 항체 제제는 하기 조건 하에 유의미한 변화가 관찰되지 않는 제제이다: 냉장 저장 온도(2℃ 내지 8℃)에서 적어도 1개월, 바람직하게는 6개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 더 바람직하게는 최대 2년 동안 저장. 또한, 안정한 액체 제제는 25℃에서 1개월, 3개월 또는 6개월 동안 저장, 또는 40℃에서 1개월 동안 저장을 포함하는 기간 후에 목적하는 특징을 나타내는 액체 제제를 포함한다. 안정성의 전형적인 허용가능한 기준은 하기와 같다: 일반적으로 SEC-HPLC에 의해 측정시 항체 단량체의 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하가 분해된다. 시각적 분석에 의해 결정된 바와 같이, 약학 항체 제제는 무색이거나 투명 내지 약간 희부연 백색이다. 제제의 농도, pH 및 삼투압은 ±10% 이하의 편차를 갖는다. 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5%의 절단이 일반적으로 관찰되고, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 응집체가 일반적으로 형성된다.

색 및/또는 선명도의 시각적 검사, 또는 자외선 산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 동적 광 산란(DLS)에 의한 측정 후에, 항체가 응집, 침전 및/또는 변성의 유의미한 증가를 나타내지 않는 경우, 항체는 약학 제제에서 이의 물리적 안정성을 유지한다. 단백질 구조의 변화는 형광 분광법(단백질의 삼차 구조를 결정함) 및 FTIR 분광법(단백질의 이차 구조를 결정함)에 의해 평가될 수 있다.

항체가 유의미한 화학적 변화를 나타내지 않는 경우, 항체는 약학 제제에서 이의 화학적 안정성을 유지한다. 화학적 안정성은 화학적으로 변형된 형태를 갖는 단백질을 검출하고 정량화함으로써 측정될 수 있다. 흔히 단백질의 화학적 구조를 변화시키는 분해 공정은 가수분해 또는 절단(방법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 평가됨), 산화(방법, 예컨대 질량 분석법 또는 MALDI/TOF/MS 등과 조합된 펩티드 맵핑에 의해 평가됨), 탈아미드화(방법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 모세관 등전 초점 조절, 펩티드 맵핑, 이소아스파르트산 측정 등에 의해 평가됨) 및 이성질체화(이소아스파르트산 함량 측정, 펩티드 맵핑 등에 의해 평가됨)를 포함한다.

제시된 시간에서 항체의 생물학적 활성이 약학 제제가 제조되었을 때 나타내는 생물학적 활성의 사전 결정된 범위 내에 있는 경우, 항체는 약학 제제에서 이의 생물학적 활성을 유지한다. 항체의 생물학적 활성은 예를 들어 항원 결합 분석에 의해 결정될 수 있다.

용어 "CD40"은 TNF 수용체 상과의 구성원인 세포 표면 수용체를 지칭하며, 또한 TNFRSF5로 공지되어 있다. CD40는 수지상 세포, B 세포 및 대식 세포의 표면 상에 편재하여 발현되고, T 세포 면역력 생산 및 유지에 필요한 분자이다. 용어 "CD40"은 세포에 의해 자연 발편되는 CD40의 임의의 변이체 또는 이소폼을 표함한다. 본원의 항체는 비-인간 종의 CD40과 교차-반응성일 수 있다. 대안적으로, 항체는 인간 CD40-특이적일 수 있고 다른 종과 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다. CD40 또는 이의 임의의 변이체 또는 이소폼은, 이를 자연적으로 발현하거나 당분야에서 통상적이고 본원에 기재된 기법을 사용하는 재조합 기법에 의해 생산되는 세포 또는 조직으로부터 단리될 수 있다. 바람직하게는, 항-CD40 항체는 정상적 글리코실화 패턴을 갖는 인간 CD40을 표적으로 한다.

본원에 사용된 아미노산 3-문자 코드 및 1-문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기재되어 있다.

본원에 언급된 "항체"는 쇄간 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 테트라펩티드 쇄 구조인 면역 글로불린을 지칭한다.

본원에서, 항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ 또는 λ 쇄, 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서, 항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.

항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 가까운 약 110개의 아미노산으로 구성된 가변 단편(Fv 영역)은 이의 아미노산 서열에서 상당히 다를 수 있다. 항체의 C-말단에 가까운 나머지 아미노산 서열으로 구성된 불변 영역은 비교적 안정하다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 또한, 항체의 특이성을 결정하는 3개의 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭된다. 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 중쇄 가변 영역(HCVR) 각각은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고; 중쇄의 3개의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 본원의 항체 또는 항원-결합 단편의 LCVR 및 HCVR의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카밧(Kabat) 넘버링 기준(LCDR1-3, HCDR2-3)을 준수하거나 카밧 및 코티아(Chothia) 넘버링 시스템(HCDR1)을 준수한다.

본원의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체, 바람직하게는 인간화된 항체를 포함한다.

본원에서 용어 "뮤린 항체"는 당분야의 지식 및 기술에 따라 생산한 인간 CD40를 표적화하는 단클론성 항체이다. 생산 동안, 시험 개체에게 CD40 항원을 주사한 후에, 목적하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 단리한다.

용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역와 융합시킴으로써 생산한 항체이며, 이는 뮤린 항체에 의해 유도된 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라 항체를 구축하기 위해, 뮤린-특이적 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 먼저 구축한 후에, 가변 영역 유전자를 뮤린 하이브리도마 세포로부터 클로닝한다. 이어서, 인간 항체의 불변 영역 유전자를 필요에 따라 클로닝한다. 뮤린 가변 영역 유전자 및 인간 불변 영역 유전자를 키메라 유전자 내로 결찰시킨 후에, 인간 벡터 내로 삽입하고, 최종적으로 키메라 항체 분자를 진핵 또는 원핵 산업 시스템에서 발현한다. 본원의 바람직한 실시양태에서, 키메라 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄는 인간 κ 또는 λ 쇄의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 키메라 CD40 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

또한, 용어 "인간화된 항체"(또한 CDR-그라프팅된 항체로 공지됨)는 뮤린 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역의 프레임워크(즉 상이한 유형의 인간 생식계열의 항체의 프레임워크 서열) 내로 그라프팅시킴으로써 생산된 항체를 지칭한다. 이는 많은 양의 뮤린 단백질 성분을 함유하는 키메라 항체에 의해 유도된 강한 면역 반응을 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(웹사이트[www.mrccpe.com.ac.uk/vbase]에서 입수가능), 및 문헌[Kabat, EA, etc., Human, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition]에서 찾아볼 수 있다. 면역원성을 감소시킴으로써 초래된 활성의 감소를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역을 최소 복귀 돌연변이시켜 활성을 유지할 수 있다. 또한, 본원의 인간화된 항체는 파지 디스플레이에 의한 CDR에 대한 친화도 성숙을 추가로 수행한 인간화된 항체를 포함한다.

본원에서 용어 "CD40에 대한 결합"은 인간 CD40과 상호작용하는 능력을 지칭한다.

용어 "특이적 결합"은 당분야에서 이용가능한 기법, 예컨대 경쟁 ELISA, BIACORE(등록상표) 분석 또는 KINEXA(등록상표) 분석에 의해 결정된다. 또한, 상기 용어는 예를 들어 본원의 항체의 항원-결합 도메인이 많은 항원에 의해 포함되는 특정 에피토프에 특이적인 경우 적용가능한데, 이 경우에 항원-결합 도메인을 갖는 항체는 에피토프를 갖는 다수의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.

본원의 "항원-결합 단편"은 인간 CD40에 결합하는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 및 scFv 단편, 및 인간 CD40에 결합할 수 있는 항체의 VH 및 VL을 사용함으로써 생산된 인간 CD40에 결합할 수 있는 기타 단편을 지칭한다. 이는 서열번호 7, 13, 9, 10, 11 및 12로부터 선택된 본원에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR을 포함한다. Fv 단편은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하나, 불변 영역은 포함하지 않고, 모든 항원 결합 부위를 갖는 최소 항체 단편이다. 일반적으로, Fv 항체는 또한 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다. 또한, 상이한 링커를 항체의 2개의 가변 영역을 폴리펩티드 쇄 내로 연결하는 데 사용할 수 있고, 이는 단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv(sFv)로 지칭된다.

용어 "에피토프"는 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역에 의해 항체를 인식하고 항체에 의해 결합할 수 있는 분자의 부분을 지칭한다.

"보존적 변형" 또는 "보존적 치환 또는 대체"는 단백질의 생물학적 활성 변경 없이 흔히 변할 수 있도록 단백질의 아미노산을 유사한 특징(예를 들어 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 주쇄 구조 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 일반적으로 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것이 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition)]을 참조한다). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 이의 생물학적 활성을 방해할 가능성이 낮다.

아미노산 서열의 "동일성" 또는 "상동성"은 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 비교된 서열 양쪽에서의 위치를 동일한 아미노산 잔기가 차지할 때, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 각각의 동일한 위치를 동일한 아미노산이 차지하는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 서열 동일성의 백분율 및 서열 유사성의 백분율을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST2.0 알고리즘이고, 이는 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 [Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공개적으로 입수가능하다.

항체 및 항원-결합 단편의 생산 및 정제 방법이 종래 기술, 예컨대 문헌[Chapters 5-8 and 15, Using Antibodies: A Laboratory Manual published by Cold Spring Harbor]에 주지되어 있다. 본원에 정의된 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 인간 FR을 비-인간 CDR에 부가하도록 유전자 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 IMGT 인간 항체 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스 및 MOE 소프트웨어(ImMunoGeneTics(IMGT) 웹사이트[http://imgt.cines.fr] 또는 문헌[the Journal of Immunoglobulins, 2001ISBN012441351])로 정렬함으로써 수득될 수 있다.

본원의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적 방법에 의해 생산되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열은 GS 발현 벡터 내로 클로닝되고 재조합될 수 있다. CHO 세포는 재조합 면역 글로불린 발현 벡터에 의해 안정하게 형질감염될 수 있다. 보다 권고되는 당분야에 주지된 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 야기할 것이다. 안정한 클론은 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현함으로써 수득된다. 양성 클론은 무혈청 배지에서 생물반응기에서 확장되어 항체를 생산한다. 항체가 분비되는 배양 배지는 종개 기법에 의해 정제되고 수집될 수 있다. 예를 들어, 조정된 완충제를 갖는 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼이 정제에 사용되어 특이적으로 결합되지 않는 성분을 세척 제거한다. 이어서, 결합된 항체를 pH 구배에 의해 용리하고, 항체 단편을 SDS-PAGE에 의해 검출한 후에 수집한다. 항체는 통상적인 방법으로 여과에 의해 농축될 수 있다. 또한, 가용성 혼합물 및 다량체가 통상적 방법, 예컨대 분자체 및 이온 교환에 의해 제거될 수 있다. 생산된 생성물은 즉시 냉동되거나(예컨대 -70℃) 동결건조되어야 한다.

동물, 인간, 실험 개체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용할 때, "투여" 및 "치료"는 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 실험 개체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 접촉시킴을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는 예를 들어 치료 방법, 약동학 방법, 진단 방법, 조사 방법 및 실험 방법을 지칭한다. 세포의 치료는 시약을 세포에 접촉시킴, 및 시약을 유체에 접촉시킴(여기서 유체는 세포에 접촉됨)을 포함한다. 또한, "투여" 및 "치료"는 예를 들어 시험관내 및 생체외 세포를 시약, 진단제 또는 결합 조성물에 의해 또는 또 다른 유형의 세포에 의해 치료하는 것을 의미한다. "치료"는 인간, 수의학 개체 또는 연구 개체에 적용할 때 연구 및 진단 적용례에 대한 치료적 치료, 예방 또는 방지 수단을 지칭한다.

"요법"은 체내 또는 체외 사용을 위한 치료제, 예를 들어 본원의 화합물에 결합할 수 있는 임의의 조성물을, 치료제가 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 질병의 하나 이상의 증상을 갖는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 일반적으로, 치료제는 치료받을 개체 또는 집단에서 하나 이상의 질병의 증상을 효과적으로 완화시키는 양으로 임의의 임상적으로 측정가능하지 않은 정도로 이러한 증상의 저하 유도하거나 이러한 증상의 진행을 억제 하기 위해 투여된다. 임의의 특정 질병의 증상을 완화시키는 데 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"으로도 지칭됨)은 다양한 인자, 예컨대 질병 단계, 환자의 연령 및 체중, 및 환자에서 목적하는 효과를 유도하는 약물의 능력에 따라 변할 수 있다. 질병의 증상이 완화되었는지는 의사 또는 기타 건강 관라 전문가에 의해 임의의 임상 시험 방법에 의해 평가되어 질환의 중증도 또는 진행을 평가할 수 있다. 본원의 실시양태(예를 들어 치료 방법 및 제제)가 각각의 표적에 대한 질병 증상을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있으나, 당분야에 공지된 임의의 통계 시험 방법, 예컨대 스튜던트 t-검정, 카이-제곱 검정, 만 및 휘트니(Mann and Whitney)를 기반으로 한 U 검정, 크러스컬-월리스(Kruskal-Wallis) 검정(H 검정), 존키어-터프스트라(Jonckheere-Terpstra) 검정 및 윌콕슨(Wilcoxon) 검정에 의해 결정된 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 표적의 질병 증상을 완화시킬 수 있다.

"유효량"은 의학적 질병의 증상 또는 상태를 개선하거나 예방하는 데 충분한 양을 포함한다. 또한, 유효량은 진단을 가능하도록 하는 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의학 개체에 대한 유효량은 하기 인자에 따라 변할 수 있다: 예를 들어 치료할 질환, 환자의 전반적 건강, 투여의 경로 및 투여량 및 부작용의 심각도. 유효량은 유의미한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 투여량 또는 투여 섭생법일 수 있다.

"Tm 값"은 단백질 열 변성의 온도, 즉 단백질의 공간 구조가 파괴될 때 단백질의 절반이 폴딩되지 않은 온도를 지칭한다. 따라서, Tm 값이 높을수록 단백질의 열 안정성이 높다.

2. 실시예 및 시험 실시예

본원은 하기 실시예에 의해 상세히 추가로 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 제한하지 않는다.

본원의 실시예에 구체적 조건이 표시되지 않은 실험 방법은 일반적으로 통상적 조건에 따르거나 제조사 또는 원료 또는 원자재에 의해 제안되는 조건에 따른다. 구체적 공급원이 표시되지 않은 시약은 상업적으로 구매한 통상적 시약이다.

본원의 CD40 항원 및 항체의 생산 및 정제 방법은 WO2018219327에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.

실시예 1: 면역 항원, 스크리닝을 위한 항원의 서열 및 이의 생산

His-태그된 인간 CD40(h-CD40-his) 재조합 단백질, Fc-태그된 인간 CD40(h-CD40-Fc) 재조합 단백질, his-태그된 뮤린 CD40(m-CD40-his) 재조합 단백질 및 his-태그된 rhesus CD40(rhesus-CD40-his) 재조합 단백질(#CD0-C52H7)은 정제된 상업 단백질 시약이었다(Acrobiosystems로부터 구매). 각각의 서열의 자료를 하기 표 1에 나타냈다. 단백질은 하기 실시예의 각각의 실험에서 사용할 수 있다.

실시예 2: 항체 하이브리도마의 생산

항-인간 CD40 단클론성 항체를, 마우스(실험용 C57BL/6 마우스, 암컷, 6 내지 8주령, [Zhao Yan (Suzhou) New Drug Research Center Co., Ltd., 동물 생산 면허 번호: 201503259])를 면역화시킴으로써 생산하였다. 사육 환경: SPF 수준. 마우스를 구매하고 실험실 환경에서 1주일 동안 12/12시간 명/암 주기 조절에서 20℃ 내지 25℃의 온도 및 40 내지 60%의 습도에서 사육하였다. 환경에 적응한 마우스를 각각의 케이지 당 5마리씩 2개의 케이지로 나누었다.

면역 항원은 Fc-태그된 변형된 인간 CD40 재조합 단백질(1 μg/μl의 농도로 포스페이트 완충제 중에 제형화된 h-CD40-Fc)이었다. 프로이드 보조제(Sigma, 로트 번호: F5881/F5506)를 유화를 위해 사용하였고, 여기서 프로이드 완전 보조제(CFA)를 일차 면역화를 위해 사용하였고, 핵산 보조제(CpG, Sangon Biotech) 및 주사용 알루미늄(Imject Alum)(Thermo, 로트 번호: PH203866)을 나머지 부스트 면역화를 위해 사용하였다. 면역화를 제0일, 제14일, 제28일, 제42일, 제56일 및 제70일에 수행하였다. 혈액을 제21일, 제35일, 제49일, 제63일 및 제77일에 혈액 검사를 위해 수집하였고, 마우스의 혈청을 ELISA에 의해 검출하여 마우스의 혈청의 항체 역가를 결정하였다.

제4 면역화 후에, 비장 세포 융합을 마우스에서 수행하였고, 이때 항체 역가가 높고 혈청에서 안정한 경향이 있었다. 부스트 면역화를 융합 3일 전에 수행하였고, 포스페이트 완충제를 사용하여 제형화한 항원 용액(10 μg)을 각각의 마우스에서 복강내로(IP) 주사하였다. 비장 림프구를 최적화된 PEG-매개된 융합 단계를 사용하여 골수종 세포 Sp2/0 세포(ATCC(등록상표) CRL-8287TM)와 융합하여 하이브리도마 세포를 수득하였고, 양호한 시험관내 활성을 갖는 단클론성 하이브리도마 세포주를 선택하였다.

실시예 3: 항-CD40 항체의 클로닝 및 서열 분석

상기에 스크리닝되고 식별된 항체의 하이브리도마 서브클론을 선택하고, 대수 생장기의 하이브리도마 세포를 수집하였다. RNA를 키트의 지시서에 따라 Trizol(Invitrogen, 15596-018)을 사용하여 추출하고 역전사시켰다(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase, Takara, 카탈로그 번호: 2680A). 이어서, 생산된 cDNA를 뮤린 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev. B 0503)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고 서열 분석을 위해 서열 분석 회사에 보냈다. 뮤린 항체의 서열을 최종적으로 수득하였다.

9E5의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:

9E5의 CDR 서열을 하기 표 2에 나타냈다:

수득한 가변 영역 서열을 인간 항체 IgG1의 불변 영역 서열 각각에 그라프팅하여 인간-뮤린 키메라 항체 서열을 수득하고, 키메라 항체의 서열을 분자 클로닝 기법에 의해 pCP 발현 벡터(MabSpace biology Co., Ltd로부터 구매) 내로 삽입하였다. 이들 서열을 PCR에 의해 증폭시킨 후에(분자 생물학 작업 방법, 예컨대 분자 클로닝을 통상적 작업 조건에 따라 수행하고 구체적으로 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual"]을 참조할 수 있다) 서열 분석하고 식별하였고, HEK293 세포 발현 시스템을 사용하여 인간-뮤린 키메라 항체 9E5-C를 수득하였다. 다양한 시험관내 활성 분석을 수행하여 MabSelect SuRe(GE Lifesciences) 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한 키메라 항체를 특성규명하였다. 데이터를 하기 표 3에 나타냈다.

실시예 4: 뮤린 항체의 인간화

수득한 뮤린 항체 9E5의 전형적 VH/VL CDR 구조에 따라, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 항체 생식계열 데이터베이스와 비교하여 고 상동성을 갖는 인간 생식계열 주형을 수득하였다. 이들 중에서, 인간 생식계열 경쇄 프레임워크 영역은 인간 κ 경쇄 유전자로부터 유래되었고, 본 발명의 항체의 경쇄 프레임워크 영역은 바람직하게는 인간 생식계열 경쇄 주형 Vk2-28/JK4(9E5)였다. 인간 생식계열 중쇄 프레임워크 영역은 인간 중쇄로부터 유래되었고, 본 발명의 항체의 중쇄 프레임워크 영역은 바람직하게는 하기에 나타낸 바와 같은 인간 생식계열 중쇄 주형 VH1-2/JH6(9E5)이었다:

9E5의 중쇄 프레임워크 영역은 바람직하게는 인간 생식계열 중쇄 주형 IGHV1-2이다(서열번호 9):

9E5의 경쇄 프레임워크 영역은 바람직하게는 인간 생식계열 경쇄 주형 IGkV2-28이다(서열번호 10):

뮤린 항체의 CDR을 선택된 인간화된 주형에 그라프팅하여 인간화된 가변 영역을 대체한 후에, 상응하는 인간 IgG 불변 영역에 의해 재조합시켰다(바람직하게는 중쇄는 IgG1이고, 경쇄는 κ였다). 이어서, 뮤린 항체의 삼차원 구조를 기반으로, 내장된 잔기, 즉 CDR과 직접 상호작용하는 잔기 및 VL 및 VH의 구조에 대해 중요한 영향력을 갖는 잔기를 복귀 돌연변이시키고, CDR의 화학적으로 불안정한 아미노산 잔기를 최적화시켜 최종 인간화된 분자를 수득하였다.

최종 인간화된 hu9E5 항체 분자(H1c 중쇄 및 L1a 경쇄를 포함함)를 상기 발현 시험 및 경쇄 및 중쇄의 조합의 복귀 돌연변이의 수의 비교를 통해 선택하고, 이들 중 완전한 경쇄 및 중쇄 서열은 각각 서열번호 17 및 18에 제시된다.

실시예 5: 인간화된 항체의 시험 데이터

인간 및 rhesus CD40에 대한 본 발명의 인간화된 항체 hu9E5의 결합 활성, 차단 활성 등을 하기 표 4에 나타냈다.

실시예 6: 마우스에서 종양 성장에 대한 항-CD40 항체의 억제

정상 인간 말초혈을 채취하고, 건강한 인간 PBMC를 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 단핵구를 CD14⁺ 마이크로 비드 키트를 사용하여 분류하고, CD14⁺ 단핵구를 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라 단리하였다, 즉 20 μl의 항-CD14 마이크로 비드를 10⁷개의 세포 각각에 대해 첨가하고 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 자성 컬럼에 첨가하고 3회 헹궜다. 자성 컬럼의 세포, 즉 CD14⁺ 단핵구를 수집하였다. 10 ng/ml IL4 및 100 ng/ml GM-CSF를 함유하는 RPMI 1640 배지를 CD14⁺ 단핵구에 첨가함으로써 단핵구를 6일 동안 배양하여(배양 방법은 당분야에 통상적인 방법이다) MoDC 세포의 유도 배양을 수행하였다. IL-2를 함유하는 RPMI 1640을 나머지 세포에 첨가하고, 현탁된 세포를 배양 후에 수집하였다(배양 방법 및 세포 수집 방법은 모두 당분야에 통상적인 방법이다). T 세포를 CD3⁺ 마이크로 비드 키트를 사용하여 분류하였다. 6일 후에, MoDC 세포 및 CD3⁺ T 세포를 각각 수집하고 Raji 세포(Shanghai Institute of Biotechnology Cell Bank, 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양됨)와 1:5:20의 비로 혼합하고 각각의 NOG 마우스(Nanjing Galaxy Biopharma, 5일 동안 적응을 위해 사육함)에게 피하로 접종하였다. 실험 동물을 일정한 온도 및 습도를 갖는 환기가 되는 독립된 상자에서 사육하였다. 사육실의 온도는 18.0℃ 내지 26.0℃였고, 습도는 40 내지 70%였고, 환기를 10 내지 20회/시간으로 수행하였고, 명암은 12시간/12시간으로 교체하였다.

실험군은 인간 IgG1 항체 대조군, hu9E5 및 기준 항체 G12를 포함하였고, 모두 3 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 각각의 군의 5마리의 마우스에게 3회의 연속된 투여로서 6주 동안 1주일에 1회 투여하였다. 전체 실험 동안에, 종양의 세로축 직경 및 가로축 직경을 버니어 캘리퍼를 사용하여 1주일에 2회 측정하였고, 종양 부피를 하기와 같이 계산하였다: 종양 부피(mm³) = 0.5 × (종양 세로축 직경 × 종양 가로축 직경²). 상대 종양 억제비(TGI(%))를 하기 식과 같이 계산하였다: TGI% = (1-T/C) × 100%. T/C %는 상대 종양 성장비, 즉 특정 시험에서 처리군 및 대조군의 상대 종양 부피 또는 종양 중량의 백분율이다. T 및 C는 각각 특정 시점에서 처리군 및 IgG1 대조군의 종양 부피(TV) 또는 종양 중량(TW)이다.

결과는 투여 21일 후에 거의 완전한 종양 제거와 함께, 인간화된 항-CD40 항체 hu9E5가 IgG1 대조군과 비교하여 매우 유의미한 항종양 효과를 가졌음을 나타냈다.

항체 약학 조성물(제제)의 예시적 생산 방법

제1 단계: CD40 항체(예컨대 hu9E5) 및 안정한 제제를 CD40 항체를 함유하는 제제 벌크로 생산하였다.

여과 후에, 벌크를 무균 시험을 위해 샘플링하였다. 이어서, 벌크를 0.22 μm PVDF 필터 요소에 의해 여과하고, 여과액을 수집하였다.

제2 단계: 충전 부피를 1.1 ml로 조정하고, 여과액을 스톱퍼를 갖춘 2 ml 바이알 내로 충전하였다. 샘플을 충전 개시, 중간 및 종료시에 채취하여 상이한 충전 부피를 측정하였다.

제3 단계: 캡핑 기계를 켜 알루미늄 캡으로 캡핑을 수행하였다.

제4 단계: 생성물에 대해 시각적 검사에 의해 결함, 예컨대 부정확한 충전이 없음을 확인하였다. 이어서, 바이알 라벨을 인쇄하고 붙였다. 이어서, 카톤 박스를 접는 동안, 카톤 라벨을 인쇄하였다. 생성물을 패키징하였다. 마지막으로, 박스 라벨을 박스에 붙였다.

실시예 7: 항-CD40 항체 제제를 위한 완충제 시스템의 pH 값의 스크리닝

하기 완충제를 제형화하여 항체 제제를 생산하였고, 여기서 항-CD40 항체 농도는 50 mg/ml였고, 샘플을 고온(40℃)에서 안정성 연구를 위해 채취하였다.

1) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.0;

2) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5;

3) 10 mM 석신산-석신산 나트륨, pH 5.0;

4) 10 mM 석신산-석신산 나트륨, pH 5.5;

5) 10 mM 석신산-석신산 나트륨, pH 6.0;

6) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5;

7) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 6.0;

8) 10 mM 히스티딘 -히스티딘 하이드로클로라이드, pH 6.5.

결과는 항-CD40 항체 에 대한 최적 pH 범위가 5.0 내지 6.0임을 보여준다. 이러한 pH 범위에서, SEC 및 CE 각각에서 3개의 완충제 시스템 사이의 차이는 크지 않고, ICE의 편차는 14.0 내지 24.1% 범위 이내이고, 이는 pH 6.5를 갖는 완충제 시스템(완충제)보다 안정하다.

실시예 8: 항-CD40 항체 제제에 대한 계면활성제의 스크리닝

10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드(pH 5.5) 및 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5)의 완충제 시스템을 선택하여 50 mg/ml 단백질, 75 mg/ml 수크로스, 및 상이한 유형의 계면활성제를 함유하는 항-CD40 항체 제제를 생산하였다. 25℃에서 이의 외관의 안정성을 조사하였다:

1) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유함;

2) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 20을 함유함;

3) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유함;

4) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 20을 함유함.

결과는 폴리솔베이트 80이 바람직한 계면활성제임을 보여준다.

실시예 9: 항-CD40 항체 제제에 대한 계면활성제 농도의 스크리닝

10 mM 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5)을 갖는 완충제 시스템을 선택하여 50 mg/ml 단백질, 75 mg/ml 수크로스 및 상이한 농도의 폴리솔베이트 80을 함유하는 항-CD40 항체 제제를 생산하였다:

1) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.1 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유함;

2) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유함;

4) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유함;

5) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.8 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유함.

샘플을 0.9% 염화 나트륨 주사에 의해 각각 0.5 mg/ml의 단백질 농도로 희석하였다. 불용성 입자의 결과는(표 3 참조) 폴리솔베이트 80의 농도가 0.1 mg/ml 내지 0.8 mg/ml인 경우, 항-CD40 항체 단백질이 염화 나트륨과 양호한 양립성을 갖는 것을 보여주며, 이는 상기에 기재된 폴리솔베이트 80 농도가 양호한 안정화 효과를 갖는 것을 시사하고; 따라서 상기에 기재된 샘플을 진탕 배양기(25℃, 300 rpm)에 5일 동안 두었다. 외관에 따라, 폴리솔베이트 80의 농도를 0.4 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.4 mg/ml로 선택하였다.

실시예 10: 항-CD40 항체 제제에 대한 당 농도의 스크리닝

10 mM 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5)을 갖는 완충제 시스템을 선택하여 50 mg/ml 단백질, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 다양한 농도의 수크로스를 함유하는 항-CD40 항체 제제를 생산하였다:

1) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 55 mg/ml 수크로스를 함유함;

2) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 65 mg/ml 수크로스를 함유함;

3) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 70 mg/ml 수크로스를 함유함;

4) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 75 mg/ml 수크로스를 함유함;

5) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5, 80 mg/ml 수크로스를 함유함.

각각의 샘플의 삼투압 결과(표 8 참조)는 수크로스 농도가 80 mg/ml인 경우 제제가 등장성임을 보여준다.

실시예 11: 항-CD40 항체에 대한 다양한 완충제 시스템의 안정성

하기 완충제 시스템을 사용하여 50 mg/ml 단백질, 80 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80를 함유하는 항-CD40 제제를 생산하였고, 25℃ 및 2℃ 내지 8℃에서 안정성을 조사하였다.

1) 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5;

2) 10 mM 히스티딘- 히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5;

3) 10 mM 히스티딘-아세트산, pH 5.5.

결과는, 25℃에서 6개월의 저장 후에, 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드와 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제 시스템 사이의 차이가 유의미하지 않았으나 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충제 시스템이 나머지 완충제 시스템보다 약간 우수하였고; 2℃ 내지 8℃에서 6개월의 저장 후에, 3개의 시스템의 품질 사이에 유의미한 차이가 없었음을 보여준다.

실시예 12: 안정성에 대한 제제의 단밸질 농도의 영향

10 mM 히스티딘-하이드로클로라이드(pH 5.5)를 갖는 완충제 시스템을 선택하여 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, 및 50 mg/ml, 25 mg/ml 또는 1 mg/ml의 단백질 농도를 함유하는 CD40 항체 제제를 생산하였다. 40℃에서 고온 안정성을 조사하였다.

1) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5, 50 mg/ml의 단백질 농도를 가짐;

2) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5, mg/ml의 단백질 농도를 가짐;

3) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5, 1 mg/ml의 단백질 농도를 가짐.

결과는, 제제의 단백질 농도가 순도에 영향을 미칠 것이고, 50 mg/ml 및 25 mg/ml의 단백질 농도가 순도에 적게 영향을 미치고, 1 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 제제의 안정성은 명백히 낮음을 보여준다.

실시예 13: 제제 성분의 포괄적 스크리닝

단백질 농도, 폴리솔베이트 80 농도 및 pH 를 추가로 최적화시키기 위해, JMP 소프트웨어를 DOE 설계를 위해 사용하였고, RSM 모델을 적용하여 일련의 규정을 수득하였다(하기 참조). 완충제 시스템 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드(His-HCl)와 히스티딘-아세트산(His-AA)의 안정성 데이터 사이의 특히 유의미한 차이가 없었고, His-HCl의 pH 완충제 범위가 5.5 초과였기 때문에, His-AA를 DOE 스크리닝 실험에 대한 완충제로서 선택하였다. 10 mM 히스티딘-아세트산(His-AA)을 갖는 완충제 시스템에서, 다양한 단백질 농도, 다양한 폴리솔베이트 80 농도 및 80 mg/ml 수크로스를 갖는 항-CD40 항체 제제를 생산하였고, 샘플을 안정성 분석을 위해 40℃에서 저장하였다:

(1) 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.0, 40 mg/ml CD40을 함유함;

(2) 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.5, 10 mg/ml CD40을 함유함;

(3) 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.5, 25 mg/ml CD40을 함유함;

(4) 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.5, 25 mg/ml CD40을 함유함;

(5) 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.0, 10 mg/ml CD40을 함유함;

(6) 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 6.0, 40 mg/ml CD40을 함유함;

(7) 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.0, 25 mg/ml CD40을 함유함;

(8) 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 6.0, 40 mg/ml CD40을 함유함;

(9) 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.0, 25 mg/ml CD40을 함유함;

(10) 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.5, 40 mg/ml CD40을 함유함;

(11) 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.5, 10 mg/ml CD40을 함유함;

(12) 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 6.0, 10 mg/ml CD40을 함유함.

결과는 하기를 보여준다: pH 값이 5.0 내지 6.0이고, 폴리솔베이트 80이 0.2 내지 0.6 mg/ml이고, 단백질 농도가 10 내지 40 mg/ml인 경우, 상기 파라미터의 변동은 안정성에 대해 크게 영향을 미치지 않았다. 규정 pH 범위는 5.0 내지 6.0이었고, 따라서 5.5의 중간 값을 최종 pH 값으로 취하고, 이전 스크리닝 결과를 전반적으로 고려하여 0.4 mg/ml를 폴리솔베이트 80의 최종 농도로 취하고, 단백질 농도를 25 mg/ml로 설정하였다.

실시예 14: 다양한 완충제 시스템에서 항-CD40 항체의 동결건조 안정성

아세트산(아세트산 나트륨) 완충제 시스템이 동결건조 동안 휘발로 인해 재구성 후에 pH 값을 이동시킬 수 있기 때문에, 이는 완충제 시스템 동결건조된 제제에 대한 완충제 시스템로서 사용하기에 적합하지 않다. 두 종류의 완충제, 예컨대 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드(His-HCl)(pH 5.5) 및 10 mM 히스티딘-아세트산(His-AA)(pH 5.5)을 선택하여 50 mg/ml 단백질, 80 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80을 함유하는 항-CD40 항체 제제를 생산하였다. 충전 부피는 1.2 ml/병이었고, 동결건조 공정은 표 13에 나타낸 바와 같았다:

1) 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5;

2) 10 mM 히스티딘-아세트산, pH 5.5.

동결건조된 생성물은 양호한 케이크 모양을 가졌고, 외관은 재구성 후에 투명하였고, pH 및 순도의 명백한 변화는 관찰되지 않았고, 이는 동결건조 공정이 적절하였음을 나타낸다. 결과는 하기를 보여주었다: 두 종류의 완충제, 예컨대 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드(pH 5.5) 및 10 mM 히스티딘-아세트산(pH 5.5) 모두가 항-CD40 항체 제제에 대한 완충제 시스템으로서 적합하였다.

실시예 15: 기타 대안적 제제

또한, 본 발명은 비제한적으로 하기를 포함하는 다른 조성을 갖는 다른 항-CD40 항체 약학 제제를 제공하되, 기타 제제는 비제한적으로 하기를 제공한다:

(1) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.5;

(2) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.8;

(3) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 6.0;

(4) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.6;

(5) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 5.8;

(6) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 하이드로클로라이드, pH 6.0;

(7) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0;

(8) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.5;

(9) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 6.0;

(10) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0;

(11) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.5;

(12) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.8;

(13) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 6.0;

(14) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충제, pH 5.5;

(15) 25 mg/ml CD40 항체, 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리솔베이트 80 및 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충제, pH 5.5.

실험 결과는, 상기에 정의된 제제를 갖는 CD40 항체 제제가 양호한 안정성을 갖고 CD40 항체 약제의 생산에 적용될 수 있음을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD. SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> CD40 ANTIBODY PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF <130> P21412628KR <140> PCT/CN2019/121985 <141> 2019-11-29 <150> CN201811448238.5 <151> 2018-11-30 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Arg Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val 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Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 완충제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖고; 상기 완충제가 바람직하게는 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제 및 석시네이트 완충제, 보다 바람직하게는 아세테이트 완충제, 가장 바람직하게는 아세트산-아세트산 나트륨 완충제로부터 선택되는, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 1 내지 120 mg/ml, 바람직하게는 10 내지 40 mg/ml의 농도를 갖는, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
4.5 내지 6.5, 바람직하게는 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는, 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
완충제가 5 내지 30 mM, 바람직하게는 10 내지 20 mM의 농도를 갖는, 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
트레할로스 및 수크로스로부터 선택된 다이사카라이드를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
제5항에 있어서,
다이사카라이드가 40 내지 95 mg/ml, 바람직하게는 60 내지 90 mg/ml의 농도를 갖는, 약학 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리솔베이트, 보다 바람직하게는 폴리솔베이트 80인 계면활성제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
제7항에 있어서,
계면활성제가 0.02 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.3 내지 0.8 mg/ml의 농도를 갖는, 약학 조성물.
(a) 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는, 1 내지 120 mg/ml의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
(b) 5 내지 30 mM의 아세테이트 완충제,
(c) 40 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및
(d) 0.02 내지 0.8 mg/ml의 폴리솔베이트 80
을 포함하는 약학 조성물로서,
바람직하게는 4.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.0 내지 6.0, 추가로 바람직하게는 5.5의 pH를 갖는 약학 조성물.
(a) 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는, 1 내지 120 mg/ml의 CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
(b) 10 내지 20 mM의 아세테이트 완충제
를 포함하는 약학 조성물로서,
5.0 내지 5.5의 pH를 갖는 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 1에 나타낸 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 나타낸 경쇄 가변 영역을 갖는, 약학 조성물.
제11항에 있어서,
CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간화된 항체인, 약학 조성물.
제12항에 있어서,
인간화된 항체의 경쇄 가변 영역 상의 경쇄 FR 서열 및 중쇄 가변 영역 상의 중쇄 FR 서열이 각각 인간 생식계열 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이 서열로부터 유래되는, 약학 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
인간화된 항체의 중쇄가 서열번호 17에 나타낸 서열 또는 이의 변이체를 갖고, 상기 변이체가 바람직하게는 중쇄 가변 영역에서 0 내지 10개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 위치 6 및 8의 돌연변이를 갖되, 상기 아미노산이 바람직하게는 I, A 또는 L로 돌연변이되고;
인간화된 항체의 경쇄가 서열번호 18에 나타낸 서열 또는 이의 변이체를 갖고, 상기 변이체가 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 0 내지 10개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 위치 2 및 3의 돌연변이를 갖되, 상기 아미노산이 바람직하게는 I, V 또는 L로 돌연변이되는, 약학 조성물.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화된 항체의 중쇄 가변 영역이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 FR 또는 이의 변이체를 추가로 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 FR을 포함하고, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 또는 IgG2의 중쇄 FR을 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
CD40 항체의 경쇄의 아미노산 서열이 서열번호 18에 나타낸 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, CD40 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 17에 나타낸 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는, 약학 조성물.
CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 생산 방법으로서,
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는, 방법.
제17항의 방법에 의해 생산되는 CD40 항체를 포함하는 동결건조된 제제.
CD40-관련된 질병 또는 증상의 치료용 약제의 생산에서 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물 또는 제18항의 동결건조된 제제의 용도로서, 상기 질병 또는 증상이 바람직하게는 암이고, 상기 암이 림프종, 유방암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 횡문근육종, 식도암, 자궁경부암, 다발성 골수종, 백혈병, 담낭암, 교아종 및 흑색종으로부터 선택되는, 용도.
용기를 포함하는 제품으로서, 상기 용기가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물 또는 제18항의 동결건조된 제제를 함유하는, 제품.