JPH0640937A - Ｌｐｓを含む鎮痛剤及び動物用鎮痛剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 化学治療係数が高く、経口、経皮、注射のい
ずれでも投与可能な鎮痛剤、動物用鎮痛剤を提供する。 【構成】 下記ＬＰＳの少なくとも１種を含むことを特
徴とする。ＬＰＳのインビトロで培養されるマクロファ
ージのＴＮＦ産生能を活性化するＬＰＳのマクロファー
ジ活性化能を指標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しな
いときのマクロファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロ
ファージ活性化能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生
量を最大恒量にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化
能を１００％とするマクロファージ活性化能（％）を表
し、横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含
有量を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロ
ファージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステスト陽
性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであ
るＬＰＳ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、鎮痛剤及び動物用鎮痛
剤に関する。より詳細には、本発明は、ＬＰＳを含む鎮
痛剤及び動物用鎮痛剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】痛みは、身体のある部位に何らかの障害
があることを示す警告反応である。従って、痛みをなく
すためには、その原因の消退、除去、治癒を待つことが
必要であるが、それにはある程度の時間を要するので、
多くの場合、根本療法と併用して、鎮痛剤が投与されて
いる。又、慢性痛の場合には、時間の経過とともに痛み
が憎悪することが多いので、鎮痛剤の投与は欠かせな
い。現在使用されている鎮痛剤は麻薬系鎮痛剤と非麻薬
系鎮痛剤とに大別される。麻薬系鎮痛剤としては、塩酸
モルヒネ、塩酸エチルモルヒネ、塩酸ペチジン、リン酸
コデイン等が使用されている。これらはいずれも急性痛
には著効を示すが、長期投与を余儀なくされる慢性痛に
対しては、薬剤耐性、耽溺性の出現等により、所定の鎮
痛効果が得られないことが多い。いずれにしても麻薬で
あることからして、投与に際しては最大限の注意が必要
とされている。（昭和５６年に株式会社メヂカルフレン
ド社が発行した「痛みの臨床」の７０〜７４頁）一方、
非麻薬系鎮痛剤の鎮痛作用は一般に麻薬系に比べて弱い
が、非習慣性であることが特徴である。これに属するも
のは数多く市販されており、アスピリン、フェニルブタ
ゾン、ペンタゾシン等が代表例といえる。アスピリンは
最も繁用されている鎮痛剤であり、アレルギー反応と大
量投与に注意すれば、安全性は高いとされている。（前
掲「痛みの臨床」の７５頁） しかし、頭痛、関節痛、
歯痛その他の外皮構造の痛みにはよく作用するが、内蔵
痛に対しては効果が薄いという欠点がある。（１９８６
年に廣川書店が発行した「第十一改正日本薬局方解説
書」のＣ−４６頁） フェニルブタゾンは、鎮痛作用はアスピリンより弱い
が、炎症性疼痛を緩和するので炎症性疾患に伴う疼痛を
鎮めるのに使用されている。しかし、死亡例も多く報告
されている程に副作用が強いので、それ以外の鎮痛目的
に使用されることはない。（前掲「第十一改正日本薬局
方解説書」のＣ−１３４２頁） ペンタゾシンは塩酸モルヒネの約１／３の強力な鎮痛効
果を持ち、習慣性のない非麻薬系鎮痛剤として広範に使
用されており、副作用は少ないとされているが、長期使
用においては耐性、依存性がみられるなど、薬理学的に
は麻薬系鎮痛剤と全く同様に取り扱われるべき薬剤であ
ると考えるべきとされている。（前掲「痛みの臨床」の
７４頁） このように、現在使用されている鎮痛剤には
幾多の欠点があり、未だ満足すべきものは提供されてい
ない。特に、慢性痛に対する鎮痛剤として、安全性が高
く、副作用がなく、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発
が強く待たれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、高い鎮痛効
果を有し、化学治療係数が高く、長期使用が可能であ
り、生産コストが安く、しかも、経口、経皮、注射いず
れの経路でも投与が可能な、大量に供給可能な新規な鎮
痛剤、動物用鎮痛剤を提供することを技術的課題とする
ものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】前記技術的課題は、高い
鎮痛効果を有し、化学治療係数が高く、長期使用が可能
であり、生産コストが安く、しかも、経口、経皮、注射
いずれの経路でも投与が可能な、大量に供給可能なＬＰ
Ｓを含む鎮痛剤、動物用鎮痛剤を提供することにより達
成される。この鎮痛剤、動物用鎮痛剤には、インビトロ
で培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能を活性化す
るＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標とし、縦軸
に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージのＴ
ＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０％、マ
クロファージのＴＮＦ産生量を最大かつ一定の値（本明
細書の他の箇所においては、「最大恒量」と称す）にす
る時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とす
るマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、その
ＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表
すシグモイド曲線を描くとき、マクロファージ活性化能
のＥＤ_５０を与えるリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量が
０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであるＬＰＳの少なく
とも１種が含まれる。ここで「少なくとも１種を含む」
とは、本発明のＬＰＳは各別に使用できることはもちろ
ん、その意図される用途が阻害されない限り、それらの
２種以上を任意に組み合わせて、又、更には他のいずれ
の物質とも組み合わせて使用できることを意味する。例
えば、他の鎮痛剤、鎮静剤、催眠剤、鎮痙剤、鎮吐剤等
と配合することもできる。

【０００５】「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一
種であり、動物体内のほとんど全ての組織に分布し、粒
子状の異物や体内の老廃細胞などを捕食して消化する大
型のアメーバ状細胞の総称である。「ＴＮＦ」は、マク
ロファージにより産生される腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）の総称であり
［１９８５年に発行された ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０、２３４５〜２３
５４頁］、マクロファージの活性が高まるにつれてその
産生量は増していく。「リムラステスト」は、１９６８
年にレヴィン（Ｌｅｖｉｎ）が創案した、カブトガニ血
球抽出液と発色合成基質を用いたエンドトキシン定量法
である。本発明の鎮痛剤、動物用鎮痛剤の活性成分とし
て使用できるＬＰＳは、特にその採取源、生産方法、精
製方法を限定されることはない。例えば、細菌や植物か
ら採取されるＬＰＳであっても、或は合成リピドＡのよ
うな合成品であってもよい。なお、本明細書、特にその
特許請求の範囲において、採取源は特に名称で特定され
たそのものに限定されることなく、その採取源の成長、
保存、流通の過程で付着、共存する細菌その他の全ての
ものが含まれる。例えば、「小麦ＬＰＳ」と特定された
場合には、小麦そのものから採取されたＬＰＳのみなら
ず、小麦の成長、保存、流通の過程で付着、共存する細
菌その他の全てのものが含まれるものと理解されたい。
なぜならば、特に寄生植物、寄生動物という関係が解明
されているもの以外にも、特定の植物、動物、菌界生
物、地衣界生物に、それらにより付着、共存を許された
ものが棲息している例が多く存在し得ることは当業界で
良く知られていることであるからである。

【０００６】これらＬＰＳのうちから、本発明の鎮痛
剤、動物用鎮痛剤の活性成分として使用できるＬＰＳを
選択するには、インビトロで培養されるマクロファージ
のＴＮＦ産生能を活性化するＬＰＳのマクロファージ活
性化能を指標とし、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないと
きのマクロファージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファ
ージ活性化能を０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を
最大恒量にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を
１００％とするマクロファージ活性化能（％）を表し、
横軸に、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
を対数尺で表すシグモイド曲線を描くとき、マクロファ
ージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステスト陽性Ｌ
ＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍｌであるも
のを選択すればよい。

【０００７】リムラステスト陽性植物源ＬＰＳ 原料植物として使用できるものを下記に例示する。な
お、本明細書に記載した植物が帰属する科名、属名は、
次の文献の記載を照合して決定された。 裸子植物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類：昭
和５７年（正編）、昭和５８年（続編）に北隆館から発
行された「原色牧野植物大図鑑」の記載を照合して所属
を決定した。但し、「燕麦」は、昭和４５年に女子栄養
大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭和５
８年に至文堂から発行された「新日本植物誌顕花篇」の
記載を照合し、「裸麦」は、昭和４６年に東京同文書院
から発行された「総合食品事典」の記載を照合し、「鳩
麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウコ
ン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダミ」
、「胡椒」、「トウガラシ」、「ダイウイキョウ」、
「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾウ」、「オ
タネニンジン」、「ボウフウ」、「オオツヅラフジ」、
「ウンカリア・ヒルスタ」は、昭和６３年に北隆館から
発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合
し、「アボガド」は、昭和５３年に財団法人農林統計協
会から発行された熱帯農業技術叢書第１５号「ブラジル
の果実」の記載を照合し、「カイワレダイコン」は、昭
和５９年に北隆館から発行された「原色園芸植物大図
鑑」の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和４４年に廣
川書店から発行された「図説熱帯植物集成」の記載を照
合し、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品協会が昭
和６１年に公示した、「クロレラ規格基準」の記載を照
合して所属を決定した。 菌類：昭和６２年に保育社から発行された「原色日本新
菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し、酵
母は、昭和３７年に技報堂から発行された「微生物学ハ
ンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前掲の
「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属を決
定した。 本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。裸子植物
としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマツを使用
できる。単子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属
植物であるイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ
科オオムギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属
植物である烏麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクマ
笹、イネ科ジュズダマ属植物である鳩麦、アヤメ科アヤ
メ属植物であるアヤメ、ユリ科ネギ属植物であるニンニ
ク、ユリ科キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ
科ジャノヒゲ属植物であるジャノヒゲ、ショウガ科ショ
ウガ属植物であるミョウガ、ショウガ科ウコン属植物で
あるウコン、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシ
ャクを使用できる。双子葉類植物としては、マメ科ダイ
ズ属植物である大豆、マメ科インゲンマメ属植物である
小豆、マメ科ソラマメ属植物であるそら豆、マメ科クズ
属植物であるクズ、マメ科カンゾウ属植物であるナンキ
ンカンゾウ、ナス科ナス属植物であるジャガイモ、トウ
ガラシ、ナス科トマト属植物であるトマト、ナス科トウ
ガラシ属植物であるトウガラシ、バラ科ビワ属植物であ
るビワ、バラ科サクラ属植物であるモモ、クスノキ科ア
ボガド属植物であるアボガド、クルミ科クルミ属植物で
あるクルミ、ウリ科トウナス属植物であるカボチャ、ウ
リ科アマチャヅル属植物であるアマチャヅル、アブラナ
科ダイコン属植物であるカイワレダイコン、マタタビ科
マタタビ属植物であるマタタビ、ドクダミ科ドクダミ属
植物であるドクダミ、コショウ科コショウ属植物である
胡椒、シキミ科シキミ属植物であるダイウイキョウ、ニ
クズク科ニクズク属植物であるニクズク、ミカン科ミカ
ン属植物であるダイダイ、ウコギ科オタネニンジン属植
物であるオタネニンジン、セリ科サボシュニコビア属植
物であるボウフウ、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物
であるオオツヅラフジ、アカネ科カギカズラ属植物であ
るウンカリア・ヒルスタを使用できる。シダ植物として
は、例えば、トクサ科トクサ属植物であるスギナ、ゼン
マイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを使用できる。ソ
ウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ類
植物、緑ソウ類植物、ランソウ類植物を使用できる。カ
ッソウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植物
であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、ホ
ンダワラ科ヒジキ属植物であるヒジキを使用できる。紅
ソウ類植物としては、例えば、ウシケノリ科アマノリ属
植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物と
しては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物であ
るクロレラを使用できる。菌類植物としては、例えば、
担子菌類植物、子ノウ菌類植物を使用できる。担子菌類
植物としては、例えば、ヒラタケ科マツオウジ属植物で
ある椎茸、キシメジ科エノキタケ属植物であるエノキ
茸、キシメジ科シメジ属植物であるシメジ、タコウキン
科マイタケ属植物であるマイ茸、サルノコシカケ科ポリ
ポラス属植物であるアワビ茸、ハラタケ科ハラタケ属植
物であるマッシュルーム、キクラゲ科キクラゲ属植物で
あるキクラゲ、モエギタケ科スギタケ属植物であるナメ
コを使用できる。子ノウ菌類植物としては、例えば、エ
ンドミセタセア科サッカロミセス属植物であるパン酵
母、醸造用酵母を使用できる。醸造用酵母にはビール酵
母、清酒酵母、葡萄酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の
他、サッカロミセス セレヴィシドに属する多くの酵母
（例えば、ウイスキーや老酒の製造に使用される酵母）
が含まれる。又、バッカクキン科ノムシタケ属植物であ
る冬虫夏草も使用できる。植物源ＬＰＳは、以下に述べ
る方法で分離、精製できる。 原料植物を必要に応じて適宜細切、乾燥、粉砕した後
に蒸留水によく懸濁し、上清を回収する。例えば、原料
植物が穀類の種子である場合は、種皮をつけたまま、或
は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は、食用に供せ
られている程度の粉末になるまで粉砕し、得られた粉末
に水を加えて分散液とし、撹拌した後に沈降物を静置又
は遠心分離により除去するか、粉末に水を加えて練って
得られるドウをミキサー中でゆるやかに水洗し、沈降物
を除去すればよい。原料植物がクロレラである場合に
は、まず細胞膜を破砕し、エタノール洗浄により脂溶性
物質を除去した後に水抽出するとよい。この水抽出の際
の原料植物の粒度、水の温度、液性、添加量、撹拌の速
度、時間、遠心分離の際の条件等は特に制限する必要は
なく、原料植物の種類に応じて適宜調整すればよい。
又、抽出水の温度は高い方がＬＰＳの採取量、純度とも
に高い傾向があるが、操作の便宜上、原料植物に含まれ
る澱粉の糊化を招来しない５０℃以下とすることが好ま
しい。又、水の添加量は、原料植物の種類、粒度により
異なるが、穀類種子の場合にはその割合が７０ｗ／ｖ％
以下、望ましくは２０〜５０ｗ／ｖ％程度とすると操作
上便宜である。更に、撹拌の速度は、起泡を引き起こさ
ない程度のものとすることが好ましい。なお、この段階
の操作迄で、本発明のリムラステスト陽性植物ＬＰＳの
純度は、リムラステスト活性データから判断して、例え
ば小麦種子の場合には約３０倍に上昇する。以下、穀類
種子を原料として使用する場合を例にとり説明するが、
いわゆる当業者であれば、以下の記載を参考にして、他
植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリムラステスト
陽性ＬＰＳを高純度で回収する方法を実施することは極
めて容易である。 純度を更に上げるためには、上記で得られた上清を
常法に従って限外濾過に付して分子量５０００以下の画
分を除去すればよい。 得られた乾燥品を、５０ｍｇ／ｍｌになるように蒸留
水に懸濁し、遠心分離操作に付して上清を回収する。 この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にすると
沈殿が生じる。この際使用する酸は特定のものである必
要はなく、例えば、トリクロロ酢酸（以下、ＴＣＡと称
す）、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロ酢
酸を使用できる。 次いで、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留水
で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収する。 沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカリ
を加える。この際使用するアルカリも特定のものである
必要はなく、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムを使
用できる。沈殿の溶解時に塩基性がｐＨ１１より大きく
なると目的のＬＰＳが失活するので注意が必要である。 次いで酸を加えてｐＨ８としてから３７℃に加温し、
更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、３７℃
に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付す。
なお、この際使用する酸も特定のものである必要はな
い。 上清を回収して氷冷し、４℃で再び遠心分離操作に付
す。 上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に従
って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも特
定のものである必要はない。 ▲１０▼次いで常法に従ってゲル濾過に付して、リムラ
ステスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾過用の担体
としては、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−７５、Ｇ−１００、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ）Ｓ−２００、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）６Ｂ［以上は米国ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｉｎｃ．）製］、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ
−１００［米国バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎ
ｃ．）社製］、トーヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５
（東洋曹達工業社製）を使用できる。緩衝液はｐＨ３〜
１０のものならいずれでもよい。例えば、トリス−ＨＣ
ｌ又はリン酸緩衝液を使用できる。 ▲１１▼次いでこの画分に蛋白分解酵素を加え、３７℃
で２時間以上インキュベーションして残存蛋白質を分解
し、得られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により
濃縮する。なお、この際に使用する蛋白分解酵素も特定
なものである必要はなく、例えば、Ｖ８プロテアーゼ、
キモトリプシン、トリプシン、サーモライシンを単独
で、或は任意に組み合わせて使用できる。市販品として
は、例えば、プロナーゼＥ（科研化学社）、プロティネ
ースＫ（メルク社）を使用できる。 ▲１２▼次いでこの画分を常法に従って、例えば、米国
ファルマシア社製のＦＰＬＣシステムでファルマシア社
製のモノＱ−セファロース（Ｓｅｐｈ−ａｒｏｓｅ）、
Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａ−ｒｏｓｅ）を使用し
て陰イオン交換クロマトグラフィーに付してリムラステ
スト陽性画分を得る。 ▲１３▼次いで、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に
付してリムラステスト陽性画分を回収する。 以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約２０％が回収され、純度約９５％の精製標品
が得られる。又、段階終了時の純度に比べ約１０００
倍の純度（小麦種子の場合）になる。以上の方法によっ
て得られたリムラステスト陽性植物ＬＰＳはそのまま、
或いは任意の程度に濃縮した形で提供できる。又、保存
性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾燥などの任意の手
段により乾燥粉末として提供することもできる。これら
はいずれも常法で生産できる。

【０００８】リムラステスト陽性細菌源ＬＰＳ 従来より知られている大腸菌ＬＰＳ、アルカリゲネス
ラデイオバクター（Ａ． ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）か
ら得られるＬＰＳ［ピー．エイチ．グラハム（Ｐ．Ｈ．
Ｇｒａｈａｍ）、エム．エイ．オーブリエン（Ｍ．Ａ．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）共著、”アントニック ファン リー
ウヴェンホック（Ａｎｔｏｎｉｃ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗ
ｅｎｈｏｃｋ）、ｖｏｌ．３４、３２６〜３３０頁（１
９６８年）；以下、Ａ．ラディオバクターＬＰＳと称
す］、百日咳菌ＬＰＳ、リピドＡ等の他、本明細書で追
って詳述する細菌源ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３及び
それらの合成ＬＰＳが該当する。大腸菌ＬＰＳは、例え
ば、米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社から市販されてい
る。百日咳菌ＬＰＳは、例えば、フナコシ薬品（日本）
から市販されている。又、公知の百日咳菌、例えば、東
浜株Ｉ相菌の死菌体から、例えば、下記文献記載の公知
方法により調製することもできる。ウエブスター（Ｗｅ
ｂｓｔｅｒ）等著の「ジェイ．イミュノル（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．）、７４４、５５（１９５５）；ウェストフ
ァル（Ｗｅ−ｓｔｐｈａｌ）等著の「ツェト．ナツール
フォルシュ（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ）」、７６、
１４８（１９５２）。リピドＡは、例えば、第一化学薬
品から市販されている。上記菌源ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３をそれぞれ産生する３種の菌は、本発明者等が
検討した小麦からはその産地、種類を問わず分離されて
いる。従って、いずれの産地、種類の小麦及びその加工
品からも分離されると推定される。本発明者等がそれら
３種の細菌を分離できることを確認した小麦粉の産地、
種類は次の通りである。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノザン・スプリングス 米国 １・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本 上記細菌からＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を分離する
には、ウェストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等が「メソ
ッズ イン カーボハイドレート ケミストリー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）のｖｏｌ．Ｖ［米国ニューヨークのアカ
デミック プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）社が
１９６５年に発行］の８３頁に記載した熱フェノール法
を用い、更に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即
ち、菌体を蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フ
ェノールと共に撹拌し、次いで、遠心分離により水層を
回収し、この水層を透析に付してフェノールを除去し、
限外濾過により濃縮して粗ＬＰＳ画分を得、この画分を
常法に従い、例えば、ファルマシア社製のＦＰＬＣシス
テムでファルマシア社製のモノＱ−セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付
して精製し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上
の操作により、純度９６％以上の精製標品が得られる。
原料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの検出、含量測定
は、後記実験例１に詳述する通り、例えば、生化学工業
株式会社からトキシカラーシステムという名称で市販さ
れている試薬セットを使用して実施できる。即ち、原料
植物を同システムのＬＳ−１セットと合わせて発色さ
せ、その発色の強さを、同じく同セットのＥｔ−２セッ
トを使用して作成した検量線と対比させればよい。糖は
フェノール−硫酸法［エム．デュボイス（Ｍ．Ｄｕｂｏ
ｉｓ）等著、アナリテイカル ケミストリ（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２８、３
５０頁、１９５６年］で、蛋白はローリー法［オー．エ
イチ．ローリー（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ）等著、ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）］、ｖｏｌ．１９３、６５頁、１９５１年］で測定
した。

【０００９】ＬＰＳがマクロファージのインビトロＴＮ
Ｆ産生能を活性化する能力の測定方法 動物体内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（プ
ライミング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが
必要であることは、カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）
らにより、プロシーディング オブ ナショナル アカ
デミー サイエンス オブ ユーエスエー［Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、７２、３６６
６〜３６７０頁（１９７５年）］に報告されている。プ
ライミング段階開始のために投与される薬剤が「プライ
マー」（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリン
グ段階開始のために投与される薬剤が「トリガー」（内
因性ＴＮＦ産生剤）である。 ＬＰＳがマクロファージ
のインビトロＴＮＦ産生能を活性化する能力を測定する
には、マウスのマクロファージ腹腔常在細胞を採取し、
これにプライマーとしての組み換えマウスＩＦＮ−γを
添加し、次いで、トリガーとしてのＬＰＳを添加し、そ
のＴＮＦ活性を測定すればよい。ＴＮＦ活性は、Ｌ−９
２９細胞［プロシーディング オブ ナショナル アカ
デミー サイエンス オブユーエスエー７２、３６６６
〜３６７０頁］に対する細胞毒性を基にして、次のよう
にして測定する。Ｌ９２９細胞を、５％仔牛胎児血清を
加えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下、Ｍ
ＥＭ培地と表す）で育成し、８×１０^４個の細胞が１０
０μｌの同上培地に含まれる様にし、９６穴の平底プレ
ートで育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ
_２、１００％Ｈ_２Ｏであり、通常の細胞培養に用いられ
る方法でよい。その後、アクチノマイシンＤを培地中に
終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加え、培養液の液量を
１５０μｌとする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で
稀釈したものを５０μｌ加える（この際稀釈率を適宜調
製し、ＥＤ_５０を求める事ができる）。更に、最終液量
２００μｌとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時間
培養する。細胞障害活性を測定するには、まず全培地を
除去し、ついで０．１％クリスタルバイオレットを含む
１％メチルアルコール溶液を加えて固定染色する。クリ
スタルバイオレットは全有核細胞を染色するが、死細胞
は染色後にプレート底面より水洗で除去されるので、生
存細胞の結果から細胞障害活性を直接測定できる。この
染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を指標として測
定し、対照群に対する染色度と比較する事で細胞障害活
性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ９２９細
胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を求める。対
照としてウサギＴＮＳ［腫瘍障害血清（Ｔｕｍｏｒ Ｎ
ｅｃｒｏｓｉｓ Ｓｅｒｕｍ）］を使用し、このウサギ
ＴＮＳの活性ｎ（単位／ｍｌ）を２．４×１０^６単位／
ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて決定する。このウサギ
ＴＮＳのＥＤ_５０を与える稀釈率（Ｃ）を求める。検体
活性（単位／ｍｌ）はＮ／Ｃ×ｎで計算する。

【００１０】提供できる剤の製造方法 本発明の鎮痛剤は、常法の製剤技術により、散剤、顆粒
剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、貼付
剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、坐剤、注射
剤等の形態で提供できる。又、動物用としては、更に、
飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加剤として調製
することもできる。飼料添加剤とする場合には、粉剤か
顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミックス製剤と
は、飼料との混合を容易にするために澱粉などの飼料成
分で希釈されたものを指す。本発明の鎮痛剤を飼料添加
剤、プレミックス製剤として添加できる飼料は市販され
ている飼料のいずれでもよい。又、ミネラル、ビタミ
ン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼料であってもよ
い。これら製剤には、所望ならば、保存性、均質性を保
持するために、常法により賦形剤、保存剤、緩衝剤等の
添加剤を加えることもできる。更に、矯味剤、矯臭剤、
着色剤を含めることもできる。賦形剤としては、例え
ば、乳糖、デンプンを使用できる。保存剤としては、例
えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸
エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラオキシ安
息香酸エステル類、デヒドロ酢酸ナトリウム、フェノー
ル、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベ
ン等を使用できる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸
塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用できる。

【００１１】鎮痛効果の確認 本発明の鎮痛効果は、非麻薬系鎮痛剤検定法の１つとし
て確立されている「酢酸−ライズィング（Ｗｒｉｔｈｉ
ｎｇ）法」（１９８２年に医歯薬出版株式会社から発行
された「炎症と抗炎症療法」の４１５頁）による動物実
験と、エイズ患者における臨床結果により確認した。酢
酸−ライズィング法では、マウスに酢酸を与え、酢酸に
起因する「身もだえ（ライズィング）」の発生頻度を予
防する度合いを、炎症性疼痛の緩和に繁用されているフ
ェニルブタゾンとの比較も含めて観察した。以下、実施
例、製造例、実験例により、本発明を更に詳細に説明す
る。なお、それらで使用された「大腸菌ＬＰＳ］は、米
国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製Ｏ１２８：Ｂ８である。

【００１２】製造例１（小麦ＬＰＳの製造） 小型ニーダに、１．０９％の灰分を含む硬質小麦粉
（アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング）
（３，１２０ｇ）を入れ、２．０３ｌの蒸留水を加えて
１０分間練ってドウとした。１５分間の静置後に１０ｌ
の水を加えてゆるやかに撹拌してデンプン乳液を洗い出
し、同時に可溶性成分を溶出させた。この溶出液を５℃
の冷蔵庫中で１２時間静置した後、デンプン等の沈降部
を除去した。上澄み液を凍結乾燥して２０１．１ｇの粉
末を得た（粉末Ａ）。更に、残留ドウに５ｌの蒸留水を
加えてゆるやかに撹拌し、以下、上記と同様に処理して
４０．１ｇの粉末を得た（粉末Ｂ）。 これら粉末Ａ、Ｂを米国アミコン社製限外濾過機ＨＦ
−Ｌａｂ１に供し、分子量画分５，０００については中
空系カートリッジＨＦ−Ｌａｂ１ＰＭ５を、分子量画分
１０，０００については中空系カートリッジＨＦ−Ｌａ
ｂ１ＰＭ１０を取り付けて限外濾過を行った［温度５〜
１０℃。入圧２５ｐｓｉ（１．７６ｋｇ／ｃｍ^２）、出
圧１５ｐｓｉ（１．０６ｋｇ／ｃｍ^２）］。その結果に
基づき各部分を次のように命名した。 粉末Ａ：分子量５，０００以下の部分をａ_１ 分子量５，０００以上の部分をａ_２ 粉末Ｂ：分子量５，０００以下の部分をｂ_１ 分子量５，０００以上の部分をｂ_２ 粉末Ａ：分子量１０，０００以下の部分をａ_３ 分子量１０，０００以上の部分をａ_４ 粉末Ｂ：分子量１０，０００以下の部分をｂ_３ 分子量１０，０００以上の部分をｂ_４ これら各画分を後記実験例１に詳述する方法に準拠して
リムラステストに付したら、分子量５，０００以上の画
分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、分
子量５，０００以下の画分にはほとんど存在しないこと
が確認された。 上記粉末ａ_２の３０ｇを１ｌ三角フラスコに入れ、６
００ｍｌの蒸留水を注いで、６０分間スターラーで撹拌
した後、日立冷却高速遠心機ＳＣＲ−２０Ｂ（ローター
ＲＰＲ１６を事前に４℃に冷却しておいた）で４℃で遠
心分離操作（１０，０００Ｇ×１０分）に付して上清を
回収した。 この上清を１ｌ三角フラスコに入れ、氷冷下（液温約
２℃）、スターラーで撹拌しながら、事前に２℃に冷却
してあった１００％ＴＣＡ水溶液２０．５ｍｌを滴下
し、滴下終了後氷水中に１０分間放置した。 次いで前記と同様にして４℃で遠心分離操作（１０，
０００Ｇ×１０分）に付して沈殿を回収し、氷水中で冷
却下、３００ｍｌの蒸留水と共に５００ｍｌのビーカー
に入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様にして４
℃で遠心分離操作（１０，０００Ｇ×１０分）に付して
沈殿を回収した。 この沈殿を１ｌビーカーに入れ、蒸留水５００ｍｌで
懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液約３．５ｍｌを使用
して中和（ｐＨ７）し、ついで、氷水中で冷却しなが
ら、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液約２ｍｌを添加して０．
０２Ｎ水酸化ナトリウム溶液になるようにして沈殿を溶
解した。 １Ｎ塩酸約１．５ｍｌを加えてｐＨ８とし、次いで１
００ｍｌの蒸留水を加えた後に１ｌ三角フラスコに移し
て３７℃のインキュベーター内で３０分間ゆっくり振盪
した。 １００％ＴＣＡ水溶液３０ｍｌを加えて混合した後、
３７℃のインキュベーター内で１０分間ゆつくり振盪し
てから、約３７℃に保温した遠心分離器トミーＣＤ１０
０Ｒ（トミー精器社製）を使用して遠心分離操作（３，
０００Ｇ×１０分）に付した。 上清を回収して氷冷し、４℃で遠心分離操作（１０，
０００Ｇ×１０分）に付した。 ▲１０▼上清を回収して１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液約
３．６ｍｌで中和してｐＨ７とし、限外濾過器（東洋濾
紙ＵＨＰ−１５０、フィルター：ＵＫ−１０、Ｎ_２圧：
４．０ｋｇ／ｃｍ^２）で濃縮した。 ▲１１▼得られた濃縮液６０ｍｌを、セファロース（Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラム［米国ファルマシア社
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）製、カラムサイズ：
５ｃｍ（内径）×１００ｃｍ（２リットル）］を使い、
ゲル濾過［緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／１０ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、流速：６０ｍｌ／時］に付し
て、各２０ｍｌの画分を得た。 ▲１２▼初めから４３番目から５６番目迄の画分２８０
ｍｌを併せ、プロナーゼＥ（科研化学社）４５０μｇを
加え、振盪下、３７℃に２時間保温した後に、限外濾過
器（東洋濾紙ＵＨＰ−６２、フィルター：ＵＫ−１０、
Ｎ_２圧：４．０ｋｇ／ｃｍ^２）で濃縮した。次いで、フ
ァルマシア社製ＦＰＬＣシステム（カラム：モノＱＨＲ
１０／１０）を使って陰イオン交換クロマトグラフィー
に付した。即ち、１０ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ７．
５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料をカラム
に付した後、上記緩衝液でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増
加された組成を持つ緩衝液（２００ｍｌ）でカラムを洗
った。次いで、ＮａＣｌ濃度を、１６５ｍＭから１Ｍの
ＮａＣｌ濃度勾配になるように増加させながら全量４０
０ｍｌで目的ＬＰＳを溶出させ、各２ｍｌの画分を回収
した。リムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をか
けてから５〜８番目の画分を併せて、ＬＰＳ純度約９２
％の８ｍｌ［ＬＰＳ：３．０３ｍｇ（後記実験例１記載
の方法で測定したリムラステスト陽性ＬＰＳ換算値であ
る。以下のＬＰＳ量も全てこの換算値である）、糖：
０．２３ｍｇ、蛋白：０．０４ｍｇ）を回収した。 ▲１３▼次いでその８ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）×
２０．２ｃｍ（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝
液：水）に付して各３ｍｌの画分を回収した。リムラス
テスト陽性の確認された第９〜１２番目の画分を併せ
て、ＬＰＳ純度約９５％の１２ｍｌ（ＬＰＳ：２．７ｍ
ｇ、糖：０．１８ｍｇ、蛋白：０．０３ｍｇ）を回収し
た。なお、この画分は、陰イオン交換クロマトグラフィ
ーにより酸性であることを確認した。又，ＳＤＳゲル電
気泳動法による分子量は６，０００〜１０，０００だっ
た。 ▲１４▼上記画分を−８０℃で凍結後に恒量になるまで
凍結乾燥し、重量を測定したら０．７５ｍｇあった。
（以下、この凍結乾燥標品を小麦ＬＰＳと称す）この小
麦ＬＰＳのリムラス活性を後記実験例１記載の方法で測
定したら２．７ｍｇに相当するので、その比活性は
２．７÷０．７５＝３．６になる。また、夾雑物として
存在し得る単独の糖は、以上の精製により実質上全て除
去されたと考えられるので、検出された糖は全て、小麦
ＬＰＳを構成している糖と考えられる。従って、この段
階での小麦ＬＰＳの純度を重量に基づいて計算すると 蛋白＝０．０３ｍｇ ＬＰＳ＝０．７５−０．０３＝０．７２ｍｇ だから、 ０．７２÷０．７５×１００＝９６（％）である。

【００１３】小麦ＬＰＳの物性 ▲１５▼分子量 小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製
し、その４μｌを１．５ｍｌのトレフチューブに入れ
た。これに、別途、１ｍＭのＥＤＴＡに２．５％ＳＤ
Ｓ、５％メルカプトエタノール、１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）を加えて調製したＳＤＳ処理液１μｌを
加え、この混液を３分間沸騰水に浸した。ファルマシア
社製のファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）
を使用し、電極との間にＳＤＳ−バッファー ストリッ
プ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｔｒｉｐ）（ファルマシア社製）
が介在せられた１μｌの上記混液をゲル［ファルマシア
社製のファスト ゲル グラディエント（Ｐｈａｓｔ
Ｇｅｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ８−２５）に塗付し、最大電
圧２５０ｖ、最大電流１０ｍＡにセットして泳動を開始
させた（本明細書でこの泳動法をＳＤＳ電気泳動法と称
する）。泳動終了後、クマシー染色と銀染色における挙
動を観察した。クマシー染色では、染色液としてファル
マシア製の０．１％ファスト ゲルブルー（Ｐｈａｓｔ
Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ） Ｒを、脱色液として、メタノー
ル：酢酸：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使い、次
の順序で染色・脱色した。 １）５０℃で８分間染色 ２）５０℃で５分間脱色 ３）５０℃で８分間染色 ４）５０℃で１０分間脱色 ５）５０℃で５分間保護（グリセロール、酢酸、蒸留水
の容量比５：１０：８５混液） ６）乾燥 銀染色は、次の順序で行った。 １）５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１：４混液）で処理 ２）５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ３）５０℃で４分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ４）５０℃で６分間、増感液（８．３％グルタルジアル
デヒド）で処理 ５）５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ６）５０℃で５分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比１０：５：８５混液）で処理 ７）５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ８）５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ９）４０℃で１３分間、０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀で処理 １０）３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １１）３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １２）３０℃で３０秒間、現像液（０．０４ｖ／ｖ％ホ
ルムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄
液）で処理 １３）３０℃で４分間、現像液（０．０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液）
で処理 １４）５０℃で２分間、反応停止液（５％ｖ／ｖ％酢
酸）で処理 １５）５０℃で３分間、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理 １６）乾燥 ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子量８，００
０±１，０００の位置に小麦ＬＰＳの主要染色帯が検出
された。 ▲１６▼リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して、２５
μｇの小麦ＬＰＳを含む２０μｌの溶液を調製し、小試
験管に入 れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％硫酸を添加
し、１６０℃で２時間加熱した。次いで、２０μｌの１
０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバーナーで１分
間加熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌの蒸留水、
次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ硫酸、２ｍ
ｌの蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブデン酸アン
モニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコルビン酸を
混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を添加して室
温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの吸光度（Ｏ
Ｄ_{６２０ｎｍ}）を測定した。なお、検量線作製用の試料
としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬社製）を蒸
留水で希釈し、リン重量としてそれぞれ２．５μｇ、１
μｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．５ｍｌの溶液を
調製して使用した。なお、リン１ｇはリン酸二水素カリ
ウム４．３９ｇに相当する。得られた結果を表１に示
す。

【表１】 表１において、小麦ＬＰＳのデータは、無機リンの混入
（例えば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。小麦ＬＰＳの分子量を８，０００と仮定し、
上表の結果に基づいてその１分子当たりのリン数を次式
により計算すると１〜４になる。

【数１】 上記実験でリン数が１〜４と変動している原因の１つと
しては、精製段階でのモノフォスフォエステラーゼの混
入により、リン酸が脱離したことも考えられる。 ▲１７▼ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。小麦ＬＰ
Ｓを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、そ
の１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イワ
キガラス社製）に入れ、これに１００μｌの８ＮＨＣｌ
を添加して１１０℃で１６時間加熱した。４ＮＮａＯＨ
を約２００μｌ添加してｐＨ７とした。その１００μｌ
を分取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入
れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた後に、１０５℃で
１．５時間加熱し、次いで流水で冷却した。次いで、１
００μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加
え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加えた後に室温で１
時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測定した。検量線作
製用試料としては０．２０〜２００μｇ／ｍｌのＮ−ア
セチル グルコサミン（和光純薬社製）を使用した。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製。 結果、小麦ＬＰＳのヘキソサミン数は６±２／分子（仮
定分子量８，０００）だった。 ▲１７▼脂肪酸含有量 ９０μｌの小麦ＬＰＳ蒸留水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に１
０μｌの内部標準（０．５５ｍＭのマルガリン酸）を加
えた。１．０ｍｌの０．５Ｍナトリウムメチラートを加
えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を行った。
室温で１時間放置後に９６０μｌの０．５ＮＨＣｌを加
えて中和した。これに２ｍｌのヘキサンを加えて１５分
間激しく撹拌した。次いで、１，０００ｇで５分間遠心
分離を行いヘキサン層を分取した。窒素ガスでヘキサン
を蒸発させて、約２０μｌになるまで濃縮した。このサ
ンプルをガスクロマトグラフィー［本体：島津社製のＧ
Ｃ８ＡＰＦ、キャピラリーカラム：カナダのスペルコ
（Ｓｐｅｌｃｏ）社製ＦＳＣＡＰ Ｓｐ２３３０、キャ
リヤーガス：窒素］に付して脂肪酸量を測定した。脂肪
酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の合成リピ
ドＡである大腸菌型ＬＡ−１５−ＰＰ（分子量２，００
０で、１分子中の脂肪酸数は６であることが知られてい
る）を用いた。結果、小麦ＬＰＳの脂肪酸数は６±２／
分子（仮定分子量８，０００）であると推定された。上
記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添付
図面第１〜３図に示す。第１図は小麦ＬＰＳの、第２図
は大腸菌ＬＰＳの、第３図は百日咳菌ＬＰＳのチャート
である。第１〜３図において、図示されている主要ピー
ク番号に対応する保持時間（分）は次の通りであった。 第１〜３図の比較により、小麦ＬＰＳのチャートは大腸
菌ＬＰＳのチャートに似ているが、百日咳菌ＬＰＳのも
のとは大きく異なることは明白である。 ▲１８▼ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、１．０５ｍｇ／ｍｌの小麦ＬＰＳを含む蒸
留水２５０μｌを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３０
分間加熱後に冷水（２３℃）中で３０分間冷却し、つい
で日立分光光度計３２０を使って４２０、４７０、６３
０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値をそ
れぞれＡ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、１２７μｇ／ｍｌのＫＤＯア
ンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含む
蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料それ
ぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値（Ｓ_Ｔ）は０．３７９、標準試料の値（Ｓ
_ｓ）は０．２９４であった。この値の比較により、小麦
ＬＰＳには５±１モル／分子量８千のＫＤＯが含まれる
と推定された。

【００１４】製造例２（クロレラＬＰＳの製造） 細胞膜破砕クロレラ（（株）マンナンフーズ社製）３
０ｇを、洗浄液が緑色に着色しなくなるまでエタノール
で洗浄した。 この洗浄残渣２６ｇを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留
水に溶かし、４５℃で２時間振盪後に遠心分離操作（４
℃、１０，０００Ｇ×３０分）に付した。 上清を回収し、東洋濾紙Ｎｏ．２で濾過し、次いで蒸
留水で抽出した。 抽出液２９０ｍｌを下記条件で陰イオン交換クロマト
グラフィーに付した。 カラム：Ｑ−セファロース（φ３ｃｍ×２３ｃｍ、容量
約１８０ｍｌ） 緩衝剤：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、Ｎａ
Ｃｌ濃度勾配：１０ｍＭ、４００ｍＭ、１Ｍ 流速：１００〜２００ｍｌ／時 温度：室温 素通りした画分３１０ｍｌをグルコアミラーゼで処理
して澱粉を分解した（ｐＨ５．０、４０℃、約２時
間）。澱粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生じない
ことにより確認した。 遠心分離（１０，０００Ｇ×１０分）に付して上清を
回収し、１０ＮＮａＯＨ溶液で中和してｐＨ７とし、分
子量２０万カットのボアサイズを有するウルトラフィル
ターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を行
った。 得られた濃縮液３０ｍｌをファルマシア社製ＦＰＬＣ
システム（カラム：モノＱＨＲ１０／１０）を使って陰
イオン交換クロマトグラフィーに付した。即ち、１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌと１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液
（ｐＨ７．５）で試料をカラムに付した後、上記緩衝液
でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増加された組成をした液
（２００ｍｌ）でカラムを洗った。次いで、目的ＬＰＳ
を溶出するため、１６５ｍＭから１ＭのＮａＣｌ濃度勾
配になるようにＮａＣｌ濃度を増加させながら全量４０
０ｍｌでカラムを洗い、各２ｍｌの画分を回収した。リ
ムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけてから
５〜８番目の画分を併せた。 次いでその８ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）Ｇ−２５［カラム：２．０ｃｍ（内径）×２０．
２ｃｍ（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液：水）
に付して各３ｍ１の画分を回収した。リムラステスト陽
性の確認された第９〜１２番目の画分を併せて１２ｍｌ
を回収した（ＬＰＳ：１４．３ｍｇ、糖：２．０ｍｇ、
蛋白：０．５３ｍｇ）。ＬＰＳは後記実験例１記載の方
法で測定した。 上記画分を−８０℃で凍結後に恒量になるまで凍結乾
燥し、重量を測定したら５．８ｍｇあった。（以下、こ
の凍結乾燥標品をクロレラＬＰＳと称す）このクロレラ
ＬＰＳのリムラス活性は１４．３ｍｇに相当するので、
その比活性は １４．３÷５．８＝２．５ になる。また、以上の精製で、夾雑物として存在し得る
単独の糖は実質上全て除去されたと考えられるので、検
出された糖は全て、クロレラＬＰＳを構成している糖と
考えられる。従って、この段階でのクロレラＬＰＳの純
度を重量に基づいて計算すると、 蛋白＝０．５３ｍｇ ＬＰＳ＝５．８−０．５３＝５．２７ｍｇ だから、 ５．２７÷５．８×１００＝９１（％）である。クロレラＬＰＳの物性 製造例１に記載の方法と同様にして、次の値が得られ
た。但し、分子量は、後記製造例４に記載のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法により測定した。 主要分子量＝４０，０００〜９０，０００ リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万

【００１５】製造例３（百日咳菌ＬＰＳの製造） 千葉県血清研究所から入手した試験用百日咳菌液（２．
０×１０^１０細胞／ｍｌ）を死菌体として用いた。上記
死菌体を２５ｍｇ（乾燥重量）／ｍｌとなるように滅菌
水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール液（６
８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪しながら抽
出した。８，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離して水
層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と等量
の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水層を
先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータリー
エバポレータで１／１０に濃縮した。これを８，０００
Ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分取し、酢酸
ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノールを６倍
量加えて−２０℃で一晩放置した。４，０００Ｇ、４℃
で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノールで
２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄し、アスピレータ
で乾燥させた。残さを、２０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸
留水に懸濁し、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）社製
のソニファイア１８５型で超音波処理（出力コントロー
ル５、１５分、室温）に付した。次いで２，５００Ｇ、
４℃で１０分間遠心分離し、上清を分取した。この上清
を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核酸分解酵
素ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ Ａで１５〜１６時間処理
した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉと、
２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを使用した）。更に同
じ濃度の核酸分解酵素を加えて３７℃で２時間加温し
た。次いで２，５００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌｍａ
ｎ）社のアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使い、
孔径０．２μｍで濾過した。濾液を分子篩にかけ［樹
脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製セフ
ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイズ＝
内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、流速
＝約３ｍｌ／ｃｍ^２／時）、生化学工業社製のＬＳ−１
キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合わせ、
上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径０．２μ
ｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［装置：米国フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ＦＰＬＣ、樹
脂：米国ファルマシア社製モノＱ ＨＲ１０／１０、緩
衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋１０ｍＭのＮａＣｌ
（ｐＨ７．５）で１５分洗浄し、次いで、ＮａＣｌ量を
１６５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次いで、２０分か
けて、ＮａＣｌ量が１６５ｍＭから１Ｍの濃度勾配にな
るようにＮａＣｌ量を増加させながら洗浄し、次いで、
１ＭのＮａＣｌ量で３０洗浄する、流速＝２ｍｌ／
分］、生化学工業社製のＬＳ−１キットを用いてリムラ
ス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分をカラ
ムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社製セファデックスＧ−２５ファイン（ｆｉｎ
ｅ）、カラムサイズ＝内径２ｃｍ×長さ２５ｃｍ、溶出
液＝蒸留水］、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標品
（４．５０ｍｇ）に混入している可能性の最も高い物質
は核酸である。そこで、紫外吸収曲線（２００〜４００
ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度を求めた。吸光度
１のときの核酸濃度が５０μｇ／ｍｌであることを用い
て上記吸光度から核酸濃度を算出したら１％以下であっ
た。又、ＳＤＳ電気泳動では蛋白質は明確には検出され
なかった。従って、検出感度を考慮すると、上記凍結乾
燥標品に混入している蛋白質は高々０〜３％と推定され
る。従って、上記凍結乾燥標品の純度は９６％以上と推
定された。製造例１に記載の方法と同様にして測定され
たこの百日咳菌ＬＰＳの物性は次の通りであった。但
し、分子量は後記製造例４に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
によって測定した。百日咳菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝６，０００±１，０００、 リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千

【００１６】なお、製造例１に記載の方法と同様にして
測定された大腸菌ＬＰＳ［米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）
社製Ｏ１２８：Ｂ８］の物性は次の通りであった。但
し、分子量は後記製造例４に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
によって測定した。大腸菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝４０，０００±１０，０００ ８，０００±４，０００ リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万

【００１７】製造例４ ５０ｍｌ容コーニングチューブに、１．０９％の灰分
を含む硬質小麦粉（カナダ産の１・カナデイアン・ホイ
ート）１．０４ｇを秤量して入れ、２０ｍｌの蒸留水を
加えて５０ｍｇ／ｍｌの小麦粉液を調製した。 この液を３７℃の水浴中で振とう培養し、経過時間０
時、１時、２時、３時、４時、６時、８時、１０時、１
２時、２０時、２４時、４５時に各０．５ｍｌを採取
し、１０^０〜１０^５倍希釈して標準寒天培地（日水製薬
社製の培地であり、下記の組成を持つ）に１００μｌ宛
をまき込み、生菌数の測定、コロニーの観察を行った。標準寒天培地（日水製薬社コード番号：０５６１８） １リットル中 酵母エキス ２．５ｇ ペプトン ５．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ ７．１±０．１ 種類が異なると考えられた、培養経過時間８時間目、
１０時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロニー
（コロニー１）、クリーム色不透明コロニー（コロニー
２）、黄色半透明コロニー（コロニー３）、乳白色不透
明コロニー（コロニー４）、白色不透明な小さなコロニ
ー（コロニー５）を上記と同種の別の標準寒天培地にま
き、植え継ぎ、一方で、コロニー１〜５の細菌のグラム
染色性、リムラス活性を調べた。上記コロニーのうち、
コロニー４及びコロニー５（共にグラム染色性＋）のリ
ムラス活性はコロニー１〜３（共にグラム染色性−）に
比べて極めて低かったので、以後の検討から除き、日水
製薬社製の培地及びＩＤテスト・ＥＢ−２０を使用し、
コロニー１〜３の形態、生化学的性状を観察した。次の
結果が得られた。

【００１８】コロニー１を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−１） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６４号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５０
９号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明なコロ
ニーを形成する。 ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成する。 ［ＳＳ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５０３１］ 組成１リツトル中 肉エキス ５．０ｇ 胆汁酸塩 ９．０ｇ ペプトン ７．５ｇ ラクトース １０．０ｇ クエン酸ナトリウム ８．５ｇ チオ硫酸ナトリウム ５．５ｇ クエン酸第二鉄 １．０ｇ ニュートラルレッド ０．０２５ｇ ブリリアントグリン ０．０３３ｇ カンテン １３．５ｇ ｐＨ：７．１±０．１ ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 ［ＴＳＩ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５１０
３］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ ＮａＣｌ ５．０ｇ ペプトン １５．０ｇ ラクトース １０．０ｇ シュクロース １０．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ クエン酸第二鉄 ０．２ｇ チオ硫酸ナトリウム ０．２ｇ フェノールレッド ０．０２ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ：７．６±０．１ （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：− アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：−

【００１９】コロニー２を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−２） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６５号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
０号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定さ
れる。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成する。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：＋ フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：＋

【００２０】コロニー３を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−３） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６６号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
１号としてプダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成しない。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：− ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：一

【００２１】コロニー１、２、３をそれぞれ１リット
ルのＬ−肉汁培地に移し、３７℃で一夜振とうし、５，
０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理して集菌した。な
お、このＬ−肉汁培地は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社の
ポリペプトン１０ｇ、同社の酵母エキス５ｇ、和光純薬
社の特級ＮａＣｌ（５ｇ）を蒸留水に入れ、ＮａＯＨで
ｐＨ７．５に合わせ、オートクレーブし、別途、予め調
製済みの和光純薬社の特級グルコースの４０％溶液を４
００倍に希釈して加えて調製したものである。 各菌体をそれぞれ５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、これに
５０ｍｌの９０％熱フェノールを加えて６５〜７０℃で
２０分間撹拌し、冷却後に、１０，０００Ｇ、４℃で２
０分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層を
更に２回上記と同一の操作に付した。３つの水層を合わ
せ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アドヴ
ァンテック・トーヨー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹＯ）
社のＵＫ−２００を使用して限外濾過に付して分子量２
０万カット−オフにより濃縮した（Ｎ_２圧：２気圧）。 この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のＱ−セファ
ロース ファスト フロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使って陰イオン交換クロマトグ
ラフィーに付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料を
カラムに付した後、４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出さ
せた。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して
脱塩、濃縮して、純度９６％以上のＬＰＳを得た。な
お、核酸は１ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）で溶出した。

【００２２】各菌体の結果は次表２〜４の通りであっ
た。核酸量はＯＤ（２６０ｎｍ）での測定値に基づき
（１０Ｄ＝５０μｇ）、純度（％）は次式に基づき計算
した。

【数２】

【００２３】

【表２】

【表３】

【表４】

【００２４】分子量 各菌体から得られたＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２ｍ
ｇ／ｍｌ溶液を調製し、その１０μｌを１．５ｍｌ容プ
ラスチックチューブに入れた。これに、別途、１８０μ
ｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メル
カプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１
２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）及び２
２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０
μｌを加えてよく混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸
した。この加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。１０
ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシン
及び３．０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解し
て調製した泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気
泳動槽に入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動
槽に固定し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０ｖに
１時間、次いで、１５０ｖに固定して、色素がゲルより
溶出するまで泳動を続けた（本明細書においてこの泳動
法をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法と称する）。泳動終了後に、バ
イオラッド社の銀染色キット１６１−０４４３を使い銀
染色を室温で行って、挙動を確認した。同時に泳動させ
た蛋白分子量マーカー［ファルマシア社製のＬＭＷキッ
トＥ：ホスホリラーゼｂ（９４ｋ）、アルブミン（６７
ｋ）、オブアルブミン（４３ｋ）、カーボニックアンヒ
ドラーゼ（３０ｋ）、トリプシンインヒビター（２０
ｋ）、α−ラクトアルブミン（１４ｋ）］、ペプチド分
子量マーカー［ファルマシア社製の１８６０−１０１分
子量マーカー：ミオグロビン（１６．９ｋ）、ミオグロ
ビンＩ＆ＩＩ（１４．４ｋ）、ミオグロビンＩ（８．２
ｋ）、ミオグロビンＩＩ（６．０ｋ）、ミオグロビンＩ
Ｖ（２．５ｋ）］の泳動位置からＬＰＳの分子量を計算
したら、５，０００±１，０００（菌体９００８１４−
１に由来するＬＰＳ１）、６，５００±２，５００（菌
体９００８１４−２に由来するＬＰＳ２及び菌体９００
８１４−３に由来するＬＰＳ３）であった。上記銀染色
におけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３の染色帯を図４
に示す。図４において、番号１〜３がそれぞれＬＰＳ１
〜３に対応する。図４に示されるように、ＬＰＳ１は分
子量３万付近にもややまとまった染色帯を示した。ＬＰ
Ｓ２は３０，０００から４３，０００の間にも染色帯が
認められるが、１４，０００以下の染色帯の染色度と比
較すると、高分子のものは極めて少ないと推定される。
後述する糖量、ヘキソサミン量から判断しても、ＬＰＳ
２は最も糖含有率が低く、ついでＬＰＳ３、ＬＰＳ１の
順で高くなり、電気泳動で観察されたパターンと一致す
ると考えられる。又、ＬＰＳ量／総乾燥収量の比もＬＰ
Ｓ２、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に低くなっている。以上
の観察結果から、ＬＰＳ２は比較的低分子のＬＰＳが多
く、次いで、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順にその割合は少な
くなると推定される。

【００２５】リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、３１．６μｇ、５７．
６μｇ、１０３．６μｇのＬＰＳを含む２０μｌの溶液
を調製し、小試験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％
硫酸を添加し、１６０℃で２時間加熱した。次いで、２
０μｌの１０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで１分間加熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌ
の蒸留水、次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ
硫酸、２ｍｌの蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブ
デン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を
添加して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの
吸光度ＯＤ（８２０ｎｍ）を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬
社製）を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
２．５μｇ、１μｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．
５ｍｌの溶液を調製して使用した。なお、リン１ｇはリ
ン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する。結果を次表
５に示す。なお、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
（例えば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量（μｇ）は吸光量から計算された値で
ある。リン量（重量％）は、次式により計算した。な
お、式中の「０．６７」は、標準のリン１μｇのＯＤ値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各ＬＰＳの
濃度（ｍｇ／ｍｌ）を指す。

【数３】 リン数は、次式により計算した、分子量５，０００当た
りの換算数である。

【数４】

【００２６】

【表５】

【００２７】ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して１．５８ｍｇ（ＬＰＳ１）、２．８８
ｍｇ（ＬＰＳ２）、５．１８ｍｇ（ＬＰＳ３）／ｍｌの
溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付
きスピッツ（イワキガラス社製）に入れ、これに１００
μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨ７とし
た。その１００μｌを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた
後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、１００μｌを分取し、６７０μｌの９６
％エタノールを加え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加
えた後に室温で１時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μ
ｇ／ｍｌのＮ−アセチル グルコサミン（和光純薬社
製）を使った。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製した。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製した。 結果、ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３のヘキソサミン数
は各々９±１／分子量５，０００、７±１／分子量５，
０００、５±１／分子量５，０００だった。

【００２８】ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、（１）０．５０５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ１を
含む２５０μｌ蒸留水溶液；（２）０．５７６ｍｇ／ｍ
ｌのＬＰＳ２を含む２５０μｌ蒸留水溶液；（３）０．
５１８ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ３を含む２５０μｌ蒸留水溶
液；のいずれかを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３３
分間加熱後に冷水（２４．５℃）中で３０分間冷却し、
ついで日立分光光度計３２０を使い４２０、４７０、６
３０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値を
各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、０．５μモル／ｍｌのＫＤＯ
アンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含
む蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値（Ｓ_Ｔ）はＬＰＳ１で０．１０９、ＬＰＳ
２で０．０７８、ＬＰＳ３で０．０９９であった。標準
試料の値（Ｓ_Ｓ）は０．２４６であり、蒸留水のみの値
は０．００５であった。この値の比較により、ＬＰＳ１
には２±１／分子量５，０００、ＬＰＳ２には１〜２／
分子量５，０００、ＬＰＳ３には２±１／分子量５，０
００のＫＤＯが含まれると推定された。なお、これらの
値は、ＬＰＳ１を例にとると、次のように計算される。
溶液に含まれるＫＤＤの濃度をｘ（μモル／ｍｌ）とす
ると、

【数５】 上記式から、ｘ＝０．２２１となる。従って、ＬＰＳ１
の１モル（５，０００と仮定）に含まれるＫＤＤのモル
数をｙとすると、次式により、ｙ＝２．１９となる。

【数６】

【００２９】以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方
例である。なお、実施例２〜５におけるＬＰＳ量は、リ
ムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算量である。実施例２（錠剤） 小麦ＬＰＳ ０．０４ｇ ６％ＨＰＣ乳糖 １７８ｇ ステアリン酸タルク ８ｇ バレイショデンプン １４ｇ 以上を混和し、打錠して、０．１ｍｇの小麦ＬＰＳを含
む０．５ｇの錠剤４００個を調製した。実施例３（内用液剤） クロレラＬＰＳ １ｍｇ 精製水 １００ｍｌ実施例４（軟膏剤） 実施例５（注射剤） ＬＰＳ３ ０．５ｍｇ注射用蒸留水 適量 合計 １０００ｍｌ

【００３０】実験例１（リムラステスト陽性植物ＬＰＳ
の定量） 各種植物に含まれるリムラステスト陽性ＬＰＳの定量
を、生化学工業株式会社のトキシカラーシステムを使っ
て行った。 ９６穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を１
穴当たり１８０μｌ入れた。試料２０μｌ（試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解して調製した）をプレー
トの穴の１つに加えた。プレートミキサーで撹拌しなが
らピペッティングを行って１０倍希釈液を調製した。
（以後、順次希釈試料を２０μｌずつとり、同様に処理
することで１００倍、１０００倍、…と１０倍希釈系列
液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の量比を変
えることにより希釈率は任意に設定できる。） 内部標準として１．５μｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ溶液
の１００，０００倍希釈液を調製し、希釈やリムラステ
スト発色が正常であることを確認した。 上記の１０倍希釈液３５μｌを別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラーシステムのＬ
Ｓ−１セット３５μｌを添加し、３７℃で３０分間放置
した。ついで１０５μｌの１Ｍ酢酸水を加えて撹拌して
反応を停止させた。この試料液の波長４１５ｎｍでの吸
光度を、９６穴用吸光度計プレートリーダーＭＴＰ−１
００（コロナ電気株式会社製）で測定した。バックグラ
ンドとしては蒸留水を、検量線作成用としては４２ｐｇ
／ｍｌの生化学工業株式会社のトキシカラーシステムの
ＥＴ−１セットを使用して検量線を作成し、この検量線
を基準にして各試料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの定
量を行った。（試料が蒸留水である場合の吸光度を０と
した。）なお、この方法で前記ＬＳ−１セットを使用し
た場合には１０〜４５ｐｇ／ｍｌの範囲内で発色に定量
性があることが確認されたので、この範囲に入らないと
きは、希釈率を変えて再実験した。希釈試料の定量値
は、 （検量線から読み取った値）×（希釈率） で計算した。得られた結果を、固体試料の場合にはｎｇ
／ｇ単位で、液体試料の場合にはｎｇ／ｍｌ単位で次表
６に示す。なお、表中の試料の欄の会社名、地名等は、
当該試料の入手先、産地をさす。かかる記載がない品は
スーパーストアー忠実屋の神奈川県津久井郡中野町店で
購入した品で、製造者が不明なものを指す。なお、「ホ
クレン」は、北海道農業協同組合連合会の略称である。

【表６】

【００３１】実験例２（マクロファージのインビトロＴ
ＮＦ産生能を活性化する際のＥＤ_５０を与えるリムラス
テスト陽性ＬＰＳの含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
液ｍｌであるＬＰＳの選択方法） ９週齢の、平均体重２９ｇの各群３匹のオスのＣ３Ｈ／
Ｈｅマウスのマクロファージ腹腔常在細胞２００μｌ
（２×１０^５個）／穴を９６穴の平底プレートに入れ、
プライマーとしての組換えマウスＩＦＮ−γ（１００単
位／ｍｌ）を各穴に１０μｌ宛加えた。別途、各種ＬＰ
Ｓ源を６５℃の熱水（ｇ／ｍｌ）で５時間抽出して調製
した抽出液を各種希釈し、その１０μｌ／穴をプライマ
ー投与の３時間後にトリガーとして加えた。２時間培養
後に遠心分離操作に付した（３０００Ｇ、２０分）。各
穴から得られた１３０μｌの、ＴＮＦ活性はＬ９２９細
胞に対する毒性に基づいて測定し、又、リムラステスト
陽性ＬＰＳ含有量は生化学工業株式会社のトキシカラー
システムを使用して測定した。測定値を、縦軸にＴＮＦ
産生量（単位／培養液ｍｌ）を、横軸（対数尺）に対応
リムラステスト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）
を表す座標にプロットし、プロットされた各点から推定
されるシグモイド曲線を描いた。トリガーを投与しなか
った場合のＴＮＦ産生量を与える各トリガーのマクロフ
ァージ活性化能を０％とし、トリガー投与の効果として
増大するＴＮＦ産生量が最大恒量に達したときの各トリ
ガーのマクロファージ活性化能を１００％とし、その５
０％に相当するマクロファージ活性化能を与えるリムラ
ステスト陽性ＬＰＳ含有量を曲線から読み取つた。マク
ロファージ活性化能とリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量
との相関関係が上記条件を満たしたＬＰＳ採取源の結果
を表７に示す。表中で、「ＴＮＦ」はＴＮＦ産生量（単
位／培養液ｍｌ）を、「活性化能」はマクロファージ活
性化能（％）を、「ＬＰＳ」はリムラステスト陽性ＬＰ
Ｓ含有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）を表す。なお、トリガー
無添加時のＴＮＦ産生量は０．７５単位／ｍｌであった
ので、ＴＮＦ産生量が０．７５単位／ｍｌ以下である場
合をマクロファージ活性化能０％とし、マクロファージ
活性化能（％）は次式により計算した。

【数７】

【表７】 表７に示された結果を図５〜８に示す。図５〜８におい
て、縦軸はマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸
（対数尺）はリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／
培養液ｍｌ）を表している。図５において、○はターメ
リックの、●はカンボーイの、□はコンブの、▲黒四角
▼はアサクサノリのデータを示す。図６において、○は
ワカメ芽株エキスの、□は芽ヒジキの、▲黒四角▼はエ
ビオスのデータを示す。図７において、○は冬虫夏草
の、●はワカメ芽株の、□はクロレラのデータを示す。
図８において、○は大腸菌ＬＰＳの、●は小麦ＬＰＳ
の、□は百日咳菌ＬＰＳの、▲黒四角▼はリピドＡのデ
ータを示す。

【００３２】実験例３（実験動物での鎮痛効果−その
１） ８週齢の各群６匹のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（体重２０
〜２５ｇ）に、重量で０、１０^−４、１０^−３、１０
^−２、１０^−１、１、１０μｇ／匹ずつの本発明のＬＰ
Ｓ（製造例１で生産された小麦ＬＰＳ）を生理的食塩水
０．２ｍｌに溶解して静注した。その３時間後に０．５
ｍｌの１％酢酸を腹腔内投与し、３０分間にわたり、各
マウスの身もだえ回数（各群６匹の平均）を計数し、次
表８に示す結果を得た。表中、「身もだえ阻止率
（％）」は、次式により計算した。

【数８】

【表８】 両側ｔ検定により、１０^−２μｇ／匹以上の投与量であ
れば危険率１％以下で、１μｇ／匹以上の投与量であれ
ば危険率０．１％以下で、有意な鎮痛効果があると判断
された。図９は、表７に示された「身もだえ阻止率」
（図中、○で示す）と、大腸菌ＬＰＳ（米国ディフコ社
製０１２８：Ｂ８）の身もだえ阻止率（図中、●で示
す）とをグラフにしたものである。大腸菌ＬＰＳのデー
タは、その１０μｇ／匹を投与したときの平均身もだえ
数１、対照群での平均身もだえ数２４に基づいて計算さ
れた身もだえ阻止率９６％を示している。このグラフか
ら明らかな通り、本発明のＬＰＳを重量で１μｇ／匹以
上投与すると、酢酸に起因する身もだえは、その約９０
％が阻止された。 ８週齢の各群６匹のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（体重２０
〜２５ｇ）に次の薬剤を投与した。 投与群Ａ：重量で１μｇ／匹のＬＰＳ（製造例１で生産
された小麦ＬＰＳ）を生理的食塩水０．２ｍｌに溶解し
て調製した静注液 投与群Ｂ：１ｍｇ／匹の既知鎮痛剤フェニルブタゾンを
１％ＣＭＣ水溶液０．２ｍｌに溶解して調製した静注液 投与群Ｃ：生理的食塩水０．２ｍｌ 薬剤投与の０．５時間、１．５時間、３時間、８時間又
は１８時間経過後に、０．５ｍｌの１％酢酸を腹腔内投
与し、３０分間にわたり、各マウスの身もだえ回数（各
群６匹の平均）を計数し、次表９に示す結果を得た。表
中、「身もだえ阻止率（％）」は、次式により計算し
た。

【数９】 上記式で、「投与群Ｃの場合の身もだえ数」は、生理的
食塩水投与の３０分後に酢酸を投与し、３０分間にわた
って計数した場合の身もだえ数であり、投与群Ａに対し
ては３９、投与群Ｂに対しては３５であることが観察さ
れた。

【表９】 図１０は、表９に示された「身もだえ阻止率」をグラフ
にしたものである。図中、○は投与群Ａの、●は投与群
Ｂのデータを示す。表９及び図１０に示された結果から
明らかな通り、本発明のＬＰＳはフェニルブタゾンの千
分の１という驚異的な少量でフェニルブタゾンに優ると
も劣らない鎮痛効果を発揮し、効果発現に要する時間も
同程度である。更に、両側ｔ検定で危険率５％以下とし
た場合、本発明のＬＰＳの場合には、投与後８〜１８時
間経過しても有意な鎮痛効果を持続しているが、フェニ
ルブタゾンの場合には、投与後３時間経過すると有意な
鎮痛効果は示さないと判断された。即ち、本発明のＬＰ
Ｓの鎮痛効果は、フェニルブタゾンに比して、極めて長
く持続すると言える。

【００３３】実験例４（実験動物での鎮痛効果−その
２） ７〜１０週齢の各群５匹のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（平均
体重約２８ｇ）に、ＬＰＳ換算でそれぞれ０、１、５、
２５、４００μｇ／匹ずつのＬＰＳ３或いは大腸菌ＬＰ
Ｓを含むように調製した２００μｌの蒸留水をゾンデで
経口投与した。その１．５時間後に５００μｌの０．７
％酢酸を５分かけて腹腔内投与し、その後３０分間にわ
たり、各マウスの身もだえ回数を計数し、表１０に示す
結果が得られた（各群５匹の平均）。表中、「−」は該
当量では測定しなかったことを示す。又、「身もだえ阻
止率（％）」は、次式により計算した。

【数１０】

【表１０】

【００３４】実験例５（実験動物での鎮痛効果−その
３） ７週齢の各群６匹のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（平均体重約
２３ｇ）に、ＬＰＳ換算でそれぞれ１μｇ／匹ずつの
Ａ．ラデイオバクターＬＰＳ、ＬＰＳ３或いは大腸菌Ｌ
ＰＳを含むように調製した２００μｌの生理的食塩水を
静注した。対照群には生理的食塩水のみを投与した。そ
の１．５時間後に５００μｌの１％酢酸を５分かけて腹
腔内投与し、その後３０分間にわたり、各マウスの身も
だえ回数を計数した。結果、各群６匹の平均として、対
照群では１７回の身もだえが観察されたが、ＬＰＳ投与
群ではいずれも対照群における半分以下である８回の身
もだえしか観察されなかった。

【００３５】実験例６（実験動物での鎮痛効果−その
４） ８週齢の各群５匹のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（平均体重約
２９ｇ）に、ＬＰＳ換算でそれぞれ０μｇ、０．７μ
ｇ、３．５μｇ、１７．５μｇ／匹の製造例１で製造さ
れた粉末Ａ−ａ_２含むように調製した２００μｌの蒸留
水をゾンデで経口投与した。その１．５時間後に５００
μｌの０．７％酢酸を５分かけて腹腔内投与し、その後
３０分間にわたり、各マウスの身もだえ回数を計数し、
表１１に示す結果が得られた（各群５匹の平均）。表
中、「−」は該当量では測定しなかったことを示す。
又、「身もだえ阻止率（％）」は、次式により計算し
た。

【数１１】

【表１１】 図１１は表１０、表１１に示した結果をグラフ化したも
のである。図１１より、ＬＰＳ３、粉末Ａ−ａ_２、大腸
菌ＬＰＳの身もだえ阻止率ＥＤ_５０はそれぞれ２．８μ
ｇ／匹、０．４６μｇ／匹、１７μｇ／匹と推定され、
従って、大腸菌ＬＰＳに比べ、ＬＰＳ３は約６倍の、粉
末Ａ−ａ_２は約３６倍の鎮痛効果があると推定される。

【００３６】実験例７（臨床での鎮痛効果） 患者Ａ（女性、年令４１才） ［１９８６年］異性との***渉によりＨＩＶ（ヒト免疫
不全ウイルス）に感染。［１９９０年８月］ＡＲＣ（エ
イズ関連症候群） ｐ２４抗体：＋ ［１９９０年８月２０日］４００ｍｇ／日のＡＺＴ（ア
ジトチミジン）投与開始。［同年９月２８日］左大腿部
の２箇所に発疹確認。［同年１０月４日］左臀部から左
大腿部、左ふくらはぎにまでＶＺＶ（水痘・帯状庖疹）
拡大。［同月５日］入院。 白血球数：４０００ Ｃ反応性蛋白：０．２５ Ｔ４細胞数：１９６ 痛み：＋＋＋ 製造例１で生産された粉末Ａ−ａ_２を１ｍｇ／ｍｌ（リ
ムラステスト陽性ＬＰＳ量で１μｇ／ｍｌ）含む５０ｗ
／ｖ％グリセリン液（グリセリン：水＝１：１）（以
下、この液を「薬剤Ａ」と称す）を１日１回４０ｍｌず
つをＶＺＶ部位に直接塗付するとともに、１日３回１ｍ
ｌずつを経口投与した。この間、他薬剤は投与しなかっ
た。その結果、塗付数時間後に痛みは劇的に消失し、発
疹も約１週間でほぼ消失した。

【００３７】投与量、投与間隔、毒性値 本発明のＬＰＳを鎮痛剤、動物用鎮痛剤として投与する
さいの量、投与間隔は、当然、担当医師或いは獣医師の
厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体重、投与効果
を勘案して個別に決定されるが、人間の成人（６０ｋ
ｇ）で、経口投与で１μｇ〜１００ｍｇ、静脈投与で１
０ｎｇ〜１０ｍｇ、経皮投与で１００ｎｇ〜１ｍｇが１
日１回の投与量の一応の目安となる。なお、動物では、
牛、馬等の大型動物は上記の量の６０分の１を体重１ｋ
ｇ当たりの量の目安とし、豚、犬、猫等の中型、小型の
動物ではその２倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安と
し、鶏等の鳥類では更にその２倍量を体重１ｋｇ当たり
の量の目安とし投与できる。なお、ベーレンス ケルバ
ー（Ｂｅｈｒｅｎｓ Ｋ ｒｂｅｒ）法により測定した、７週齢の平均体重２２ｇ
のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスにおけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３のＬＤ_５０はそれぞれ１５０、１８０、１８０
μｇ／匹であり、大腸菌ＬＰＳ［米国ディフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ）社製０１２８：Ｂ８］の値３００μｇ／匹の６０
％以下であった。又、小麦ＬＰＳ（製造例１）、大腸菌
ＬＰＳ（同上）、百日咳菌ＬＰＳ（製造例３）の毒性値
ＬＤ_５０（１群２匹の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウス、平均体重
４５ｇ、における平均値）は静脈内投与でそれぞれ３．
２、３．４、１１ｍｇ／ｋｇであり、皮内投与でそれぞ
れ１６、１６、３２ｍｇ／ｋｇだった。

【００３８】

【発明の効果】本発明により、化学治療係数が高く、持
続時間が長く、生産コストが低く、しかも、経口、経
皮、注射のいずれの経路でもで投与可能な、大量に供給
可能な鎮痛剤、動物用鎮痛剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】小麦ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけて
得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピークを
図示したチャートである。

【図２】大腸菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけ
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。

【図３】百日咳菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにか
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。

【図４】ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３の、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法におけるパターンを示す図である。

【図５】マクロファージ活性化能とリムラステスト陽性
ＬＰＳ含有量との相関関係が本発明の条件を満たしてい
る各種ＬＰＳの当該相関関係を示すグラフである。

【図６】マクロファージ活性化能とリムラステスト陽性
ＬＰＳ含有量との相関関係が本発明の条件を満たしてい
る各種ＬＰＳの当該相関関係を示すグラフである。

【図７】マクロファージ活性化能とリムラステスト陽性
ＬＰＳ含有量との相関関係が本発明の条件を満たしてい
る各種ＬＰＳの当該相関関係を示すグラフである。

【図８】マクロファージ活性化能とリムラステスト陽性
ＬＰＳ含有量との相関関係が本発明の条件を満たしてい
る各種ＬＰＳの当該相関関係を示すグラフである。

【図９】本発明のＬＰＳの鎮痛効果の用量−応答曲線を
示すグラフである。

【図１０】本発明のＬＰＳの鎮痛効果を、既知鎮痛剤フ
ェニルブタゾンの鎮痛効果との比較で表すグラフであ
る。

【図１１】本発明のＬＰＳの鎮痛効果を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

図４において、１はＬＰＳ１の、２はＬＰＳ２の、３は
ＬＰＳ３のパターンを示す。図５〜図８において、縦軸
はマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸（対数
尺）はリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量（ｎｇ／培養液
ｍｌ）を表す。図５において、○はターメリックの、●
はカンボーイの、□はコンブの、▲黒四角▼はアサクサ
ノリのデータを示す。図６において、○はワカメ芽株エ
キスの、●は芽ヒジキの、□はエビオスのデータを示
す。図７において、○は冬虫夏草の、●はワカメ芽株
の、□はクロレラのデータを示す。図８において、○は
大腸菌ＬＰＳの、●は小麦ＬＰＳの、□は百日咳菌ＬＰ
Ｓの、▲黒四角▼はリピドＡのデータを示す。図９にお
いて、○は小麦ＬＰＳの、●は大腸菌ＬＰＳのデータを
示す。図１０図において、○は小麦ＬＰＳの、●はフェ
ニルブタゾンのデータを示す。図１１において、□はＬ
ＰＳ３の、●は粉末Ａ−ａ_２の、○は大腸菌ＬＰＳのデ
ータを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 月岡 大輔 千葉県千葉市春日１−21−17 (72)発明者 水野 伝一 神奈川県鎌倉市岡本18 (72)発明者 大島 治之 東京都八王子市館町1097館ケ丘団地２−１ −513

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＬＰＳを含む鎮痛剤であり、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
   を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
   し、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
   のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０
   ％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時
   のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマ
   クロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰ
   Ｓのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシ
   グモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステ
   スト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍ
   ｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む鎮痛剤。
2. 【請求項２】 ＬＰＳが、植物から得られるＬＰＳ、細
   菌から得られるＬＰＳ、リピドＡ、それらの合成ＬＰＳ
   及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項
   １記載の鎮痛剤。
3. 【請求項３】 植物から得られるＬＰＳが、小麦から得
   られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記載の
   鎮痛剤。 主要分子量：８，０００±１，０００（ＳＤＳ電気泳動
   法による） リン数：１〜４／分子量８千 ヘキソサミン数：６±２／分子量８千 脂肪酸数：６±２／分子量８千 ＫＤＯ数＝５±１／分子量８千
4. 【請求項４】 植物から得られるＬＰＳが、クロレラか
   ら得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記
   載の鎮痛剤。 主要分子量＝４０，０００〜９０，０００（ＳＤＳ−Ｐ
   ＡＧＥ法による） リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万
5. 【請求項５】 細菌から得られるＬＰＳが、大腸菌から
   得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記載
   の鎮痛剤。 主要分子量＝４０，０００±１０，０００ ８、０００±４，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による） リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万
6. 【請求項６】 細菌から得られるＬＰＳが、次の物性を
   有するＬＰＳである、請求項２記載の鎮痛剤。 主要分子量：５，０００±１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ法による） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００
7. 【請求項７】 細菌から得られるＬＰＳが、次の物性を
   有するＬＰＳである、請求項２記載の鎮痛剤。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ法による） リン数：１〜２／分子量５，０００ ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：１〜２／分子量５，０００
8. 【請求項８】 細菌から得られるＬＰＳが、次の物性を
   有するＬＰＳである、請求項２記載の鎮痛剤。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ法による） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００
9. 【請求項９】 細菌から得られるＬＰＳが、百日咳菌か
   ら得られ、次の物性を有するＬＰＳである、請求項２記
   載の鎮痛剤。 主要分子量＝６，０００±１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ法による） リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千
10. 【請求項１０】 細菌から得られるＬＰＳが、Ａ．ラデ
    イオバクターＬＰＳである、請求項２記載の鎮痛剤。
11. 【請求項１１】 ＬＰＳを含む動物用鎮痛剤であり、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
    を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
    し、縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファ
    ージのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を
    ０％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする
    時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とする
    マクロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬ
    ＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表す
    シグモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ_５０を与えるリムラステ
    スト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養液ｍ
    ｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む動物用鎮痛剤。