JP4026722B2 - 植物発酵エキス、植物発酵エキス末及び該植物発酵エキス配合物 - Google Patents
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Description
ポリミキシンB存在下でもマクロファージ活性化能を示す。
I:パントエア・アグロメランスを用いた植物発酵エキスの製造方法の骨子
本件において、我々は、パントエア・アグロメランスが澱粉を直接炭素源として生育可能であることを始めて見出し、パントエア・アグロメランスを用いた発酵及び培養生産物としての免疫賦活物質を多く含む小麦発酵エキスを安価に製造する方法を発明した。これにより、具体的な例としてヒト、畜産・水産養殖の分野で環境に優しく、安全で感染予防に有効な医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料を提供できる。
小麦粉を水に懸濁し、上澄み液をLブロス寒天培地に塗り広げ培養を行うと、微生物のコロニーが出現する。これらのコロニーを定法により微生物の同定を行う。例えば、グラム染色陰性、グルコース嫌気的代謝反応陽性、オキシダーゼ活性陰性のコロニーを選択し、さらに、IDテスト・EB-20(日水製薬)等を用いて、スタンダードのパントエア・アグロメランスと同じ性質を有するものを選択する。スタンダードとなるパントエア・アグロメランスは理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設より入手可能である(非特許文献4)。以下の説明において、百分率の表示は、特に断りのない限り、重量による値である。
本実施の形態では小麦発酵エキスが示す免疫賦活作用の指標として、マクロファージ活性化能をマクロファージからのTNF産生で評価した。
また、パントエア・アグロメランスを用いた発酵及び培養により、免疫賦活する有効成分の一つとしてパントエア・アグロメランス由来の低分子量リポ多糖の含有も期待される。低分子量リポ多糖は、汎用されている高分子量型のリポ多糖(以下通常のリポ多糖)に比べて極めて安全性が高く、かつ生物活性も通常のリポ多糖に比して優れている。そこで、低分子量リポ多糖含量を測定した。低分子量リポ多糖については特許文献2に詳述されている。なお、本実施例は小麦発酵エキスに関するものであるが、本発明は植物が小麦、免疫賦活物質が低分子量リポ多糖に限定されることを意味する訳ではない。
(1)小麦、その共生細菌であるパントエア・アグロメランス、及びそれらの組合せによる発酵産物の融合によってできる免疫賦活作用を持つ物質としての小麦発酵エキスそのものが新規。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
(2)グラム陰性菌のパントエア・アグロメランスを用いて植物発酵エキスを製造することが新しい。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
(1) パントエア・アグロメランスは小麦粉より定法に従い単離する(非特許文献1)。なお、一度、単離同定すれば、この菌を50%グリセロール等で保存が可能である。
(2) 0.05〜5%の食塩、0.005〜1モルのリン酸緩衝液、または、混合塩類溶液(0.5〜10%のリン酸第二ナトリウム、0.05〜5%のリン酸第一カリウム、0.05から5%の塩化ナトリウム、0.05〜5%の塩化アンモニウム)等を調製する。
(3) 0.05〜10%の濃度になるように小麦粉を水に懸濁する。
(4) 0.2〜3モルの塩化マグネシウム溶液を調製する。
(5) 0.2〜3モルの塩化カルシウム溶液を調製する。
(6) 2から5を場合によってはオートクレーブ等で滅菌操作を行う。
(7) 2から5を適量混合し、水を加え、0.1〜5%の小麦粉を含む懸濁液とする。場合によってはアルカリ溶液や酸性溶液を加えpHを中性にする。
(8) 7に場合によっては培地1リットルあたり10〜50000単位アミラーゼを加えて10℃から80℃で1〜24時間保温して、小麦でんぷんを部分消化させるのもよい。
(9) 7乃至8に1で単離したパントエア・アグロメランスを添加する。
(10) 9を1〜40℃で発酵させる。場合によっては静置や震盪してもよい。また、数時間おきに撹拌を行うことでもよい。
(11) 10を6時間から一週間発酵させる。発酵が進むと小麦粉水溶液が黄色に着色してくる。
(12) 11の発酵途中に適宜アルカリ溶液を加え、pHを中性にすることや、小麦粉懸濁液や無機塩類を添加することもよい。
(13) 発酵を終了させ、遠心分離(1000〜5000rpm、10〜60分間)等の操作により固形分を沈殿物として回収する。沈殿物は小麦粉発酵物として、そのまま飼料として又は飼料に混ぜる原料として使うこともできる。
(14) 小麦発酵エキスを製造する場合は、13を水または塩類緩衝液等で懸濁し、これを80〜140℃で10分から6時間加熱処理する。さらに、これを遠心分離や濾過することで、固形分を除去してもよい。除去した沈殿に再度水や緩衝液を加え、加熱抽出を数回繰り返してもよい。
(15) 14で製造した小麦発酵エキスは用途によってはさらに簡便な精製を追加することが出来る。すなわち、14のエキスに、最終濃度0.05〜1モル/lになるように塩化ナトリウム等の塩を加え、その後、エタノール等の溶媒をエキスの1〜3倍量添加すると沈殿が生じる。これを遠心分離機等で回収してもよい。この沈殿をさらに、エタノール等の溶媒で洗浄してもよい。これを乾燥させれば、粉末とすることも出来る。
小麦粉を炭素源として小麦常在性の共生細菌であるパントエア・アグロメランスが増殖可能であるか、確認するために、小麦粉固形培地におけるパントエア・アグロメランスの生育を調べた。
(1) 0.5%小麦粉を炭素源として含むM9寒天培地を作成した。
(2) LB寒天培地より、パントエア・アグロメランスのコロニーを1つかきとり、PBS1mlに懸濁した。これをさらにPBSにて10倍から10000倍までに段階的に希釈し、それぞれの0.1mlを1のM9寒天培地に撒いた。
(3) 37℃で6日間培養した後、コロニーの出現を観察した。その結果、10000倍希釈の0.1mlを撒いたシャーレで約300個のコロニーが観察された。
(1) 小麦粉0.5gに蒸留水5mlを加え懸濁し、上澄みをLブロス寒天培地に0.1ml添加し、37℃で一晩培養した。
(2) 黄色のコロニーを単離し、通常の方法で菌を同定し、パントエア・アグロメランスを単離し、これを50%グリセロール溶液に懸濁し、冷凍庫に保存した。このストックの一部をLB寒天培地にとり、37℃に放置してパントエア・アグロメランスの独立コロニーを作成した。
(3) 2リットルの三角フラスコにリン酸第二ナトリウム・7結晶水64g、リン酸第一カリウム15g、塩化ナトリウム2.5g、塩化アンモニウム5gをとり、精製水を加え全量1リットルとした(無機塩類混合溶液)。塩化マグネシウム・2結晶水13.1gをとり、精製水を加え全量を100mlとした(塩化マグネシウム溶液)。塩化カルシウム11.1gをとり、精製水を加え全量を100mlとした(塩化カルシウム溶液)。4リットルの精製水を5リットルの三角フラスコにいれた(精製水)。上記の溶液、精製水はすべてオートクレーブ(TOMY BS−325、120℃、20分)して滅菌処理を行った。
(4) 1リットルの三角フラスコに小麦粉(日清製粉)24gをとり、精製水を加え全量600mlとした。これを同様にオートクレーブした後、α−アミラーゼ(SIGMA、Bacillus、タンパク質1mg当たり1500〜3000単位の酵素活性)3mgを加え、65℃の水浴で4〜12時間加熱した(小麦粉アミラーゼ処理液)。
(5) 調整した溶液等をそれぞれ表1に示した量を無菌的に滅菌した3リットルの坂口フラスコに入れ小麦粉培地とした。
(7) 5に6を全量加え37℃で撹拌しながら、20〜30時間発酵させた。発酵液のpHを測定し、アンモニア水を加え、pHを7に調整した。これに、150mlの小麦粉アミラーゼ処理液と無機塩類混合溶液37.5mlを無菌的に添加し、同様に発酵を20〜30時間行った。同じ操作をさらに、もう一度繰り返し、合計で65から80時間発酵させた。
(8) 7の小麦粉発酵溶液を遠心分離(日立、高速冷却遠心機 SCR−20B、5000rpm、20分間、4℃)し、沈殿を回収した。
(9) 8の沈殿にリン酸緩衝液を加えて懸濁し、全量100mlとして、33mlずつ50ml遠心管に移し、沸騰水浴中で30分間加熱抽出した。加熱終了後、室温まで冷却し、本液を遠心分離(日立、高速冷却遠心機 SCR−20B、10000rpm、20分間、20℃)した。遠心後、淡黄色の上清82mlをデカントで別の容器に回収した。
(10) 9の上清80mlに8.9mlの5モル塩化ナトリウム溶液を加えた。これに178mlのエタノールを加えると白濁を生じた。これを、冷凍庫(−90℃)で一晩放置後、本液を遠心分離(日立、高速冷却遠心機SCR−20B、10000rpm、20分間、4℃)した。上清を除き沈殿を得た。沈殿に冷やした10mlの70%エタノールを加え、懸濁した後、本液を遠心分離(日立、高速冷却遠心機 SCR−20B、10000rpm、20分間、20℃)し、沈殿を洗浄した。沈殿を風乾し、蒸留水に溶解し、11mlの小麦発酵エキス溶液を得た。
(11) 乾燥重量の測定:0.3mlを予め秤量した1.5mlプラスチックチューブに移し、凍結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ7.45mgで衡量となった。したがって、10の小麦発酵エキスの乾燥重量は溶液1ml当たり24.8mg、全量11ml当たり、273mgであった。
(12) 同一の方法で独立に8回の小麦発酵エキスを製造し、それぞれをブラッドフォード法によるタンパク質定量BSAを標準タンパク質として、各サンプルのタンパク質量を測定した。比較対象として精製したリムラス陽性糖脂質(特許文献1)と低分子リポ多糖(特許文献2)を用いた。測定結果を表2に示した。表2〜5、7の小麦発酵エキスについての数値は上記10で得られる小麦発酵エキスを乾燥して得られた重量の1gあたりの含有量をmgで表示した。
(13) 糖含量の測定:フェノール硫酸法によりグルコースを標準糖として測定した。測定結果を表3に示した。
(14) 核酸含有量の測定:100倍希釈したサンプルの210〜340nmの吸光度測定を行った。260nmの吸光度から320nmの吸光度を引いた値と、DNAとしての吸光度1ODあたり、50μgとしての最大含有量を算出した。測定結果を表4に示した。
(15) リムラスアッセイによるリムラス活性物質含有量の測定:リムラス活性物質量は生化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業Et-1を用いた。測定結果を表5に示した。
(16) ヨウ素でんぷん反応:ヨウ素試薬1N(ヨウ素12.7gにヨウ化カリウム25gに水10mlを加え、よく混ぜた後、水を加えて100mlとしたもの)を用時、水で200倍希釈し、これを、予め1mg/mlの濃度に溶解させた小麦発酵エキス0.1mlに5μl加えて良く混ぜる。小麦発酵エキスは直ちに溶液は淡紫色から濃紫色の発色を示した(陽性)。リムラス陽性糖脂質、低分子量リポ多糖は同様な操作で発色は認められない(陰性)。以上の結果を表6にまとめた。
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株のTHP−1(1×106個/250μl:10%ウシ胎児血清入りRPMI1640培地)を入れ、予め30分間前培養した。各サンプルの終濃度が1〜10000ng/mlになるように培地250μl(最終量500μl)を加えた。サンプルにポリミキシンB(12.5μg/ml)を含む群を設けた。4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。上清のTNF活性は、L−929細胞障害試験により測定した。結果を表8に示す。小麦発酵エキスはポリミキシンB存在下でもマクロファージからTNFを産生させたが、低分子量リポ多糖及びリムラス陽性糖脂質はポリミキシンB存在下ではマクロファージからTNFを産生できなかった。このことから小麦発酵エキスは低分子量リポ多糖やリムラス陽性糖脂質とは異なる生物活性を持つ事が明らかである。
実施例2で製造した小麦発酵エキスを430μg/kg含有する飼料を作製した。供与鶏はブロイラーコマーシャル鶏を一群約5500〜6000羽で用いた。対照試験区分は小麦発酵エキスを含まない飼料である。孵化後3週齢で小麦発酵エキス入りエサの投与を開始し7週齢まで毎日投与した。死亡匹数を毎日測定した。出荷時に基準に満たない鶏は廃棄した。結果を表9に示す。試験区(小麦発酵エキス入り飼料)は除去率は1.9%と少なく、対照区では3.3%に達した。育成率は試験区で98.1%となり、対照区で96.7%となったので、1.4%の育成率の向上が見られた。出荷実羽数と除去羽数を試験区と対照区で有意差検定をしたところχ2検定でP<0.0001の有意差が見られた。上のことから小麦発酵エキス入り飼料のブロイラー飼育における感染防除効果が示された。
実施例2で製造した小麦発酵エキス入り飼料の感染防御効果を野外試験で一群につき約5200尾のブリを飼育した。結果を表10に示した。連鎖球菌による死亡は非投与対照で4.8%に達した。小麦発酵エキスを100μg/kg/日(体重1kg、1日あたり)を摂取させた群(試験区)と、非投与群(対照区)では、小麦発酵エキス投与群が有意に(P<0.00001)死亡率を低下させることが認められた。
(1) コイ:体重70gのマゴイを使用した。試験は1群20匹で行った。
(2) コイヘルペスウイルスの調整:コイヘルペス感染で死亡したコイのエラ1gに10mlのハンクスバランスドソルトソリューション(HBSS)緩衝液を加えてホモジネートし、0.45ミクロンのフィルターでろ過し、そのろ液をウイルス溶液とした。
(3) コイヘルペスウイルスの感染:上記ろ液を600μl/100g 体重で、コイの腹腔内に注射した。
(4) 小麦発酵エキス含有飼料の作成:市販飼料に、0、5、10、20mg/kg飼料の割合で実施例2で製造した小麦発酵エキスを混合して、作成した。
(5) 給餌方法:体重あたり1%の重量のそれぞれの飼料を1日1回給餌した。これは、小麦発酵エキス量に換算すると、それぞれ、0、50、100、200μg/kg体重/日に相当する。
(6) 実験:小麦発酵エキス含有飼料を1週間給餌した後、ウイルスを感染させ、その後10日間小麦発酵エキス含有飼料を給餌した。ウイルス感染操作後10日間のコイの生存率を観察した。その結果を図1に示す。
表11に記載した配合において脂溶性基材1の軟膏に実施例2で製造した小麦発酵エキスを1割前後添加して混合して軟膏を得た。
1.小麦発酵エキス入り保湿クリーム処方
使用成分を表12に示した。A組を70℃で加熱溶解し、これに1/4量の精製水で溶き70℃で加熱溶解したB組と、1/4量の精製水で溶き70℃で加熱溶解したC組を加え、ホモジナイザーで充分混合した後40℃まで冷却し、D組を加えてpHを6.8まで調整した後、残りの精製水と実施例2で製造した小麦発酵エキスを適量加え、充分混合して乳液を得る。なお、小麦発酵エキスは、5mg/mlになるように予め精製水に溶解しておき、乳液100gに対しては、その0.1mlを添加する。
本クリームを男女43人に使用してもらいアンケート調査を行った。その結果、保湿効果について確かに効果ありと答えた者が18名、やや効果ありと答えた者が18名、効果なしと答えたものが2名、無記入が5名であった(一標本符号検定:P<0.0001)。あれ肌の改善の防止効果について、確かに効果あり良いと答えた者が6名、やや効果ありと答えた者が13名で、効果なしと答えたものは0名、無記入が24名であった。(一標本符号検定:P<0.0001)。使用後の肌の症状の悪化について、あると答えた者が0名であった。また、軽度のアトピー様症状を持つ4名に本クリームを使用してもらいアンケート調査を行ったところ、アトピー性皮膚炎の改善について、確かに効果ありと答えた者が3名、やや効果ありと答えた者が1名であった(一標本符号検定:P<0.125)。その他には、にきび跡の治りが早いという者が1名いた。また、本クリームを9名の男性に髭剃り後に使用してもらいアンケート調査を行ったところ、8名が髭剃り後の痛みの軽減、かさつきの防止、かみそり傷の早期治癒などに効果があったと答えた(一標本符号検定:P<0.01)。さらに五十肩の症状のある2名が肩に塗って痛み軽減効果を試したところ、1名は効果ありと答えた。
1.小麦発酵エキス入り化粧水処方
使用成分を表13に示した。小麦発酵エキスは、実施例2で製造した小麦発酵エキスを5mg/mlになるように予め精製水に溶解しておき、化粧水100gに対しては、その0.1mlを添加する。
本化粧水を5人の女性に使用してもらいアンケート調査を行った。その結果、保湿効果について良いと答えた者が3名、普通と答えた者が2名であった。いずれも肌のトラブルはなかった。
生体機能の改善を目的として小麦発酵エキスを加えた入浴剤を作製した。入浴剤の基本成分を表14に示した。
(1) 原材料としてグラニュー糖、水飴、水に実施例2で製造した小麦発酵エキスを加えたものを5:5:5:1の割合で混合し、加熱して120℃〜160℃で煮詰める。
(2) 1で得たものを冷却用鉄板上で冷却し、棒状に引き伸ばして1g前後の粒状に成型し飴を得た。
現在、アルコール分解機能増強食品として、市販されている製品に実施例2で製造した小麦発酵エキスを混合し、新たな効果として咽喉痛の緩和が認められるか否かを検討した。
市販製品:商標「飲んでお息」
成分を表15に示した。
顔面、手足、体躯、首、腕、背部等に皮疹が観察され、自覚症状が中等度から高度症状を示す難治性のアトピー性皮膚炎患者男女9人(25歳から34歳)に実施例2で製造した小麦発酵エキス50μg/mlを含む50%グリセロール溶液を患者に一日2〜3回、一回当たり2〜3mlを服用させた。自覚症状(掻痒感)は患者の訴えにより、軽度、中等度、高度に分類した。2週間から2ヶ月使用後に再度受診し、効果を評価した。結果は著効(皮疹の著明改善と自覚症状の殆どの消失)が4名(44%)、有効(皮疹の軽度改善と自覚症状の減少)が4名(44%)、不変が1名(11%)で、悪化が0名であった(一標本符号検定:P<0.03)。以上から有効率89%と判定された。
実施例2で製造した小麦発酵エキスを蒸留水に溶かし、マウスにゾンデを用いて一匹当たり、0.2mlを経口投与した。90分後にマウスに0.7%の酢酸を腹腔内投与し、5分間様子を見た後に、30分間に起こる身もだえ数を測定した。結果を表16に蒸留水投与対照の身もだえ数を30%阻害するのに必要な各試料の量として示した。大腸菌由来の低分子量リポ多糖の有効活性を1とした時に小麦発酵エキスは7となり、小麦発酵エキスが優れた鎮痛作用を示すことが認められた。
小麦発酵エキスのアトピー性皮膚炎に対する効果を調べるために、I型アレルギーモデルを導入した。一群3〜4匹の雄性のBALB/cマウスに抗ジニトロフェニル、マウスモノクローナル抗体を1μg/マウスで静脈投与した。一時間後に実施例2で製造した小麦発酵エキス(4μg/マウス)を腹部皮内投与または経口投与(100μg/マウス)し、さらに1時間後に、マウスの耳介の表裏に0.25%ジニトロフルオロベンゼン含有アセトン−オリーブオイル混合溶液(4対1)をアレルゲンとして20μl塗布した。塗布後、1、2、24及び48時間目の耳介の厚さをシクネスゲージで測定し、塗布直前の厚さとの差(△)を浮腫の程度とした。薬剤投与の効果は、アレルゲン投与1時間後に認められる早期反応と、24時間後に誘導される遅発反応、それぞれの抑制を以下の式によって求められる抑制率で評価した。{抑制率 = (1−薬剤投与後の△耳介の浮腫/対照の△耳介の浮腫)×100}結果を表17に示す。表から明らかなように、小麦発酵エキスは皮内投与でも、経口投与でもアレルギー反応を抑制した。
小麦発酵エキスの感染予防効果を調べるために、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染モデルを導入した。一群10匹の雄性のBALB/cマウス(6−8週齢)にサイクロフォスファミド(CY)200mg/kgを腹腔内投与し、5日後に実施例2で製造した小麦発酵エキスを皮内投与した。3時間後にMRSA(3×107コロニーフォーミングユニット(CFU))を静脈内投与し、生存日数を調べた。結果を表18に示した。表から明らかなように小麦発酵エキスは生理食塩水(対照)群に比べて統計学的に有意な(χ2検定、P<0.001)差でMRSAに対する感染予防効果が認められた。
小麦発酵エキスの転移がん治療効果を調べるために、MethAがん細胞の肺転移モデルを導入した。一群10匹の雄性のBALB/cマウス(6−8週齢)にMethA細胞を1×105細胞静脈内投与し、12日後より4日間連日、実施例2で製造した小麦発酵エキスを皮内投与した。細胞移植20日後に剖検し、肺を摘出し、ホルマリン固定を行った。肺を肉眼で観察し、結節数を測定した。結果を表19に示した。表から明らかなように小麦発酵エキスは生理食塩水(対照)群に比べて統計学的に有意な(t−検定、P<0.001)差でMethAの肺転移癌に対する治療効果が認められた。
(1) 2リットルの三角フラスコに1.0リットルの水と、リン酸第一カリウム0.2g、リン酸第二ナトリウム1.15g、食塩8g、塩化カリウム0.2gを加えた。
(2) 1に乾燥おから20gを加えた。
(3) 2をオートクレーブで滅菌した。
(4) 種菌の調製。前もって同じ組成で調製した2%おから培地5mlに小麦粉より単離しておいたパントエア・アグロメランスのコロニーを一つ加え37℃で一晩(15時間)緩やかに撹拌し、発酵させて、おから発酵用の種菌を準備した。
(5) 3に4を全量加え37℃で緩やかに撹拌しながら、48時間発酵させた。
(6) 5のおから発酵溶液をオートクレーブで120℃20分間の加熱抽出をした。これを遠心分離(クボタ 8800、2000rpm、10分間)し、上澄みを回収し、おから発酵エキスとした。
(7) 乾燥重量の測定 0.3mlを予め秤量した1.5mlプラスチックチューブに移し、凍結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ5.97mgで衡量となった。したがって、6のおから発酵エキスの乾燥重量は溶液1ml当たり19.9mg、全量1000ml当たり、19.9gであった。
(8) ブラッドフォード法によるタンパク質定量BSAを標準タンパク質として、10倍希釈したサンプルでタンパク質量を測定した。結果を表15に示した。
(9) 核酸含有量の測定 100倍希釈したサンプルの210〜340nmの吸光度測定を行った。260nmの吸光度から320nmの吸光度を引いた値と、DNAとしての吸光度1ODあたり、50μgとしての最大含有量を算出した。
(10) 糖含量の測定 フェノール硫酸法によりグルコースを標準糖として測定した。
(11) リムラスアッセイによるリムラス活性物質含有量の測定 リムラス活性物質量は生化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業Et−1を用いた。結果を表20に示した
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株のTHP−1(1×106個/250μl:10%ウシ胎児血清入りRPMI1640培地)を入れ、予め30分間前培養した。各サンプルの終濃度が100〜10000ng/mlになるように培地250μl(最終量500μl)を加えた。サンプルにポリミキシンB(12.5μg/ml)を含む群を設けた(100ng/mlのみポリミキシンBを含む群なし)。4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。上清のTNF活性は、L−929細胞障害試験により測定した。結果を表21に示す。おから発酵エキスはポリミキシンB存在下でもマクロファージからTNFを産生させたが、低分子量リポ多糖はポリミキシンB存在下ではマクロファージからTNFを産生できなかった。このことからおから発酵エキスは低分子量リポ多糖とは異なり、小麦発酵エキスと同様の生物活性を持つ事が明らかである。
(1) 2リットルの三角フラスコに1.0リットルの水と、リン酸第一カリウム0.2g、リン酸第二ナトリウム1.15g、食塩8g、塩化カリウム0.2gを加えた。
(2) 1に乾燥米粉20gを加えた。
(3) 2をオートクレーブで滅菌した。
(4) 種菌の調製。前もって同じ組成で調製した2%米粉培地5mlに小麦粉より単離しておいたパントエア・アグロメランスのコロニーを一つ加え37℃で一晩(15時間)緩やかに撹拌し、発酵させて、米粉発酵用の種菌を準備した。
(5) 3に4を全量加え37℃で緩やかに撹拌しながら、72時間発酵させた。
(6) 5の米粉発酵溶液をオートクレーブで120℃20分間の加熱抽出をした。これを遠心分離(クボタ 8800、2000rpm、10分間)し、上澄みを回収し、米粉発酵エキスとした。
(7) リムラスアッセイによるリムラス活性物質含有量の測定 リムラス活性物質量は生化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業Et−1を用いた。米粉発酵エキス中のリムラス活性物質含有量は1.7μg/mlと測定された。
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株のTHP−1(1×106個/250μl:10%ウシ胎児血清入りRPMI1640培地)を入れ、予め30分間前培養した。各サンプルの終濃度が1〜10000ng/mlになるように培地250μl(最終量500μl)を加えた。サンプルにポリミキシンB(12.5μg/ml)を含む群を設けた。4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。上清のTNF活性は、L−929細胞障害試験により測定した。結果を表22に示す。米粉発酵エキスはポリミキシンB存在下でもマクロファージからTNFを産生させたが、低分子量リポ多糖はポリミキシンB存在下ではマクロファージからTNFを産生できなかった。このことから米粉発酵エキスは低分子量リポ多糖やリムラス陽性糖脂質とは異なる生物活性を持つ事が明らかである。
(1) 2リットルの三角フラスコに1.0リットルの水と、リン酸第一カリウム0.2g、リン酸第二ナトリウム1.15g、食塩8g、塩化カリウム0.2gを加えた。
(2) 1に乾燥わかめめかぶ20gを加えた。
(3) 2をオートクレーブで滅菌した。
(4) 種菌の調製。前もって同じ組成で調製した2%わかめめかぶ培地5mlに小麦粉より単離しておいたパントエア・アグロメランスのコロニーを一つ加え37℃で一晩(15時間)緩やかに撹拌し、発酵させて、わかめめかぶ発酵用の種菌を準備した。
(5) 3に4を全量加え37℃で緩やかに撹拌しながら、72時間発酵させた。
(6) 5のわかめめかぶ発酵溶液をオートクレーブで120℃20分間の加熱抽出をした。これを遠心分離(クボタ 8800、2000rpm、10分間)し、上澄みを回収し、わかめめかぶ発酵エキスとした。
(7) リムラスアッセイによるリムラス活性物質含有量の測定 リムラス活性物質量は生化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業Et−1を用いた。わかめめかぶ発酵エキス中のリムラス活性物質含有量は132μg/mlと測定された。
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株のTHP−1(1×106個/250μl:10%ウシ胎児血清入りRPMI1640培地)を入れ、予め30分間前培養した。各サンプルの終濃度が1〜10000ng/mlになるように培地250μl(最終量500μl)を加えた。サンプルにポリミキシンB(12.5μg/ml)を含む群を設けた。4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。上清のTNF活性は、L−929細胞障害試験により測定した。結果を表23に示す。わかめめかぶ発酵エキスはポリミキシンB存在下でもマクロファージからTNFを産生させたが、低分子量リポ多糖はポリミキシンB存在下ではマクロファージからTNFを産生できなかった。このことからわかめめかぶ発酵エキスは低分子量リポ多糖やリムラス陽性糖脂質とは異なる生物活性を持つ事が明らかである。
Claims (6)
- 小麦粉をアミラーゼで処理した小麦粉アミラーゼ処理液をパントエア・アグロメランスによって発酵させて、同時に該パントエア・アグロメランスを培養して得られることを特徴とする植物発酵エキス。
- 請求項1記載の植物発酵エキスから得られることを特徴とする植物発酵エキス末。
- 請求項1記載の植物発酵エキス又は請求項2記載の植物発酵エキス末が配合されていることを特徴とする植物発酵エキス配合物。
- 前記植物発酵エキス配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤であることを特徴とする請求項3記載の植物発酵エキス配合物。
- ポリミキシンB存在下でもマクロファージ活性化能を示すという理化学的性質を示すことを特徴とする請求項1記載の植物発酵エキス。
- 免疫賦活活性を持つことを特徴とする請求項1又は5記載の植物発酵エキス。
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