JP5294659B2

JP5294659B2 - 発酵及び培養方法、レンコン発酵エキス及び発酵エキス配合物

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Publication number: JP5294659B2
Application number: JP2008061930A
Authority: JP
Inventors: 源一郎杣; 孝志西澤; 千恵河内; 裕之稲川
Original assignee: Biomedical Research Group Inc
Current assignee: Biomedical Research Group Inc
Priority date: 2007-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2028-03-11
Also published as: JP2008255108A

Description

本発明は、ヒトを含む哺乳動物（具体的には家畜、愛玩動物など）、鳥類（具体的には養鶏、愛玩鳥類など）、両生類、は虫類、魚類（具体的には、愛玩魚類など）、無脊椎動物及び植物などの動植物に及ぶ医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品、飼料、肥料及び浴用剤などに添加しても安全な免疫賦活物質含有食用グラム陰性菌によるソバ又はレンコン発酵方法、ソバ又はレンコン発酵によって得られる免疫賦活物質含有のエキスなどに関する。

ヒトを含む哺乳動物（具体的には家畜、愛玩動物など）、鳥類（具体的には養鶏、愛玩鳥類など）、両生類、は虫類、魚類（具体的には、愛玩魚類など）、無脊椎動物及び植物に関して、感染防除技術を含む疾病予防・治療法を確立することは喫緊の課題である。しかもこれを達成する上では、化学物質を用いず、環境汚染がなく、耐性菌を生ずることなく、人体に蓄積性がない方法が強く求められている。本発明者らは如上の課題に関して、日本では古くより食されているソバとレンコンに着目した。ソバやレンコンは単に主食のデンプン源としてだけでなく、健康食品的に取り扱われてきている。

本発明者らは、グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖に免疫賦活作用があることを見出している。そこで、古来より食されているソバやレンコンに存在するグラム陰性菌に注目した。すなわち、食品の製造に用いられるグラム陰性菌にリムラス陽性糖脂質なかんずくリポ多糖が存在すれば、この事実はリムラス陽性糖脂質あるいはリポ多糖の食経験を立証することになる。すでに小麦粉常在菌であるパントエア・アグロメランスから得たリポ多糖を用いることができることを見出した（非特許文献１）。このことは、リムラス陽性糖脂質あるいはリポ多糖が経皮、経口投与で安心・安全であることを強力に示す知見であると共に、これら物質を用いた新たな化粧品・食品などのヘルスケア商品、医薬品などの開発を可能とするはずである。

本発明が提供するソバ又はレンコン発酵エキスとは発酵及び培養を行って得られる培養液そのもの、これを固液分離して得られる液体成分、及び固液分離して得られる固体成分に抽出過程を加え得られる液体成分などを総称する名称である。すなわち、ソバ又はレンコン発酵エキスは本発明に係る発酵及び培養方法によって得られる培養液そのもの、及び、その培養液の全部又は一部分を用いて調製することのできるエキスをすべて含んでいる。言うまでもないがソバ又はレンコン発酵エキスは乾燥してエキス末として利用することもできるし、エキス末を任意の濃度に適当な溶液例えば生理食塩水入りの燐酸緩衝液などに溶解して利用することもできる。
河内千恵ほか：小麦発酵抽出物の自然免疫調節作用、NEW FOOD INDUSTRY 48, 19-26（2006）. 若命浩二：ソバポリフェノールの利用開発，ソバの栄養，(社）日本ソバ協会，49-54(2000）小砂憲一ほか：食品と開発，33，1143-1145(1998）我妻千尋ほか：PMP（ソバポリフェノール）のTriton誘発高脂血症モデルに対する影響，第２回日本代替医療学会学術集会要旨，85(1999）石黒綾ほか：化学発がんに対するAHCCとPMPの相乗効果，第２回日本代替医療学会学術集会要旨，85(1999） Kayashita, J. et al.: Hypocholesterolemiceffect of buckwheat protein extract in rats fed cholesterol enriched diets,Nutr. Res., 15, 691-698(1995) Kayashita, J. et al.: Consumption ofbuckwheat protein lowers plasma cholesteroland raises fecal neutral sterols incholesterol-fed rats because of its low digestability, J. Nutr., 127,1395-1400(1997) Kayashita, J. et al.: Feeding of buckwheatprotein extract reduces hepatic triglyceride concentration, adipose tissueweight, and hepatic lipogenesis in rats, Nutr. Biochem., 7, 555-559(1996) Powers EM. Efficacy of the Ryu nonstainingKOH technique for rapidly determining Gram reactions of food-bone and waterbonebacteria and yeasts. Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 3756-3758.

ソバ（学名：Fagopyrum esculentum）はタデ科の植物で、米、麦の主要穀類より生産量は少ないものの、世界の広い地域で生産されている食用植物である。食用のほか、ソバは漢方で用いられており、『本朝食鑑』（1697）では「気味甘く、微寒にして毒なし、気を降ろし、腸胃の滓穢積滞を寛にす。水腫・白濁・泄利・腹痛・上気を治し、或は気盛んにして湿熱あるものによろし」とあり、ソバが、健康維持に有用な役割を持つことが伺える。

ソバはカテキン類のほか，ソバ種実は穀類で唯一，フラボノイド化合物であるルチンを含んでいる。ルチンは毛細血管の強化作用を有し高血圧や糖尿病に有効であるといわれている。また、ソバ種実ポリフェノールは，細胞実験での抗酸化能の確認（非特許文献２）に加え，生体内では，マウス脳中の過酸化脂質の低下作用（非特許文献３），トライトン（Triton）誘発高脂血症モデルラットに対する血清中性脂肪の上昇抑制効果（非特許文献４），化学発がんモデル（皮膚がん）マウスに対する発がん抑制効果（非特許文献５）が明らかにされている．ポリフェノール以外では，タンパク抽出物（BWPE）がコレステロール低下作用（非特許文献６,７）をもつことが報告されている。加えて、ソバタンパクは肝臓トリグリセライド濃度の低下，精巣上体付着脂肪組織重量と腎付着脂肪組織重量の減少をもたらすことが明らかにされている（非特許文献８）。しかしながら、これらのソバの機能性成分は、ソバ自体の成分の解析であり、ソバに付着・共生している細菌由来の免疫賦活成分について解析されたことはこれまでになく、その機能性は不明であった。

レンコンは、ハスの地下茎が肥大した物で、食用に栽培され食物繊維やビタミンCなどの栄養素を豊富に含んでいる野菜であり、胃腸粘膜を保護するムチンや抗酸化作用を有するポリフェノールなど生理活性を示す物質を多く含んでいる。また、漢方の分野では咳や痰の沈静化、炎症の抑制といった目的でレンコンを使用しており、アレルギー症状の改善に対しても効果が期待される。地下茎の接合部分（普段は食用としない箇所）を生薬名「藕節（グウセツ）」と称し，吐血，胃潰瘍，十二指腸潰瘍，下血などに止血を目的として民間薬的に利用されている。止血作用については含有タンニンによるものと考えられている。しかしながら、これらレンコンについてもその機能性成分は、レンコン自体の成分の解析であり、レンコンに付着・共生している細菌由来の免疫賦活成分について解析されたことはこれまでになく、その機能性は不明であった。

本発明は、上記問題点に鑑み、食経験の長いレンコンに付着・共生するグラム陰性菌単独又は混合で発酵し該菌を培養する方法及び該方法で得られるエキス、エキス配合物を提供することを目的とする。

本発明はレンコンの機能性を増強するために、免疫賦活機能を有するグラム陰性菌が有するリポ多糖に着目している。本発明は実施例に記載した微生物に限定されるわけではなく、免疫賦活機能を有する食経験のあるグラム陰性菌である、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・プリムチカ（Serratia plymuthica）、エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnigenus）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、レクレルシア・アデカルボキシラータ（Leclercia adecarboxylata）などの他の微生物にも適応できることは明らかである。さらに、本発明により提供されるレンコン発酵エキスは、経口及び経皮投与で安全に免疫を活性化することができるので、医薬品、並びに、栄養補助や特定機能性をもつ食品を含む食品、スキンケア製品、飼料及びペットフードなど動植物の健康維持を目的とした広範な用途に配合して用いることができる。

本発明の発酵及び培養方法は、レンコンに由来する素材を、前記レンコンに付着又は共生するグラム陰性菌によって発酵させて、同時に該菌を培養することを特徴とする。

また、前記レンコンに由来する素材はレンコンに力学的操作を加えることによって得られることが望ましい。

また、本発明のレンコン発酵エキスは、上記発酵及び培養方法で得られることを特徴とする。

また、本発明のレンコン発酵エキス末は、上記植物発酵エキスから得られることを特徴とする。

また、本発明のレンコン発酵エキス配合物は、上記レンコン発酵エキス又は上記レンコン発酵エキス末が配合されていることを特徴とする。

また、上記レンコン発酵エキス配合物は、医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、植物用肥料、植物用医薬品又は浴用剤であることを特徴とする。

以下、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。

ソバ粉に含まれるリムラス陽性糖脂質含量
ソバ粉に含まれるリムラス陽性糖脂質量を測定した。ソバ粉（内層ソバ粉、中層ソバ粉、外層ソバ粉）、ソバの皮及びソバの実の粉砕物を各2.00g秤量し、それぞれに注射用水を加えて20mlとした。ボルテックスミキサーにて攪拌し懸濁液を調製した。懸濁液の各１mlを1.5mlチューブに移し、ブロックヒーターを用いて95℃で30分間加熱した。加熱終了後、遠心分離を行い、上清をリムラス陽性糖脂質測定用の原液とした。生化学工業のエンドスペシーのキットを用いて測定した。方法は、キット添付のプロトコールに従った。測定された糖脂質含量はIP-PA1の重量換算値として算出した。その結果を表１に示した。いずれのサンプルからも糖脂質が検出された。糖脂質含量は、ソバの実を破砕して抽出したものが最も高いものであった。

ソバからの微生物の分離
実施例１の結果から、各種ソバサンプルにグラム陰性菌が存在することが推測された。そこで、次にソバからの微生物の単離を行った。ソバ粉、ソバの皮及びソバの実の粉砕物を各2.00g秤量し、それぞれに滅菌済みの蒸留水（大塚注射用水）を加えて20mlとした。ボルテックスミキサーにて攪拌し得られた懸濁液を普通寒天培地の平板プレートに塗抹し、30℃の恒温槽内で2日間分離培養を行った。培養後、各プレート上に認められたコロニー数（生菌数）を計測し、ソバ粉の単位重量当たりの生菌数を算出し表２に示した。菌数については、内層粉は菌数が最も少なく、ソバの皮が最も高かった。コロニーの形態によって分けられる菌の種類と割合は標品間で大きな違いは認められず、黄色のコロニーの菌がほぼ9割を占めた。黄色のコロニーについては、コロニーのサイズが大きいものと小さいものの少なくとも2種類が含まれ、ほぼ半々の割合で認められた。標品間での認められた菌の種類の違いについては、外層粉とソバの実の粉砕物では橙色のコロニーが認められたが、内層粉、中層粉及びソバの皮では認められなかった。各標品のプレートから菌種が異なる可能性が高いと判定したコロニー38種について純培養を行った。

ソバ付着グラム陰性菌、グラム陽性菌の判定
Ryuの方法（非特許文献９）を用いた。実施例２で得られたコロニーの形態より菌種が異なると推定されたコロニーを選択し、別の普通寒天培地プレートにまき、菌の単離を行った。各菌のコロニーより、菌体を掻き取りスライドグラス上に移し、3%KOH水溶液5μlを菌体にかけ、菌体をかき混ぜた。1分以内に粘り、ゲル化し糸を引くようになればKOHの反応に陽性と判定し、グラム陰性菌とした。菌体をかき混ぜても変化が認められず、糸を引かない場合は、KOHの反応に陰性と判定し、グラム陽性菌と判定した。分離した38種の微生物のうち、10菌株がグラム陽性菌と判定され、残りの27菌株がグラム陰性菌と判定された。黄色コロニーの菌株は全て、グラム陰性と判定された。ソバ粉サンプルに存在する生菌数の約9割がグラム陰性細菌であることがわかった。

ソバ付着菌種の同定
グラム陰性菌と判定された27菌株について判定した。ブドウ糖発酵性の有無、チトクローム・オキシダーゼの有無、ID-テスト EB20（日水製薬）を用いて菌種同定した。
(1).ブドウ糖発酵性
TSI寒天培地でブドウ糖発酵性を試験した。実施例３でグラム陰性菌と判定した菌株を用いた。TSI寒天培地（日水製薬株式会社）に被検菌を高層部にせん刺後、斜面部に塗布し、30℃の恒温槽にて18〜24時間培養した。ブドウ糖発酵性の菌は高層部が黄色に変化し、ブドウ糖非発酵性の菌は高層部の色は朱色で変化しない。ブドウ糖のみを分解する菌は高層部が黄変し、斜面部は無変化。乳糖、白糖共に、又はいずれか一方の分解菌は高層、斜面部共に黄変。ガス産生があれば高層部に気泡又はき裂を生じる。硫化水素の産生があれば高層部が濃く変化する。その結果、9株がブドウ糖非発酵性グラム陰性菌、18菌株がブドウ糖発酵性グラム陰性菌と判定された（表３）。
(2).チトクローム・オキシダーゼ
Ryuの反応とTSI寒天培地での培養から、ブドウ糖発酵性のグラム陰性菌と判定された18菌株を用いた。チトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙（チトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙、日水製薬株式会社）1片をシャーレに入れ、精製水数滴を滴下してろ紙全体を湿らせ、直ちにその上に固形培地上の培養菌をループで塗布した。1分以内に塗布部分が深青色を呈する菌をチトクローム・オキシダーゼ陽性菌と判定した。塗布部分に変化が認められない場合はその菌をチトクローム・オキシダーゼ陰性菌と判定した。その結果、18株ともにオキシダーゼ陰性のグラム陰性菌であった（表３）。
(3). IDテスト・EB-20
TSI寒天培地にて、ブドウ糖発酵性グラム陰性菌と判定された18菌株についてブドウ糖発酵性グラム陰性桿菌を同定することができるIDテスト・EB-20（日水製薬株式会社）で推定される菌種の同定を行った。普通寒天培地上で増殖培養した被検菌をループを用いて、IDテスト・EBブイヨン1本(2.5ml/tube)に懸濁した。接種菌液の菌液濃度は溶液1ml中に細菌3×10⁸個相当とした。調製した菌液をIDテスト・EBプレートの各ホールの段差の部分に接種した。H₂S、LDC、ADH、ODC、URE、INO、SOR及びARAの8項目には、菌液接種後、流動パラフィンを3滴重層して空気を遮断した。プレートにふたをして30℃の恒温槽の中で18から24時間培養した。生化学的性状の成績は、培養後添付の色調判定表と比較して陽性・陰性を判定した。PPA、IND、VPの3項目は培養後、IDテスト・EB（code 06628、日水製薬株式会社）試薬を加えてから判定した。判定結果に基づいてIDテスト・EB-20・解析プロファイル（5版）により、対応する菌種を調べた。グラム陰性菌と判定された各菌株の分類・同定結果を表３にまとめた。

ID・テストEB-20で候補となった菌種を示した。表中では属名は省略してある。
S. ficaria：Serratia ficaria、S. plymuthica：Serratia plymuthica、
E. amnigenus：Enterobacter amnigenus、E. cloacae：Enterobacter cloacae
E. agglomerans：Enterobacter agglomerans、R.aquatilis：Rahnella aquatilis
L. adecarboxylata： Leclercia adecarboxylata

パントエア・アグロメンランスの抗体を用いた同定
IDテストで同定を試みたグラム陰性菌の菌株の中にパントエア・アグロメランスの可能性が高いと判定された菌株が18種中に7種あった。いずれもコロニーは黄色でありパントエア・アグロメランスと類似していた。そこで、これらの7種について、小麦より分離したパントエア・アグロメランスより得られるリムラス陽性糖脂質のIP-PA1と同様の糖鎖構造を有する菌か調べる目的で、糖脂質 IP-PA1に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた免疫学的な同定を試みた。各被検菌について、プレートより菌を10mg程度掻き取り、予め重量を測定しておいた1.5mlチューブに移した。菌体の湿重量10mgに対して90μlの蒸留水を加え、100mg/mlの菌体の懸濁液を調製した。ブロックヒーターを用いて、95℃にて30分間加熱し糖脂質を抽出した。加熱後、遠心上清を糖脂質の加熱抽出液原液とした。原液10μlをPBS(-)990μlの入った1.5mlに加え、100倍希釈を調製した。各菌株から調製した希釈液を、50μlずつ、９６穴イムノプレート（マキシソープ、NUNC）のAからHのウエルに添加した。陰性コントロールとしてのPBS(-)のみと陽性のコントロールとしてのIP-PA1の10μg/mlのPBS(-)溶液をそれぞれ同様に50μlずつ添加し、一晩、室温にて放置して固相化した。その後、3%牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS(-)溶液を、抗体その他のタンパクの非特異的吸着を防止目的でウエル当たり250μl加え、室温で１時間放置した。その後、0.05%Tween 20を含むTBS（10ｍM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl）にて3回洗浄後、列ごと（A列：細胞培養の培養液のみ、B列：4E11、C列：20A8、D列：32G3、E列：34G2、F列：49H5、G列：86F12）にIP-PA1に特異的モノクローナル抗体
（IP-PA1特異的モノクローナル抗体は以下の方法で作製した。パントエア・アグロメランス加熱死菌を完全フロイトアジュバントと混合し、BALB/cマウス腹腔内に一匹当り１×１０^８個投与し、２週間間隔で３回腹腔内に投与した。最終投与3日後に、脾臓から細胞を取り出し、ミエローマ（P3U1）と５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を用いて細胞融合した。融合細胞を１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＨＡＴ培地に懸濁させ９６穴平底プレートで３７℃、５％ＣＯ_２下で静置しながら、７日間培養し、コロニー形成が見られた上清中を、IP-PA1を抗原とした公知慣用のＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法で測定した。上記で得られたモノクローナル抗体産生細胞を公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。その結果、抗IP-PA1マウスモノクローナルＩｇＧ抗体を得た。）
を50μlずつ加えた。室温で１時間反応させ、次いで、ウエルを0.05%Tween 20を含むTBSで3回洗浄し、1%BSA含有PBS(-)溶液で1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、Ｍ、Ａ免疫グロブリン抗体（シグマ社製）を50μlずつ、ウエルに入れ、室温で１時間放置した。その後、0.05%Tween 20を含むTBSで4回洗浄し、1mg/mlになるようにp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業製）を基質緩衝液に溶解した溶液を100μl/ウエルの割合で入れ、室温で１時間放置した後、2規定の水酸化ナトリウム水溶液50μl/ウエルを入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(モデル550、BIO-RAD)にて415nmの吸光度を測定した。その結果、7菌株中、2菌株が6種のIP-PA1特異的抗体に対して反応性を示した（表４）。

陽性のコントロールであるIP-PA1での吸光度値を100、陰性のコントロールであるPBS(-)での吸光度値を0とした場合の、各菌の抽出液を添加したウエルの吸光度値の割合を%で示した。

ソバ発酵エキス
ソバ粉0.5gと塩類（リン酸水素二ナトリウム七水和物1.28g、リン酸二水素カリウム0.3g、塩化ナトリウム50mg、塩化アンモニウム100mg、1M硫酸マグネシウム水溶液0.2ml、1M塩化カルシウム水溶液0.01ml）と水を加え全量を100mlとし１リットルの坂口フラスコに入れた。これをオートクレーブ（ＴＯＭＹＢＳ−３２５、１２０℃、２０分）で滅菌した。実施例４の中層粉No.2のコロニー（パントエア・アグロメランス、表３においては旧称であるエンテロバクター・アグロメランスと表記）の分離菌株を種菌として、滅菌した溶液に加え、30℃にて一晩培養した。遠心分離器（日立、高速冷却遠心機ＳＣＲ−２０Ｂ、５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿にリン酸緩衝液を加えて懸濁し、全量１００ｍｌとして、沸騰水浴中で３０分間加熱抽出した。加熱終了後、室温まで冷却し、本液を遠心分離（日立、高速冷却遠心機ＳＣＲ−２０Ｂ、１００００ｒｐｍ、２０分間、２０℃）した。遠心後、淡黄色の上清を得た。この上清８０ｍｌあたりに８．９ｍｌの５モル塩化ナトリウム溶液を加え、これに１７８ｍｌのエタノールを加えた。これを、冷凍庫（−９０℃）で一晩放置後、本液を遠心分離（日立、高速冷却遠心機ＳＣＲ−２０Ｂ、１００００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した。上清を除いて得た沈殿を風乾し、蒸留水に溶解し、１０ｍｌのソバ発酵エキス溶液を得た。本エキスの固形分は、０．３ｍｌを予め秤量した１．５ｍｌプラスチックチューブに移し、凍結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ１１．５ｍｇであった（3.8%）。

ブラッドフォード法によるタンパク質定量を、ＢＳＡを標準タンパク質として、ソバ発酵エキスを測定した。糖含量の測定はフェノール硫酸法によりグルコースを標準糖として測定した。核酸含有量の測定は１００倍希釈したサンプルの２１０〜３４０ｎｍの吸光度測定を行った。２６０ｎｍの吸光度から３２０ｎｍの吸光度を引いた値と、ＤＮＡとしての吸光度1.0 ＯＤあたり、５０μｇとしての最大含有量を算出した。リムラスアッセイによるリムラス活性物質含有量の測定はリムラス活性物質量は生化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業Et-1を用いた。測定結果を表５に示した。表５のソバ発酵エキスについての数値は乾燥重量の１ｇあたりの含有量をｍｇで表示した。

ソバ発酵エキスのアトピー性皮膚炎抑制効果
ソバ発酵エキスのアトピー性皮膚炎に対する効果を調べるために、Ｉ型アレルギーモデルを導入した。一群5匹の雄性のBALB/cマウスに抗ジニトロフェニル、マウスモノクローナル抗体(IgE)を1μｇ/マウスで静脈投与した。一時間後に実施例６で製造したソバ発酵エキス(10μｇ/マウス)を腹部皮内投与又は経口投与（1mg/マウス）し、さらに1時間後に、マウスの耳介の表裏に０．２５％ジニトロフルオロベンゼン含有アセトン−オリーブオイル混合溶液（４対１）をアレルゲンとして２０μｌ塗布した。塗布後、１、２、２４及び４８時間目の耳介の厚さをシクネスゲージで測定し、塗布直前の厚さとの差（△）を浮腫の程度とした。薬剤投与の効果は、アレルゲン投与1時間後に認められる早期反応と、24時間後に誘導される遅発反応、それぞれの抑制を以下の式によって求められる抑制率で評価した。｛抑制率 = (１−薬剤投与後の△耳介の浮腫/対照の△耳介の浮腫）×１００｝結果を表６に示す。表から明らかなように、ソバ発酵エキスは皮内投与でも、経口投与でもアレルギー反応を抑制した。

レンコンに含まれるリムラス陽性糖脂質含量
レンコンに含まれるリムラス陽性糖脂質量を測定した。レンコンに付いている土を水道水にて洗い落とした後、滅菌蒸留水にて3回洗浄した。その後、節部分と可食部に切り分け、それぞれについて、すりおろし、キムワイプにくるんだ後、圧搾して絞り汁を得た。絞り汁を遠心分離し、上清を新鮮標品からの抽出液として試験に供した。また、接続部と可食部に切り分けた後、薄く切り分け、40℃にて3日間乾燥剤を入れた乾燥機にて乾燥させた。乾燥した標品を乳鉢・乳棒を用いて細かく砕き粉末状とした。各粉末2.0gに蒸留水を加え20mlとした後、粉末を懸濁し、沸騰水浴中にて20分間加熱抽出を行った。加熱後、室温まで冷却したところ、各標品共に、ゲル化した（含まれる炭水化物によるものと推定される）為、一部をさらに蒸留水にて5倍希釈し、懸濁・攪拌し、遠心分離を行いその上清（以下、「レンコン希釈液」という。）を試験に供した。レンコンは3本用いて、各サンプルを調製した。生化学工業のエンドスペシーのキットを用いて測定した。方法は、キット添付のプロトコールに従った。測定された糖脂質含量はIP-PA1の重量換算値として算出した。その結果を表７に示した。いずれのサンプルからも糖脂質が検出された。

レンコン抽出液のマクロファージ活性化能（一酸化窒素産生能）
マウスのマクロファージ系細胞RAW264.7を用いたレンコン抽出物の免疫作用の測定はRAW264.7細胞を細胞濃度を8×10⁵cells/mlとして、その100μlを96ウエルプレートの各ウエルに移し、6時間後に試験に用いた。RAW264.7細胞に各レンコン希釈液を50μlを添加し、1時間37℃、5%CO₂インキュベータ内で培養した。その後、LPSp（パントエア・アグロメランスから得られる低分子量リポ多糖）400ng/mlを含む培養液50μl（終濃度100ng/ml：これを「LPSpの高純度標品」とする）又は、培養液のみを50μl添加し、さらに23時間培養を行った。培養終了後、上清50μlを回収し常法に従いGriess試薬を用いて培養液中の一酸化窒素の代謝物である亜硝酸イオン量を測定した。

測定結果を表８に示した。節部分および可食部の乾燥標品の抽出液を添加した場合、各産地の標品共に添加量に依存してRAW264.7細胞からのNO産生の増加が認められた。節部分の新鮮標品からの抽出液を添加した場合、各産地の標品共に添加量に依存してRAW264.7細胞からのNO産生の増加が認められた。可食部の新鮮標品からの抽出液を添加した場合、各産地の標品共に終濃度10ng/ml添加量においてRAW264.7細胞からのNO産生が認められた。

以上結果から抽出液自体にRAW264.7細胞からのNO産生を誘導する活性のあることが明らかとなった。これらの活性は、LPSpの高純度標品に比較すると1/10程度であった。

レンコン付着細菌の分離・単離
レンコンの各根茎接続部の一部を蒸留水に懸濁し、段階希釈後、100μlずつを普通寒天培地にまきこみ、30℃の恒温槽内でインキュベートした。4日間のインキュベートの後、プレート上に認められる各コロニーについて、別の普通寒天培地プレートにまき、菌の単離を行った。また、同時にプレート上の菌数、菌腫内訳から単位重量当たりの菌の存在数について算出した。

レンコン付着細菌の同定
純培養で得られた各菌のコロニーを用い、グラム陰性か陽性をRyuの方法に基づき3%KOHに対する溶解性により決定した。グラム陰性菌と判別された菌株についてはID-test EB20（日水製薬）を用いて同定を行った。

その結果、レンコンの根から、1.4×10⁸/gから2.0×10⁸/gの細菌が認められた。各レンコンに共通して、わずかに黄色のコロニーの菌（グラム陰性菌と判定）が約全コロニー数の1割から2割程度を占めた。菌数の割合としては少ないが(1%以下)共通してコロニーの周囲が黄色で中心部が緑色のグラム陰性菌と判定された菌株が認められた。計59菌株単離したところ、グラム陰性菌と判定した51菌株の内、オキシダーゼ試験で陰性を示した（腸内細菌科の可能性が高い）15菌株についてID-test EB20で同定を試みたところ、セラチア・プリムチカ（Serratia plymuthica）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）と同定された菌株があった。残りの13菌株については該当する種が認められなかった。

レンコン発酵エキス
各種グラム陰性菌のレンコン培養エキス
レンコンをスライスし、70℃の乾燥器に1週間乾燥させ、これを乳鉢ですりつぶしてレンコン粉末を得た。レンコン粉0.5gと塩類（リン酸水素二ナトリウム七水和物1.28g、リン酸二水素カリウム0.3g、塩化ナトリウム50mg、塩化アンモニウム100mg、1M硫酸マグネシウム水溶液0.2ml、1M塩化カルシウム水溶液0.01ml）と水を加え全量を100mlとした。これをオートクレーブで滅菌し、実施例11においてパントエア・アグロメランスと同定された一つのコロニー、又は、実施例11においてグラム陰性菌と同定された51菌株の内、セラチア・プリムチカとも、パントエア・アグロメランスとも同定されなかった菌体のコロニー（合計３サンプル）を加え、30℃にて一晩培養した。その後、培養液を95℃にて30分間加熱し糖脂質を抽出した。加熱後、遠心上清することでレンコン発酵エキスが得られた。

本エキス中の乾燥重量は０．３ｍｌを予め秤量した１．５ｍｌプラスチックチューブに移し、凍結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ４．５ｍｇであった（固形分１．５％）。

ブラッドフォード法によるタンパク質定量を、ＢＳＡを標準タンパク質として、レンコン発酵エキスを測定した。糖含量の測定はフェノール硫酸法によりグルコースを標準糖として測定した。核酸含有量の測定は１００倍希釈したサンプルの２１０〜３４０ｎｍの吸光度測定を行った。２６０ｎｍの吸光度から３２０ｎｍの吸光度を引いた値と、ＤＮＡとしての吸光度1.0 ＯＤあたり、５０μｇとしての最大含有量を算出した。リムラスアッセイによるリムラス活性物質含有量の測定はリムラス活性物質量は生化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業Et-1を用いた。測定結果を表９に示した。表９のレンコン発酵エキスについての数値は乾燥重量の１ｇあたりの含有量をｍｇで表示した。

レンコン発酵エキス入りアメの製造
原材料としてグラニュー糖、水飴、水に実施例12で製造したレンコン発酵エキスを加えたものを５：５：５：１の割合で混合し、加熱して１２０℃〜１６０℃で煮詰めた。これを冷却用鉄板上で冷却し、棒状に引き伸ばして１ｇ前後の粒状に成型し飴を得た。本アメ適量を水２０ｍｌに入れ、加熱することで溶解させた。この溶液中のレンコン発酵エキス有効成分としてリポ多糖量を測定したところ、８．９μｇ/ｇであった。このアメを、風邪をひいてのどの痛みのある男女６名に摂取させた。その後、直ちにのどの痛みに対するアンケート調査を行った。のどの痛みについては、６名とも痛みが軽減したと感じた（一標本符号検定：Ｐ＜０．０３）。

Claims

レンコンに由来する素材を、前記レンコンに付着又は共生するグラム陰性菌によって発酵させて、同時に該菌を培養することを特徴とする発酵及び培養方法。
前記レンコンに由来する素材はレンコンに力学的操作を加えることによって得られることを特徴とする請求項１記載の発酵及び培養方法。
請求項１又は２記載の発酵及び培養方法で得られることを特徴とするレンコン発酵エキス。
請求項３記載の植物発酵エキスから得られることを特徴とするレンコン発酵エキス末。
請求項３記載のレンコン発酵エキス又は請求項４記載のレンコン発酵エキス末が配合されていることを特徴とするレンコン発酵エキス配合物。
前記レンコン発酵エキス配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、植物用肥料、植物用医薬品又は浴用剤であることを特徴とする請求項５記載のレンコン発酵エキス配合物。