JPH05155778A - Ｌｐｓを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 発育促進効果が高く、長期使用が可能であ
り、経口、経皮、薬浴、注射のいずれでも投与可能な発
育促進剤、動物用発育促進剤を提供する。 【構成】 下記ＬＰＳの少なくとも１種を含むことを特
徴とする。ＬＰＳのインビトロで培養されるマクロファ
ージのＴＮＦ産生能を活性化するＬＰＳのマクロファー
ジ活性化能を指標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しな
いときのマクロファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロ
ファージ活性化能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生
量を最大恒量にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化
能を１００％とするマクロファージ活性化能（％）を表
し、横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含
有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロ
ファージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステスト陽
性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであ
るＬＰＳ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発育促進剤及び動物用
発育促進剤に関する。より詳細には、本発明は、ＬＰＳ
を含む発育促進剤及び動物用発育促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】人間の場合、出生時の体重が２，５００
ｇ未満のものを未熟児と呼び、体重が２，５００ｇ以上
になるまでは特別の看護体制下で保育されるのが通例で
ある。これは、出生時体重が小さいほど、新生児期にお
ける死亡率が高く、或いは、様々な病気をおこしやす
く、又、その後の発育にも問題があることが多いからで
ある。（平山宗宏等編「育児全書」、１２６〜１２８
頁、昭和５２年社会保険出版社発行） 又、痩身者につ
いては、２０代では標準者及び肥満者よりも有意に死亡
指数が高い、年齢層に関係なく、入院率は痩身者が最も
多い、痩身者の方が肥満者より骨折しやすい等の報告が
ある。（森川憲導等著「肥満児とやせ児」、２４〜３０
頁、昭和５８年２月２８日株式会社ぎょうせい発行）上
記事情は、程度の差こそあれ、本質的に人間以外の動物
であっても同様であると推定される。加えて、人間の食
に供される牛、豚、魚等の場合には、その発育状況によ
り商品価値は決まり、又、育成期間が短い程経営効率は
よくなる。このように、出生時及びその後においても、
人間及びその他の動物において発育促進の必要が生じる
ことがある。現在、この発育は主として栄養摂取量の増
加により達成を意図されているが、食欲のない者に摂取
を強制するとかえって食欲を害し、好ましい結果は得ら
れない。又、摂取効率には個体差がある。そのため、人
間以外の動物、例えば肥育牛においてはホルモン剤、非
ホルモン剤が発育促進剤として与えられており、この場
合、飼料を節減するという効果の達成も意図されてい
る。しかし、ホルモン剤は副作用、体内残留性の点から
使用が差し控えられており、又、非ホルモン剤は、一部
が商品化されているにすぎない。（土屋平四郎等著「改
訂・肉牛飼養全科第２版」、１７９〜１８１頁、昭和６
３年社団法人農山漁村文化協会発行）従って、人間及び
その他の動物の健康体を回復、維持する手段、及び、よ
り経済的に食肉を提供する手段としての発育促進剤開発
の要請が存在しており、副作用や体内残留性の問題がな
く、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発が強く待たれて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な発育
促進剤、動物用発育促進剤を提供することを技術的課題
とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】前記技術的課題は、優れ
た発育促進効果を有し、未熟児の誕生を予防し、副作用
や体内残留性の問題がなく、長期使用が可能であり、生
産コストが安く、しかも、経口、経皮、薬浴、注射いず
れの経路でも投与が可能な、大量に供給可能なＬＰＳを
含む発育促進剤、動物用発育促進剤を提供することによ
り達成される。この発育促進剤、動物用発育促進剤に
は、インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産
生能を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指
標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロ
ファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化
能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大かつ一
定の値（本明細書の他の箇所においては、「最大恒量」
と称す）にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を
１００％とするマクロファージ活性化能（％）を表し、
横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファ
ージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステスト陽性Ｌ
ＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであるＬ
ＰＳの少なくとも１種が含まれる。ここで「少なくとも
１種を含む」とは、本発明のＬＰＳは各別に使用できる
ことはもちろん、その意図される用途が阻害されない限
り、それらの２種以上を任意に組み合わせて、又、更に
は他のいずれの物質とも組み合わせて使用できることを
意味する。例えば、他の発育促進剤、ビタミン剤等のい
わゆる栄養剤その他と配合することもできる。

【０００５】「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一
種であり、動物体内のほとんど全ての組織に分布し、粒
子状の異物や体内の老廃細胞などを捕食して消化する大
型のアメーバ状細胞の総称である。「ＴＮＦ」は、マク
ロファージにより産生される腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）の総称であり［１
９８５年に発行された ザ ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、２
６０、２３４５〜２３５４頁］、マクロファージの活性
が高まるにつれてその産生量は増していく。「リムラス
テスト」は、１９６８年にレヴィン（Ｌｅｖｉｎ）が創
案した、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いた
エンドトキシン定量法である。本発明の発育促進剤、動
物用発育促進剤の活性成分として使用できるＬＰＳは、
特にその採取源、生産方法、精製方法を限定されること
はない。例えば、細菌や植物から採取されるＬＰＳであ
っても、或は合成リピドＡのような合成品であってもよ
い。なお、本明細書、特にその特許請求の範囲におい
て、採取源は特に名称で特定されたそのものに限定され
ることなく、その採取源の成長、保存、流通の過程で付
着、共存する細菌その他の全てのものが含まれる。例え
ば、「小麦ＬＰＳ」と特定された場合には、小麦そのも
のから採取されたＬＰＳのみならず、小麦の成長、保
存、流通の過程で付着、共存する細菌その他の全てのも
のが含まれるものと理解されたい。なぜならば、特に寄
生、共生植物、寄生、共生動物という関係が解明されて
いるもの以外にも、特定の植物、動物、菌界生物、地衣
界生物に、それらにより付着、共存を許されたものが棲
息している例が多く存在し得ることは当業界で良く知ら
れていることであるからである。

【０００６】これらＬＰＳのうちから、本発明の発育促
進剤、動物用発育促進剤の活性成分として使用できるＬ
ＰＳを選択するには、インビトロで培養されるマクロフ
ァージのＴＮＦ産生能を活性化するＬＰＳのマクロファ
ージ活性化能を指標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加し
ないときのマクロファージのＴＮＦ産生量を与えるマク
ロファージ活性化能を０％、マクロファージのＴＮＦ産
生量を最大恒量にする時のＬＰＳのマクロファージ活性
化能を１００％とするマクロファージ活性化能（％）を
表し、横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ
含有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マク
ロファージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステスト
陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌで
あるものを選択すればよい。

【０００７】リムラステスト陽性植物源ＬＰＳ 原料植物として使用できるものを下記に例示する。な
お、本明細書に記載した植物が帰属する科名、属名は、
次の文献の記載を照合して決定された。 裸子植物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類：昭
和５７年（正編）、昭和５８年（続編）に北隆館から発
行された「原色牧野植物大図鑑」の記載を照合して所属
を決定した。但し、「燕麦」は、昭和４５年に女子栄養
大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭和５
８年に至文堂から発行された「新日本植物誌顕花篇」の
記載を照合し、「裸麦」は、昭和４６年に東京同文書院
から発行された「総合食品事典」の記載を照合し、「鳩
麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウコ
ン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダ
ミ」、「胡椒」、「トウガラシ」、「ダイウイキョ
ウ」、「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾ
ウ」、「オタネニンジン」、「ボウフウ」、「オオツヅ
ラフジ」、「ウンカリア・ヒルスタ」は、昭和６３年に
北隆館から発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記
載を照合し、「アボガド」は、昭和５３年に財団法人農
林統計協会から発行された熱帯農業技術叢書第１５号
「ブラジルの果実」の記載を照合し、「カイワレダイコ
ン」は、昭和５９年に北隆館から発行された「原色園芸
植物大図鑑」の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和４
４年に廣川書店から発行された「図説熱帯植物集成」の
記載を照合し、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品
協会が昭和６１年に公示した、「クロレラ規格基準」の
記載を照合して所属を決定した。 菌類：昭和６２年に保育社から発行された「原色日本新
菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し、酵
母は、昭和３７年に技報堂から発行された「微生物学ハ
ンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前掲の
「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属を決
定した。 本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。裸子植物
としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマツを使用
できる。単子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属
植物であるイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ
科オオムギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属
植物である鳥麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクマ
笹、イネ科ジュズダマ属植物である鳩麦、アヤメ科アヤ
メ属植物であるアヤメ、ユリ科ネギ属植物であるニンニ
ク、ユリ科キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ
科ジャノヒゲ属植物であるジャノヒゲ、ショウガ科ショ
ウガ属植物であるミョウガ、ショウガ科ウコン属植物で
あるウコン、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシ
ャクを使用できる。双子葉類植物としては、マメ科ダイ
ズ属植物である大豆、マメ科インゲンマメ属植物である
小豆、マメ科ソラマメ属植物であるそら豆、マメ科クズ
属植物であるクズ、マメ科カンゾウ属植物であるナンキ
ンカンゾウ、ナス科ナス属植物であるジャカイモ、トウ
ガラシ、ナス科トマト属植物であるトマト、ナス科トウ
ガラシ属植物であるトウガラシ、バラ科ビワ属植物であ
るビワ、バラ科サクラ属植物であるモモ、クスノキ科ア
ボガド属植物であるアボガド、クルミ科クルミ属植物で
あるクルミ、ウリ科トウナス属植物であるカボチャ、ウ
リ科アマチャヅル属植物であるアマチャヅル、アブラナ
科ダイコン属植物であるカイワレダイコン、マタタビ科
マタタビ属植物であるマタタビ、ドクダミ科ドクダミ属
植物であるドクダミ、コショウ科コショウ属植物である
胡椒、シキミ科シキミ属植物であるダイウイキョウ、ニ
クズク科ニクズク属植物であるニクズク、ミカン科ミカ
ン属植物であるダイダイ、ウコギ科オタネニンジン属植
物であるオタネニンジン、セリ科サボシュニコビア属植
物であるボウフウ、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物
であるオオツヅラフジ、アカネ科カギカズラ属植物であ
るウンカリア・ヒルスタを使用できる。シダ植物として
は、例えば、トクサ科トクサ属植物であるスギナ、ゼン
マイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを使用できる。ソ
ウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ類
植物、緑ソウ類植物、ランソウ類植物を使用できる。カ
ッソウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植物
であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、ホ
ンダワラ科ヒジキ属植物であるヒジキを使用できる。紅
ソウ類植物としては、例えば、ウシケノリ科アマノリ属
植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物と
しては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物であ
るクロレラを使用できる。菌類植物としては、例えば、
担子菌類植物、子ノウ菌類植物を使用できる。担子菌類
植物としては、例えば、ヒラタケ科マツオウジ属植物で
ある椎茸、キシメジ科エノキタケ属植物であるエノキ
茸、キシメジ科シメジ属植物であるシメジ、タコウキン
科マイタケ属植物であるマイ茸、サルノコシカケ科ポリ
ポラス属植物であるアワビ茸、ハラタケ科ハラタケ属植
物であるマッシュルーム、キクラゲ科キクラゲ属植物で
あるキクラゲ、モエギタケ科スギタケ属植物であるナメ
コを使用できる。子ノウ菌類植物としては、例えば、エ
ンドミセタセア科サッカロミセス属植物であるパン酵
母、醸造用酵母を使用できる。醸造用酵母にはビール酵
母、清酒酵母、葡萄酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の
他、サッカロミセス セレヴイシドに属する多くの酵母
（例えば、ウイスキーや老酒の製造に使用される酵母）
が含まれる。又、バッカクキン科ノムシタケ属植物であ
る冬虫夏草も使用できる。植物源ＬＰＳは、以下に述べ
る方法で分離、精製できる。 １）原料植物を必要に応じて適宜細切、乾燥、粉砕した
後に蒸留水によく懸濁し、上清を回収する。例えば、原
料植物が穀類の種子である場合は、種皮をつけたまま、
或は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は、食用に供
せられている程度の粉末になるまで粉砕し、得られた粉
末に水を加えて分散液とし、攪拌した後に沈降物を静置
又は遠心分離により除去するか、粉末に水を加えて練っ
て得られるドウをミキサー中でゆるやかに水洗し、沈降
物を除去すればよい。原料植物がクロレラである場合に
は、まず細胞膜を破砕し、エタノール洗浄により脂溶性
物質を除去した後に水抽出するとよい。この水抽出の際
の原料植物の粒度、水の温度、液性、添加量、攪拌の速
度、時間、遠心分離の際の条件等は特に制限する必要は
なく、原料植物の種類に応じて適宜調整すればよい。
又、抽出水の温度は高い方がＬＰＳの採取量、純度とも
に高い傾向があるが、操作の便宜上、原料植物に含まれ
る澱粉の糊化を招来しない５０℃以下とすることが好ま
しい。又、水の添加量は、原料植物の種類、粒度により
異なるが、穀類種子の場合にはその割合が７０ｗ／ｖ％
以下、望ましくは２０〜５０ｗ／ｖ％程度とすると操作
上便利である。更に、攪拌の速度は、起泡を引き起こさ
ない程度のものとすることが好ましい。なお、この段階
の操作迄で、本発明のリムラステスト陽性植物ＬＰＳの
純度は、リムラステスト活性データから判断して、例え
ば小麦種子の場合には約３０倍に上昇する。以下、穀類
種子を原料として使用する場合を例にとり説明するが、
いわゆる当業者であれば、以下の記載を参考にして、他
植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリムラステスト
陽性ＬＰＳを高純度で回収する方法を実施することは極
めて容易である。 ２）純度を更に上げるためには、上記１で得られた上清
を常法に従って限外雄過に付して分子量５０００以下の
画分を除去すればよい。 ３）得られた乾燥品を、５０ｍｇ／ｍｌになるように蒸
留水に懸濁し、遠心分離操作に付して上清を回収する。 ４）この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にする
と沈殿が生じる。この際使用する酸は特定のものである
必要はなく、例えば、トリクロロ酢酸（以下、ＴＣＡと
称す）、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロ
酢酸が使用できる。 ５）次いで、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留
水で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収す
る。 ６）沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカ
リを加える。この際使用するアルカリも特定のものであ
る必要はなく、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムが使
用できる。沈殿の溶解時に塩基性がｐＨ１１より大きく
なると目的のＬＰＳが失活するので注意が必要である。 ７）次いで酸を加えてｐＨ８としてから３７℃に加温
し、更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、３
７℃に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付
す。なお、この際使用する酸も特定のものである必要は
ない。 ８）上清を回収して氷冷し、４℃で再び遠心分離操作に
付す。 ９）上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に
従って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも
特定のものである必要はない。 １０）次いで常法に従ってゲル濾過に付して、リムラス
テスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾過用の担体と
しては、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ
−７５、Ｇ−１００、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）Ｓ−２００、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
６Ｂ［以上は米国ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｉｎｃ．）製］、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ−１
００［米国バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎｃ．）社
製］、トーヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋曹
達工業社製）を使用できる。緩衝液はｐＨ３〜１０のも
のならいずれでもよい。例えば、トリス−ＨＣｌ又はリ
ン酸緩衝液が使用できる。 １１）次いでこの画分に蛋白分解酵素を加え、３７℃で
２時間以上インキュベージョンして残存蛋白質を分解
し、得られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により
濃縮する。なお、この際に使用する蛋白分解酵素も特定
なものである必要はなく、例えば、Ｖ８プロテアーゼ、
キモトリプシン、トリプシン、サーモライシンが単独
で、或は任意に組み合わせて使用できる。市販品として
は、例えば、プロナーゼＥ（科研化学社）、プロティネ
ースＫ（メルク社）を使用できる。 １２）次いでこの画分を常法に従って、例えば、米国フ
ァルマシア社製のＦＰＬＣシステムでファルマシア社製
のモノＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、Ｑ−
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用して陰イオ
ン交換クロマトグラフィーに付してリムラステスト陽性
画分を得る。 １３）次いで、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に付
してリムラステスト陽性画分を回収する。 以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約２０％が回収され、純度約９５％の精製標品
が得られる。又、段階１）終了時の純度に比べ約１００
０倍の純度（小麦種子の場合）になる。以上の方法によ
って得られたリムラステスト陽性植物ＬＰＳはそのま
ま、或いは任意の程度に濃縮した形で提供できる。又、
保存性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾燥などの任意
の手段により乾燥粉末として提供することもできる。こ
れらはいずれも常法で生産できる。

【０００８】リムラステスト陽性細菌源ＬＰＳ 従来より知られている大腸菌ＬＰＳ、アルカリゲネス
ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）から
得られるＬＰＳ［ピー．エイチ．グラハム（Ｐ．Ｈ．Ｇ
ｒａｈａｍ）、エム，エイ．オーブリエン（Ｍ．Ａ．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）共著、”アントニック ファン リー
ウヴェンホック（Ａｎｔｏｎｉｃｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅ
ｎｈｏｃｋ）、ｖｏｌ．３４、３２６〜３３０頁（１９
６８年）：本明細書の他の箇所では、Ａ．ラディオバク
ターＬＰＳと称す］、百日咳菌ＬＰＳ、リピドＡ等の
他、本明細書で追って詳述する細菌源ＬＰＳ１、ＬＰＳ
２、ＬＰＳ３及びそれらの合成ＬＰＳが該当する。大腸
菌ＬＰＳは、例えば、米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社か
ら市販されている。百日咳菌ＬＰＳは、例えば、フナコ
シ薬品（日本）から市販されている。又、公知の百日咳
菌、例えば、東浜株１相菌の死菌体から、例えば、下記
文献記載の公知方法により調製することもできる。ウエ
ブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）等著の「ジャーナル オブ
イミュノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ）、７４４、５５（１９５５）；ウェストフ
ァル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等著の「ツェト．ナツールフ
ォルシュ（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ）」、７６、１
４８（１９５２）。リピドＡは、例えば、第一化学薬品
から市販されている。上記菌源ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、Ｌ
ＰＳ３をそれぞれ産生する３種の菌は、本発明者等が検
討した小麦からはその産地、種類を問わず分離されてい
る。従って、いずれの産地、種類の小麦及びその加工品
からも分離されると推定される。本発明者等がそれら３
種の細菌を分離できることを確認した小麦粉の産地、種
類は次の通りである。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノーザン・スプリングス 米国 １・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本 上記細菌からＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を分離する
には、ウェストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等が「メソ
ッズ イン カーボハイドレート ケミストリ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）のｖｏｌ．Ｖ［米国ニューヨークのアカ
デミック プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）社が
１９６５年に発行］の８３頁に記載した熱フェノール法
を用い、更に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即
ち、菌体を蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フ
ェノールと共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層を
回収し、この水層を透析に付してフェノールを除去し、
限外濾過により濃縮して粗ＬＰＳ画分を得、この画分を
常法に従い、例えば、ファルマシア社製のＦＰＬＣシス
テムでファルマシア社製のモノＱ−セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付
して精製し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上
の操作により、純度９６％以上の精製標品が得られる。
原料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの検出、含量測定
は、後記実験例１に詳述する通り、例えば、生化学工業
株式会社からトキシカラ−システムという名称で市販さ
れている試薬セットを使用して実施できる。即ち、原料
植物を同システムのＬＳ−１セットと合わせて発色さ
せ、その発色の強さを、同じく同セットのＥｔ−２セッ
トを使用して作成した検量線と対比させればよい。糖は
フェノール−硫酸法［エム．デユボイス（Ｍ．Ｄｕｂｏ
ｉｓ）等著、アナリテイカル ケミストリ（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２８、３
５０頁、１９５６年］で、蛋白はローリー法［オー．エ
イチ．ローリー（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ）等著、ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）］、ｖｏｌ．１９３、６５頁、１９５１年］で測定
した。

【０００９】ＬＰＳがマクロファージのインビトロＴＮ
Ｆ産生能を活性化する能力の測定方法 動物体内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（プ
ライミング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが
必要であることは、カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）
らにより、プロシーディング オブ ナショナル アカ
デミー サイエンス オブ ユーエスエー［Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇ ｏｆ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ＵＳＡ．、７２、３６６６〜３
６７０頁（１９７５年）］に報告されている。プライミ
ング段階開始のために投与される薬剤が「プライマー」
（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリング段階
開始のために投与される薬剤が「トリガー」（内因性Ｔ
ＮＦ産生剤）である。ＬＰＳがマクロファージのインビ
トロＴＮＦ産生能を活性化する能力を測定するには、マ
ウスのマクロファージ腹腔常在細胞を採取し、これにプ
ライマーとしての組み換えマウスＩＦＮ−γを添加し、
次いで、トリガーとしてのＬＰＳを添加し、そのＴＮＦ
活性を測定すればよい。ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞
［プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
サイエンス オブ ユーエスエー ７２、 ３６６６〜
３６７０頁］に対する細胞毒性を基にして、次のように
して測定する。Ｌ９２９細胞を、５％仔牛胎児血清を加
えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下、ＭＥ
Ｍ培地と表す）で育成し、８×１０^４個の細胞が１００
μｌの同上培地に含まれる様にし、９６穴の平底プレー
トで育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ_２
であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。その
後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ／ｍｌ
となるように加え、培養液の液量を１５０μｌとする。
即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０
μｌ加える（この際稀釈率を適宜調製し、ＥＤ_５０を求
められる）。更に、最終液量２００μｌとなったＬ９２
９細胞を上記条件で１８時間培養する。細胞障害活性を
測定するには、まず全培地を除去し、ついで、０．１％
クリスタルバイオレットを含む１％メチルアルコール溶
液を加えて固定染色する。クリスタルバイオレットは全
有核細胞を染色するが、死細胞は染色後にプレート底面
より水洗で除去されるので、生存細胞の結果から細胞障
害活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ（５９０ｎ
ｍ）での吸光度を指標として測定し、対照群に対する染
色度と比較することで細胞障害活性を測定する。活性の
定義は次の様に行う。Ｌ９２９細胞が５０％生存できる
検体の稀釈率（Ｎ）を求める。対照としてウサギＴＮＳ
［腫瘍障害血清（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｓｅ
ｒｕｍ）］を使用し、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位
／ｍｌ）を２．４×１０^６単位／ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−
α（旭化成株式会社から入手した組換えヒト型ＴＮＦ）
を用いて決定する。このウサギＴＮＳのＥＤ_５０を与え
る稀釈率（Ｃ）を求める。検体活性（単位／ｍｌ）はＮ
／Ｃ × ｎで計算する。

【００１０】提供できる剤の製造方法 本発明の発育促進剤は、常法の製剤技術により、散剤、
顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、
貼付剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、坐剤、
注射剤、薬浴剤等の形態で提供できる。又、動物用とし
ては、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加
剤として調製することもできる。飼料添加剤とする場合
には、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミ
ックス製剤とは、飼料との混合を容易にするために澱粉
などの飼料成分で希釈されたものを指す。本発明の発育
促進剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添加でき
る飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。又、ミ
ネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼料
であってもよい。これら製剤には、所望ならば、保存
性、均質性を保持するために、常法により賦形剤、保存
剤、緩衝剤等の添加剤を加えることもできる。更に、矯
味剤、矯臭剤、着色剤を含めることもできる。賦形剤と
しては、例えば、乳糖、デンプンが使用できる。保存剤
としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオ
キシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等の
パラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸ナトリウ
ム、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プ
ロピルパラベン等が使用できる。緩衝剤としては、例え
ば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用できる。

【００１１】発育促進効果の確認 本発明の発育促進効果は、マウスに投与し、増体効果を
調べることにより確認した。以下、実施例、製造例、実
験例により、本発明を更に詳細に説明する。なお、それ
らで使用された「大腸菌ＬＰＳ］は、米国ディフコ（Ｄ
ｉｆｃｏ）社製０１２８：Ｂ８である。

【００１２】製造例１（小麦ＬＰＳの製造） １）小型ニーダに、１．０９％の灰分を含む硬質小麦粉
（アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング）
（３，１２０ｇ）を入れ、２．０３リットルの蒸留水を
加えて１０分間練ってドウとした。１５分間の静置後に
１０リットルの水を加えてゆるやかに攪拌してデンプン
乳液を洗い出し、同時に可溶性成分を溶出させた。この
溶出液を５℃の冷蔵庫中で１２時間静置した後、デンプ
ン等の沈降部を除去した。上清を凍結乾燥して２０１．
１ｇの粉末を得た（粉末Ａ）。更に、残留ドウに５リッ
トルの蒸留水を加えてゆるやかに攪拌し、以下、上記と
同様に処理して４０．１ｇの粉末を得た（粉末Ｂ）。 ２）これら粉末Ａ、Ｂを米国アミコン社製限外濾過機Ｈ
Ｆ−Ｌａｂ１に供し、分子量画分５，０００については
中空系カートリッジＨＦ−Ｌａｂ１ＰＭ５を、分子量画
分１０，０００については中空系カートリッジＨＦ−Ｌ
ａｂ１ＰＭ１０を取り付けて限外濾過を行った［温度５
〜１０℃。入圧２５ｐｓｉ（１．７６ｋｇ／ｃｍ^２）、
出圧１５ｐｓｉ（１．０６ｋｇ／ｃｍ^２）］。その結果
に基づき各部分を次のように命名した。 粉末Ａ：分子量５，０００以下の部分をａ_１ 分子量５，０００以上の部分をａ_２ 粉末Ｂ：分子量５，０００以下の部分をｂ_１ 分子量５，０００以上の部分をｂ_２ 粉末Ａ：分子量１０，０００以下の部分をａ_３ 分子量１０，０００以上の部分をａ_４ 粉末Ｂ：分子量１０，０００以下の部分をｂ_３ 分子量１０，０００以上の部分をｂ_４ これら各画分を後記実験例１に詳述する方法に準拠し
てリムラステストに付したら、分子量５，０００以上の
画分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、
分子量５，０００以下の画分にはほとんど存在しないこ
とが確認された。 ３）上記粉末ａ_２の３０ｇを１リットル三角フラスコに
入れ、６００ｍｌの蒸留水を注いで、６０分間スターラ
ーで攪拌した後、日立冷却高速遠心機ＳＣＲ−２０Ｂ
（ローターＲＰＲ１６を事前に４℃に冷却しておいた）
で４℃で遠心分離操作（１０，０００Ｇ×１０分）に付
して上清を回収した。 ４）この上清を１リットル三角フラスコに入れ、氷冷下
（液温約２℃）、スターラーで攪拌しながら、事前に２
℃に冷却してあった１００％ＴＣＡ水溶液２０．５ｍｌ
を滴下し、滴下終了後氷水中に１０分間放置した。 ５）次いで前記と同様にして４℃で遠心分離操作（１
０，０００Ｇ×１０分）に付して沈殿を回収し、氷水中
で冷却下、３００ｍｌの蒸留水と共に５００ｍｌのビー
カーに入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様にし
て４℃で遠心分離操作（１０，０００Ｇ×１０分）に付
して沈殿を回収した。 ６）この沈殿を１リットルビーカーに入れ、蒸留水５０
０ｍｌで懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液約３．５ｍ
ｌを使用して中和（ｐＨ７）し、ついで、氷水中で冷却
しながら、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液約２ｍｌを添加し
て０．０２Ｎ水酸化ナトリウム溶液になるようにして沈
殿を溶解した。 ７）１Ｎ塩酸約１．５ｍｌを加えてｐＨ８とし、次いで
１００ｍｌの蒸留水を加えた後に１リットル三角フラス
コに移して３７℃のインキュベーター内で３０分間ゆっ
くり振とうした。 ８）１００％ＴＣＡ水溶液３０ｍｌを加えて混合した
後、３７℃のインキュベーター内で１０分間ゆっくり振
とうしてから、約３７℃に保温した遠心分離器トミーＣ
Ｄ１００Ｒ（トミー精器社製）を使用して遠心分離操作
（３，０００Ｇ×１０分）に付した。 ９）上清を回収して氷冷し、４℃で遠心分離操作（１
０，０００Ｇ×１０分）に付した。 １０）上清を回収して１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液約
３．６ｍｌで中和してｐＨ７とし、限外濾過器（東洋濾
紙ＵＨＰ−１５０、フィルター：ＵＫ−１０、Ｎ_２圧：
４．０ｋｇ／ｃｍ^２）で濃縮した。 １１）得られた濃縮液６０ｍｌを、セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラム［米国ファルマシア社（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）製、カラムサイズ：５ｃ
ｍ（内径）×１００ｃｍ（２リットル）］を使い、ゲル
濾過［緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／１０ｍＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、流速：６０ｍｌ／時］に付して、
各２０ｍｌの画分を得た。 １２）初めから４３番目から５６番自迄の画分２８０ｍ
ｌを併せ、プロナーゼＥ（科研化学社）４５０μｇを加
え、振とう下、３７℃に２時間保温した後に、限外濾過
器（東洋濾紙ＵＨＰ−６２、フィルター：ＵＫ−１０、
Ｎ_２圧：４．０ｋｇ／ｃｍ^２）で濃縮した。次いで、フ
ァルマシア社製ＦＰＬＣシステム（カラム：モノＱＨＲ
１０／１０）を使って陰イオン交換クロマトグラフィー
に付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料をカラム
に付した後、上記緩衝液でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増
加された組成を持つ緩衝液（２００ｍｌ）でカラムを洗
った。次いで、ＮａＣｌ濃度を、１６５ｍＭから１Ｍの
ＮａＣｌ濃度勾配になるように増加させながら全量４０
０ｍｌで目的ＬＰＳを溶出させ、各２ｍｌの画分を回収
した。リムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をか
けてから５〜８番目の画分を併せて、ＬＰＳ純度約９２
％の８ｍｌ［ＬＰＳ：３．０３ｍｇ（後記実験例１記載
の方法で測定したリムラステスト陽性ＬＰＳ換算値であ
る。以下のＬＰＳ量も全てこの換算値である）、糖：
０．２３ｍｇ、蛋白：０．０４ｍｇ］を回収した。 １３）次いでその８ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）×２
０．２ｃｍ（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液：
水）に付して各３ｍｌの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第９〜１２番目の画分を併せて、Ｌ
ＰＳ純度約９５％の１２ｍｌ（ＬＰＳ：２．７ｍｇ、
糖：０．１８ｍｇ、蛋白：０．０３ｍｇ）を回収した。
なお、この画分は、陰イオン交換クロマトグラフィーに
より酸性であることを確認した。 １４）上記画分を−８０℃で凍結後に恒量になるまで凍
結乾燥し、重量を測定したら０．７５ｍｇあった。（以
下、この凍結乾燥標品を小麦ＬＰＳと称す）この小麦Ｌ
ＰＳのリムラス活性を後記実験例１記載の方法で測定し
たら２．７ｍｇに相当するので、その比活性は ２．７
÷０．７５＝３．６になる。また、夾雑物として存在し
得る単独の糖は、以上の精製により実質上全て除去され
たと考えられるので、検出された糖は全て、小麦ＬＰＳ
を構成している糖と考えられる。従って、この段階での
小麦ＬＰＳの純度を重量に基づいて計算すると 蛋白＝０．０３ｍｇ ＬＰＳ＝０．７５−０．０３＝０．７２ｍｇ だから、 ０．７２÷０．７５×１００＝９６（％） である。

【００１３】小麦ＬＰＳの物性 １５）分子量 小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製
し、その４μｌを１．５ｍｌのトレフチューブに入れ
た。これに、別途、１ｍＭのＥＤＴＡに２．５％ＳＤ
Ｓ、５％メルカプトエタノール、１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）を加えて調製したＳＤＳ処理液１μｌを
加え、この混液を３分間沸騰水に浸した。ファルマシア
社製のファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）
を使用し、電極との間にＳＤＳ−バッファー ストリッ
プ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｔｒｉｐ）（ファルマシア社製）
が介在せられた１μｌの上記混液をゲル［ファルマシア
社製のファスト ゲル グラディエント（Ｐｈａｓｔ
Ｇｅｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ８−２５）］に塗付し、最
大電圧２５０ｖ、最大電流１０ｍＡにセットして泳動を
開始させた（本明細書でこの泳動法をＳＤＳ−１法と称
する）。泳動終了後、クマシー染色と銀染色における挙
動を観察した。クマシー染色では、染色液としてファル
マシア製の０．１％ファスト ゲルブルー（Ｐｈａｓｔ
Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）Ｒを、脱色液として、メタノー
ル：酢酸：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使い、次
の順序で染色・脱色した。 １：５０℃で８分間染色 ２：５０℃で５分間脱色 ３：５０℃で８分間染色 ４：５０℃で１０分間脱色 ５：５０℃で５分間保護（グリセロール、酢酸、蒸留水
の容量比５：１０：８５混液） ６：乾燥 銀染色は、次の順序で行った。 １：５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１：４混液）で処理 ２：５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ３：５０℃で４分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ４：５０℃で６分間、増感液（８．３％グルタルジアル
デヒド）で処理 ５：５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ６：５０℃で５分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ７：５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ８：５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ９：４０℃で１３分間、０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀で処理 １０：３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １１：３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １２：３０℃で３０秒間、現像液（０．０４ｖ／ｖ％ホ
ルムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄
液）で処理 １３：３０℃で４分間、現像液（０．０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液）
で処理 １４：５０℃で２分間、反応停止液（５％ｖ／ｖ％酢
酸）で処理 １５：５０℃で３分間、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理 １６：乾燥 ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子量８，００
０±１，０００の位置に小麦ＬＰＳの主要染色帯が検出
された。別途、小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して２ｍｇ／
ｍｌ溶液を調製し、その１０μｌを１．５ｍｌ容プラス
チックチューブに入れた。これに、別途、１８０μｌの
１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メルカプ
トエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１２．５
μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）及び２２．５
μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０μｌを
加えてよく混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、こ
の加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。１０ｍｌの１
０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシン及び３．
０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解して調製し
た泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気泳動槽に
入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定
し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０ｖに１時間、
次いで、１５０ｖに固定して、色素がゲルより溶出する
まで泳動を続けた（本明細書においてこの泳動法をＳＤ
Ｓ−２法と称する）。泳動終了後に、バイオラッド社の
銀染色キット１６１−０４４３を使い銀染色を室温で行
って、挙動を確認した。結果、分子量８，０００±１，
０００、５，０００±２，０００の位置に小麦ＬＰＳの
主要染色帯が検出された。なお、ＳＤＳ−１法、ＳＤＳ
−２法で、小麦ＬＰＳと同時に泳動させた蛋白分子量マ
ーカーは、ファルマシア社製のＬＭＷキットＥ［ホスホ
リラーゼｂ（９４ｋ）、アルブミン（６７ｋ）、オブア
ルブミン（４３ｋ）、カーボニックアンヒトラーゼ（３
０ｋ）、トリプシンインヒビター（２０ｋ）、α−ラク
トアルブミン（１４ｋ）］、ペプチド分子量マーカー
は、ファルマシア社製の１８６０−１０１分子量マーカ
ー［ミオグロビン（１６．９ｋ）、ミオグロビンＩ＆Ｉ
Ｉ（１４．４ｋ）、ミオグロビンＩ（８．２ｋ）、ミオ
グロビンＩＩ（６．０ｋ）、ミオグロビンＩＶ（２．５
ｋ）］であった。 １６）リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して、２５
μｇの小麦ＬＰＳを含む２０μｌの溶液を調製し、小試
験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％硫酸を添加し、
１６０℃で２時間加熱した。次いで、２０μｌの１０ｖ
／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバーナーで１分間加
熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌの蒸留水、次い
で０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ硫酸、２ｍｌの
蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブデン酸アンモニ
ウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコルビン酸を混合
して調製し、その０．５ｍｌを使用）を添加して室温で
３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの吸光度（ＯＤ
_{８２０ｎｍ}）を測定した。なお、検量線作製用の試料と
しては、リン酸二水素カリウム（和光純薬社製）を蒸留
水で希釈し、リン重量としてそれぞれ２．５μｇ、１μ
ｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．５ｍｌの溶液を調
製して使用した。なお、リン１ｇはリン酸二水素カリウ
ム４．３９ｇに相当する。得られた結果を表１に示す。

【００１４】

【表１】

【００１５】表１において、小麦ＬＰＳのデータは、無
機リンの混入（例えば、リン酸緩衝液に由来する）によ
る誤差を避けるために、加熱処理をしていない対照のデ
ータを減じた値である。小麦ＬＰＳの分子量を８，００
０と仮定し、上表の結果に基づいてその１分子当たりの
リン数を次式により計算すると１〜４になる。

【００１６】

【数１】

【００１７】上記実験でリン数が１〜４と変動している
原因の１つとしては、精製段階でのモノフォスフォエス
テラーゼ混入で、リン酸が脱離したことも考えられる。 １７）ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。小麦ＬＰ
Ｓを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、そ
の１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イワ
キガラス社製）に入れ、これに１００μｌの８ＮＨＣｌ
を添加して１１０℃で１６時間加熱した。４ＮＮａＯＨ
を約２００μｌ添加してｐＨ７とした。その１００μｌ
を分取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入
れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた後に、１０５℃で
１．５時間加熱し、次いで流水で冷却した。次いで、１
００μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加
え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加えた後に室温で１
時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測定した。検量線作
製用試料としては０．２０〜２００μｇ／ｍｌのＮ−ア
セチル グルコサミン（和光純薬社製）を使用した。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製。 結果、小麦ＬＰＳのヘキソサミン数は６±２／分子（仮
定分子量８，０００）だった。 １８）脂肪酸含有量 ９０μｌの小麦ＬＰＳ蒸留水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に１
０μｌの内部標準（０．５５ｍＭのマルガリン酸）を加
えた。１．０ｍｌの０．５Ｍナトリウムメチラートを加
えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を行った。
室温で１時間放置後に９６０μｌの０．５ＮＨＣｌを加
えて中和した。これに２ｍｌのヘキサンを加えて１５分
間激しく攪拌した。次いで、１，０００ｇで５分間遠心
分離を行いヘキサン層を分取した。窒素ガスでヘキサン
を蒸発させて、約２０μｌになるまで濃縮した。このサ
ンプルをガスクロマトグラフィー［本体：島津社製のＧ
Ｃ８ＡＰＦ、キャピラリーカラム：カナダのスペルコ
（Ｓｐｅｌｃｏ）社製ＦＳＣＡＰ Ｓｐ２３３０、キャ
リヤーガス：窒素］に付して脂肪酸量を測定した。脂肪
酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の合成リピ
ドＡである大腸菌型ＬＡ−１５−ＰＰ（分子量２，００
０で、１分子中の脂肪酸数は６であることが知られてい
る）を用いた。結果、小麦ＬＰＳの脂肪酸数は６±２／
分子（仮定分子量８，０００）であると推定された。上
記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添付
の図１〜図３に示す。図１は小麦ＬＰＳの、図２は大腸
菌ＬＰＳの、図３は百日咳菌ＬＰＳのチャートである。
図１〜図３において、図示されている主要ピーク番号に
対応する保持時間（分）は次の通りであった。 図１〜図３の比較により、小麦ＬＰＳのチャートは大腸
菌ＬＰＳのチャートに似ているが、百日咳菌ＬＰＳのも
のとは大きく異なることは明白である。 １９）ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、１．０５ｍｇ／ｍｌの小麦ＬＰＳを含む蒸
留水２５０μｌを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３０
分間加熱後に冷水（２３℃）中で３０分間冷却し、つい
で日立分光光度計３２０を使って４２０、４７０、６３
０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値をそ
れぞれＡ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、１２７μｇ／ｍｌのＫＤＯア
ンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含む
蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料それ
ぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値 （Ｓ_Ｔ）は０．３７９、標準試料の値
（Ｓ_ｓ）は０．２９４であった。この値の比較により、
小麦ＬＰＳには５±１モル／分子量８千のＫＤＯが含ま
れると推定された。

【００１８】製造例２（クロレラＬＰＳの製造） １）細胞膜破砕クロレラ（株式会社マンナンフーズ製）
３０ｇを、洗浄液が緑色に着色しなくなるまでエタノー
ルで洗浄した。 ２）この洗浄残渣２６ｇを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸
留水に溶かし、４５℃で２時間振とう後に遠心分離操作
（４℃、１０，０００Ｇ×３０分）に付した。 ３）上清を回収し、東洋濾紙Ｎｏ．２で濾過し、次いで
蒸留水で抽出した。 ４）抽出液２９０ｍｌを下記条件で陰イオン交換クロマ
トグラフィーに付した。 カラム：Ｑ−セファロース（φ３ｃｍ×２３ｃｍ、容量
約１８０ｍｌ） 緩衝剤：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、Ｎａ
Ｃｌ濃度勾配：１０ｍＭ、４００ｍＭ、１Ｍ 流速：１００〜２００ｍｌ／時 温度：室温 ５）素通りした画分３１０ｍｌをグルコアミラーゼで処
理して澱粉を分解した（ｐＨ５．０、４０℃、約２時
間）。澱粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生じない
ことにより確認した。 ６）遠心分離（１０，０００Ｇ×１０分）に付して上清
を回収し、１０ＮＮａＯＨ溶液で中和してｐＨ７とし、
分子量２０万カットのポアサイズを有するウルトラフィ
ルターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を
行った。 ７）得られた濃縮液３０ｍｌをファルマシア社製ＦＰＬ
Ｃシステム（カラム：モノＱＨＲ１０／１０）を使って
陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。即ち、１０
ｍＭトリス−ＨＣｌと１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液
（ｐＨ７．５）で試料をカラムに付した後、上記緩衝液
でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増加された組成をした液
（２００ｍｌ）でカラムを洗った。次いで、目的ＬＰＳ
を溶出するため、１６５ｍＭから１ＭのＮａＣｌ濃度勾
配になるようにＮａＣｌ濃度を増加させながら全量４０
０ｍｌでカラムを洗い、各２ｍｌの画分を回収した。リ
ムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけてから
５〜８番目の画分を併せた。 ８）次いでその８ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）×２
０．２ｃｍ（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液：
水）に付して各３ｍｌの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第９〜１２番目の画分を併せて１２
ｍｌを回収した（ＬＰＳ：１４．３ｍｇ、糖：２．０ｍ
ｇ、蛋白：０．５３ｍｇ）。ＬＰＳは後記実験例１記載
の方法で測定した。 ９）上記画分を−８０℃で凍結後に恒量になるまで凍結
乾燥し、重量を測定したら５．８ｍｇあった。（以下、
この凍結乾燥標品をクロレラＬＰＳと称す）このクロレ
ラＬＰＳのリムラス活性は１４．３ｍｇに相当するの
で、その比活性は １４．３÷５．８＝２．５ になる。また、以上の精製で、夾雑物として存在し得る
単独の糖は実質上全て除去されたと考えられるので、検
出された糖は全て、クロレラＬＰＳを構成している糖と
考えられる。従って、この段階でのクロレラＬＰＳの純
度を重量に基づいて計算すると、 蛋白＝０．５３ｍｇ ＬＰＳ＝５．８−０．５３＝５．２７ｍｇ なので、 ５．２７÷５．８×１００＝９１（％）である。クロレラＬＰＳの物性 製造例１に記載の方法と同様にして、次の値が得られ
た。分子量は、ＳＤＳ−２法により測定した。 主要分子量＝４０，０００〜９０，０００ リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万

【００１９】製造例３（百日咳菌ＬＰＳの製造） 千葉県血清研究所から入手した試験用百日咳菌液（２．
０×１０^１０ 細胞／ｍｌ）を死菌体として用いた。上
記死菌体を２５ｍｇ（乾燥重量）／ｍｌとなるように滅
菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール液
（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪しなが
ら抽出した。８，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで１／１０に濃縮した。これを８，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノールを
６倍量加えて−２０℃で一晩放置した。４，０００Ｇ、
４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。残さを、２０ｍｇ／ｍｌとなるよう
に蒸留水に懸濁し、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）
社製のソニファイア１８５型で超音波処理（出力コント
ロール５、１５分、室温）に付した。次いで２，５００
Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を分取した。この
上清を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核酸分
解酵素ＤＮａｓｅｌ、ＲＮａｓｅ Ａで１５〜１６時間
処理した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ
と、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを使用した）。更
に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて３７℃で２時間加温
した。次いで２，５００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離
し、上清を分取した。この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌ
ｍａｎ）社のアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使
い、孔径０．２μｍで濾過した。濾液を分子篩にかけ
［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイ
ズ＝内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、
流速＝約３ｍｌ／ｃｍ^２／時）］、生化学工業社製のＬ
Ｓ−１キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合
わせ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径
０．２μｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［装
置：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ＦＰ
ＬＣ、樹脂：米国ファルマシア社製モノＱ ＨＲ１０／
１０、緩衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋１０ｍＭの
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で１５分洗浄し、次いで、Ｎａ
Ｃｌ量を１６５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次いで、
２０分かけて、ＮａＣｌ量が１６５ｍＭから１Ｍの濃度
勾配になるようにＮａＣｌ量を増加させながら洗浄し、
次いで、１ＭのＮａＣｌで３０分洗浄する、流速＝２ｍ
ｌ／分］、生化学工業社製のＬＳ−１キットを用いてリ
ムラス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分を
カラムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）社製セファデックスＧ−２５ファイン（ｆｉ
ｎｅ）、カラムサイズ＝内径２ｃｍ×長さ２５ｃｍ、溶
出液＝蒸留水］、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標
品（４．５０ｍｇ）に混入している可能性の最も高い物
質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線（２００〜４０
０ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度を求めた。吸光
度１のときの核酸濃度が５０μｇ／ｍｌであることを用
いて上記吸光度から核酸濃度を算出したら１％以下であ
った。又、ＳＤＳ−１法、ＳＤＳ−２法のいずれによっ
ても蛋白質は明確には検出されなかった。従って、検出
感度を考慮すると、上記凍結乾燥標品に混入している蛋
白質は高々０〜３％と推定される。従って、上記凍結乾
燥標品の純度は９６％以上と推定された。製造例１に記
載の方法と同様にして測定されたこの百日咳菌ＬＰＳの
物性は次の通りであった。分子量はＳＤＳ−２法によっ
て測定した。百日咳菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝６，０００±１，０００ リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千

【００２０】なお、製造例１に記載の方法と同様にして
測定された大腸菌ＬＰＳ［米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）
社製Ｏ１２８：Ｂ８］の物性は次の通りであった。分子
量はＳＤＳ−２法によって測定した。大腸菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝４０，０００±１０，０００ ８，０００± ４，０００ リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万

【００２１】製造例４（ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３
の製造） １）５０ｍｌ容コーニングチューブに、１．０９％の灰
分を含む硬質小麦粉（カナダ産の１・カナディアン・ホ
イート）１．０４ｇを秤量して入れ、２０ｍｌの蒸留水
を加えて５０ｍｇ／ｍｌの小麦粉液を調製した。 ２）この液を３７℃の水浴中で振とう培養し、培養開始
後０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、
８時間、１０時間、１２時間、２０時間、２４時間、４
５時間目に各０．５ｍｌを採取し、１０゜〜１０_５倍希
釈して標準寒天培地（下記組成を持つ日水製薬社製の培
地）に１００μｌ宛をまき込み、生菌数の測定、コロニ
ーの観察を行った。標準寒天培地（日水製薬社コード番号：０５６１８） １リットル中 酵母エキス ２．５ｇ ペプトン ５．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ ７．１±０．１ ３）種類が異なると考えられた、培養経過時間８時間
目、１０時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロ
ニー（コロニー１）、クリーム色不透明コロニー（コロ
ニー２）、黄色半透明コロニー（コロニー３）、乳白色
不透明コロニー（コロニー４）、白色不透明な小さなコ
ロニー（コロニー５）を上記と同種の別の標準寒天培地
にまき、植え継ぎ、一方で、コロニー１〜５の細菌のグ
ラム染色性、リムラス活性を調べた。上記コロニーのう
ち、コロニー４及びコロニー５（共にグラム染色性＋）
のリムラス活性はコロニー１〜３（共にグラム染色性
−）に比べて極めて低かったので、以後の検討から除
き、日水製薬社製の培地及びＩＤテスト・ＥＢ−２０を
使用し、コロニー１〜３の形態、生化学的性状を観察し
た。次の結果が得られた。

【００２２】コロニー１を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−１） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６４号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５０
９号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 （ａ）形態 １） 短桿状 ２） 運動性なし ３）グラム染色性：− （ｂ） 生育状態 １）標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明コロ
ニーを形成する。 ２）ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成す
る。 ［ＳＳ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５０３１］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ 胆汁酸塩 ９．０ｇ ペプトン ７．５ｇ ラクトース １０．０ｇ クエン酸ナトリウム ８．５ｇ チオ硫酸ナトリウム ５．５ｇ クエン酸第二鉄 １．０ｇ ニュートラルレッド ０．０２５ｇ プリリアントグリン ０．０３３ｇ カンテン １３．５ｇ ｐＨ：７．１±０．１ ３）ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 ［ＴＳＩ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５１０
３］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ ＮａＣｌ ５．０ｇ ペプトン １５．０ｇ ラクトース １０．０ｇ シュクロース １０．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ クエン酸第二鉄 ０．２ｇ チオ硫酸ナトリウム ０．２ｇ フェノールレッド ０．０２ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ：７．６±０．１ （ｃ）生理的性質 １）フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ ２）インドールの生成：− ３）硫化水素の生成：− ４）クエン酸の利用：＋ ５）ウレアーゼ：− ６）オキシダーゼ：− ７）Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 １）ラクトース：＋ ２）アドニット：− ３）ラムノース：＋ ４）マンニット：＋ ５）エスクリン：＋ ６）イノシット：− ７）ソルビット：＋ ８）アラビノース：＋ ９）ラフィノース：＋ １０）シュクロース：＋ （ｅ）その他 １）リジンの脱炭酸反応：− ２）マロン酸の利用：− ３）アルギニンの分解：− ４）フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− ５）オルニチンの脱炭酸反応：−

【００２３】コロニー２を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−２） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６５号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
０号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定さ
れる。 （ａ）形態 １） 短桿状 ２） 運動性なし ３）グラム染色性：− （ｂ）生育状態 １）標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形
成する。 ２）ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成す
る。 ３）ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 １）フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ ２）インドールの生成：− ３）硫化水素の生成：− ４）クエン酸の利用：＋ ５）ウレアーゼ：− ６）オキシダーゼ：− ７）Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 １）ラクトース：＋ ２）アドニット：− ３）ラムノース：＋ ４）マンニット：＋ ５）エスクリン：＋ ６）イノシット：− ７）ソルビット：＋ ８）アラビノース：＋ ９）ラフィノース：＋ １０）シュクロース：＋ （ｅ）その他 １）リジンの脱炭酸反応：− ２）マロン酸の利用：＋ ３）アルギニンの分解：＋ ４）フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− ５）オルニチンの脱炭酸反応：＋

【００２４】コロニー３を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−３） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６６号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
１号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 （ａ）形態 １） 短桿状 ２） 運動性なし ３）グラム染色性：− （ｂ） 成育状態 １）標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形
成する。 ２）ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。 ３）ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成しない。 （ｃ） 生理的性質 １）フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ ２）インドールの生成：− ３）硫化水素の生成：− ４）クエン酸の利用：＋ ５）ウレアーゼ：− ６）オキシダーゼ：− ７）Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 １）ラクトース：＋ ２）アドニット：− ３）ラムノース：＋ ４）マンニット：＋ ５）エスクリン：＋ ６）イノシット：− ７）ソルビット：− ８）アラビノース：＋ ９）ラフィノース：− １０）シュクロース：＋ （ｅ）その他 １）リジンの脱炭酸反応：− ２）マロン酸の利用：＋ ３）アルギニンの分解：− ４）フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− ５）オルニチンの脱炭酸反応：−

【００２５】４）コロニー１、２、３をそれぞれ１リッ
トルのＬ−肉汁培地に移し、３７℃で一夜振とうし、
５，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理して集菌した。
なお、このＬ−肉汁培地は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社
のポリペプトン１０ｇ、同社の酵母エキス５ｇ、和光純
薬社の特級ＮａＣｌ（５ｇ）を蒸留水に入れ、ＮａＯＨ
でｐＨ７．５に合わせ、オートクレーブし、別途、予め
調製済みの和光純薬社の特級グルコースの４０％溶液を
４００倍に希釈して加えて調製したものである。 ５）各菌体をそれぞれ５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、これ
に５０ｍｌの９０％熱フェノールを加えて６５〜７０℃
で２０分間攪拌し、冷却後に、１０，０００Ｇ、４℃で
２０分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層
を更に２回上記と同一の操作に付した。３つの水層を合
わせ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アド
ヴァンテック・トーヨー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹ
Ｏ）社のＵＫ−２００を使用して限外濾過に付して分子
量２０万カット−オフにより濃縮した（Ｎ_２圧：２気
圧）。 ６）この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のＱ−セフ
ァロース ファストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使って陰イオン交換クロマトグ
ラフィーに付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料を
カラムに付した後、４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出さ
せた。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して
脱塩、濃縮して、純度９６％以上のＬＰＳを得た。な
お、核酸は１ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）で溶出した。

【００２６】各菌体の結果は次の表２〜表４の通りであ
った。核酸量はＯＤ（２６０ｎｍ）での測定値に基づき
（１０Ｄ＝５０μｇ）、純度（％）は次式に基づき計算
した。

【００２７】

【数２】

【００２８】

【表２】

【００２９】

【表３】

【００３０】

【表４】

【００３１】７）分子量 各菌体ＬＰＳの分子量を、製造例１と同様にしてＳＤＳ
−２法により測定したら、５，０００±１，０００（菌
体９００８１４−１に由来するＬＰＳ１）、６，５００
±２，５００（同−２に由来するＬＰＳ２及び同−３に
由来するＬＰＳ３）であった。銀染色におけるそれらの
染色帯を図４に示す。図４で、番号１〜３がそれぞれＬ
ＰＳ１〜ＬＰＳ３に対応する。図４に示されるように、
ＬＰＳ１は分子量３万付近にもややまとまった染色帯を
示した。ＬＰＳ２は３０，０００から４３，０００の間
にも染色帯が認められるが、１４，０００以下の染色帯
の染色度と比較すると、高分子のものは極めて少ないと
推定される。後述する糖量、ヘキソサミン量から判断し
ても、ＬＰＳ２は最も糖含有率が低く、ついでＬＰＳ
３、ＬＰＳ１の順で高くなり、電気泳動で観察されたパ
ターンと一致すると考えられる。又、ＬＰＳ量／総乾燥
収量の比もＬＰＳ２、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に低くな
っている。以上の観察結果から、ＬＰＳ２は比較的低分
子のＬＰＳが多く、次いで、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に
その割合は少なくなると推定される。

【００３２】８）リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、３１．６μｇ、５７．
６μｇ、１０３．６μｇのＬＰＳを含む２０μｌの溶液
を調製し、小試験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％
硫酸を添加し、１６０℃で２時間加熱した。次いで、２
０μｌの１０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで１分間加熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌ
の蒸留水、次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ
硫酸、２ｍｌの蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブ
デン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を
添加して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの
吸光度ＯＤ（８２０ｎｍ）を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬
社製）を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
２．５μｇ、１μｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．
５ｍｌの溶液を調製して使用した。なお、リン１ｇはリ
ン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する。結果を表５
に示す。なお、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
（例えば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量（μｇ）は吸光量から計算された値で
ある。リン量（重量％）は、次式により計算した。な
お、式中の「０．６７」は、標準のリン１μｇのＯＤ値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各ＬＰＳの
濃度（ｍｇ／ｍｌ）を指す。

【００３３】

【数３】

【００３４】リン数は、次式により計算した、分子量
５，０００当たりの換算数である。

【００３５】

【数４】

【００３６】

【表５】

【００３７】９）ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して１．５８ｍｇ（ＬＰＳ１）、２．８８
ｍｇ（ＬＰＳ２）、５．１８ｍｇ（ＬＰＳ３）／ｍｌの
溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付
きスピッツ（イワキガラス社製）に入れ、これに１００
μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨ７とし
た。その１００μｌを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた
後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、１００μｌを分取し、６７０μｌの９６
％エタノールを加え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加
えた後に室温で１時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μ
ｇ／ｍｌのＮ−アセチル グルコサミン（和光純薬社
製）を使った。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製した。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製した。 結果、ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３のヘキソサミン数
は各々９±１／分子量５，０００、７±１／分子量５，
０００、５±１／分子量５，０００だった。

【００３８】１０）ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、（１）０．５０５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ１を
含む２５０μｌ蒸留水溶液；（２）０．５７６ｍｇ／ｍ
ｌのＬＰＳ２を含む２５０μｌ蒸留水溶液；（３）０．
５１８ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ３を含む２５０μｌ蒸留水溶
液；のいずれかを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３３
分間加熱後に冷水（２４．５℃）中で３０分間冷却し、
ついで日立分光光度計３２０を使い４２０、４７０、６
３０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値を
各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、０．５μモル／ｍｌのＫＤＯ
アンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含
む蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値（Ｓ_Ｔ）はＬＰＳ１で０．１０９、ＬＰＳ
２で０．０７８、ＬＰＳ３で０．０９９であった。標準
試料の値（Ｓ_Ｓ）は０．２４６であり、蒸留水のみの値
は０．００５であった。この値の比較により、分子量
５，０００当たり、ＬＰＳ１には２±１の、ＬＰＳ２に
は１〜２個の、ＬＰＳ３には２±１個のＫＤＯが含まれ
ると推定された。なお、これらの値は、ＬＰＳ１を例に
とると、次のように計算される。溶液に含まれるＫＤＤ
の濃度をχ（μモル／ｍｌ）とすると、

【００３９】

【数５】

【００４０】上記式から、χ＝０．２２１となる。従っ
て、ＬＰＳ１の１モル（５，０００と仮定）に含まれる
ＫＤＤのモル数をｙとすると、次式により、ｙ＝２．１
９となる。

【００４１】

【数６】

【００４２】以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方
例である。なお、実施例１〜４におけるＬＰＳ量は、リ
ムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算量である。実施例１ （錠剤） 小麦ＬＰＳ ０．０４ｇ ６％ＨＰＣ乳糖 １７８ｇ ステアリン酸タルク ８ｇ バレイショデンプン １４ｇ 以上を混和し、打錠して、０．１ｍｇの小麦ＬＰＳを含
む０．５ｇの錠剤４００個を調製した。実施例２ （内用液剤） クロレラＬＰＳ １ｍｇ 精製水 １００ｍｌ

【００４３】実験例１（リムラステスト陽性植物ＬＰＳ
の定量） 各種植物に含まれるリムラステスト陽性ＬＰＳの定量
を、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムを使っ
て行った。 ９６穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を１
穴当たり１８０μｌ入れた。試料２０μｌ（試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解して調製した）をプレー
トの穴の１つに加えた。プレートミキサーで攪拌しなが
らピペッティングを行って１０倍希釈液を調製した。
（以後、順次希釈試料を２０μｌずつとり、同様に処理
することで１００倍、１０００倍、…と１０倍希釈系列
液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の量比を変
えることにより希釈率は任意に設定できる。） 内部標準として１．５μｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ溶液
の１００，０００倍希釈液を調製し、希釈やリムラステ
スト発色が正常であることを確認した。 上記の１０倍希釈液３５μｌを別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムのＬ
Ｓ−１セット３５μｌを添加し、３７℃で３０分間放置
した。ついで１０５μｌの１Ｍ酢酸水を加えて攪拌して
反応を停止させた。この試料液の波長４１５ｎｍでの吸
光度を、９６穴用吸光度計プレートリーダーＭＴＰ−１
００（コロナ電気株式会社製）で測定した。バックグラ
ンドとしては蒸留水を、検量線作成用としては４２ｐｇ
／ｍｌの生化学工業株式会社のトキシカラージステムの
ＥＴ−１セットを使用して検量線を作成し、この検量線
を基準にして各試料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの定
量を行った。（試料が蒸留水である場合の吸光度を０と
した。）なお、この方法で前記ＬＳ−１セットを使用し
た場合には１０〜４５ｐｇ／ｍｌの範囲内で発色に定量
性があることが確認されたので、この範囲に入らないと
きは、希釈率を変えて再実験した。希釈試料の定量値
は、 （検量線から読み取った値）×（希釈率） で計算した。得られた結果を、固体試料の場合にはｎｇ
／ｇ単位で、液体試料の場合にはｎｇ／ｍｌ単位で次の
表６〜表１１に示す。なお、表中の試料の欄の会社名、
地名等は、当該試料の入手先、産地をさす。かかる記載
がない品はスーパーストアー忠実屋の神奈川県津久井郡
中野町店で購入した品で、製造者が不明なものを指す。
なお、「ホクレン」は、北海道農業協同組合連合会の略
称である。

【００４４】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【００４５】実験例２（マクロファージのインビトロＴ
ＮＦ産生能を活性化する際のＥＤ_５０を与えるリムラス
テスト陽性ＬＰＳの含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
液ｍｌであるＬＰＳの選択方法） ９週齢の、平均体重２９ｇの各群３匹のオスのＣ３Ｈ／
Ｈｅマウスのマクロファージ腹腔常在細胞２００μｌ
（２×１０^５個）／穴を９６穴の平底プレートに入れ、
プライマーとしての組換えマウス１ＦＮ−γ（１００単
位／ｍｌ）を各穴に１０μｌ宛加えた。別途、各種ＬＰ
Ｓ源を６５℃の熱水（ｇ／ｍｌ）で５時間抽出して調製
した抽出液を各種希釈し、その１０μｌ／穴をプライマ
ー投与の３時間後にトリガーとして加えた。２時間培養
後に遠心分離操作に付した（３０００Ｇ、２０分）。各
穴から得られた１３０μｌの、ＴＮＦ活性はＬ９２９細
胞に対する毒性に基づいて測定し、又、リムラステスト
陽性ＬＰＳ含有量は生化学工業株式会社のトキシカラー
ジステムを使用して測定した。測定値を、縦軸にＴＮＦ
産生量（単位／培養液ｍｌ）を、横軸（対数尺）に対応
リムラステスト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）
を表す座標にプロットし、プロットされた各点から推定
されるシグモイド曲線を描いた。トリガーを投与しなか
った場合のＴＮＦ産生量を与える各トリガーのマクロフ
ァージ活性化能を０％とし、トリガー投与の効果として
増大するＴＮＦ産生量が最大恒量に達したときの各トリ
ガーのマクロファージ活性化能を１００％とし、その５
０％に相当するマクロファージ活性化能を与えるリムラ
ステスト陽性ＬＰＳ含有量を曲線から読み取った。マク
ロファージ活性化能とリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
との相関関係が上記条件を満たしたＬＰＳ採取源の結果
を表１２〜表１４に示す。表中で、「ＴＮＦ」はＴＮＦ
産生量（単位／培養液ｍｌ）を、「活性化能」はマクロ
ファージ活性化能（％）を、「ＬＰＳ」はリムラステス
ト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）を表す。な
お、トリガー無添加時のＴＮＦ産生量は０．７５単位／
ｍｌであったので、ＴＮＦ産生量が０．７５単位／ｍｌ
以下である場合をマクロファージ活性化能０％とし、マ
クロファージ活性化能（％）は次式により計算した。

【００４６】

【数７】

【００４７】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【００４８】実験例３（実験動物での発育促進効果−そ
の１） Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスに、出生後、蒸留水（６匹）、Ｌ
ＰＳ換算でそれぞれ５ｎｇ／ｍｌ（６匹）、５０ｎｇ／
ｍｌ（５匹）の粉末Ａ−ａ_２（製造例１）を含むように
調製した蒸留水を自由摂取させた。（以下、それぞれ、
蒸留水摂取群、５ｎｇ摂取群、５０ｎｇ摂取群と称
す。） 他の給餌条件は全く同様であり、株式会社日本
クレア市販のラット、マウス用の飼料ＣＥ−２を自由摂
取させた。出生後に体重を測定し、各群の平均値（／
匹）として、次の表１５に示す結果が得られた。表中、
５ｎｇ摂取群、５０ｎｇ摂取群の欄中の増加率は、それ
ぞれそれらの平均値の、蒸留水投与群の平均値に対する
増加率（％）を表している。

【００４９】

【表１５】

【００５０】図５は、表１５に示した結果をグラフ化し
たものである。表１５及び図５より、本発明のＬＰＳが
有意な発育促進効果を示すことが明らかである。

【００５１】実験例４（実験動物での発育促進効果−そ
の２） 懐妊しているＣ３Ｈ／Ｈｅ雌マウスに蒸留水、ＬＰＳ換
算でそれぞれ５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌの粉末Ａ−
ａ_２（製造例１）を含むように調製した蒸留水を自由摂
取させた。（以下、それぞれ、蒸留水摂取群、５ｎｇ摂
取群、５０ｎｇ摂取群と称す。） 摂取開始後６日目に
蒸留水摂取群マウスから誕生した雌マウスを５匹、５ｎ
ｇ摂取群から誕生した雌マウスを７匹、５０ｎｇ摂取群
から誕生した雌マウスを４匹選び、誕生後２０日目から
それぞれ親マウスと同じ物を摂取させた。他の給餌条件
は誕生前から全く同様であり、株式会社日本クレア市販
のラット、マウス用の飼料ＣＥ−２を自由摂取させた。
誕生後２０日目から各マウスの体重を測定し、各群の平
均値（／匹）として、次の表１６に示す結果が得られ
た。表中、５ｎｇ摂取群、５０ｎｇ摂取群の欄中の増加
率は、それぞれ、それらの平均値の、蒸留水投与群の平
均値に対する増加率（％）を表している。

【００５２】

【表１６】

【００５３】図６は、表１６に示した結果をグラフ化し
たものである。表１６及び図６より、本発明のＬＰＳが
有意な発育促進効果を示すこと、又、表１５及び図５に
示した結果との比較により、誕生後に本発明のＬＰＳを
初めて摂取させるよりも、懐妊中の親にも摂取させるこ
とによりその発育促進効果は約２倍になることを示して
いる。

【００５４】投与量、投与間隔、毒性値 本発明のＬＰＳを発育促進剤、動物用発育促進剤として
投与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医師或いは
獣医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体重、
投与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の成人
（６０ｋｇ）で、経口投与で１μｇ〜１００ｍｇ、静脈
投与で１０ｎｇ〜１０ｍｇ、経皮投与で１００ｎｇ〜１
ｍｇが１日１回の投与量の一応の目安となる。なお、動
物では、牛、馬等の大型動物は上記の量の６０分の１を
体重１ｋｇ当たりの量の目安とし、豚、犬、猫等の中
型、小型の動物ではその２倍量を体重１ｋｇ当たりの量
の目安とし、鶏等の鳥類では更にその２倍量を体重１ｋ
ｇ当たりの量の目安とし投与できる。なお、ベーレンス
ケルバー（Ｂｅｈｒｅｎｓ Ｋ

【外１】 ｒｂｅｒ）法により計算した、７週齢の平均体重２２ｇ
のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスにおけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３のＬＤ_５０はそれぞれ１５０、１８０、１８０
μｇ／匹であり、大腸菌ＬＰＳ［米国ディフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ）社製０１２８：Ｂ８］の値３００μｇ／匹の６０
％以下であった。又、小麦ＬＰＳ（製造例１）、大腸菌
ＬＰＳ（同上）、百日咳菌ＬＰＳ（製造例３）の毒性値
ＬＤ_５０（１群２匹の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウス、平均体重
４５ｇ、における平均値）は静脈内投与でそれぞれ３．
２、３．４、１１ｍｇ／ｋｇであり、皮内投与でそれぞ
れ１６、１６、３２ｍｇ／ｋｇだった。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、優れた発育促進効果を有
し、未熟児の誕生を予防し、副作用や体内残留性の問題
がなく、長期使用が可能であり、生産コストが低く、し
かも、経口、経皮、薬浴、注射のいずれの経路でもで投
与可能な、大量に供給可能な発育促進剤、動物用発育促
進剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】小麦ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけて
得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピークを
図示したチャートである。

【図２】大腸菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけ
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。

【図３】百日咳菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにか
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。

【図４】ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３の、ＳＤＳ−２
法におけるパターンを示す図である。

【図５】本発明のＬＰＳの発育促進効果を示すグラフで
ある。

【図６】本発明のＬＰＳの発育促進効果を示すグラフで
ある。

【符号の説明】 図４において、１はＬＰＳ１の、２はＬＰＳ２の、３は
ＬＰＳ３のパターンを示す。 図５、図６において、は蒸留水投与群の、△は本発明の
ＬＰＳの５ｎｇ投与群の、▲は本発明のＬＰＳの５０ｎ
ｇ投与群のデータを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 月岡 大輔 千葉県千葉市春日１−21−17 (72)発明者 水野 伝一 神奈川県鎌倉市岡本18 (72)発明者 大島 治之 東京都八王子市館町1097館ケ丘団地２−１ −513

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＬＰＳを含む発育促進剤であり、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
   を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
   し、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
   のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０
   ％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時
   のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマ
   クロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰ
   Ｓのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシ
   グモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステ
   スト陽性ＬＰＳ含有量か０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍ
   ｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む発育促進剤。
2. 【請求項２】 ＬＰＳが、植物から得られるＬＰＳ、細
   菌から得られるＬＰＳ、リピドＡ、それらの台成ＬＰＳ
   及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項
   １記載の発育促進剤。
3. 【請求項３】 植物から得られるＬＰＳが、小麦から得
   られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記載の
   発育促進剤。 主要分子量：８，０００±１，０００（ＳＤＳ−１法に
   よる） ８，０００±１，０００（ＳＤＳ−２法による） ５，０００±２，０００（ＳＤＳ−２法による） リン数：１〜４／分子量８千 ヘキソサミン数：６±２／分子量８千 脂肪酸数：６±２／分子量８千 ＫＤＯ数＝５±１／分子量８千
4. 【請求項４】 植物から得られるＬＰＳが、クロレラか
   ら得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記
   載の発育促進剤。 主要分子量＝４０，０００〜９０，０００（ＳＤＳ−２
   法による） リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万
5. 【請求項５】 細菌から得られるＬＰＳが、大腸菌から
   得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記載
   の発育促進剤。 主要分子量＝４０，０００±１０，０００（ＳＤＳ−２
   法による） ８，０００± ４，０００（ＳＤＳ−２法による） リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万
6. 【請求項６】 細菌から得られるＬＰＳが、次の物性を
   有するＬＰＳである、請求項２記載の発育促進剤。 主要分子量：５，０００±１，０００（ＳＤＳ−２法に
   よる） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００
7. 【請求項７】 細菌から得られるＬＰＳが、次の物性を
   有するＬＰＳである、請求項２記載の発育促進剤。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−２法に
   よる） リン数：１〜２／分子量５，０００ ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：１〜２／分子量５，０００
8. 【請求項８】 細菌から得られるＬＰＳが、次の物性を
   有するＬＰＳである、請求項２記載の発育促進剤。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−２法に
   よる） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００
9. 【請求項９】 細菌から得られるＬＰＳが、百日咳菌か
   ら得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記
   載の発育促進剤。 主要分子量＝６，０００±１，０００（ＳＤＳ−２法に
   よる） リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千
10. 【請求項１０】 細菌から得られるＬＰＳが、Ａ．ラデ
    ィオバクターＬＰＳである、請求項２記載の発育促進
    剤。
11. 【請求項１１】 ＬＰＳを含む動物用発育促進剤であ
    り、インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産
    生能を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指
    標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロ
    ファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化
    能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量に
    する時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％と
    するマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そ
    のＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で
    表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファージ活性化
    能のＥＤ_５０を与えるリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
    が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであるＬＰＳの少な
    くとも１種を含む動物用発育促進剤。