JP5294659B2 - 発酵及び培養方法、レンコン発酵エキス及び発酵エキス配合物 - Google Patents
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Description
河内千恵ほか: 小麦発酵抽出物の自然免疫調節作用、NEW FOOD INDUSTRY 48, 19-26(2006). 若命浩二:ソバポリフェノールの利用開発,ソバの栄養,(社)日本ソバ協会,49-54(2000) 小砂憲一ほか:食品と開発,33,1143-1145(1998) 我妻千尋ほか:PMP(ソバポリフェノール)のTriton誘発高脂血症モデルに対する影響,第2回日本代替医療学会学術集会要旨,85(1999) 石黒綾ほか:化学発がんに対するAHCCとPMPの相乗効果,第2回日本代替医療学会学術集会要旨,85(1999) Kayashita, J. et al.: Hypocholesterolemiceffect of buckwheat protein extract in rats fed cholesterol enriched diets,Nutr. Res., 15, 691-698(1995) Kayashita, J. et al.: Consumption ofbuckwheat protein lowers plasma cholesteroland raises fecal neutral sterols incholesterol-fed rats because of its low digestability, J. Nutr., 127,1395-1400(1997) Kayashita, J. et al.: Feeding of buckwheatprotein extract reduces hepatic triglyceride concentration, adipose tissueweight, and hepatic lipogenesis in rats, Nutr. Biochem., 7, 555-559(1996) Powers EM. Efficacy of the Ryu nonstainingKOH technique for rapidly determining Gram reactions of food-bone and waterbonebacteria and yeasts. Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 3756-3758.
ソバ粉に含まれるリムラス陽性糖脂質量を測定した。ソバ粉(内層ソバ粉、中層ソバ粉、外層ソバ粉)、ソバの皮及びソバの実の粉砕物を各2.00g秤量し、それぞれに注射用水を加えて20mlとした。ボルテックスミキサーにて攪拌し懸濁液を調製した。懸濁液の各1mlを1.5mlチューブに移し、ブロックヒーターを用いて95℃で30分間加熱した。加熱終了後、遠心分離を行い、上清をリムラス陽性糖脂質測定用の原液とした。生化学工業のエンドスペシーのキットを用いて測定した。方法は、キット添付のプロトコールに従った。測定された糖脂質含量はIP-PA1の重量換算値として算出した。その結果を表1に示した。いずれのサンプルからも糖脂質が検出された。糖脂質含量は、ソバの実を破砕して抽出したものが最も高いものであった。
実施例1の結果から、各種ソバサンプルにグラム陰性菌が存在することが推測された。そこで、次にソバからの微生物の単離を行った。ソバ粉、ソバの皮及びソバの実の粉砕物を各2.00g秤量し、それぞれに滅菌済みの蒸留水(大塚注射用水)を加えて20mlとした。ボルテックスミキサーにて攪拌し得られた懸濁液を普通寒天培地の平板プレートに塗抹し、30℃の恒温槽内で2日間分離培養を行った。培養後、各プレート上に認められたコロニー数(生菌数)を計測し、ソバ粉の単位重量当たりの生菌数を算出し表2に示した。菌数については、内層粉は菌数が最も少なく、ソバの皮が最も高かった。コロニーの形態によって分けられる菌の種類と割合は標品間で大きな違いは認められず、黄色のコロニーの菌がほぼ9割を占めた。黄色のコロニーについては、コロニーのサイズが大きいものと小さいものの少なくとも2種類が含まれ、ほぼ半々の割合で認められた。標品間での認められた菌の種類の違いについては、外層粉とソバの実の粉砕物では橙色のコロニーが認められたが、内層粉、中層粉及びソバの皮では認められなかった。各標品のプレートから菌種が異なる可能性が高いと判定したコロニー38種について純培養を行った。
Ryuの方法 (非特許文献9)を用いた。実施例2で得られたコロニーの形態より菌種が異なると推定されたコロニーを選択し、別の普通寒天培地プレートにまき、菌の単離を行った。各菌のコロニーより、菌体を掻き取りスライドグラス上に移し、3%KOH水溶液5μlを菌体にかけ、菌体をかき混ぜた。1分以内に粘り、ゲル化し糸を引くようになればKOHの反応に陽性と判定し、グラム陰性菌とした。菌体をかき混ぜても変化が認められず、糸を引かない場合は、KOHの反応に陰性と判定し、グラム陽性菌と判定した。分離した38種の微生物のうち、10菌株がグラム陽性菌と判定され、残りの27菌株がグラム陰性菌と判定された。黄色コロニーの菌株は全て、グラム陰性と判定された。ソバ粉サンプルに存在する生菌数の約9割がグラム陰性細菌であることがわかった。
グラム陰性菌と判定された27菌株について判定した。ブドウ糖発酵性の有無、チトクローム・オキシダーゼの有無、ID-テスト EB20(日水製薬)を用いて菌種同定した。
(1).ブドウ糖発酵性
TSI寒天培地でブドウ糖発酵性を試験した。実施例3でグラム陰性菌と判定した菌株を用いた。TSI寒天培地(日水製薬株式会社)に被検菌を高層部にせん刺後、斜面部に塗布し、30℃の恒温槽にて18〜24時間培養した。ブドウ糖発酵性の菌は高層部が黄色に変化し、ブドウ糖非発酵性の菌は高層部の色は朱色で変化しない。ブドウ糖のみを分解する菌は高層部が黄変し、斜面部は無変化。乳糖、白糖共に、又はいずれか一方の分解菌は高層、斜面部共に黄変。ガス産生があれば高層部に気泡又はき裂を生じる。硫化水素の産生があれば高層部が濃く変化する。その結果、9株がブドウ糖非発酵性グラム陰性菌、18菌株がブドウ糖発酵性グラム陰性菌と判定された(表3)。
(2).チトクローム・オキシダーゼ
Ryuの反応とTSI寒天培地での培養から、ブドウ糖発酵性のグラム陰性菌と判定された18菌株を用いた。チトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙(チトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙、日水製薬株式会社)1片をシャーレに入れ、精製水数滴を滴下してろ紙全体を湿らせ、直ちにその上に固形培地上の培養菌をループで塗布した。1分以内に塗布部分が深青色を呈する菌をチトクローム・オキシダーゼ陽性菌と判定した。塗布部分に変化が認められない場合はその菌をチトクローム・オキシダーゼ陰性菌と判定した。その結果、18株ともにオキシダーゼ陰性のグラム陰性菌であった(表3)。
(3). IDテスト・EB-20
TSI寒天培地にて、ブドウ糖発酵性グラム陰性菌と判定された18菌株についてブドウ糖発酵性グラム陰性桿菌を同定することができるIDテスト・EB-20(日水製薬株式会社)で推定される菌種の同定を行った。普通寒天培地上で増殖培養した被検菌をループを用いて、IDテスト・EBブイヨン1本(2.5ml/tube)に懸濁した。接種菌液の菌液濃度は溶液1ml中に細菌3×108個相当とした。調製した菌液をIDテスト・EBプレートの各ホールの段差の部分に接種した。H2S、LDC、ADH、ODC、URE、INO、SOR及びARAの8項目には、菌液接種後、流動パラフィンを3滴重層して空気を遮断した。プレートにふたをして30℃の恒温槽の中で18から24時間培養した。生化学的性状の成績は、培養後添付の色調判定表と比較して陽性・陰性を判定した。PPA、IND、VPの3項目は培養後、IDテスト・EB(code 06628、日水製薬株式会社)試薬を加えてから判定した。判定結果に基づいてIDテスト・EB-20・解析プロファイル(5版)により、対応する菌種を調べた。グラム陰性菌と判定された各菌株の分類・同定結果を表3にまとめた。
S. ficaria:Serratia ficaria、S. plymuthica:Serratia plymuthica、
E. amnigenus:Enterobacter amnigenus、E. cloacae:Enterobacter cloacae
E. agglomerans:Enterobacter agglomerans、R.aquatilis:Rahnella aquatilis
L. adecarboxylata: Leclercia adecarboxylata
IDテストで同定を試みたグラム陰性菌の菌株の中にパントエア・アグロメランスの可能性が高いと判定された菌株が18種中に7種あった。いずれもコロニーは黄色でありパントエア・アグロメランスと類似していた。そこで、これらの7種について、小麦より分離したパントエア・アグロメランスより得られるリムラス陽性糖脂質のIP-PA1と同様の糖鎖構造を有する菌か調べる目的で、糖脂質 IP-PA1に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた免疫学的な同定を試みた。各被検菌について、プレートより菌を10mg程度掻き取り、予め重量を測定しておいた1.5mlチューブに移した。菌体の湿重量10mgに対して90μlの蒸留水を加え、100mg/mlの菌体の懸濁液を調製した。ブロックヒーターを用いて、95℃にて30分間加熱し糖脂質を抽出した。加熱後、遠心上清を糖脂質の加熱抽出液原液とした。原液10μlをPBS(-)990μlの入った1.5mlに加え、100倍希釈を調製した。各菌株から調製した希釈液を、50μlずつ、96穴イムノプレート(マキシソープ、NUNC)のAからHのウエルに添加した。陰性コントロールとしてのPBS(-)のみと陽性のコントロールとしてのIP-PA1の10μg/mlのPBS(-)溶液をそれぞれ同様に50μlずつ添加し、一晩、室温にて放置して固相化した。その後、3%牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS(-)溶液を、抗体その他のタンパクの非特異的吸着を防止目的でウエル当たり250μl加え、室温で1時間放置した。その後、0.05%Tween 20を含むTBS(10mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl) にて3回洗浄後、列ごと(A列:細胞培養の培養液のみ、B列:4E11、C列:20A8、D列:32G3、E列:34G2、F列:49H5、G列:86F12)にIP-PA1に特異的モノクローナル抗体
(IP-PA1特異的モノクローナル抗体は以下の方法で作製した。パントエア・アグロメランス加熱死菌を完全フロイトアジュバントと混合し、BALB/cマウス腹腔内に一匹当り1×108個投与し、2週間間隔で3回腹腔内に投与した。最終投与3日後に、脾臓から細胞を取り出し、ミエローマ(P3U1)と50%ポリエチレングリコール(平均分子量1000)を用いて細胞融合した。融合細胞を10%FBS(牛胎児血清)を含むHAT培地に懸濁させ96穴平底プレートで37℃、5%CO2下で静置しながら、7日間培養し、コロニー形成が見られた上清中を、IP-PA1を抗原とした公知慣用のELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法で測定した。上記で得られたモノクローナル抗体産生細胞を公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。その結果、抗IP-PA1マウスモノクローナルIgG抗体を得た。)
を50μlずつ加えた。室温で1時間反応させ、次いで、ウエルを0.05%Tween 20を含むTBSで3回洗浄し、1%BSA含有PBS(-)溶液で1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合抗マウスIgG、M、A免疫グロブリン抗体(シグマ社製)を50μlずつ、ウエルに入れ、室温で1時間放置した。その後、0.05%Tween 20を含むTBSで4回洗浄し、1mg/mlになるようにp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム(和光純薬工業製)を基質緩衝液に溶解した溶液を100μl/ウエルの割合で入れ、室温で1時間放置した後、2規定の水酸化ナトリウム水溶液50μl/ウエルを入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(モデル550、BIO-RAD)にて415nmの吸光度を測定した。その結果、7菌株中、2菌株が6種のIP-PA1特異的抗体に対して反応性を示した(表4)。
ソバ粉0.5gと塩類(リン酸水素二ナトリウム七水和物1.28g、リン酸二水素カリウム0.3g、塩化ナトリウム50mg、塩化アンモニウム100mg、1M硫酸マグネシウム水溶液0.2ml、1M塩化カルシウム水溶液0.01ml)と水を加え全量を100mlとし1リットルの坂口フラスコに入れた。これをオートクレーブ(TOMY BS−325、120℃、20分)で滅菌した。実施例4の中層粉No.2のコロニー(パントエア・アグロメランス、表3においては旧称であるエンテロバクター・アグロメランスと表記)の分離菌株を種菌として、滅菌した溶液に加え、30℃にて一晩培養した。遠心分離器(日立、高速冷却遠心機 SCR−20B、5000rpm、20分間、4℃)により沈殿を回収した。沈殿にリン酸緩衝液を加えて懸濁し、全量100mlとして、沸騰水浴中で30分間加熱抽出した。加熱終了後、室温まで冷却し、本液を遠心分離(日立、高速冷却遠心機 SCR−20B、10000rpm、20分間、20℃)した。遠心後、淡黄色の上清を得た。この上清80mlあたりに8.9mlの5モル塩化ナトリウム溶液を加え、これに178mlのエタノールを加えた。これを、冷凍庫(−90℃)で一晩放置後、本液を遠心分離(日立、高速冷却遠心機SCR−20B、10000rpm、20分間、4℃)した。上清を除いて得た沈殿を風乾し、蒸留水に溶解し、10mlのソバ発酵エキス溶液を得た。本エキスの固形分は、0.3mlを予め秤量した1.5mlプラスチックチューブに移し、凍結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ11.5mgであった(3.8%)。
ソバ発酵エキスのアトピー性皮膚炎に対する効果を調べるために、I型アレルギーモデルを導入した。一群5匹の雄性のBALB/cマウスに抗ジニトロフェニル、マウスモノクローナル抗体(IgE)を1μg/マウスで静脈投与した。一時間後に実施例6で製造したソバ発酵エキス(10μg/マウス)を腹部皮内投与又は経口投与(1mg/マウス)し、さらに1時間後に、マウスの耳介の表裏に0.25%ジニトロフルオロベンゼン含有アセトン−オリーブオイル混合溶液(4対1)をアレルゲンとして20μl塗布した。塗布後、1、2、24及び48時間目の耳介の厚さをシクネスゲージで測定し、塗布直前の厚さとの差(△)を浮腫の程度とした。薬剤投与の効果は、アレルゲン投与1時間後に認められる早期反応と、24時間後に誘導される遅発反応、それぞれの抑制を以下の式によって求められる抑制率で評価した。{抑制率 = (1−薬剤投与後の△耳介の浮腫/対照の△耳介の浮腫)×100}結果を表6に示す。表から明らかなように、ソバ発酵エキスは皮内投与でも、経口投与でもアレルギー反応を抑制した。
レンコンに含まれるリムラス陽性糖脂質量を測定した。レンコンに付いている土を水道水にて洗い落とした後、滅菌蒸留水にて3回洗浄した。その後、節部分と可食部に切り分け、それぞれについて、すりおろし、キムワイプにくるんだ後、圧搾して絞り汁を得た。絞り汁を遠心分離し、上清を新鮮標品からの抽出液として試験に供した。また、接続部と可食部に切り分けた後、薄く切り分け、40℃にて3日間乾燥剤を入れた乾燥機にて乾燥させた。乾燥した標品を乳鉢・乳棒を用いて細かく砕き粉末状とした。各粉末2.0gに蒸留水を加え20mlとした後、粉末を懸濁し、沸騰水浴中にて20分間加熱抽出を行った。加熱後、室温まで冷却したところ、各標品共に、ゲル化した(含まれる炭水化物によるものと推定される)為、一部をさらに蒸留水にて5倍希釈し、懸濁・攪拌し、遠心分離を行いその上清(以下、「レンコン希釈液」という。)を試験に供した。レンコンは3本用いて、各サンプルを調製した。生化学工業のエンドスペシーのキットを用いて測定した。方法は、キット添付のプロトコールに従った。測定された糖脂質含量はIP-PA1の重量換算値として算出した。その結果を表7に示した。いずれのサンプルからも糖脂質が検出された。
マウスのマクロファージ系細胞RAW264.7を用いたレンコン抽出物の免疫作用の測定はRAW264.7細胞を細胞濃度を8×105cells/mlとして、その100μlを96ウエルプレートの各ウエルに移し、6時間後に試験に用いた。RAW264.7細胞に各レンコン希釈液を50μlを添加し、1時間37℃、5%CO2インキュベータ内で培養した。その後、LPSp(パントエア・アグロメランスから得られる低分子量リポ多糖)400ng/mlを含む培養液50μl(終濃度100ng/ml:これを「LPSpの高純度標品」とする)又は、培養液のみを50μl添加し、さらに23時間培養を行った。培養終了後、上清50μlを回収し常法に従いGriess試薬を用いて培養液中の一酸化窒素の代謝物である亜硝酸イオン量を測定した。
レンコンの各根茎接続部の一部を蒸留水に懸濁し、段階希釈後、100μlずつを普通寒天培地にまきこみ、30℃の恒温槽内でインキュベートした。4日間のインキュベートの後、プレート上に認められる各コロニーについて、別の普通寒天培地プレートにまき、菌の単離を行った。また、同時にプレート上の菌数、菌腫内訳から単位重量当たりの菌の存在数について算出した。
純培養で得られた各菌のコロニーを用い、グラム陰性か陽性をRyuの方法に基づき3%KOHに対する溶解性により決定した。グラム陰性菌と判別された菌株についてはID-test EB20(日水製薬)を用いて同定を行った。
各種グラム陰性菌のレンコン培養エキス
レンコンをスライスし、70℃の乾燥器に1週間乾燥させ、これを乳鉢ですりつぶしてレンコン粉末を得た。レンコン粉0.5gと塩類(リン酸水素二ナトリウム七水和物1.28g、リン酸二水素カリウム0.3g、塩化ナトリウム50mg、塩化アンモニウム100mg、1M硫酸マグネシウム水溶液0.2ml、1M塩化カルシウム水溶液0.01ml)と水を加え全量を100mlとした。これをオートクレーブで滅菌し、実施例11においてパントエア・アグロメランスと同定された一つのコロニー、又は、実施例11においてグラム陰性菌と同定された51菌株の内、セラチア・プリムチカとも、パントエア・アグロメランスとも同定されなかった菌体のコロニー(合計3サンプル)を加え、30℃にて一晩培養した。その後、培養液を95℃にて30分間加熱し糖脂質を抽出した。加熱後、遠心上清することでレンコン発酵エキスが得られた。
原材料としてグラニュー糖、水飴、水に実施例12で製造したレンコン発酵エキスを加えたものを5:5:5:1の割合で混合し、加熱して120℃〜160℃で煮詰めた。これを冷却用鉄板上で冷却し、棒状に引き伸ばして1g前後の粒状に成型し飴を得た。本アメ適量を水20mlに入れ、加熱することで溶解させた。この溶液中のレンコン発酵エキス有効成分としてリポ多糖量を測定したところ、8.9μg/gであった。このアメを、風邪をひいてのどの痛みのある男女6名に摂取させた。その後、直ちにのどの痛みに対するアンケート調査を行った。のどの痛みについては、6名とも痛みが軽減したと感じた(一標本符号検定:P<0.03)。
Claims (6)
- レンコンに由来する素材を、前記レンコンに付着又は共生するグラム陰性菌によって発酵させて、同時に該菌を培養することを特徴とする発酵及び培養方法。
- 前記レンコンに由来する素材はレンコンに力学的操作を加えることによって得られることを特徴とする請求項1記載の発酵及び培養方法。
- 請求項1又は2記載の発酵及び培養方法で得られることを特徴とするレンコン発酵エキス。
- 請求項3記載の植物発酵エキスから得られることを特徴とするレンコン発酵エキス末。
- 請求項3記載のレンコン発酵エキス又は請求項4記載のレンコン発酵エキス末が配合されていることを特徴とするレンコン発酵エキス配合物。
- 前記レンコン発酵エキス配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、植物用肥料、植物用医薬品又は浴用剤であることを特徴とする請求項5記載のレンコン発酵エキス配合物。
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