JPH05155778A - Lpsを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤 - Google Patents
Lpsを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤Info
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- JPH05155778A JPH05155778A JP3357351A JP35735191A JPH05155778A JP H05155778 A JPH05155778 A JP H05155778A JP 3357351 A JP3357351 A JP 3357351A JP 35735191 A JP35735191 A JP 35735191A JP H05155778 A JPH05155778 A JP H05155778A
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- lps
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- macrophage
- sds
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 発育促進効果が高く、長期使用が可能であ
り、経口、経皮、薬浴、注射のいずれでも投与可能な発
育促進剤、動物用発育促進剤を提供する。 【構成】 下記LPSの少なくとも1種を含むことを特
徴とする。LPSのインビトロで培養されるマクロファ
ージのTNF産生能を活性化するLPSのマクロファー
ジ活性化能を指標とし、縦軸に、そのLPSを添加しな
いときのマクロファージのTNF産生量を与えるマクロ
ファージ活性化能を0%、マクロファージのTNF産生
量を最大恒量にする時のLPSのマクロファージ活性化
能を100%とするマクロファージ活性化能(%)を表
し、横軸に、そのLPSのリムラステスト陽性LPS含
有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロ
ファージ活性化能のED50を与えるリムラステスト陽
性LPS含有量が0.4〜100ng/培養液mlであ
るLPS。
り、経口、経皮、薬浴、注射のいずれでも投与可能な発
育促進剤、動物用発育促進剤を提供する。 【構成】 下記LPSの少なくとも1種を含むことを特
徴とする。LPSのインビトロで培養されるマクロファ
ージのTNF産生能を活性化するLPSのマクロファー
ジ活性化能を指標とし、縦軸に、そのLPSを添加しな
いときのマクロファージのTNF産生量を与えるマクロ
ファージ活性化能を0%、マクロファージのTNF産生
量を最大恒量にする時のLPSのマクロファージ活性化
能を100%とするマクロファージ活性化能(%)を表
し、横軸に、そのLPSのリムラステスト陽性LPS含
有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロ
ファージ活性化能のED50を与えるリムラステスト陽
性LPS含有量が0.4〜100ng/培養液mlであ
るLPS。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、発育促進剤及び動物用
発育促進剤に関する。より詳細には、本発明は、LPS
を含む発育促進剤及び動物用発育促進剤に関する。
発育促進剤に関する。より詳細には、本発明は、LPS
を含む発育促進剤及び動物用発育促進剤に関する。
【0002】
【従来の技術】人間の場合、出生時の体重が2,500
g未満のものを未熟児と呼び、体重が2,500g以上
になるまでは特別の看護体制下で保育されるのが通例で
ある。これは、出生時体重が小さいほど、新生児期にお
ける死亡率が高く、或いは、様々な病気をおこしやす
く、又、その後の発育にも問題があることが多いからで
ある。(平山宗宏等編「育児全書」、126〜128
頁、昭和52年社会保険出版社発行) 又、痩身者につ
いては、20代では標準者及び肥満者よりも有意に死亡
指数が高い、年齢層に関係なく、入院率は痩身者が最も
多い、痩身者の方が肥満者より骨折しやすい等の報告が
ある。(森川憲導等著「肥満児とやせ児」、24〜30
頁、昭和58年2月28日株式会社ぎょうせい発行)上
記事情は、程度の差こそあれ、本質的に人間以外の動物
であっても同様であると推定される。加えて、人間の食
に供される牛、豚、魚等の場合には、その発育状況によ
り商品価値は決まり、又、育成期間が短い程経営効率は
よくなる。このように、出生時及びその後においても、
人間及びその他の動物において発育促進の必要が生じる
ことがある。現在、この発育は主として栄養摂取量の増
加により達成を意図されているが、食欲のない者に摂取
を強制するとかえって食欲を害し、好ましい結果は得ら
れない。又、摂取効率には個体差がある。そのため、人
間以外の動物、例えば肥育牛においてはホルモン剤、非
ホルモン剤が発育促進剤として与えられており、この場
合、飼料を節減するという効果の達成も意図されてい
る。しかし、ホルモン剤は副作用、体内残留性の点から
使用が差し控えられており、又、非ホルモン剤は、一部
が商品化されているにすぎない。(土屋平四郎等著「改
訂・肉牛飼養全科第2版」、179〜181頁、昭和6
3年社団法人農山漁村文化協会発行)従って、人間及び
その他の動物の健康体を回復、維持する手段、及び、よ
り経済的に食肉を提供する手段としての発育促進剤開発
の要請が存在しており、副作用や体内残留性の問題がな
く、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発が強く待たれて
いる。
g未満のものを未熟児と呼び、体重が2,500g以上
になるまでは特別の看護体制下で保育されるのが通例で
ある。これは、出生時体重が小さいほど、新生児期にお
ける死亡率が高く、或いは、様々な病気をおこしやす
く、又、その後の発育にも問題があることが多いからで
ある。(平山宗宏等編「育児全書」、126〜128
頁、昭和52年社会保険出版社発行) 又、痩身者につ
いては、20代では標準者及び肥満者よりも有意に死亡
指数が高い、年齢層に関係なく、入院率は痩身者が最も
多い、痩身者の方が肥満者より骨折しやすい等の報告が
ある。(森川憲導等著「肥満児とやせ児」、24〜30
頁、昭和58年2月28日株式会社ぎょうせい発行)上
記事情は、程度の差こそあれ、本質的に人間以外の動物
であっても同様であると推定される。加えて、人間の食
に供される牛、豚、魚等の場合には、その発育状況によ
り商品価値は決まり、又、育成期間が短い程経営効率は
よくなる。このように、出生時及びその後においても、
人間及びその他の動物において発育促進の必要が生じる
ことがある。現在、この発育は主として栄養摂取量の増
加により達成を意図されているが、食欲のない者に摂取
を強制するとかえって食欲を害し、好ましい結果は得ら
れない。又、摂取効率には個体差がある。そのため、人
間以外の動物、例えば肥育牛においてはホルモン剤、非
ホルモン剤が発育促進剤として与えられており、この場
合、飼料を節減するという効果の達成も意図されてい
る。しかし、ホルモン剤は副作用、体内残留性の点から
使用が差し控えられており、又、非ホルモン剤は、一部
が商品化されているにすぎない。(土屋平四郎等著「改
訂・肉牛飼養全科第2版」、179〜181頁、昭和6
3年社団法人農山漁村文化協会発行)従って、人間及び
その他の動物の健康体を回復、維持する手段、及び、よ
り経済的に食肉を提供する手段としての発育促進剤開発
の要請が存在しており、副作用や体内残留性の問題がな
く、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発が強く待たれて
いる。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な発育
促進剤、動物用発育促進剤を提供することを技術的課題
とするものである。
促進剤、動物用発育促進剤を提供することを技術的課題
とするものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】前記技術的課題は、優れ
た発育促進効果を有し、未熟児の誕生を予防し、副作用
や体内残留性の問題がなく、長期使用が可能であり、生
産コストが安く、しかも、経口、経皮、薬浴、注射いず
れの経路でも投与が可能な、大量に供給可能なLPSを
含む発育促進剤、動物用発育促進剤を提供することによ
り達成される。この発育促進剤、動物用発育促進剤に
は、インビトロで培養されるマクロファージのTNF産
生能を活性化するLPSのマクロファージ活性化能を指
標とし、縦軸に、そのLPSを添加しないときのマクロ
ファージのTNF産生量を与えるマクロファージ活性化
能を0%、マクロファージのTNF産生量を最大かつ一
定の値(本明細書の他の箇所においては、「最大恒量」
と称す)にする時のLPSのマクロファージ活性化能を
100%とするマクロファージ活性化能(%)を表し、
横軸に、そのLPSのリムラステスト陽性LPS含有量
を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファ
ージ活性化能のED50を与えるリムラステスト陽性L
PS含有量が0.4〜100ng/培養液mlであるL
PSの少なくとも1種が含まれる。ここで「少なくとも
1種を含む」とは、本発明のLPSは各別に使用できる
ことはもちろん、その意図される用途が阻害されない限
り、それらの2種以上を任意に組み合わせて、又、更に
は他のいずれの物質とも組み合わせて使用できることを
意味する。例えば、他の発育促進剤、ビタミン剤等のい
わゆる栄養剤その他と配合することもできる。
た発育促進効果を有し、未熟児の誕生を予防し、副作用
や体内残留性の問題がなく、長期使用が可能であり、生
産コストが安く、しかも、経口、経皮、薬浴、注射いず
れの経路でも投与が可能な、大量に供給可能なLPSを
含む発育促進剤、動物用発育促進剤を提供することによ
り達成される。この発育促進剤、動物用発育促進剤に
は、インビトロで培養されるマクロファージのTNF産
生能を活性化するLPSのマクロファージ活性化能を指
標とし、縦軸に、そのLPSを添加しないときのマクロ
ファージのTNF産生量を与えるマクロファージ活性化
能を0%、マクロファージのTNF産生量を最大かつ一
定の値(本明細書の他の箇所においては、「最大恒量」
と称す)にする時のLPSのマクロファージ活性化能を
100%とするマクロファージ活性化能(%)を表し、
横軸に、そのLPSのリムラステスト陽性LPS含有量
を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファ
ージ活性化能のED50を与えるリムラステスト陽性L
PS含有量が0.4〜100ng/培養液mlであるL
PSの少なくとも1種が含まれる。ここで「少なくとも
1種を含む」とは、本発明のLPSは各別に使用できる
ことはもちろん、その意図される用途が阻害されない限
り、それらの2種以上を任意に組み合わせて、又、更に
は他のいずれの物質とも組み合わせて使用できることを
意味する。例えば、他の発育促進剤、ビタミン剤等のい
わゆる栄養剤その他と配合することもできる。
【0005】「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一
種であり、動物体内のほとんど全ての組織に分布し、粒
子状の異物や体内の老廃細胞などを捕食して消化する大
型のアメーバ状細胞の総称である。「TNF」は、マク
ロファージにより産生される腫瘍障害因子(Tumor
Necrosis Factor)の総称であり[1
985年に発行された ザ ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー(The Journal o
f Biological Chemistry.、2
60、2345〜2354頁]、マクロファージの活性
が高まるにつれてその産生量は増していく。「リムラス
テスト」は、1968年にレヴィン(Levin)が創
案した、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いた
エンドトキシン定量法である。本発明の発育促進剤、動
物用発育促進剤の活性成分として使用できるLPSは、
特にその採取源、生産方法、精製方法を限定されること
はない。例えば、細菌や植物から採取されるLPSであ
っても、或は合成リピドAのような合成品であってもよ
い。なお、本明細書、特にその特許請求の範囲におい
て、採取源は特に名称で特定されたそのものに限定され
ることなく、その採取源の成長、保存、流通の過程で付
着、共存する細菌その他の全てのものが含まれる。例え
ば、「小麦LPS」と特定された場合には、小麦そのも
のから採取されたLPSのみならず、小麦の成長、保
存、流通の過程で付着、共存する細菌その他の全てのも
のが含まれるものと理解されたい。なぜならば、特に寄
生、共生植物、寄生、共生動物という関係が解明されて
いるもの以外にも、特定の植物、動物、菌界生物、地衣
界生物に、それらにより付着、共存を許されたものが棲
息している例が多く存在し得ることは当業界で良く知ら
れていることであるからである。
種であり、動物体内のほとんど全ての組織に分布し、粒
子状の異物や体内の老廃細胞などを捕食して消化する大
型のアメーバ状細胞の総称である。「TNF」は、マク
ロファージにより産生される腫瘍障害因子(Tumor
Necrosis Factor)の総称であり[1
985年に発行された ザ ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー(The Journal o
f Biological Chemistry.、2
60、2345〜2354頁]、マクロファージの活性
が高まるにつれてその産生量は増していく。「リムラス
テスト」は、1968年にレヴィン(Levin)が創
案した、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いた
エンドトキシン定量法である。本発明の発育促進剤、動
物用発育促進剤の活性成分として使用できるLPSは、
特にその採取源、生産方法、精製方法を限定されること
はない。例えば、細菌や植物から採取されるLPSであ
っても、或は合成リピドAのような合成品であってもよ
い。なお、本明細書、特にその特許請求の範囲におい
て、採取源は特に名称で特定されたそのものに限定され
ることなく、その採取源の成長、保存、流通の過程で付
着、共存する細菌その他の全てのものが含まれる。例え
ば、「小麦LPS」と特定された場合には、小麦そのも
のから採取されたLPSのみならず、小麦の成長、保
存、流通の過程で付着、共存する細菌その他の全てのも
のが含まれるものと理解されたい。なぜならば、特に寄
生、共生植物、寄生、共生動物という関係が解明されて
いるもの以外にも、特定の植物、動物、菌界生物、地衣
界生物に、それらにより付着、共存を許されたものが棲
息している例が多く存在し得ることは当業界で良く知ら
れていることであるからである。
【0006】これらLPSのうちから、本発明の発育促
進剤、動物用発育促進剤の活性成分として使用できるL
PSを選択するには、インビトロで培養されるマクロフ
ァージのTNF産生能を活性化するLPSのマクロファ
ージ活性化能を指標とし、縦軸に、そのLPSを添加し
ないときのマクロファージのTNF産生量を与えるマク
ロファージ活性化能を0%、マクロファージのTNF産
生量を最大恒量にする時のLPSのマクロファージ活性
化能を100%とするマクロファージ活性化能(%)を
表し、横軸に、そのLPSのリムラステスト陽性LPS
含有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マク
ロファージ活性化能のED50を与えるリムラステスト
陽性LPS含有量が0.4〜100ng/培養液mlで
あるものを選択すればよい。
進剤、動物用発育促進剤の活性成分として使用できるL
PSを選択するには、インビトロで培養されるマクロフ
ァージのTNF産生能を活性化するLPSのマクロファ
ージ活性化能を指標とし、縦軸に、そのLPSを添加し
ないときのマクロファージのTNF産生量を与えるマク
ロファージ活性化能を0%、マクロファージのTNF産
生量を最大恒量にする時のLPSのマクロファージ活性
化能を100%とするマクロファージ活性化能(%)を
表し、横軸に、そのLPSのリムラステスト陽性LPS
含有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マク
ロファージ活性化能のED50を与えるリムラステスト
陽性LPS含有量が0.4〜100ng/培養液mlで
あるものを選択すればよい。
【0007】リムラステスト陽性植物源LPS 原料植物として使用できるものを下記に例示する。な
お、本明細書に記載した植物が帰属する科名、属名は、
次の文献の記載を照合して決定された。 裸子植物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類:昭
和57年(正編)、昭和58年(続編)に北隆館から発
行された「原色牧野植物大図鑑」の記載を照合して所属
を決定した。但し、「燕麦」は、昭和45年に女子栄養
大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭和5
8年に至文堂から発行された「新日本植物誌顕花篇」の
記載を照合し、「裸麦」は、昭和46年に東京同文書院
から発行された「総合食品事典」の記載を照合し、「鳩
麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウコ
ン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダ
ミ」、「胡椒」、「トウガラシ」、「ダイウイキョ
ウ」、「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾ
ウ」、「オタネニンジン」、「ボウフウ」、「オオツヅ
ラフジ」、「ウンカリア・ヒルスタ」は、昭和63年に
北隆館から発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記
載を照合し、「アボガド」は、昭和53年に財団法人農
林統計協会から発行された熱帯農業技術叢書第15号
「ブラジルの果実」の記載を照合し、「カイワレダイコ
ン」は、昭和59年に北隆館から発行された「原色園芸
植物大図鑑」の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和4
4年に廣川書店から発行された「図説熱帯植物集成」の
記載を照合し、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品
協会が昭和61年に公示した、「クロレラ規格基準」の
記載を照合して所属を決定した。 菌類:昭和62年に保育社から発行された「原色日本新
菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し、酵
母は、昭和37年に技報堂から発行された「微生物学ハ
ンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前掲の
「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属を決
定した。 本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。裸子植物
としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマツを使用
できる。単子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属
植物であるイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ
科オオムギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属
植物である鳥麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクマ
笹、イネ科ジュズダマ属植物である鳩麦、アヤメ科アヤ
メ属植物であるアヤメ、ユリ科ネギ属植物であるニンニ
ク、ユリ科キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ
科ジャノヒゲ属植物であるジャノヒゲ、ショウガ科ショ
ウガ属植物であるミョウガ、ショウガ科ウコン属植物で
あるウコン、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシ
ャクを使用できる。双子葉類植物としては、マメ科ダイ
ズ属植物である大豆、マメ科インゲンマメ属植物である
小豆、マメ科ソラマメ属植物であるそら豆、マメ科クズ
属植物であるクズ、マメ科カンゾウ属植物であるナンキ
ンカンゾウ、ナス科ナス属植物であるジャカイモ、トウ
ガラシ、ナス科トマト属植物であるトマト、ナス科トウ
ガラシ属植物であるトウガラシ、バラ科ビワ属植物であ
るビワ、バラ科サクラ属植物であるモモ、クスノキ科ア
ボガド属植物であるアボガド、クルミ科クルミ属植物で
あるクルミ、ウリ科トウナス属植物であるカボチャ、ウ
リ科アマチャヅル属植物であるアマチャヅル、アブラナ
科ダイコン属植物であるカイワレダイコン、マタタビ科
マタタビ属植物であるマタタビ、ドクダミ科ドクダミ属
植物であるドクダミ、コショウ科コショウ属植物である
胡椒、シキミ科シキミ属植物であるダイウイキョウ、ニ
クズク科ニクズク属植物であるニクズク、ミカン科ミカ
ン属植物であるダイダイ、ウコギ科オタネニンジン属植
物であるオタネニンジン、セリ科サボシュニコビア属植
物であるボウフウ、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物
であるオオツヅラフジ、アカネ科カギカズラ属植物であ
るウンカリア・ヒルスタを使用できる。シダ植物として
は、例えば、トクサ科トクサ属植物であるスギナ、ゼン
マイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを使用できる。ソ
ウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ類
植物、緑ソウ類植物、ランソウ類植物を使用できる。カ
ッソウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植物
であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、ホ
ンダワラ科ヒジキ属植物であるヒジキを使用できる。紅
ソウ類植物としては、例えば、ウシケノリ科アマノリ属
植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物と
しては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物であ
るクロレラを使用できる。菌類植物としては、例えば、
担子菌類植物、子ノウ菌類植物を使用できる。担子菌類
植物としては、例えば、ヒラタケ科マツオウジ属植物で
ある椎茸、キシメジ科エノキタケ属植物であるエノキ
茸、キシメジ科シメジ属植物であるシメジ、タコウキン
科マイタケ属植物であるマイ茸、サルノコシカケ科ポリ
ポラス属植物であるアワビ茸、ハラタケ科ハラタケ属植
物であるマッシュルーム、キクラゲ科キクラゲ属植物で
あるキクラゲ、モエギタケ科スギタケ属植物であるナメ
コを使用できる。子ノウ菌類植物としては、例えば、エ
ンドミセタセア科サッカロミセス属植物であるパン酵
母、醸造用酵母を使用できる。醸造用酵母にはビール酵
母、清酒酵母、葡萄酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の
他、サッカロミセス セレヴイシドに属する多くの酵母
(例えば、ウイスキーや老酒の製造に使用される酵母)
が含まれる。又、バッカクキン科ノムシタケ属植物であ
る冬虫夏草も使用できる。植物源LPSは、以下に述べ
る方法で分離、精製できる。 1)原料植物を必要に応じて適宜細切、乾燥、粉砕した
後に蒸留水によく懸濁し、上清を回収する。例えば、原
料植物が穀類の種子である場合は、種皮をつけたまま、
或は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は、食用に供
せられている程度の粉末になるまで粉砕し、得られた粉
末に水を加えて分散液とし、攪拌した後に沈降物を静置
又は遠心分離により除去するか、粉末に水を加えて練っ
て得られるドウをミキサー中でゆるやかに水洗し、沈降
物を除去すればよい。原料植物がクロレラである場合に
は、まず細胞膜を破砕し、エタノール洗浄により脂溶性
物質を除去した後に水抽出するとよい。この水抽出の際
の原料植物の粒度、水の温度、液性、添加量、攪拌の速
度、時間、遠心分離の際の条件等は特に制限する必要は
なく、原料植物の種類に応じて適宜調整すればよい。
又、抽出水の温度は高い方がLPSの採取量、純度とも
に高い傾向があるが、操作の便宜上、原料植物に含まれ
る澱粉の糊化を招来しない50℃以下とすることが好ま
しい。又、水の添加量は、原料植物の種類、粒度により
異なるが、穀類種子の場合にはその割合が70w/v%
以下、望ましくは20〜50w/v%程度とすると操作
上便利である。更に、攪拌の速度は、起泡を引き起こさ
ない程度のものとすることが好ましい。なお、この段階
の操作迄で、本発明のリムラステスト陽性植物LPSの
純度は、リムラステスト活性データから判断して、例え
ば小麦種子の場合には約30倍に上昇する。以下、穀類
種子を原料として使用する場合を例にとり説明するが、
いわゆる当業者であれば、以下の記載を参考にして、他
植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリムラステスト
陽性LPSを高純度で回収する方法を実施することは極
めて容易である。 2)純度を更に上げるためには、上記1で得られた上清
を常法に従って限外雄過に付して分子量5000以下の
画分を除去すればよい。 3)得られた乾燥品を、50mg/mlになるように蒸
留水に懸濁し、遠心分離操作に付して上清を回収する。 4)この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にする
と沈殿が生じる。この際使用する酸は特定のものである
必要はなく、例えば、トリクロロ酢酸(以下、TCAと
称す)、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロ
酢酸が使用できる。 5)次いで、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留
水で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収す
る。 6)沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカ
リを加える。この際使用するアルカリも特定のものであ
る必要はなく、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムが使
用できる。沈殿の溶解時に塩基性がpH11より大きく
なると目的のLPSが失活するので注意が必要である。 7)次いで酸を加えてpH8としてから37℃に加温
し、更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、3
7℃に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付
す。なお、この際使用する酸も特定のものである必要は
ない。 8)上清を回収して氷冷し、4℃で再び遠心分離操作に
付す。 9)上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に
従って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも
特定のものである必要はない。 10)次いで常法に従ってゲル濾過に付して、リムラス
テスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾過用の担体と
しては、例えばセファデックス(Sephadex)G
−75、G−100、セファクリル(Sephacry
l)S−200、セファロース(Sepharose)
6B[以上は米国ファルマシア社(Pharmacia
Inc.)製]、バイオゲル(Biogel)P−1
00[米国バイオラッド(Biorad Inc.)社
製]、トーヨーパールHW−50、HW−55(東洋曹
達工業社製)を使用できる。緩衝液はpH3〜10のも
のならいずれでもよい。例えば、トリス−HCl又はリ
ン酸緩衝液が使用できる。 11)次いでこの画分に蛋白分解酵素を加え、37℃で
2時間以上インキュベージョンして残存蛋白質を分解
し、得られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により
濃縮する。なお、この際に使用する蛋白分解酵素も特定
なものである必要はなく、例えば、V8プロテアーゼ、
キモトリプシン、トリプシン、サーモライシンが単独
で、或は任意に組み合わせて使用できる。市販品として
は、例えば、プロナーゼE(科研化学社)、プロティネ
ースK(メルク社)を使用できる。 12)次いでこの画分を常法に従って、例えば、米国フ
ァルマシア社製のFPLCシステムでファルマシア社製
のモノQ−セファロース(Sepharose)、Q−
セファロース(Sepharose)を使用して陰イオ
ン交換クロマトグラフィーに付してリムラステスト陽性
画分を得る。 13)次いで、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に付
してリムラステスト陽性画分を回収する。 以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約20%が回収され、純度約95%の精製標品
が得られる。又、段階1)終了時の純度に比べ約100
0倍の純度(小麦種子の場合)になる。以上の方法によ
って得られたリムラステスト陽性植物LPSはそのま
ま、或いは任意の程度に濃縮した形で提供できる。又、
保存性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾燥などの任意
の手段により乾燥粉末として提供することもできる。こ
れらはいずれも常法で生産できる。
お、本明細書に記載した植物が帰属する科名、属名は、
次の文献の記載を照合して決定された。 裸子植物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類:昭
和57年(正編)、昭和58年(続編)に北隆館から発
行された「原色牧野植物大図鑑」の記載を照合して所属
を決定した。但し、「燕麦」は、昭和45年に女子栄養
大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭和5
8年に至文堂から発行された「新日本植物誌顕花篇」の
記載を照合し、「裸麦」は、昭和46年に東京同文書院
から発行された「総合食品事典」の記載を照合し、「鳩
麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウコ
ン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダ
ミ」、「胡椒」、「トウガラシ」、「ダイウイキョ
ウ」、「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾ
ウ」、「オタネニンジン」、「ボウフウ」、「オオツヅ
ラフジ」、「ウンカリア・ヒルスタ」は、昭和63年に
北隆館から発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記
載を照合し、「アボガド」は、昭和53年に財団法人農
林統計協会から発行された熱帯農業技術叢書第15号
「ブラジルの果実」の記載を照合し、「カイワレダイコ
ン」は、昭和59年に北隆館から発行された「原色園芸
植物大図鑑」の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和4
4年に廣川書店から発行された「図説熱帯植物集成」の
記載を照合し、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品
協会が昭和61年に公示した、「クロレラ規格基準」の
記載を照合して所属を決定した。 菌類:昭和62年に保育社から発行された「原色日本新
菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し、酵
母は、昭和37年に技報堂から発行された「微生物学ハ
ンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前掲の
「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属を決
定した。 本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。裸子植物
としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマツを使用
できる。単子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属
植物であるイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ
科オオムギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属
植物である鳥麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクマ
笹、イネ科ジュズダマ属植物である鳩麦、アヤメ科アヤ
メ属植物であるアヤメ、ユリ科ネギ属植物であるニンニ
ク、ユリ科キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ
科ジャノヒゲ属植物であるジャノヒゲ、ショウガ科ショ
ウガ属植物であるミョウガ、ショウガ科ウコン属植物で
あるウコン、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシ
ャクを使用できる。双子葉類植物としては、マメ科ダイ
ズ属植物である大豆、マメ科インゲンマメ属植物である
小豆、マメ科ソラマメ属植物であるそら豆、マメ科クズ
属植物であるクズ、マメ科カンゾウ属植物であるナンキ
ンカンゾウ、ナス科ナス属植物であるジャカイモ、トウ
ガラシ、ナス科トマト属植物であるトマト、ナス科トウ
ガラシ属植物であるトウガラシ、バラ科ビワ属植物であ
るビワ、バラ科サクラ属植物であるモモ、クスノキ科ア
ボガド属植物であるアボガド、クルミ科クルミ属植物で
あるクルミ、ウリ科トウナス属植物であるカボチャ、ウ
リ科アマチャヅル属植物であるアマチャヅル、アブラナ
科ダイコン属植物であるカイワレダイコン、マタタビ科
マタタビ属植物であるマタタビ、ドクダミ科ドクダミ属
植物であるドクダミ、コショウ科コショウ属植物である
胡椒、シキミ科シキミ属植物であるダイウイキョウ、ニ
クズク科ニクズク属植物であるニクズク、ミカン科ミカ
ン属植物であるダイダイ、ウコギ科オタネニンジン属植
物であるオタネニンジン、セリ科サボシュニコビア属植
物であるボウフウ、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物
であるオオツヅラフジ、アカネ科カギカズラ属植物であ
るウンカリア・ヒルスタを使用できる。シダ植物として
は、例えば、トクサ科トクサ属植物であるスギナ、ゼン
マイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを使用できる。ソ
ウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ類
植物、緑ソウ類植物、ランソウ類植物を使用できる。カ
ッソウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植物
であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、ホ
ンダワラ科ヒジキ属植物であるヒジキを使用できる。紅
ソウ類植物としては、例えば、ウシケノリ科アマノリ属
植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物と
しては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物であ
るクロレラを使用できる。菌類植物としては、例えば、
担子菌類植物、子ノウ菌類植物を使用できる。担子菌類
植物としては、例えば、ヒラタケ科マツオウジ属植物で
ある椎茸、キシメジ科エノキタケ属植物であるエノキ
茸、キシメジ科シメジ属植物であるシメジ、タコウキン
科マイタケ属植物であるマイ茸、サルノコシカケ科ポリ
ポラス属植物であるアワビ茸、ハラタケ科ハラタケ属植
物であるマッシュルーム、キクラゲ科キクラゲ属植物で
あるキクラゲ、モエギタケ科スギタケ属植物であるナメ
コを使用できる。子ノウ菌類植物としては、例えば、エ
ンドミセタセア科サッカロミセス属植物であるパン酵
母、醸造用酵母を使用できる。醸造用酵母にはビール酵
母、清酒酵母、葡萄酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の
他、サッカロミセス セレヴイシドに属する多くの酵母
(例えば、ウイスキーや老酒の製造に使用される酵母)
が含まれる。又、バッカクキン科ノムシタケ属植物であ
る冬虫夏草も使用できる。植物源LPSは、以下に述べ
る方法で分離、精製できる。 1)原料植物を必要に応じて適宜細切、乾燥、粉砕した
後に蒸留水によく懸濁し、上清を回収する。例えば、原
料植物が穀類の種子である場合は、種皮をつけたまま、
或は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は、食用に供
せられている程度の粉末になるまで粉砕し、得られた粉
末に水を加えて分散液とし、攪拌した後に沈降物を静置
又は遠心分離により除去するか、粉末に水を加えて練っ
て得られるドウをミキサー中でゆるやかに水洗し、沈降
物を除去すればよい。原料植物がクロレラである場合に
は、まず細胞膜を破砕し、エタノール洗浄により脂溶性
物質を除去した後に水抽出するとよい。この水抽出の際
の原料植物の粒度、水の温度、液性、添加量、攪拌の速
度、時間、遠心分離の際の条件等は特に制限する必要は
なく、原料植物の種類に応じて適宜調整すればよい。
又、抽出水の温度は高い方がLPSの採取量、純度とも
に高い傾向があるが、操作の便宜上、原料植物に含まれ
る澱粉の糊化を招来しない50℃以下とすることが好ま
しい。又、水の添加量は、原料植物の種類、粒度により
異なるが、穀類種子の場合にはその割合が70w/v%
以下、望ましくは20〜50w/v%程度とすると操作
上便利である。更に、攪拌の速度は、起泡を引き起こさ
ない程度のものとすることが好ましい。なお、この段階
の操作迄で、本発明のリムラステスト陽性植物LPSの
純度は、リムラステスト活性データから判断して、例え
ば小麦種子の場合には約30倍に上昇する。以下、穀類
種子を原料として使用する場合を例にとり説明するが、
いわゆる当業者であれば、以下の記載を参考にして、他
植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリムラステスト
陽性LPSを高純度で回収する方法を実施することは極
めて容易である。 2)純度を更に上げるためには、上記1で得られた上清
を常法に従って限外雄過に付して分子量5000以下の
画分を除去すればよい。 3)得られた乾燥品を、50mg/mlになるように蒸
留水に懸濁し、遠心分離操作に付して上清を回収する。 4)この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にする
と沈殿が生じる。この際使用する酸は特定のものである
必要はなく、例えば、トリクロロ酢酸(以下、TCAと
称す)、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロ
酢酸が使用できる。 5)次いで、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留
水で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収す
る。 6)沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカ
リを加える。この際使用するアルカリも特定のものであ
る必要はなく、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムが使
用できる。沈殿の溶解時に塩基性がpH11より大きく
なると目的のLPSが失活するので注意が必要である。 7)次いで酸を加えてpH8としてから37℃に加温
し、更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、3
7℃に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付
す。なお、この際使用する酸も特定のものである必要は
ない。 8)上清を回収して氷冷し、4℃で再び遠心分離操作に
付す。 9)上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に
従って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも
特定のものである必要はない。 10)次いで常法に従ってゲル濾過に付して、リムラス
テスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾過用の担体と
しては、例えばセファデックス(Sephadex)G
−75、G−100、セファクリル(Sephacry
l)S−200、セファロース(Sepharose)
6B[以上は米国ファルマシア社(Pharmacia
Inc.)製]、バイオゲル(Biogel)P−1
00[米国バイオラッド(Biorad Inc.)社
製]、トーヨーパールHW−50、HW−55(東洋曹
達工業社製)を使用できる。緩衝液はpH3〜10のも
のならいずれでもよい。例えば、トリス−HCl又はリ
ン酸緩衝液が使用できる。 11)次いでこの画分に蛋白分解酵素を加え、37℃で
2時間以上インキュベージョンして残存蛋白質を分解
し、得られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により
濃縮する。なお、この際に使用する蛋白分解酵素も特定
なものである必要はなく、例えば、V8プロテアーゼ、
キモトリプシン、トリプシン、サーモライシンが単独
で、或は任意に組み合わせて使用できる。市販品として
は、例えば、プロナーゼE(科研化学社)、プロティネ
ースK(メルク社)を使用できる。 12)次いでこの画分を常法に従って、例えば、米国フ
ァルマシア社製のFPLCシステムでファルマシア社製
のモノQ−セファロース(Sepharose)、Q−
セファロース(Sepharose)を使用して陰イオ
ン交換クロマトグラフィーに付してリムラステスト陽性
画分を得る。 13)次いで、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に付
してリムラステスト陽性画分を回収する。 以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約20%が回収され、純度約95%の精製標品
が得られる。又、段階1)終了時の純度に比べ約100
0倍の純度(小麦種子の場合)になる。以上の方法によ
って得られたリムラステスト陽性植物LPSはそのま
ま、或いは任意の程度に濃縮した形で提供できる。又、
保存性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾燥などの任意
の手段により乾燥粉末として提供することもできる。こ
れらはいずれも常法で生産できる。
【0008】リムラステスト陽性細菌源LPS 従来より知られている大腸菌LPS、アルカリゲネス
ラディオバクター(A.radiobactor)から
得られるLPS[ピー.エイチ.グラハム(P.H.G
raham)、エム,エイ.オーブリエン(M.A.
O’Brien)共著、”アントニック ファン リー
ウヴェンホック(Antonicvan Leeuwe
nhock)、vol.34、326〜330頁(19
68年):本明細書の他の箇所では、A.ラディオバク
ターLPSと称す]、百日咳菌LPS、リピドA等の
他、本明細書で追って詳述する細菌源LPS1、LPS
2、LPS3及びそれらの合成LPSが該当する。大腸
菌LPSは、例えば、米国ディフコ(Difco)社か
ら市販されている。百日咳菌LPSは、例えば、フナコ
シ薬品(日本)から市販されている。又、公知の百日咳
菌、例えば、東浜株1相菌の死菌体から、例えば、下記
文献記載の公知方法により調製することもできる。ウエ
ブスター(Webster)等著の「ジャーナル オブ
イミュノロジー(Journal of Immun
ology)、744、55(1955);ウェストフ
ァル(Westphal)等著の「ツェト.ナツールフ
ォルシュ(Z.Naturforsch)」、76、1
48(1952)。リピドAは、例えば、第一化学薬品
から市販されている。上記菌源LPS1、LPS2、L
PS3をそれぞれ産生する3種の菌は、本発明者等が検
討した小麦からはその産地、種類を問わず分離されてい
る。従って、いずれの産地、種類の小麦及びその加工品
からも分離されると推定される。本発明者等がそれら3
種の細菌を分離できることを確認した小麦粉の産地、種
類は次の通りである。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノーザン・スプリングス 米国 1・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本 上記細菌からLPS1、LPS2、LPS3を分離する
には、ウェストファル(Westphal)等が「メソ
ッズ イン カーボハイドレート ケミストリ−(Me
thods in Carbohydrate Che
mistry)のvol.V[米国ニューヨークのアカ
デミック プレス(AcademicPress)社が
1965年に発行]の83頁に記載した熱フェノール法
を用い、更に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即
ち、菌体を蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フ
ェノールと共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層を
回収し、この水層を透析に付してフェノールを除去し、
限外濾過により濃縮して粗LPS画分を得、この画分を
常法に従い、例えば、ファルマシア社製のFPLCシス
テムでファルマシア社製のモノQ−セファロース(Se
pharose)、Q−セファロース(Sepharo
se)を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付
して精製し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上
の操作により、純度96%以上の精製標品が得られる。
原料中のリムラステスト陽性LPSの検出、含量測定
は、後記実験例1に詳述する通り、例えば、生化学工業
株式会社からトキシカラ−システムという名称で市販さ
れている試薬セットを使用して実施できる。即ち、原料
植物を同システムのLS−1セットと合わせて発色さ
せ、その発色の強さを、同じく同セットのEt−2セッ
トを使用して作成した検量線と対比させればよい。糖は
フェノール−硫酸法[エム.デユボイス(M.Dubo
is)等著、アナリテイカル ケミストリ(Analy
tical Chemistry)、vol.28、3
50頁、1956年]で、蛋白はローリー法[オー.エ
イチ.ローリー(O.H.Lowry)等著、ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリ(Journa
l of Biological Chemistr
y)]、vol.193、65頁、1951年]で測定
した。
ラディオバクター(A.radiobactor)から
得られるLPS[ピー.エイチ.グラハム(P.H.G
raham)、エム,エイ.オーブリエン(M.A.
O’Brien)共著、”アントニック ファン リー
ウヴェンホック(Antonicvan Leeuwe
nhock)、vol.34、326〜330頁(19
68年):本明細書の他の箇所では、A.ラディオバク
ターLPSと称す]、百日咳菌LPS、リピドA等の
他、本明細書で追って詳述する細菌源LPS1、LPS
2、LPS3及びそれらの合成LPSが該当する。大腸
菌LPSは、例えば、米国ディフコ(Difco)社か
ら市販されている。百日咳菌LPSは、例えば、フナコ
シ薬品(日本)から市販されている。又、公知の百日咳
菌、例えば、東浜株1相菌の死菌体から、例えば、下記
文献記載の公知方法により調製することもできる。ウエ
ブスター(Webster)等著の「ジャーナル オブ
イミュノロジー(Journal of Immun
ology)、744、55(1955);ウェストフ
ァル(Westphal)等著の「ツェト.ナツールフ
ォルシュ(Z.Naturforsch)」、76、1
48(1952)。リピドAは、例えば、第一化学薬品
から市販されている。上記菌源LPS1、LPS2、L
PS3をそれぞれ産生する3種の菌は、本発明者等が検
討した小麦からはその産地、種類を問わず分離されてい
る。従って、いずれの産地、種類の小麦及びその加工品
からも分離されると推定される。本発明者等がそれら3
種の細菌を分離できることを確認した小麦粉の産地、種
類は次の通りである。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノーザン・スプリングス 米国 1・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本 上記細菌からLPS1、LPS2、LPS3を分離する
には、ウェストファル(Westphal)等が「メソ
ッズ イン カーボハイドレート ケミストリ−(Me
thods in Carbohydrate Che
mistry)のvol.V[米国ニューヨークのアカ
デミック プレス(AcademicPress)社が
1965年に発行]の83頁に記載した熱フェノール法
を用い、更に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即
ち、菌体を蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フ
ェノールと共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層を
回収し、この水層を透析に付してフェノールを除去し、
限外濾過により濃縮して粗LPS画分を得、この画分を
常法に従い、例えば、ファルマシア社製のFPLCシス
テムでファルマシア社製のモノQ−セファロース(Se
pharose)、Q−セファロース(Sepharo
se)を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付
して精製し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上
の操作により、純度96%以上の精製標品が得られる。
原料中のリムラステスト陽性LPSの検出、含量測定
は、後記実験例1に詳述する通り、例えば、生化学工業
株式会社からトキシカラ−システムという名称で市販さ
れている試薬セットを使用して実施できる。即ち、原料
植物を同システムのLS−1セットと合わせて発色さ
せ、その発色の強さを、同じく同セットのEt−2セッ
トを使用して作成した検量線と対比させればよい。糖は
フェノール−硫酸法[エム.デユボイス(M.Dubo
is)等著、アナリテイカル ケミストリ(Analy
tical Chemistry)、vol.28、3
50頁、1956年]で、蛋白はローリー法[オー.エ
イチ.ローリー(O.H.Lowry)等著、ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリ(Journa
l of Biological Chemistr
y)]、vol.193、65頁、1951年]で測定
した。
【0009】LPSがマクロファージのインビトロTN
F産生能を活性化する能力の測定方法 動物体内にTNFを産生させるためには、産生前駆(プ
ライミング)段階と産生開始(トリガリング)段階とが
必要であることは、カーズウェル(Carswell)
らにより、プロシーディング オブ ナショナル アカ
デミー サイエンス オブ ユーエスエー[Proce
eding of NationalAcademy
Science of USA.、72、3666〜3
670頁(1975年)]に報告されている。プライミ
ング段階開始のために投与される薬剤が「プライマー」
(内因性TNF産生促進剤)であり、トリガリング段階
開始のために投与される薬剤が「トリガー」(内因性T
NF産生剤)である。LPSがマクロファージのインビ
トロTNF産生能を活性化する能力を測定するには、マ
ウスのマクロファージ腹腔常在細胞を採取し、これにプ
ライマーとしての組み換えマウスIFN−γを添加し、
次いで、トリガーとしてのLPSを添加し、そのTNF
活性を測定すればよい。TNF活性は、L−929細胞
[プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
サイエンス オブ ユーエスエー 72、 3666〜
3670頁]に対する細胞毒性を基にして、次のように
して測定する。L929細胞を、5%仔牛胎児血清を加
えたイーグルミニマムエッセンシャル培地(以下、ME
M培地と表す)で育成し、8×104個の細胞が100
μlの同上培地に含まれる様にし、96穴の平底プレー
トで育種する。育種条件は37℃、2時間、5%CO2
であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。その
後、アクチノマイシンDを培地中に終濃度1μg/ml
となるように加え、培養液の液量を150μlとする。
即座に、検体を適当にMEM培地で稀釈したものを50
μl加える(この際稀釈率を適宜調製し、ED50を求
められる)。更に、最終液量200μlとなったL92
9細胞を上記条件で18時間培養する。細胞障害活性を
測定するには、まず全培地を除去し、ついで、0.1%
クリスタルバイオレットを含む1%メチルアルコール溶
液を加えて固定染色する。クリスタルバイオレットは全
有核細胞を染色するが、死細胞は染色後にプレート底面
より水洗で除去されるので、生存細胞の結果から細胞障
害活性を直接測定できる。この染色度をOD(590n
m)での吸光度を指標として測定し、対照群に対する染
色度と比較することで細胞障害活性を測定する。活性の
定義は次の様に行う。L929細胞が50%生存できる
検体の稀釈率(N)を求める。対照としてウサギTNS
[腫瘍障害血清(Tumor Necrosis Se
rum)]を使用し、このウサギTNSの活性n(単位
/ml)を2.4×106単位/mg/mlのTNF−
α(旭化成株式会社から入手した組換えヒト型TNF)
を用いて決定する。このウサギTNSのED50を与え
る稀釈率(C)を求める。検体活性(単位/ml)はN
/C × nで計算する。
F産生能を活性化する能力の測定方法 動物体内にTNFを産生させるためには、産生前駆(プ
ライミング)段階と産生開始(トリガリング)段階とが
必要であることは、カーズウェル(Carswell)
らにより、プロシーディング オブ ナショナル アカ
デミー サイエンス オブ ユーエスエー[Proce
eding of NationalAcademy
Science of USA.、72、3666〜3
670頁(1975年)]に報告されている。プライミ
ング段階開始のために投与される薬剤が「プライマー」
(内因性TNF産生促進剤)であり、トリガリング段階
開始のために投与される薬剤が「トリガー」(内因性T
NF産生剤)である。LPSがマクロファージのインビ
トロTNF産生能を活性化する能力を測定するには、マ
ウスのマクロファージ腹腔常在細胞を採取し、これにプ
ライマーとしての組み換えマウスIFN−γを添加し、
次いで、トリガーとしてのLPSを添加し、そのTNF
活性を測定すればよい。TNF活性は、L−929細胞
[プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
サイエンス オブ ユーエスエー 72、 3666〜
3670頁]に対する細胞毒性を基にして、次のように
して測定する。L929細胞を、5%仔牛胎児血清を加
えたイーグルミニマムエッセンシャル培地(以下、ME
M培地と表す)で育成し、8×104個の細胞が100
μlの同上培地に含まれる様にし、96穴の平底プレー
トで育種する。育種条件は37℃、2時間、5%CO2
であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。その
後、アクチノマイシンDを培地中に終濃度1μg/ml
となるように加え、培養液の液量を150μlとする。
即座に、検体を適当にMEM培地で稀釈したものを50
μl加える(この際稀釈率を適宜調製し、ED50を求
められる)。更に、最終液量200μlとなったL92
9細胞を上記条件で18時間培養する。細胞障害活性を
測定するには、まず全培地を除去し、ついで、0.1%
クリスタルバイオレットを含む1%メチルアルコール溶
液を加えて固定染色する。クリスタルバイオレットは全
有核細胞を染色するが、死細胞は染色後にプレート底面
より水洗で除去されるので、生存細胞の結果から細胞障
害活性を直接測定できる。この染色度をOD(590n
m)での吸光度を指標として測定し、対照群に対する染
色度と比較することで細胞障害活性を測定する。活性の
定義は次の様に行う。L929細胞が50%生存できる
検体の稀釈率(N)を求める。対照としてウサギTNS
[腫瘍障害血清(Tumor Necrosis Se
rum)]を使用し、このウサギTNSの活性n(単位
/ml)を2.4×106単位/mg/mlのTNF−
α(旭化成株式会社から入手した組換えヒト型TNF)
を用いて決定する。このウサギTNSのED50を与え
る稀釈率(C)を求める。検体活性(単位/ml)はN
/C × nで計算する。
【0010】提供できる剤の製造方法 本発明の発育促進剤は、常法の製剤技術により、散剤、
顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、
貼付剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、坐剤、
注射剤、薬浴剤等の形態で提供できる。又、動物用とし
ては、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加
剤として調製することもできる。飼料添加剤とする場合
には、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミ
ックス製剤とは、飼料との混合を容易にするために澱粉
などの飼料成分で希釈されたものを指す。本発明の発育
促進剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添加でき
る飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。又、ミ
ネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼料
であってもよい。これら製剤には、所望ならば、保存
性、均質性を保持するために、常法により賦形剤、保存
剤、緩衝剤等の添加剤を加えることもできる。更に、矯
味剤、矯臭剤、着色剤を含めることもできる。賦形剤と
しては、例えば、乳糖、デンプンが使用できる。保存剤
としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオ
キシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等の
パラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸ナトリウ
ム、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プ
ロピルパラベン等が使用できる。緩衝剤としては、例え
ば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用できる。
顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、
貼付剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、坐剤、
注射剤、薬浴剤等の形態で提供できる。又、動物用とし
ては、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加
剤として調製することもできる。飼料添加剤とする場合
には、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミ
ックス製剤とは、飼料との混合を容易にするために澱粉
などの飼料成分で希釈されたものを指す。本発明の発育
促進剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添加でき
る飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。又、ミ
ネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼料
であってもよい。これら製剤には、所望ならば、保存
性、均質性を保持するために、常法により賦形剤、保存
剤、緩衝剤等の添加剤を加えることもできる。更に、矯
味剤、矯臭剤、着色剤を含めることもできる。賦形剤と
しては、例えば、乳糖、デンプンが使用できる。保存剤
としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオ
キシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等の
パラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸ナトリウ
ム、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プ
ロピルパラベン等が使用できる。緩衝剤としては、例え
ば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用できる。
【0011】発育促進効果の確認 本発明の発育促進効果は、マウスに投与し、増体効果を
調べることにより確認した。以下、実施例、製造例、実
験例により、本発明を更に詳細に説明する。なお、それ
らで使用された「大腸菌LPS]は、米国ディフコ(D
ifco)社製0128:B8である。
調べることにより確認した。以下、実施例、製造例、実
験例により、本発明を更に詳細に説明する。なお、それ
らで使用された「大腸菌LPS]は、米国ディフコ(D
ifco)社製0128:B8である。
【0012】製造例1(小麦LPSの製造) 1)小型ニーダに、1.09%の灰分を含む硬質小麦粉
(アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング)
(3,120g)を入れ、2.03リットルの蒸留水を
加えて10分間練ってドウとした。15分間の静置後に
10リットルの水を加えてゆるやかに攪拌してデンプン
乳液を洗い出し、同時に可溶性成分を溶出させた。この
溶出液を5℃の冷蔵庫中で12時間静置した後、デンプ
ン等の沈降部を除去した。上清を凍結乾燥して201.
1gの粉末を得た(粉末A)。更に、残留ドウに5リッ
トルの蒸留水を加えてゆるやかに攪拌し、以下、上記と
同様に処理して40.1gの粉末を得た(粉末B)。 2)これら粉末A、Bを米国アミコン社製限外濾過機H
F−Lab1に供し、分子量画分5,000については
中空系カートリッジHF−Lab1PM5を、分子量画
分10,000については中空系カートリッジHF−L
ab1PM10を取り付けて限外濾過を行った[温度5
〜10℃。入圧25psi(1.76kg/cm2)、
出圧15psi(1.06kg/cm2)]。その結果
に基づき各部分を次のように命名した。 粉末A:分子量5,000以下の部分をa1 分子量5,000以上の部分をa2 粉末B:分子量5,000以下の部分をb1 分子量5,000以上の部分をb2 粉末A:分子量10,000以下の部分をa3 分子量10,000以上の部分をa4 粉末B:分子量10,000以下の部分をb3 分子量10,000以上の部分をb4 これら各画分を後記実験例1に詳述する方法に準拠し
てリムラステストに付したら、分子量5,000以上の
画分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、
分子量5,000以下の画分にはほとんど存在しないこ
とが確認された。 3)上記粉末a2の30gを1リットル三角フラスコに
入れ、600mlの蒸留水を注いで、60分間スターラ
ーで攪拌した後、日立冷却高速遠心機SCR−20B
(ローターRPR16を事前に4℃に冷却しておいた)
で4℃で遠心分離操作(10,000G×10分)に付
して上清を回収した。 4)この上清を1リットル三角フラスコに入れ、氷冷下
(液温約2℃)、スターラーで攪拌しながら、事前に2
℃に冷却してあった100%TCA水溶液20.5ml
を滴下し、滴下終了後氷水中に10分間放置した。 5)次いで前記と同様にして4℃で遠心分離操作(1
0,000G×10分)に付して沈殿を回収し、氷水中
で冷却下、300mlの蒸留水と共に500mlのビー
カーに入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様にし
て4℃で遠心分離操作(10,000G×10分)に付
して沈殿を回収した。 6)この沈殿を1リットルビーカーに入れ、蒸留水50
0mlで懸濁し、1N水酸化ナトリウム溶液約3.5m
lを使用して中和(pH7)し、ついで、氷水中で冷却
しながら、1N水酸化ナトリウム溶液約2mlを添加し
て0.02N水酸化ナトリウム溶液になるようにして沈
殿を溶解した。 7)1N塩酸約1.5mlを加えてpH8とし、次いで
100mlの蒸留水を加えた後に1リットル三角フラス
コに移して37℃のインキュベーター内で30分間ゆっ
くり振とうした。 8)100%TCA水溶液30mlを加えて混合した
後、37℃のインキュベーター内で10分間ゆっくり振
とうしてから、約37℃に保温した遠心分離器トミーC
D100R(トミー精器社製)を使用して遠心分離操作
(3,000G×10分)に付した。 9)上清を回収して氷冷し、4℃で遠心分離操作(1
0,000G×10分)に付した。 10)上清を回収して10N水酸化ナトリウム溶液約
3.6mlで中和してpH7とし、限外濾過器(東洋濾
紙UHP−150、フィルター:UK−10、N2圧:
4.0kg/cm2)で濃縮した。 11)得られた濃縮液60mlを、セファロース(Se
pharose)6Bカラム[米国ファルマシア社(P
harmacia Inc.)製、カラムサイズ:5c
m(内径)×100cm(2リットル)]を使い、ゲル
濾過[緩衝液:10mMトリス−HCl/10mMNa
Cl(pH7.5)、流速:60ml/時]に付して、
各20mlの画分を得た。 12)初めから43番目から56番自迄の画分280m
lを併せ、プロナーゼE(科研化学社)450μgを加
え、振とう下、37℃に2時間保温した後に、限外濾過
器(東洋濾紙UHP−62、フィルター:UK−10、
N2圧:4.0kg/cm2)で濃縮した。次いで、フ
ァルマシア社製FPLCシステム(カラム:モノQHR
10/10)を使って陰イオン交換クロマトグラフィー
に付した。即ち、10mMトリス−HCl(pH7.
5)と10mMのNaClを含む緩衝液で試料をカラム
に付した後、上記緩衝液でNaCl量が165mMに増
加された組成を持つ緩衝液(200ml)でカラムを洗
った。次いで、NaCl濃度を、165mMから1Mの
NaCl濃度勾配になるように増加させながら全量40
0mlで目的LPSを溶出させ、各2mlの画分を回収
した。リムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をか
けてから5〜8番目の画分を併せて、LPS純度約92
%の8ml[LPS:3.03mg(後記実験例1記載
の方法で測定したリムラステスト陽性LPS換算値であ
る。以下のLPS量も全てこの換算値である)、糖:
0.23mg、蛋白:0.04mg]を回収した。 13)次いでその8mlを、セファデックス(Seph
adex)G−25[カラム:2.0cm(内径)×2
0.2cm(66ml)]を使ってゲル濾過(緩衝液:
水)に付して各3mlの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第9〜12番目の画分を併せて、L
PS純度約95%の12ml(LPS:2.7mg、
糖:0.18mg、蛋白:0.03mg)を回収した。
なお、この画分は、陰イオン交換クロマトグラフィーに
より酸性であることを確認した。 14)上記画分を−80℃で凍結後に恒量になるまで凍
結乾燥し、重量を測定したら0.75mgあった。(以
下、この凍結乾燥標品を小麦LPSと称す)この小麦L
PSのリムラス活性を後記実験例1記載の方法で測定し
たら2.7mgに相当するので、その比活性は 2.7
÷0.75=3.6になる。また、夾雑物として存在し
得る単独の糖は、以上の精製により実質上全て除去され
たと考えられるので、検出された糖は全て、小麦LPS
を構成している糖と考えられる。従って、この段階での
小麦LPSの純度を重量に基づいて計算すると 蛋白=0.03mg LPS=0.75−0.03=0.72mg だから、 0.72÷0.75×100=96(%) である。
(アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング)
(3,120g)を入れ、2.03リットルの蒸留水を
加えて10分間練ってドウとした。15分間の静置後に
10リットルの水を加えてゆるやかに攪拌してデンプン
乳液を洗い出し、同時に可溶性成分を溶出させた。この
溶出液を5℃の冷蔵庫中で12時間静置した後、デンプ
ン等の沈降部を除去した。上清を凍結乾燥して201.
1gの粉末を得た(粉末A)。更に、残留ドウに5リッ
トルの蒸留水を加えてゆるやかに攪拌し、以下、上記と
同様に処理して40.1gの粉末を得た(粉末B)。 2)これら粉末A、Bを米国アミコン社製限外濾過機H
F−Lab1に供し、分子量画分5,000については
中空系カートリッジHF−Lab1PM5を、分子量画
分10,000については中空系カートリッジHF−L
ab1PM10を取り付けて限外濾過を行った[温度5
〜10℃。入圧25psi(1.76kg/cm2)、
出圧15psi(1.06kg/cm2)]。その結果
に基づき各部分を次のように命名した。 粉末A:分子量5,000以下の部分をa1 分子量5,000以上の部分をa2 粉末B:分子量5,000以下の部分をb1 分子量5,000以上の部分をb2 粉末A:分子量10,000以下の部分をa3 分子量10,000以上の部分をa4 粉末B:分子量10,000以下の部分をb3 分子量10,000以上の部分をb4 これら各画分を後記実験例1に詳述する方法に準拠し
てリムラステストに付したら、分子量5,000以上の
画分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、
分子量5,000以下の画分にはほとんど存在しないこ
とが確認された。 3)上記粉末a2の30gを1リットル三角フラスコに
入れ、600mlの蒸留水を注いで、60分間スターラ
ーで攪拌した後、日立冷却高速遠心機SCR−20B
(ローターRPR16を事前に4℃に冷却しておいた)
で4℃で遠心分離操作(10,000G×10分)に付
して上清を回収した。 4)この上清を1リットル三角フラスコに入れ、氷冷下
(液温約2℃)、スターラーで攪拌しながら、事前に2
℃に冷却してあった100%TCA水溶液20.5ml
を滴下し、滴下終了後氷水中に10分間放置した。 5)次いで前記と同様にして4℃で遠心分離操作(1
0,000G×10分)に付して沈殿を回収し、氷水中
で冷却下、300mlの蒸留水と共に500mlのビー
カーに入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様にし
て4℃で遠心分離操作(10,000G×10分)に付
して沈殿を回収した。 6)この沈殿を1リットルビーカーに入れ、蒸留水50
0mlで懸濁し、1N水酸化ナトリウム溶液約3.5m
lを使用して中和(pH7)し、ついで、氷水中で冷却
しながら、1N水酸化ナトリウム溶液約2mlを添加し
て0.02N水酸化ナトリウム溶液になるようにして沈
殿を溶解した。 7)1N塩酸約1.5mlを加えてpH8とし、次いで
100mlの蒸留水を加えた後に1リットル三角フラス
コに移して37℃のインキュベーター内で30分間ゆっ
くり振とうした。 8)100%TCA水溶液30mlを加えて混合した
後、37℃のインキュベーター内で10分間ゆっくり振
とうしてから、約37℃に保温した遠心分離器トミーC
D100R(トミー精器社製)を使用して遠心分離操作
(3,000G×10分)に付した。 9)上清を回収して氷冷し、4℃で遠心分離操作(1
0,000G×10分)に付した。 10)上清を回収して10N水酸化ナトリウム溶液約
3.6mlで中和してpH7とし、限外濾過器(東洋濾
紙UHP−150、フィルター:UK−10、N2圧:
4.0kg/cm2)で濃縮した。 11)得られた濃縮液60mlを、セファロース(Se
pharose)6Bカラム[米国ファルマシア社(P
harmacia Inc.)製、カラムサイズ:5c
m(内径)×100cm(2リットル)]を使い、ゲル
濾過[緩衝液:10mMトリス−HCl/10mMNa
Cl(pH7.5)、流速:60ml/時]に付して、
各20mlの画分を得た。 12)初めから43番目から56番自迄の画分280m
lを併せ、プロナーゼE(科研化学社)450μgを加
え、振とう下、37℃に2時間保温した後に、限外濾過
器(東洋濾紙UHP−62、フィルター:UK−10、
N2圧:4.0kg/cm2)で濃縮した。次いで、フ
ァルマシア社製FPLCシステム(カラム:モノQHR
10/10)を使って陰イオン交換クロマトグラフィー
に付した。即ち、10mMトリス−HCl(pH7.
5)と10mMのNaClを含む緩衝液で試料をカラム
に付した後、上記緩衝液でNaCl量が165mMに増
加された組成を持つ緩衝液(200ml)でカラムを洗
った。次いで、NaCl濃度を、165mMから1Mの
NaCl濃度勾配になるように増加させながら全量40
0mlで目的LPSを溶出させ、各2mlの画分を回収
した。リムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をか
けてから5〜8番目の画分を併せて、LPS純度約92
%の8ml[LPS:3.03mg(後記実験例1記載
の方法で測定したリムラステスト陽性LPS換算値であ
る。以下のLPS量も全てこの換算値である)、糖:
0.23mg、蛋白:0.04mg]を回収した。 13)次いでその8mlを、セファデックス(Seph
adex)G−25[カラム:2.0cm(内径)×2
0.2cm(66ml)]を使ってゲル濾過(緩衝液:
水)に付して各3mlの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第9〜12番目の画分を併せて、L
PS純度約95%の12ml(LPS:2.7mg、
糖:0.18mg、蛋白:0.03mg)を回収した。
なお、この画分は、陰イオン交換クロマトグラフィーに
より酸性であることを確認した。 14)上記画分を−80℃で凍結後に恒量になるまで凍
結乾燥し、重量を測定したら0.75mgあった。(以
下、この凍結乾燥標品を小麦LPSと称す)この小麦L
PSのリムラス活性を後記実験例1記載の方法で測定し
たら2.7mgに相当するので、その比活性は 2.7
÷0.75=3.6になる。また、夾雑物として存在し
得る単独の糖は、以上の精製により実質上全て除去され
たと考えられるので、検出された糖は全て、小麦LPS
を構成している糖と考えられる。従って、この段階での
小麦LPSの純度を重量に基づいて計算すると 蛋白=0.03mg LPS=0.75−0.03=0.72mg だから、 0.72÷0.75×100=96(%) である。
【0013】小麦LPSの物性 15)分子量 小麦LPSを蒸留水に溶解して1mg/ml溶液を調製
し、その4μlを1.5mlのトレフチューブに入れ
た。これに、別途、1mMのEDTAに2.5%SD
S、5%メルカプトエタノール、10mMトリス塩酸
(pH8.0)を加えて調製したSDS処理液1μlを
加え、この混液を3分間沸騰水に浸した。ファルマシア
社製のファストシステム(Phast System)
を使用し、電極との間にSDS−バッファー ストリッ
プ(Buffer Strip)(ファルマシア社製)
が介在せられた1μlの上記混液をゲル[ファルマシア
社製のファスト ゲル グラディエント(Phast
Gel Gradient 8−25)]に塗付し、最
大電圧250v、最大電流10mAにセットして泳動を
開始させた(本明細書でこの泳動法をSDS−1法と称
する)。泳動終了後、クマシー染色と銀染色における挙
動を観察した。クマシー染色では、染色液としてファル
マシア製の0.1%ファスト ゲルブルー(Phast
Gel Blue)Rを、脱色液として、メタノー
ル:酢酸:蒸留水(容量比3:1:6)混液を使い、次
の順序で染色・脱色した。 1:50℃で8分間染色 2:50℃で5分間脱色 3:50℃で8分間染色 4:50℃で10分間脱色 5:50℃で5分間保護(グリセロール、酢酸、蒸留水
の容量比5:10:85混液) 6:乾燥 銀染色は、次の順序で行った。 1:50℃で2分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比5:1:4混液)で処理 2:50℃で2分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 3:50℃で4分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 4:50℃で6分間、増感液(8.3%グルタルジアル
デヒド)で処理 5:50℃で3分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 6:50℃で5分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 7:50℃で2分間、洗浄液(脱イオン水)で処理 8:50℃で2分間、洗浄液(脱イオン水)で処理 9:40℃で13分間、0.25w/v%硝酸銀で処理 10:30℃で30秒間、洗浄液(脱イオン水)で処理 11:30℃で30秒間、洗浄液(脱イオン水)で処理 12:30℃で30秒間、現像液(0.04v/v%ホ
ルムアルデヒド+2.5w/v%炭酸ナトリウム洗浄
液)で処理 13:30℃で4分間、現像液(0.04v/v%ホル
ムアルデヒド+2.5w/v%炭酸ナトリウム洗浄液)
で処理 14:50℃で2分間、反応停止液(5%v/v%酢
酸)で処理 15:50℃で3分間、保護液(酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比10:8:85混液)で処理 16:乾燥 LPSは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子量8,00
0±1,000の位置に小麦LPSの主要染色帯が検出
された。別途、小麦LPSを蒸留水に溶解して2mg/
ml溶液を調製し、その10μlを1.5ml容プラス
チックチューブに入れた。これに、別途、180μlの
10%(w/v)SDS、45μlの5%β−メルカプ
トエタノール、90μlのCBB色素溶液、112.5
μlの0.5Mトリス塩酸(pH6.8)及び22.5
μlの蒸留水を加えて調製したSDS処理液10μlを
加えてよく混合し、次いで5分間沸騰水浴中に浸し、こ
の加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。10mlの1
0%(w/v)SDS、17.9gのトリシン及び3.
03gのトリスを1リットルの蒸留水に溶解して調製し
た泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気泳動槽に
入れた。20%ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定
し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を50vに1時間、
次いで、150vに固定して、色素がゲルより溶出する
まで泳動を続けた(本明細書においてこの泳動法をSD
S−2法と称する)。泳動終了後に、バイオラッド社の
銀染色キット161−0443を使い銀染色を室温で行
って、挙動を確認した。結果、分子量8,000±1,
000、5,000±2,000の位置に小麦LPSの
主要染色帯が検出された。なお、SDS−1法、SDS
−2法で、小麦LPSと同時に泳動させた蛋白分子量マ
ーカーは、ファルマシア社製のLMWキットE[ホスホ
リラーゼb(94k)、アルブミン(67k)、オブア
ルブミン(43k)、カーボニックアンヒトラーゼ(3
0k)、トリプシンインヒビター(20k)、α−ラク
トアルブミン(14k)]、ペプチド分子量マーカー
は、ファルマシア社製の1860−101分子量マーカ
ー[ミオグロビン(16.9k)、ミオグロビンI&I
I(14.4k)、ミオグロビンI(8.2k)、ミオ
グロビンII(6.0k)、ミオグロビンIV(2.5
k)]であった。 16)リン含有量 チェン−トリバラ(Chen−Toribara)法
[チェン等著、「アナリティカル ケミストリ(Ana
lytical Chemistry)、vol.2
8、1756〜1758頁(1956年)に準拠して次
の通りに行った。小麦LPSを蒸留水に溶解して、25
μgの小麦LPSを含む20μlの溶液を調製し、小試
験管に入れた。20μlの50v/v%硫酸を添加し、
160℃で2時間加熱した。次いで、20μlの10v
/v%過塩素酸を添加した後にガスバーナーで1分間加
熱して灰化させた。その後に0.5mlの蒸留水、次い
で0.5mlの反応試薬(1mlの6N硫酸、2mlの
蒸留水、2mlの2.5v/w%モリブデン酸アンモニ
ウム及び1mlの10v/w%のアスコルビン酸を混合
して調製し、その0.5mlを使用)を添加して室温で
30分間放置した後に、820nmでの吸光度(OD
820nm)を測定した。なお、検量線作製用の試料と
しては、リン酸二水素カリウム(和光純薬社製)を蒸留
水で希釈し、リン重量としてそれぞれ2.5μg、1μ
g、0.25μg、0μgを含む0.5mlの溶液を調
製して使用した。なお、リン1gはリン酸二水素カリウ
ム4.39gに相当する。得られた結果を表1に示す。
し、その4μlを1.5mlのトレフチューブに入れ
た。これに、別途、1mMのEDTAに2.5%SD
S、5%メルカプトエタノール、10mMトリス塩酸
(pH8.0)を加えて調製したSDS処理液1μlを
加え、この混液を3分間沸騰水に浸した。ファルマシア
社製のファストシステム(Phast System)
を使用し、電極との間にSDS−バッファー ストリッ
プ(Buffer Strip)(ファルマシア社製)
が介在せられた1μlの上記混液をゲル[ファルマシア
社製のファスト ゲル グラディエント(Phast
Gel Gradient 8−25)]に塗付し、最
大電圧250v、最大電流10mAにセットして泳動を
開始させた(本明細書でこの泳動法をSDS−1法と称
する)。泳動終了後、クマシー染色と銀染色における挙
動を観察した。クマシー染色では、染色液としてファル
マシア製の0.1%ファスト ゲルブルー(Phast
Gel Blue)Rを、脱色液として、メタノー
ル:酢酸:蒸留水(容量比3:1:6)混液を使い、次
の順序で染色・脱色した。 1:50℃で8分間染色 2:50℃で5分間脱色 3:50℃で8分間染色 4:50℃で10分間脱色 5:50℃で5分間保護(グリセロール、酢酸、蒸留水
の容量比5:10:85混液) 6:乾燥 銀染色は、次の順序で行った。 1:50℃で2分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比5:1:4混液)で処理 2:50℃で2分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 3:50℃で4分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 4:50℃で6分間、増感液(8.3%グルタルジアル
デヒド)で処理 5:50℃で3分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 6:50℃で5分間、洗浄液(エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比10:5:85混液)で処理 7:50℃で2分間、洗浄液(脱イオン水)で処理 8:50℃で2分間、洗浄液(脱イオン水)で処理 9:40℃で13分間、0.25w/v%硝酸銀で処理 10:30℃で30秒間、洗浄液(脱イオン水)で処理 11:30℃で30秒間、洗浄液(脱イオン水)で処理 12:30℃で30秒間、現像液(0.04v/v%ホ
ルムアルデヒド+2.5w/v%炭酸ナトリウム洗浄
液)で処理 13:30℃で4分間、現像液(0.04v/v%ホル
ムアルデヒド+2.5w/v%炭酸ナトリウム洗浄液)
で処理 14:50℃で2分間、反応停止液(5%v/v%酢
酸)で処理 15:50℃で3分間、保護液(酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比10:8:85混液)で処理 16:乾燥 LPSは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子量8,00
0±1,000の位置に小麦LPSの主要染色帯が検出
された。別途、小麦LPSを蒸留水に溶解して2mg/
ml溶液を調製し、その10μlを1.5ml容プラス
チックチューブに入れた。これに、別途、180μlの
10%(w/v)SDS、45μlの5%β−メルカプ
トエタノール、90μlのCBB色素溶液、112.5
μlの0.5Mトリス塩酸(pH6.8)及び22.5
μlの蒸留水を加えて調製したSDS処理液10μlを
加えてよく混合し、次いで5分間沸騰水浴中に浸し、こ
の加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。10mlの1
0%(w/v)SDS、17.9gのトリシン及び3.
03gのトリスを1リットルの蒸留水に溶解して調製し
た泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気泳動槽に
入れた。20%ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定
し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を50vに1時間、
次いで、150vに固定して、色素がゲルより溶出する
まで泳動を続けた(本明細書においてこの泳動法をSD
S−2法と称する)。泳動終了後に、バイオラッド社の
銀染色キット161−0443を使い銀染色を室温で行
って、挙動を確認した。結果、分子量8,000±1,
000、5,000±2,000の位置に小麦LPSの
主要染色帯が検出された。なお、SDS−1法、SDS
−2法で、小麦LPSと同時に泳動させた蛋白分子量マ
ーカーは、ファルマシア社製のLMWキットE[ホスホ
リラーゼb(94k)、アルブミン(67k)、オブア
ルブミン(43k)、カーボニックアンヒトラーゼ(3
0k)、トリプシンインヒビター(20k)、α−ラク
トアルブミン(14k)]、ペプチド分子量マーカー
は、ファルマシア社製の1860−101分子量マーカ
ー[ミオグロビン(16.9k)、ミオグロビンI&I
I(14.4k)、ミオグロビンI(8.2k)、ミオ
グロビンII(6.0k)、ミオグロビンIV(2.5
k)]であった。 16)リン含有量 チェン−トリバラ(Chen−Toribara)法
[チェン等著、「アナリティカル ケミストリ(Ana
lytical Chemistry)、vol.2
8、1756〜1758頁(1956年)に準拠して次
の通りに行った。小麦LPSを蒸留水に溶解して、25
μgの小麦LPSを含む20μlの溶液を調製し、小試
験管に入れた。20μlの50v/v%硫酸を添加し、
160℃で2時間加熱した。次いで、20μlの10v
/v%過塩素酸を添加した後にガスバーナーで1分間加
熱して灰化させた。その後に0.5mlの蒸留水、次い
で0.5mlの反応試薬(1mlの6N硫酸、2mlの
蒸留水、2mlの2.5v/w%モリブデン酸アンモニ
ウム及び1mlの10v/w%のアスコルビン酸を混合
して調製し、その0.5mlを使用)を添加して室温で
30分間放置した後に、820nmでの吸光度(OD
820nm)を測定した。なお、検量線作製用の試料と
しては、リン酸二水素カリウム(和光純薬社製)を蒸留
水で希釈し、リン重量としてそれぞれ2.5μg、1μ
g、0.25μg、0μgを含む0.5mlの溶液を調
製して使用した。なお、リン1gはリン酸二水素カリウ
ム4.39gに相当する。得られた結果を表1に示す。
【0014】
【表1】
【0015】表1において、小麦LPSのデータは、無
機リンの混入(例えば、リン酸緩衝液に由来する)によ
る誤差を避けるために、加熱処理をしていない対照のデ
ータを減じた値である。小麦LPSの分子量を8,00
0と仮定し、上表の結果に基づいてその1分子当たりの
リン数を次式により計算すると1〜4になる。
機リンの混入(例えば、リン酸緩衝液に由来する)によ
る誤差を避けるために、加熱処理をしていない対照のデ
ータを減じた値である。小麦LPSの分子量を8,00
0と仮定し、上表の結果に基づいてその1分子当たりの
リン数を次式により計算すると1〜4になる。
【0016】
【数1】
【0017】上記実験でリン数が1〜4と変動している
原因の1つとしては、精製段階でのモノフォスフォエス
テラーゼ混入で、リン酸が脱離したことも考えられる。 17)ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン(Elson−Morgan)法
(東京化学同人出版「生化学実験講座」No.4の37
7〜379頁)に準拠して次の通りに行った。小麦LP
Sを蒸留水に溶解して1mg/mlの溶液を調製し、そ
の100μlをスクリューキャップ付きスピッツ(イワ
キガラス社製)に入れ、これに100μlの8NHCl
を添加して110℃で16時間加熱した。4NNaOH
を約200μl添加してpH7とした。その100μl
を分取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入
れ、200μlの下記試薬Aを加えた後に、105℃で
1.5時間加熱し、次いで流水で冷却した。次いで、1
00μlを分取し、670μlの96%エタノールを加
え、更に、67μlの下記試薬Bを加えた後に室温で1
時間放置し、535nmで吸光度を測定した。検量線作
製用試料としては0.20〜200μg/mlのN−ア
セチル グルコサミン(和光純薬社製)を使用した。 (試薬A)75μlのアセチルアセトンと2.5mlの
1.25N炭酸ナトリウムを混合して調製。 (試薬B)1.6gのp−ジメチルベンズアルデヒドと
30mlの濃塩酸と30mlの96%エタノールを混合
して調製。 結果、小麦LPSのヘキソサミン数は6±2/分子(仮
定分子量8,000)だった。 18)脂肪酸含有量 90μlの小麦LPS蒸留水溶液(1mg/ml)に1
0μlの内部標準(0.55mMのマルガリン酸)を加
えた。1.0mlの0.5Mナトリウムメチラートを加
えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を行った。
室温で1時間放置後に960μlの0.5NHClを加
えて中和した。これに2mlのヘキサンを加えて15分
間激しく攪拌した。次いで、1,000gで5分間遠心
分離を行いヘキサン層を分取した。窒素ガスでヘキサン
を蒸発させて、約20μlになるまで濃縮した。このサ
ンプルをガスクロマトグラフィー[本体:島津社製のG
C8APF、キャピラリーカラム:カナダのスペルコ
(Spelco)社製FSCAP Sp2330、キャ
リヤーガス:窒素]に付して脂肪酸量を測定した。脂肪
酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の合成リピ
ドAである大腸菌型LA−15−PP(分子量2,00
0で、1分子中の脂肪酸数は6であることが知られてい
る)を用いた。結果、小麦LPSの脂肪酸数は6±2/
分子(仮定分子量8,000)であると推定された。上
記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添付
の図1〜図3に示す。図1は小麦LPSの、図2は大腸
菌LPSの、図3は百日咳菌LPSのチャートである。
図1〜図3において、図示されている主要ピーク番号に
対応する保持時間(分)は次の通りであった。 図1〜図3の比較により、小麦LPSのチャートは大腸
菌LPSのチャートに似ているが、百日咳菌LPSのも
のとは大きく異なることは明白である。 19)KDO含有量 KDO(2−ケト−3−デオキシオクトネート)含有量
をジフェニルアミン法[シャビ アール(Shaby
R.)等著、アナリティカル バイオケム(Analy
tical Biochem.)、58(1)、123
〜129頁(1974年)]に準拠して次の通りに行っ
た。500mgのジフェニルアミン、5mlのエタノー
ル、45mlの氷酢酸、50mlの濃塩酸(全て和光純
薬社製)を合わせてKDO検出試薬を調製した。その5
00μlに、1.05mg/mlの小麦LPSを含む蒸
留水250μlを合わせ、100℃の沸騰水浴中で30
分間加熱後に冷水(23℃)中で30分間冷却し、つい
で日立分光光度計320を使って420、470、63
0、650nmでの紫外部吸収を測定した(測定値をそ
れぞれA420、A470、A630、A650とす
る)。標準試料としては、127μg/mlのKDOア
ンモニウム塩[米国シグマ(Sigma)社製]を含む
蒸留水250μlを使用した。検体試料、標準試料それ
ぞれについて、次式の値を求めた。 S=A420−A470+A630−A650 検体試料の値 (ST)は0.379、標準試料の値
(Ss)は0.294であった。この値の比較により、
小麦LPSには5±1モル/分子量8千のKDOが含ま
れると推定された。
原因の1つとしては、精製段階でのモノフォスフォエス
テラーゼ混入で、リン酸が脱離したことも考えられる。 17)ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン(Elson−Morgan)法
(東京化学同人出版「生化学実験講座」No.4の37
7〜379頁)に準拠して次の通りに行った。小麦LP
Sを蒸留水に溶解して1mg/mlの溶液を調製し、そ
の100μlをスクリューキャップ付きスピッツ(イワ
キガラス社製)に入れ、これに100μlの8NHCl
を添加して110℃で16時間加熱した。4NNaOH
を約200μl添加してpH7とした。その100μl
を分取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入
れ、200μlの下記試薬Aを加えた後に、105℃で
1.5時間加熱し、次いで流水で冷却した。次いで、1
00μlを分取し、670μlの96%エタノールを加
え、更に、67μlの下記試薬Bを加えた後に室温で1
時間放置し、535nmで吸光度を測定した。検量線作
製用試料としては0.20〜200μg/mlのN−ア
セチル グルコサミン(和光純薬社製)を使用した。 (試薬A)75μlのアセチルアセトンと2.5mlの
1.25N炭酸ナトリウムを混合して調製。 (試薬B)1.6gのp−ジメチルベンズアルデヒドと
30mlの濃塩酸と30mlの96%エタノールを混合
して調製。 結果、小麦LPSのヘキソサミン数は6±2/分子(仮
定分子量8,000)だった。 18)脂肪酸含有量 90μlの小麦LPS蒸留水溶液(1mg/ml)に1
0μlの内部標準(0.55mMのマルガリン酸)を加
えた。1.0mlの0.5Mナトリウムメチラートを加
えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を行った。
室温で1時間放置後に960μlの0.5NHClを加
えて中和した。これに2mlのヘキサンを加えて15分
間激しく攪拌した。次いで、1,000gで5分間遠心
分離を行いヘキサン層を分取した。窒素ガスでヘキサン
を蒸発させて、約20μlになるまで濃縮した。このサ
ンプルをガスクロマトグラフィー[本体:島津社製のG
C8APF、キャピラリーカラム:カナダのスペルコ
(Spelco)社製FSCAP Sp2330、キャ
リヤーガス:窒素]に付して脂肪酸量を測定した。脂肪
酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の合成リピ
ドAである大腸菌型LA−15−PP(分子量2,00
0で、1分子中の脂肪酸数は6であることが知られてい
る)を用いた。結果、小麦LPSの脂肪酸数は6±2/
分子(仮定分子量8,000)であると推定された。上
記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添付
の図1〜図3に示す。図1は小麦LPSの、図2は大腸
菌LPSの、図3は百日咳菌LPSのチャートである。
図1〜図3において、図示されている主要ピーク番号に
対応する保持時間(分)は次の通りであった。 図1〜図3の比較により、小麦LPSのチャートは大腸
菌LPSのチャートに似ているが、百日咳菌LPSのも
のとは大きく異なることは明白である。 19)KDO含有量 KDO(2−ケト−3−デオキシオクトネート)含有量
をジフェニルアミン法[シャビ アール(Shaby
R.)等著、アナリティカル バイオケム(Analy
tical Biochem.)、58(1)、123
〜129頁(1974年)]に準拠して次の通りに行っ
た。500mgのジフェニルアミン、5mlのエタノー
ル、45mlの氷酢酸、50mlの濃塩酸(全て和光純
薬社製)を合わせてKDO検出試薬を調製した。その5
00μlに、1.05mg/mlの小麦LPSを含む蒸
留水250μlを合わせ、100℃の沸騰水浴中で30
分間加熱後に冷水(23℃)中で30分間冷却し、つい
で日立分光光度計320を使って420、470、63
0、650nmでの紫外部吸収を測定した(測定値をそ
れぞれA420、A470、A630、A650とす
る)。標準試料としては、127μg/mlのKDOア
ンモニウム塩[米国シグマ(Sigma)社製]を含む
蒸留水250μlを使用した。検体試料、標準試料それ
ぞれについて、次式の値を求めた。 S=A420−A470+A630−A650 検体試料の値 (ST)は0.379、標準試料の値
(Ss)は0.294であった。この値の比較により、
小麦LPSには5±1モル/分子量8千のKDOが含ま
れると推定された。
【0018】製造例2(クロレラLPSの製造) 1)細胞膜破砕クロレラ(株式会社マンナンフーズ製)
30gを、洗浄液が緑色に着色しなくなるまでエタノー
ルで洗浄した。 2)この洗浄残渣26gを100mg/mlの濃度で蒸
留水に溶かし、45℃で2時間振とう後に遠心分離操作
(4℃、10,000G×30分)に付した。 3)上清を回収し、東洋濾紙No.2で濾過し、次いで
蒸留水で抽出した。 4)抽出液290mlを下記条件で陰イオン交換クロマ
トグラフィーに付した。 カラム:Q−セファロース(φ3cm×23cm、容量
約180ml) 緩衝剤:10mMトリス−HCl(pH7.5)、Na
Cl濃度勾配:10mM、400mM、1M 流速:100〜200ml/時 温度:室温 5)素通りした画分310mlをグルコアミラーゼで処
理して澱粉を分解した(pH5.0、40℃、約2時
間)。澱粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生じない
ことにより確認した。 6)遠心分離(10,000G×10分)に付して上清
を回収し、10NNaOH溶液で中和してpH7とし、
分子量20万カットのポアサイズを有するウルトラフィ
ルターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を
行った。 7)得られた濃縮液30mlをファルマシア社製FPL
Cシステム(カラム:モノQHR10/10)を使って
陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。即ち、10
mMトリス−HClと10mMのNaClを含む緩衝液
(pH7.5)で試料をカラムに付した後、上記緩衝液
でNaCl量が165mMに増加された組成をした液
(200ml)でカラムを洗った。次いで、目的LPS
を溶出するため、165mMから1MのNaCl濃度勾
配になるようにNaCl濃度を増加させながら全量40
0mlでカラムを洗い、各2mlの画分を回収した。リ
ムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけてから
5〜8番目の画分を併せた。 8)次いでその8mlを、セファデックス(Sepha
dex)G−25[カラム:2.0cm(内径)×2
0.2cm(66ml)]を使ってゲル濾過(緩衝液:
水)に付して各3mlの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第9〜12番目の画分を併せて12
mlを回収した(LPS:14.3mg、糖:2.0m
g、蛋白:0.53mg)。LPSは後記実験例1記載
の方法で測定した。 9)上記画分を−80℃で凍結後に恒量になるまで凍結
乾燥し、重量を測定したら5.8mgあった。(以下、
この凍結乾燥標品をクロレラLPSと称す)このクロレ
ラLPSのリムラス活性は14.3mgに相当するの
で、その比活性は 14.3÷5.8=2.5 になる。また、以上の精製で、夾雑物として存在し得る
単独の糖は実質上全て除去されたと考えられるので、検
出された糖は全て、クロレラLPSを構成している糖と
考えられる。従って、この段階でのクロレラLPSの純
度を重量に基づいて計算すると、 蛋白=0.53mg LPS=5.8−0.53=5.27mg なので、 5.27÷5.8×100=91(%)である。クロレラLPSの物性 製造例1に記載の方法と同様にして、次の値が得られ
た。分子量は、SDS−2法により測定した。 主要分子量=40,000〜90,000 リン数=4±1/分子量1万 ヘキソサミン数=7±1/分子量1万 脂肪酸数=6±1/分子量1万 KDO数=2±1/分子量1万
30gを、洗浄液が緑色に着色しなくなるまでエタノー
ルで洗浄した。 2)この洗浄残渣26gを100mg/mlの濃度で蒸
留水に溶かし、45℃で2時間振とう後に遠心分離操作
(4℃、10,000G×30分)に付した。 3)上清を回収し、東洋濾紙No.2で濾過し、次いで
蒸留水で抽出した。 4)抽出液290mlを下記条件で陰イオン交換クロマ
トグラフィーに付した。 カラム:Q−セファロース(φ3cm×23cm、容量
約180ml) 緩衝剤:10mMトリス−HCl(pH7.5)、Na
Cl濃度勾配:10mM、400mM、1M 流速:100〜200ml/時 温度:室温 5)素通りした画分310mlをグルコアミラーゼで処
理して澱粉を分解した(pH5.0、40℃、約2時
間)。澱粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生じない
ことにより確認した。 6)遠心分離(10,000G×10分)に付して上清
を回収し、10NNaOH溶液で中和してpH7とし、
分子量20万カットのポアサイズを有するウルトラフィ
ルターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を
行った。 7)得られた濃縮液30mlをファルマシア社製FPL
Cシステム(カラム:モノQHR10/10)を使って
陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。即ち、10
mMトリス−HClと10mMのNaClを含む緩衝液
(pH7.5)で試料をカラムに付した後、上記緩衝液
でNaCl量が165mMに増加された組成をした液
(200ml)でカラムを洗った。次いで、目的LPS
を溶出するため、165mMから1MのNaCl濃度勾
配になるようにNaCl濃度を増加させながら全量40
0mlでカラムを洗い、各2mlの画分を回収した。リ
ムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけてから
5〜8番目の画分を併せた。 8)次いでその8mlを、セファデックス(Sepha
dex)G−25[カラム:2.0cm(内径)×2
0.2cm(66ml)]を使ってゲル濾過(緩衝液:
水)に付して各3mlの画分を回収した。リムラステス
ト陽性の確認された第9〜12番目の画分を併せて12
mlを回収した(LPS:14.3mg、糖:2.0m
g、蛋白:0.53mg)。LPSは後記実験例1記載
の方法で測定した。 9)上記画分を−80℃で凍結後に恒量になるまで凍結
乾燥し、重量を測定したら5.8mgあった。(以下、
この凍結乾燥標品をクロレラLPSと称す)このクロレ
ラLPSのリムラス活性は14.3mgに相当するの
で、その比活性は 14.3÷5.8=2.5 になる。また、以上の精製で、夾雑物として存在し得る
単独の糖は実質上全て除去されたと考えられるので、検
出された糖は全て、クロレラLPSを構成している糖と
考えられる。従って、この段階でのクロレラLPSの純
度を重量に基づいて計算すると、 蛋白=0.53mg LPS=5.8−0.53=5.27mg なので、 5.27÷5.8×100=91(%)である。クロレラLPSの物性 製造例1に記載の方法と同様にして、次の値が得られ
た。分子量は、SDS−2法により測定した。 主要分子量=40,000〜90,000 リン数=4±1/分子量1万 ヘキソサミン数=7±1/分子量1万 脂肪酸数=6±1/分子量1万 KDO数=2±1/分子量1万
【0019】製造例3(百日咳菌LPSの製造) 千葉県血清研究所から入手した試験用百日咳菌液(2.
0×1010 細胞/ml)を死菌体として用いた。上
記死菌体を25mg(乾燥重量)/mlとなるように滅
菌水に懸濁した。これに等量の90%熱フェノール液
(68〜70℃)を添加し、68℃で1時間振盪しなが
ら抽出した。8,000G、4℃で20分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで1/10に濃縮した。これを8,0
00G、4℃で20分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、0〜4℃の冷エタノールを
6倍量加えて−20℃で一晩放置した。4,000G、
4℃で30分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで2回、次いでアセトンで1回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。残さを、20mg/mlとなるよう
に蒸留水に懸濁し、米国ブランソン(Branson)
社製のソニファイア185型で超音波処理(出力コント
ロール5、15分、室温)に付した。次いで2,500
G、4℃で10分間遠心分離し、上清を分取した。この
上清を4℃で、米国シグマ(Sigma)社製の核酸分
解酵素DNasel、RNase Aで15〜16時間
処理した(最終的には10μg/mlのDNase I
と、20μg/mlのRNase Aを使用した)。更
に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて37℃で2時間加温
した。次いで2,500G、4℃で10分間遠心分離
し、上清を分取した。この上清を米国ゲルマン(Gel
man)社のアクロディスク(Acrodisc)を使
い、孔径0.2μmで濾過した。濾液を分子篩にかけ
[樹脂:米国ファルマシア(Pharmacia)社製
セファロース(Sepharose)6B、カラムサイ
ズ=内径5cm×長さ100cm、緩衝液=10mMの
トリス−HCl、10mMのNaCl(pH7.5)、
流速=約3ml/cm2/時)]、生化学工業社製のL
S−1キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合
わせ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径
0.2μmで濾過した。濾液をイオン交換にかけ[装
置:米国ファルマシア(Pharmacia)社製FP
LC、樹脂:米国ファルマシア社製モノQ HR10/
10、緩衝液=10mMのトリス−HCl+10mMの
NaCl(pH7.5)で15分洗浄し、次いで、Na
Cl量を165mMに増加して30分洗浄し、次いで、
20分かけて、NaCl量が165mMから1Mの濃度
勾配になるようにNaCl量を増加させながら洗浄し、
次いで、1MのNaClで30分洗浄する、流速=2m
l/分]、生化学工業社製のLS−1キットを用いてリ
ムラス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分を
カラムで脱塩し[樹脂:米国ファルマシア(Pharm
acia)社製セファデックスG−25ファイン(fi
ne)、カラムサイズ=内径2cm×長さ25cm、溶
出液=蒸留水]、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標
品(4.50mg)に混入している可能性の最も高い物
質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線(200〜40
0nm)をとり、260nmでの吸光度を求めた。吸光
度1のときの核酸濃度が50μg/mlであることを用
いて上記吸光度から核酸濃度を算出したら1%以下であ
った。又、SDS−1法、SDS−2法のいずれによっ
ても蛋白質は明確には検出されなかった。従って、検出
感度を考慮すると、上記凍結乾燥標品に混入している蛋
白質は高々0〜3%と推定される。従って、上記凍結乾
燥標品の純度は96%以上と推定された。製造例1に記
載の方法と同様にして測定されたこの百日咳菌LPSの
物性は次の通りであった。分子量はSDS−2法によっ
て測定した。百日咳菌LPSの物性 主要分子量=6,000±1,000 リン数=4/分子量6千 ヘキソサミン数=12/分子量6千 脂肪酸数=4/分子量6千 KDO数=2±1/分子量6千
0×1010 細胞/ml)を死菌体として用いた。上
記死菌体を25mg(乾燥重量)/mlとなるように滅
菌水に懸濁した。これに等量の90%熱フェノール液
(68〜70℃)を添加し、68℃で1時間振盪しなが
ら抽出した。8,000G、4℃で20分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで1/10に濃縮した。これを8,0
00G、4℃で20分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、0〜4℃の冷エタノールを
6倍量加えて−20℃で一晩放置した。4,000G、
4℃で30分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで2回、次いでアセトンで1回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。残さを、20mg/mlとなるよう
に蒸留水に懸濁し、米国ブランソン(Branson)
社製のソニファイア185型で超音波処理(出力コント
ロール5、15分、室温)に付した。次いで2,500
G、4℃で10分間遠心分離し、上清を分取した。この
上清を4℃で、米国シグマ(Sigma)社製の核酸分
解酵素DNasel、RNase Aで15〜16時間
処理した(最終的には10μg/mlのDNase I
と、20μg/mlのRNase Aを使用した)。更
に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて37℃で2時間加温
した。次いで2,500G、4℃で10分間遠心分離
し、上清を分取した。この上清を米国ゲルマン(Gel
man)社のアクロディスク(Acrodisc)を使
い、孔径0.2μmで濾過した。濾液を分子篩にかけ
[樹脂:米国ファルマシア(Pharmacia)社製
セファロース(Sepharose)6B、カラムサイ
ズ=内径5cm×長さ100cm、緩衝液=10mMの
トリス−HCl、10mMのNaCl(pH7.5)、
流速=約3ml/cm2/時)]、生化学工業社製のL
S−1キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合
わせ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径
0.2μmで濾過した。濾液をイオン交換にかけ[装
置:米国ファルマシア(Pharmacia)社製FP
LC、樹脂:米国ファルマシア社製モノQ HR10/
10、緩衝液=10mMのトリス−HCl+10mMの
NaCl(pH7.5)で15分洗浄し、次いで、Na
Cl量を165mMに増加して30分洗浄し、次いで、
20分かけて、NaCl量が165mMから1Mの濃度
勾配になるようにNaCl量を増加させながら洗浄し、
次いで、1MのNaClで30分洗浄する、流速=2m
l/分]、生化学工業社製のLS−1キットを用いてリ
ムラス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分を
カラムで脱塩し[樹脂:米国ファルマシア(Pharm
acia)社製セファデックスG−25ファイン(fi
ne)、カラムサイズ=内径2cm×長さ25cm、溶
出液=蒸留水]、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標
品(4.50mg)に混入している可能性の最も高い物
質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線(200〜40
0nm)をとり、260nmでの吸光度を求めた。吸光
度1のときの核酸濃度が50μg/mlであることを用
いて上記吸光度から核酸濃度を算出したら1%以下であ
った。又、SDS−1法、SDS−2法のいずれによっ
ても蛋白質は明確には検出されなかった。従って、検出
感度を考慮すると、上記凍結乾燥標品に混入している蛋
白質は高々0〜3%と推定される。従って、上記凍結乾
燥標品の純度は96%以上と推定された。製造例1に記
載の方法と同様にして測定されたこの百日咳菌LPSの
物性は次の通りであった。分子量はSDS−2法によっ
て測定した。百日咳菌LPSの物性 主要分子量=6,000±1,000 リン数=4/分子量6千 ヘキソサミン数=12/分子量6千 脂肪酸数=4/分子量6千 KDO数=2±1/分子量6千
【0020】なお、製造例1に記載の方法と同様にして
測定された大腸菌LPS[米国ディフコ(Difco)
社製O128:B8]の物性は次の通りであった。分子
量はSDS−2法によって測定した。大腸菌LPSの物性 主要分子量=40,000±10,000 8,000± 4,000 リン数=12/分子量3万 ヘキソサミン数=45±6/分子量3万 脂肪酸数=18/分子量3万 KDO数=5±1/分子量3万
測定された大腸菌LPS[米国ディフコ(Difco)
社製O128:B8]の物性は次の通りであった。分子
量はSDS−2法によって測定した。大腸菌LPSの物性 主要分子量=40,000±10,000 8,000± 4,000 リン数=12/分子量3万 ヘキソサミン数=45±6/分子量3万 脂肪酸数=18/分子量3万 KDO数=5±1/分子量3万
【0021】製造例4(LPS1、LPS2、LPS3
の製造) 1)50ml容コーニングチューブに、1.09%の灰
分を含む硬質小麦粉(カナダ産の1・カナディアン・ホ
イート)1.04gを秤量して入れ、20mlの蒸留水
を加えて50mg/mlの小麦粉液を調製した。 2)この液を37℃の水浴中で振とう培養し、培養開始
後0時間、1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、
8時間、10時間、12時間、20時間、24時間、4
5時間目に各0.5mlを採取し、10゜〜105倍希
釈して標準寒天培地(下記組成を持つ日水製薬社製の培
地)に100μl宛をまき込み、生菌数の測定、コロニ
ーの観察を行った。標準寒天培地(日水製薬社コード番号:05618) 1リットル中 酵母エキス 2.5g ペプトン 5.0g ブドウ糖 1.0g カンテン 15.0g pH 7.1±0.1 3)種類が異なると考えられた、培養経過時間8時間
目、10時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロ
ニー(コロニー1)、クリーム色不透明コロニー(コロ
ニー2)、黄色半透明コロニー(コロニー3)、乳白色
不透明コロニー(コロニー4)、白色不透明な小さなコ
ロニー(コロニー5)を上記と同種の別の標準寒天培地
にまき、植え継ぎ、一方で、コロニー1〜5の細菌のグ
ラム染色性、リムラス活性を調べた。上記コロニーのう
ち、コロニー4及びコロニー5(共にグラム染色性+)
のリムラス活性はコロニー1〜3(共にグラム染色性
−)に比べて極めて低かったので、以後の検討から除
き、日水製薬社製の培地及びIDテスト・EB−20を
使用し、コロニー1〜3の形態、生化学的性状を観察し
た。次の結果が得られた。
の製造) 1)50ml容コーニングチューブに、1.09%の灰
分を含む硬質小麦粉(カナダ産の1・カナディアン・ホ
イート)1.04gを秤量して入れ、20mlの蒸留水
を加えて50mg/mlの小麦粉液を調製した。 2)この液を37℃の水浴中で振とう培養し、培養開始
後0時間、1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、
8時間、10時間、12時間、20時間、24時間、4
5時間目に各0.5mlを採取し、10゜〜105倍希
釈して標準寒天培地(下記組成を持つ日水製薬社製の培
地)に100μl宛をまき込み、生菌数の測定、コロニ
ーの観察を行った。標準寒天培地(日水製薬社コード番号:05618) 1リットル中 酵母エキス 2.5g ペプトン 5.0g ブドウ糖 1.0g カンテン 15.0g pH 7.1±0.1 3)種類が異なると考えられた、培養経過時間8時間
目、10時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロ
ニー(コロニー1)、クリーム色不透明コロニー(コロ
ニー2)、黄色半透明コロニー(コロニー3)、乳白色
不透明コロニー(コロニー4)、白色不透明な小さなコ
ロニー(コロニー5)を上記と同種の別の標準寒天培地
にまき、植え継ぎ、一方で、コロニー1〜5の細菌のグ
ラム染色性、リムラス活性を調べた。上記コロニーのう
ち、コロニー4及びコロニー5(共にグラム染色性+)
のリムラス活性はコロニー1〜3(共にグラム染色性
−)に比べて極めて低かったので、以後の検討から除
き、日水製薬社製の培地及びIDテスト・EB−20を
使用し、コロニー1〜3の形態、生化学的性状を観察し
た。次の結果が得られた。
【0022】コロニー1を形成する細菌(識別番号:9
00814−1) (通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成2
年8月17日から微工研菌寄第11664号として国内
寄託され、平成3年8月12日より微工研条寄第350
9号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た)以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 (a)形態 1) 短桿状 2) 運動性なし 3)グラム染色性:− (b) 生育状態 1)標準寒天培地:黄〜クリーム色で丸形の不透明コロ
ニーを形成する。 2)SS寒天培地:白色で半透明なコロニーを形成す
る。 [SS寒天培地:日水製薬社コード番号:05031] 組成1リットル中 肉エキス 5.0g 胆汁酸塩 9.0g ペプトン 7.5g ラクトース 10.0g クエン酸ナトリウム 8.5g チオ硫酸ナトリウム 5.5g クエン酸第二鉄 1.0g ニュートラルレッド 0.025g プリリアントグリン 0.033g カンテン 13.5g pH:7.1±0.1 3)TSI寒天培地:斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 [TSI寒天培地:日水製薬社コード番号:0510
3] 組成1リットル中 肉エキス 5.0g NaCl 5.0g ペプトン 15.0g ラクトース 10.0g シュクロース 10.0g ブドウ糖 1.0g クエン酸第二鉄 0.2g チオ硫酸ナトリウム 0.2g フェノールレッド 0.02g カンテン 15.0g pH:7.6±0.1 (c)生理的性質 1)フォーゲス・プロスカウエル反応:+ 2)インドールの生成:− 3)硫化水素の生成:− 4)クエン酸の利用:+ 5)ウレアーゼ:− 6)オキシダーゼ:− 7)O−Fテスト:+ (d)炭素源の利用性 1)ラクトース:+ 2)アドニット:− 3)ラムノース:+ 4)マンニット:+ 5)エスクリン:+ 6)イノシット:− 7)ソルビット:+ 8)アラビノース:+ 9)ラフィノース:+ 10)シュクロース:+ (e)その他 1)リジンの脱炭酸反応:− 2)マロン酸の利用:− 3)アルギニンの分解:− 4)フェニルアラニンの脱アミノ化反応:− 5)オルニチンの脱炭酸反応:−
00814−1) (通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成2
年8月17日から微工研菌寄第11664号として国内
寄託され、平成3年8月12日より微工研条寄第350
9号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た)以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 (a)形態 1) 短桿状 2) 運動性なし 3)グラム染色性:− (b) 生育状態 1)標準寒天培地:黄〜クリーム色で丸形の不透明コロ
ニーを形成する。 2)SS寒天培地:白色で半透明なコロニーを形成す
る。 [SS寒天培地:日水製薬社コード番号:05031] 組成1リットル中 肉エキス 5.0g 胆汁酸塩 9.0g ペプトン 7.5g ラクトース 10.0g クエン酸ナトリウム 8.5g チオ硫酸ナトリウム 5.5g クエン酸第二鉄 1.0g ニュートラルレッド 0.025g プリリアントグリン 0.033g カンテン 13.5g pH:7.1±0.1 3)TSI寒天培地:斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 [TSI寒天培地:日水製薬社コード番号:0510
3] 組成1リットル中 肉エキス 5.0g NaCl 5.0g ペプトン 15.0g ラクトース 10.0g シュクロース 10.0g ブドウ糖 1.0g クエン酸第二鉄 0.2g チオ硫酸ナトリウム 0.2g フェノールレッド 0.02g カンテン 15.0g pH:7.6±0.1 (c)生理的性質 1)フォーゲス・プロスカウエル反応:+ 2)インドールの生成:− 3)硫化水素の生成:− 4)クエン酸の利用:+ 5)ウレアーゼ:− 6)オキシダーゼ:− 7)O−Fテスト:+ (d)炭素源の利用性 1)ラクトース:+ 2)アドニット:− 3)ラムノース:+ 4)マンニット:+ 5)エスクリン:+ 6)イノシット:− 7)ソルビット:+ 8)アラビノース:+ 9)ラフィノース:+ 10)シュクロース:+ (e)その他 1)リジンの脱炭酸反応:− 2)マロン酸の利用:− 3)アルギニンの分解:− 4)フェニルアラニンの脱アミノ化反応:− 5)オルニチンの脱炭酸反応:−
【0023】コロニー2を形成する細菌(識別番号:9
00814−2) (通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成2
年8月17日から微工研菌寄第11665号として国内
寄託され、平成3年8月12日より微工研条寄第351
0号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た)以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定さ
れる。 (a)形態 1) 短桿状 2) 運動性なし 3)グラム染色性:− (b)生育状態 1)標準寒天培地:クリーム色で不透明なコロニーを形
成する。 2)SS寒天培地:赤色で不透明なコロニーを形成す
る。 3)TSI寒天培地:斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 (c)生理的性質 1)フォーゲス・プロスカウエル反応:+ 2)インドールの生成:− 3)硫化水素の生成:− 4)クエン酸の利用:+ 5)ウレアーゼ:− 6)オキシダーゼ:− 7)O−Fテスト:+ (d)炭素源の利用性 1)ラクトース:+ 2)アドニット:− 3)ラムノース:+ 4)マンニット:+ 5)エスクリン:+ 6)イノシット:− 7)ソルビット:+ 8)アラビノース:+ 9)ラフィノース:+ 10)シュクロース:+ (e)その他 1)リジンの脱炭酸反応:− 2)マロン酸の利用:+ 3)アルギニンの分解:+ 4)フェニルアラニンの脱アミノ化反応:− 5)オルニチンの脱炭酸反応:+
00814−2) (通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成2
年8月17日から微工研菌寄第11665号として国内
寄託され、平成3年8月12日より微工研条寄第351
0号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た)以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定さ
れる。 (a)形態 1) 短桿状 2) 運動性なし 3)グラム染色性:− (b)生育状態 1)標準寒天培地:クリーム色で不透明なコロニーを形
成する。 2)SS寒天培地:赤色で不透明なコロニーを形成す
る。 3)TSI寒天培地:斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成する。 (c)生理的性質 1)フォーゲス・プロスカウエル反応:+ 2)インドールの生成:− 3)硫化水素の生成:− 4)クエン酸の利用:+ 5)ウレアーゼ:− 6)オキシダーゼ:− 7)O−Fテスト:+ (d)炭素源の利用性 1)ラクトース:+ 2)アドニット:− 3)ラムノース:+ 4)マンニット:+ 5)エスクリン:+ 6)イノシット:− 7)ソルビット:+ 8)アラビノース:+ 9)ラフィノース:+ 10)シュクロース:+ (e)その他 1)リジンの脱炭酸反応:− 2)マロン酸の利用:+ 3)アルギニンの分解:+ 4)フェニルアラニンの脱アミノ化反応:− 5)オルニチンの脱炭酸反応:+
【0024】コロニー3を形成する細菌(識別番号:9
00814−3) (通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成2
年8月17日から微工研菌寄第11666号として国内
寄託され、平成3年8月12日より微工研条寄第351
1号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た)以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 (a)形態 1) 短桿状 2) 運動性なし 3)グラム染色性:− (b) 成育状態 1)標準寒天培地:黄色で丸形の半透明なコロニーを形
成する。 2)SS寒天培地:コロニーを形成しない。 3)TSI寒天培地:斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成しない。 (c) 生理的性質 1)フォーゲス・プロスカウエル反応:+ 2)インドールの生成:− 3)硫化水素の生成:− 4)クエン酸の利用:+ 5)ウレアーゼ:− 6)オキシダーゼ:− 7)O−Fテスト:+ (d)炭素源の利用性 1)ラクトース:+ 2)アドニット:− 3)ラムノース:+ 4)マンニット:+ 5)エスクリン:+ 6)イノシット:− 7)ソルビット:− 8)アラビノース:+ 9)ラフィノース:− 10)シュクロース:+ (e)その他 1)リジンの脱炭酸反応:− 2)マロン酸の利用:+ 3)アルギニンの分解:− 4)フェニルアラニンの脱アミノ化反応:− 5)オルニチンの脱炭酸反応:−
00814−3) (通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成2
年8月17日から微工研菌寄第11666号として国内
寄託され、平成3年8月12日より微工研条寄第351
1号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た)以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 (a)形態 1) 短桿状 2) 運動性なし 3)グラム染色性:− (b) 成育状態 1)標準寒天培地:黄色で丸形の半透明なコロニーを形
成する。 2)SS寒天培地:コロニーを形成しない。 3)TSI寒天培地:斜面部での変化はないが、高層部
は黄変する。ガスを生成しない。 (c) 生理的性質 1)フォーゲス・プロスカウエル反応:+ 2)インドールの生成:− 3)硫化水素の生成:− 4)クエン酸の利用:+ 5)ウレアーゼ:− 6)オキシダーゼ:− 7)O−Fテスト:+ (d)炭素源の利用性 1)ラクトース:+ 2)アドニット:− 3)ラムノース:+ 4)マンニット:+ 5)エスクリン:+ 6)イノシット:− 7)ソルビット:− 8)アラビノース:+ 9)ラフィノース:− 10)シュクロース:+ (e)その他 1)リジンの脱炭酸反応:− 2)マロン酸の利用:+ 3)アルギニンの分解:− 4)フェニルアラニンの脱アミノ化反応:− 5)オルニチンの脱炭酸反応:−
【0025】4)コロニー1、2、3をそれぞれ1リッ
トルのL−肉汁培地に移し、37℃で一夜振とうし、
5,000G、4℃で20分間遠心処理して集菌した。
なお、このL−肉汁培地は、ディフコ(Difco)社
のポリペプトン10g、同社の酵母エキス5g、和光純
薬社の特級NaCl(5g)を蒸留水に入れ、NaOH
でpH7.5に合わせ、オートクレーブし、別途、予め
調製済みの和光純薬社の特級グルコースの40%溶液を
400倍に希釈して加えて調製したものである。 5)各菌体をそれぞれ50mlの蒸留水に懸濁し、これ
に50mlの90%熱フェノールを加えて65〜70℃
で20分間攪拌し、冷却後に、10,000G、4℃で
20分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層
を更に2回上記と同一の操作に付した。3つの水層を合
わせ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アド
ヴァンテック・トーヨー(ADVANTEC TOY
O)社のUK−200を使用して限外濾過に付して分子
量20万カット−オフにより濃縮した(N2圧:2気
圧)。 6)この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のQ−セフ
ァロース ファストフロー(Q−Sepharose
Fast Flow)を使って陰イオン交換クロマトグ
ラフィーに付した。即ち、10mMトリス−HCl(p
H7.5)と10mMのNaClを含む緩衝液で試料を
カラムに付した後、400mMNaCl/10mMトリ
ス−HCl(pH7.5)でリムラス活性画分を溶出さ
せた。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して
脱塩、濃縮して、純度96%以上のLPSを得た。な
お、核酸は1MNaCl/10mMトリス−HCl(p
H7.5)で溶出した。
トルのL−肉汁培地に移し、37℃で一夜振とうし、
5,000G、4℃で20分間遠心処理して集菌した。
なお、このL−肉汁培地は、ディフコ(Difco)社
のポリペプトン10g、同社の酵母エキス5g、和光純
薬社の特級NaCl(5g)を蒸留水に入れ、NaOH
でpH7.5に合わせ、オートクレーブし、別途、予め
調製済みの和光純薬社の特級グルコースの40%溶液を
400倍に希釈して加えて調製したものである。 5)各菌体をそれぞれ50mlの蒸留水に懸濁し、これ
に50mlの90%熱フェノールを加えて65〜70℃
で20分間攪拌し、冷却後に、10,000G、4℃で
20分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層
を更に2回上記と同一の操作に付した。3つの水層を合
わせ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アド
ヴァンテック・トーヨー(ADVANTEC TOY
O)社のUK−200を使用して限外濾過に付して分子
量20万カット−オフにより濃縮した(N2圧:2気
圧)。 6)この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のQ−セフ
ァロース ファストフロー(Q−Sepharose
Fast Flow)を使って陰イオン交換クロマトグ
ラフィーに付した。即ち、10mMトリス−HCl(p
H7.5)と10mMのNaClを含む緩衝液で試料を
カラムに付した後、400mMNaCl/10mMトリ
ス−HCl(pH7.5)でリムラス活性画分を溶出さ
せた。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して
脱塩、濃縮して、純度96%以上のLPSを得た。な
お、核酸は1MNaCl/10mMトリス−HCl(p
H7.5)で溶出した。
【0026】各菌体の結果は次の表2〜表4の通りであ
った。核酸量はOD(260nm)での測定値に基づき
(10D=50μg)、純度(%)は次式に基づき計算
した。
った。核酸量はOD(260nm)での測定値に基づき
(10D=50μg)、純度(%)は次式に基づき計算
した。
【0027】
【数2】
【0028】
【表2】
【0029】
【表3】
【0030】
【表4】
【0031】7)分子量 各菌体LPSの分子量を、製造例1と同様にしてSDS
−2法により測定したら、5,000±1,000(菌
体900814−1に由来するLPS1)、6,500
±2,500(同−2に由来するLPS2及び同−3に
由来するLPS3)であった。銀染色におけるそれらの
染色帯を図4に示す。図4で、番号1〜3がそれぞれL
PS1〜LPS3に対応する。図4に示されるように、
LPS1は分子量3万付近にもややまとまった染色帯を
示した。LPS2は30,000から43,000の間
にも染色帯が認められるが、14,000以下の染色帯
の染色度と比較すると、高分子のものは極めて少ないと
推定される。後述する糖量、ヘキソサミン量から判断し
ても、LPS2は最も糖含有率が低く、ついでLPS
3、LPS1の順で高くなり、電気泳動で観察されたパ
ターンと一致すると考えられる。又、LPS量/総乾燥
収量の比もLPS2、LPS3、LPS1の順に低くな
っている。以上の観察結果から、LPS2は比較的低分
子のLPSが多く、次いで、LPS3、LPS1の順に
その割合は少なくなると推定される。
−2法により測定したら、5,000±1,000(菌
体900814−1に由来するLPS1)、6,500
±2,500(同−2に由来するLPS2及び同−3に
由来するLPS3)であった。銀染色におけるそれらの
染色帯を図4に示す。図4で、番号1〜3がそれぞれL
PS1〜LPS3に対応する。図4に示されるように、
LPS1は分子量3万付近にもややまとまった染色帯を
示した。LPS2は30,000から43,000の間
にも染色帯が認められるが、14,000以下の染色帯
の染色度と比較すると、高分子のものは極めて少ないと
推定される。後述する糖量、ヘキソサミン量から判断し
ても、LPS2は最も糖含有率が低く、ついでLPS
3、LPS1の順で高くなり、電気泳動で観察されたパ
ターンと一致すると考えられる。又、LPS量/総乾燥
収量の比もLPS2、LPS3、LPS1の順に低くな
っている。以上の観察結果から、LPS2は比較的低分
子のLPSが多く、次いで、LPS3、LPS1の順に
その割合は少なくなると推定される。
【0032】8)リン含有量 チェン−トリバラ(Chen−Toribara)法
[チェン等著、「アナリティカル ケミストリ(Ana
lytical Chemistry)、vol.2
8、1756〜1758頁(1956年)に準拠して次
の通りに行った。LPS1、LPS2、LPS3を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、31.6μg、57.
6μg、103.6μgのLPSを含む20μlの溶液
を調製し、小試験管に入れた。20μlの50v/v%
硫酸を添加し、160℃で2時間加熱した。次いで、2
0μlの10v/v%過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで1分間加熱して灰化させた。その後に0.5ml
の蒸留水、次いで0.5mlの反応試薬(1mlの6N
硫酸、2mlの蒸留水、2mlの2.5v/w%モリブ
デン酸アンモニウム及び1mlの10v/w%のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その0.5mlを使用)を
添加して室温で30分間放置した後に、820nmでの
吸光度OD(820nm)を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム(和光純薬
社製)を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
2.5μg、1μg、0.25μg、0μgを含む0.
5mlの溶液を調製して使用した。なお、リン1gはリ
ン酸二水素カリウム4.39gに相当する。結果を表5
に示す。なお、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
(例えば、リン酸緩衝液に由来する)による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量(μg)は吸光量から計算された値で
ある。リン量(重量%)は、次式により計算した。な
お、式中の「0.67」は、標準のリン1μgのOD値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各LPSの
濃度(mg/ml)を指す。
[チェン等著、「アナリティカル ケミストリ(Ana
lytical Chemistry)、vol.2
8、1756〜1758頁(1956年)に準拠して次
の通りに行った。LPS1、LPS2、LPS3を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、31.6μg、57.
6μg、103.6μgのLPSを含む20μlの溶液
を調製し、小試験管に入れた。20μlの50v/v%
硫酸を添加し、160℃で2時間加熱した。次いで、2
0μlの10v/v%過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで1分間加熱して灰化させた。その後に0.5ml
の蒸留水、次いで0.5mlの反応試薬(1mlの6N
硫酸、2mlの蒸留水、2mlの2.5v/w%モリブ
デン酸アンモニウム及び1mlの10v/w%のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その0.5mlを使用)を
添加して室温で30分間放置した後に、820nmでの
吸光度OD(820nm)を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム(和光純薬
社製)を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
2.5μg、1μg、0.25μg、0μgを含む0.
5mlの溶液を調製して使用した。なお、リン1gはリ
ン酸二水素カリウム4.39gに相当する。結果を表5
に示す。なお、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
(例えば、リン酸緩衝液に由来する)による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量(μg)は吸光量から計算された値で
ある。リン量(重量%)は、次式により計算した。な
お、式中の「0.67」は、標準のリン1μgのOD値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各LPSの
濃度(mg/ml)を指す。
【0033】
【数3】
【0034】リン数は、次式により計算した、分子量
5,000当たりの換算数である。
5,000当たりの換算数である。
【0035】
【数4】
【0036】
【表5】
【0037】9)ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン(Elson−Morgan)法
(東京化学同人出版「生化学実験講座」No.4の37
7〜379頁)に準拠して次の通りに行った。LPSを
蒸留水に溶解して1.58mg(LPS1)、2.88
mg(LPS2)、5.18mg(LPS3)/mlの
溶液を調製し、その100μlをスクリューキャップ付
きスピッツ(イワキガラス社製)に入れ、これに100
μlの8NHClを添加して110℃で16時間加熱し
た。4NNaOHを約200μl添加してpH7とし
た。その100μlを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、200μlの下記試薬Aを加えた
後に、105℃で1.5時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、100μlを分取し、670μlの96
%エタノールを加え、更に、67μlの下記試薬Bを加
えた後に室温で1時間放置し、535nmで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては0.20〜200μ
g/mlのN−アセチル グルコサミン(和光純薬社
製)を使った。 (試薬A)75μlのアセチルアセトンと2.5mlの
1.25N炭酸ナトリウムを混合して調製した。 (試薬B)1.6gのp−ジメチルベンズアルデヒドと
30mlの濃塩酸と30mlの96%エタノールを混合
して調製した。 結果、LPS1、LPS2、LPS3のヘキソサミン数
は各々9±1/分子量5,000、7±1/分子量5,
000、5±1/分子量5,000だった。
(東京化学同人出版「生化学実験講座」No.4の37
7〜379頁)に準拠して次の通りに行った。LPSを
蒸留水に溶解して1.58mg(LPS1)、2.88
mg(LPS2)、5.18mg(LPS3)/mlの
溶液を調製し、その100μlをスクリューキャップ付
きスピッツ(イワキガラス社製)に入れ、これに100
μlの8NHClを添加して110℃で16時間加熱し
た。4NNaOHを約200μl添加してpH7とし
た。その100μlを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、200μlの下記試薬Aを加えた
後に、105℃で1.5時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、100μlを分取し、670μlの96
%エタノールを加え、更に、67μlの下記試薬Bを加
えた後に室温で1時間放置し、535nmで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては0.20〜200μ
g/mlのN−アセチル グルコサミン(和光純薬社
製)を使った。 (試薬A)75μlのアセチルアセトンと2.5mlの
1.25N炭酸ナトリウムを混合して調製した。 (試薬B)1.6gのp−ジメチルベンズアルデヒドと
30mlの濃塩酸と30mlの96%エタノールを混合
して調製した。 結果、LPS1、LPS2、LPS3のヘキソサミン数
は各々9±1/分子量5,000、7±1/分子量5,
000、5±1/分子量5,000だった。
【0038】10)KDO含有量 KDO(2−ケト−3−デオキシオクトネート)含有量
をジフェニルアミン法[シャビ アール(Shaby
R.)等著、アナリティカル バイオケム(Analy
tical Biochem.)、58(1)、123
〜129頁(1974年)]に準拠して次の通りに行っ
た。500mgのジフェニルアミン、5mlのエタノー
ル、45mlの氷酢酸、50mlの濃塩酸(全て和光純
薬社製)を合わせてKDO検出試薬を調製した。その5
00μlに、(1)0.505mg/mlのLPS1を
含む250μl蒸留水溶液;(2)0.576mg/m
lのLPS2を含む250μl蒸留水溶液;(3)0.
518mg/mlのLPS3を含む250μl蒸留水溶
液;のいずれかを合わせ、100℃の沸騰水浴中で33
分間加熱後に冷水(24.5℃)中で30分間冷却し、
ついで日立分光光度計320を使い420、470、6
30、650nmでの紫外部吸収を測定した(測定値を
各々A420、A470、A630、A650とす
る)。標準試料としては、0.5μモル/mlのKDO
アンモニウム塩[米国シグマ(Sigma)社製]を含
む蒸留水250μlを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 S=A420−A470+A630−A650 検体試料の値(ST)はLPS1で0.109、LPS
2で0.078、LPS3で0.099であった。標準
試料の値(SS)は0.246であり、蒸留水のみの値
は0.005であった。この値の比較により、分子量
5,000当たり、LPS1には2±1の、LPS2に
は1〜2個の、LPS3には2±1個のKDOが含まれ
ると推定された。なお、これらの値は、LPS1を例に
とると、次のように計算される。溶液に含まれるKDD
の濃度をχ(μモル/ml)とすると、
をジフェニルアミン法[シャビ アール(Shaby
R.)等著、アナリティカル バイオケム(Analy
tical Biochem.)、58(1)、123
〜129頁(1974年)]に準拠して次の通りに行っ
た。500mgのジフェニルアミン、5mlのエタノー
ル、45mlの氷酢酸、50mlの濃塩酸(全て和光純
薬社製)を合わせてKDO検出試薬を調製した。その5
00μlに、(1)0.505mg/mlのLPS1を
含む250μl蒸留水溶液;(2)0.576mg/m
lのLPS2を含む250μl蒸留水溶液;(3)0.
518mg/mlのLPS3を含む250μl蒸留水溶
液;のいずれかを合わせ、100℃の沸騰水浴中で33
分間加熱後に冷水(24.5℃)中で30分間冷却し、
ついで日立分光光度計320を使い420、470、6
30、650nmでの紫外部吸収を測定した(測定値を
各々A420、A470、A630、A650とす
る)。標準試料としては、0.5μモル/mlのKDO
アンモニウム塩[米国シグマ(Sigma)社製]を含
む蒸留水250μlを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 S=A420−A470+A630−A650 検体試料の値(ST)はLPS1で0.109、LPS
2で0.078、LPS3で0.099であった。標準
試料の値(SS)は0.246であり、蒸留水のみの値
は0.005であった。この値の比較により、分子量
5,000当たり、LPS1には2±1の、LPS2に
は1〜2個の、LPS3には2±1個のKDOが含まれ
ると推定された。なお、これらの値は、LPS1を例に
とると、次のように計算される。溶液に含まれるKDD
の濃度をχ(μモル/ml)とすると、
【0039】
【数5】
【0040】上記式から、χ=0.221となる。従っ
て、LPS1の1モル(5,000と仮定)に含まれる
KDDのモル数をyとすると、次式により、y=2.1
9となる。
て、LPS1の1モル(5,000と仮定)に含まれる
KDDのモル数をyとすると、次式により、y=2.1
9となる。
【0041】
【数6】
【0042】以下は、本発明のLPSを含む製剤の処方
例である。なお、実施例1〜4におけるLPS量は、リ
ムラステストによる大腸菌LPS換算量である。実施例1 (錠剤) 小麦LPS 0.04g 6%HPC乳糖 178g ステアリン酸タルク 8g バレイショデンプン 14g 以上を混和し、打錠して、0.1mgの小麦LPSを含
む0.5gの錠剤400個を調製した。実施例2 (内用液剤) クロレラLPS 1mg 精製水 100ml
例である。なお、実施例1〜4におけるLPS量は、リ
ムラステストによる大腸菌LPS換算量である。実施例1 (錠剤) 小麦LPS 0.04g 6%HPC乳糖 178g ステアリン酸タルク 8g バレイショデンプン 14g 以上を混和し、打錠して、0.1mgの小麦LPSを含
む0.5gの錠剤400個を調製した。実施例2 (内用液剤) クロレラLPS 1mg 精製水 100ml
【0043】実験例1(リムラステスト陽性植物LPS
の定量) 各種植物に含まれるリムラステスト陽性LPSの定量
を、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムを使っ
て行った。 96穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を1
穴当たり180μl入れた。試料20μl(試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解して調製した)をプレー
トの穴の1つに加えた。プレートミキサーで攪拌しなが
らピペッティングを行って10倍希釈液を調製した。
(以後、順次希釈試料を20μlずつとり、同様に処理
することで100倍、1000倍、…と10倍希釈系列
液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の量比を変
えることにより希釈率は任意に設定できる。) 内部標準として1.5μg/mlの大腸菌LPS溶液
の100,000倍希釈液を調製し、希釈やリムラステ
スト発色が正常であることを確認した。 上記の10倍希釈液35μlを別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムのL
S−1セット35μlを添加し、37℃で30分間放置
した。ついで105μlの1M酢酸水を加えて攪拌して
反応を停止させた。この試料液の波長415nmでの吸
光度を、96穴用吸光度計プレートリーダーMTP−1
00(コロナ電気株式会社製)で測定した。バックグラ
ンドとしては蒸留水を、検量線作成用としては42pg
/mlの生化学工業株式会社のトキシカラージステムの
ET−1セットを使用して検量線を作成し、この検量線
を基準にして各試料中のリムラステスト陽性LPSの定
量を行った。(試料が蒸留水である場合の吸光度を0と
した。)なお、この方法で前記LS−1セットを使用し
た場合には10〜45pg/mlの範囲内で発色に定量
性があることが確認されたので、この範囲に入らないと
きは、希釈率を変えて再実験した。希釈試料の定量値
は、 (検量線から読み取った値)×(希釈率) で計算した。得られた結果を、固体試料の場合にはng
/g単位で、液体試料の場合にはng/ml単位で次の
表6〜表11に示す。なお、表中の試料の欄の会社名、
地名等は、当該試料の入手先、産地をさす。かかる記載
がない品はスーパーストアー忠実屋の神奈川県津久井郡
中野町店で購入した品で、製造者が不明なものを指す。
なお、「ホクレン」は、北海道農業協同組合連合会の略
称である。
の定量) 各種植物に含まれるリムラステスト陽性LPSの定量
を、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムを使っ
て行った。 96穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を1
穴当たり180μl入れた。試料20μl(試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解して調製した)をプレー
トの穴の1つに加えた。プレートミキサーで攪拌しなが
らピペッティングを行って10倍希釈液を調製した。
(以後、順次希釈試料を20μlずつとり、同様に処理
することで100倍、1000倍、…と10倍希釈系列
液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の量比を変
えることにより希釈率は任意に設定できる。) 内部標準として1.5μg/mlの大腸菌LPS溶液
の100,000倍希釈液を調製し、希釈やリムラステ
スト発色が正常であることを確認した。 上記の10倍希釈液35μlを別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラ−システムのL
S−1セット35μlを添加し、37℃で30分間放置
した。ついで105μlの1M酢酸水を加えて攪拌して
反応を停止させた。この試料液の波長415nmでの吸
光度を、96穴用吸光度計プレートリーダーMTP−1
00(コロナ電気株式会社製)で測定した。バックグラ
ンドとしては蒸留水を、検量線作成用としては42pg
/mlの生化学工業株式会社のトキシカラージステムの
ET−1セットを使用して検量線を作成し、この検量線
を基準にして各試料中のリムラステスト陽性LPSの定
量を行った。(試料が蒸留水である場合の吸光度を0と
した。)なお、この方法で前記LS−1セットを使用し
た場合には10〜45pg/mlの範囲内で発色に定量
性があることが確認されたので、この範囲に入らないと
きは、希釈率を変えて再実験した。希釈試料の定量値
は、 (検量線から読み取った値)×(希釈率) で計算した。得られた結果を、固体試料の場合にはng
/g単位で、液体試料の場合にはng/ml単位で次の
表6〜表11に示す。なお、表中の試料の欄の会社名、
地名等は、当該試料の入手先、産地をさす。かかる記載
がない品はスーパーストアー忠実屋の神奈川県津久井郡
中野町店で購入した品で、製造者が不明なものを指す。
なお、「ホクレン」は、北海道農業協同組合連合会の略
称である。
【0044】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【0045】実験例2(マクロファージのインビトロT
NF産生能を活性化する際のED50を与えるリムラス
テスト陽性LPSの含有量が0.4〜100ng/培養
液mlであるLPSの選択方法) 9週齢の、平均体重29gの各群3匹のオスのC3H/
Heマウスのマクロファージ腹腔常在細胞200μl
(2×105個)/穴を96穴の平底プレートに入れ、
プライマーとしての組換えマウス1FN−γ(100単
位/ml)を各穴に10μl宛加えた。別途、各種LP
S源を65℃の熱水(g/ml)で5時間抽出して調製
した抽出液を各種希釈し、その10μl/穴をプライマ
ー投与の3時間後にトリガーとして加えた。2時間培養
後に遠心分離操作に付した(3000G、20分)。各
穴から得られた130μlの、TNF活性はL929細
胞に対する毒性に基づいて測定し、又、リムラステスト
陽性LPS含有量は生化学工業株式会社のトキシカラー
ジステムを使用して測定した。測定値を、縦軸にTNF
産生量(単位/培養液ml)を、横軸(対数尺)に対応
リムラステスト陽性LPS含有量(ng/培養液ml)
を表す座標にプロットし、プロットされた各点から推定
されるシグモイド曲線を描いた。トリガーを投与しなか
った場合のTNF産生量を与える各トリガーのマクロフ
ァージ活性化能を0%とし、トリガー投与の効果として
増大するTNF産生量が最大恒量に達したときの各トリ
ガーのマクロファージ活性化能を100%とし、その5
0%に相当するマクロファージ活性化能を与えるリムラ
ステスト陽性LPS含有量を曲線から読み取った。マク
ロファージ活性化能とリムラステスト陽性LPS含有量
との相関関係が上記条件を満たしたLPS採取源の結果
を表12〜表14に示す。表中で、「TNF」はTNF
産生量(単位/培養液ml)を、「活性化能」はマクロ
ファージ活性化能(%)を、「LPS」はリムラステス
ト陽性LPS含有量(ng/培養液ml)を表す。な
お、トリガー無添加時のTNF産生量は0.75単位/
mlであったので、TNF産生量が0.75単位/ml
以下である場合をマクロファージ活性化能0%とし、マ
クロファージ活性化能(%)は次式により計算した。
NF産生能を活性化する際のED50を与えるリムラス
テスト陽性LPSの含有量が0.4〜100ng/培養
液mlであるLPSの選択方法) 9週齢の、平均体重29gの各群3匹のオスのC3H/
Heマウスのマクロファージ腹腔常在細胞200μl
(2×105個)/穴を96穴の平底プレートに入れ、
プライマーとしての組換えマウス1FN−γ(100単
位/ml)を各穴に10μl宛加えた。別途、各種LP
S源を65℃の熱水(g/ml)で5時間抽出して調製
した抽出液を各種希釈し、その10μl/穴をプライマ
ー投与の3時間後にトリガーとして加えた。2時間培養
後に遠心分離操作に付した(3000G、20分)。各
穴から得られた130μlの、TNF活性はL929細
胞に対する毒性に基づいて測定し、又、リムラステスト
陽性LPS含有量は生化学工業株式会社のトキシカラー
ジステムを使用して測定した。測定値を、縦軸にTNF
産生量(単位/培養液ml)を、横軸(対数尺)に対応
リムラステスト陽性LPS含有量(ng/培養液ml)
を表す座標にプロットし、プロットされた各点から推定
されるシグモイド曲線を描いた。トリガーを投与しなか
った場合のTNF産生量を与える各トリガーのマクロフ
ァージ活性化能を0%とし、トリガー投与の効果として
増大するTNF産生量が最大恒量に達したときの各トリ
ガーのマクロファージ活性化能を100%とし、その5
0%に相当するマクロファージ活性化能を与えるリムラ
ステスト陽性LPS含有量を曲線から読み取った。マク
ロファージ活性化能とリムラステスト陽性LPS含有量
との相関関係が上記条件を満たしたLPS採取源の結果
を表12〜表14に示す。表中で、「TNF」はTNF
産生量(単位/培養液ml)を、「活性化能」はマクロ
ファージ活性化能(%)を、「LPS」はリムラステス
ト陽性LPS含有量(ng/培養液ml)を表す。な
お、トリガー無添加時のTNF産生量は0.75単位/
mlであったので、TNF産生量が0.75単位/ml
以下である場合をマクロファージ活性化能0%とし、マ
クロファージ活性化能(%)は次式により計算した。
【0046】
【数7】
【0047】
【表12】
【表13】
【表14】
【0048】実験例3(実験動物での発育促進効果−そ
の1) C3H/He雄マウスに、出生後、蒸留水(6匹)、L
PS換算でそれぞれ5ng/ml(6匹)、50ng/
ml(5匹)の粉末A−a2(製造例1)を含むように
調製した蒸留水を自由摂取させた。(以下、それぞれ、
蒸留水摂取群、5ng摂取群、50ng摂取群と称
す。) 他の給餌条件は全く同様であり、株式会社日本
クレア市販のラット、マウス用の飼料CE−2を自由摂
取させた。出生後に体重を測定し、各群の平均値(/
匹)として、次の表15に示す結果が得られた。表中、
5ng摂取群、50ng摂取群の欄中の増加率は、それ
ぞれそれらの平均値の、蒸留水投与群の平均値に対する
増加率(%)を表している。
の1) C3H/He雄マウスに、出生後、蒸留水(6匹)、L
PS換算でそれぞれ5ng/ml(6匹)、50ng/
ml(5匹)の粉末A−a2(製造例1)を含むように
調製した蒸留水を自由摂取させた。(以下、それぞれ、
蒸留水摂取群、5ng摂取群、50ng摂取群と称
す。) 他の給餌条件は全く同様であり、株式会社日本
クレア市販のラット、マウス用の飼料CE−2を自由摂
取させた。出生後に体重を測定し、各群の平均値(/
匹)として、次の表15に示す結果が得られた。表中、
5ng摂取群、50ng摂取群の欄中の増加率は、それ
ぞれそれらの平均値の、蒸留水投与群の平均値に対する
増加率(%)を表している。
【0049】
【表15】
【0050】図5は、表15に示した結果をグラフ化し
たものである。表15及び図5より、本発明のLPSが
有意な発育促進効果を示すことが明らかである。
たものである。表15及び図5より、本発明のLPSが
有意な発育促進効果を示すことが明らかである。
【0051】実験例4(実験動物での発育促進効果−そ
の2) 懐妊しているC3H/He雌マウスに蒸留水、LPS換
算でそれぞれ5ng/ml、50ng/mlの粉末A−
a2(製造例1)を含むように調製した蒸留水を自由摂
取させた。(以下、それぞれ、蒸留水摂取群、5ng摂
取群、50ng摂取群と称す。) 摂取開始後6日目に
蒸留水摂取群マウスから誕生した雌マウスを5匹、5n
g摂取群から誕生した雌マウスを7匹、50ng摂取群
から誕生した雌マウスを4匹選び、誕生後20日目から
それぞれ親マウスと同じ物を摂取させた。他の給餌条件
は誕生前から全く同様であり、株式会社日本クレア市販
のラット、マウス用の飼料CE−2を自由摂取させた。
誕生後20日目から各マウスの体重を測定し、各群の平
均値(/匹)として、次の表16に示す結果が得られ
た。表中、5ng摂取群、50ng摂取群の欄中の増加
率は、それぞれ、それらの平均値の、蒸留水投与群の平
均値に対する増加率(%)を表している。
の2) 懐妊しているC3H/He雌マウスに蒸留水、LPS換
算でそれぞれ5ng/ml、50ng/mlの粉末A−
a2(製造例1)を含むように調製した蒸留水を自由摂
取させた。(以下、それぞれ、蒸留水摂取群、5ng摂
取群、50ng摂取群と称す。) 摂取開始後6日目に
蒸留水摂取群マウスから誕生した雌マウスを5匹、5n
g摂取群から誕生した雌マウスを7匹、50ng摂取群
から誕生した雌マウスを4匹選び、誕生後20日目から
それぞれ親マウスと同じ物を摂取させた。他の給餌条件
は誕生前から全く同様であり、株式会社日本クレア市販
のラット、マウス用の飼料CE−2を自由摂取させた。
誕生後20日目から各マウスの体重を測定し、各群の平
均値(/匹)として、次の表16に示す結果が得られ
た。表中、5ng摂取群、50ng摂取群の欄中の増加
率は、それぞれ、それらの平均値の、蒸留水投与群の平
均値に対する増加率(%)を表している。
【0052】
【表16】
【0053】図6は、表16に示した結果をグラフ化し
たものである。表16及び図6より、本発明のLPSが
有意な発育促進効果を示すこと、又、表15及び図5に
示した結果との比較により、誕生後に本発明のLPSを
初めて摂取させるよりも、懐妊中の親にも摂取させるこ
とによりその発育促進効果は約2倍になることを示して
いる。
たものである。表16及び図6より、本発明のLPSが
有意な発育促進効果を示すこと、又、表15及び図5に
示した結果との比較により、誕生後に本発明のLPSを
初めて摂取させるよりも、懐妊中の親にも摂取させるこ
とによりその発育促進効果は約2倍になることを示して
いる。
【0054】投与量、投与間隔、毒性値 本発明のLPSを発育促進剤、動物用発育促進剤として
投与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医師或いは
獣医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体重、
投与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の成人
(60kg)で、経口投与で1μg〜100mg、静脈
投与で10ng〜10mg、経皮投与で100ng〜1
mgが1日1回の投与量の一応の目安となる。なお、動
物では、牛、馬等の大型動物は上記の量の60分の1を
体重1kg当たりの量の目安とし、豚、犬、猫等の中
型、小型の動物ではその2倍量を体重1kg当たりの量
の目安とし、鶏等の鳥類では更にその2倍量を体重1k
g当たりの量の目安とし投与できる。なお、ベーレンス
ケルバー(Behrens K
投与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医師或いは
獣医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体重、
投与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の成人
(60kg)で、経口投与で1μg〜100mg、静脈
投与で10ng〜10mg、経皮投与で100ng〜1
mgが1日1回の投与量の一応の目安となる。なお、動
物では、牛、馬等の大型動物は上記の量の60分の1を
体重1kg当たりの量の目安とし、豚、犬、猫等の中
型、小型の動物ではその2倍量を体重1kg当たりの量
の目安とし、鶏等の鳥類では更にその2倍量を体重1k
g当たりの量の目安とし投与できる。なお、ベーレンス
ケルバー(Behrens K
【外1】 rber)法により計算した、7週齢の平均体重22g
のC3H/He雄マウスにおけるLPS1、LPS2、
LPS3のLD50はそれぞれ150、180、180
μg/匹であり、大腸菌LPS[米国ディフコ(Dif
co)社製0128:B8]の値300μg/匹の60
%以下であった。又、小麦LPS(製造例1)、大腸菌
LPS(同上)、百日咳菌LPS(製造例3)の毒性値
LD50(1群2匹の雄BALB/Cマウス、平均体重
45g、における平均値)は静脈内投与でそれぞれ3.
2、3.4、11mg/kgであり、皮内投与でそれぞ
れ16、16、32mg/kgだった。
のC3H/He雄マウスにおけるLPS1、LPS2、
LPS3のLD50はそれぞれ150、180、180
μg/匹であり、大腸菌LPS[米国ディフコ(Dif
co)社製0128:B8]の値300μg/匹の60
%以下であった。又、小麦LPS(製造例1)、大腸菌
LPS(同上)、百日咳菌LPS(製造例3)の毒性値
LD50(1群2匹の雄BALB/Cマウス、平均体重
45g、における平均値)は静脈内投与でそれぞれ3.
2、3.4、11mg/kgであり、皮内投与でそれぞ
れ16、16、32mg/kgだった。
【0055】
【発明の効果】本発明により、優れた発育促進効果を有
し、未熟児の誕生を予防し、副作用や体内残留性の問題
がなく、長期使用が可能であり、生産コストが低く、し
かも、経口、経皮、薬浴、注射のいずれの経路でもで投
与可能な、大量に供給可能な発育促進剤、動物用発育促
進剤が提供される。
し、未熟児の誕生を予防し、副作用や体内残留性の問題
がなく、長期使用が可能であり、生産コストが低く、し
かも、経口、経皮、薬浴、注射のいずれの経路でもで投
与可能な、大量に供給可能な発育促進剤、動物用発育促
進剤が提供される。
【図1】小麦LPSをガスクロマトグラフィーにかけて
得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピークを
図示したチャートである。
得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピークを
図示したチャートである。
【図2】大腸菌LPSをガスクロマトグラフィーにかけ
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。
【図3】百日咳菌LPSをガスクロマトグラフィーにか
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。
【図4】LPS1、LPS2、LPS3の、SDS−2
法におけるパターンを示す図である。
法におけるパターンを示す図である。
【図5】本発明のLPSの発育促進効果を示すグラフで
ある。
ある。
【図6】本発明のLPSの発育促進効果を示すグラフで
ある。
ある。
【符号の説明】 図4において、1はLPS1の、2はLPS2の、3は
LPS3のパターンを示す。 図5、図6において、は蒸留水投与群の、△は本発明の
LPSの5ng投与群の、▲は本発明のLPSの50n
g投与群のデータを示す。
LPS3のパターンを示す。 図5、図6において、は蒸留水投与群の、△は本発明の
LPSの5ng投与群の、▲は本発明のLPSの50n
g投与群のデータを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 月岡 大輔 千葉県千葉市春日1−21−17 (72)発明者 水野 伝一 神奈川県鎌倉市岡本18 (72)発明者 大島 治之 東京都八王子市館町1097館ケ丘団地2−1 −513
Claims (11)
- 【請求項1】 LPSを含む発育促進剤であり、 インビトロで培養されるマクロファージのTNF産生能
を活性化するLPSのマクロファージ活性化能を指標と
し、 縦軸に、そのLPSを添加しないときのマクロファージ
のTNF産生量を与えるマクロファージ活性化能を0
%、マクロファージのTNF産生量を最大恒量にする時
のLPSのマクロファージ活性化能を100%とするマ
クロファージ活性化能(%)を表し、横軸に、そのLP
Sのリムラステスト陽性LPS含有量を対数尺で表すシ
グモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のED50を与えるリムラステ
スト陽性LPS含有量か0.4〜100ng/培養液m
lであるLPSの少なくとも1種を含む発育促進剤。 - 【請求項2】 LPSが、植物から得られるLPS、細
菌から得られるLPS、リピドA、それらの台成LPS
及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項
1記載の発育促進剤。 - 【請求項3】 植物から得られるLPSが、小麦から得
られ、次の物性を有するLPSである、請求項2記載の
発育促進剤。 主要分子量:8,000±1,000(SDS−1法に
よる) 8,000±1,000(SDS−2法による) 5,000±2,000(SDS−2法による) リン数:1〜4/分子量8千 ヘキソサミン数:6±2/分子量8千 脂肪酸数:6±2/分子量8千 KDO数=5±1/分子量8千 - 【請求項4】 植物から得られるLPSが、クロレラか
ら得られ、次の物性を有するLPSである、請求項2記
載の発育促進剤。 主要分子量=40,000〜90,000(SDS−2
法による) リン数=4±1/分子量1万 ヘキソサミン数=7±1/分子量1万 脂肪酸数=6±1/分子量1万 KDO数=2±1/分子量1万 - 【請求項5】 細菌から得られるLPSが、大腸菌から
得られ、次の物性を有するLPSである、請求項2記載
の発育促進剤。 主要分子量=40,000±10,000(SDS−2
法による) 8,000± 4,000(SDS−2法による) リン数=12/分子量3万 ヘキソサミン数=45±6/分子量3万 脂肪酸数=18/分子量3万 KDO数=5±1/分子量3万 - 【請求項6】 細菌から得られるLPSが、次の物性を
有するLPSである、請求項2記載の発育促進剤。 主要分子量:5,000±1,000(SDS−2法に
よる) リン数:2±1/分子量5,000 ヘキソサミン数:9±1/分子量5,000 KDO数:2±1/分子量5,000 - 【請求項7】 細菌から得られるLPSが、次の物性を
有するLPSである、請求項2記載の発育促進剤。 主要分子量:6,500±2,500(SDS−2法に
よる) リン数:1〜2/分子量5,000 ヘキソサミン数:7±1/分子量5,000 KDO数:1〜2/分子量5,000 - 【請求項8】 細菌から得られるLPSが、次の物性を
有するLPSである、請求項2記載の発育促進剤。 主要分子量:6,500±2,500(SDS−2法に
よる) リン数:2±1/分子量5,000 ヘキソサミン数:5±1/分子量5,000 KDO数:2±1/分子量5,000 - 【請求項9】 細菌から得られるLPSが、百日咳菌か
ら得られ、次の物性を有するLPSである、請求項2記
載の発育促進剤。 主要分子量=6,000±1,000(SDS−2法に
よる) リン数=4/分子量6千 ヘキソサミン数=12/分子量6千 脂肪酸数=4/分子量6千 KDO数=2±1/分子量6千 - 【請求項10】 細菌から得られるLPSが、A.ラデ
ィオバクターLPSである、請求項2記載の発育促進
剤。 - 【請求項11】 LPSを含む動物用発育促進剤であ
り、インビトロで培養されるマクロファージのTNF産
生能を活性化するLPSのマクロファージ活性化能を指
標とし、縦軸に、そのLPSを添加しないときのマクロ
ファージのTNF産生量を与えるマクロファージ活性化
能を0%、マクロファージのTNF産生量を最大恒量に
する時のLPSのマクロファージ活性化能を100%と
するマクロファージ活性化能(%)を表し、横軸に、そ
のLPSのリムラステスト陽性LPS含有量を対数尺で
表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファージ活性化
能のED50を与えるリムラステスト陽性LPS含有量
が0.4〜100ng/培養液mlであるLPSの少な
くとも1種を含む動物用発育促進剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3357351A JPH05155778A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Lpsを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3357351A JPH05155778A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Lpsを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05155778A true JPH05155778A (ja) | 1993-06-22 |
Family
ID=18453687
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3357351A Pending JPH05155778A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Lpsを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH05155778A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996023002A1 (fr) * | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Lipopolysaccharide de faible poids moleculaire |
US8075928B2 (en) | 2003-09-26 | 2011-12-13 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
-
1991
- 1991-12-02 JP JP3357351A patent/JPH05155778A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996023002A1 (fr) * | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Lipopolysaccharide de faible poids moleculaire |
US8075928B2 (en) | 2003-09-26 | 2011-12-13 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
EP2444480A1 (en) | 2003-09-26 | 2012-04-25 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
US9394513B2 (en) | 2003-09-26 | 2016-07-19 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
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